Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn giống khoai tây sạch bệnh

úp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã đ−ợc cám ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã đ−ợc chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Hà Thị Hân ii Lời Cảm ơn Để hoàn thành báo luận văn, trong quá trình thực tập tôi đã nhận đ−ợc sự giúp đỡ tận tình và điều kiện thuận lợi của tr−ờng Đại Học Nông Nghiệp I - Hà Nội, Khoa Nông học, Bộ môn Sinh lý thực vật. Tr−ớc hết tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cô giáo TS. Nguyễn Thị Kim Thanh, ng−ời đã tận tình h−ớng dẫn, chỉ bảo, giúp đỡ tôi trong quá trình thực tập và hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tới toàn thể các thầy giáo, cô giáo, các cán bộ công nhân viên chức trong Bộ môn Sinh lý thực vật, Bộ môn Công nghệ sinh học - Khoa Nông Học - Tr−ờng Đại Học Nông Nghiệp I Hà Nội. Nhân dịp này, tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới những ng−ời thân trong gia đình, bạn bè đã giúp đỡ động viên và khuyến khích tôi trong suốt thời gian học tập và hoàn thành luận văn. Tác giả luận văn Hà thị Hân iii Mục lục 1.1. Đặt vấn đề x 1.2. Mục đích, yêu cầu xii 1.3. ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn xiii 2. Tổng quan tài liệu xiv 2.1. Giới thiệu chung về cây khoai tây xiv 2.2. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam xvii 2.3. Thực trạng về tình hình giống khoai tây ở Việt Nam xxii 2.4. Kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn gene thực vật xxviii 2.5. Tình hình nghiên cứu bảo quản in vitro trong và ngoài n−ớc xxxiv 3. Vật liệu, nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu xxxix 3.1. Vật liệu nghiên cứu xxxix 3.2. Nội dung nghiên cứu xxxix 3.3. Ph−ơng pháp nghiên cứu xlii 3.4. Xử lý số liệu xlv 4. Kết quả và thảo luận xlvi 4.1. Nghiên cứu ảnh h−ởng của việc giảm dinh d−ỡng trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro xlvi 4.1.1. Nghiên cứu ảnh h−ởng của các loại môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro xlvi 4.1.2. Nghiên cứu ảnh h−ởng của việc giảm hàm l−ợng dinh d−ỡng môi tr−ờng MS đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro li 4.2. Nghiên cứu ảnh h−ởng của nền môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro lvi 4.3. Nghiên cứu sử dụng các chất gây áp suất thẩm thấu trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro lx iv 4.3.1. Nghiên cứu sử dụng nồng độ đ−ờng cao trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro lxi 4.3.2. Nghiên cứu sử dụng manitol trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro lxvi 4.3.3. Nghiên cứu sử dụng sorbitol trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro lxx 4.4. Nghiên cứu ảnh h−ởng của nhịêt độ thấp đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro lxxv 4.5. Nghiên cứu ảnh h−ởng của nồng độ Chlor cholin chlorit (CCC) trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro lxxx 4.6. Nghiên cứu khả năng bảo quản nguồn giống khoai tây thông qua việc tạo và l−u giữ củ siêu bi in vitro lxxxv 5. Kết luận và đề nghị lxxxviii 5.1. Kết luận lxxxviii 5.2. Đề nghị lxxxix Tài liệu tham khảo xc Phần phụ lục 87 v Danh Mục Các từ Viết tắt ABA : Axít abscisic BA : Benzyl adenin CS : Cộng sự CTĐC : Công thức thí nghiệm CTTN : Công thức thí nghiệm CTV : Cộng tác viên ĐC : Đối chứng Fao : Tổ chức nông l−ơng thế giới KHKT : Khoa học kỹ thuật NXB : Nhà xuất bản NN : Nông nghiệp PP : Page paper PTS : Phó tiến sĩ TS : Tiến Sĩ Tr : Trang vi Danh mục bảng Bảng 2.1. Diện tích, năng suất, sản l−ợng khoai tây thế giới trong một số năm gần đây xviii Bảng 2.2. Diện tích, năng suất, sản l−ợng khoai tây từ 1976 - 2002 xx Bảng 4.1. Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro trong các môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau xlviii Bảng 4.2. Chiều cao, số lá của cây khoai tây in vitro trong các môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau (sau cấy 8 tuần) xlix Bảng 4.3. Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng giảm hàm l−ợng dinh d−ỡng lii Bảng 4.4. Chiều cao, số lá của cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng giảm hàm l−ợng dinh d−ỡng (sau 8 cấy tuần) liii Bảng 4.5. Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có hàm l−ợng agar khác nhau lvii Bảng 4.6. Chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có hàm l−ợng agar khác nhau (sau cấy 8 tuần) lviii Bảng 4.7. Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng nuôi cấy có nồng độ đ−ờng cao lxii Bảng 4.8. Chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có nuôi cấy có nồng độ đ−ờng cao (sau cấy 8 tuần) lxiii Bảng 4.9. Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có bổ sung manitol lxvii Bảng 4.10. Chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng nuôi cấy có bổ sung manitol (sau cấy 20 tuần ) lxviii Bảng 4.11. Thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có bổ sung sorbitol với các nồng độ khác nhau lxxi vii Bảng 4.12. Chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có bổ sung sorbitol với các nồng độ khác nhau (sau cấy 20 tuần) lxxii Bảng 4.13. ảnh h−ởng của nhiệt độ thấp đến thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro lxxvi Bảng 4.14. ảnh h−ởng của nhiệt độ thấp đến sự sinh tr−ởng chiều cao, số lá của cây khoai tây in vitro (sau cấy 20 tuần) lxxvii Bảng 4.15. ảnh h−ởng của nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy đến thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái của cây khoai tây in vitro lxxxi Bảng 4.16. ảnh h−ởng của nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy đến sự sinh tr−ởng chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro (sau cấy 20 tuần) lxxxii Bảng 4.17. Đánh giá khả năng duy trì nguồn giống khoai tây bằng tạo và l−u giữ củ siêu bi trên môi tr−ờng nuôi cấy lxxxvi viii Danh mục hình Hình 1. ảnh h−ởng của các loại môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau đến tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro xlvii Hình 2. Tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng giảm hàm l−ợng dinh d−ỡng liv Hình 3. Tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có hàm l−ợng agar khác nhau lvii Hình 4. Tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng nuôi cấy có nồng độ đ−ờng cao lxii Hình 5. Tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có bổ sung manitol lxvii Hình 6. Tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong môi tr−ờng có bổ sung sorbitol lxxiii Hình 7. ảnh h−ởng của nhịêt độ thấp đến tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro lxxviii Hình 8. ảnh h−ởng của nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy đến tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro lxxxiii ix x 1. Mở đầu 1.1. Đặt vấn đề Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) là một trong bốn loại cây trồng quan trọng (khoai tây, lúa n−ớc, ngô và lúa mì) trong hệ thống cây trồng của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trong thành phần củ khoai tây có chứa nhiều chất dinh d−ỡng quan trọng nh− protein, lipit, các loại vitamin và các chất khoáng (Tạ Thu Cúc, 2000) [10]. Vì vậy khoai tây đ−ợc coi là cây l−ơng thực, thực phẩm chính, quan trọng của nhiều n−ớc trên thế giới. Khoai tây là cây trồng có nhiều đặc tính nông sinh học quý nh−: thời gian sinh tr−ởng ngắn, thích nghi đ−ợc với nhiều vùng sinh thái và nhiều chân đất khác nhau, năng suất củ cao nên đ−ợc trồng rộng rãi ở nhiều n−ớc trên thế giới. Từ năm 1988 đã có 130 n−ớc trồng khoai tây với tổng diện tích 18,3 triệu ha và tổng sản l−ợng là 295,1 triệu tấn, năng suất trung bình là 16 tấn /ha (Tr−ơng Đích,1997) [12]. ở Việt Nam, khoai tây đ−ợc đ−a vào trồng ở Đồng Bằng Sông Hồng từ những năm 1890 do ng−ời Pháp mang đến (Tr−ơng Văn Hộ và cộng sự, 2002) [14]. Sau khi vụ đông ra đời cây khoai tây đ−ợc coi là cây trồng mang lại thu nhập cao và đ−ợc trồng trong 11 công thức luân canh khác nhau (Đỗ Kim Chung, 2003) [7]. Hiện nay với phong trào “cánh đồng 50 triệu đồng/ha/năm” thì sản xuất khoai tây có ý nghĩa rất quan trọng. Một vụ khoai tây có thể cho năng suất 20 tấn/ha, với giá bán bình quân 2000 đồng/kg đã cho thu nhập khoảng 40 triệu đồng/ha [12]. Tuy nhiên, ở n−ớc ta hiện nay sản xuất khoai tây ch−a phản ánh đúng tiềm năng của nó. Trong khi nhu cầu về tiêu dùng khoai tây ngày càng tăng nh−ng năng suất và sản l−ợng khoai tây vẫn còn rất thấp chỉ đạt khoảng 8- 10 tấn/ha trong khi đó một số n−ớc trên thế giới năng suất đạt tới 40 - 50 tấn/ha, vì thế, sản xuất khoai tây ở n−ớc ta vẫn ch−a đáp ứng nhu cầu tiêu dùng khoai xi tây trong n−ớc (Đỗ Kim Chung, 2003)[7]. Nguyên nhân cơ bản của hạn chế trên là do vấn đề giống khoai tây, từ nhiều năm nay ng−ời trồng khoai tây đa số vẫn sử dụng củ không đảm bảo chất l−ợng để làm giống, đó là những củ ở trong n−ớc hoặc nhập từ Trung Quốc đã bị thoái hoá do bị già sinh lý hoặc bị nhiễm bệnh virus nên đã làm giảm đáng kể năng suất khoai tây, vì thế hiệu quả kinh tế đem lại cho ng−ời trồng khoai tây còn rất thấp. Trên thế giới, đối với các n−ớc có nền nông nghiệp phát triển do đã tổ chức đ−ợc một hệ thống sản xuất giống khoai tây quốc gia chặt chẽ nên đã khắc phục hiện t−ợng này, nhờ đó năng suất khoai tây tăng lên liên tục và nền sản xuất khoai tây phát triển khá ổn định. Cây khoai tây có đặc điểm rất dễ bị lây nhiễm virus. Theo nghiên cứu của Vũ Triệu Mân (1978)[16], khoai tây th−ờng bị nhiễm 6 loại virus làm cho cây sinh tr−ởng chậm, còi cọc, biến dạng và củ nhỏ dẫn đến giảm năng suất từ 30 - 90%. Đặc biệt, virus có các đặc tính nguy hiểm nh−: không thể chữa đ−ợc, truyền cho đời sau qua củ, lây lan qua côn trùng truyền bệnh và xây xát cơ giới. Tốc độ tái nhiễm virus rất nhanh, khi nhiễm bệnh virus mà không có cách khắc phục thì sẽ bị lây lan đến mức tối đa (Trần Văn Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, 1993)[19]. Do vậy khi củ giống có tỷ lệ nhiễm virus khoảng 10% là đã gây ảnh h−ởng đáng kể đến sinh tr−ởng phát triển và năng suất khoai tây, vì vậy lúc này cần phải thay thế giống sạch bệnh (Nguyễn Thị Kim Thanh,1998) [28]. Hiện nay để có giống sạch bệnh ng−ời ta bắt nguồn từ kỹ thuật nuôi cấy Meristen, một cơ quan gần nh− không có virus. Bằng các ph−ơng pháp kiểm tra hiện đại kết hợp với nuôi cấy mô ng−ời ta sẽ tạo đ−ợc cây sạch bệnh virus, đ−a vào hệ thống sản xuất giống đ−ợc kiểm tra chặt chẽ từ khâu đầu cho tới khi sản phẩm cuối cùng đ−a ra sản xuất là các củ giống khoai tây sạch bệnh (Nguyễn Quang Thạch và cộng sự, 1991) [22]. Song khâu đầu tiên cần phải có nguồn vật liệu sạch bệnh. Với kỹ thuật “lọc sạch” virus bằng nuôi cấy Meristem thì tỷ lệ thành công thấp và tốn nhiều xii thời gian. Do vậy, xu h−ớng chiến l−ợc của các n−ớc trồng khoai tây trên thế giới hiện nay là cần chủ động l−u giữ nguồn vật liệu ban đầu sạch virus để cung cấp cho hệ thống sản xuất giống, nhằm rút ngắn và tăng hiệu quả của hệ thống sản xuất giống để th−ờng xuyên cung cấp nhanh nhất nguồn giống khoai tây sạch bệnh thay thế l−ợng giống khoai tây đã bị thoái hoá trong sản xuất. Trên thế giới, nhiều nhà khoa học quan tâm nghiên cứu kỹ thuật bảo quản, duy trì nguồn vật liệu khoai tây sạch bệnh bằng các ph−ơng pháp khác nhau (insitu, exsitu). Trong đó, ph−ơng pháp bảo quản insitu (bảo quản tại chỗ) có hiệu quả không cao vì cây khoai tây là cây dễ bị lây nhiễm virus trong điều kiện tự nhiên. Sau một vụ trồng, tỷ lệ nhiễm virus có thể 50% đến 100 (Vũ Triệu Mân, 1986) [17]. Vì vậy, đối với cây khoai tây cần đ−ợc áp dụng ph−ơng pháp bảo quản exsitu (bảo quản trong điều kiện nhân tạo). Trong đó, ph−ơng pháp bảo quản in vitro là ph−ơng pháp bảo quản có hiệu quả cao đối với cây khoai tây. Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn giống khoai tây sạch bệnh”. 1.2. Mục đích, yêu cầu 1.2.1. Mục đích Nghiên cứu một số yếu tố tác động làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro hoặc duy trì củ khoai tây in vitro với mục đích kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển bằng cây hoặc củ in vitro. Trên cơ sở đó có thể cung cấp một cách chủ động nguồn cây hoặc củ khoai tây in vitro sạch bệnh cho hệ thống sản xuất khoai tây. 1.2.2. Yêu cầu - Xác định đ−ợc ảnh h−ởng của các yếu tố: nhiệt độ thấp, các chất làm tăng áp suất thẩm thấu (saccarose, sorbitol và manitol), môi tr−ờng nghèo dinh d−ỡng, nền môi tr−ờng, chất ức chế sinh tr−ởng CCC (chlor cholin chlorit axit) trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro nh−ng vẫn đảm bảo chất l−ợng cây tốt. xiii - Đánh giá khả năng bảo quản khoai tây bằng ph−ơng pháp l−u giữ củ microtuber (siêu bi) trong ống nghiệm. 1.3. ý nghĩa khoa học, ý nghĩa thực tiễn 1.3.1. ý nghĩa khoa học Đánh giá đ−ợc tác động làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro của các yếu tố sử dụng trong thí nghiệm (nhiệt độ thấp, các chất làm tăng áp suất thẩm thấu, môi tr−ờng nghèo dinh d−ỡng, CCC, hàm l−ợng agar) và khả năng l−u giữ củ khoai tây trong ống nghiệm. Cung cấp thêm những dẫn liệu cơ bản về lĩnh vực duy trì nguồn giống sạch bệnh làm tài liệu cho nghiên cứu giảng dạy. 1.3.2. ý nghĩa thực tiễn Xác định kỹ thuật bảo quản nguồn giống khoai tây sạch bệnh in vitro để chủ động cung cấp nguồn vật liệu sạch bệnh ban đầu cho hệ thống sản xuất khoai tây giống ở n−ớc ta nhằm góp phần thúc đẩy nền sản xuất khoai tây giống trong n−ớc để thay thế dần khoai tây giống nhập nội. xiv 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Giới thiệu chung về cây khoai tây 2.1.1. Nguồn gốc, phân loại cây khoai tây Cây khoai tây có nguồn gốc ở vùng núi cao Ander thuộc Lack Tinicaca Nam Mỹ. Trong quá trình thuần hoá khoai tây đ−ợc lan rộng khắp vùng núi Ander. Vào thế kỷ XVI ng−ời Tây Ban Nha chinh phục châu Mĩ, nông dân đã trồng nhiều giống khoai tây dọc miền núi bây giờ là Bolivia, Columbia, Ecuador và Peru. Từ Tây Ban Nha khoai tây đã lan truyền tới nhiều n−ớc châu á vào thế kỷ XVII, cho tới thế kỷ XVIII lan truyền khắp các n−ớc châu Âu và đ−ợc trồng rộng rãi (Tạ Thu Cúc, 2000) [10]. Cây khoai tây (Solanum tuberosum L.) thuộc họ cà (Solanaceae), bộ cà (Solanales), phân lớp bạc hà (Limiidea), lớp ngọc lan (Magnoliophyta) (Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên, 1969, D−ơng Đức Tiến, 1978) [3] [4]. Có nhiều cách phân loại khác nhau, nh−ng theo Haward H. W. (1990), Hawkes J.G. (1982) [43] [45] thì khoai tây đ−ợc phân loại theo số l−ợng nhiễm sắc thể nh− sau: - Loại nhị bội thể (2n=24) gồm 4 loài là: S. Xajanhuiri, S. goniocalyx, S. phureja, S. setenotonum. - Loại tam bội thể (3n=36) gồm 2 loại là: S.xchaucha, S.xjuzeperukii. - Loại tứ bội thể (4n=48) phân bố rộng rãi nhất chiếm 70%, loại này gồm 2 loài phụ là Solanaceae tuberosum spp.tuberosum và spp andigena. - Loại ngũ bội (5n=60) gồm S. xcurtilobum. - Loại lục bội (6n=72) gồm S. demissium. xv 2.1.2. Giá trị dinh d−ỡng và ý nghĩa kinh tế của cây khoai tây Khoai tây là một cây l−ơng thực và thực phẩm có giá trị dinh d−ỡng cao. Trong củ khoai tây có chứa rất nhiều dinh d−ỡng quan trọng nh−: protein, đ−ờng, lipit, các loại vitamin, caroten, B1, B2, B3, B6, PP và đặc biệt là vitamin C, ngoài ra còn có các chất khoáng quan trọng nh− K, P và Mg. Trong 100g khoai tây luộc có ít nhất 5% nhu cầu protein, 3% năng l−ợng, 7 - 12% Fe, 10% vitamin B6 và 50% nhu cầu vitamin C cho ng−ời /ngày (Tạ Thu Cúc, Hồ Hữu An, 2000) [10]. Theo Beukema, Vanderzaag (1979), trong số các cây trồng của vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới từ 30° vĩ Bắc đến 30° vĩ Nam thì khoai tây là cây sinh lợi hơn cả, do có năng suất năng l−ợng và năng suất protein cao nhất. Nếu protein của trứng là 100% thì của khoai tây là 71% cao hơn ngô, đậu t−ơng, bột mì và đậu Hà Lan [28]. Giá trị dinh d−ỡng của một số sản phẩm nh− sau: Sản phẩm Tỷ lệ protein sử dụng (% so với trứng) Trứng 100 Khoai tây 71 Đậu t−ơng 56 Ngô 55 Bột mì 52 Đậu Hà Lan 44 Do vậy khoai tây đ−ợc xếp là l−ơng thực quan trọng đứng hàng thứ ba trên thế giới chỉ sau lúa mì và lúa n−ớc. ở Việt Nam khoai tây là cây l−ơng thực và thực phẩm đứng hàng thứ t− sau lúa, ngô, khoai lang và là cây không thể thiếu trong cơ cấu cây trồng vụ đông (Nguyễn Quang Thạch, 1993) [23]. xvi Theo Ngô Đức Thiệu (1978,) [33], thì ở các n−ớc phát triển khoai tây đ−ợc sử dụng làm thức ăn gia súc. Nếu năng suất khoai tây 150 tạ củ và 80 tạ thân lá/ha có thể đảm bảo 5.500 đơn vị thức ăn gia súc. ở Việt Nam sản xuất khoai tây cũng góp to lớn cho chăn nuôi nhất là chăn nuôi lợn (90% hộ trồng khoai tây sử dụng củ nhỏ làm thức ăn cho chăn nuôi) (Nguyễn Công Chức, 2001) [8]. Bên cạnh giá trị làm l−ơng thực, thực phẩm, thức ăn cho gia súc, khoai tây còn là nguồn nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp chế biến. Tinh bột khoai tây có thể sử dụng trong ngành công nghiệp dệt, gỗ ép, giấy và đặc biệt là trong công nghiệp chế biến axit hữu cơ (lactic, xitric), dung môi hữu cơ (Etanol, Butanol), axit cacbonic và nhiều sản phẩm phụ khác. −ớc tính 1 tấn khoai tây củ có hàm l−ợng tinh bột là 17,6% chất t−ơi thì sẽ cho 112 lít r−ợu, 55 kg axit hữu cơ và một số sản phẩm phụ khác, hoặc là 170 kg tinh bột hoặc là 80 kg glucoza cùng nhiều sản phẩm khác [28]. Do vậy khoai tây đ−ợc l−u thông trên thị tr−ờng thế giới với khối l−ợng rất lớn hàng năm và là một trong những mặt hàng nông sản bán chạy nhất. Giá 1 tấn khoai tây lên đến 265 - 270 USD năm 1986 tại Anh (Lê H−ng Quốc, 2002) [21]. ở Việt Nam, theo kết quả điều tra tại các tỉnh: Bắc Giang, Hà Tây, Thái Bình cho thấy lãi ròng trên một hecta khoai tây th−ơng phẩm chính vụ dao động từ 3,83 đến 10,90 triệu đồng (1999). Sản xuất giống cho giá trị cao hơn sản xuất khoai tây th−ơng phẩm từ 2 - 4 lần. Lãi ròng đối với sản xuất khoai tây cao hơn từ 1,7 - 3,8 lần so với khoai lang và ngô (Nguyễn Công Chức, 2002) [9]. Khoai tây có vai trò kinh tế xã hội to lớn, hiện nay sản xuất khoai tây đóng góp từ 42 - 87% thu nhập từ cây vụ đông, 4,5 - 34,5% thu nhập từ trồng trọt, 4,5 - 22,5% trong tổng thu nhập của hộ trồng khoai tây. Với diện tích khoai tây nh− hiện nay khoảng trên d−ới 30.000 ha, ngành sản xuất này đã tạo ra việc làm cho 120.000 - 180.000 lao động nông nghiệp trong vụ đông xuân [9]. Vì vậy, hiện nay khoai tây đ−ợc xác định là một trong những cây chủ yếu xvii nằm trong ch−ơng trình tạo công ăn việc làm, nâng cao thu nhập, đảm bảo an toàn l−ơng thực và cải thiện chế độ dinh d−ỡng cho ng−ời dân vùng đồng bằng và miền núi phía Bắc (Nguyễn Tiến H−ng, 2003) [15]. Ngoài ra sản xuất khoai tây còn đem lại lợi ích lâu dài và đáng kể khác nh−: làm tăng năng suất các cây trồng sau đó, tăng độ phì nhiêu và màu mỡ của đất, giảm chi phí làm đất và làm cỏ [10]. 2.2. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới và Việt Nam 2.2.1. Tình hình sản xuất khoai tây trên thế giới Do có vai trò kinh tế và dinh d−ỡng to lớn nên cây khoai tây đ−ợc trồng rộng rãi trên thế giới với 130 n−ớc khác nhau, từ 71° vĩ Bắc đến 40° vĩ Nam. Tuy nhiên, do các điều kiện về khí hậu tự nhiên, điều kiện kinh tế và các điều kiện về khoa học kỹ thuật khác nhau nên diện tích trồng khoai tây và sản l−ợng khoai tây khác nhau giữa các châu lục và các n−ớc (FAO , 2001) [1]: Châu á có số n−ớc trồng khoai tây nhiều nhất so với các châu lục khác là 42 n−ớc với tổng diện tích năm 2001 là 7,7 triệu ha, năng suất bình quân là 15,2 tấn, sản l−ợng là 116,853 triệu tấn (FAO, 2001) [1]. Châu âu có số n−ớc trồng khoai tây nhiều thứ hai thế giới là 38 n−ớc với tổng diện tích năm 2001 là 8,966 triệu ha (đứng thứ nhất thế giới ), năng suất bình quân là 15,3 tấn/ha, sản l−ợng là 137,272 triệu tấn (FAO, 2001) [1]. Châu Phi có số n−ớc trồng khoai tây nhiều thứ ba thế giới là 37 n−ớc với tổng diện tích là 1,185 triệu ha, năng suất bình quân là 11,3 tấn/ha (thấp nhất thế giới), sản l−ợng là 13,407 triệu tấn (FAO, 2001) [1]. Bắc và Nam Mỹ có 18 n−ớc trồng khoai tây với tổng diện tích là 0,764 triệu tấn, năng suất trung bình là 34,5 tấn/ha (cao nhất thế giới), sản l−ợng 26,372 triệu tấn (FAO, 2001) [1]. xviii Nam Mỹ có 10 n−ớc trồng khoai tây với tổng diện tích là 0,914 triệu ha, năng suất bình quân là 14,9 tấn/ha, sản l−ợng 13,648 triệu tấn (FAO, 2001)[1]. Châu Đại D−ơng là châu lục có diện tích và sản l−ợng khoai tây thấp nhất so với các châu lục khác: tổng diện tích trồng khoai tây là 0,052 triệu ha, sản l−ợng là 1,753 triệu tấn, tuy nhiên năng suất khoai tây ở đây khá cao đứng thứ hai thế giới sau Bắc và Trung Mỹ, trung bình đạt 33,5 tấn/ha, đặc biệt ở châu lục này có New Zealand là n−ớc có năng suất khoai tây cao nhất so với các n−ớc trên thế giới là 50 tấn/ha (FAO, 2001) [1]. Trong đó Trung Quốc là n−ớc đứng đầu thế giới về diện tích trồng khoai tây đạt 4,602 triệu ha (năm 2001), Nga đứng thứ hai thế giới về diện tích trồng khoai tây là 3,211 triệu ha (FAO, 2001) [1]. Theo kết quả công bố của FAO (2000) [39] các n−ớc đứng đầu thế giới về sản l−ợng khoai tây là Trung Quốc đạt 62036 triệu tấn/năm, sau đó là Hà Lan đạt 24232 triệu tấn/năm, ấn Độ đạt 23500 triệu tấn/năm và Mỹ là 23404 triệu tấn/năm. Bảng 2.1. Diện tích, năng suất, sản l−ợng khoai tây thế giới trong một số năm gần đây Năm Diện tích ( triệu ha) Năng suất (tấn/ha) Sản l−ợng (triệu tấn) 1998 18,788 15,900 299,768 1999 19,613 15,300 299,556 2000 20,028 16,400 328,361 2001 19,581 15,800 309,307 (Nguồn: Fao, 2001) xix 2.2.2. Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam Khoai tây đ−ợc du nhập vào Việt Nam từ năm 1890 do ng−ời Pháp mang tới (Tạ Thu Cúc, 2000) [10]. Tuy nhiên cho đến đầu thập kỷ 70 với sự áp dụng rộng rãi về giống lúa mới có năng suất cao, thời gian sinh tr−ởng ngắn hơn so với các giống truyền thống, nông dân vùng đồng bằng sông Hồng có điều kiện trồng thêm vụ đông sau khi thu hoạch vụ lúa xuân và lúa mùa trong một năm. Thời kỳ này cây khoai tây đ−ợc coi là cây l−ơng thực trong hệ thống các cây l−ơng thực thực phẩm của Việt Nam (Tr−ơng Văn Hộ, Nguyễn Văn Kim, 2002) [14]. Hiện nay khoai tây đ−ợc trồng rộng rãi ở hầu hết các tỉnh trong cả n−ớc, đặc biệt là các tỉnh vùng đồng bằng châu thổ sông Hồng, Đà Lạt, Lâm Đồng. Với hệ thống canh tác tiên tiến trong những năm gần đây thì khoai tây là cây vụ đông quan trọng trong công thức luân canh: lúa mùa - khoai tây - luá xuân của các tỉnh vùng đồng bằng châu thổ sông Hồng và miền núi phía Bắc. Mặt khác cây khoai tây có khả năng thích nghi với nhiều loại đất khác nhau, do đó có khả năng mở rộng diện tích trồng ở Việt Nam (Hồ Hữu An, Đinh Thế Lộc, 2005) [1]. Tuy nhiên trong thực tế sản xuất khoai tây ở Việt Nam ch−a phát triển mạnh, diện tích trồng và sản l−ợng lại có xu h−ớng giảm. Tổng diện tích sản xuất khoai tây đã giảm dần từ 93.900 ha, với năng suất 9,3 tấn/ha (năm 1890) xuống còn 32.100 ha với năng suất 8,1 tấn/ha (năm 1993) và khoảng 30.000ha với năng suất 11 tấn/ha (năm 2001) (Đào Huy Chiên, Tr−ơng Văn Hộ, Peter Vanderzaag và ctv, 2001 - 2002) [5] [6]. Trong một vài năm trở lại đây (từ 2000 đến nay) diện tích trồng khoai tây lại có xu h−ớng tăng dần vào đầu niên vụ 2002 - 2003, đạt khoảng 35.000 ha. Sự tăng lên về diện tích trồng khoai tây chủ yếu là do nhu cầu sử dụng khoai tây và tiến bộ kỹ thuật áp dụng trong sản xuất khoai tây, đặc biệt là các tiến bộ kỹ thuật kỹ thuật về giống. Sản l−ợng khoai tây dao động từ 260.100 tấn - 361.638 tấn giai đoạn 1976 - 1990, từ xx 243.348 tấn - 382.296 tấn giai đoạn 1991 - 2000 và tăng tới 400.000 - 421036 tấn niên vụ 2002 - 2003 (Đỗ Kim Chung, 2003) [7] (Bảng 2.2) Bảng 2.2. Diện tích, năng suất, sản l−ợng khoai tây từ 1976 - 2002 Năm Diện tích (ha) Năng suất (tấn/ha) Sản l−ợng (tấn) 1976 25500 10,02 260100 1980 90600 8,73 576000 1985 23600 7,99 188564 1990 36200 9,99 361638 1991 31936 9,02 288063 1992 25748 10,07 259282 1993 27245 9,00 245205 1994 26233 9,28 243349 1995 27747 8,93 247683 1996 32687 10,36 338780 1997 31972 10,96 350262 1998 37672 10,15 382296 1999 30121 11,58 348826 2000 28022 11,57 342128 2001 33321 11,94 397689 2002 34968 12,04 421036 (Nguồn tính toán từ niên giám tổng cục thống kê 2004) xxi Yếu tố quan trọng ảnh h−ởng đến năng suất khoai tây ở Việt Nam hiện nay là chất l−ợng củ giống. Hiện nay trên thị tr−ờng giống khoai tây của Việt Nam còn có nhiều bất cập: giống nhập từ Trung Quốc có chất l−ợng thấp (chủ yếu là khoai tây thịt và không đ−ợc kiểm dịch chặt chẽ), các giống nhập khẩu từ Đức và Hà Lan có chất l−ợng cao thì giá thành lại quá đắt nông dân không có khả năng đầu t−, hệ thống sản xuất giống tốt ở trong n−ớc còn thiếu, giống do nông dân tự để đã thoái hoá nghiêm trọng (Nguyễn Kim Chung, 2003)[7]. Ngay cả ở nơi có trình độ thâm canh, có truyền thống sản xuất khoai tây lâu đời nh− Hạ Hồi - Th−ờng Tín thì năng suất khoai tây cũng chỉ đạt từ 12 - 13 tấn/ha. Các giống khoai tây mà ng−ời nông dân sử dụng hiện nay hầu hết là do nông dân tự duy trì từ vụ này qua vụ khác, hoặc là các giống nông dân tự mua không rõ nguồn gốc. Do vậy hầu hết là các giống đã bị thoái hoá nghiêm trọng, tỷ lệ nhiễm bệnh virus cao từ 54 - 65% và hao hụt trong bảo quản lớn từ 45 - 60%. Khoai tây là cây trồng nhân giống chủ yếu bằng con đ−ờng vô tính, có tỷ lệ tái nhiễm virus cao. Hơn nữa trong điều kiện sản xuất của Việt Nam, củ giống khoai tây phải bảo quản qua thời gian dài (khoảng 9 tháng, từ tháng 2 - tháng 10), d−ới điều kiện nóng ẩm của mùa hè làm cho sự hao hụt về khối l−ợng do thối hỏng lên tới 50%, củ giống bị già sinh lý nhanh chóng, khi trồng cây mọc sớm, thời gian sinh tr−ởng ngắn, tỷ lệ củ bi lớn, số củ th−ơng phẩm giảm, năng suất thấp (Nguyễn Quang Thạch, 1993) [24]. Theo Ngô Đức Thiệu (1984) [34] thoái hoá là quá trình làm giảm dần năng suất gieo trồng của khoai tây biểu hiện ở chỗ củ khoai tây ngày một nhỏ đi cả về kích th−ớc lẫn trọng l−ợng, chất l−ợng củ xấu dần, hàm l−ợng các chất dinh d−ỡng giảm dần so với tr−ớc. Nếu quá trình này diễn ra lâu dài mà không đ−ợc cải tạo sẽ đ−a đến tác hại là tiêu diệt hoàn toàn giống khoai tây nào đó. Hiện t−ợng thoái hoá giống khoai tây ở Việt Nam hiện nay cũng là hiện t−ợng chung của tất cả các n−ớc trồng khoai tây. Sau một số vụ trồng khoai xxii tây liên tiếp cây bị thấp, lùn, sinh tr−ởng kém, lá xoăn, thân lá dị dạng, củ nhỏ, năng suất giảm (Vũ Triệu Mân, 1986) [17]. Theo Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn & ctv (1993)[24] thì chất l−ợng củ giống đ−ợc quyết định bởi độ sạch bệnh virus và bởi tuổi sinh lý của củ giống. Nh− vậy cây khoai tây có hai nguyên nhân gây thoái hoá chính là: - Thoái hoá do virus (nguyên nhân bệnh lý). - Thoái hoá do sự già hoá củ giống (nguyên nhân sinh lý). Trong đó virus là nguyên nhân chính dẫn tới hiện t−ợng thoái hoá giống khoai tây, hiện t−ợng này đã đ−ợc Parmentier phát hiện từ năm 1876. Sau đó khoảng một thế kỷ ng−ời ta mới xác định đặc tính của virus và khẳng định chúng là nguyên nhân chính gây thoái hoá khoai tây. Cho đến năm 1913 thì bệnh thoái hoá khoai tây mới chính thức đ−ợc đề nghị bởi Quanjer - Viện bảo vệ thực vật Wageningen (Nguyễn Quang Thạch, 1993) [24]. Do đó để khắc phục bệnh virus cần tiến hành sử dụng giống sạch bệnh bằng các biện pháp sau: + Sử dụng giống sạch bệnh bằng con đ−ờng nhập nội giống khoai tây từ các n−ớc: Hà Lan, Pháp, Đức ... + Xây dựng hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh trong n−ớc. Đây là giải pháp chủ động, tích cực nh−ng cần đ−ợc đầu t− và tổ chức thực hiện tốt. 2.3. Thực trạng về tình hình giống khoai tây ở Việt Nam 2.3.1. Cơ cấu giống khoai tây Theo kết quả điều tra của dự án hợp tác Việt - Đức "Thúc đẩy sản xuất khoai tây ở Việt Nam" (Đỗ Kim Chung, 2003) [7] thì hiện nay trong sản xuất của chúng ta có 5 nhóm giống khoai tây là: giống Th−ờng Tín (Akasagen), xxiii các giống khoai tây nhập từ châu Âu, giống khoai tây hạt lai (TPS), giống khoai tây cải tiến KT3 và các giống nhập khẩu từ Trung Quốc. Nông dân miền Bắc trồng chủ yếu là giống khoai tây Th−ờng Tín, niên vụ 2002 - 2003 giống này đ−ợc trồng với khoảng 8,5% diện tích khoai tây cả n−ớc. Đặc biệt ở các tỉnh Thái Bình, Hải D−ơng, Nam Định, Ninh Bình giống khoai tây Th−ờng Tín chiếm từ 5 - 30% diện tích khoai tây của các tỉnh. Hạn chế lớn nhất của giống khoai tây Th−ờng Tín là dễ bị nhiễm bệnh, nhất là bệnh héo xanh và bệnh mốc s−ơng nên năng suất th−ờng thấp [7]. Các giống khoai tây nhập khẩu từ Châu Âu đ−ợc nông dân chấp nhận một cách rộng rãi, đặc biệt với các giống xác nhận. Hiện nay các giống Diamant, Mariella, Nicolla đang đ−ợc trồng ở Đồng Bằng Sông Hồng với khoảng 15,19% diện tích và dao động từ 3 - 27% diện tích tuỳ theo từng nơi. Trong số các giống này Diamant đ−ợc trồng phổ biến nhất chiếm tới 14% tổng diện tích. Song trong thực tế hầu hết các vật liệu trồng đều bị thoái hoá sau 2 - 3 năm và nông dân phải mua giống với giá rất đắt khoảng 10.000 đồng/1 kg củ giống. Mặt khác các giống này có khả năng nhiễm bệnh (đặc biệt là bệnh do virus PVX và PVY) cao trong thời gian bảo quản dài [7]. Các giống khoai tây cải tiến KT2 và KT3 cũng đ−ợc trồng khoảng 4% diện tích khoai tây cả n−ớc trong niên vụ 2002 - 2003 và dao động từ 2 - 14% tuỳ theo từng tỉnh. Đặc điểm nổi bật của các giống khoai tây cải tiến (đặc biệt KT3) là có khả năng kháng lại một số bệnh virus, nhờ đó nông dân có thể để giống một số vụ mà năng suất không giảm [7]. Các gống hạt lai TPS (Hồng Hà 2, Hồng Hà 7) đ−ợc trồng khoảng 8% diện tích khoai tây cả n−ớc niên vụ 2002 - 2003. Riêng ở tỉnh Thái Bình diện tích trồng hai giống khoai tây hạt lai lên tới 40% diện tích. Các giống khoai tây Trung Quốc nh−: Việt Dẫn, ._.Kim Quan, VT2 và Xuyên Vu đ−ợc trồng chủ yếu ở các tỉnh miền núi, Trung du phía Bắc và đồng xxiv bằng sông Hồng. Hiện nay có khoảng 66% diện tích khoai tây cả n−ớc là các giống khoai tây Trung Quốc, đặc biệt là giống VT2, trừ tỉnh Thái Bình có diện tích ít nhất là 20% còn lại các tỉnh khác đã trồng từ 70 - 87%. Nguyên nhân chủ yếu là các giống khoai tây Trung Quốc có giá rất rẻ, chỉ có 2500 - 3000 đồng/1kg giống [7]. Nhìn chung cơ cấu giống khoai tây hiện nay của n−ớc ta là rất phức tạp, trong sản xuất có ít nhất 10 giống khoai tây khác nhau cùng tồn tại và dẫn tới các vấn đề về giống nh−: + Khó kiểm soát chất l−ợng củ giống. + Giống không đ−ợc xác nhận dẫn đến thoái hoá giống, dễ nhiễm bệnh. + Hao hụt nhiều khi vận chuyển và marketing. + Sản phẩm lẫn nhiều giống khác nhau nên không suất khẩu đ−ợc. 2.3.2. Nhu cầu khoai tây giống ở Việt Nam hiện nay Theo kết quả điều tra của dự án khoai tây Việt - Đức (Đỗ Kim Chung) [7] thì mức giống trung bình trồng trên 1ha ở Việt Nam hiện nay là 1100 kg/ha. Do đó với diện tích khoai tây là khoảng 35000 ha niên vụ 2002 - 2003, khoảng 39000 ha năm 2005 và sẽ tăng tới 45000 ha vào năm 2010 thì mức khoai tây giống cần thiết cho niên vụ 2002 - 2003 là 38500 tấn (1,1 tấn x 35000 ha) và sẽ tăng lên đến 46800 tấn vào năm 2005 và 49500 tấn vào năm 2010. Trong đó khoảng 37% l−ợng giống cần đ−ợc cung cấp vào cuối tháng 9 và trong suốt cả tháng 10, 63% còn lại cần đ−ợc cung cấp vào tháng 11. Do tập quán và trình độ canh tác khác nhau giữa các vùng miền mà thị hiếu của ng−ời nông dân về nguồn cung cấp giống và đặc điểm giống là khác nhau: Đối với nguồn cung cấp thì có khoảng 75% nông dân mua giống toàn bộ hay một phần từ các nguồn khác nhau, 25% số nông dân còn lại hoàn toàn sử dụng giống do nhà tự để. Nguồn giống mà nông dân thích mua bao gồm xxv giống của các viện nghiên cứu (54,1%), giống của các hợp tác xã (34,4%) và giống của các cơ quan khuyến nông (11,5%). Thực trạng này cũng khác nhau giữa các tỉnh (Đỗ Kim Chung) [7]. Đối với đặc điểm của giống thì khoảng 45% số nông dân −a thích giống khoai tây có cỡ củ từ 30 củ/kg. Tất cả nông dân ở hai tỉnh Bắc Ninh và Bắc Giang đều mong muốn củ giống có cỡ củ từ 30 - 40 củ/kg, trong khi nông dân ở tỉnh Hải D−ơng muốn mua giống với cỡ củ là từ 20 - 30 củ/kg và nông dân ở tỉnh Thái Bình muốn mua giống có cỡ củ từ 10 - 15 củ/kg. Về mầu của vỏ củ thì ở Bắc Ninh, Bắc Giang có hơn 70% nông dân muốn giống có vỏ củ mầu vàng đậm, trong khi đa số nông dân ở Thái Bình lại thích giống có vỏ củ mầu vàng nhạt. Về ruột củ và chất l−ợng củ giống thì hầu hết nông dân ở các nơi đều thích khoai giống có ruột củ mầu vàng và đ−ợc bảo quản lạnh [7]. 