Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản tinh hầu Cửa Sông (Crassostrea rivularis) trong nitơ lỏng (-1960C)

hay đóng hộp. Vỏ hầu dùng nung vôi làm bột phấn hoặc làm thức ăn chăn nuôi gia súc. Vì những giá trị như vậy nên nhu cầu về hầu ngày càng lớn. Tuy nhiên do tình trạng khai thác quá mức nguồn lợi hầu tự nhiên, nguồn nước bị ảnh hưởng của nền công nghiệp hiện đại thì nguồn lợi này đang có nguy cơ cạn kiệt, khả năng tái phát triển nguồn lợi hầu ở một số địa phương đã trở thành vấn đề khó có thể thực hiện được. Việc thu gom con giống trong tự nhiên không đủ đáp ứng cho nhu cầu nuôi. Với thành công của đề tài KC06-14NN (2001-2004), Viện nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản I đã xây dựng hoàn chỉnh quy trình sản xuất, có thể chủ động về nguồn giống nhưng lại khó có thể đáp ứng đủ con giống quanh năm vì tỷ lệ hầu đực, hầu cái biến động qua các tháng (Hà Đức Thắng, 2005). Vì vậy để chủ động trong quá trình sản xuất con giống bằng phương pháp thụ tinh nhân tạo thì việc bảo quản nguồn tinh trùng hầu là hết sức cần thiết. Một trong những biện pháp bảo quản đã và đang thu hút sự quan tâm của các nhà chọn và sản xuất giống hiện nay là phương pháp bảo quản tinh trùng trong nitơ lỏng. Trên thế giới việc bảo quản tinh hầu trong nitơ lỏng đã được nghiên cứu từ lâu (Lanna, 1971; Hughes, 1973; Staeger, 1974; Zell và ctv.,1979; Van der Horst và ctv.,1985; Bougrier và Rabenomanana, 1986…). Những kết quả được công bố cho thấy bảo quản bằng phương pháp này có rất nhiều ưu điểm, chất lượng cao và có tính ổn định. Không những thế với phương pháp bảo quản này còn cho phép người nuôi đảm bảo nguồn nguyên liệu cho quá trình sản xuất giống, dễ dàng trong quá trình vận chuyển xa, đặc biệt có ý nghĩa quan trọng nhằm cung cấp tinh phục vụ cho những nghiên cứu lai tạo ra giống hầu mới có chất lượng. Bảo quản tinh còn giúp lưu giữ nguồn gen, góp phần trong công tác bảo tồn đa dạng giống thuỷ sản và nhiều lợi ích khác. Ở Việt Nam, phương pháp lưu giữ giống hầu sử dụng nitơ lỏng cho đến nay vẫn chưa có công bố nào. Do vậy nghiên cứu ứng dụng phương pháp này là rất cần thiết, thành công của phương pháp này sẽ đáp ứng nguồn tinh trùng hầu phục vụ những mục đích trên. Vì những lý do đó trong phạm vi của đề tài thực tập tốt nghiệp, được sự đồng ý và giúp đỡ của cô hướng dẫn tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản tinh hầu Cửa Sông (Crassostrea rivularis) trong nitơ lỏng (-1960C)”. Mục tiêu nghiên cứu Bước đầu xây dựng kỹ thuật bảo quản tinh hầu Cửa Sông (Crassostrea rivularis) trong nitơ lỏng (-1960C). Nội dung nghiên cứu Nghiên cứu đặc điểm sinh học tinh dịch hầu Cửa Sông thông qua các chỉ tiêu như hoạt lực, mật độ, pH. Xác định tỷ lệ pha loãng, chất chống đông và nồng độ chất chống đông phù hợp trong bảo quản tinh hầu Cửa Sông trong nitơ lỏng (-1960C). Xác định phương pháp làm lạnh phù hợp trong bảo quản tinh hầu Cửa Sông trong nitơ lỏng (-1960C). PHẦN 2. TỔNG QUAN 2.1. Đặc điểm sinh học của hầu Cửa Sông 2.1.1. Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại Thiel (1931) thì vị trí phân loại của hầu Cửa Sông như sau: Ngành động vật thân mềm: Mollusca Lớp hai mảnh vỏ: Bivalvia Bộ cơ lệch : Anisomyarya Họ hầu : Ostreidae Giống hầu: Crassostrea Loài hầu Cửa Sông: Crassostrea rivularis 2.1.2. Đặc tính phân loại Vỏ to, dầy, dài, chắc, biến đổi có khi gần hình tròn, hình bầu dục, hình tam giác… vỏ phải hơi phẳng dẹp và nhỏ hơn vỏ trái, mặt vỏ có nhiều lớp vẩy mỏng mầu vàng nâu hay tím sẫm. Hầu 1-2 tuổi các tấm vẩy thường phẳng mỏng và giòn. Hầu càng nhiều tuổi các tấm vẩy càng dầy, chắc, mặt ngoài vỏ mầu xám tím hoặc nâu. Mặt trong vỏ mầu trắng, dây nề nâu tím đen. Vết cơ khép vỏ rất to, mầu vàng nhạt hình dạng không nhất định, phần lớn hình quả trứng hay bầu dục nằm phía