Nghiên cứu khả năng tăng trưởng của một số vi sinh vật trên bề mặt Cellulose vi khuẩn (BC-Bacterial cellulose)

cứu nhiều nhất. Cấu trúc của BC được tổng hợp khác nhau ở các lồi vi khuẩn khác nhau. Bảng 2.1 : Cấu trúc cellulose của một số vi sinh vật [7] Giống Cấu trúc cellulose Acetobacter Achromobacter Aerobacter Agrobacterium Alcaligen Pseudomonas Rhizobium Sarcina Zoogloea Lớp màng ngoại bào tạo thành các dãi Sợi Sợi Sợi ngắn Sợi Các sợi khơng tách biệt Sợi ngắn Cellulose dị hình Chưa xác định rõ cấu trúc Trong đĩ chủng Acetobacter đặc biệt là Acetobacter xylinum (A. aceti ssp. xylinum, A. xylinus) là vi sinh vật tạo cellulose hữu hiệu nhất và được sử dụng phổ biến nhất trong việc sản xuất thạch dừa vì năng suất tạo BC cao, cấu trúc BC phù hợp cho nhiều ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau [7]. Vi khuẩn Acetobacter xylinum Phân loại: Theo khĩa phân loại Bergey, A. xylinum thuộc: Lớp : Schizomycetes Bộ : Pseudomonadales Bộ phụ : Pseudomonadieae Họ : Pseudomonadaceae Giống : Acetobacter Lồi : Acetobacter xylinum Gần đây, A. xylinum đã được xếp vào giống mới Gluconacetobacter, bao gồm các lồi là G. xylinus, G. hansenii, G. europaeus, G. oboediens và G. intermedius [7]. Đặc điểm hình thái A. xylinum: A. xylinum cĩ dạng hình que, thẳng hay hơi cong, cĩ thể di động hoặc khơng và khơng sinh bào tử. Chúng là vi khuẩn gram âm nhưng gram của chúng cĩ thể bị biến đổi do tế bào già đi hay do mơi trường. Tế bào đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. A. xylinum thuộc loại vi khuẩn hiếu khí bắt buộc vì thế chúng tăng trưởng ở bề mặt tiếp xúc giữa mơi trường lỏng và mơi trường khí và cĩ khả năng tạo màng cellulose trên mơi trường nuơi cấy [7]. Hình 2.1: Tế bào Acetobacter xylinum Trên mơi trường rắn sau khoảng 3 – 7 ngày nuơi cấy, khuẩn lạc A. xylinum cĩ dạng nhỏ, nhày, cĩ màu kem, hơi trong nhưng sau một tuần thì khuẩn lạc to, đục, màu cà phê sữa, khơ dần. Trên mơi trường lỏng sau 24 giờ nuơi cấy thì xuất hiện một lớp màng đục dày, sau 36 – 48 giờ hình thành một lớp màng trong và ngày càng dày [11]. Đặc điểm sinh lý và sinh hĩa của A. xylinum Phản ứng catalase dương tính. Oxi hĩa ethanol thành CO2 và H2O. Khơng tăng trưởng trên mơi trường Hoyer. Khơng tạo sắc tố nâu. Vi khuẩn hiếu khí hồn tồn. Chuyển hĩa glucose thành acid. Chuyển hố glycerol thành dihydroxyaceton. Tổng hợp cellulose. A. xylinum sử dụng nhiều nguồn đường khác nhau và tùy thuộc vào chủng mà nguồn đường nào được sử dụng tốt nhất. Chúng cĩ thể chuyển hĩa glucose thành acid gluconic, điều này làm cho pH mơi trường giảm từ 1 - 2 đơn vị. Nhiệt độ tối ưu để A. xylinum phát triển là từ 25 - 30°C và pH từ 5,4 – 6,3. A. xylinum cĩ thể phát triển trong phạm vi pH từ 3 – 8, nhiệt độ từ 12 - 35°C và nồng độ ethanol cĩ thể tới 10% [7]. Các đặc điểm của BC Cấu trúc của BC Cellulose là một polymer khơng phân nhánh bao gồm những gốc glucopyranose nối với nhau bởi liên kết β-1,4-glucan. Các nghiên cứu cho thấy BC cĩ cấu trúc hĩa học giống y hệt PC (cellulose thực vật). Tuy nhiên, cấu trúc đa phân và thuộc tính của BC khác với PC. Chiều rộng của các sợi cellulose được tạo ra từ gỗ thơng là 30.000 – 75.000nm trong khi những dải vi sợi cellulose cĩ chiều dài từ 1 - 9μm hình thành nên cấu trúc lưới dày đặc, được ổn định bởi các nối hydrogen. BC khác với PC về chỉ số kết chặt, về