Nghiên cứu lịch dùng vacxin cúm H5N1 cho ngan pháp thương phẩm tại trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương

BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------------ KHUẤT THỊ TUYÊN NGHIÊN CỨU LỊCH DÙNG VACXIN CÚM H5N1 CHO NGAN PHÁP THƯƠNG PHẨM TẠI TRUNG TÂM NGHIÊN CỨU GIA CẦM THỤY PHƯƠNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN THỊ NGA HÀ NỘI - 2010 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........i LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng ñược ai công bố trong bất kì công trình nào khác. Tôi xin cam ñoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn ñều ñã ñược chỉ rõ nguồn gốc. Mọi sự giúp ñỡ ñã ñược cảm ơn. Tác giả luận văn Khuất Thị Tuyên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........ii LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành bản luận văn này, ngoài sự cố gắng nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận ñược sự giúp ñỡ, tạo ñiều kiện của các ñơn vị tập thể: Ban giám hiệu, Viện ñào tạo sau ñại học, Ban chủ nhiệm khoa Thú y, bộ môn Vi sinh vật - truyền nhiễm - Trường ñại học Nông nghiệp Hà Nội. Ban giám ñốc Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương, Ban lãnh ñạo Trạm nghiên cứu gia cầm Cẩm Bình. Bộ môn virus - Trung tâm chẩn ñoán thú y TW - Cục thú y ðặc biệt là sự chỉ bảo, giúp ñỡ tận tình của các thầy cô hướng dẫn và giúp ñỡ khoa học: + TS Nguyễn Thị Nga -Trưởng phòng thú y - Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương- Viện Chăn Nuôi + TS Trần Thị Lan Hương - Giảng viên bộ môn Vi sinh vật - truyền nhiễm Trường ðại Học Nông nghiệp Hà Nội. Tôi cũng nhận ñược sự hợp tác giúp ñỡ của, các anh chị ñồng nghiệp trong Trạm nghiên cứu gia cầm Cẩm Bình. Nhân dịp này, cho phép tôi ñược bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc về những quan tâm giúp ñỡ quý báu ñó. Tôi xin chân thành cảm ơn bạn bè, ñồng nghiệp và người thân, những người ñã ñộng viên, tạo ñiều kiện giúp ñỡ tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng 11 năm 2010 Tác giả luận văn Khuất Thị Tuyên Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........iii MỤC LỤC Lời cam ñoan Error! Bookmark not defined. Lời cám ơn Error! Bookmark not defined. Mục lục Error! Bookmark not defined. Danh mục các bảng Error! Bookmark not defined. Danh mục hình Error! Bookmark not defined. 1. MỞ ðẦU ...................................................................................................i 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài ........................................................................1 1.2. Với mục tiêu ñề tài:...............................................................................2 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .........................................................................3 2.1. Bệnh cúm gia cầm ................................................................................3 2.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm và tình hình dịch cúm gia cầm. ...................3 2.2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm................................................................3 2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới .........................................5 2.2.3 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam ..........................................6 2.3. ðặc ñiểm sinh học của virus cúm týp A. ...............................................8 2.3.1 ðặc ñiểm về hình thái và cấu trúc ....................................................8 2.3.2. ðặc tính kháng nguyên của virus cúm týp A .................................12 2.3.3. Thành phần hóa học và sức kháng của virus..................................14 2.3.4. Quá trình nhân lên của virus..........................................................15 2.3.5. ðộc lực của virus ..........................................................................16 2.4. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm ............................................................18 2.5. Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm. .....................................20 2.5.1 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao (HPAI) ........................................................................................20 2.5.2 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực thấp (LPAI) .......................................................................................21 2.6. Bệnh tích.............................................................................................21 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........iv 2.7 Chẩn ñoán bệnh cúm gia cầm ..............................................................22 2.8. Miễn dịch cúm gia cầm.......................................................................24 2.8.1 Miễn dịch không ñặc hiệu ..............................................................26 2.8.2. Miễn dịch ñặc hiệu........................................................................26 2.8.3. Một số phương pháp ñánh giá ñáp ứng miễn dịch cúm gia cầm ....28 2.9. Vacxin.................................................................................................28 2.9.1. Sự cần thiết của tiêm vacxin phòng bệnh cúm gia cầm.................28 2.9.2 Vacxin vô hoạt ñồng chủng: ...........................................................30 2.9.3 Vacxin vô hoạt dị chủng: ................................................................30 2.9.4 Vacxin tái tổ hợp: ..........................................................................30 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ..................................35 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ..............................................................35 3.1. ðối tượng............................................................................................35 3.2. Nội dung nghiên cứu...........................................................................35 3.2.1. Xác ñịnh kháng thể cúm gia cầm chủ ñộng ở ñàn ngan Pháp mẹ và thụ ñộng ở ñàn ngan con nuôi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương. ..................................................................................................35 3.2.2. Xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể sử dụng liều vacxin cúm H5N1 lần 1 cho ngan con. .......................................................................................35 3.2.3. Xác ñịnh hàm lượng kháng thể của ñàn ngan con sau khi sử dụng vacxin cúm H5N1 lần 2. .........................................................................35 3.2.4. Xác ñịnh hiệu lực của vacxin cúm H5N1 trên ñàn ngan bằng phương pháp công cường ñộc. .............................................................................35 3.2.5. Khuyến cáo lịch dùng vacxin H5N1 phòng bệnh cúm cho ngan Pháp thương phẩm. .................................................................................35 3.3. Nguyên liệu ........................................................................................36 3.4. Phương pháp nghiên cứu.....................................................................36 3.4.1 Bố trí thí nghiệm ............................................................................36 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........v 3.4.2. Phương pháp lấy máu ngan con:....................................................38 3.4.3. Phương pháp làm phản ứng HA ....................................................38 3.4.4. Phương pháp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu gà (Phản ứng HI) ...................................................................................................40 3.4.5. Xử lý số liệu..................................................................................42 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................................43 4.1. Kết quả kiểm tra kháng thể cúm gia cầm chủ ñộng ở ngan mẹ và thụ ñộng ở ngan con nuôi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương......................43 4.1.1. Tương quan giữa hàm lượng kháng thể cúm gia cầm chủ ñộng ở ngan mẹ và thụ ñộng ở ngan con.............................................................43 4.1.2. Diễn biến kháng thể thụ ñộng ở ngan con......................................47 4.2 Xác ñịnh thời ñiểm thích hợp ñể sử dụng liều vacxin cúm H5N1 lần 1 cho ngan con..............................................................................................54 4.3. Kết quả xác ñịnh lượng kháng thể của ñàn ngan con sau khi sử dụng vacxin cúm gia cầm H5N1 lần 2. ...............................................................62 4.4. Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin cúm H5N1 trên ñàn ngan bằng phương pháp công cường ñộc ....................................................................68 4.5. Khuyến cáo lịch dùng vacxin H5N1 phòng bệnh cúm cho ngan thương phẩm..........................................................................................................77 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ......................................................................78 5.1. Kết luận ..............................................................................................78 5.2 ðề nghị ................................................................................................79 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AI : Avian influenza Cs : Cộng sự OIE : Office internation des epizooties FAO : Food and Agriculture Organization HA : Haemagglutination HI : Haemagglutination Inhibition HPAI : Highly Pathogenic Avian Influenza IL : Interleukin KT : Kháng thể LPAI : Low Pathogenic Avian Influenza MDCK : Madin – Darby Canine Kidney Cell NXB : Nhà xuất bản Pp : page paper ARN : axit ribonucleic TCID50 : 50 percent tissue culture infective dose TN : Thí nghiệm Tr : Trang Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Tương quan giữa hàm lượng kháng thể cúm gia cầm ngan mẹ và kháng thể thụ ở ngan con 46 4.2 Diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ñộng cúm gia cầm ở ñàn ngan con nở từ trứng của ngan mẹ có HI bình quân = 6,43 log2 và 6,1 log2 49 4.3 Diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ñộng cúm gia cầm ở ñàn ngan con nở từ trứng của ngan mẹ có HI bình quân = 5,73 log2 và 5,27 log2 51 4.4 Diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ñộng cúm gia cầm ở ñàn ngan con nở từ trứng của ngan mẹ có HI bình quân = 4,5 log2 và 3,8 log2 53 4.5 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần 1 (sau khi tiêm vacxin cho ngan mẹ 1 tháng) 55 4.6 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần 1 (sau khi tiêm vacxin cho ngan mẹ 3 tháng) 58 4.7 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần 1 (sau khi