trong lưng, vỏ trái to dầy và lõm sâu. Mặt trong mầu ngà. 2.1.3. Đặc điểm sinh học Phân bố: hầu Cửa Sông (Crassostrea rivularis) là loại hầu phân bố rất rộng rãi ở nước ta. Hầu hết các cửa sông có vật bám là thấy có hầu Cửa Sông, chúng thường hình thành những bãi hầu rất lớn có khi dài hàng chục cây số như ở sông Bạch Đằng, sông Chanh và các sông lân cận. Vì vậy hầu Cửa Sông là loại hầu chiếm sản lượng chủ yếu ở nước ta. Sản lượng hàng năm có thể tới hàng trăm tấn cả vỏ. Khai thác hầu Cửa Sông là nghề sống chủ yếu của nhân dân các bãi hầu. Trong các loài hầu nuôi trên thế giới, hầu Cửa Sông cùng với hầu ống là hai loại hầu lớn hơn cả, con to nhất của hầu Cửa Sông tới hơn 40cm. Hầu Cửa Sông sống trong vùng nước lợ, tính thích ứng với độ muối rộng, có khi sống được ở trong nước có độ muối từ 1-30‰ nhưng thích hợp nhất là 10-23‰. Chúng có thể phân bố từ tuyến triều cao cho tới độ sâu 10m, nhưng nhiều nhất và thường lớn nhất ở phạm vi 5-7m. Hiện tượng quần tập rất phổ biến, chúng thường kín vật bám và nhiều khi bám chồng chất lên nhau từng cụm lớn tua tủa như lưỡi mai. Có khi thiếu vật bám chúng bám lên các vỏ hầu đã chết, trên một vỏ hầu dài 15cm có tới 30 con bám, trung bình lớn từ 5-20cm. Vì vậy, ngư dân thường gọi bằng nhiều dị tên khác nhau, thí dụ như “hầu rừng” là loại bám chi chít dầy khắp rạn đá lớn, “hầu lỗ” là loại hầu bám trên các hòn đá, hầu “lưỡi mai”, “hầu rơi” loại bám trên các vỏ hầu thành cụm, “hầu bạ” to thường bám đơn độc. Phương thức sống: ở giai đoạn ấu trùng, chúng sống phù du, ấu trùng hầu có khả năng bơi lội nhờ hoạt động của tiêm mao. Ở giai đoạn trưởng thành, hầu sống bám trên các giá thể (sống cố định) trong suốt đời sống của chúng. Thức ăn và phương thức bắt mồi: thức ăn của ấu trùng bao gồm vi khuẩn, sinh vật nhỏ, mùn bã hữu cơ, tảo sillic, trùng roi có kích thước dưới 10µm. Ấu trùng có thể sử dụng vật chất hoà tan trong nước và các hạt vật chất hữu cơ. Khi trưởng thành thức ăn của chúng chủ yếu là thực vật phù du và mùn bã hữu cơ. Các loài tảo thường gặp là tảo Silic như: Melosira, Coscinodiscus, Cyclotella, Skeletonema… Phương thức bắt mồi của hầu thụ động theo hình thức lọc. Cũng như các loài Bivavia khác, hầu bắt mồi trong quá trình hô hấp nhờ vào cấu tạo đặc biệt của mang. Khi hô hấp nước mang theo thức ăn đi qua bề mặt mang, các hạt thức ăn sẽ giữ lại ở mang nhờ các tiêm mao và dịch nhờn được tiết từ tiêm mao. Các hạt thức ăn có kích thước nhỏ sẽ được dịch nhờn của tiêm mao cuốn dần về phía miệng, còn các hạt thức ăn quá lớn tiêm mao không giữ được sẽ bị dòng nước cuốn đi khỏi bề mặt mang, sau đó được tập chung ở mép màng áo và bị màng áo đẩy ra ngoài. Mặc dù hầu bắt mồi thụ động nhưng với cách thức bắt mồi như vậy, chúng chỉ có thể chọn lọc theo kích thước thức ăn. Quá trình chọn lọc được thực hiện 4 lần theo phương thức trên: lần 1 xẩy ra trên bề mặt mang, lần thứ 2 xẩy ra trên đường vận chuyển, lần 3 xẩy ra trên xúc biện, lần thứ 4 xẩy ra tại manh nang tiêu hoá. Tại dạ dầy, thức ăn được tiêu hoá một phần nhờ các men như: Amylase, Lactase, Glipase, Maltase, Protease. Các thức ăn không thích hợp được đẩy xuống ruột và ra ngoài qua hậu môn. Các nhân tố tác động tới hoạt động bắt mồi của hầu là thuỷ triều, lượng thức ăn, các yếu tố môi trường (nhiệt độ, độ muối…). Sinh trưởng: nhiệt độ là yếu tố ảnh hưởng đến tốc độ sinh trưởng của hầu. Ở vùng nhiệt đới, nhiệt độ ấm áp nên tốc độ sinh trưởng của hầu rất nhanh và quá trình sinh trưởng diễn ra quanh năm. Ở vùng ôn đới, quá trình quá trình sinh trưởng chỉ diễn ra vào mùa xuân - hè, còn mùa thu đông gần như không sinh trưởng. Sự sinh trưởng của hầu còn phụ thuộc vào mật độ, nếu mật độ hầu cao thì hầu chậm lớn. Tốc độ sinh trưởng của hầu cũng khác nhau và tuỳ theo vùng phân bố do điều kiện môi trường nước của từng vùng