mức độ polymer hĩa. Hình 2.2: Cấu trúc của cellulose vi khuẩn và cellulose thực vật [44] Hai dạng kết tinh phổ biến của cellulose trong tự nhiên là I và II, được phân biệt bởi các kỹ thuật phân tích bằng tia X, quang phổ và tia hồng ngoại. Tùy thuộc vào điều kiện mơi trường nuơi cấy và giống vi khuẩn mà cellulose dạng nào chiếm ưu thế. Cellulose I và II đều được tổng hợp trong tự nhiên trong đĩ celulose I phổ biến hơn. Cellulose I cĩ thể được chuyển thành cellulose II, nhưng cellulose II thì khơng thể chuyển thành cellulose I. Rất ít tế bào Eukaryote tổng hợp cellulose II. A. xylinum thì tổng hợp được cả 2 loại cellulose I và II. Cellulose I: được tổng hợp bởi đa số thực vật và A. xylinum ở mơi trường tĩnh. Các chuỗi β-1,4-glucan được sắp xếp song song với nhau theo một trục. Năm 1984 Atalla và Vander Hart đã xác định được cấu trúc cellulose Iα và cellulose Iβ. Cellulose II: thường được tổng hợp trong mơi trường nuơi cấy lắc. Các chuỗi β-1,4-glucan xếp một cách ngẫu nhiên, hầu như khơng song song và nối với nhau bởi một số lượng lớn nối hydrogen, làm cho cellulose II cĩ độ bền về nhiệt [7][24]. Hình 2.3: Sự hình thành vi sợi bởi A. xylinum [Iguchi và cộng sự, 2000]Vi sợi Cellulose Microfibril Tiền sợi Lỗ xuất cellulose Cellulose II LPS envelope Cellulose Synthase Cellulose I Cytoplasmic Membrane Chức năng sinh lý của cellulose đối với Acetobacter xylinum Tế bào A. xylinum được bẫy bên trong mạng lưới polymer. Mạng lưới này là vật chống đỡ cho quần thể vi sinh vật luơn ở bề mặt tiếp giáp giữa mơi trường lỏng và khơng khí. Cellulose cịn cĩ vai trị tích trữ và cĩ thể được sử dụng khi vi sinh vật này bị thiếu nguồn dinh dưỡng. Sự phân hủy cellulose được xúc tác bởi enzyme exo-glucanase hay endo-glucanase. Nhờ tính dẻo và tính thấm nước của màng cellulose mà vi khuẩn kháng lại được những thay đổi bất lợi trong mơi trường sống như giảm lượng nước, thay đổi pH, xuất hiện chất độc và vi sinh vật gây bệnh. Cellulose bao quanh bảo vệ chúng khỏi tia cực tím. Khoảng 23% số tế bào A. xylinum được bao BC sống sĩt sau 1 giờ xử lý tia cực tím. Tách BC khỏi tế bào, khả năng sống chỉ cịn 3% [7]. Tính chất độc đáo của BC Độ tinh khiết cao: BC là cellulose sinh học duy nhất đuợc tổng hợp khơng cĩ chứa lignin hay hemicellulose. Do đĩ BC cĩ thể bị vi khuẩn phân hủy hồn tồn và là nguồn nguyên liệu tái sinh. Độ bền dai cơ học lớn: cellulose cĩ độ bền dai cao, chịu lực kéo cao, trọng lượng nhẹ, độ bền đáng kể. Khả năng hút nước cực cao ở trạng thái ẩm: khả năng giữ nước đáng kể, lực ẩm cao. Màng cellulose vi khuẩn cĩ khả năng giữ nước rất lớn, nĩ cĩ thể hút 60 – 700 lần trọng lượng của nĩ. Màng cellulose được hình thành trực tiếp trong quá trình sinh tổng hợp vì vậy việc sản xuất giấy, sợi khơng cần qua các bước trung gian. Màng cellulose được định hướng trong quá trình tổng hợp: cĩ khả năng hình thành các sợi biến động, tạo các màng bền theo một trục. Theo Brown và White (1989) cĩ thể hình thành một găng tay cellulose khơng cần khâu bằng cách sử dụng một khối đất xốp mà khơng khí thấm qua được và dìm xuống bên trong mơi trường lỏng nuơi cấy A. xylinum, tế bào vi khuẩn sẽ tập hợp xung quanh đất xốp và hình thành cellulose theo hình dạng mong muốn. Màng cellulose được biến đổi trực tiếp trong quá trình tổng hợp: khi thêm chất phụ gia hay cơ chất nhất định vào trong quá trình