2.3.3. Tình hình sản xuất khoai tây giống ở Việt Nam Trải qua nhiều b−ớc thăng trầm, sản xuất khoai tây Việt Nam trong những năm gần đây có chiều h−ớng tăng lên do nhu cầu tiêu dùng trong n−ớc, nguyên liệu cho chế biến và hàng hoá xuất khẩu và đặc biệt là do có nguồn giống phong phú hơn. Khoai tây không phải là cây có nguồn gốc bản địa lại đ−ợc trồng ở Việt Nam từ hơn 100 năm nay nên giống để sản xuất chủ yếu là nguồn giống nhập khẩu. Các giống sau khi nhập khẩu th−ờng đ−ợc ng−ời dân duy trì bằng kho tán xạ và th−ờng đ−ợc sử dụng trong một thời gian dài. Mặt khác do có nguồn gốc ôn đới và đ−ợc nhân giống chủ yếu theo ph−ơng pháp vô tính nên giống th−ờng bị thoái hoá theo thời gian đồng thời kéo theo sự giảm sút về năng suất. Năng suất khoai tây giảm do giống bị thoái hoá và do giai đoạn sinh lý không phù hợp. Củ giống bị thoái hoá chủ yếu do nhiễm bệnh virus và vi khuẩn và tỷ lệ nhiễm bệnh năm sau th−ờng cao hơn năm tr−ớc. Chính vì vậy xxvi hàng năm Việt Nam th−ờng phải nhập khẩu một l−ợng giống nhất định để thay thế giống bị thoái hoá (Nguyễn Quang Thạch) [26] [27]. ở các n−ớc sản xuất khoai tây truyền thống với việc áp dụng các tiến bộ về khoa học và công nghệ đặc biệt là công nghệ sinh học nên năng suất khoai tây đạt khá cao. Năng suất khoai tây tiềm năng theo tính toán của các nhà khoa học có thể đạt 140 tấn/ha. Tại các n−ớc sản xuất khoai tây truyền thống năng suất có thể đạt 60 tấn/ha [7]. ở Việt Nam, do đặc điểm địa hình và khí hậu, khoai tây chỉ có thể trồng vào vụ Đông - Xuân ở miền Bắc và có thể trồng cả năm ở một số vùng của tỉnh Lâm Đồng. Do đó theo các nhà khoa học thì năng suất khoai tây tiềm năng ở Việt Nam khoảng 30 đến 40 tấn/ha nếu có giống tốt. Tuy nhiên năng suất khoai tây bình quân của n−ớc ta hiện nay chỉ đạt 11 - 12 tấn/ha mà nguyên nhân chủ yếu là do chất l−ợng củ giống kém ( Hồ Hữu An, 2005) [1]. Trong khi đó sản xuất khoai tây giống trong n−ớc còn gặp nhiều bất cập: ở Đồng Bằng Sông Hồng do có khí hậu nóng ẩm, có nhiều tác nhân gây bệnh nhất là các bệnh do virus X, Y, vi khuẩn gây bệnh héo xanh và bệnh mốc s−ơng làm ảnh h−ởng lớn đến năng suất. Vì vậy để sản xuất giống ở vùng này cần phải có một số kho lạnh và nhà l−ới. Còn nếu sản xuất ở vùng núi thì có −u điểm hơn về cách ly không gian và thời gian sản xuất song cũng có những khó khăn nhất định nh− dễ bị héo xanh vi khuẩn, nông dân ít kinh nghiệm và kỹ năng sản xuất khoai tây giống và khó khăn trong việc vận chuyển [7]. Vậy để đáp ứng những yêu cầu về giống khoai tây cho sản xuất hiện nay chúng ta cần phải phát triển nhanh hệ thống sản xuất khoai tây giống tại chỗ sử dụng công nghệ sinh học. Với những tiến bộ về khoa học và kỹ thuật mới có thể sản xuất một l−ợng lớn củ giống siêu bi và củ bi trong phòng thí nghiệm và trong nhà l−ới và là nguồn giống ban đầu phục vụ cho việc nhân giống ở những đời tiếp theo cho đến giống xác nhận (Nguyễn Quang Thạch và xxvii Ctv, 2004) [26]. Trong hệ thống này điều mấu chốt cơ bản là chúng ta phải luôn luôn có nguồn giống sạch bệnh, sẵn sàng nhân lên khi cần để đáp ứng yêu cầu sản xuất một cách nhanh chóng và chủ động. Do vậy bảo quản in vitro là không thể thiếu trong hệ thống sản xuất giống sạch bệnh. 2.3.4. Hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh Theo Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2004) [26] thì hệ thống sản xuất giống khoai tây tiêu chuẩn quốc tế đ−ợc thể hiện ở sơ đồ sau: Sơ đồ nhân giống khoai tây từ vật liệu nuôi cấy mô đến giống xác nhận Theo sơ đồ, tr−ớc hết cần có nguyên liệu sạch bệnh đó là các củ giống đã đ−ợc đánh giá là sạch virus qua các ph−ơng pháp đánh giá chuẩn xác (th−ờng dùng là kỹ thuật ELISA). Cũng có thể sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô phân sinh đỉnh (meristem) để tạo cây sạch bệnh virus làm nguyên liệu ban đầu. Sau khi có nguyên liệu sạch bệnh thì sử dụng kỹ thuật nuôi cấy mô để nhân nhanh cây sạch bệnh với số l−ợng lớn. Cây cấy mô sạch bệnh có thể đem G1 G2 G3 G4 G5 Củ giống siêu nguyên chủng: Củ micro Củ mini Củ giống nguyên chủng 1 Củ giống nguyên chủng 2 Củ giống xác nhận Củ mini Phòng thí nghiệm, nhà màn Vùng cách ly và ven biển Vùng chuyên sản xuất giống Nhà màn cách ly Củ hoặc cây sạch bệnhVật liệu ban đầu sạch bệnh Vùng chuyên sản xuất giống G0 xxviii tạo củ trực tiếp trong ống nghiệm để thu đ−ợc củ siêu bi (microtuber) hoặc đem trồng trong nhà màn cách ly với nguồn bệnh và môi giới truyền bệnh. Củ thu đ−ợc từ cây trồng trong nhà màn th−ờng có kích th−ớc nhỏ nên đ−ợc gọi là củ bi (minituber). Củ siêu bi tạo nên cũng sẽ đ−ợc trồng trong nhà màn và kết quả cũng cho củ bi. Các củ bi tạo nên có độ sạch bệnh rất cao (0%) và đ−ợc xem là giống gốc hay còn gọi là giống siêu nguyên chủng. Các củ bi lại tiếp tục đ−ợc trồng ở những vùng cách ly cao với nguồn bệnh và môi giới truyền bệnh, th−ờng là các vùng miền núi nơi có mật độ môi giới truyền bệnh thấp hoặc vùng ven biển có tốc độ gió cao ngăn cản sự di chuyển của môi giới truyền bệnh để sản xuất ra củ giống nguyên chủng 1. Từ củ giống nguyên chủng 1 đem trồng ở những vùng chuyên sản xuất giống sẽ thu đ−ợc củ giống nguyên chủng 2 và thế hệ sau đó là giống xác nhận. Giống xác nhận sẽ đ−ợc cung cấp cho các vùng trồng sản xuất khoai tây th−ơng phẩm [26]. 2.4. Kỹ thuật bảo quản in vitro nguồn gene thực vật 2.4.1. Khái niệm chung Kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào (nuôi cấy in vitro) đang thực sự đ−ợc ứng dụng một cách có hiệu quả trong nhiều lĩnh vực nh− nhân giống vô tính cây trồng, tạo cây sạch bệnh, tạo dòng thuần, lai tế bào, chọn dòng tế bào...và một lĩnh vực rất quan trọng và có ý nghĩa lớn đó là nuôi cấy bảo quản in vitro nguồn tài nguyên di truyền thực vật quý hiếm và sạch bệnh (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997) [2]. Mục đích cơ bản của bảo quản nguồn tài nguyên di truyền thực vật là duy trì sự phong phú, đa dạng di truyền trong loài, giữa các loài và trong hệ sinh thái nói chung, đồng thời có sự hiểu biết về chúng để làm cơ sở cho việc khai thác, sử dụng chúng trong hiện tại và trong t−ơng lai (Khanna và ctv, 1991) [2] Nguồn gene cây trồng th−ờng đ−ợc bảo quản theo hai ph−ơng thức : + Ph−ơng thức in-situ (bảo quản tại chỗ): loại bảo quản này cho phép cây trồng sinh tr−ởng trong điều kiện sinh thái tự nhiên. Ph−ơng thức bảo quản xxix này th−ờng áp dụng cho những cây sinh sản vô tính, các cây hoang dại (Hawkes, 1982) [44]. + Ph−ơng thức ex-situ: các cơ quan của cây trồng đ−ợc bảo quản trong điều kiện nhân tạo, tối −u. Nó có thể tái sinh thành cây con hoàn chỉnh khi cần thiết. Bảo quản ex-situ đóng một vai trò quan trọng trong việc xây dựng ngân hàng gene. Ph−ơng thức này đ−ợc áp dụng cho nhiều đối t−ợng cây trồng khác nhau. Trong bảo quản ex-situ nguồn gene bất kỳ của loại cây trồng nào cũng có thể đ−ợc duy trì, l−u giữ. Có những hình thức bảo quản ex-situ khác nhau (Khanna và cs, 1991) [2]: - Trên v−ờn −ơm, tạo thành Field genebank. - Bảo quản hạt trong kho lạnh tạo thành seed genebank. - Bảo quản in vitro tạo thành in vitro genebank. - Bảo quản DNA, acid nucleic, chất mang thông tin di truyền. Vấn đề lựa chọn hình thức bảo quản nào thì tuỳ thuộc vào bản chất cây trồng, điều kiện kinh tế và sự phát triển khoa học công nghệ của từng quốc gia. Hawkes (1982) [44] đã tổng kết về các hình thức bảo quản phụ thuộc vào bản chất cây trồng nh− sau: Bản chất cây trồng quyết dịnh các giải pháp bảo quản Yếu tố sinh học Ph−ơng pháp bảo quản Cây lâu năm (cây gỗ) Insitu, ngân hành gene đồng ruộng, in vitro (hạt và hạt phấn) Cây hàng năm Ngân hàng gene đồng ruộng, in vitro Cây nhân vô tính với hạt vô sinh Ngân hàng gene đồng ruộng, in vitro, bảo quản đông khô Cây nhân giống vô tính với hạt có phôi Ngân hàng gene đồng ruộng, bảo quản hạt phấn, hạt, in vitro, đông khô Cây thích hợp nuôi cấy mô Tìm các ph−ơng pháp bảo quản thích hợp, bảo quản in vitro Cây có hạt phấn với sự sống cao Bảo quản hạt phấn (Nguồn: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997) xxx 2.4.2. Bảo quản in vitro nguồn gene thực vật Bảo quản nguồn gene in vitro sử dụng hai ph−ơng pháp: bảo quản bằng nuôi cấy in vitro và bảo quản bằng kỹ thuật đông khô (Cryopreservation). Giải pháp công nghệ bảo quản in vitro đ−ợc phát triển trong vòng 10 - 15 năm trở lại đây. Nó đ−ợc bắt đầu với việc nuôi cấy, bảo quản mô sẹo, tế bào, phục vụ mục đích nghiên cứu sinh lý, sinh hoá và tổng hợp các chất thứ cấp. sau đó chúng đ−ợc chuyển sang kỹ thuật bảo quản in vitro chồi, mầm, phôi và cây con hoàn chỉnh phục vụ công tác nhân nhanh sản xuất cây giống quý hiếm, chất l−ợng cao, sạch bệnh và xây dựng nguồn gene cây trồng. Bảo quản in vitro tồn tại và phát triển đồng thời với việc sử dụng các nguồn gene cổ truyền. Trong t−ơng lai gần bảo quản in vitro sẽ cho ra đời các ngân hàng gene in vitro (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997) [2]. Bảo quản in vitro nguồn gene thực vật nhằm thực hiện hai nhiệm vụ: + Bảo quản các tập đoàn hoạt động, nhằm cung cấp vật liệu phục vụ công tác nghiên cứu và trao đổi nguồn gene giữa các ngân hàng gene trên thế giới. + Bảo quản tập đoàn cơ bản, bảo tồn nguồn gene lâu dài, bổ sung vật liệu cho các tập đoàn hoạt động. 2.4.3. Kỹ thuật bảo quản in vitro Bảo quản nguồn gene trong điều kiện in vitro đ−ợc coi là giải pháp công nghệ có triển vọng, cơ bản đối với các loại cây trồng nhân giống vô tính và cây có hạt mất sức nảy mầm cũng nh− cây có tỷ lệ nhiễm virus cao [2]. Mẫu đ−a vào bảo quản rất đa dạng, có thể là tế bào đơn, mô sẹo, đoạn thân, đoạn rễ hoặc cây con hoàn chỉnh. Bảo quản in vitro dựa trên hai nguyên lý khoa học sau: + Duy trì sinh tr−ởng tối thiểu (trong bảo quản ngắn hạn) + Tạm ngừng sinh tr−ởng (trong bảo quản dài hạn) xxxi 2.4.3.1. Duy trì sinh tr−ởng tối thiểu Duy trì sinh tr−ởng tối thiểu đ−ợc áp dụng nhiều cho bảo quản cây con hoàn chỉnh, đối với nhóm cây nông nghiệp nhân giống vô tính nh− khoai lang, khoai tây, sắn, chuối, dứa...Cây con đ−ợc đặt trong điều kiện ánh sáng, nhiệt độ và chế độ dinh d−ỡng đặc biệt. Duy trì sinh tr−ởng tối thiểu dựa trên cơ sở của kỹ thuật nhân giống vô tính in vitro nh−ng duy trì kéo dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển nhờ vào việc làm chậm sinh tr−ởng của mẫu cấy. Trong thời gian bảo quản tốc độ sinh tr−ởng phát triển của cây con th−ờng giảm đi nhiều lần (khoảng từ 15 - 20 lần) so với tốc độ sinh tr−ởng trong điều kiện bình th−ờng nhờ vào việc sử dụng những yếu tố sinh tr−ởng khác nhau phụ thuộc vào bản chất cây trồng bao gồm: nhiệt độ thấp, chất ức chế sinh tr−ởng (ABA), những chất gây áp suất thẩm thấu cao (manitol, đ−ờng saccaroza, dầu phủ,...), hoặc làm nghèo dinh d−ỡng trong quá trình nuôi cấy (Hồ Hữu Nhị, 1993) [20]. Mẫu đ−ợc đ−a vào nuôi cấy là những cơ quan ít xảy ra biến dị dinh d−ỡng trong quá trình tạo cây con (phôi, chồi, mầm,...). Cây con đ−a vào bảo quản in vitro phải đ−ợc làm sạch bệnh, cây khoẻ. Trong bảo quản in vitro, hình thức nuôi cấy bảo quản sinh tr−ởng tối thiểu đ−ợc áp dụng nhiều và trở thành một giải pháp không thể thiếu đ−ợc trong các ngân hàng gene cây trồng. Trên thế giới, hơn m−ời năm qua theo số liệu thống kê của ban tài nguyên cây trồng thế giới, nguồn gene của 20 loài cây trồng khác nhau đ−ợc l−u giữ bằng con đ−ờng này nh−: dứa, cà phê, cao su, khoai lang, khoai tây, chuối, đu đủ, dừa, khoai mài, ca cao, nho, cam, gừng, nghệ, cọ dầu (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, 1997) [2]. Thành công đầu có ý nghĩa thực tiễn là việc ứng dụng bảo quản nguồn gene các tập đoàn cây lấy củ trong nông nghiệp. Sử dụng các yếu tố kìm hãm xxxii sinh tr−ởng cây con trong quá trình nuôi cấy (điều kiện bảo quản bao gồm nhiệt độ, ánh sáng,...) đã làm kéo dài thời gian giữa các lần cấy chuyển. Điều kiện bảo quản của một số loại cây trồng Cây trồng Điều kiện bảo quản Thời gian cấy chuyển Khoai lang (Ipomoea batatus) Nhiệt độ 6 - 18oC ánh sáng 1000 Lux Manitol 3% 12 - 18 tháng Sắn (Manihot esculenta) Nhiệt độ 23o C ánh sáng 100 Lux 18 - 24 tháng Chuối (Musa spp) Nhiệt độ 15oC ánh sáng 1200 Lux 18 tháng Khoai tây (Solanum SPP) Nhiệt độ từ 6 - 10oC ánh sáng 2000 Lux Manitol 3% 24 tháng (Nguồn: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, 1997) 2.4.3.2. Bảo quản ngừng sinh tr−ởng tạm thời Ph−ơng pháp này đ−ợc áp dụng cho nhiều loại cây trồng nh−ng chủ yếu cho loại cây có hạt không bảo quản đ−ợc trong điều kiện nhiệt độ và độ ẩm thấp. Mẫu đ−a vào bảo quản phôi, mô, tế bào. Tr−ớc khi đ−a vào bảo quản mẫu phải đ−ợc xử lý qua một số công đoạn: - Chất làm giảm sinh tr−ởng: xử lý 5 - 10 % prolin và 3 - 6% manitol - Chất chống đông: dung dịch DMSO 1M + glycerol 1M + sacaroza 2M xxxiii - Bảo quản ở nhiệt độ -196 0C Trong quá trình bảo quản mẫu đ−ợc để ở nhiệt độ -1960C, các quá trình trao đổi chất, quá trình sinh tr−ởng, phát triển đều tạm ngừng hoạt động. Ph−ơng pháp bảo quản này có thể l−u giữ mẫu vài chục năm (khoảng 20 - 30 năm). Khi cần phục hồi sinh tr−ởng, mẫu đ−ợc lấy ra nuôi cấy tạo cây con hoàn chỉnh (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997) [2]. 