khác nhau và do đặc trưng riêng của từng loài (yếu tố di truyền). Một đặc điểm nổi bật của hầu vùng nhiệt đới là quá trình sinh trưởng nhanh trong 6-12 tháng đầu tiên và sau đó chậm dần. Sinh sản: hầu Cửa Sông là loài động vật đã phân tính rõ rệt con đực và con cái riêng biệt, không có trường hợp trứng và tinh trùng cùng hình thành trên một cá thể. Tuy vậy trong quá trình phát dục có sự biến tính, tỷ lệ đực cái thay đổi theo mùa vụ khác nhau theo từng địa điểm. Trong tự nhiên, tỷ lệ hầu cái là 40-68% và hầu đực chiếm từ 21-61% (trong các tháng 4 đến tháng 10). Tỷ lệ này giảm thấp từ 0-16% (hầu cái) và 38-90% (hầu đực) trong các tháng từ 11 đến tháng 4 năm sau. Hầu con có thể tham gia lần đầu rất sớm sau 6-7 tháng tuổi kích thước đạt 40-50mm là đã phát hiện thấy có sản phẩm sinh dục và có khả năng tham gia sinh sản lần đầu. Khi hầu bố mẹ tham gia sinh sản, trứng và tinh trùng được phóng vào môi trường nước, quá trình thụ tinh và phát triển của ấu trùng diễn ra trong nước. Trong quá trình sinh sản việc phóng tinh trùng kích thích hầu cái đẻ trứng. Sức sinh sản của hầu là rất lớn. Đó là sự thích nghi với điều kiện sống. Hầu đẻ trứng, thụ tinh ngoài, ấu trùng trải qua biến thái vì vậy quần đàn hầu thường đẻ rất nhiều trứng. Sức sinh sản này phụ thuộc rất nhiều vào kích thước cá thể. Cá thể càng lớn sức sinh sản càng cao. Nhiệt độ cũng ảnh hưởng rất lớn tới sức sinh sản của hầu, nhiệt độ là yếu tố quan trọng và trực tiếp ảnh hưởng tới sức sinh sản. Nhiệt độ thích hợp cho sinh sản thường trong phạm vi 28-300C. Tuổi không có ảnh hưởng tới sức sinh sản của nhóm hầu. Sau khi thụ tinh, trứng hình tròn đồng thời sinh ra một màng trong suốt, tế bào chất bắt đầu lưu động nhân tế bào tiêu biến. Một giờ sau thể cực thứ nhất và thể cực thứ 2 xuất hiện, sau đó trứng bắt đầu quá trình phân cắt, sau lần phân cắt thứ 6 thành 64 tế bào thì phôi bắt đầu bước vào các giai đoạn phát triển. Sau đó phôi tiếp tục phát triển thành ấu trùng bánh xe, ấu trùng có điểm mắt, ấu trùng chân bò và khi chuyển sang giai đoạn bám chúng hoàn toàn không còn khả năng bơi lội, hình dạng của chúng đã tương đối giống với hầu trưởng thành, chúng chỉ có khả năng bám một lần trong đời. Bảng 2.1. Quá trình phát triển phôi, ấu trùng hầu (25-280C) Giai đoạn phát triển Thời gian Kích thước (µm) Trứng thụ tinh 30 phút 50 Thể cực hứ nhất 1 giờ 50-60 Thể cực thứ 2 1 giờ 30 phút 50-60 Phân cắt lần 1 2 giờ 60 Phân cắt lần 2 2 giờ-2 giờ 30 phút 60 Giai đoạn phôi nang 5-10 giờ 60-70 Ấu trùng Verliger 12 giờ 70 Ấu trùng đỉnh vỏ thẳng 24 giờ 70 Ấu trùng đỉnh vỏ lồi 8-10 ngày 150-180 Ấu trùng có điểm mắt 17-20 ngày 200-250 Ấu trùng có chân bò 20-22 ngày 220-250 Ấu trùng bám 22-25 ngày 270-300 Nguồn: Hà Đức Thắng (2005) Sản lượng, công nghệ nuôi và công nghệ sản xuất giống hầu trên thế giới và Việt Nam 2.2.1. Sản lượng, công nghệ nuôi và công nghệ sản xuất giống hầu trên thế giới Hiện nay trên thế giới có hơn 200 loài hầu nhưng mới chỉ có một số loài có giá trị kinh tế được đưa vào sản xuất công nghiệp. Bảng 2.2. Sản lượng một số loài hầu nuôi chính (năm 1999) Tên loài Sản lượng (nghìn tấn) Hầu Thái Bình Dương (C.gigas) 3600 Hầu Châu Mỹ (C. virginica) 59 Hầu khác (Crassostrea spp) 25 Hầu Philippin (C. iredalea) 19 Hầu Thái Bình Dương (C.gigas) là loài hầu bản địa của Nhật Bản nhưng với những ưu điểm vượt trội hầu Thái Bình Dương đã sớm được di nhập và trở thành loài hầu nuôi quan trọng trên thế giới. Tổng sản lượng hầu Thái Bình Dương năm 1950 đạt 150000 tấn, năm 1990 là 1,2 triệu tấn, cho đến năm 2003 đã đạt 4,38 triệu tấn. Trung bình hàng năm tốc độ tăng sản lượng đạt 7,8% và có xu hướng tăng mạnh trong những năm tiếp theo (FAO, 2004). Tính đến năm 2000 (FAO, 2004) đứng đầu thế giới về sản lượng hầu là Trung Quốc đạt 3,3 triệu tấn. Đứng thứ 2 về sản