tổng hợp BC thì cĩ thể làm thay đổi những thuộc tính của BC. Nếu cho thuốc nhuộm vào mơi trường nuơi cấy cĩ thể kiểm sốt các tính chất vật lý của cellulose trong quá trình tổng hợp. Tổng hợp trực tiếp các dẫn xuất của cellulose nhờ vào sự tác động lên gen liên quan đến quá trình tổng hợp cellulose từ đĩ giúp kiểm sốt hình dạng cellulose, kiểm sốt trọng lượng phân tử cellulose [11][31]. Sinh tổng hợp BC Sinh tổng hợp BC là một tiến trình bao gồm nhiều bước được điều hịa một cách chuyên biệt và chính xác, liên quan đến một số lớn enzyme, các phức hợp xúc tác và các protein điều hịa. Cellulose được tổng hợp từ A.xylinum là sản phẩm cuối cùng của sự biến dưỡng carbon, phụ thuộc vào trạng thái sinh lý của tế bào bao gồm cả chu trình pentose phosphate hoặc chu trình Krebs, kết hợp với quá trình tạo glucose. Sự thủy phân glucose khơng hoạt động ở vi khuẩn acid acetic bởi vì chúng khơng tổng hợp được enzyme quan trọng của con đường này đĩ là phosphofructose kinase. Ở A.xylinum, sự tổng hợp cellulose liên hệ chặt chẽ với quá trình dị hĩa và tiêu thụ khoảng 10% năng lượng cĩ nguồn gốc từ những phản ứng dị hĩa. Sự tổng hợp BC khơng gây trở ngại cho các quá trình đồng hĩa khác, bao gồm sự tổng hợp protein. A.xylinum biến đổi nhiều phức hợp carbon như: hexose, glycerol, pyruvate, dihydroxyacetone và các dicarboxylic acid thành cellulose với hiệu suất 50%. Ngày nay con đường tổng hợp cellulose ở A.xylinum đã được hiểu rất rõ. Đĩ là một quá trình tổng hợp gồm nhiều bước liên tiếp nhau, gồm hai giai đoạn chính: giai đoạn polymer hĩa, giai đoạn kết tinh. Giai đoạn polymer hĩa: trong đĩ cĩ sự tham gia của enzyme tổng hợp cellulose xúc tác. Đầu tiên enzyme glucokinase (GK) xúc tác phản ứng phosphoryl hĩa glucose thành glucose-6-phosphate (Glc-6-P). Tiếp theo Glc-6-P bị isomer hĩa tạo thành glucose-1-phosphate (Glc-1-P) nhờ enzyme phosphoglucosemutase (PGM). Sau đĩ enzyme UDP-glucose pyrophosphorylase (UGP) xúc tác chuyển Glc-1-P thành UDPGlc, trong đĩ cĩ sự hiện diện của UTP. Cuối cùng cellulose được tạo thành từ UDPGlc nhờ enzyme cellulose synthase và cyclic-di-GMP là yếu tố giúp hoạt hĩa enzyme này. Giai đoạn kết tinh: các chuỗi bắt đầu được tổng hợp nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucan. Các chuỗi glucan kết hợp với nhau bằng liên kết Van der Waals tạo nên lớp các chuỗi glucan. Lớp này chỉ tồn tại trong một thời gian ngắn, sau đĩ các lớp này sẽ kết hợp với nhau bằng liên kết hydro tạo thành các sợi cơ bản thường gồm 16 chuỗi glucan. Các sợi cơ bản tiếp tục kết hợp với nhau tạo thành vi sợi, rồi sau đĩ tạo thành các bĩ và thành các sợi. Kích thước, hình dạng, độ trong suốt, tỷ lệ các dạng của cellulose tùy thuộc vào vị trí xúc tác của phức chất enzyme. Hình 2.4: Con đường dự đốn của quá trình sinh tổng hợp và tiết ra cellulose khi glucose được tế bào A. xylinum hấp thụ từ bên ngồi [43] 1PFK Fru-bi-P FBP Con đường sinh glucose Chu trình Pentose phosphate Chu trình Krebs PGI FK Fru-6-P Fructose PTS Fru-1-P ATP ADP PGA G6PDH (NAD, NADP) Glucose Glc-6-P GK ADP ATP Cellulose CS UDP-Glc UGP Glc-1-P PGM Hình 2.5: Con đường sinh tổng hợp BC ở Acetobacter xylinum [44] UDPGlc pyrophosphorylase là enzyme quyết định sự tổng hợp cellulose vì vài kiểu hình đột biến khơng tổng hợp cellulose thiếu enzyme này (Valla et al.,1989). Hơn nữa, hoạt tính pyrophosphorylase