tiêm vacxin cho ngan mẹ 5 tháng) 61 4.8 Hàm lượng kháng thể của ngan khi sử dụng vacxin cúm H5N1 lần 2 (nở từ trứng của ñàn ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 1 tháng) 64 4.9 Hàm lượng kháng thể của ngan khi sử dụng vacxin cúm H5N1 lần 2 (nở từ trứng của ñàn ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 3 tháng) 65 4.10 Hàm lượng kháng thể của ngan khi sử dụng vacxin cúm H5N1 lần 2 (nở từ trứng của ñàn ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 5 tháng) 67 4.11 Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin cúm H5N1 trên ñàn ngan bằng phương pháp công cường ñộc 70 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........viii 4.12 Kết quả theo dõi triệu chứng của ngan sau khi công virus cúm cường ñộc 73 4.13 Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể của ngan sau khi công virus cúm cường ñộc 76 4.14 Lịch sử dụng vacxin cúm H5N1 cho ñàn ngan thương phẩm 77 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Ảnh virus dưới kính hiển vi ñiện tử [60] 8 2.2 Mô phỏng cấu trúc virus cúm [54] 9 2.3 Thông tin căn bản Trình tự Amino acid ở vị trí chia tách [54] 10 2.4 Thông tin căn bản cơ chế chức năng của Hemagglutinin [54] 10 2.5 Cấu trúc Haemagglutinin và Neuraminidase [60] 11 2.6 Sơ ñồ biến dị ñiểm 14 2.7 Sơ ñồ sự tái tổ hợp gen (shift) 14 2.8 Sự sao chép và tái tạo [60] 16 4.1 Tương quan giữa hàm lượng kháng thể ngan mẹ và ngan con 47 4.2 Diễn biến kháng thể thụ ñộng ở ngan con 54 4.3 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần 1 (nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 1 tháng) 56 4.4 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần 1 (nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 3 tháng) 59 4.5 Hiệu giá kháng thể của ngan con khi dùng vacxin cúm H5N1 lần 1 (nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 5 tháng) 62 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........1 1. MỞ ðẦU 1.1. Tính cấp thiết của ñề tài Dịch cúm gia cầm do virus cúm A (H5N1) thể ñộc lực cao (HPAI) ñã bùng phát ở Việt Nam cuối năm 2003, mặc dù ñã ñược khống chế nhưng dịch vẫn xẩy ra rải rác ở một số tỉnh. Biện pháp khống chế ñến 9/2004 là tiêu hủy toàn ñàn nhiễm bệnh và có tiếp xúc với nguồn bệnh. Biện pháp này ñã cho kết quả tốt nhưng tốn kém và gây thiệt hại kinh tế rất lớn cho người chăn nuôi. Mặt khác trong các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra gần ñây có nhiều ổ dịch xảy ra trên thủy cầm (52,7%) và từ nhiều ñàn không tiêm vacxin phòng cúm gia cầm ở ngoài dân. ðặc biệt có nhiều ổ dịch xảy ra ở mô hình chăn nuôi hỗn hợp (gà, vịt, ngan) và ñược báo cáo là phát ra trên thủy cầm trước sau ñó lây nhiễm cho gà. Trong chăn nuôi gia cầm, ngan cũng ñược nuôi rất phổ biến khắp cả nước. Do vậy nếu ngan không ñược tiêm phòng vacxin phòng virus cúm gia cầm sẽ có nguy cơ nhiễm virus cúm, mắc bệnh, chết và lây lan mầm bệnh cho các ñối tượng gia cầm khác cũng như con người. Biện pháp sử dụng vacxin cúm gia cầm là cần thiết ñể hạn chế sự phát tán mầm bệnh, giảm sự thải virus ra ngoài môi trường. Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương là nơi giữ giống gốc các dòng ngan Pháp, trước ñây Trung tâm sử dụng vacxin H5N9 phòng cúm gia cầm cho ngan nhưng sau ñó vacxin H5N9 không ñược nhập gây khó khăn trong việc phòng cúm gia cầm cho ngan, do vậy chưa có vacxin chính thức nào phòng cúm gia cầm dành riêng cho ngan. Do ñó, chúng tôi tiến hành nghiên cứu ñề tài “Nghiên cứu lịch dùng vacxin cúm H5N1 cho ngan Pháp thương phẩm tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương” Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........2 1.2. Với mục tiêu ñề tài: + ðưa ra lịch sử dụng vacxin cúm H5N1 phòng bệnh cúm gia cầm cho ñàn ngan Pháp thương phẩm tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thụy Phương. + An toàn cho ngan của Trung tâm và giảm chi phí nhập vacxin. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Bệnh cúm gia cầm Bệnh cúm gia cầm (Avian influenza: AI) là bệnh truyền nhiễm gây ra bởi virus cúm týp A thuộc họ Orthomyxoviridae với nhiều subtýp khác nhau, Ito, T and Y. Kawaoka, 1998 [48] Trước ñây bệnh còn ñược gọi là bệnh dịch tả gà (Fowl plague), nhưng từ Hội nghị Quốc tế lần thứ nhất về bệnh Cúm gia cầm tại Beltsville, Mỹ, năm 1981 ñã thay thế tên này bằng tên bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao (Highly Pathogenic Avian Influenza-HPAI) ñể chỉ virus cúm týp A có ñộc lực cao (Cục thú y, 2004) [7]. OIE (Office internation des epizooties) xếp HPAI vào danh mục 1 trong 15 bệnh nguy hiểm ở ñộng vật. Bệnh cúm gia cầm là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm, có tốc ñộ lây lan rất nhanh với tỉ lệ chết cao trong ñàn gia cầm nhiễm bệnh. Virus gây bệnh cúm gia cầm chủ yếu là loại H5, H7 và H9, gây bệnh cho gà, vịt, ngan, ngỗng, ngan, các loại chim. Virus còn gây bệnh cho cả con người và có thể trở thành ñại dịch, vì thế bệnh cúm gia cầm ñang ngày càng trở nên nguy hiểm hơn bao giờ hết (Cục thú y, 2005) [8], (Lê Văn Năm, 2004) [20]. 2.2. Lịch sử bệnh cúm gia cầm và tình hình dịch cúm gia cầm. 2.2.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm Trước ñây rất lâu từ năm 412 trước công nguyên bệnh cúm ñã ñược Hippcrate mô tả tuy nhiên tới năm 1680 một vụ ñại dịch cúm ñược mô tả kỹ và ñến nay ñã xảy ra 31 vụ. Trong hơn 100 năm qua có 4 vụ ñại dịch cúm xảy ra vào các năm 1889, 1918, 1957, 1968 (Cục thú y, 2004) [7]. Năm 1878 ở Itali ñã xảy ra một bệnh gây tử vong rất cao ở gia cầm và ñược gọi là bệnh dịch tả gia cầm (Fowl plague), bệnh lần ñầu tiên ñược Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........4 Porroncito mô tả và ông nhận ñịnh trong tương lai ñây là một bệnh quan trọng và nguy hiểm. ðến năm 1901 Centani và Savunozzi ñã ñề cập ñến ổ dịch này và xác ñịnh ñược căn nguyên siêu nhỏ có khả năng qua lọc là yếu tố gây bệnh. Qua một thời gian rất dài ñến năm 1955, Achafer ñã xác ñịnh ñược căn nguyên gây bệnh thuộc nhóm virus cúm týp A thông qua kháng nguyên bề mặt là H7N1, H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây, chim hoang, ở Bắc Mỹ, Nam Mỹ, Châu Phi, Trung Cận ðông (theo Phạm Sỹ Lăng, 2004) [19]. Năm 1963, virus cúm týp A ñược phân lập ở Bắc Mỹ do loài thủy cầm di trú dẫn nhập vào ñàn gà. Từ năm 1960-1979 bệnh ñược phát hiện ở Canada, Mexico,…Theo thống kê của Alexander thì có các ổ dịch lớn: ở Australia (1975-1985), Anh (1974), Mỹ (1983-1984), Ireland (1983-1984), Mexico (1984). ðặc biệt ở Hong Kong (1997) virus không chỉ gây bệnh cho gia cầm mà còn lây nhiễm và gây tử vong cho người. Sự lây nhiễm loài chim hoang dã sang gia cầm ñã có bằng chứng từ trước năm 1970 nhưng chỉ ñược công nhận khi xác ñịnh ñược tỷ lệ nhiễm virus cúm cao ở một số loài thủy cầm di trú (theo Phạm Sỹ Lăng, 2004) [19]. Từ sau khi phát hiện ra virus cúm týpA các nhà khoa học thấy rằng virus cúm có ở nhiều loài chim hoang dã và gia cầm nuôi những vùng khác nhau trên thế giới. Bệnh xảy ra nghiêm trọng nhất với gia cầm thuộc subtýp H5, H7. ðến nay dịch cúm gia cầm liên tục bùng nổ khắp các châu lục trên thế giới và với mức ñộ nguy hiểm của nó từ ñó thúc ñẩy các nhà khoa học tổ chức các hội thảo chuyên ñề về bệnh cúm gia cầm. Hội thảo lần ñầu tiên vào năm 1981 tại Beltsville (Mỹ), lần thứ hai tại Athen năm 1986, lần thứ ba tại Madison WI vào 1992, lần thứ tư tại Athen năm 1997 và lần thứ năm năm 2003 cũng tại Athen. Từ ñó tới nay trong các về dịch tễ bệnh cúm gia cầm luôn là một trong Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........5 những nội dung ñược coi trọng và ñược liên tục tổ chức ở nhiều nơi trên thế giới. ðiều ñó cho thấy bệnh cúm gia cầm ngày càng trở nên nguy hiểm và gây nhiều thiệt hại về mặt kinh tế cho ngành chăn nuôi gia cầm trên phạm vi toàn cầu. ðặc biệt và nguy hiểm hơn khi virus cúm gia cầm vượt ‘rào cản về loài’ thích nghi gây bệnh trên người với tỷ lệ tử vong cao. 2.2.2 Tình hình dịch cúm gia cầm trên thế giới Ở các nước Châu Á theo ñánh giá của các tổ chức quốc tế thì trong tháng 12/2003 và tháng 01/2004 dịch cúm gà ñã gây ra ñại dịch ở 11 nước và vùng lãnh thổ bao gồm: Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Indonexia, Trung Quốc, Hồng Kong, ðài Loan, Pakistan mà tác nhân gây bệnh là virus cúm A. Hàn Quốc: Dịch cúm gia cầm xảy ra từ 12/12/2003 ñến 24/3/2004 do virus H5N1 gây ra và tổng số gia cầm bị tiêu huỷ là hơn 400 nghìn con và 1 ổ dịch do H5N2 gây ra vào 10/12/2004. Nhật Bản: dịch cúm gia cầm xảy ra từ 27/1/2004 ñến 5/3/2004 do virus H5N1 gây nên. Thái Lan: ðợt 1 dịch cúm gia cầm xảy ra từ 23/1/2004 ñến giữa tháng 3/2004 ở 11 tỉnh thành, với tổng số gia cầm bị tiêu huỷ khoảng 30 triệu con; ñợt dịch thứ 2 tái bùng phát từ 3/7/2004 nguyên nhân do virus H5N1. Trung Quốc: virus H5N1 xuất hiện từ 27/1/2004 ở Quảng Tây sau ñó lan sang 15 tỉnh khác ñặc biệt ở các tỉnh biên giới với Việt Nam ñều có dịch. Indonesia: Dịch cúm xuất hiện ñầu tiên vào tháng 1/2004 – 11/2004 ở 16/33 tỉnh thành; dịch xuất hiện trở lại vào 23/3/2005 do virus H5N1. Giữa năm 2005 dịch cúm gia cầm do H5N1 bắt ñầu xuất hiện tại Kazakhstan, Nga rồi nhanh chóng lan rộng sang các nước khác ở khu vực Châu Âu như: Rumani, Hylap, Thổ Nhĩ Kỳ, Azerbaijan, rồi sang Châu Phi, các nước khác thuộc Châu Á như vùng Vịnh, Trung Quốc và Iraq. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........6 ðến ngày 02 tháng 08 năm 2006 chủng virus ñộc lực cao H5N1 ñã có mặt tại 51 quốc gia và vùng lãnh thổ trên hầu khắp các châu lục, tập trung chủ yếu ở Châu Á và Châu Âu. Trong mấy năm gần ñây dịch cúm vẫn xẩy ra lẻ tẻ khắp nơi trên thế giới dù không gây thành dịch lớn nhưng vẫn gây ảnh hưởng lớn tới kinh tế và chăn nuôi gia cầm trên toàn thế giới ñặc biệt ở các khu vực, các nước ñang phát triển như ở châu Á, châu Phi. 2.2.3 Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam Dịch cúm gia cầm ở nước ta ñược thông báo ñầu tiên vào cuối tháng 12 năm 2003. ðến nay ñã dược ghi nhận xảy ra ở 4 ñợt chính sau. - ðợt 1: 12/2003 - 30/3/04 : Dịch xảy ra ở 2574 xã phường thuộc 381 huyện thị trấn, của 57/61 tỉnh- thành phố của Việt Nam. Mắc bệnh và tiêu huỷ 43,9 triệu con (gà: 30,4 triệu ; thuỷ cầm: 13,5 triệu); 14,76 triệu chim cút và chim khác - ðợt 2: Từ 4/2004 - 11/2004. Bệnh xuất hiện ở 46 xã phường tại 32 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........7 huyện, thị xã, thuộc 17 tỉnh. Thời gian cao ñiểm nhất là tháng 7, sau ñó giảm dần, ñến tháng 11 cả nước chỉ có 1 ñiểm phát dịch. Tổng số gia cầm bị tiêu hủy: 84.000 con (56.000 gà, hơn 8.000 vịt). - ðợt 3: Từ 12/2004 - 6/2005. Bệnh xuất hiện ở 670 xã tại 182 huyện thuộc 36 tỉnh thành phố (15 tỉnh phía Bắc, 21 tỉnh phía Nam). Thời ñiểm xuất hiện các ổ dịch nhiều nhất vào tháng 1/2005 (143 ổ dịch/31 tỉnh thành). Trong ñợt dịch này có: 470.000 gà, 825.000 vịt ngan, 551.000 chim cút ñã chết hoặc bị tiêu hủy. - ðợt 4: Từ 10/ 2005 - 1/2006, xảy ra ở 24 tỉnh thành. Có 3.972.000 gia cầm (1.338.000 gà, 2.135.000 thủy cầm) ñã chết hoặc tiêu hủy. - ðợt 5: Từ tháng 12/ 2006 – 17/1/20007. Có 18.921gia cầm (671 gà, 18.250 vịt ngan) ñã chết hoặc tiêu hủy. Bên cạnh ñó từ 2008 ñến nay dịch cúm vẫn liên tục xảy ra lẻ tẻ ở các ñịa phương và vào các mùa khác nhau như năm 2007 dịch xảy ra vào cả mùa hè tháng 4 - tháng 5; năm 2010 xẩy ra vào tháng 5 - tháng 6 gây chết các ñàn gia cầm ở xã Duy Thành Duy Xuyên Quảng Nam làm cho phải tiêu huỷ 9000 gia cầm trong ñịa bàn và nguyên nhân dịch nổ ra là do công tác tiêm phòng vaccin chỉ ñạt 40%. Mặt khác còn do ý thức của người dân (như một số nơi ở tỉnh Kiên Giang) có dịch vịt, gà chết không báo cáo, thậm chí còn ăn cả vịt–gà chết không rõ nguyên nhân; một phần khác do cuộc sống của người nông dân quá khốn khổ họ nghĩ ăn vào chưa chết ngay trong khi dịch biết ñến khi nào mới nổ ra, năm 2010 hay 2015. Một vấn ñề khác là mỗi hộ gia ñình nuôi không nhiều, nhưng nuôi nhiều loại gia cầm và nhiều lứa tuổi; mạng lưới thú y xã chỉ có một người, vì vậy gia cầm không ñược giám sát tại chỗ một cách kịp thời. Bên cạnh gây thiệt hại về kinh tế (chỉ tính vụ dịch năm 2003 -2004 làm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........8 giảm 1,5% mức tăng GDP của nền kinh tế khu vực ðông Nam Á), cúm gia cầm còn lây sang người, qua số liệu thống kê người bị nhiễm và tử vong do cúm H5N1 thì từ năm 2003 - 2008 tổng số người chết do cúm H5N1 khu vực Châu Á và châu Âu là 234 người trong tổng 369 người nhiễm chiếm 63%; Indonesia ñứng ñầu với 129 ca nhiễm chiếm 34,96% và tỷ lệ chết/tỷ lệ nhiễm cao nhất là 81,39%, Việt Nam có 105 ca nhiễm chiếm 28,46% và số người chết/số người nhiễm là 48,57%. 2.3. ðặc ñiểm sinh học của virus cúm týp A. 2.3.1 ðặc ñiểm về hình thái và cấu trúc Virus cúm gia cầm thuộc virus cúm týp A, một trong 4 nhóm của họ Orthomyxoviridae:- virus cúm A (Influenza virus A) - virus cúm B (Influenza virus B) - virus cúm C (Influenza virus C) - nhóm Thogotovirus (Kawaoka, 1991)[50]. Hình 2.1: Ảnh virus dưới kính hiển vi ñiện tử [60] ðặc tính cấu trúc chung của tất cả 4 nhóm virus trong họ Orthomyxoviridae là có hệ gen là axit ribonucleic (ARN) một sợi, cấu trúc sợi âm , ký hiệu là ss(-)RNA (negative single stranded RNA), ñộ dài 10.000-15.000 nucleotit, không ñược nối với nhau tạo thành một sợi ARN hoàn chỉnh mà phân Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........9 chia thành 6 ñến 8 ñoạn (segment) có cấu trúc riêng biệt (Kawaoka, 1991) [50]. Khác với các nhóm virus trong họ virus cúm týp A có nhiều biến chủng khác nhau ñặc biệt với khả năng thích ứng rộng rãi trên nhiều loại vật chủ, tính kháng nguyên luôn biến ñổi, sự sắp xếp tái tổ hợp lại các phân ñoạn gen nên virus cúm týp A ñược coi là nhóm virus nguy hiểm nhất trong họ Orthomyxoviridae. Trong lịch sử những vụ dịch cúm kinh hoàng diễn ra ở người và trên gia cầm thì virus cúm týp A là thủ phạm chính. Hình 2.2: Mô phỏng cấu trúc virus cúm [54] Hạt virus (virion) có cấu trúc hình cầu hoặc ñôi khi có dạng hình sợi kéo dài, ñường kính khoảng 80-120nm. Phân tử lượng của một hạt virion vào khoảng 250 triệu Dalton. Vỏ virus là những protein có nguồn gốc từ màng tế bào mà virus gây nhiễm, bao gồm một số protein ñược glycosyl hoá và một số protein dạng trần không ñược glycosyl hoá. Protein bề mặt có cấu trúc từ các loại glycoprotein là các gai mấu có ñộ dài 10-14 nm, ñường kính 4-6 nm (Pastoret và cộng sự, 1997) [61]. Khi nghiên cứu sâu về cấu trúc hệ gen virus cúm týp A, Murphy và Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........10 Webster (1996) [59] cho thấy tất cả các thành viên của nhóm virus cúm A ñều có hệ gen là ARN một sợi chứa 8 phân ñoạn kế tiếp nhau mang mật mã cho 10 loại protein khác nhau của virus, 8 phân ñoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt rõ ràng nhờ phương pháp ñiện di. Hình 2.3: Thông tin căn bản Trình tự Amino acid ở vị trí chia tách [54] - Phân ñoạn gen từ 1 - 3 mã hoá cho protein PB1, PB2, và PA là các protein có chức năng của enzim polymeraza, có vai trò bảo vệ sự sao chép và biên dịch ARN của hạt virus (Biswas và Nayak, 1996) [33] - Phân ñoạn 4 mã hoá cho protein Hemagglutinin (HA) có chức năng bám dính vào thụ thể tế bào. Hình 2.4: Thông tin căn bản cơ chế chức năng của Hemagglutinin [54] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........11 Theo Bosch và cộng sự (1979) [34], Very và cộng sự (1992) [66], HA là một polipeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng ñoạn oligopeptit ngắn ñặc trưng cho các subtýp H (H1- H16) trong tái tổ hợp tạo nên biến chủng. Mô típ của chuỗi nối oligopeptit chứa một số axít amin cơ bản làm khung, thay ñổi ñặc hiệu theo từng loại hình subtýp H. Sự biến ñổi thành phần của chuỗi nối sẽ quyết ñịnh ñộc lực của biến chủng virus mới (Hoirmoto và Kawaoka, 1995) [43] - Phân ñoạn 5 mã hoá cho protein Nucleoprotein (NP) (Buckler White và Murphy, 1998) [36] - Phân ñoạn 6 là gen chịu trách nhiệm tổng hợp protein có vai trò như enzim là Neuraminidase (NA) có chức năng axit sialic, giúp giải phóng ARN virus từ endosom và tạo hạt virus mới. (Castrucci và Kawaoka, 1993) [38] Hình 2.5: Cấu trúc Haemagglutinin và Neuraminidase [60] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........12 - Phân ñoạn 7 mã hoá cho 2 tiểu phần protein ñệm (matrix protein) M1 và M2 (Holsinger và cộng sự, 1994) [42] trong ñó M2 là một tetramer có chức năng tạo khe H+, giúp cởi bỏ vỏ virus sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm, M1 có chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp và nảy chồi của virus. - Phân ñoạn 8 với ñộ dài tương ñối ổn ñịnh mã hoá cho 2 tiểu phần protein không cấu trúc NS1 và NS2 có chức năng: chuyển ARN từ nhân ra kết hợp với M1 kích thích phiên mã, chống interferon (Luong và Palese, 1992) [56] 2.3.2. ðặc tính kháng nguyên của virus cúm týp A Kháng nguyên của virus cúm diễn biến hết sức phức tạp do hiện tượng biến ñổi gen. Dựa trên cơ sở các loại protein kháng nguyên: protein nhân (Nucleoprotein - NP), protein Hemagglutinin (HA), protein ñệm (matrix protein M1), protein enzim cắt thụ thể Neuraminidase (NA) là những kháng nguyên có vai trò quan trọng trong miễn dịch bảo hộ và có tính ña dạng cao của virus cúm týp A nên ñược nghiên cứu nhiều nhất [68]. Một ñặc tính quan trọng của kháng nguyên virus cúm là khả năng gây ngưng kết hồng cầu của nhiều loài ñộng vật mà thực chất là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt virus với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, tạo mạng ngưng kết qua các cầu nối virus. Từ ñặc tính này có thể sử dụng các phản ứng ngưng kết hồng cầu (phản ứng HA = Hemagglutination test) trong chẩn ñoán cúm gia cầm. Sự biến ñổi trong chính nội bộ gen hay biến dị ngẫu nhiên (Drift) mà bản chất là sự thay ñổi nucleotit trong ñoạn gen là biến dị. Chính nhờ sự biến ñổi này cho phép virus cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1- H16) và biến thể gen NA (N1 – N9). Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........13 Cũng nhờ hiện tượng Drift của virus cúm có thể lý giải ñược không phải mọi H1, H5 hay Hx hoặc N1, N2 hay Nx ñều giống nhau. Sự khác nhau trong chính các Hx hay Nx do biến dị ngẫu nhiên tạo nên tính thích ứng với từng loài vật chủ khác nhau ở mỗi loại hình thức tái tổ hợp HA và NA (Suarez và cộng sự, 1998) [64] Bên cạnh hiện tượng Drift, sự biến ñổi hệ gen của virus cúm A còn diễn ra nhờ hiện tượng tái tổ hợp gen – hiện tượng Shift xảy ra khi hai hoặc nhiều virus cúm cùng nhiễm vào tế bào. Tuy chỉ xuất hiện với tần xuất thấp nhưng khi hiện tượng tái tổ hợp gen xảy ra sẽ gây ra các vụ dịch lớn cho người và ñộng vật, với mức ñộ nguy hiểm không thể lường trước ñược. Hiện tượng Shift ở virus cúm A cho thấy nguy cơ của sự lưu hành ñồng thời nhiều loại virus cúm với số lượng lớn trong cùng một không gian và thời gian kéo dài. Một ñiều nữa trong nghiên cứu về ñặc tính kháng nguyên của virus cúm là giữa các biến thể tái tổ hợp và biến chủng subtýp về huyết thanh học không hoặc rất ít có phản ứng chéo. Vì ñặc ñiểm này sẽ gây nên một trở ngại lớn cho các nghiên cứu nhằm tạo ra vacxin cúm cho người và cho ñộng vật. (Kawaoka, 1991)[50], (Ito và cộng sự, 1998) [47] Khi xâm nhiễm vào cơ thể ñộng vật, virus cúm A sẽ kích thích tạo nên các kháng thể ñặc hiệu, trong ñó quan trọng hơn cả là kháng thể kháng HA, chỉ có loại kháng thể này mới ._.có vai trò trung hoà virus cho bảo hộ miễn dịch. Một số kháng thể khác có tác dụng kìm hãm sự nhân lên của virus: Kháng thể kháng NA có tác dụng ngăn cản giải phóng virus, kháng thể kháng M2 ngăn cản chức năng protein M2 không cho quá trình bao gói virion xảy ra (Lu và cộng sự, 1999) [55] Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........14 Hình 2.6: Sơ ñồ biến dị ñiểm Hình 2.7: Sơ ñồ sự tái tổ hợp gen (shift) 2.3.3. Thành phần hóa học và sức kháng của virus Bên cạnh các ñặc tính về cấu trúc và ñặc tính kháng nguyên thành phần hóa học của virus cúm gia cầm cũng ñược nghiên cứu khá kỹ: RNA của virus chiếm 0,8 - 1,1% ; protein: 70 - 75%; Lipit: 20 - 24% và 5 - 8% hyrocacbon. Lipit tập trung ở màng virus và chủ yếu là Lipit có gốc phốt pho, số còn lại là Cholesterol, glucolipit và một ít hyrocacbon gồm có galactose, manose, ribose, fruccose. Protein của virus chủ yếu là glycoprotein. Virus cúm gia cầm có sức ñề kháng yếu và bị “chết” dễ dàng trong môi trường bên ngoài nếu như không ñược bảo vệ bằng các chất hữu cơ có trong Biến dị ñiểm H1N2 H2N2 H2N1 Kết quả: 28= 256 loại vi rút mới PB2 PB1 PA HA NA NP M Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........15 nước bọt hoặc phân. - Virus rất mẫn cảm với nhiệt ñộ: ở 4oC virus có thể tồn tại ít nhất là 35 ngày; ở 37oC virus có thể tồn tại vài ngày; ở 56oC virus có thể tồn tại vài giờ; ở 60oC virus có thể tồn tại 30 phút. - Virus dễ bị vô hoạt bởi: tia cực tím, các chất oxy hoá, sodium dodecylsunphat, lipid solvents (xà phòng); các chất tẩy trùng: Formalin và các hợp chất iod [45] - ðiểm ñẳng ñiện của virus tương ứng với pH = 5,3 ở vùng pH thấp có tính axit ñộc tính của virus giảm nhanh hơn ở khu vực kiềm. Người ta ñã phân lập ñược virus từ nước ao, hồ là nơi các loài thủy cầm sinh sống. Nếu nguồn nước này không ñược xử lý ñây sẽ là nguyên nhân lây nhiễm cho gia cầm. Trong phủ tạng gà, virus tồn tại 24-39 ngày, ánh nắng chiếu trực tiếp sống ñược 40 giờ còn chiếu thường thì sống 15 ngày (Peter van Beek, 2005) [22] 2.3.4. Quá trình nhân lên của virus. Theo Kingsburg quá trình nhân lên của virus ñược mô tả tóm tắt: Virus ñược hấp thụ vào bề mặt tế bào nhờ có receptor bản chất là glycoprotein chứa axit sialic, từ ñó virus qua màng tế bào nhờ hiện tượng ẩm bào. Trong khoảng ẩm bào khi nồng ñộ pH ñược ñiều hoà ñể giảm xuống mức thấp nhất sẽ xẩy ra sự hợp nhất giữa màng tế bào và virus. Lúc này nucleocapxit của virus ñược vận chuyển vào nhân tế bào. Nhờ hệ thống enzim sao chép của virus, ngay lập tức các