lượng hầu là Nhật Bản, đồng thời đây cũng là nước có công nghệ sinh sản nhân tạo và công nghệ nuôi hầu phát triển sớm nhất thế giới và luôn dẫn đầu về sản lượng nhưng từ năm 1980 đến nay sản lượng hầu liên tục giảm, hiện nay chỉ còn bằng 5,6% sản lượng của Trung Quốc. Các nước có sản lượng hầu lớn tiếp theo (sản lượng năm 2000) là: Hàn Quốc - 208000 tấn; Pháp - 135000 tấn và Mỹ - 50000 tấn. Các nước Đông Nam Á tuy có rất nhiều điều kiện thuận lợi, nhưng lại không quan tâm tới nghề nuôi hầu. Chỉ có Philippin có nghề nuôi hầu gốc địa phương có sản lượng 12000 tấn (1999). Thái lan và Malaixia cũng bắt đầu nuôi hầu, nhưng sản lượng không đáng kể. Theo FAO (2006) sản lượng hầu năm 2002 đạt 4,33 triệu tấn, năm 2004 đạt 4,6 triệu tấn, tốc độ sản lượng trong giai đoạn này là 3,1%. Cũng giống như bất cứ đối tượng nuôi khác, đối với hầu nuôi theo phương pháp công nghiệp thì công tác sản xuất giống đóng vai trò then chốt, nó giúp người nuôi chủ động giống trong khi việc vớt giống từ tự nhiên gặp nhiều bất lợi và không chủ động. Để có thể xây dựng được quy trình sản xuất giống nhân tạo thì trong suốt thế kỷ XX đã có rất nhiều nghiên cứu về đặc điểm sinh học của hầu cũng như các nghiên cứu về thức ăn cho các loài thân mềm. Với nhiều nghiên cứu khác nhau đến năm 1991 Uting và Spencer đã xây dựng hoàn thiện sơ đồ cung cấp tảo trong quá trình ương nuôi các loài động vật thân mềm, điều này giải quyết khó khăn của các trại sản xuất, góp phần đem lại nhiều thành công trong sản xuất giống hầu nhân tạo. Năm 2004 Helm và Bourne đã thành công trong việc đưa ra quy trình sản xuất hầu Thái Bình Dương. Năm 2006 Rico và cộng sự đã nghiên cứu công thức trộn hỗn hợp tảo làm thức ăn cho hầu C.gigas trong điều kiện hầu bố mẹ được ương ở 190C, cung cấp thức ăn 6% trọng lượng cơ thể. Khi tham gia sinh sản kết hợp tỷ lệ 3 đực 6 cái, đảm bảo 50 tinh trùng/ trứng. Thu được tỷ lệ ấu trùng 98% khi sử dụng thức ăn là C.calcitrans và Forma pumilum. Đỉnh cao của phương pháp sản xuất giống nhân tạo là thu hầu giống đơn. Theo Cross và Kingzett (1992) thì sau khi nuôi ấu trùng hầu đến giai đoạn hậu ấu trùng đỉnh vỏ lồi thì dùng LHG kích thích hầu xuống đáy mà không cần vật bám, hoặc dùng bột vỏ hầu, bột vỏ điệp kích thước 300-500µm. Với phương pháp này chúng ta có thể thu được con giống đơn phục vụ cho nghề nuôi hầu bằng khay hoặc bằng túi. Cùng với việc nghiên cứu sản xuất giống hầu thì các nghiên cứu về công nghệ nuôi cũng được tiến hành. Kết quả của các nghiên cứu này đã cho ra đời nhiều phương thức nuôi khác nhau như: nuôi treo trên mặt đáy, nuôi trên đá, nuôi trên cọc, hình thức nuôi treo, nuôi trên bè, nuôi treo trên dây, và hình thức nuôi hầu rời. 2.2.2. Sản lượng, công nghệ nuôi và công nghệ sản xuất giống hầu ở Việt Nam Ở Việt Nam nghề nuôi hầu vẫn còn rất mới mẻ, nuôi hầu mới chỉ bắt đầu từ những năm cuối thế kỷ XX. Sản lượng hầu nuôi ở nước ta rất thấp chủ yếu là đánh bắt ở tự nhiên, công nghệ nuôi hầu cũng rất đơn giản phần lớn là dựa vào con giống tự nhiên, sau đó quản lý vùng bãi triều và thu hoạch. Năm 2001-2003 Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thủy sản I đã tiến hành thử nghiệm thành công sản xuất giống nhân tạo hầu biển (C. gigas) bằng công nghệ của Australia. Tuy nhiên việc nuôi hầu giống lên hầu thương phẩm chưa thu được kết quả vì hầu bị chết hàng loạt (Đồng Xuân Vĩnh, 2004). Năm 2001-2004 đề tài KC06-NN14 của Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản I đã xây dựng thành công quy trình sản xuất giống hầu (trên cả 3 đối tượng hầu: C.rivularis, C. belchery, C.lugubris). Quy trình sản xuất giống hầu hoàn toàn chủ động trong tất cả các khâu (Hà Đức Thắng, 2005). Hiện nay Viện Nghiên cứu Nuôi trồng Thuỷ sản I cũng đang triển khai đề tài KC.06.18/06-10 “Nghiên cứu công nghệ sản xuất giống và