khác nhau giữa những lồi A. xylinum khác nhau và hoạt tính cao nhất thì được phát hiện trong những lồi sản xuất cellulose hiệu quả nhất như là A. xylinum ssp. sucrofermentans BPR2001. Ngồi ra cĩ vài lồi thích sử dụng fructose như là nguồn cacbon và thể hiện hoạt tính phosphoglucoisomerase cao và cĩ hệ enzyme trao đổi phosphor và phụ thuộc vào phosphoenolpyruvate. Hệ này xúc tác biến đổi fructose thành fructose-1-phosphate và thành fructose-1,6-biphosphate [7][6]. Nguyên liệu để nuơi Acetobacter xylinum nhằm thu BC Nước dừa già Nước dừa già là mơi trường cổ điển để thu nhận BC từ A. xylinum. Đây là mơi trường chứa nhiều chất dinh dưỡng và các chất kích thích sinh trưởng: 1,3 diphenyllurea, hexitol, cytokinin, myo-inositol, sorbitol… Dừa sau khi thu hoạch thường được bảo quản từ 3 ngày rồi đem sử dụng làm mơi trường lên men. Nếu để lâu lượng đường trong nước dừa giảm, chất lượng dinh dưỡng của nước dừa cũng khơng đảm bảo. Mơi trường nước dừa cần cung cấp thêm nguồn cacbon (sucrose, glucose hoặc nguồn cacbon khác), nguồn nitơ (SA, DAP). Rỉ đường Là phần nước đường khơng thể kết tinh hết cũng như cịn lẫn các tạp chất sau khi ly tâm nhiều lần nước mía để tách lấy đường kết tinh. Rỉ đường là một hỗn hợp khá phức tạp. Ngồi lượng đường khá cao, rỉ đường cịn chứa các hợp chất nitrogen, vitamin và các hợp chất vơ cơ khác. Thành phần của rỉ đường cĩ chứa 15 – 20% nước, 80 – 85% chất khơ hịa tan và nhiều loại vitamin như: thiamine, riboflavin, acid nicotinic, acid folic, biotin … Chất khơ hịa tan trong rỉ đường gồm: Đường tổng số chiếm hơn 50%, trong đĩ saccharose chiếm 30 – 35%, đường khử chiếm 15 – 20% (gồm glucose, fructose). Chất khử khơng lên men thường chiếm 1,7%. Thành phần chất khơ cịn lại chiếm dưới 50%, trong đĩ cĩ 30 – 32% chất hữu cơ và chất vơ cơ 18 – 20%. Khi được bảo quản lâu ngày, chất lượng rỉ đường thường giảm. Vì vậy cần cĩ chế độ bảo quản hợp ý để quá trình lên men đạt hiệu quả cao. Ngồi ra, cịn sử dụng nước mía và các nguyên liệu khác từ cơng nghiệp thực phẩm để lên men thu BC [7]. Các phương pháp sản xuất BC Nhân giống Giống vi khuẩn Acetobacter xylinum được giữa trong ống thạch nghiêng trong điều kiện lạnh sâu. Khi cần nuơi cấy thì tiến hành hoạt hĩa chúng. Khi lấy giống ra sử dụng cần cấy chuyền qua mơi trường rắn. Cấy khuẩn lạc vào ống nghiệm chứa mơi trường lỏng đã hấp khử trùng, hoạt hĩa ở nhiệt độ 28°C trong 18 – 24 giờ được giống cấp 1. Giống cấp 1 cĩ thể tiếp tục được nhân giống cấp 2, 3… Tỉ lệ giống so với mơi trường từ 1 – 10%. Lên men Lên men tĩnh: mơi trường dinh dưỡng để lên men A. xylinum được cho vào các khay lên men cĩ bề mặt thống rộng. Trong quá trình lên men các khay được đậy bằng giấy báo cĩ độ xốp, giúp tạo độ thơng khí giữa mơi trường lên men và mơi trường bên ngồi nhưng vẫn tránh được khả năng nhiễm khuẩn. Nhiệt độ thích hợp cho quá trình lên men 28 - 30°C. Sợi cellulose mới được tổng hợp sẽ di chuyển lên bề mặt mơi trường nuơi cấy tạo thành lớp màng cellulos nằm ở mặt phân cách giữa mơi trường lỏng và khơng khí. Cellulose tiếp tục được tổng hợp bám lên màng cellulose bên trên. Sau 7 – 10 ngày cĩ thể thu BC. Hình 2.6: Miếng BC được hình thành từ lên men tĩnh [24] Lên men động: vi khuẩn A. xylinum thường được nuơi cấy trong mơi trường nuơi cấy lắc. Cấy dịch huyền phù vi khuẩn đã được hoạt hĩa vào mơi trường