sợi (-) ARN của virus ñược chuyển thành sợi (+) ARN ñể làm khuôn tổng hợp nhiều sợi (-) ARN mới là nguyên liệu của các hạt virion mới. Các sợi (-) ARN tổng hợp mới ñược bao gói trong protein M1, NS và NP. Sau ñó tổ hợp ribonucleoprotein này ñược vận chuyển qua màng nhân ra nguyên sinh chất và tiếp tục di chuyển ñến sát màng tế bào ở vị trí có sự biến Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........16 ñổi ñặc hiệu với virus. Song song với quá trình trên, một phần các sợi ARN thông tin của virus sau khi ñược sao chép trong nhân sẽ ñi ra nguyên sinh chất ñể ñiều khiển ribosom của tế bào tổng hợp nên protein cấu trúc và protein nguyên liệu. Tiếp ñó tất cả các protein cấu trúc này sẽ ñược vận chuyển xuyên qua hệ thống võng mạc nội mô (RE) và hệ thống Golgi rồi ñược cắm lên màng tế bào nhiễm. Sự kết hợp cuối cùng của tổ hợp ribonucleoprotein và các protein cấu trúc HA, NA và M2 sẽ tạo nên hạt virus hoàn chỉnh mới và theo hình thức “nảy chồi” các hạt virion sẽ giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm. Hình 2.8: Sự sao chép và tái tạo [60] 2.3.5. ðộc lực của virus ðộc lực của virus cúm gia cầm có sự dao ñộng lớn, phụ thuộc vào nhiều yếu tố mà trước hết là protein HA. Các nghiên cứu ở mức ñộ phân tử cho thấy khả năng lây nhiễm virus bị ảnh hưởng bởi tác ñộng của men proteaza của vật chủ ñến sự phá vỡ liên kết hoá học sau khi dịch mã của phân tử ngưng kết. Mà thực chất là sự cắt ñôi protein HA thành hai tiểu phần HA1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........17 và HA2, nhờ thế virus có thể xâm nhập vào tế bào. Tính thụ cảm của ngưng kết tố và sự phá vỡ liên kết của men proteaza lại phụ thuộc vào số lượng các amino axit cơ bản tại ñiểm bắt ñầu vỡ liên kết. Các enzym giống trypsin có khả năng phá vỡ liên kết khi chỉ có 1 phần tử arginin, trong khi ñó các men proteaza khác lại cần nhiều amino axit cơ bản, vì thế ñánh giá ñộc lực của virus trên cơ sở gây nhiễm cho gia cầm và sau ñó phân tích sự sắp xếp các amino axit của các virus (Cục thú y, 2004) [7]. ðể giám ñịnh ñộc lực của virus cúm người ta phân tích một yếu tố quan trọng khác mang tính chất quyết ñịnh là phân tích trình tự Nucleotit của gen HA. Về lâm sàng người ta chia virus cúm gia cầm làm 2 loại: Loại virus có ñộc lực thấp: LPAI (Low Pathogenic Avian Influenza) và loại virus có ñộc lực cao: HPAI (High Pathogenic Avian Influenza). ðể ñánh giá ñộc lực của virus cúm thuộc loại nào các nhà khoa học ñã thống nhất sử dụng phương pháp gây bệnh cho gà 4 - 6 tuần tuổi bằng cách tiêm tĩnh mạch 0,2 ml nước trứng với tỷ lệ pha loãng 1/10 ñã ñược gây nhiễm virus và chia ra 3 loại ñộc lực: - Loại virus có ñộc lực cao (HPAI): Nếu sau 10 ngày tiêm tĩnh mạch cho gà làm chết 75 - 100% gà thực nghiệm và phát triển tốt trên tế bào xơ phôi gà, tế bào thận chó trong môi trường nuôi cấy không có Trypsin. - Loại virus có ñộc lực trung bình: gây bệnh với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nhưng gây chết không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm. - Loại virus có ñộc lực thấp (LPAI): virus phát triển trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch nhưng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt và không tạo ra bệnh tích ñại thể, không làm chết gà. Tuy nhiên sự bội nhiễm vi khuẩn ñặc biệt là Steptococcuc, Staphylococcus...hoặc các bệnh khác cùng với cúm có thể làm cho bệnh gây ra do virus ñộc lực thấp trở nên ñộc hơn và gây bệnh ác Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........18 liệt hơn. Nguyên nhân là do các vi khuẩn bội nhiễm sản sinh enzim proteaza phá vỡ các liên kết của ngưng kết tố ngay cả khi không có axit amin cơ bản. (Koike, 2007) [53]. Sau ñó ñánh giá mức ñộ nhiễm bệnh của gà ñể cho ñiểm (chỉ số IVPI) ðiểm tối ña là 3 ñiểm và ñó là virus có ñộc lực cao nhất. Theo qui ñịnh của tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) thì virus cúm nào có chỉ số IVPI từ 1,2 trở lên là thuộc loại HPAI [51] Căn cứ vào tỷ lệ gây chết, triệu chứng lâm sàng, bệnh tích: 4 nhóm + Virus có ñộc lực cao (highly virulent) : gồm các virus HPAI: H5 hoặc H7 gây bệnh cho gà, tỷ lệ gây chết cao với các triệu chứng thể hiện ở hầu hết các cơ quan, trong ñó có triệu chứng thần kinh và hệ tuần hoàn. Tỷ lệ ốm và tỷ lệ chết có thể lên ñến 100% + Virus có ñộc lực vừa (moderately virulent) : tỷ lệ gây chết từ 5-97% ở gà con, gà ñẻ. Bệnh tích ñặc trưng thường gặp ở ñường hô hấp, sinh sản, thận hoặc tụy. Bệnh nặng hơn nếu như kế phát virus hoặc vi khuẩn gây bệnh khác + Virus có ñộc lực thấp (mildly virulent) : tỷ lệ gây chết thấp (<5%), có triệu chứng nhẹ ở ñường hô hấp và giảm tỷ lệ ñẻ. + Virus không có ñộc lực (avirulent) : gồm các chủng virus không gây ra dịch cúm với các triệu chứng lâm sàng và không gây chết gà. 2.4. Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm Virus cúm gia cầm có ở hầu hết khắp nơi trên thế giới trong các loại gia cầm, dã cầm và ñộng vật có vú. Virus ñược phân lập ở hầu hết các loại chim hoang dã: vịt trời thiên nga, hải âu, mòng biển và các loài vẹt, diều hâu....Tuy nhiên tần xuất và số lượng virus phân lập ñược ở loài thuỷ cầm trong ñó ñặc biệt phải kể ñến vịt trời ñều cao hơn các loài khác. Một số nghiên cứu cho thấy: - Virus cúm týp A gây bệnh chủ yếu cho gia cầm (ñặc biệt ở gà), người Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........19 và ñộng vật có vú khác. - Năm 1959, ở Scotland ñã phát hiện từ gà phân týp virus cúm H5 mà trước ñó, hầu hết các virus gây bệnh cao ñều thuộc phân týp H7. Cho ñến nay, các virus kể trên ñều thuộc phân týp H5 hoặc H7. Các virus này thường chỉ gây ra các ổ dịch lẻ tẻ, dễ bị khống chế. Trước năm 1955, gia cầm thường nhiễm chủng virus cúm có ñộc lực thấp dù ñã ñược phân lập nhưng ít ñược quan tâm như A/gà/ðức/N/49 (H10N7). - Trong những năm gần ñây, các virus như vậy ñều thấy chủ yếu trên gà tây, hiếm thấy ở gà tại hầu hết các nước phát triển chăn nuôi gia cầm công nghiệp. Tuy nhiên, các ổ dịch cúm gia cầm xảy ra nghiêm trọng lại do sự xuất hiện bất thường của một virus có ñộc lực thấp nhưng biến thể ñể trở thành một virus có ñộc lực cao gây thành bệnh cúm ñộc lực cao ở gia cầm HPAI. (Bùi Quang Anh, Văn ðăng Kỳ, 2004) [3]. - Nhiều thông báo cho rằng vịt nuôi cũng bị nhiễm virus cúm nhưng ít phát bệnh do vịt có sức ñề kháng với virus bệnh, kể cả những chủng có ñộc lực cao gây bệnh nặng cho gà, gà tây, vịt từ khi bị nhiễm ñến khi bắt ñầu thải virus trong vòng 30 ngày và tiếp tục ñược tồn tại trong số ñông vịt trời cho ñến mùa sinh sản tiếp theo ñể truyền cho con non qua ñường tiêu hoá do virus bài thải theo phân gây ô nhiễm ao hồ. Tuy nhiên, năm 1961, ở Nam phi ñã phân lập ñược virus cúm týp A (H5N1) gây bệnh cho cả gà và vịt (Cục thú y, 2004) [7]. Thực tế diễn biến dịch cúm gia cầm ở Việt Nam cho thấy vụ dịch ñầu năm 2004 và ñến nay là ngược lại vịt nuôi bị nhiễm nhiều và phát bệnh nặng với tỷ lệ chết cao 70% - 100%. Theo Lê Văn Năm (2004) [20] bệnh thường xảy ra ở gia cầm từ 4 – 66 tuần tuổi. Gia cầm dễ bị bệnh và có tỷ lệ chết cao ở những nơi bệnh phát ra lần ñầu tiên và ở gia cầm sắp ñẻ hoặc ñang ñẻ ñỉnh cao. Gia cầm càng cao sản thì khả năng mẫn cảm càng lớn với bệnh, gia cầm mái mẫn cảm hơn con trống. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........20 Phần lớn các loài gia cầm non ñều mẫn cảm với virus cúm týp A. Hiện nay ñã phân lập ñược virus cúm từ vịt bầu, ngỗng, chim cút, gà nhật, gà gô, gà lôi ... Phân týp của virus cúm týp A ñã gây dịch cho nhiều loài ñộng vật có vú như lợn, ngựa, chồn, hải cẩu và thú hoang dã ở nhiều nơi trên thế giới. 2.5. Triệu chứng lâm sàng của bệnh cúm gia cầm. Thời kỳ ủ bệnh thường ngắn từ vài giờ ñến 3 ngày, tuỳ theo số lượng virus, con ñường xâm nhập, loài cảm nhiễm gây bệnh. Một số nghiên cứu cho thấy thời gian ủ bệnh trong nhiều trường hợp có thể dài hơn ñến 7 ngày và lâu nhất có thể ñến 14 ngày (Lê Văn Năm, 2004) [20] Biểu hiện triệu chứng lâm sàng của bệnh phụ thuộc vào nhiều yếu tố: loài vật mắc và ñộc lực của virus gây bệnh, tuổi mắc và ñiều kiện môi trường, chế ñộ dinh dưỡng, tình trạng miễn dịch, sự bội nhiễm của một số vi khuẩn. Trường hợp virus gây bệnh có ñộc lực cao, gà có thể mắc và chết tới 100%. 2.5.1 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực cao (HPAI) Khi nhiễm các chủng virus ñộc lực cao (HPAI) gia cầm thường chết ñột ngột, tỷ lệ tử vong cao có khi lên ñến 100% trong vài ngày, theo Vũ Quốc Hùng, 2005 [15] khi theo dõi tỷ lệ chết của gà, ngan, vịt mắc cúm gia cầm ở Bắc Giang trong vụ dịch năm 2003 - 2005 sau 6 ngày theo dõi tỷ lệ chết ñều ñạt mức khá cao gà chết 75,59%, ngan chết cao nhất là 84,2%, ở vịt thấp nhất là 68,67%. Các triệu chứng về hô hấp thường xuất hiện ñầu tiên và khá ñiển hình như ho khẹc, hắt hơi, thở khò khè, vẩy mỏ, chảy nhiều nước mũi, nước mắt. Tiếp theo là mi mắt bị viêm, mặt phù nề, sưng mọng, mào tích dầy lên do thuỷ thũng, tím tái, có nhiều ñiểm xuất huyết. Thịt gà bị bệnh thường thâm xám, dưới da vùng chân có xuất huyết. Bên cạnh ñó con vật sốt cao, biểu hiện không bình thường ở hệ thống Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........21 tiêu hoá, sinh sản và thần kinh: Con vật giảm hoạt ñộng, giảm tiêu thụ thức ăn, gầy yếu, tăng tần số ấp bóng ở ñàn ñang ñẻ, giảm sản lượng trứng. Trường hợp nặng biểu hiện ñi lại không bình thường, run rẩy, mệt mỏi nằm li bì tụ ñống với nhau, lông xù, rối loạn thần kinh, ỉa chảy, một số con biểu hiện co giật hoặc ñầu ở tư thế không bình thường (Cục thú y, 2004) [7]. 