nuôi thương phẩm hầu Thái Bình Dương (C. gigas) phục vụ xuất khẩu”. Thành công của đề tài sẽ mở ra những hướng phát triển mới cho nghề nuôi hầu ở nước ta. 2.3. Những yếu tố chính ảnh hưởng đến tinh trùng trong quá trình bảo quản lạnh 2.3.1. Dung dịch pha loãng Dung dịch pha loãng còn được các nhà nghiên cứu gọi là extender, có tác dụng duy trì trạng thái vô hoạt, không làm tinh trùng chuyển động trước khi sử dụng, kéo dài thời gian sống tiềm sinh của tinh trùng (Bates và ctv., 1996). Graybill và Horton (1996) cho rằng việc tìm được extender thích hợp là bước đầu tiên của quá trình bảo quản tinh và extender được định nghĩa như sau: “extender là một dung dịch của muối vô cơ hoặc hữu cơ, có tác dụng bảo vệ sự sống của tế bào tinh trùng trong thời gian bảo quản”. Extender thường bao gồm hỗn hợp các chất vô cơ và chất hữu cơ giống như tinh trùng đồng thời thoả mãn các điều kiện sống của tinh trùng ngoài cơ thể, ngoài đảm bảo chất dinh dưỡng giống tinh tươi của cá cần đặc biệt chú ý tới các yếu tố pH, áp suất thẩm thấu, tỷ trọng, độ nhớt, nhiệt độ, tỷ lệ các chất điện giải và không điện giải. 2.3.2. Áp suất thẩm thấu Áp suất thẩm thấu của dung dịch bảo quản tương đương áp suất thẩm thấu của tinh trùng nghĩa là tinh trùng phải sống trong môi trường đẳng trương có như vậy tinh trùng mới giữ nguyên hình thái, tiến hành trao đổi bình thường. Các dung dịch ưu trương hoặc nhược trương đều có hại cho tinh trùng làm tinh trùng trương phồng hoặc teo lại và chết nhanh chóng (Đỗ Văn Thu, 2000). 2.3.3. Tỷ trọng môi trường Tỷ trọng của dung dịch bảo quản tương đương tỷ trọng của tinh dịch để tránh tình trạng tinh trùng bị lực đẩy Ascimet làm thay đổi hình thái môi tinh trùng. 2.3.4. pH pH của dung dịch bảo quản tương đương pH của tinh trùng, vì quá trình trao đổi chất của tinh trùng liên quan đến hàng loạt enzym. Các enzym này xúc tiến các phản ứng hoá học trong một giới hạn pH nhất định (Đỗ Văn Thu, 2000). 2.3.5. Tỷ lệ các chất điện giải và không điện giải Để giữ thăng bằng về áp lực thẩm thấu và ổn định pH cho tinh trùng trong dung dịch bảo quản phải có các chất điện giải. Các ion điện giải, đặc biệt các anion của các acid gây hại đến màng tinh trùng vì vậy phải có các chất không điện giải ngăn ngừa tác động có hại của các ion, tránh hiện tượng làm mất điện tích trên bề mặt tinh trùng gây hiện tượng tụ dính ở tinh trùng (Đỗ Văn Thu, 2000). Milovanov (1962) nhận thấy trong dung dịch bảo quản nếu tăng hoá trị của các cation thì có hại cho tinh trùng. Muối có cation +2 (Ca, Mg, Ba) làm tinh trùng bị tụ dính, muối có cation +3 và +4 (Al, Fe) làm tinh dịch bị đông đặc và chết nhanh. Theo Popov (1968) cation có hoá trị +1 ( Na, K) và +2 (Ca, Mg) có tác dụng như nhau. Đối với anion thì có tương quan thuận, muối có hoá trị -2 tác động lên tinh trùng tốt hơn hóa trị -1, nghĩa là anion cùng hoá trị thì tác dụng lên tình trùng giống nhau. Theo Popov (1968), dung dịch bảo quản dùng muối có anion hoá trị 2, 3, 4 so với hoá trị 1 làm tăng sức sống của tinh trùng. Theo Dương Đình Long dùng Natri - bicarbonat vừa có tác dụng điều chỉnh pH vừa cung cấp một lượng nhỏ CO2 vào môi trường, ức chế hoạt động của tinh trùng (Trích qua Đỗ Văn Thu, 2000). 2.3.6. Độ nhớt Độ nhớt của dung dịch bảo quản phải tương đương với tinh dịch để tránh tình trạng sức căng mặt ngoài tác động lên màng bọc tinh trùng và ma sát nội phân tử qua lớn khi tinh trùng vận động ( Đỗ Văn Thu, 2000). Do đặc điểm sinh học của mỗi loài là khác nhau lên dung dịch bảo quản cũng có thể khác nhau, việc tìm ra dung dịch phù hợp với từng loài là rất cần thiết. Horton và Ott (1976) đã chỉ ra một số extender đơn giản gồm các thành phần NaCl, NaHCO3 và Lectihin cho kết quả bảo quản thành công. Dung dịch bảo quản được điều chỉnh và phát triển dựa trên đặc điểm sinh lý, hoá cơ bản của tinh dịch vì vậy chúng có thành phần tương đối giống nhau (Rao Gopal, 1989). Một số nghiên cứu cho biết thành phần đơn giản của extender như sau: NaCl, KCl, CaCl, NaHCO3, NaHPO4, MgSO4 có thể không hoặc có các chất dinh dưỡng như glucose, fructose, lòng đỏ trứng gà, leccithin, glycine. 