nuơi cấy đã chuẩn bị sẵn trong các bình erlen rồi đem đi lắc trong các máy lắc ổn nhiệt ở 28 - 30°C, 180 – 200 vịng/phút. BC được tạo từ mơi trường lắc cĩ dạng hạt nhỏ, hạt hình sao và các sợi dài, chúng phân tán rất tốt trong mơi trường. Lượng O2 hịa tan trong mơi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng và khả năng tổng hợp BC của vi khuẩn A. xylinum. Do đĩ, quá trình lên men đạt hiệu quả cao, các reactor cĩ sục khí thường xuyên được sử dụng để lên men. Hình 2.7: Hạt BC được hình thành từ nuơi cấy lắc [24] Ứng dụng của BC Với những ưu điểm nổi bật, BC ngày càng được nghiên cứu nhiều và cĩ nhiều ứng dụng rộng rãi. Bảng 2.2: Một số sản phẩm từ màng BC của Acetobacter xylinum [6] [21][15] Lĩnh vực ứng dụng Sản phẩm Thực phẩm Tráng miệng (thạch dừa) Ăn kiêng (kem, salad) Thịt nhân tạo Vỏ bao xúc xích Nước uống siro khơng cĩ cholesterol Trà Kobucha hay manchurian Y dược Lớp màng trị bỏng Tác nhân vận chuyển thuốc Da nhân tạo Chất làm co mạch Mỹ phẩm Mĩng nhân tạo Đánh mĩng dày và mỏng hơn Mơi trường Miếng xốp làm sạch vết dầu tràn Hấp thu chất độc Quần áo, giày dép tự phân hủy Dầu mỏ Thu hồi dầu Trang phục Sản xuất sợi nhân tạo Y phục quân đội Thể thao Lều lắp ráp Sản phẩm rừng Gỗ nhân tạo Giấy, giấy đặc biệt để lưu trữ hồ sơ Thùng hàng cĩ độ bền cao Lĩnh vực khác Làm màng lọc Tả lĩt cĩ thể tái chế Màng rung động âm thanh Mơi trường nuơi cấy mơ thực vật Hình 2.8: Sản phẩm trị bỏng da Biofill thương mại làm từ màng BC[7]. Hình 2.9: Ứng dụng BC làm giá thể nuơi cấy cụm chồi thuốc lá[7]. Hình 2.10: Ứng dụng BC trong vật liệu mới làm tấm xốp [7]. Ứng dụng BC làm giá đỡ nuơi cấy tế bào vi sinh vật BC phù hợp với các yêu cầu cơ bản của giá đỡ trong kĩ thuật nuơi cấy tế bào vi sinh vật. Phù hợp hình dạng thiết bị phản ứng sinh học: hình dạng, kích thước của sản phẩm BC rất đa dạng và cĩ thể chủ động tạo ra hình dạng mong muốn. Đây là ưu điểm của BC so với các giá đỡ khác. BC cĩ tính cơ lý bền và ổn định: độ chịu lực của BC khá cao. Tính chất cơ lý bền và ổn định của BC giúp cho BC chịu được sự tác động của mơi trường như khuấy trộn hoặc các áp lực. BC khơng tan trong mơi trường phản ứng. Giá đỡ BC cĩ độ trương nở tốt: độ trương nở cao giúp cho sự khuếch tán của cơ chất, sản phẩm. Mơi trường trong và ngồi giá đỡ khơng cĩ sự khác biệt giúp cho tế bào vi sinh vật giữ nguyên được các đặc điểm sinh hĩa của tế bào tự do. BC đã qua xử lý khơng gây tác động kìm hãm đến hoạt động sống của vi sinh vật vì sau giai đoạn xủ lý, BC chỉ là giá đỡ trơ về mặt hĩa học và cĩ độ trương nở tốt. Giá thành BC: so với các vật liệu khác thì BC thấp hơn rất nhiều. BC cĩ khả năng tái sử dụng. BC an tồn cho mơi trường sống. Thuận lợi của việc sản xuất BC theo phương pháp lên men là: tốc độ sinh sản nhanh, trang thiết bị đơn giản, giá thành rẻ. Tuy nhiên điểm hạn chế của nĩ là khơng thể nuơi cấy những vi sinh vật tạo ra cellulase vì bản chất của BC là cellulose [12]. Giới thiệu về Saccharomyces cerevisiae Đặc điểm của S. cerevisiae S. cerevisiae là tế bào nhân chuẩn đơn bào, được dùng làm đối tượng mơ hình cho nghiên cứu sinh vật nhân chuẩn. Ứng dụng sớm trong lên men rượu và làm bánh mì. Hiện nay ứng dụng trong cơng nghiệp lên men rượu với quy mơ lớn. Đối tượng sinh vật nhân chuẩn đơn bào dùng để sản xuất protein tái tổ hợp. Cấu tạo và sinh sản của S. cerevisiae Phân loại: Giới: Nấm Ngành: Ascomycota Lớp: Saccharomycetes Bộ: Saccharomycetales Họ: Saccharomycetaceae Giống: Saccharomyces Lồi: Saccharomyces cerevisiae Saccharomyces cerevisiae là sinh vật đơn bào, tế bào giống như ở động và thực vật [9]. S. cerevisiae thường cĩ dạng hình trịn hay bầu dục. Tế bào nấm men thường lớn gấp 10 lần so với vi khuẩn. Kích thước thay đổi trong khoảng (3 – 10)μm x (4,5 – 15)μm. Hình 2.11: Tế bào nấm men S. cerevisiae [40][42] Hình 2.12: Khuẩn lạc S. cerevisiae trên mơi trường Hansen Nhân của tế bào S. cerevisiae cĩ chứa 17 đơi nhiễm sắc thể. Ngồi nhiễm sắc thể, trong nhân tế bào S. serevisiae cịn cĩ thể cĩ plasmid cĩ cấu tạo là 1 phân tử DNA vịng chứa 6300 đơi base và cĩ kích thước 2μm, cĩ khả năng sao chép độc lập, mang thơng tin di truyền, cĩ vai trị quan trọng trong thao tác chuyển gen của kĩ thuật di truyền[3]. Cũng như các cơ thể sống khác, thành phần chủ yếu của tế bào nấm men là nước (chiếm khoảng 75% khối lượng chung). Thành phần sinh khối khơ của nấm men : Chất vơ cơ 5 – 10 Cacbon 25 – 50 Nitơ 4,8 – 12 Protein (N x 6,25) 30 – 75 Lipid 2 – 5 Chất khơ của tế bào nấm men gồm 23 – 28% là chất hữu cơ và 5 – 7% là chất tro. Chất hữu cơ gồm: protein 13 – 14%, glycogen 6 – 8%, cellulose 1,8 – 2%, chất béo 0,5 – 2%. Protein: nấm men cĩ hàm lượng protein trung bình khoảng 50% (tính theo chất khơ) và khoảng 45% chất khơ protein hồn chỉnh. Các dẫn xuất của acid nucleic như base, purin, pyrimidin, các acid amin tự do đều được coi là nguyên liệu. Glycogen: là chất dự trữ nguồn cacbon. Khi trong mơi trường thiếu nguồn cacbon dinh dưỡng, glycogen sẽ được huy động tham gia vào quá trình tiêu hĩa của nấm men và giải phĩng ra nước, CO2. Chất béo: gồm acid oleic, linoelic, palmitic. Trong chất béo cĩ 30 – 40% phosphatide. Tro: gồm các oxide sau: P2O5 khoảng 25 – 60%, CaO 1 – 8%, MgO 4 – 6%, Na2O 0,5 – 2%, SO2 0,5 – 6%, SiO2 1 – 2%, Fe2O3 0,05 – 0,7%. Nấm men S. cerevisiae cĩ nhiều phương thức sinh sản khác nhau: Sinh sản vơ tính: Tế bào nảy chồi đa cực, đơi khi cĩ khuẩn ty giả. Sinh sản hữu tính: Bào tử túi. Túi khá bền và hình thành trực tiếp từ một tế bào lưỡng bội. Mỗi túi cĩ chứa 1-4 (ít khi nhiều hơn). Bào tử túi hình ơ van, trịn nhẵn. Chu kì sống của nấm men S. cerevisiae: cĩ 2 giai đoạn đơn bội và lưỡng bội. Đầu tiên tế bào dinh dưỡng đơn bội (n) sinh sơi nảy nở theo kiểu nảy chồi. Sau đĩ hai tế bào đơn bội tiếp hợp với nhau, cĩ sự trao đổi của tế bào chất và nhân, tạo ra tế bào lưỡng bội (2n). Tế bào lưỡng bội lại nảy chồi thành nhiều tế bào lưỡng bội khác, cuối cùng hình thành hợp tử. Sau quá trình giảm phân nhân của hợp tử thành bốn nhân đơn bội. Mỗi nhân đơn bội được bao bọc tế bào chất, hình thành màng, tạo thành bốn bào tử nằm trong một túi gọi là bào tử túi. Khi túi vỡ, bào tử ra ngồi phát triển thành tế bào dinh dưỡng và lại phân chia theo lối này rồi tiếp tục chu trình sống. Trong vịng đời của nấm men cĩ sự luân phiên sinh sản vơ tính và hữu tính với các giai đoạn đơn bội và lưỡng bội khác nhau[9]. Sự hình thành nang bào tử trong điều kiện thiếu CO2 ở Saccharomyces cerevisiae được kích thích khi nồng độ oxy 12% và nồng độ oxy 41,1% thì giảm cũng khơng đáng kể. Tuy nhiên khi oxy đạt nồng độ 68,8% và 100% thì khả năng hình thành nang bào tử sẽ giảm rất rõ. CO2 kiềm hãm sự hình thành nang bào tử và rất ít nang bào tử được hình