2.4.3.3. Bảo quản quỹ gene in vitro khoai tây Khoai tây là cây trồng nhân giống vô tính có tỷ lệ nhiễm bệnh vi khuẩn, virus rất cao, các bệnh này đ−ợc lan truyền từ đời này sang đời khác qua vật liệu nhân giống nh− thân, củ.... Hơn nữa nhiều khi triệu chứng bệnh lại đang ở dạng tiềm ẩn làm cho khó có thể loại bỏ hết cây bệnh trong thời gian sinh tr−ởng phát triển (Nguyễn Quang Thạch) [24]. Vì vậy cần bảo quản tập đoàn giống khoai tây sạch bệnh để chủ động cung cấp nguồn giống sạch cho sản xuất. Việc bảo quản tập đoàn khoai tây sạch bệnh trên đồng ruộng (field genebank) rất tốn kém lại không an toàn. áp dụng ph−ơng pháp bảo quản in vitro là ít tốn kém, an toàn và chủ động. Trong bảo quản in vitro, khoảng thời gian giữa các lần cấy chuyển là quan trọng quyết định đến hiệu quả và chi phí trong bảo quản, khoảng thời gian càng dài thì chi phí bảo quản càng giảm và càng giảm sự già hoá của cây (Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, 1994) [18]. Vì vậy, ng−ời ta đã tìm mọi cách làm giảm sự sinh tr−ởng phát triển của cây in vitro. Có thể sử dụng nhiệt thấp và hoá chất để làm chậm sinh tr−ởng của cây. Chúng ta biết rằng mỗi phản ứng sinh hoá diễn ra trong quá trình sinh tr−ởng phát triển của cây thì đều đ−ợc điều khiển bởi enzym. Mỗi emzym lại có nhiệt độ tối −u cho hoạt tính xúc tác của mình và đa số các enzym đều bị giảm hoạt tính ở nhiệt độ thấp. Vì vậy, các nhà nghiên cứu đã vận dụng điều này để bảo quản in vitro. xxxiv Đối với cây khoai tây, nhiều tác giả cho biết nhiệt độ d−ới 3oC và trên 28oC đều không có lợi cho sự sinh tr−ởng phát triển của cây khoai tây in vitro, có thể làm cây chết. Nhiệt độ 6oC đã đ−ợc xác định là nhiệt độ thích hợp để kìm hãm sinh tr−ởng tối thiểu nh−ng vẫn đảm bảo sự sống của cây (Harney H.A, 1966; A. Schaf- Menuhr, E Muller and Mix-Wagner và ctv, 1996) [42] [37]. Ngoài biện pháp nhiệt độ thấp, nhiều tác giả cũng nghiên cứu sử dụng hoá chất trong môi tr−ờng nuôi cấy. Với yêu cầu hoá chất đó không đ−ợc làm tổn th−ơng cấu trúc gene hoặc gây đột biến cho cây. Saccaroza đ−ợc bổ sung thêm vào môi tr−ờng nuôi cấy để làm tăng áp suất thẩm thấu của môi tr−ờng sẽ làm giảm sự hấp thu dinh d−ỡng của cây, do đó làm cây chậm sinh tr−ởng. Sorbitol, manitol là những chất hoàn toàn trung tính, không xâm nhập vào tế bào nh−ng có tác dụng làm tăng áp suất thẩm thấu của môi tr−ờng nuôi cấy, cây khoai tây in vitro có thể tạm ngừng sinh tr−ởng khoảng 5 - 6 tháng trong môi tr−ờng bổ sung 4% manitol (Hồ Hữu Nhị, 1993) [20]. 2.5. Tình hình nghiên cứu Bảo quản in vitro trong và ngoài n−ớc 2.5.1.Tình hình nghiên cứu ở trong n−ớc Ph−ơng pháp duy trì và bảo quản quỹ gene là một lĩnh vực đ−ợc nhiều nhà khoa học trong và ngoài n−ớc quan tâm nghiên cứu. ở n−ớc ta để bảo quản tốt hơn nguồn gene các cây nhân giống vô tính nhất là những cây lấy củ, rễ và cây ăn quả, thời gian qua ch−ơng trình quỹ gene đã tạo điều kiện cho bộ môn công nghệ sinh học của Viện Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam b−ớc đầu nghiên cứu nuôi cấy in vitro bảo quản có kết quả tốt một số tập đoàn cây trồng: 107 mẫu giống từ tập đoàn khoai lang trên đồng ruộng đã đ−ợc bảo quản an toàn trong điều kiện in vitro ở nhiệt độ 18 - 20oC với thời gian cấy chuyển từ 6 - 9 tháng. Các giống cây trồng khác xxxv nh− khoai tây, chuối, dứa, mít và cam chanh đã và đang đ−ợc đ−a vào bảo quản trong điều kiện in vitro và kiểm tra lại sự ổn định di truyền của chúng bên ngoài đồng ruộng (Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội, 1997) [2]. Theo Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (1994) [19] thì khi hàm l−ợng đ−ờng trong môi tr−ờng nuôi cấy tăng (1 - 100 g/l) thời gian duy trì cụm chồi chuối in vitro tăng (6 - 14 tuần) trên 100g/l thì cụm chồi hoá đen. Kết quả t−ơng tự với manitol. Sự phối hợp giữa saccarose (50 g/l) và manitol (60 g/l) có hiệu quả rõ rệt với thời gian duy trì là 36 tuần khi môi tr−ờng nuôi cấy có BA (3 mg/l) và NAA (0,1 mg/l); kết quả t−ơng tự khi BA (1 mg/l). Các kết quả nghiên cứu ban đầu của Hà Thị Hân (2003) [13] cho biết nồng độ đ−ờng 7% trong môi tr−ờng nuôi cấy có tác dụng làm chậm sự sinh tr−ởng của cây so với đối chứng là điều kiện cấy nhân thông th−ờng. Khả năng tăng tr−ởng về chiều cao cây giảm so với đối chứng là 35,89 - 44,68% và số lá giảm bằng 66,24 - 78,29% so với đối chứng. Cây có hiện t−ợng già hoá nhanh (cây phân nhánh nhiều, vàng lụi sớm). Tác động phối hợp nhiệt độ thấp 6oC và nồng độ đ−ờng cao thì 7% và 2% đ−ờng saccaroza đều có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro. Sau 7 tuần nuôi cấy sự tăng tr−ởng về chiều so với đối chứng từ 83,33 - 104,5%, số lá từ 86,25 - 103,68% so với đối chứng, cây mập, lá xanh tốt. Việc bổ sung manitol vào môi tr−ờng nuôi cấy có tác dụng làm giảm sự sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro. Nồng độ manitol 3% có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng nhất. Cây khoai tây sau 7 tuần nuôi cấy có sự tăng chiều cao và số lá không đáng kể (chiều cao từ 1,22 - 1,41 cm, số lá từ 5,2 - 6,4) mà vẫn giữ đ−ợc trạng thái cây mập, lá xanh tốt [13]. Theo Nguyễn Thị Kim Thanh (2004)[29][30],[31] thì các nhân tố có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro là nhiệt độ thấp 6oC và xxxvi 3% manitol, saccaroza 5% hoặc glucoza 5%. Tuy nhiên các nhân tố khác nhau có hiệu quả tác động làm chậm sinh tr−ởng khác nhau. Nhiệt độ thấp 6oC và manitol 3% có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng tốt hơn saccaroza 5% và glucoza 5%. Sau 8 tuần bảo quản, cây khoai tây ở công thức hiệt độ thấp 6oC và manitol 3% chỉ cao 3 - 4 cm trong khi đó các công thức saccaroza 5% và glucoza 5% cây khoai tây đều cao trên 10 cm cần đ−ợc cấy chuyển và trạng thái chồi cũng kém, đạt từ mức trung bình đến xấu và cây có biểu hiện già hoá. Trong điều kiện nhiệt độ thấp 6oC và manitol 3%, cây khoai tây có khả năng bảo quản đ−ợc thời gian dài, sau 12 tuần cây vẫn duy trì mức sinh tr−ởng thấp đồng thời đảm bảo trạng thái cây tốt [31]. 2.5.2. Tình hình nghiên cứu ở n−ớc ngoài Sự duy trì và thời gian duy trì dài của các giống khoai tây là khía cạnh quan trọng của nhiều ch−ơng trình nuôi cấy. Theo Espiroza và ctv (1884) (Kenneth C. Tores, 1988) [46] cho rằng lóng thân khoai tây có thể đ−ợc bảo quản trong một chu kỳ dài trên môi tr−ờng nuôi cấy MS có bổ sung 4% manitol, 3% saccaroza và 8 gr agar/1 lít. Môi tr−ờng này áp dụng nguyên lý thẩm thấu để làm giảm tỷ lệ sinh tr−ởng và kích thích sự phân chia tế bào của đỉnh sinh tr−ởng lóng, có thể cung cấp nhiều lóng cho sự nhân trở lại khi cần thiết. Giảm nhiệt độ bảo quản xuống 8oC là ng−ỡng nhiệt độ tin cậy làm giảm tỷ lệ sinh tr−ởng của cây khoảng cách giữa hai lần cấy chuyển ở ng−ỡng nhiệt độ này đạt từ 2 - 3 năm. Theo A. Schafer-Muhr & ctv (1996) [37] thì ph−ơng pháp làm lạnh đơn giản đã phát triển cho bảo quản đông khô, một trong các ph−ơng pháp thu thập in vitro của các giống khoai tây cũ. Đã có trên 15 giống và kiểu gene đ−ợc làm lạnh và giữ trong nitơ lỏng. Hầu hết các giống đều có tỷ lệ sống cao, trung bình 80%, tỷ lệ cây tái sinh thấp hơn trung bình 40%. Nguồn gene khoai tây th−ờng đ−ợc duy trì bằng nuôi cấy in vitro d−ới hình thức bảo quản sinh xxxvii tr−ởng chậm. Bảo quản in vitro đặc biệt tốt với bảo quản ngắn hạn và bảo quản dài hạn đặc biệt vì nó có thể chủ động giống. Tuy bảo quản dài hạn không đáp ứng kịp thời nhu cầu sử dụng nhanh chóng. Nh−ng bảo quản đông khô, bảo quản trong nitơ lỏng vẫn chiếm −u thế. Cùng h−ớng nghiên cứu với A. Schafer-Muhr các tác giả Deutsche Sammlung Von, Mikroorganis Men Und, Zellkulturen Gmbh (1998) [38] cũng khẳng định ph−ơng pháp bảo quản lạnh khô meistem khoai tây bằng kỹ thuật nhỏ giọt là ph−ơng pháp cần thiết để thu thập nguồn gene trong bảo quản insitu. Theo Sodar Uddin Siddiqui và ctv (2006) [48] thì đỉnh sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro cấy trên môi tr−ờng Murashige skoog 1962 đ−ợc bảo quản ở nhiệt độ từ 17 - 25oC với chất gây stress là manitol có nồng độ từ 1 - 3% thì chu kỳ bảo quản là trên 6 tháng. Giữa nhiệt độ và chất gây stress có ảnh h−ởng riêng rẽ đến sự sống và sự sinh tr−ởng của chồi đỉnh. Trong đó, hàm l−ợng chất gây stress ảnh h−ởng đến sự sinh tr−ởng của chồi, nhiệt độ ảnh h−ởng đến sự sống sót của chồi. Tỷ lệ cây nuôi cấy sẽ sống cao hơn và chu kỳ bảo quản sẽ dài hơn ở điều kiện nhiệt độ là 25oC. Các tác giả Gopal.J, Chamail, Anjali, Sarkar, Debabrata (2004) [41] công bố các kết quả nghiên cứu về kỹ thuật duy trì nguồn giống khoai tây bằng bảo quản củ minituber là những củ giống minituber đ−ợc tạo ra trên môi tr−ờng không có ABA nh−ng có hàm l−ợng đ−ờng saccaroza cao và có 44,38Mm benzyn-adenin có thể bảo quản đ−ợc 12 tháng ở điều kiện ánh sáng yếu và nhiệt độ là 6 ± 10C. Banerjee & Delanghe (1985) (Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển, 1985) [18] đã duy trì và bảo quản chuối d−ới dạng cụm chồi qua ph−ơng thức bảo quản sinh tr−ởng chậm in vitro thời gian kéo dài trên một năm ở nhiệt độ 15oC, c−ờng độ ánh sáng yếu (500 - 1000) lux và trong môi tr−ờng nuôi cấy có BA (10Mm). Zamova và ctv (1986, 1987) đã dùng áp suất thẩm thấu để xxxviii kìm hãm sinh tr−ởng với sorbitol hay manitol (0,025 hay 0,25 Mm ). Mora và ctv (1986) thực hiện việc kìm hãm 50% sinh tr−ởng bằng cách bổ sung vào môi tr−ờng nuôi cấy 4% manitol, 3,9% saccaroza giữ đ−ợc 18 tháng [18]. Tại một số trung tâm nghiên cứu nông nghiệp quốc tế nh−: CIP (Trung tâm nghiên cứu khoai tây) ở Pêru l−u giữ nguồn gene khoai tây và khoai lang với một khối l−ợng lớn trong điều kiện in vitro; IITA bảo quản in vitro nhiều tập đoàn khoai mài, sắn, vạc; CIAT (Trung tâm nghiên cứu nông nghiệp nhiệt đới) chịu trách nhiệm duy trì nguồn gene cây sắn và INIBAP (Mạng l−ới cải tạo giống chuối thế giới) có ngân hàng gene in vitro chuối tại Bỉ. Ngoài ra nhiều tập đoàn cây trồng nhân giống vô tính khác cũng đ−ợc bảo quản in vitro trong hệ thống ngân hàng gene của nhiều quốc gia nh− ấn Độ, Trung Quốc, Nhật Bản, vv...( Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội (1997) [2] Viện nghiên cứu Nông nghiệp quốc tế đã đ−a ra bảng tổng kết kết quả bảo quản in vitro của một số loại cây trồng nh− sau: Bảng tổng kết duy trì, bảo quản in vitro của một số cây trồng chính ở Viện nghiên cứu Nông nghiệp quốc tế Nơi bảo quản Loại cây trồng Tổng số mẫu tập đoàn Bảo quản in vitro IITA (Nigena) Khoai lang Sắn Chuối 1000 2000 250 6000 400 150 CIAT (Colum bia) Sắn 4500 1500 CIP (Pêru) Khoai tây 3481 1500 INIBAP (Bỉ) Chuối - 1000 (Nguồn: Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội, 1997) xxxix 3. Vật liệu, Nội dung và ph−ơng pháp nghiên cứu 3.1. Vật liệu nghiên cứu Các thí nghiệm đ−ợc tiến hành trên một số giống khoai tây đang đ−ợc nhân và nuôi d−ỡng tại phòng thí nghiệm của Bộ môn Sinh lý thực vật - Khoa Nông học - Tr−ờng Đại Học Nông Nghiệp I Hà Nội. Đây là những giống trong tập đoàn giống đã đ−ợc xác nhận là sạch bệnh của Trung tâm khảo kiểm nghiệm giống cây trồng Trung −ơng (Phụ lục 3). Số TT Tên giống Ký hiệu Nguồn gốc 1 Mariella Mar Đức 2 Diamant Dia Hà Lan 3 Solara Sol Đức - Sử dụng đốt thân cây khoai tây in vitro cho các thí nghiệm nghiên cứu về kỹ thuật bảo quản sinh tr−ởng chậm cây khoai tây in vitro. - Sử dụng cây khoai tây in vitro có chiều cao 7 - 8 cm với 5 - 6 lá cho các thí nghiệm tạo củ và duy trì củ siêu bi in vitro. 3.2. Nội dung nghiên cứu 3.2.1. Nghiên cứu ảnh h−ởng của việc giảm dinh d−ỡng trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro * Nghiên cứu ảnh h−ởng của các loại môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro Thí nghiệm tiến hành nuôi cấy cây khoai tây in vitro trên các môi tr−ờng dinh d−ỡng tiêu chuẩn: CT1: môi tr−ờng MS (Murashige Skoog, 1962) (ĐC) xl CT2: môi tr−ờng B5 (Gamborg) CT3: môi tr−ờng Knop * Nghiên cứu ảnh h−ởng của việc giảm hàm l−ợng dinh d−ỡng môi tr−ờng MS đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro Thí nghiệm tiến hành trên môi tr−ờng dinh d−ỡng MS với các hàm l−ợng môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau: CT1: MS (ĐC) CT2: 1/2MS CT3: 1/4MS 3.2.2. Nghiên cứu ảnh h−ởng của nền môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro Thí nghiệm tiến hành nuôi cấy các đốt thân khoai tây trên môi tr−ờng có hàm l−ợng agar tăng với các công thức sau: CT1: 7 g agar/l (ĐC) CT2: 8 g agar/l CT3: 9 g agar/l CT4: 10 g agar/l 3.2.3. Nghiên cứu sử dụng các chất gây áp suất thẩm thấu trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro * Nghiên cứu sử dụng nồng độ đ−ờng cao trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro Thí nghiệm gồm các công thức sau: CT1: 2% saccaroza (ĐC) CT2: 4% saccaroza xli CT3: 6% saccaroza CT4: 8% saccaroza * Nghiên cứu sử dụng manitol trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro CT1: 0% manitol (ĐC) CT2: 2% manitol CT3: 3% manitol CT4: 4% manitol * Nghiên cứu sử dụng sorbitol trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro Thí nghiệm tiến hành với 4 công thức: CT1: 0% sorbitol (ĐC) CT2: 2% sorbitol CT3: 3% sorbitol CT4: 4% sorbitol 3.2.4. Nghiên cứu ảnh h−ởng của nhiệt độ thấp đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro Thí nghiệm đ−ợc tiến hành với các công thức sau: CT1: ĐC (nhiệt độ phòng nuôi: 250C) CT2: 150C CT3: 100C CT4: 50C 3.2.5. Nghiên cứu ảnh h−ởng của chlor cholin chlorit (CCC) đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro Thí nghiệm tiến hành nuôi cấy các đốt thân khoai tây trên môi tr−ờng dinh d−ỡng MS có bổ sung thêm CCC với các nồng độ khác nhau xlii CT1: 0 ppm CCC (ĐC) CT2: 200ppm CCC CT3: 400ppm CCC CT4: 600ppm CCC CT5: 800ppm CCC 3.2.6. Nghiên cứu khả năng bảo quản và l−u giữ củ khoai tây in vitro của các giống nghiên cứu Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành đánh giá khả năng bảo quản in vi._.n của cây. Nh−ng ng−ỡng nhiệt độ thấp là bao nhiêu thì phù hợp với khả năng duy trì sinh tr−ởng chậm cây khoai tây in vitro là vấn đề đặt ra cần phải nghiên cứu. Trong thí nghiệm này chúng tôi tiến hành nghiên cứu xác định ng−ỡng nhiệt độ thấp nhằm duy trì sinh tr−ởng tối thiểu cây khoai tây in vitro để kéo lxxvi dài thời gian giữa hai lần cấy chuyển của cây khoai tây in vitro trên cả 3 giống khoai tây nghiên cứu. Thí nghiệm tiến hành theo dõi sự sinh tr−ởng phát triển của cây khoai tây in vitro trong các điều kiện nhiệt độ thấp khác nhau và so sánh với công thức đối chứng (nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 2oC) . Các số liệu theo dõi sự sinh tr−ởng phát triển của cây khoai tây in vitro sau cấy 20 tuần đ−ợc trình bày ở bảng 4.13, 4.14 và hình 7. Từ số liệu thu đ−ợc cho thấy trong điều kện nhiệt độ thấp cây khoai tây in vitro đã bị hạn chế sinh tr−ởng. Nhiệt độ càng thấp thì thời gian mọc mầm của cây càng dài và sự sinh tr−ởng của cây càng bị hạn chế: Bảng 4.13. ảnh h−ởng của nhiệt độ thấp đến thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái chồi của cây khoai tây in vitro Công thức thí nghiệm Tên giống Các chỉ tiêu theo dõi ĐC 15oC 10oC 5oC LSD 5% CV % Thời gian mọc mầm (ngày) 3,28 8,16 9,76 13,72 0,35 3,0 Số chồi/cây (chồi) 1,32 1,06 1,00 1,00 Mar Trạng thái chồi *** *** *** *** Thời gian mọc mầm (ngày) 3,12 8,92 10,16 13,96 0,75 6,7 Số chồi/cây (chồi) 1,40 1,12 1,02 1,00 Dia Trạng thái chồi *** *** *** *** Thời gian mọc mầm (ngày) 3,26 8,18 10,02 13,88 0,29 2,5 Số chồi/cây (chồi) 1,36 1,08 1,00 1,00 Sol Trạng thái chồi *** *** *** *** Ghi chú : ĐC : nhiệt độ phòng nuôi 25 ± 2oC ***: trạng thái chồi chồi tốt, thân mập, bản lá to, có mầu xanh đậm lxxvii Bảng 4.14. ảnh h−ởng của nhiệt độ thấp đến sự sinh tr−ởng chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro (sau cấy 20 tuần) Công thức thí nghiệm Tên Giốn g Các chỉ tiêu theo dõi 15oC 10oC 5oC LSD 5% CV % (cm) 7,87 4,80 2,94 0,31 2,9 Tốc độ tăng tr−ởng (cm/tuần) 0,39 0,24 0,15 Chiều cao cây % so với đối chứng 19,21 11,82 7,39 (Lá/cây) 9,84 6,96 4,56 0,28 3,3 Tốc độ tăng tr−ởng (lá/tuần) 0,49 0,35 0,23 Mar Số lá % so với đối chứng 24,38 17,41 11,34 (cm) 8,13 4,94 2,79 0,35 2,3 Tốc độ tăng tr−ởng (cm/tuần) 0,41 0,25 0,14 Chiều cao cây % so với đối chứng 19,62 11,96 6,67 (Lá/cây) 9,96 7,32 4,92 0,50 3,9 Tốc độ tăng tr−ởng (lá/tuần) 0,50 0,37 0,25 Dia Số lá % so với đối chứng 23,81 17,62 11,90 (cm) 8,62 5,78 3,64 0,23 4,0 Tốc độ tăng tr−ởng (cm/tuần) 0,43 0,29 0,18 Chiều cao cây % so với đối chứng 19,91 13,26 8,43 (Lá/cây) 11,00 7,68 5,72 0,33 2,8 Tốc độ tăng tr−ởng (lá/tuần) 0,55 0,38 0,29 Sol Số lá % so với đối chứng 24,55 16,96 12,76 lxxviii 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Mar Dia Sol Giống T ốc đ ộ tă ng tr −ở ng c hi ều c ao c ây (c m /tu ần ) ĐC 15 C 10 C 5 C Hình 7. ảnh h−ởng của nhịêt độ thấp đến tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro Khi nuôi cấy trong điều kiện nhiệt độ thấp, quá trình sinh tr−ởng phát triển của cây khoai tây chậm hơn rất nhiều ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm. - Về thời gian mọc mầm: trong điều kiện nhiệt độ thấp thời gian mọc mầm của cây khoai tây in vitro dài hơn cả so với ảnh h−ởng của môi tr−ờng nghèo dinh d−ỡng và các chất gây áp suất cao trong môi tr−ờng. Nhiệt độ càng giảm thì thời gian mọc mầm của cây khoai tây in vitro càng dài. Thời gian mọc mầm của cây khoai tây kéo dài từ 8,16 - 8,92 ngày (ở 15oC) đến 13,72 - 13,96 ngày (ở 5oC), chậm hơn so với đối chứng từ 4,92 - 5,8 ngày (ở 15oC) đến 10,44 - 10,84 ngày (ở 5oC) tuỳ từng giống nghiên cứu. - Về số chồi/cây: khi nuôi d−ỡng cây khoai tây in vitro trong điều kiện nhiệt độ thấp, cây chỉ phát triển phát triển một thân chính mà không phân chồi ở các nách lá. Sau 20 tuần nuôi cấy, chỉ ở điều kiện 15oC cây mới phân chồi nh−ng số chồi/cây trung bình rất thấp chỉ có1,06 - 1,12 chồi. - Về trạng thái chồi: nhìn chung, trong điều kiện nhiệt độ thấp, cây khoai tây in vitro của tất cả các giống đều có trạng thái sinh tr−ởng rất tốt. Cây lxxix của tất cả các giống đều mập, lá xanh đậm, bản lá to và giữ đ−ợc trạng thái trẻ sinh lý. - Về chiều cao cây: sự tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro trong điều kiện nhiệt độ thấp là rất thấp so với cây sinh tr−ởng trong điều kiện nhiệt độ phòng nuôi. Nhiệt độ bảo quản càng thấp thì tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây càng giảm ở tất cả các giống nghiên cứu. + ở nhiệt độ 15oC, tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây trung bình từ 0,39 - 0,43 cm/tuần chỉ bằng 19,21 - 19,91% đối chứng. So với các công thức ở nhiệt độ 10oC và 5oC thì tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây ở 15oC cao hơn t−ơng ứng từ 0,14 - 0,16 và 0,24 - 0,27 cm/tuần. + ở nhiệt độ 10oC, tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây trung bình từ 0,24 - 0,29 cm/tuần, giảm bằng 11,28 - 13,26% tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây trong điều kiện cấy nhân. So với cây sinh tr−ởng ở điều kiện 10oC thì tốc độ tăng tr−ởng chiều cao ở 10oC cao hơn 0,09 - 0,11cm/tuần. + ở nhiệt độ 5oC là ng−ỡng nhiệt độ có hiệu quả làm chậm sinh tr−ởng tốt nhất. Tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây trung bình từ 0,14 - 0,18 cm/tuần, giảm bằng 6,67 - 8,34% đối chứng. - Về số lá/cây: t−ơng tự sự tăng tr−ởng chiều cao cây, tốc độ tăng tr−ởng số lá/cây cũng giảm dần khi ng−ỡng nhiệt độ bảo quản đ−ợc hạ thấp dần. Tốc độ tăng tr−ởng số lá cao nhất ở nhiệt độ 15oC là 0,49 - 0,55 lá/tuần giảm bằng 23,81 - 24,55% đối chứng. Tiếp đó là tốc độ tăng tr−ởng số lá ở ng−ỡng nhiệt độ 10oC giảm xuống 0,35 - 0,38 lá/tuần bằng 16,96 - 17,62% đối chứng. Thấp nhất là tốc độ tăng t−ởng số lá ở 5oC, trung bình từ 0,23 - 0,29 lá/tuần, thấp hơn ở công thức 15oC và 10oC t−ơng ứng từ 0,17 - 0,26 lá/tuần và 0,12 - 0,26 lá/tuần, giảm xuống bằng 11,34 - 12,76% tốc độ tăng tr−ởng số lá ở công thức đối chứng. lxxx Tóm lại: điều kiện nhiệt độ thấp có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro rất tốt đồng thời có tác dụng chống lại sự già hoá cho cây. Trong đó, nhiệt độ 5oC có hiệu quả duy trì tốt nhất cho vấn đề bảo quản nguồn giống. Sau 20 tuần nuôi cấy chiều cao cây trung bình chỉ có 2,79 - 3,64 cm. Nếu so sánh với tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây trong điều kiện cấy nhân thì ta có thể kéo dài chu kỳ bảo quản lên tới 60 tuần. 4.5. Nghiên cứu ảnh h−ởng của nồng độ Chlor cholin chlorit (CCC) trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro Khác với động vật và con ng−ời, ở thực vật bất cứ hoạt động sinh tr−ởng và phát triển nào, đặc biệt là các quá trình hình thành cơ quan (rễ, thân, lá, hoa, quả...) cũng nh− sự chuyển qua các giai đoạn sinh tr−ởng phát triển của cây đều đ−ợc điều chỉnh đồng thời bởi nhiều loại hormon ở trong chúng. Trong đó có hai nhóm chất cơ bản là nhóm chất kích thích sinh tr−ởng và nhóm chất ức chế sinh tr−ởng. Chlor cholin chlorit thuộc nhóm chất ức chế sinh tr−ởng và đ−ợc xem là chất kháng gibberrellin (GA - kích thích sự giãn tế bào). Do đó, CCC có tác dụng ức chế sự giãn của tế bào làm cho lóng cây ngắn lại dẫn đến ức chế sự sinh tr−ởng chiều cao của cây. Vì vậy với mục đích duy trì sinh tr−ởng chậm cây khoai tây in vitro chúng tôi tiến hành nghiên cứu bổ sung CCC vào môi tr−ờng nuôi cấy [25]. Thí nghiệm tiến hành nuôi cấy các đốt thân khoai tây in vitro trên môi tr−ờng có bổ sung CCC với các nồng độ 200 ppm, 400 ppm, 600 ppm và 800 ppm. Kết quả theo dõi sự sinh tr−ởng của cây khoai tây đ−ợc trình bày trên hai bảng 4.15, 4.16 và hình 8. lxxxi Bảng 4.15. ảnh h−ởng của nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy đến thời gian mọc mầm, số chồi và trạng thái của cây khoai tây in vitro Nồng độ CCC (ppm/l) Tên giống Các chỉ tiêu theo dõi ĐC 200 400 600 800 LSD 5% Thời