2.5.2 Triệu chứng lâm sàng ñiển hình của bệnh cúm gia cầm chủng ñộc lực thấp (LPAI) Gia cầm bị nhiễm các chủng virus có ñộc lực yếu hơn cũng có những triệu chứng tương tự như bệnh do những chủng có ñộc lực cao gây lên, nhưng mức ñộ biểu hiện nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn. Tuy nhiên khi có sự cộng nhiễm với vi khuẩn hoặc virus khác có khả năng gây bệnh hoặc ñiều kiện môi trường bất lợi thì tỷ lệ tử vong có thể tới 60% - 70% và các triệu chứng lâm sàng cũng dần nặng hơn. 2.6. Bệnh tích Cũng như triệu chứng lâm sàng mức ñộ bệnh tích ñại thể của bệnh của bệnh cúm gia cầm cũng rất ña dạng, phụ thuộc rất nhiều vào ñộc lực của virus và quá trình diễn biến của bệnh. + Bệnh tích thường gặp: Mào và yếm (tích) sưng to, phù quanh mí mắt. Chỗ da không có lông bị tím bầm. Chân bị xuất huyết. Xuất huyết vùng ñầu và thâm tím; Niêm mạc phế quản phù nề có chứa chất nhầy; Viêm xoang bụng tích nước hoặc viêm dính; Xuất huyết ñốm ở trên bề mặt niêm mạc; Viêm xuất huyết hầu hết toàn bộ ñường tiêu hoá, ñặc biệt rõ ở manh tràng, dạ dầy tuyến nơi tiếp giáp với mề (Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2007) [6] + Các ñặc trưng về tổ chức học bao gồm: Phù nề, xung huyết, xuất huyết và thâm nhập limpho ñơn nhân ở cơ vân, cơ tim, lách, phổi, tổ chức thần kinh ñặc biệt còn gây phản ứng viêm hoại tử. Nhiều tác giả ñi sâu nghiên cứu ñã nêu lên một số khác biệt về ñặc ñiểm bệnh tích do từng chủng virus cúm gây ra. Khi bị nhiễm H5N9 sẽ có Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........22 xuất hiện hoại tử nặng ở hệ lâm ba và ñốm hoại tử ở lách nhưng khi nhiễm H5N2, H5N1 lại không có hoại tử nặng ở hệ lâm ba. Gia cầm nhiễm H5N3 xuất hiện hoại tử cơ tim, viêm cơ tim trong bệnh tích. Những chủng virus gây ra các triệu chứng thần kinh thì bệnh tích thấy mạch vành sưng, hoại tử các tế bào thần kinh mà ít thấy tụ huyết, xuất huyết ở các mô thần kinh. 2.7 Chẩn ñoán bệnh cúm gia cầm Việc chẩn ñoán cúm gia cầm do nhiễm virus týp A chủ yếu là phải phân lập và ñịnh danh virus kết hợp với chẩn ñoán dựa trên triệu chứng lâm sáng, xác ñịnh bệnh tích ñại thể, vi thể và dịch tễ học với một số phản ứng huyết thanh học theo chẩn ñoán thường quy của Trung Tâm chẩn ñoán thú y trung ương – Cục thú y, sơ ñồ chẩn ñoán phòng thí nghiệm của bênh cúm gia cầm hiện nay như sau: Xét nghiệm nhanh: BD Dir hoặc Quickvue Bệnh phẩm Phủ tạng: Phổi, khí quản, gan,.. Huyết thanh Dịch họng, ổ nhớp Tìm kháng thể cúm Phân lập virus: trên trứng hoặc tế bào Giám ñịnh Huyết thanh học Rt - pcr Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........23 * Phân lập virus. Là một chẩn ñoán cơ bản, có ý nghĩa quyết ñịnh. ðể phân lập virus thường sử dụng mẫu bệnh phẩm là phổi, khí quản, não, lách. Việc phân lập ñược thực hiên trên môi trường tế bào thận chó (Madin – Darby Canine Kidney Cell - MDCK) hoặc trên phôi trứng gà. * Phân lập virus trên môi trường tế bào. ðể có thể lây nhiễm bệnh phẩm môi trường tế bào trước hết phải thực hiện nuôi cấy trên chai T–25 trong môi trường phát triển tế bào với các hoá chất nguyên liệu cần thiết. Sau khi thảm tế bào mọc từ 90% trở lên sau 24-72 giờ có thể sử dụng ñể phân lập virus bằng việc tiêm truyền huyễn dịch bệnh phẩm ñã ñược xử lý kháng sinh hoặc qua lọc lên bề mặt tế bào. Quá trình lây nhiễm bệnh phẩm ñược bổ sung môi trường nuôi cấy virus (D – MEM với TCPK treaed trypsin) trong tủ ấm CO2. Tiến hành quan sát bệnh tích tế bào (CPU) hàng ngày. Có thể sử dụng phản ứng HA ñể kiểm tra bằng cách thu hoạch dịch nổi trong chai tế bào ñã cấy virus sau 1-7 ngày. Nếu âm tính có thể cấy chuyển trên tế bào thêm 2-3 lần, mẫu phân lập trên tế bào ñược bảo quản trong tủ âm 700C (-700C). * Phân lập virus trên phôi trứng. Tiêm 0,1 - 0,3ml nước bệnh phẩm vào túi niệu của phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, hàn kín, mỗi mẫu bệnh phẩm tiêm cho 3 trứng và tiếp tục cho ấp ở nhiệt ñộ 370C trong 7 ngày. Một số ít chủng virus có ñộc lực cao có thể gây chết phôi khoảng 18-24 giờ trứng thu hoạch ñể ở nhiệt ñộ 40C qua một ñêm. Virus nhân lên trong nước trứng có hiện tượng ngưng kết hồng cầu gà. Nếu không gây ngưng kết hồng cầu thì có thể lấy nước trứng thu ñược tiêm lần 2 cho phôi gà. Phần lớn các phôi bị tạp khuẩn sẽ chết trước 24 giờ phải bỏ ñi. Những phôi sống sau 24h tiếp tục ñược theo dõi ñến 72h. Lấy nước phôi từ Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........24 những phôi chết trong khoảng 48h và sau 48h hoặc từ phôi chưa chết ñến 72h vào việc giám ñịnh virus. ðây là khoảng thời gian mà số lượng virus cúm (nếu có) ñã ñạt ñến mức lý tưởng. (Trước khi thu hoạch nước trứng phải cất trứng vào tủ lạnh 40 C trong 4 giờ hoặc ñể tủ ấm trong 20 phút ở nhiệt ñộ - 200C. Nước trứng (nước niệu mô phôi trứng) ñược cho vào ống nghiệm 10 ml và bảo quản trong tủ âm -700C.) Mẫu phân lập ñược kiểm tra bằng phản ứng HA nếu âm tính có thể cấy chuyển trên phôi trứng gà thêm 2-3 ñợt. * ðịnh danh virus. Sau khi phân lập ñược virus từ môi trường tế bào hoặc trên phôi trứng gà, có thể giám ñịnh virus bằng các HI test ñể giám ñịnh subtype H; NI test ñể xác ñịnh subtype N hoặc bằng phương pháp RT – PCR ñể xác ñịnh subtype H, N. 2.8. Miễn dịch cúm gia cầm Miễn dịch là khả năng của cơ thể nhận ra và loại thải các vật lạ ra khỏi cơ thể (Vũ Triệu An, 1997) [1]. Khi một kháng nguyên (vi khuẩn, virus) xâm nhập vào cơ thể, cơ thể sẽ ñáp ứng lại bằng ñáp ứng miễn dịch, khả năng này phải nhờ hệ miễn dịch của cơ thể; bao gồm miễn dịch không ñặc hiệu (miễn dịch tự nhiên) và miễn dịch ñặc hiệu. ðáp ứng miễn dịch ñặc hiệu có thể là ñáp ứng miễn dịch dịch thể, tạo ra kháng thể dịch thể, là các lớp glubulin miễn dịch (Ig), hoặc ñáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào tạo ra các lympho T mẫn cảm hoặc là cả hai. ðây là các kháng thể chủ ñộng, là cơ sở tạo ra miễn dịch chủ ñộng cho cơ thể. Với virus cúm gia cầm khi vào cơ thể sẽ kích thích sinh ra ñáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào và ñáp ứng miễn dịch dịch thể. Sau khi virus nhược ñộc vào cơ thể chỉ sau 2-3 ngày ñáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào ñã xuất hiện. Chính nhờ có quá trình ñáp ứng miễn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........25 dịch này ta có thể giải thích ñược khả năng bảo hộ của gia cầm với virus cường ñộc có ñược trước khi kháng thể dịch thể xuất hiện. Trong quá trình ñáp ứng miễn dịch dịch thể với virus cúm gia cầm, sự hình thành kháng thể cũng tuân theo quy luật chung. Khi virus cúm gia cầm vào cơ thể kháng thể không sinh ra ngay lập tức mà phải có một thời gian tiềm tàng, từ sau 6-10 ngày kháng thể mới xuất hiện, lượng kháng thể tăng dần ñạt mức cao nhất sau khoảng 3 - 4 tuần rồi lượng kháng thể giảm dần và biến mất sau một thời gian, thời gian tồn tại của kháng thể dài hay ngắn, lượng kháng thể ñược sản xuất nhiều hay ít phụ thuộc vào chủng virus. Kháng thể cúm gia cầm chỉ tồn tại trong cơ thể thời gian rồi bị ñảo thải, nên khi lượng kháng thể giảm xuống phải tiêm nhắc lại ñể tạo trạng thái miễn dịch cao cho cơ thể. Ở bệnh cúm gia cầm, virus vào cơ thể lần ñầu sẽ gây ra ñáp ứng miễn dịch sơ cấp. Trong quá trình ñáp ứng miễn dịch này, lớp kháng thể tạo ra ban ñầu chủ yếu là IgM, sau ñó là lớp IgY ñược tạo ra yếu hay trung bình. Khi virus vào lần sau sẽ gây ra ñáp ứng miễn dịch thứ cấp, trong ñáp ứng miễn dịch này lớp kháng thể ñược tạo ra chủ yếu là IgY còn lớp IgM chỉ có số lượng rất ít. Cùng với các lớp glubulin miễn dịch có trong huyết thanh do tương bào của tổ chức lympho hạch, lách sản xuất ra còn có vai trò quan trọng của các lớp glubulin miễn dịch cục bộ do các tương bào của tổ chức lympho dưới niêm mạc tiết ra ñổ vào màng nhầy ñệm ở ñường hô hấp trên, ñường tiêu hoá của gà, tạo miễn dịch cục bộ cho cơ thể. Thành phần của lớp glubulin miễn dịch này chủ yếu là lớp IgA tiết ngoài ra còn có một ít là lớp IgY. Trong ñáp ứng tiên phát mức ñộ kháng thể trong máu tăng chậm và giảm nhanh. ðáp ứng miễn dịch thứ phát xuất hiện khi virus vào lần sau tiếp xúc với kháng nguyên cùng loại lần sau. ðáp ứng miễn dịch lần này nhanh, mạnh hơn lần thứ nhất rất nhiều và lớp kháng thể thường là IgY. Trong lần ñầu tiếp Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........26 xúc với kháng nguyên thì các tế bào có thẩm quyền miễn dịch biệt hóa ñể trở thành 2 loại: 1 loại tế bào trực tiếp sản xuất ra kháng thể và 1 loại tế bào có trí nhớ miễn dịch. Khi kháng nguyên vào lần sau và tiếp xúc với tế bào nhớ miễn dịch thì chúng chỉ việc nhớ lại và tiết kháng thể. Kháng thể ñược sản xuất ra nhanh hơn, nhiều hơn và ñáp ứng miễn dịch kéo dài hơn với ñáp ứng miễn dịch tiên phát. Cơ thể gia cầm tạo ñược trạng thái miễn dịch ñối với kháng nguyên và trí nhớ miễn dịch ñược duy trì. 2.8.1 Miễn dịch không ñặc hiệu Bất cứ một tác nhân nào muốn xâm nhập vào cơ thể thì phải qua hàng rào bảo vệ cơ thể hay ñó chính là hệ thống miễn dịch không ñặc hiệu. Gia cầm có cơ chế phòng chống tự nhiên rất phát triển. Hệ thống miễn dịch không ñặc hiệu bao gồm: Da, niêm mạc, dịch tiết các tuyến, gan, lách, thận, mảng payer, phản ứng viêm, tế bào thực bào, các kháng thể tự nhiên không ñặc hiệu (bổ thể, propecdin, lyzozim, và opsonin). 2.8.2. Miễn dịch ñặc hiệu Cũng như các bệnh truyền nhiễm khác miễn dịch chống bệnh cúm gia cầm gồm nhiều loại nhưng chúng tôi chỉ xin ñề cập miễn dịch ñặc hiệu tiếp thu chủ ñộng và tiếp thu bị ñộng - ñây là hai loại miễn dịch ñóng vai trò chủ ñạo. Miễn dịch bị ñộng Ở gia cầm non hệ thống miễn dịch chưa phát triển hoàn thiện vì vậy ngay từ lúc sơ sinh cơ thể của chúng hoàn toàn không có khả năng chống lại tác nhân gây bệnh một cách chủ ñộng và ñặc hiệu. Trạng thái miễn dịch ñặc hiệu chỉ có thể có ñược khi cơ thể gia cầm mẹ có miễn dịch và truyền kháng thể ñặc hiệu cho con non qua lòng ñỏ trứng. ðây là kháng thể thụ ñộng, là cơ sở tạo nên miễn dịch thụ ñộng ở gia cầm con. Ở gia cầm con 1 ngày tuổi trong máu có kháng thể cúm gia cầm kháng thể này không tự bản thân gia cầm con sinh ra mà chúng ñược thừa hưởng từ gia cầm mẹ có miễn dịch truyền qua Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........27 lòng ñỏ trứng. Kháng thể thụ ñộng thuộc lớp IgY, ở gia cầm có miễn dịch lớp kháng thể này ñược truyền theo ñường máu tới ống dẫn trứng, qua lớp biểu mô ñi vào túi lòng ñỏ của quả trứng trong giai ñoạn ñang hình thành. ðến ngày thứ 11 sau khi ấp phôi ñã phát triển, kháng thể từ lòng ñỏ trứng qua nội bì vào máu của gia cầm con và tồn tại trong một thời gian. Lượng kháng thể thụ ñộng trong huyết thanh gia cầm con có liên quan ñến kháng thể có trong lòng ñỏ trứng và trong huyết thanh của gia cầm mẹ. Ở gia cầm mẹ lượng kháng thể có trong huyết thanh cao hơn một ít so với lượng kháng thể có trong lòng ñỏ trứng. Người ta có thể sử dụng kháng thể trong lòng ñỏ trứng ñể thay thế cho kháng thể có trong huyết thanh. Trong huyết thanh gia cầm con có lượng kháng thể thụ ñộng thấp hơn so với lượng kháng thể của gia cầm mẹ và trong lòng ñỏ trứng. Kháng thể này có xu hướng giảm dần cứ sau 4-5 ngày lượng kháng thể lai giảm ñi một nửa, thời gian tồn tại ngắn từ 15-24 ngày, tuy thời gian tồn tại ngắn nhưng có khả năng bảo hộ cho gia cầm trong những ngày tuổi ñầu. Tuy vậy, khi dùng vacxin lần ñầu tạo miễn dịch chủ ñộng cho gia cầm thì kháng thể thụ ñộng sẽ trung hoà một lượng virus vacxin. Miễn dịch chủ ñộng Miễn dịch chủ ñộng ñối với bệnh cúm gia cầm là loại miễn dịch thu ñược sau khi gia cầm mắc bệnh khỏi hoặc sau khi làm vacxin. Vacxin sau khi vào cơ thể ñược ñưa ñến các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch như: hạch, lách, tổ chức lympho dưới niêm mạc kích thích sản sinh ra các kháng thể ñặc hiệu (kháng thể dịch thể và kháng thể tế bào). Trong quá trình sử dụng vacxin, khả năng tạo miễn dịch chủ ñộng của ñàn gia cầm chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như kháng thể thụ ñộng, lượng kháng nguyên khi sử dụng, yếu tố dinh dưỡng ... ðây là cơ sở chính của việc tiêm phòng vacxin cúm mũi 1 và nhắc lại Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........28 mũi 2 ở gia cầm. Vacxin có thể giảm sự nghiêm trọng của bệnh và sự lan truyền của virus trong thực tế, nhưng virus có thể sẽ không bị loại hoàn toàn khỏi ñàn gia cầm (Alexander et al 1996) [30] 2.8.3. Một số phương pháp ñánh giá ñáp ứng miễn dịch cúm gia cầm Mức ñộ ñáp ứng miễn