thành ở nồng độ CO2 25% hoặc cao hơn. Hơi nước từ dung dịch ethanol 5% ức chế đáng kể sự hình thành bào tử (Adams và Miller - 1954) [26]. S. cerevisiae phát triển ở nhiệt độ tối ưu là 30°C, thời gian nhân đơi khoảng 1,5 – 2 giờ. Nấm men Saccharomyces cerevisiae phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong đất, trong nước, trong khơng khí, trong trái cây, nước ngọt, nước nho ép trước khi lên men thành rượu, rượu táo, rượu vang, rượu sake, bia, quả ơliu, salads, bột mì, bánh mì, kefir, yogurt, phơ mai, kem [23]. Nhu cầu dinh dưỡng Saccharomyces cerevisiae cĩ khả năng phát triển trên các nguồn cacbon khác nhau, glucose được sử dụng phổ biến nhất. Ngồi ra fructose, maltose, saccharose, galactose và các dextrin đơn giản cũng được sử dụng. Nhưng S. cerevisiae khơng cĩ enzyme polyhydrolase trong đĩ cĩ amylase và cellulose vì vậy nấm men khơng sử dụng trực tiếp được tinh bột cũng như cellulose và hemicelulose. Cịn lactose, pentose cũng hồn tồn khơng sử dụng được. Với raffinose chỉ sử dụng được một phần ba. S. cerevisiae cũng cĩ thể tồn tại trên nguồn cacbon khơng lên men như glycerol, ethanol và acetate (3% glycerol, 3% ethanol, 3% acetate). Tùy từng ứng dụng, cĩ thể phối trộn nhiều cacbon vào mơi trường nuơi cấy. Nấm men S. cerevisiae khơng đồng hĩa được nitrate. Nguồn nitơ vơ cơ được sử dụng tốt là các muối ammonium của acid vơ cơ cũng như hữu cơ, đĩ là ammonium sulphate, phosphate, muối acetate, lactate, succinate. Các nguồn nitơ hữu cơ thường là hỗn hợp các acid amin, các peptide, các nucleotide… Trong thực tế thường dùng cao nấm men, cao ngơ, dịch thủy phân protein tự nhiên (đậu tương, khơ lạc…) làm nguồn nitơ hữu cơ. Đối với các nguyên tố vơ cơ thì phospho được quan tâm trước hết. S. cerevisiae sử dụng rất tốt nguồn phospho vơ cơ là orthophosphate, thường dùng muối K2HPO4 và KH2PO4 làm nguồn P và K. Kế đến là nguyên tố lưu huỳnh vì là thành phần của một vài acid amin trong phân tử protein. Trong nuơi cấy nấm men thường cĩ (NH4)2SO4 làm nguồn N và S. Vài ion kim loại như kali, magie, canxi, sắt, kẽm cũng cần cĩ trong mơi trường nuơi cấy S. cerevisiae. Những nhân tố sinh trưởng cơ bản đối với nấm men S. cerevisiae là 6 vitamin nhĩm B: B8, biotin, B3, B1, B6 và PP. Trong cơng nghiệp thường dùng các nguồn vitamin là cao ngơ, cao nấm men, nước chiết cám (cám gạo, cám mì), dịch thủy phân đậu tương bằng enzyme và đặc biệt là rỉ đường (cung cấp biotin). Saccharomyces cerevisiae khác với các lồi nấm men khác nhờ vào đặc tính sinh trưởng và các đặc điểm sinh lý: phần lớn lồi này cĩ khả năng lên men đường. Đặc tính cơ bản nhất của nấm men được phân loại dựa vào khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau[17][35]. Ứng dụng của Saccharomyces cerevisiae Nấm men cĩ nhiều ứng dụng trong sản xuất cơng nghiệp như cơng nghiệp sản xuất cồn, sinh khối (thực phẩm, men bánh mì, bổ sung vào thức ăn chăn nuơi) và các sản phẩm trao đổi chất khác. Trong những năm gần đây, nấm men cịn được sử dụng để sản xuất enzyme, vitamin, polysaccharide, carotenoid, ethanol, CO2, glycerin, acid hữu cơ và các hợp chất được tổng hợp bằng cách tái tổ hợp DNA vào nấm men. Trong các sản phẩm nĩi trên cĩ nhiều sản phẩm được sản xuất ở quy mơ thương mại. S. cerevisiae và các chủng nấm men khác từ hạt ngũ cốc được dùng để sản xuất rượu chưng cất. Ngày nay nấm men dùng trong