gian mọc mầm (ngày) 3,28 5,00 5,52 7,08 7,64 0,19 Số chồi/cây (chồi) 1,40 1,32 1,16 1,00 1,00 Mar Trạng thái chồi *** *** *** *** ** Thời gian mọc mầm (ngày) 3,12 5,12 5,80 7,08 8,00 0,22 Số chồi/cây (chồi) 1,36 1,30 1,20 1,00 1,00 Dia Trạng thái chồi *** *** *** *** * Thời gian mọc mầm (ngày) 3,26 5,04 6,02 6,56 7,08 0,39 Số chồi/cây (chồi) 1,40 1,28 1,14 1,02 1,02 Sol Trạng thái chồi *** *** *** *** ** Ghi chú: ***: trạng thái chồi tốt, thân mập, lá xanh đậm, bản lá to **: trạng thái chồi trung bình *: trạng thái chồi xấu, thân gầy và mảnh, lá nhỏ kém xanh Từ kết quả thu đ−ợc chúng tôi thấy rằng việc bổ sung CCC vào môi tr−ờng nuôi cấy đã có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro. Nồng độ CCC càng cao sinh tr−ởng của cây khoai tây càng chậm. - Về thời gian mọc mầm: khi tăng nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy từ 200 - 800 ppm thì thời gian mọc mầm của cây khoai tây tăng dần từ 5 - 8 ngày tuỳ thuộc vào từng giống và công thức nghiên cứu. ở nồng độ 800 ppm/l thời gian mọc mầm của cây khoai tây chậm nhất từ 7,08 ngày (giống Sollara) - 8, ngày (giống Diamant), chậm hơn đối chứng từ 3,28 - 4,24 ngày. lxxxii Bảng 4.16. ảnh h−ởng của nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy đến sự sinh tr−ởng chiều cao, số lá cây khoai tây in vitro (sau cấy 20 tuần) Nồng độ CCC (ppm/l) Tên Giống Các chỉ tiêu theo dõi 200 400 600 800 LSD 5% CV % (cm) 9,86 7,82 6,30 5,82 0,37 3,8 Tốc độ tăng tr−ởng (cm/tuần) 0,49 0,39 0,32 0,29 Chiều cao cây % so với đối chứng 24,14 19,21 15,76 14,28 (lá/cây) 14,64 11,12 9,36 8,28 0,30 5,1 Tốc độ tăng tr−ởng (lá/tuần) 0,73 0,56 0,47 0,41 Mar Số lá % so với đối chứng 36,32 27,86 23,38 20,59 (cm) 10,54 8,22 6,58 5,16 0,28 2,8 Tốc độ tăng tr−ởng (cm/tuần) 0,53 0,41 0,33 0,26 Chiều cao cây % so với đối chứng 25,36 19,62 15,78 12,34 (lá/cây) 14,80 12,32 8,30 6,64 0,36 2,6 Tốc độ tăng tr−ởng (lá/tuần) 0,74 0,62 0,41 0,33 Dia Số lá % so với đối chứng 35,24 29,52 19,52 15,71 (cm) 11,28 9,80 8,00 6,40 0,37 3,1 Tốc độ tăng tr−ởng (cm/tuần) 0,56 0,49 0,40 0,32 Chiều cao cây % so với đối chứng 25,93 22,68 18,52 14,81 (lá/cây) 13,16 11,84 9,68 8,24 0,21 4,4 Tốc độ tăng tr−ởng (lá/tuần) 0,66 0,59 0,48 0,41 Sol Số lá % so với đối chứng 26,34 29,46 24,00 18,39 lxxxiii 0 0.5 1 1.5 2 2.5 Mar Dia Sol Giống T ốc đ ộ tă ng tr −ở ng c hi ều c ao c ây ( cm /tu ần ) ĐC 200 ppm 400 ppm 600 ppm 800 ppm Hình 8. ảnh h−ởng của nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy đến tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây khoai tây in vitro - Về số chồi/cây: trong môi tr−ờng có bổ sung chất ức chế sinh tr−ởng CCC cây khoai tây in vitro của các giống nghiên cứu đẻ rất ít chồi. ở các nồng độ CCC 200 ppm và 400 ppm/l, số chồi/cây trung bình 1,16 - 1,32 chồi. ở các nồng độ CCC 600 ppm và 800 ppm/l, cây không phân chồi, số chồi/cây trung bình là 1 chồi. - Về trạng thái chồi: nhìn chung, môi tr−ờng có bổ sung CCC ít ảnh h−ởng đến trạng thái sinh tr−ởng chồi của cây khoai tây in vitro. Các nồng độ từ 200 - 600 ppm/l đều cho trạng thái cây sinh tr−ởng tốt (thân mập, lá xanh và bản lá to). Tuy nhiên khi nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy tăng cao đến 800 ppm/l thì trạng thái chồi lại có biểu hiện kém: các giống Mariella và Sollara cho trạng thái chồi ở mức trung bình, riêng giống Diamant có trạng thái chồi ở mức xấu ( thân gầy, lá nhỏ và vàng). lxxxiv - Về chiều cao cây: việc bổ sung CCC vào môi tr−ờng nuôi cấy có tác dụng làm giảm tốc độ tăng tr−ởng chiều cao, nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy càng cao tốc độ tăng tr−ởng chiều cao càng giảm dần. + ở nồng độ CCC 200 ppm/l cây khoai tây có chiều cao trung bình 9,86 - 11,28 cm, với tốc độ tăng tr−ởng trung bình 0,49 - 0,56 cm/tuần giảm bằng 24,14 - 25,93% đối chứng. Nh− vậy, sau 20 tuần nuôi cấy, chiều cao cây đã đạt đến ng−ỡng cần phải cấy chuyển. + ở nồng độ CCC 400 ppm/l, sự tăng tr−ởng về chiều cao tuy đã giảm so với nồng độ 200 ppm/l từ 1,48 - 2,32 cm nh−ng vẫn ở mức cao, trung bình 7,82 - 9,8 cm. Tốc độ tăng tr−ởng chiều cao giảm bằng 19,21 - 22,68% đối chứng. + ở nồng độ CCC 600 ppm/l, tốc độ tăng tr−ởng chiều cao cây thấp hơn nhiều so với hai nồng độ trên, trung bình 0,32 - 0,4 cm/tuần giảm bằng 15,76 - 18,52% đối chứng. + Nồng độ CCC 800 ppm/l, là nồng độ có tác dụng hạn chế sinh tr−ởng chiều cao cây mạnh nhất, tốc độ tăng tr−ởng trung bình chỉ đạt 0,26 - 0,32 cm/tuần, giảm bằng 12,34 - 14,81% đối chứng. - Về số lá/cây: T−ơng tự nh− sự tăng tr−ởng về chiều cao cây, tốc độ tăng tr−ởng số lá giảm dần khi nồng độ CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy tăng dần. Tuy nhiên số lá/cây của tất cả các giống đều ở mức cao. Tốc độ tăng tr−ởng số lá ở nồng độ 800 ppm thấp nhất vẫn đạt 0,33 - 0,41 lá/tuần, giảm bằng 15,71 - 20,59% đối chứng. Nh− vậy, CCC trong môi tr−ờng nuôi cấy vừa có dụng làm chậm tăng tr−ởng chiều cao cây vừa đảm bảo đ−ợc hệ số nhân cao sau chu kỳ bảo quản. Tóm lại: việc bổ sung CCC vào môi tr−ờng nuôi cấy có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro. ở độ 800 ppm cây sinh tr−ởng chậm nhất song trạng thái chồi của các giống đều không đ−ợc tốt. Nồng độ lxxxv 600 ppm/l vừa có tác dụng hạn chế sinh tr−ởng đồng thời đảm bảo trạng thái chồi tốt cho tất cả các giống nghiên cứu. 4.6. Nghiên cứu khả năng bảo quản nguồn giống khoai tây thông qua việc tạo và l−u giữ củ siêu bi in vitro Sản xuất củ khoai tây in vitro là kỹ thuật tạo củ giống hoàn toàn sạch bệnh nên đ−ợc sử dụng là nguồn vật liệu của hệ thống sản xuất giống. Các tác giả Trần Thanh Th−, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1988) [35], Paul, Struik, Lommen (1991) [28] khẳng định rằng sản xuất củ siêu bi in vitro là ph−ơng pháp hữu hiệu để có thể thu đ−ợc số l−ợng lớn củ giống trong thời gian ngắn với diện tích nhỏ. Củ nhỏ in vitro đ−ợc sản xuất quanh năm trong điều kiện vô trùng nên củ giống thu đ−ợc hoàn toàn sạch bệnh. Củ giống in vitro có kích th−ớc nhỏ nếu bảo quản với kỹ thuật thông th−ờng sẽ bị mất n−ớc, củ bị teo tóp dẫn đến giảm sức sống đồng thời hiện t−ợng già hoá sinh lý xẩy ra nhanh chóng. Bên cạnh đó, sau khi thu hoạch củ giống tiếp xúc với môi tr−ờng bên ngoài dễ bị nhiễm bệnh, khi cần nhân nhanh một l−ợng giống lớn lại phải tiến hành lần l−ợt từng b−ớc khử trùng và vào mẫu. Vì vậy với mục đích duy trì nguồn giống trong điều kiện in vitro chúng tôi tiến hành bảo quản củ in vitro ngay trong điều kiện nuôi d−ỡng ở ống nghiệm. Thí nghiệm tiến hành tạo củ khoai tây trên môi tr−ờng MS + 12% saccaroza và theo rõi thời gian tồn tại của cây mẹ sau tạo củ 2 tháng cho đến khi cây mẹ chết hoàn toàn. Tiếp đó tiến hành cấy chuyển củ sang môi tr−ờng nhân và theo dõi thời gian mọc mầm của củ giống. Các kết quả đ−ợc trình bày trên bảng 4.17. lxxxvi Bảng 4.17. Đánh giá khả năng duy trì nguồn giống khoai tây bằng tạo và l−u giữ củ siêu bi trên môi tr−ờng nuôi cấy Thời gian mọc mầm của củ microtuber (ngày) Tên giống Thời gian xuất hiện củ (ngày) Thời gian cây mẹ tồn tại (ngày) ngày bắt đầu xuất hiện mầm ngày mọc mầm hoàn toàn Mar 4,68 36,12 60,34 89,86 Dia 5,24 32,98 68,16 92,48 Sol 5,04 35,18 64,38 96,26 KT3 6,12 33,74 61,12 93,14 LSD 5% 0,65 3,94 4,97 4,65 CV% 55 6,1 5,0 3,8 Từ số liệu thu đ−ợc chúng tôi thấy rằng việc l−u giữ củ giống khoai tây in vitro trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo đã có tác dụng kéo dài thời gian thời gian ngủ nghỉ của củ giống. Trong điều kiện nuôi cấy nhân tạo, mặc dù trong thời gian tạo củ cây khoai tây in vitro đ−ợc đặt trong điều kiện tối hoàn toàn nh−ng sau 2 tháng (đủ thời gian chín sinh lý có thể thu hoạch) cây mẹ vẫn còn tồn tại. Khi đ−ợc đ−a ra điều kiện có ánh sáng của phòng nuôi cấy cây mẹ tiếp tục sinh tr−ởng và tồn tại đ−ợc 32,98 - 36,12 ngày tuỳ từng giống. Nh− vậy nếu tính cả thời gian tạo củ thì chu kỳ của cây khoai tây in vitro kéo dài hơn 3 tháng (khoảng 92,98 - 96,12 ngày), trong thời gian này nếu là cấy nhân thông th−ờng thì chúng ta phải tiến hành cấy chuyển ít nhất 3 lần. Khi cấy chuyển sang môi tr−ờng nhân củ khoai tây mới thực sự bắt đầu chu kỳ ngủ nghỉ. Sau cấy chuyển từ 60,34 - 68,16 ngày củ siêu bi của các lxxxvii giống bắt đầu mọc mầm và sau từ 90 - 96 ngày thì các giống mới mọc mầm hoàn toàn. Nh− vậy bằng biện pháp l−u giữ củ siêu bi trong ống nghiệm chúng ta có thể kéo dài thời gian bảo quản nguồn giống trong vòng 7 tháng đồng thời đảm bảo sự trẻ hoá sinh lý cho cây in vitro. lxxxviii 5. Kết luận và đề nghị 5.1. Kết luận Từ kết quả nghiên cứu trên, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Sử dụng môi tr−ờng nghèo dinh d−ỡng (B5, Knop) cũng nh− việc giảm hàm l−ợng dinh d−ỡng của môi tr−ờng MS (1/2MS, 1/4MS) đều tỏ ra không phù hợp cho mục đích duy trì sinh tr−ởng chậm cây khoai tây. Trong môi tr−ờng B5 và Knop cây khoai tây tuy có tác dụng hạn chế sự sinh tr−ởng nh−ng trạng thái chồi lại rất kém (thân gầy, lá vàng, có hiện t−ợng tàn lụi). Trong môi tr−ờng 1/2MS và 1/4 MS, cây khoai tây có hiện t−ợng mọc vống cao và trạng thái cây kém. 2. Nền môi tr−ờng cứng do hàm l−ợng agar cao có tác dụng làm giảm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro, tuy nhiên hiệu quả không cao. Sau 8 tuần nuôi cấy cây khoai tây ở các giống nghiên cứu đều ở mức cao, ở hàm l−ợng agar cao nhất 10 g/l thì chiều cao cây trung bình cũng đạt 10,82 - 11,7 cm, số lá trung bình từ 10,52 - 11,8 lá. 3. Việc sử dụng các chất làm tăng áp suất thẩm thấu của môi tr−ờng nuôi cấy có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng đáng kể so với đối chứng. Trong đó manitol 3% và sorbitol 2% có hiệu quả bảo quản tốt nhất, sau thời gian bảo quản 20 tuần chiều cao cây trung bình t−ơng ứng chỉ đạt 2,84 - 3,92 cm và 5,08 - 6,18 cm mà vẫn giữ đ−ợc trạng thái chồi tốt. Nồng độ đ−ờng saccaroza 6% có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng nh−ng hiệu quả thấp, sau 8 tuần nuôi cấy chiều cao cây trung bình đạt 9,44 - 12,04 cm đồng thời cây đã có biểu hiện già hoá. 4. Nhiệt độ thấp có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro. Nhiệt độ 5oC có hiệu quả duy trì cao. Sau 20 tuần nuôi cấy cây có chiều cao trung bình từ 2,79 (giống Diamant) - 3,64 cm (giống Sollara), số lá/cây từ lxxxix 4,48 - 5,72 lá, trạng thái chồi tốt giữ đ−ợc trạng thái trẻ sinh lý (thân mập, lá xanh, không phân nhánh). 5. Việc bổ sung CCC vào môi tr−ờng nuôi cấy có tác dụng làm chậm sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro. Nồng độ CCC 600 ppm/l là thích hợp nhất. Sau 20 tuần nuôi cấy, cây có chiều cao trung bình từ 6,18 - 8,0 cm, số lá/ cây từ 8,30 - 9,68 lá tuỳ từng giống và đảm bảo đ−ợc trạng thái chồi tốt của tất cả các giống nghiên cứu. 6. Việc tạo và l−u giữ củ siêu bi in vitro có tác dụng duy trì nguồn giống khoai tây sạch bệnh. Khả năng l−u giữ củ trong điều kiện in vitro tới hơn 7 tháng đồng thời sự mọc mầm củ in vitro còn có tác dụng làm trẻ hoá cây in vitro. 