2.3.7. Tỷ lệ pha loãng Tỷ lệ pha loãng khác nhau dẫn đến nồng độ tinh trùng trong mẫu khác nhau. Theo Smirnov (1974) mật độ tinh trùng trong tinh dịch pha loãng ảnh hưởng lên kết quả đông lạnh, khi pha loãng tinh dịch có cùng tỷ lệ, tinh dịch nào có nồng độ tinh trùng cao khả năng đông lạnh kém hơn tinh dịch có nồng độ thấp. Platanov (1978) cho rằng nồng độ tinh trùng ảnh hưởng đến tốc độ đông lạnh và sự phục hồi sức sống của tinh trùng trong quá trình giải đông (Trích qua Đỗ Văn Thu, 2000). Tỷ lệ pha loãng giữa tinh trùng và extender ở các loài là khác nhau. Ở cá tỷ lệ này có thể thay đổi từ 1:1 đến 1:20, khi tỷ lệ pha loãng lớn hơn 1:20 thường cho hoạt lực tinh sau giải đông thấp hơn (Chamberyon Zohan, 1990; Gwo và ctv., 1991). Đối với tinh trùng hầu Thái Bình Dương theo nghiên cứu của Bougrier (1986) tỷ lệ pha loãng tốt nhất là 1:12,5 và 1:15. Tuy nhiên một số nghiên cứu cho rằng tỷ lệ pha loãng là tương đối rộng, việc lựa chọn sao cho phù hợp với từng loài là cần thiết. 2.3.8. Chất chống đông và nồng độ chất chống đông Chất chống đông đóng vai trò như chất bảo vệ giúp tinh trùng sống sót trong và sau quá trình đông lạnh, hạn chế tối đa ảnh hưởng sốc nhiệt đến tinh trùng trong quá trình làm lạnh và giải đông. Trong một số nghiên cứu nếu không có chất chống đông, nguyên sinh chất của tinh trùng có hiện tượng kết dính lại và tế bào bị phá huỷ, ngay cả khi đã có extender tinh dịch nguyên sinh chất và túi tinh cũng không bảo vệ được tinh trùng khi làm lạnh quá thấp. Một số chất chống đông hay sử dụng để bảo quản tinh là: Glycerol, Ethylene Glycol (EG), Propylen Glycol, Dimethyl Sulfoxide (DMSO), Methanol, Dimthyl Acetamide (DMA). Trên thực tế nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh trong quá trình bảo quản tinh trùng của nhiều loài thuỷ sản thì DMSO là chất chống đông cho kết quả tốt hơn cả. Chất này thuộc nhóm chất có phân tử lượng nhỏ, nhanh chóng thấm qua màng vào tế bào, đẩy một phân tử nước ra ngoài, giúp nguyên sinh chất của tinh trùng không bị phá huỷ trong quá trình đông lạnh. Trong 3 chất Glycerol, Methanol, DMSO thường được sử dụng trong bảo quản tinh hầu, DMSO được coi là hiệu quả nhất nhưng bản thân nó lại gây độc nhất cho tế bào. Kobina Yankson và John Moyse (1991) khi bảo quản tinh của 4 đối tượng hầu (C.tulipa, C.gigas, C.iredalei, C.cucullata) chỉ dùng DMSO với 4 nồng độ 5%, 10%, 15%, 20%. Cho biết kết quả tốt nhất khi bảo quản tinh hầu C.gigas là DMSO 10%, còn 3 đối tượng hầu còn lại thì DMSO 15% là thích hợp nhất. Nhiều tác giả khi nghiên cứu về bảo quản tinh trùng đều cho rằng tiêu chuẩn để đánh giá ngưỡng thích hợp của chất chống đông cũng như nồng độ chất chống đông phụ thuộc vào từng loài khác nhau. 2.3.9. Nhiệt độ và thời gian cân bằng nhiệt Nhiệt độ là nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến sức sống và khả năng vận động của tinh trùng. Nhiệt độ cao hay thấp đều có hại cho tinh trùng. Sự vận động của tinh trùng và nhiệt độ môi trường có liên quan đến nhau. Khi nhiệt độ tăng cao dần thì sức hoạt động của tinh trùng cũng tăng thêm. Thời gian cân bằng nhiệt là thời gian để chất chống đông thấm sâu vào tinh trùng đồng thời giảm các tác nhân lạnh đối với tinh trùng vì vậy sau khi pha loãng tinh dịch cần làm lạnh đều từ từ đến 40C (Tierch và Wayman, 2000). Hyvarien (1983) và Pironen (1993) chỉ ra rằng thời gian cân bằng tốt nhất không quá 1 phút trong khi Bayness và Scott (1987) lại kết luận thời gian cân bằng tốt nhất dài từ 15-30 phút nhưng có thể thay