dịch cúm của gia cầm có thể ñược ñánh giá bằng phương pháp huyết thanh học và công cường ñộc. Khả năng bảo hộ của cơ thể chống virus cường ñộc có mối tương quan với hiệu giá kháng thể, có thể sử dụng phản ứng huyết thanh học ñể ñánh giá mức ñộ ñáp ứng miễn dịch của gia cầm như phản ứng AGID, phản ứng ELISA và phản ứng HI. Trong ñó phản ứng HI ñược sử dụng rộng rãi trong các phòng thí nghiệm, phương pháp công cường ñộc ñược sử dụng với mục ñích xác ñịnh mức ñộ ñáp ứng miễn dịch của cơ thể sau khi sử dụng vacxin. Phương pháp công cường ñộc ñánh giá ñúng mức ñộ bảo hộ của ñàn gia cầm nhưng do một số khó khăn, ñặc biệt là vấn ñề dịch bệnh nên không phải lúc nào phương pháp này cũng ñược sử dụng (Bell, 1991) [31] 2.9. Vacxin 2.9.1. Sự cần thiết của tiêm vacxin phòng bệnh cúm gia cầm. Trong thực tế sản xuất, có nhiều nguyên nhân khác nhau làm cho các biện pháp an toàn sinh học không ñủ mạnh ñể khống chế sự lây lan của các chủng virus ñộc lực cao hoặc xuất hiện kẽ hở nào ñó mà bệnh có nguy cơ xâm nhập vào ñàn gây bệnh. Do ñó việc sử dụng vacxin là một giải pháp có ích làm giảm thiệt hại kinh tế và góp phần khống chế bệnh có hiệu quả. Quan ñiểm OIE: Sử dụng vacxin trong phòng bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao là biện pháp hỗ trợ song song với các biện pháp tổng hợp khác như tiêu huỷ gia cầm bị nhiễm bệnh, an toàn sinh học, kiểm soát vận chuyển Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........29 và theo OIE sử dụng vacxin là dập dịch, hạn chế thiệt hại trực tiếp hạn chế sự lây lan của virus. Cuộc họp liên ngành của OIE, FAO, WHO tại Rome tháng 2 năm 2004 ñã chỉ ra ñối với cúm gia cầm việc sử dụng vacxin như một giải pháp, một công cụ tích cực ñể ngăn chặn, khống chế và tiến ñến thanh toán bệnh cúm gia cầm ở vùng bảo vệ. Vacxin nên ñược sử dụng thành một chiến lược toàn diện phòng chống dịch cúm gia cầm, bao gồm năm công ñoạn là: An toàn sinh học, năng cao nhận thức của người dân, giám sát và chẩn ñoán, loại bỏ gia cầm bị nhiễm virus và sử dụng vacxin. Quan ñiểm của Trung Quốc: Trung Quốc tuân thủ các nguyên tắc phòng chống dịch cúm gia cầm của OIE khi dịch nổ ra. Trung Quốc còn cho việc sử dụng vacxin nhằm mục ñích phòng bệnh. ðiều ñó xuất phát từ cơ sở Trung Quốc là nước có lượng thuỷ cầm chiếm ñại ña số trên thế giới, do vậy nếu tiêu huỷ các ñàn gia cầm có kháng thể kháng lại virus cúm gia cầm thì thiệt hại sẽ rất lớn. Trung Quốc sử dụng các biện pháp ñồng bộ song song với việc sử dụng vacxin trong toàn quốc nhằm khống chế các ổ dịch xảy ra và phòng lây lan từ nước ngoài, từ ñịa phương có dịch sang ñịa phương khác. Theo Ilaria Capua và Stefano Marangon (2004) [47], một số vacxin phòng bệnh cúm gia cầm hiện nay: Phòng hộ bệnh cúm gia cầm là kết quả của ñáp ứng miễn dịch chống lại protein Haemaglutinin (HA) mà hiện nay ñã xác ñịnh ñược 16 subtýp khác nhau từ H1-H16 và ở mức ñộ nào ñó chống lại protein Neuraminidae (NA) mà ñã xác ñịnh ñược 9 subtýp từ N1-N9. Các ñáp ứng miễn dịch kháng lại protein bên trong như Nucleoprotein (NP) và protein Matrix (M) của virus ñã ñược chứng minh là không ñủ ñể tạo phòng hộ trên thực ñịa. Vì vậy không có 1 vacxin nào chung cho tất cả các virus cúm gia cầm. Trong thực tế sự phòng hộ ñược tạo ra nhờ các subtýp Haemaglutinin có trong vacxin. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ...........30 2.9.2 Vacxin vô hoạt ñồng chủng: Ban ñầu ñược sản xuất như các vacxin tự phát (autogenous), nghĩa là vacxin chứa cùng những virus cúm giống như chủng gây bệnh trên thực ñịa. Loại vacxin này ñược sử dụng rộng rãi ở Mehico và Pakistan. Một trong những vacxin thuộc loại này ñang ñược sử dụng hiện nay là của Aventis Pasteur, Nobilis và Weike Harbin. Nhược ñiểm của vacxin này là không phân biệt gia cầm ñược tiêm chủng với gia cầm nhiễm virus thực ñịa qua kiểm tra kháng thể. 2.9.3 Vacxin vô hoạt dị chủng: Vacxin này ñược sản xuất tương tự như vacxin vô hoạt ñồng chủng. ðiểm khác biệt là chủng virus sử dụng trong vacxin có kháng nguyên H giống chủng virus trên thực ñịa còn kháng nguyên N dị chủng. Khi nhiễm virus trên thực ñịa bảo hộ lâm sàng và giảm thải trừ virus ra ngoài môi trường ñược ñảm bảo bằng phản ứng miễn dịch sản sinh bởi kháng nguyên nhóm H ñồng chủng, trong khi kháng thể chống N sản sinh bởi virus thực ñịa có thể sử dụng như chất ñánh dấu sự lây nhiễm trên thực ñịa. Vacxin dị chủng mức ñộ bảo hộ không tỉ lệ chặt chẽ với mức ñộ ñồng chủng giữa gen ngưng kết tố hồng cầu trong vacxin và chủng trên thực ñịa. ðây là một ưu ñiểm lớn cho phép thành lập ngân hàng vacxin bởi vì giống gốc không chứa virus có mặt trên thực ñịa. Loại vacxin này ñược sử dụng rộng rãi ở Trung Quốc, một số nước châu Mỹ, châu Âu. Ở Việt Nam hiện nay ñang sử dụng vacxin cúm vô hoạt dị chủng với chủng H5N2 và vacxin cúm vô hoạt ñồng chủng với chủng H5N1 nhập từ Trung Quốc, Hà Lan. 2.9.4 Vacxin tái tổ hợp: ðể kịp thời có vacxin tiêm chủng phòng bệnh cho vật nuôi thì chiến lược sản xuất vacxin virus tái tổ hợp là một phương thức hiệu quả: một vài loạ._. i t iê m v a cx in 1 th án g) H iệ u gi á H I ( lo g 2 ) H I 4 ≥ lo g 2 ð àn Tu ổi n ga n dù n g v ac x in (ng ày ) Th ời gi an sa u dù n g v ac x in (ng ày ) Số m ẫu ki ểm tr a (n) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 H I ( X x m ± ) (lo g 2 ) Tỷ lệ có kt (% ) Số m ẫu Tỷ lệ (% ) 14 10 3 3 3 1 4, 20 ± 0, 31 10 0 7 70 21 10 4 2 2 1 1 5, 30 ± 0, 38 10 0 10 10 0 ð àn 1 35 35 10 1 4 2 2 1 4, 80 ± 0, 38 10 0 9 90 14 10 2 4 3 1 4, 30 ± 0, 40 10 0 8 80 21 10 2 3 2 2 1 5, 70 ± 0, 22 10 0 10 10 0 ð àn 2 42 35 10 1 3 2 3 1 5, 00 ± 0, 31 10 0 9 90 14 10 1 5 3 1 4, 40 ± 0, 60 10 0 9 90 21 10 2 3 2 2 1 5, 70 ± 0, 22 10 0 10 10 0 ð àn 3 49 35 10 4 2 2 2 5, 20 ± 0, 31 10 0 10 10 0 Tr ư ờ n g ð ạ i h ọ c N ôn g n gh iệ p H à N ộ i – Lu ậ n vă n th ạ c sĩ n ôn g n gh iệ p . . . . . . . . . . . 65 Bả n g 4. 9. H àm lư ợ n g kh án g th ể củ a n ga n kh i s ử dụ n g v a cx in cú m H 5N 1 lầ n 2 (n ở từ tr ứ n g củ a ñà n n ga n m ẹ sa u kh i t iê m v a cx in 3 th án g) H iệ u gi á H I ( lo g 2 ) H I 4 ≥ lo g 2 ð àn Tu ổi n ga n dù n g v ac x in (ng ày ) Th ời gi an sa u dù n g v ac x in (ng ày ) Số m ẫu ki ểm tr a (n) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 H I ( X x m ± ) (lo g 2 ) Tỷ lệ có kt (% ) Số m ẫu Tỷ lệ (% ) 14 10 3 3 3 1 4, 20 ± 0, 31 10 0 7 70 21 10 3 4 2 1 5, 10 ± 0, 40 10 0 10 10 0 ð àn 4 35 35 10 1 3 4 2 4, 70 ± 0, 40 10 0 9 90 14 10 3 3 3 1 4, 20 ± 0, 31 10 0 7 70 21 10 3 4 2 1 5, 50 ± 0, 18 10 0 10 10 0 ð àn 5 42 35 10 1 3 4 2 4, 90 ± 0, 31 10 0 9 90 14 10 3 3 3 1 4, 10 ± 0, 40 10 0 7 70 21 10 2 3 3 2 5, 40 ± 0, 31 10 0 10 10 0 ð àn 6 49 35 10 1 3 3 2 1 4, 80 ± 0, 31 10 0 9 90 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 66 - ðàn 3: Sau khi dùng vacxin lần 2 ở 49 ngày tuổi ñược 14 ngày hàm lượng kháng thể HI bình quân ñạt cao 4,40 log2 với 100% số mẫu có kháng thể và 9/10 mẫu có HI ≥ 4 log2 ñạt 90% số mẫu có khả năng bảo hộ cho ñàn ngan; sau 21 ngày ñạt 5,7 log2 với 100% số mẫu có kháng thể và 100% số mẫu có HI ≥ 4 log2 ñạt bảo hộ; sau 35 ngày sử dụng vacxin HI bình quân giảm ñi còn 5,2 log2 với 100% số mẫu ñạt bảo hộ. * Qua bảng 4.9 cho chúng ta thấy: - Ở ñàn ngan 4: Sau khi dùng vacxin lần 2 ở 35 ngày tuổi với 10 mẫu kiểm tra ở 14 ngày sau khi dùng vacxin hàm lượng kháng thể HI bình quân ñạt cao 4,2 log2 với 100% số mẫu có kháng thể và 9/10 mẫu có HI ≥ 4 log2 ñạt 90% số mẫu có khả năng bảo hộ cho ñàn ngan; sau 21 ngày sử dụng vacxin HI bình quân ñạt 5,1 log2 với 100% số mẫu có kháng thể và 100% số mẫu có HI ≥ 4 log2 ñạt bảo hộ; sau 35 ngày sử dụng vacxin HI bình quân còn 4,7 log2 với 90% số mẫu ñạt bảo hộ. - ðàn 5: Vacxin lần 2 tiêm ở 42 ngày tuổi khi kiểm tra 10 mẫu cho thấy hàm lượng kháng thể HI bình quân ñạt cao sau 21 ngày sử dụng vacxin, HI bình quân ñạt 5,50 log2 với 100% số mẫu có HI ≥ 4 log2 ñạt bảo hộ; sau 35 ngày sử dụng vacxin số mẫu vẫn ñạt tỷ lệ bảo hộ là 90,0%. - Ở thời ñiểm 49 ngày tuổi làm vacxin lần 2 ở ñàn 6 số mẫu có khả năng bảo hộ cho ñàn ngan sau 21 ngày là 100%; sau 35 ngày sử dụng vacxin HI bình quân còn 4,8 log2 với 9/10 mẫu có HI ≥ 4 log2 tương ñương với 90,0% số mẫu ñạt bảo hộ. * Với các ñàn ngan con nở từ ñàn ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 5 tháng, chúng tôi tiến hành dùng vacxin lần 2 vào lúc 35 và 42 ngày tuổi. - ðàn 7: Ở 14 ngày sau khi dùng vacxin cúm lần 2 hàm lượng kháng thể HI bình quân ñạt 4,1 log2 với 100% số mẫu có kháng thể và 7/10 mẫu có HI ≥ 4 log2 ñạt 70 % số mẫu có khả năng bảo hộ cho ñàn ngan; sau 21 ngày sử dụng vacxin HI bình quân tăng lên 5,1 log2 và 100% số mẫu ñạt bảo hộ. Kiểm tra thời ñiểm sau khi làm vacxin 35 ngày tỷ lệ bảo hộ vẫn ñạt 90%. Tr ư ờ n g ð ạ i h ọ c N ôn g n gh iệ p H à N ộ i – Lu ậ n vă n th ạ c sĩ n ôn g n gh iệ p . . . . . . . . . . . 67 Bả n g 4. 10 . H àm lư ợn g kh án g th ể củ a n ga n kh i s ử dụ n g v a cx in cú m H 5N 1 lầ n 2 (n ở từ tr ứ n g củ a ñà n n ga n m ẹ sa u kh i t iê m v a cx in 5 th án g) H iệ u gi á H I ( lo g 2 ) H I 4 ≥ lo g 2 ð àn Tu ổi n ga n dù n g v ac x in (ng ày ) Th ời gi an sa u dù n g v ac x in (ng ày ) Số m ẫu ki ểm tr a (n) 0 1 2 3 4 5 6 7 8 H I ( X x m ± ) (lo g 2 ) Tỷ lệ có kt (% ) Số m ẫu Tỷ lệ (% ) 14 10 3 4 2 1 4, 10 ± 0, 40 10 0 7 70 21 10 3 4 2 1 5, 10 ± 0, 40 10 0 10 10 0 28 10 1 3 2 3 1 5, 00 ± 0, 31 10 0 9 90 ð àn 7 35 35 10 1 3 3 2 1 4, 90 ± 0, 31 10 0 9 90 14 10 3 4 2 1 4, 10 ± 0, 82 10 0 7 70 21 10 3 3 3 1 5, 2 ± 0, 31 10 0 10 10 0 28 10 1 2 3 3 1 5, 1 ± 0, 31 10 0 9 90 ð àn 8 42 35 10 1 4 3 2 4, 6 ± 0, 40 10 0 9 90 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 68 - Ở ñàn ngan 8 sau khi dùng vacxin cúm lần 2 ñược 14 ngày, hàm lượng kháng thể HI bình quân ñạt 4,10 log2 với 100% số mẫu có kháng thể và 7/10 mẫu có HI ≥ 4 log2 ñạt 70 % số mẫu có khả năng bảo hộ cho ñàn ngan; sau 21 ngày HI bình quân tăng lên 5,2 log2 và 100% số mẫu ñạt bảo hộ; sau 35 ngày sử dụng vacxin HI bình quân giảm ñi còn 4,6 log2 với 9/10 mẫu có HI ≥ 4 log2 tương ñương với 90,0% số mẫu ñạt bảo hộ. Kết quả trên cho thấy ở ñàn ngan con sau khi sử dụng vacxin cúm H5N1 ñược 28 ngày, dùng tiếp vacxin cúm lần 2 cả 8 ñàn ngan thí nghiệm ñều cho khả năng bảo hộ cao với bệnh (sau khi dùng vacxin 35 ngày tỷ lệ bảo hộ vẫn còn ñạt 90-100%). Như vậy theo chúng tôi sau khi sử dụng vacxin cúm H5N1 ñược 28 ngày, dùng tiếp vacxin cúm lần 2 cho ñàn ngan. 4.4. Kết quả xác ñịnh hiệu lực của vacxin cúm H5N1 trên ñàn ngan bằng phương pháp công cường ñộc Khi sử dụng vacxin cho ñộng vật sẽ kích thích cơ thể sản sinh kháng thể ñặc hiệu, ñây là cơ sở tạo ra miễn dịch cho cơ thể bảo hộ với bệnh. Hiệu lực của một vacxin khi sử dụng ñược ñánh giá dựa vào khả năng bảo hộ với bệnh của vật. Mức ñộ bảo hộ với bệnh của ngan sau khi dùng vacxin cúm H5N1 ñược ñánh giá chính xác bằng phương pháp công cường ñộc cho ngan, phương pháp này có một số khó khăn nhất là vấn ñề dịch bệnh nên không phải lúc