5.2. Đề nghị - Đánh giá tiếp tục khả năng bảo quản cây khoai tây in vitro ở các công thức có hiệu quả duy trì sinh tr−ởng chậm cao để xác định chu kỳ bảo quản tối đa đối với mỗi yếu tố tác động. - Mở rộng hơn nữa quy mô thí nghiệm về các công thức thí nghiệm cũng nh− về số l−ợng giống khoai tây để phục vụ cho kỹ thuật l−u giữ nguồn gene khoai tây quý hiếm, đáp ứng kịp thời nhu cầu về nguồn giống sạch bệnh cho sản xuất khi cần thiết. xc TàI liệu tham khảo Phần tiếng việt 1. Hồ Hữu An, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ và kỹ thuật thâm canh, Quyển 6 - cây khoai tây, NXB Lao động xã hội. 2. Lê Trần Bình, Hồ Hữu Nhị, Lê Thị Muội (1997), Giáo trình công nghệ sinh học thực vật trong cải tiến giống cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 3. Võ Văn Chi, Vũ Văn Chuyên và cs (1969), “Cây khoai tây” trích trong cuốn Cây cỏ th−ờng thấy ở Việt Nam, tập IV, Tr 130 - 131. 4. Võ Văn Chi, D−ơng Đức Tiến (1978), Phân loại học thực vật bậc cao, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 5. Đào Huy Chiên (2001), “Các kết quả nghiên cứu và phát triển cây có củ 1996 - 2000”, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, vol 34, N01-2, tr39- 40 6. Đào Huy Chiên, Tr−ơng Văn Hộ, peter Vanderzaag, Nguyễn Thị Thuấn, Nguyễn Thị Hoa, Đỗ Thị Bích Nga, Vũ Thị Bích Dần, Trịnh Văn Mỹ, Đào Mạnh Hùng (2002), "Kết quả chọn tạo giống khoai tây VC 38-6" Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học kỹ thuật, NXB Nông nghiệp. 7. Đỗ Kim Chung (2003), Thị tr−ờng khoai tây ở Việt Nam, NXB Văn hoá Thông tin Hà Nội. 8. Nguyễn Công Chức (2001), “Hiệu quả kinh tế của sản xuất khoai tây ở Đồng Bằng Sông Hồng”, Tạp chí Khoa học và phát triển nông thôn, N02, tr78-79 9. Nguyễn Công Chức (2002), Dự án, “ Phát triển khoai tây ở Việt Nam”, Báo Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn số 66, 67. Tr59. xci 10. Tạ Thu Cúc, Hồ Hữu An, Nghiêm Thị Bích Hà (2000), Giáo trình cây rau, tr 144-166, NXB Nông nghiệp. 11. Phạm Tiến Dũng (2003), Xử lý kết quả thí nghiệm trên máy vi tính bằng IRRISTAT 4.0 trong windows, NXB Nông nghiệp. 12. Vũ Thị Hằng (2005), Nghiên cứu tẩy sạch virus bằng kỹ thuật nuôi cấy meristem nhằm phục tráng giống khoai tây KT2, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Tr−ờng Đại Học NNI - Hà Nội. 13. Hà Thị Hân (2003), Nghiên cứu kỹ thuật duy trì sinh tr−ởng chậm cây khoai tây in vi tro của một số giống khoai tây sạch bệnh nhập nội, Báo cáo tốt nghiệp khoa Nông học – Tr−ờng Đại Học NNI - Hà Nội. 14. Tr−ơng Văn Hộ, Nguyễn Văn Kim (2002), “Nghiên cứu phát triển cây khoai tây ở Việt Nam”, Tạp chí nông nghiệp và phát triển nông thôn, N0 8, tr288-289 15. Nguyễn Tiến H−ng (2005), Nghiên cứu một số giải pháp sản xuất khoai tây giống chất l−ợng cao góp phần hoàn thiện hệ thống sản xuất giống cho các tỉnh phía Bắc, Luận án thạc sĩ nông nghiệp, Tr−ờng Đại Học NNI – Hà Nội. 16. Vũ Triệu Mân (1978), Bệnh virus hại khoai tây, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội. 17. Vũ Triệu Mân (1986), Một số kết quả nghiên cứu bệnh virus hại ai tây và các chủng virus X, Y hại khoai tây giống Ackersegen ở Th−ờng Tín - Hà Tây, Luận án PTS nông nghiệp, Tr−ờng Đại Học NNI - Hà Nội. 18. Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (1994), “Duy trì và bảo quản in vitro”, tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học, Trung tâm công nghệ sinh học, tr19-25. xcii 19. Trần văn Ngọc, Trần Văn Minh, Nguyễn Văn Uyển (1993), “Nhân giống khoai tây bằng ph−ơng pháp nuôi cấy mô thực vật”, Tạp chí khoa học và công nghệ, N02, tr 41- 44, 48. 20. Hồ Hữu Nhị (1993), “Nghiên cứu bảo quản tập đoàn cây trồng nhân giống vô tính”, kết quả nghiên cứu khoa học nông nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội, tr 125 21. Lê H−ng Quốc (2001), “Dự án khoai tây Việt Đức khuyến khích phát triển sản xuất khoai tây ở Việt Nam”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, N09, tr 594-595. 22. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn, Mai Thị Tân, Nguyễn Thị Lý Anh, Phạm Thị Vân, Nguyễn Thị Thanh Nga (1991), Xây dung mô hình sản xuất khoai tây giống có chất l−ợng cao (sạch virus, trẻ sinh lý) bắt nguồn từ nuôi cấy in vitro, đề tài cấp bộ. 23. Nguyễn Quang Thạch, Hoàng Minh Tấn, Frei. U, Wenzel. G (1993), “Nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học trong công tác giống khoai tây ở Việt Nam”, Kết quả nghiên cứu khoa học Khoa Trồng trọt 1991- 1992. Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tr134- 144. 24. Nguyễn Quang Thạch (1993), Một số biện pháp khắc phục sự thoái hoá giống khoai tây ( Solanum tuberosum L.) ở Đồng Bằng Bắc Bộ, Luận án phó tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Tr−ờng Đại Học NNI - Hà Nội. 25. Nguyễn Quang thạch, Hoàng Minh Tấn, Trần Văn Phẩm (2000), Giáo trình sinh lý thực vật, NXB Nông nghiệp. 26. Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Xuân Tr−ờng, Nguyễn Thị Lý Anh (2004), ứng dụng công nghệ cao sản xuất khoai tây giống sạch bệnh, Bộ NN &PTNT, Trung tâm Khuyến nông quốc gia, trung tâm tin học, Thông tin chuyên đề. xciii 27. Nguyễn Quang Thạch, Phạm Văn Tuân, Lai Đức L−u (2005), “nghiên cứu sản xuất củ giống Minituber từ cây in vitro”, Tạp chí khoa học kỹ thuật nông nghiệp tập III, số 1, năm 2005. 28. Nguyễn Thị Kim Thanh (1998), Nghiên cứu xây dung quy trình sản xuất củ giống khoai tây sạch bệnh có kích th−ớc nhỏ bắt nguồn từ nuôi cấy in vitro, Luận án tiến sĩ khoa học nông nghiệp, Tr−ờng Đại Học NNI - Hà Nội. 29. Nguyễn Thị Kim Thanh (2003), “ Nghiên cứu kỹ thuật thâm canh nhanh cây in vitro của một số dòng giống khoai tây nhập nội sạch bệnh”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, số 10, tr 1267- 1269. 30. Nguyễn Thị Kim Thanh (2004), “Nghiên cứu kỹ thuật duy trì sinh tr−ởng chậm cây khoai tây in vitro của một số giống khoai tây sạch bệnh”, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, tr41- 44. 31. Nguyễn Thị Kim Thanh (2004), “ Đánh giá hiệu quả của một số nhân tố sử dụng trong môi tr−ờng nuôi cấy đến khả năng làm chậm sinh tr−ởng cây khoai tây in vitro”, Tạp chí khoa học nông nghiệp, số 4, tập II, Tr−ờng ĐHNNI. 32. Phạm chí Thành (1988), Giáo trình ph−ơng pháp thí nghiệm đồng ruộng, NXB Nông nghiệp. 33. Ngô Đức Thiệu (1978), Chế độ t−ới n−ớc của cây khoai tây vùng Gia Lâm- Hà Nội, Luận án PTS khoa học nông nghiệp, tr 3, Tr−ờng Đại Học NNI - Hà Nội. 34. Ngô Đức Thiệu (1984), Kỹ Thuật trồng khoai tây, NXB Nông nghiệp. 35. Trần Thị Thanh Th−, Lê Trần Bình, Lê Thị Muội (1988), “Tạo củ khoai tây sạch virus bằng ph−ơng pháp nuôi cấy in vitro”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật nông nghiệp, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Tr150- 152. xciv 36. Đặng Thị Vân (1997), Nghiên cứu cải tiến một số khâu kỹ thuật góp phần hoàn thiện hệ thống sản xuất giống khoai tây sạch bệnh bắt nguồn từ nuôi cấy in vitro cho vùng Đồng Bằng Sông Hồng, Luận án thạc sĩ khoa học nông nghiệp, Tr−ờng Đại Học NNI - Hà Nội. Phần tiếng anh 37. A. Schafer - Menuhr; E Muller and G.Mix-Wager (1996), “Cryopreservation an alternative for the long term storage of old potato Varieties”, Ann.J. Pot 43, pp 507- 513. 38. Deutsche Sammlung Von; Mikroorganis Men Und; Zellkulturen Gmbh (1998), “Protocol for cryopreservation of potato Meristems by the “Droplet” method”, American potato journal, vol 65, No 4, pp1-10. 39. FAO yearbook, 2000, vol 54 40. Gerson Reman de Luces Fortes, E Jonny Everson Scherwinski Pereira (2001), “In vitro storage of potato under acetyl salicylic acid and two carbohydrate soures”, Potato preservation, vol 36, no 10, October. scielo. php? Cript = Sci_arttext and pid = 50100- 204x2001001000007. 41. Gopal, J, Chamail, An jail, Sarkar, Debabrata (2004), “In vitro production of microtubers for conservation of potato germ plasm, effect of genotype, Absisic acid, and sucrose”, Potato preservation, vol 40, issue 5, September. congress.Org/ Sub. Cfm? Source = 344. 42. Harney H.A.; Crawey M.P., Clinch P.E.M.(1966), “The emmeet of growth regulator tuberization of cultured stem segment of Solanumt tuberosum”, Eur. Pot J.9, pp 146-151 xcv 43. Harward H.W.(1990), Genetic of the potato Solanum turberosum, Logs press, London, pp 126. 44. Hawkes J.G.(1982), Genetic conservation of recalcitrant species, Incropgenetic resources, Rome, pp 83-92. 45. Hawkes J.G.(1982), History of the potato, the potato Crop, Rome. 46. Kenneth C. Tores (1988), Potato micropropagation and germ plasm storage. Tissue culture techniqui for horticultural crop, pp 181-186, published by Van Nostrand Reinhold , New York. 47. Soddar Uddin Siddiqui, M Fayyaz Chaudhary an Ráhid Anwar (2006), “International plant genetic reasources institute studies on the in vitro conservation of potato (Solanum tuberosum L.) germ plasm in Pakistan”, Potato preservation, N0 3, April. congress.Org/Sub. Cfm? Source = 344. xcvi Phụ lục xcvii Phụ lục 1 Một số hình ảnh minh hoạ ảnh 1. Sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro trên các môi tr−ờng dinh d−ỡng khác nhau (sau cấy 8 tuần) xcviii ảnh 2. sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro trên môi tr−ờng có hàm l−ợng agar cao (sau cấy 8 tuần) ảnh 3. Sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro trên môi tr−ờng có nồng độ đ−ờng cao (sau cấy 8 tuần) xcix ảnh 4. Sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro trên môi tr−ờng có bổ sung manitol (sau cấy 20 tuần) ảnh 5. Sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro trên môi tr−ờng có bổ sung sorbitol (sau cấy 20 tuần) c ảnh 6. Sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro trong điều kiện nhiệt độ thấp (sau cấy 20 tuần) ảnh 7. Sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro sau cấy chuyển củ microtuber vào môi tr−ờng dinh d−ỡng 16 tuần ci ảnh 8: Sinh tr−ởng của cây khoai tây in vitro trên môi tr−ờng có bổ sung CCC (sau cấy 20 tuần) cii PHụ lục 2 thành phần dinh d−ỡng của các môi tr−ờng dinh d−ỡng Bảng thành phần môi tr−ờng dinh d−ỡng MS (Murashige- Skoog, 1962) STT Tên hoá chất Hàm l−ợng/l môi tr−ờng I Các nguyên tố đa l−ợng (g/l) 1 NH4NO3 1,65 2 KNO3 1,90 3 CaCl2.2H2O 0,44 4 MgSO4.7H2O 0,50 5 KHPO4 0,17 II Các nguyên tố vi l−ợng (mg/l) 1 H3BO3 6,20 2 MnSO4.4H2O 22,30 3 ZnSO4.4H2O 8,60 4 KI 0,83 5 MoO4.2H2O 0,25 6 CoCl2.6H2O 0,025 7 CuSO4.5H2O 0,025 III Các vitamin (mg/l) 1 Glycin 2,0 2 Thiamin HCl 0,5 3 Pyridoxin 0,5 4 Nicotin 0,5 IV Inositol 100 mg/l V NaFeEDTA (g/l) 1 NaEDTA 0,03725 2 FeSO4.2H2O 0,02785 ciii Thành phần môi trừơng dinh d−ỡng B5 (GamBorg) STT Tên hoá chất Hàm l−ợng/l môi tr−ờng I Các nguyên tố đa l−ợng (g/l) 1 (NH4)2SO4.H2O 0,15 2 KNO3 3,0 3 CaCl2.2H2O O,15 II FeEDTA 28 mg/l III Các nguyên tố vi l−ợng (mg/l) 1 KI 0,75 2 H3BO3 3,00 3 MnSO4.4H2O 13.2 4 ZnSO4.7H2O 2,0 5 NaMoO4.5H2O 0,25 6 CoCl2.6H2O 0,025 7 CuSO4.5H2O 0,025 IV Các vitamin (mg/l) 1 Thiamin HCl 10 2 Pyridoxin 1 3 Nicotin 1 4 Inositol 100 civ Bảng thành phần môi tr−ờng dinh d−ỡng Knop STT Tên hoá chất Hàm l−ợng/l môi tr−ờng I Các nguyên tố đa l−ợng (g/l) 1 KNO3 0,25 2 Ca(NO3).4 H2O 1,0 3 MgSO4..7H2O 0,51 4 KH2PO4 0,25 5 KCl 0,12 6 FeSO4 0,035 7 NaEDTA 0,05 II Các nguyên tố vi l−ợng (mg/l) 1 MgSO4.4H2O 0,25 2 H3BO3 0,25 3 ZnSO4 0,05 4 CuSO4.5H2O 0,008 5 Na2MO4.2H2O 0,011 III Các vitamin (mg/l) 1 Glycin 2,0 2 Thiamin HCl 0,5 3 Pyridoxin 0,5 4 Nicotin 0,5 cv Phụ lục 3 ._.