đổi tuỳ thuộc vào loại chất chống đông và nồng độ chất chống đông. Nếu nồng độ chất chất chống đông cao, thời gian cân bằng lâu là rất độc đối với sự phát triển phôi sau này (Shafer, 1981). Dưới những điều kiện đó protein trong tế bào có thể bị biến chất và sức sống của tinh trùng sau giải đông sẽ giảm, càng tăng thời gian cân bằng mức tổn thương càng lớn, sức sống tinh trùng giảm nhanh chóng và tuổi thọ rút ngắn lại. 2.3.10. Tốc độ hạ nhiệt Trong quá trình đông lạnh tinh dịch từ nhiệt độ thấp sang lạnh sâu -1960C giai đoạn đầu nếu khoảng cách nhiệt độ lớn dễ gây hiện tượng sốc nhiệt, giảm sức sống hoặc gây chết hàng loạt tinh trùng. Vì vậy giai đoạn đầu nên giảm từ từ để tinh trùng không bị sốc nhiệt (Bart, 2000). Theo một số giả thuyết, trong quá trình hạ nhiệt tinh dịch, sự đông lại của phần nguyên sinh chất ở hai dạng: dạng rắn ở thể kết tinh và dạng rắn ở thể thuỷ tinh. Dạng rắn ở thể thuỷ tinh, chất nguyên sinh rắn lại không bài tiết được nước, các phân tử nước là nguyên nhân làm phá vỡ tế bào. Khi đông lạnh tinh dịch thì sự nguy hiểm do tác động làm lạnh đã giảm bớt từ thời điểm bắt đầu từ 00C cho nên rút ngắn thời gian tinh dịch ở trạng thái lỏng trong khoảng nhiệt độ dưới 00C là cần thiết, lúc này làm lạnh nhanh nhẩy vọt qua thời kỳ tới hạn của sự kết tinh hoá mạnh hình thành sự rắn của dạng thuỷ tinh. Có nhiều phương pháp làm lạnh trước khi chuyển vào nitơ có thể làm trên đá khô, trong máy làm đá hoặc trên hơi nitơ lỏng. Hiệu quả hơn là làm lạnh theo chương trình cài đặt trên phần mềm (Cryogentic). Bougrier (1986) bảo quản tinh hầu Thái Bình Dương bằng cách làm lạnh trên hơi nitơ lỏng 5cm trong 3 phút sau đó được chuyển vào nitơ lỏng. Còn Adam và ctv., (2004) lại làm lạnh tinh hầu Thái Bình Dương sử dụng máy làm lạnh (Kryo-10 Serie II) với chương trình hạ nhiệt từ 00C tới -800C, giữ ở -800C trong 10 phút sau đó bảo quản trong nitơ lỏng. Nhiều nghiên cứu về bảo quản tinh cho thấy rằng tốc độ làm lạnh được xem là tốt nhất theo chương trình của Steyn và Van Vuren (1987) với các bước hạ nhiệt như sau: Bước 1: Hạ từ 40C xuống -40C, tốc độ hạ nhiệt 40C/phút. Bước 2: Hạ từ -40C xuống -800C, tốc độ hạ nhiệt 110C/phút. Một số nghiên cứu áp dụng : Hạ từ 00C xuống -100C, tốc độ hạ nhiệt 10C/phút. Hạ từ -100C xuống -150C, tốc độ hạ nhiệt 20C/phút. Hạ từ -150C xuống -250C, tốc độ hạ nhiệt 30C/phút. Hạ từ -250C xuống -800C, tốc độ hạ nhiệt 7-80C/phút. Tốc độ hạ nhiệt ảnh hưởng rất lớn đến kết quả bảo quản vì vậy cần tìm chu trình hạ nhiệt phù hợp với đối tượng nghiên cứu. 2.3.11. Phương pháp giải đông Stoss và Holtz (1983) cho rằng tốc độ giải đông có thể là một trong những yếu tố quyết định sự thành công của bảo quản tinh. Trong điều kiện bảo quản ở nitơ lỏng tinh trùng đang ở trạng thái kết dính dưới dạng thuỷ tinh thể, giải đông không đáp ứng nhu cầu về mặt sinh học, cơ học sẽ giảm hoạt lực của tinh trùng, đặc biệt hình thái acrosome của tinh trùng. Kết quả giải đông phụ thuộc vào nhiệt độ, thời gian giải đông, tỷ lệ pha loãng cũng như kích thước viên hoặc cọng chứa tinh dịch. Một số công trình nghiên cứu so sánh kết quả giải đông trong khoảng thời gian như nhau cho thấy phương pháp làm tan giá bằng nước ấm 200C tốt hơn trong không khí, tốc độ tan giá nhanh thu được tỷ lệ hoạt lực tinh trùng cao hơn (Durbin và ctv.,1982). Khi bảo quản tinh hầu Thái Bình Dương, Adam (2004) cho rằng giải đông ở nhiệt độ khoảng 200C trong thời gian từ 15-20 giây cho tỷ lệ thụ tinh cao. 2.3.12. Các yếu tố khác Ngoài các yếu tố trên để đánh giá đúng kết quả cần đảm bảo thao tác thu mẫu, cần gieo tinh theo tỷ lệ hợp lý giữa số lượng trứng và tinh, lượng trứng nhiều hoặc ít đều ảnh hưởng không tốt. Chất lượng trứng, điều kiện môi trường trong quá trình ương ấp cũng là nhân tố ảnh hưởng tới kết quả. Nguyên lý chung của một quy trình đều thực hiện qua các bước sau: thu mẫu tinh, đánh giá chất lượng tinh, lựa chọn dung dịch bảo quản, lựa chọn chất chống đông và nồng độ chất chống đông, tỷ lệ pha loãng với dung dịch bảo quản, thời gian cân bằng, kỹ thuật đóng cọng, phương pháp làm lạnh, phương pháp giải đông, phương pháp thụ tinh. 2.4. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh hầu trên thế giới và ở Việt Nam 2.4.1. Tình hình nghiên cứu bảo quản tinh hầu trên thế giới Cùng với sự ra đời của công nghệ sản xuất giống nhân tạo, thì song song đó các phương pháp bảo quản tinh trùng của các loài cũng được nhiều nhà khoa học tiến hành nghiên cứu. Mục đích của những nghiên cứu này chủ yếu hướng tới việc lưu giữ nguồn tinh trùng phục vụ cho sản xuất, cho bảo tồn nguồn gen đối với một số loài quý hiếm và một số phục vụ các nghiên cứu khoa học về lai tạo giống (Beaumont và Hoare, 2003). Bắt đầu từ những năm 70 của thế kỷ XX, một số công trình nghiên cứu về bảo quản tinh trùng hầu đã được công bố rộng rãi. Với những kỹ thuật khác nhau các nghiên cứu cũng đưa ra đựơc một số kết quả nhất định tuy nhiên vẫn chỉ dừng ở mức khiêm tốn và theo thời gian kỹ thuật bảo quản tinh ngày càng hoàn thiện hơn và cho các kết quả khả quan hơn. Tiersch và ctv.,(2000) đã đề xuất quy trình bảo quản tinh đối với các loài thuỷ sản bao gồm: thu mẫu tinh, đánh giá chất lượng tinh trùng, pha loãng tinh với extender và chất chống đông, kỹ thuật đóng mẫu, chạy chương trình hạ nhiệt, chuyển mẫu tinh vào lưu giữ, giải đông và tiến hành thụ tinh với trứng. Mỗi bước đều ảnh hưởng trực tiếp tới chất lượng tinh bảo quản, nếu như không hoàn thành một trong những khâu đó thì có thể dẫn đến sự thất bại của toàn bộ quy trình kỹ thuật. Công bố đầu tiên về bảo quản tinh hầu phải kể đến là nghiên cứu của Lannan (1971), đối tượng nghiên cứu là hầu Thái Bình Dương (C. gigas), sử dụng nước biển và chất chống đông DMSO 20%. Tỷ lệ thụ tinh ở hai mẫu lần lượt là 7,0% và 9,3%. Các kỹ thuật này được phát triển hoàn thiện hơn bởi các nhà khoa học như: Huges (1973) bảo quản lạnh tinh trùng hầu C.virginica với nước biển và chất chống đông DMSO 5%, 10%. Sau khi được pha loãng (tỷ lệ 1:1) với dung dịch bảo quản được lưu giữ ở nhiệt độ thấp. Hwang và Chen (1973) đã nghiên cứu bảo quản tinh trùng hầu C.gigas, dung dịch bảo quản là nước biển, 2 chất chống đông (DMSO, Glycerol) với 6 nồng độ khác nhau (3,3%; 5%; 6,6%; 7,5%; 15%; 20%) sau đó bảo quản trong nitơ lỏng. Vẫn trên đối tượng hầu C.gigas, Staeger (1974) một lần nữa thí nghiệm sử dụng dung dịch bảo quản là nước biển, 2 chất chống đông (DMSO, Glycerol) nồng độ 20%, tỷ lệ pha loãng 1:1, bảo quản ở -1700C. Tuy nhiên những nghiên cứu này vẫn chưa thu được kết quả tốt từ tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng được bảo quản lạnh. Vào năm 1979, với phương pháp nghiên cứu của Zell và cộng sự trên hầu C.virginicia đã cho kết quả khá tốt, tỷ lệ thụ tinh từ 78-91% với tinh trùng được bảo quản lạnh. Sử dụng chất bảo quản gồm NaHCO + glycine + DMSO 8%, tỷ lệ pha loãng 1:6 sau đó làm lạnh xuống -800C rồi bảo quản trong nitơ lỏng. Năm 1986, Bougrier thí nghiệm trên hầu C.gigas. Tinh hầu sau khi thu được, pha loãng với dung dịch bảo quản, tỷ lệ (1:5; 1:10; 1:12,5; 1:15; 1:17,5; 1:20 ). Công thức của dung dịch bảo quản được sử dụng là: DCSB4 (pH 8.5) + DMSO 10%. Sau khi được đóng cọng, làm lạnh trên hơi nitơ lỏng 5cm trong 3 phút thì được chuyển vào bảo quản trong nitơ lỏng (-1960) trong thời gian không quá 3 ngày. Giải đông ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Kết quả cho thấy tỷ lệ pha loãng 1:12,5 và 1:15 cho kết quả tốt hơn hẳn, tỷ lệ thụ tinh của tinh trùng sau khi bảo quản ở 3 ngày đạt 92%. Nghiên cứu của Kobina Yankson và John Moyse (1991) trên 4 đối tượng hầu (C.tulipa, C.gigas, C.i._.