nào cũng sử dụng ñược. Ở bệnh cúm gia cầm, khả năng bảo hộ cho cơ thể trước sự tấn công của virus cường ñộc có liên quan ñến sự có mặt của kháng thể trung hoà, hàm lượng kháng thể này thương ñược xác ñịnh dựa vào hiệu giá của phản ứng HI. Vì vậy sau khi sử dụng vacxin cúm H5N1 cho ngan, chúng tôi ñã tìm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 69 hiểu hiệu lực của vacxin cúm H5N1 ở ñàn ngan bằng phương pháp công cường ñộc, ñồng thời có thể biết ñược mối tương quan giữa hiệu giá HI với mức ñộ bảo hộ chống virus cúm cường ñộc H5N1 ở ngan. Thí nghiệm ñược tiến hành trên ñàn ngan Pháp, chia làm 2 nhóm: - Nhóm ngan ñược dùng 2 lần vacxin cúm H5N1: ở thời ñiểm 14, 42 ngày tuổi, sau 21 ngày dùng vacxin lần 2 (lúc ngan 63 ngày tuổi) lấy máu làm phản ứng HI ñể xác ñịnh hàm lượng kháng thể cúm H5N1 dựa vào hiệu giá của phản ứng HI. - Nhóm ngan ñối chứng không dùng vacxin cúm H5N1 và có phản ứng HI âm tính. Dùng virus cúm cường ñộc: Virus H5N1 (A/chicken/Vietnam/NCVD/029) thể ñộc lực cao thuộc phân nhánh HA clade 2.3.4 cho toàn bộ số ngan thí nghiệm với liều virus dùng cho công cường ñộc là 106TCID50/ml/con, theo dõi trong thời gian 12 ngày, những ngan còn sống sót sau khi công sẽ lấy máu kiểm tra hàm lượng kháng thể bằng phản ứng HI. Những ngan sống và chết ñược mổ khám kiểm tra bệnh tích. Kết quả thu ñược ñược trình bày ở bảng 4.11; 4.12; 4.13. Kết quả ở bảng 4.11 cho thấy: Ở lô ngan ñã ñược dùng vacxin có hiệu giá kháng thể cúm HI dao ñộng từ 3 log2 ñến 7 log2. Sau khi công virus cúm cường ñộc sau 12 ngày cả 10 ngan thí nghiệm vẫn sống bình thường tỷ lệ bảo hộ 100%. Hiệu giá kháng thể cúm HI dao ñộng từ 5 log2 ñến 10 log2. Tr ư ờ n g ð ạ i h ọ c N ôn g n gh iệ p H à N ộ i – Lu ậ n vă n th ạ c sĩ n ôn g n gh iệ p . . . . . . . . . . . 70 Bả n g 4. 11 . K ết qu ả x ác ñị n h hi ệu lự c củ a v a cx in cú m H 5N 1 tr ên ñ àn n ga n bằ n g ph ư ơ n g ph áp cô n g cư ờ n g ñ ộc K ết qu ả cô n g cư ờn g ñộ c ð ối tư ợn g n gh iê n cứ u Số n ga n th eo dõ i ( co n ) Th ứ tự n ga n th eo dõ i H iệ u gi á H I ( lo g 2 ) tr ướ c kh i c ôn g N ga n ch ết N ga n số n g H iệ u gi á H I ( lo g 2 ) sa u kh i c ôn g 1 3 0 B ìn h th ườ n g 5 2 4 0 B ìn h th ườ n g 6 3 4 0 B ìn h th ườ n g 7 4 5 0 B ìn h th ườ n g 6 5 5 0 B ìn h th ườ n g 7 6 5 0 B ìn h th ườ n g 7 7 6 0 B ìn h th ườ n g 8 8 6 0 B ìn h th ườ n g 8 9 7 0 B ìn h th ườ n g 9 N ga n dù n g v ac x in 10 10 7 0 B ìn h th ườ n g 10 N ga n kh ôn g dù n g v ac x in 5 0 5 0 0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 71 Trong khi ñó ở lô ngan ñối chứng không dùng vacxin, có hiệu giá HI =0 sau khi công cường ñộc 3 ñến 7 ngày cả 5 ngan ñối chứng ñều chết, tỷ lệ bảo hộ là 0%. Như vậy, vacxin cúm H5N1 sau khi sử dụng cho ñàn ngan có khả năng bảo hộ cao. Những ngan có hiệu giá HI ≥ 4 log2 ñều có khả năng bảo hộ với bệnh cúm gia cầm như khuyến cáo của OIE. Trong thí nghiệm của chúng tôi có 1 ngan hiệu giá HI trước khi công virus cường ñộc = 3 log2 nhưng vẫn có khả năng bảo hộ cho ñàn ngan ngoài vai trò của kháng thể dịch thể ñặc hiệu có lẽ còn liên quan ñến kháng thể tế bào. * Kết quả theo dõi về triệu chứng Sau khi tiến hành công cường ñộc, chúng tôi thấy ở nhóm ngan ñối chứng sau khi công 2 ngày, cả 5 ngan có biểu hiện ủ rũ, bỏ ăn, ỉa phân xanh, có triệu chứng thần kinh ñầu nghẹo ủ rũ, ñầu cổ thõng xuống ñất, sau 3 ngày có 1 ngan chết, 4 ngày có 2 ngan chết và sau 7 ngày 100 % ngan chết. Tỷ lệ bảo hộ 0 % (bảng 4.12) Trong khi ñó ở nhóm ngan thí nghiệm (có hiệu giá HI 3 log2 - 7 log2), sau khi công virus cường ñộc ngan ăn uống bình thường và HI bình quân sau khi công tăng lên từ 5 log2-10 log2. Toàn bộ số ngan thí nghiệm sau khi công 12 ngày không chết hoàn toàn khỏe mạnh, ăn uống bình thường, tỷ lệ bảo hộ 100% sau 12 ngày công cường ñộc. Từ kết quả nghiên cứu chúng tôi nhận thấy, ngan mắc bệnh cúm gia cầm cũng có những triệu chứng ñặc trưng của bệnh cúm gia cầm ñó là những triệu chứng về thần kinh, ủ rũ, rối loạn vận ñộng, bỏ ăn, ỉa phân xanh, phân biến ñổi nhiều nước. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng hoàn toàn phù Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 72 hợp với kết quả nghiên cứu về triệu chứng bệnh cúm gia cầm của một số tác giả trên thế giới như theo Kingsbury, D (1985) [51] virus cúm gây bệnh với các triệu chứng thể hiện ở hầu hết các cơ quan, trong ñó có triệu chứng thần kinh và hệ tuần hoàn. Bệnh tích ñặc trưng thường gặp ở ñường hô hấp, thận hoặc tụy. Khi nghiên cứu về bệnh cúm gia cầm trên ngan ở Việt Nam theo Vũ Quốc Hùng, 2005 [15] khi khảo sát triệu chứng lâm sàng của ngan mắc cúm gia cầm ở Bắc Giang cho thấy tỷ lệ ngan kém ăn và ỉa chảy phân loãng là 100%, ñi lại không bình thường, có triệu chứng thần kinh là 44%, * Kết quả theo dõi bệnh tích Những ngan chết sau khi công cường ñộc ñược chúng tôi mổ khám (bảng 4.13) kiểm tra bệnh tích, kết quả thu ñược một số bệnh tích ñặc trưng: Tim tụ máu, xuất huyết trên bề mặt, khí quản xung, xuất huyết, ñường tiêu hoá viêm, tuyến tuỵ xuất huyết... kết quả thu ñược hoàn toàn phù hợp với các bệnh tích mà thực tế xẩy ra trong các vụ dịch 2003 ñến nay (Hình 4.3; 4.4; 4.5; 4.6; 4.7). Trích theo Bộ Nông nghiệp và PTNT, 2007 [6] bệnh tích cúm gia cầm thường gặp: Mào và yếm (tích) sưng to, phù quanh mí mắt, chỗ da không có lông bị tím bầm, chân bị xuất huyết, xuất huyết vùng ñầu và thâm tím, niêm mạc phế quản phù nề có chứa chất nhầy. Viêm xuất huyết hầu hết toàn bộ ñường tiêu hoá, ñặc biệt rõ ở manh tràng, dạ dầy tuyến nơi tiếp giáp với mề. Chúng tôi cũng tiến hành mổ khám những ngan thí nghiệm, kết quả cho thấy: 10 ngan thí nghiệm các cơ quan nội tạng không có bệnh tích. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 73 Bảng 4.12. Kết quả theo dõi triệu chứng của ngan sau khi công virus cúm cường ñộc Lô ñối chứng Lô tiêm vacxin Thời gian sau khi công cường ñộc (ngày) Triệu chứng biểu hiện Số ngan chết (con) Triệu chứng biểu hiện Số ngan chết (con) 1 Chưa biểu hiện 0 Không 0 2 0 Không 0 3 Bỏ ăn, ủ rũ, sã cánh, rải rác ỉa phân xanh, trắng, một số con có hiện tượng thần kinh hoặc chúi ñầu xuống ñất. 1 Không 0 4 Ngan ủ rũ toàn ñàn, có biểu hiện thần kinh 2 Không 0 7 Ngan có biểu hiện thần kinh, ỉa chảy nhiều 2 Không 0 Tổng 5 Không 0 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 74 Hình ảnh ngan ñối chứng trước và sau khi công virus cường ñộc Hình 4.1 Ngan ñối chứng chết sau công virus cúm cường ñộc 7 ngày Hình 4.2 Ngan ñối chứng trước khi công virus cúm cường ñộc Hình ảnh vacxin cúm H5N1 và bảo quản mẫu máu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 75 Một số hình ảnh bệnh tích ñại thể của ngan ñối chứng sau khi công virus cúm cường ñộc Hình 4.3- 4.4 Bệnh tích tim tụ máu và xuất huyết Hình 4.5 Bệnh tích khí quản xung và xuất huyết Hình 4.6 Bệnh tích tuyến tuỵ xuất huyết Hình 4.7 Chân ngan bị tụ máu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 76 Bảng 4.13. Kết quả kiểm tra bệnh tích ñại thể của ngan sau khi công virus cúm cường ñộc Cơ quan Lô ñối chứng Lô thí nghiệm Xoang mũi Có dịch nhầy, xuất huyết Khô, không có dịch nhầy Khí quản Xung và xuất huyết nhẹ Bình thường Phổi Bình thường Bình thường Dạ dày cơ Xuất huyết Bình thường Dạ dày tuyến Xuất huyết Bình thường Ruột Niêm mạc viêm dày, ruột, manh tràng xuất huyết nặng Bình thường Tuyến tụy Xuất huyết Bình thường Gan 1 số con gan hơi sưng có ñiểm xuất huyết Bình thường Màng tim, tim Viêm, xuất huyết Bình thường Chân Tụ huyết dưới da chân Bình thường Kết quả thu ñược sau khi công cường ñộc, tất cả ngan ñối chứng ñều chết sau 7 ngày công cường ñộc, còn ngan thí nghiệm vẫn hoàn toàn khỏe mạnh. Như vậy có thể khẳng ñịnh hiệu quả của việc tiêm phòng cúm gia cầm cho ngan bằng vacxin H5N1 cho kết quả tốt, có thể bảo hộ 100% cho ñàn ngan, kết quả thu ñược tương ñương với kết quả công cường ñộc của Trung tâm Chẩn ñoán Thú y Trung ương và Viện Nghiên cứu Thú y Harbin của Trung Quốc: “ðánh giá hiệu lực vacxin bằng thí nghiệm công cường ñộc vi rút cúm gia cầm” có thể bảo hộ cho gia cầm từ 90% - 100% . Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 77 4.5. Khuyến cáo lịch dùng vacxin H5N1 phòng bệnh cúm cho ngan thương phẩm. Từ kết quả nghiên cứu trên cho thấy ñể phòng bệnh cúm gia cầm cho ñàn ngan thương phẩm nuôi tại Trung tâm nghiên cứu gia cầm Thuỵ Phương ñạt hiệu quả cao theo chúng tôi nên sử dụng vacxin H5N1 của Trung Quốc theo lịch dùng ở bảng 4.14: Bảng 4.14. Lịch sử dụng vacxin cúm H5N1 cho ñàn ngan Pháp thương phẩm ðối tượng tiêm vacxin Số lần tiêm Tuổi tiêm (ngày) Liều lượng (ml/con) 1 14 0,3 Ngan con nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin từ 1-3 tháng 2 42 1 1 7 0,3 Ngan con nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 5 tháng 2 35 1 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 78 5 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Từ những kết quả nghiên cứu của ñề tài, chúng tôi có một số kết luận sau: 5.1.1. Kháng thể thụ ñộng chống cúm gia cầm ở ngan con có sự liên quan chặt chẽ với lượng kháng thể chủ ñộng có trong cơ thể ngan mẹ. Hệ số tương quan giữa kháng thể chủ ñộng ngan mẹ với kháng thể thụ ñộng ngan con là r = 0,96. Phương trình biểu diễn sự tương quan giữa kháng thể ngan mẹ và kháng thể thụ ñộng ngan con: y = 1,01 – 1,36 x. 5.1.2. Diễn biến hàm lượng kháng thể thụ ñộng trên ñàn ngan con chịu ảnh hưởng rất lớn từ kháng thể chủ ñộng trên ñàn ngan mẹ. Với ngan con nở ra từ ngan mẹ ñược tiêm vacxin cúm sau 1-4 tháng cho hàm lượng kháng thể thụ ñộng cao ñạt từ 4,9 log2 - 4,3 log2 ở 1 ngày tuổi với mức bảo hộ 90-100%; với ngan con nở ra từ ngan mẹ ñược tiêm vacxin cúm sau 5-6 tháng cho hàm lượng kháng thể thụ ñộng thấp 3,5 log2 - 2,1 log2 ở 1 ngày tuổi. Sau ñó theo thời gian lượng kháng thể giảm dần. 5.1.3. ðàn ngan con nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin cúm ñược 1 - 3 tháng có thời ñiểm thích hợp nhất dùng vacxin cúm H5N1 lần ñầu tiên là 14 ngày tuổi và ngan con nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin cúm ñược 5 tháng là 7 ngày tuổi. 5.1.4. Sau khi tiêm vacxin cúm gia cầm H5N1 lần 1 ñược 28 ngày dùng tiếp liều vacxin cúm lần 2 ñã tạo ñược miễn dịch cao cho ñàn ngan (sau khi dùng vacxin lần 2 ñược 35 ngày lúc ngan ñược 70-75 ngày tuổi thì ñàn ngan vẫn bảo hộ với bệnh cúm gia cầm. 5.1.5. Ngan con sau khi ñược dùng 2 lần vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 79 khi công cường ñộc cho tỷ lệ bảo hộ 100%. 5.1.6. Có thể dùng vacxin H5N1 của Trung Quốc phòng bệnh cúm cho ngan Pháp thương phẩm 2 lần tại thời ñiểm 14, 42 ngày tuổi (ngan con nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin từ 1-3 tháng) và tại thời ñiểm 7, 35 ngày tuổi (ngan con nở từ trứng của ngan mẹ sau khi tiêm vacxin 5 tháng). 5.2 ðề nghị + Sử dụng lịch phòng trên cho các ñàn ngan Pháp thương phẩm + ðể phòng chống bệnh cúm gia cầm hiệu quả ngoài việc tiêm vacxin phòng bệnh cần ñẩy mạnh công tác phòng bệnh và an toàn sinh học, tăng cường công tác giám sát virus cúm gia cầm trên các ñàn thuỷ cầm. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 80 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Vũ Triệu An (1997), Miễn dịch học, NXB Y học, Hà Nội 2. Bùi Quang Anh (2005), Báo cáo về dịch cúm gia cầm tại hội nghị kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực châu Á do FAO, OIE tổ chức tại thành phố Hồ Chí Minh từ 23 - 25 tháng 2 năm 2005. 3. Bùi Quang Anh, Văn ðăng Kỳ (2004), “Bệnh cúm gia cầm: Lưu hành bệnh, chẩn ñoán và kiểm soát dịch bệnh”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 11 (3), tr.69-75 4. Bộ nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2005), Quy trình chẩn ñoán bệnh cúm gia cầm.10 TCN.Hà Nội 2005. 5. Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn (2005). Quyết ñịnh số 1715 Qð/BNN-TY về việc ban hành Quy ñịnh tạm thời về sử dụng vacxin cúm gia cầm. 6. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2007), Cẩm nang phòng chống bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 7. Cục Thú y (2004), Bệnh cúm gia cầm và biện pháp phòng chống, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 8. Cục Thú y (2005), Báo cáo tình hình dịch cúm gia cầm giai ñoạn 2004 - 2005. 9. Cục thú y (2005), Sổ tay hướng dẫn phòng chống bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm trên người, Hà Nội. 10. Trương Văn Dung và Nguyễn Viết Không (2004), Một số hoạt ñộng nghiên cứu khoa học của viện Thú y quốc gia về bệnh cúm gia cầm và giải pháp khoa học công nghệ trong thời gian mới, Tạp chí KHKTTY, tập XI, số 3-năm 2004 11. Nguyễn Tiến Dũng, Malik Peiris, Robert Webster, ðào Thanh Vân, Bùi Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 81 Ngọc Anh, Nguyễn Thế Vinh, Kent Inui, Bùi Nghĩa Vượng, Nguyễn Viết Không và Ngô Thanh Long (2004), “Nguồn gốc virus cúm gia cầm H5N1 tại Việt Nam năm 2003-2004”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 11 (3), tr.6-14. 12. Nguyễn Tiến Dũng, (2005) VNinfluenza, Báo cáo tại Hội nghị tổng kết phòng chống dịch cúm gia cầm 2004-2005 của Bộ Nông nghiệp và PTNT 13. Trần Xuân Hạnh (2004),"Một vài vấn ñề phòng bệnh cúm gia cầm bằng vacxin", khoa học kỹ thuật thú y, 11(3), tr.77-84 14. Lê Thanh Hòa (2004), Virus cúm A của gia cầm và mối quan hệ lây nhiễm ñộng vật sang người. 15. Vũ Quốc Hùng (2005), "Nghiên cứu một số ñặc ñiểm bệnh lý chủ yếu của bệnh cúm gia cầm" Luận văn Thạc sỹ nông nghiệp, Trường ðại Học Nông nghiệp - Hà Nội.tr 64 16. Trần Thị Lan Hương (2001), "Một số yếu tố ảnh hưởng ñến ñáp ứng miễn dịch chống bệnh Newcastle của ñàn gà công nghiệp" Luận án tiến sỹ nông nghiệp, Trường ðại Học Nông nghiệp - Hà Nội. 17. Ilazia Capua, Stefano Maragon (2003), “Sử dụng vacxin như một giải pháp khống chế bệnh cúm gà”, (Nguyễn Thu Hồng dịch), Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, III, 2004 18. J.H. Breytenbach (2004), “Tiêm chủng, một phần của chiến lược khống chế bệnh cúm gà” (Nguyễn Thị Mến, Bùi Văn ðông dịch), Tạp chí khoa học kỹ thuật thú y, 11(2), tr.72-78. 19. Phạm Sỹ Lăng (2004), “Diễn biến bệnh cúm gia cầm ở châu Á và các hoạt ñộng phòng chống bệnh”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thu y, 11(3), tr.91-94. 20. Lê Văn Năm (2004), Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 82 tích ñại thể bệnh cúm gia cầm ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc, Tạp chí KHKTTY, tập XI, số 4-năm 2004. 21. Lê Văn Năm (2004), Bệnh cúm gà, Khoa học kỹ thuật Thú y, 11(1), tr. 81-86 22. Peter van Beek DVM, Reg, chuyên gia sức khoẻ vật nuôi; Dự án EU: SANCO/2005/D2/017 23. Nguyễn Vĩnh Phước (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXB Nông nghiệp. 24. Nguyễn Như Thanh (1997), Miễn dịch học, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 25. Tô Long Thành (2005), “Kinh nghiệm phòng chống dịch cúm gia cầm và sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Trung Quốc”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 12(3), tr.87-90. 26. Tô Long Thành (2005) " Một số thông tin mới về bệnh cúm gia cầm" Tạp chí Khoa học Kỹ thuật thú y, Tập VII, số 1- 2005. 27. Tô Long Thành (2006), Thông tin cập nhật về bệnh cúm gia cầm và vacxin phòng chống cúm gia cầm. 28. Tổ chức y tế thế giới, Hướng dẫn tạm thời về công tác khống chế dịch cúm có khả năng sinh bệnh cao trong gia cầm. TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI 29. Alexander D.J. (1991). Newcastle disease and other paramyxovirus infections. In Disease of poultry, Iowa State University Press, Ames, Iowa, USA. 30. Alexander D.J. (1996). Highly Pathogenic Avian Influenza (fowl plague). In OIE Manual of standards for diagnostic tests and vacxins. List A and B diseases of mammals, birds and bees, 3rd ed. Office International des Epizooties: Paris, 155-160. 31. Bell, I.G, Nicholls, P.J,Norman,C.(1991), “The resistance of meat Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 83 chickens vaccinated by aerosol with a live V4-HR Newcastle disease virus vaccin in the field to challennge with velogenic Newcastle disease virus”, Australian-Veterinary-Journal, p97-101. 32. Bio – Medicine, passive immunization again bird flu, web: http:/www.bio-medicine.org 33. Biswas. S. K and D. F. Nayak, (1996), "Infuenza virus polymerase basic protein 1 interacts with influenza virus polymerase basic protein 2 at multiple sites". J. Virol (70), pp. 6716-6722. 34. Bosch. F. X. M. Orlich, H. D. Klenk and R. Rott (1979), "The strructủe of the hemagglutinin, a determinant for the pathogenicity of infuenza viruses ". Virology (95), pp. 197-207. 35. Brendon J Hanson et al (2006), Passive immunoprophylaxis and therapy with humanized monoclonal antibody specific for influenza A H5 hemagglutinin in mice. 36. Buclkler White and B. R. Muphy (1998), "Nucleotide sequence analysis of the nucleoprotein gene of an avian and a human infuenza virus strain identifies two classes of nucleoproteins . Virology (155), pp. 345-355 " 37. Capua I et al (2000), “Vaccination for Avian Influenza in Italy”. 38. Castrucci. M. R and Y. Kawaoko (1993), "Biologic importance of neuramidase stalk length in influenza A virus" J. Virol (67), pp. 759- 764. 39. Collins. R. A, L.S. Ko, K. L. So, T. Ellis (2002), "Detection of hyghly pathogenic avian influenza subtybe H5 (Euroacian lineage) using NASBA" J. Virol Methods 103 (2), pp. 213-215. 40. Flanagan’s MegaHydrate (2007), Monoclonal Neutralizing antibodies again bird flu. Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 84 41. Food and Agriculture Organization of the United (FAO) (2004).FAO, OIE & WHO Technical consultation on the Control of Avian Influenza. Animal health special report. 42. Holsinger. L. J, D. Nichani, L.H. Pinto and R. A. Lamb (1994), " Influenza A virus M2 ion chanel protein: a structurefunction analysis" J. Virol (68), pp. 1551-1563. 43. Horimoto. T and Y. Kawaoka (1995), "Direct reverse transciptase PCR to determine virulence potential of influenza A viruses in birds", J. Clin Microbiol, 33 (3), pp. 748-751. 44. Horimoto. T and Y. Kawaoka (2001), "Pandemic threat poesd by avian influenza viruses ", Clin Microbiol Rev, 14(1), pp. 129-149. 45. Hinshaw. V. S, R. G. Webster and B. Turner (1979), "Water borne transmission of influenza A viruses". Intervirology (11), pp. 66-68. 46. Hinshaw. V. S, R. G. Webster and B. C. Easterday and W. J. Bean (1981), "Replication of avian influenza A viruses in mammals". Infect Inmum (34), pp. 354-361. 47. Ito. T and Y. Kawaoko (1998), Avian influenza, Black well Sciences Ltd, Oxford, United Kingdom. 48. Ito. T, J. N. Couceiro, S. Kelm, R. G. Webster and Y. Kawaoka (1998), "Molecular basic for the generation in pig of avian influenza A viruses with pandemic potential", J. Virol (72), pp. 7367-7373. 49. Kawaoka (1988-Virology 179 [759-767]) và Murphy (Virology, Raver press NewYork [1179 – 1240]). 50. Kawaoka Y (1991), "Difference in receptor specifcity among influenza A viruses from difference specis of animals", J. Vet. Med. Sci 53, pp. 357-358. 51. Kingsbury, D (1985) Orthomyxo-and paramyxoviruses and their Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 85 replication. In B. Field (ed) Virology. Raven Press. New York, pp.1157- 1178. 52. Kishida N, Sacoda Y, Isoda N, Matsuda K, Eto M, Sunaga Y, Umemura T, Kida H. Pathogenicity of H5 influenza viruses for ducks. Arch Virol 2005 Jul; 150(7):1383-92. 53. Koike. (2007) Guidelines for Field Veterinarians and Para- professionals on the Surveillance of Avian Influenza, PowerPoint Sep- Oct 2007. 54. Lee C.W, Senne D.A. & Suarez D.L. (2004). Effect of vacxin use in the evolution of Mexican lineage H5N2 avian influenza virus. J. Virol ., 78 (15), 8372–8381. 55. Lu. X. T. M. Tumpey and J. M. Katz (1999), " A mouse model for the evaluation of pathogenesis and immunity to influenza A (H5N1) viruses isolated from human", J. Virol (73), pp. 5903-5911. 56. Luong. G and Palese. P (1992), "Genetic analysis of influenza viruses", Curr Opinion Gen Develop 2, pp.77-81. 57. Mo. I. P. M. Brugh and D. E. Swayne (1997), " Comparative pathology of chickens exprimentaly inoculated with avian influenza viruses of low and high pathogenicty", Avian Dis, 41, pp 125-136. 58. Mo. I. P. M. Brugh and D. E. Swayne (1997), " Comparative pathology of chickens exprimentaly inoculated with avian influenza viruses of low and high pathogenicty", Avian Dis, 41, pp 125-136. 59. Murphy B. R, and Webster R.G. (1996) Orthomyxoviruses, pp. 1397- 1445 60. Office International des Epizooties (OIE) (1992). Chapter A15, Highly Pathogenic Avian Influenza (Fowl Plague). In: Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vacxins, Second Edition. OIE, Paris, France Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ........... 86 61. Pastoret P.P., Blancou J., Vannier P. & Verschueren C. (1997), Vetrynary Vaccinology, Elsevier Science B.V 62. Science news, First successful libraries of avian flu virus antibodies created. Web: http:/www.sciencedaily.com 63. Skeeles, G.H, Lukert, P.D, Fletcher, O.J, and Leonard, J.D, (1979), "Immunization studies with a cellculture-adapted infectious bursal disease virus", Avian Dis, p. 456-465. 64. Suares. D. L, M. L. Perdue and D. E. Swayne (1998), "Comparisons of highly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong", J. Virol (72), pp. 6678-6688. 65. Swayne D.E.& Suarez D.L. (2000), “Highly pathogenic avian influenza” 66. Very. M. M. Orlich, S. Adle, H. D. Klenk, R. Rott and W. Garten (1992), "Hemagglutinin activation of pathogenic avian infuenza viruses of serotype H7 requires the protease recognition motif R-X-K/R-R". Virology 188, pp. 408-413. 67. Webster. R. G, W. J. Bean, O. T. Gorman, T. M. Chambers and Y. Kawaoka (1992), " Evolution and ecology of influenza A viruses", Microbiol. Re.(56), pp. 152-179. 68. WHO is the equivalent organization for Human Health in UN. i ._.