sản xuất ethanol được cải tiến bằng cách biến đổi gen và hợp nhất với tế bào trần để tăng năng suất cho quá trình sản xuất. Trước đây, việc sản xuất ethanol chủ yếu bằng phương pháp tổng hợp hĩa học từ dầu. Nhưng hiện nay, phần lớn lượng ethanol được sản xuất bằng nấm men (cao hơn 87% so với phương pháp hĩa học). Enzyme invertase của nấm men S. cerevisiae được sử dụng rộng rãi trong cơng nghiệp sản xuất bánh kẹo và mứt. S. cerevisiae được dùng làm tế bào chủ để sản xuất DNA tái tổ hợp. Một số sản phẩm được tiết ra bởi nấm men S. cerevisiae chứa gen tái tổ hợp: α-amylase của lúa mì, nhân tố phát triển biểu bì ở người, nhân tố giải phĩng hormone tăng trưởng ở người, albumin huyết thanh người, nhân tố tăng trưởng insulin của người, prochymosin, insulin và somatostation. Interferon-γ của người được tạo ra 5 – 10% tổng lượng protein của tế bào hemoglobin người, kế tiếp là hemendogenous chiếm 2 – 3% tổng số protein. Superoxide dismutase của người được tạo ra trong pha ổn định của tế bào[12][1]. Giới thiệu về Rhodotorula Đặc điểm của tế bào Rhodotorula Phân loại Giới: Nấm Ngành: Basidiomycota Lớp: Urediniomycetes Bộ: Sporidiales Họ: Sporidiobolaceae Giống: Rhodotorula Theo Kurtzman và Fell (2000) giống men Rhodotorula gồm 45 lồi, theo mơ tả các tác giả cho rằng lồi Rh. mucilaginosa trước đĩ cĩ tên gọi là Rh. rubra, lồi này sinh enzyme urease, khơng đồng hĩa nitrate, khơng phát triển trên cycloheximide hoặc ở nhiệt độ 40°C và lồi Rh. rubra thực ra chỉ là một dạng riêng của lồi Rh. glutinis, tên gọi Rh. rubra ở một số tài liệu hiện nay khơng cịn nữa và đã được thay bằng tên mới là Rh. mucilaginosa. Cho đến ngày nay, người ta đã phân lập được 34 lồi, trong đĩ cĩ 2 lồi Rhodotorula glutinis và Rhodotorula gracilis đang được quan tâm nhiều nhất. Cấu tạo và sinh sản của Rhodotorula Tế bào nấm men Rhodotorula ở dạng đơn bào, hình trịn, oval, elip đến dạng thon dài hoặc gậy. Kích thước tế bào (2,5 – 5)x(5 – 10)μm. Khuẩn lạc Rhodotorula cĩ bề mặt trơn nhẵn, bong, đơi khi gồ ghề, mịn. Mép khuẩn lạc khơng cĩ răng cưa. Khuẩn lạc cĩ màu từ kem, hồng cĩ khi màu vàng hoặc đỏ cam. Kích thước khuẩn lạc tùy mơi trường, cĩ thể đạt từ 1 – 10mm. Quan sát dưới kính hiển vi khơng hình thành sợi nấm, một số cĩ sinh sợi nấm giả nhưng rất kém phát triển, khơng hình thành bào tử đốt. Hình 2.13: Khuẩn lạc Rhodotorula trên mơi trường Hansen Rhodotorula thuộc nhĩm nấm men khơng sinh bào tử, thuộc nhĩm vi sinh vật ưa ấm, khoảng nhiệt độ dao động từ 20 - 40°C. Giống như các lồi nấm men khác, tế bào Rhodotorula cũng được cấu tạo chủ yếu từ các thành phần cơ bản như: thành tế bào, màng tế bào chất, tế bào chất, nhân và các bào quan khác. Vài acid amin tham gia vào thành phần cấu tạo của tế bào nấm men Rhodotorula: arginine, histidine, isoleucine, leucine, tryptophan, phenylalanine, methionine… Nấm men Rhodotorula sinh sản bằng cách nảy chồi đa cực, trừ một số lồi như: Rh. pilimanae, Rh. pilatii, Rh .javaniti, Rh. ingniosa, Rh. difuens và Rh.bogoriensis là nảy chồi cĩ cực. Ngồi ra, Rhodotorula cịn sinh sản theo kiểu phân đơi. Tốc độ sinh sản nhanh, thời gian để số tế bào tăng gấp đơi là từ 2 - 6 giờ. Đầu tiên hạch dài ra và bắt đầu thắt lại ở giữa. Tế bào mẹ bắt đầu phát triển một chồi con. Một phần hạch chuyển động vào chồi, một phần ở tế bào mẹ. Đồng thời một phần tế bào chất cũng sang chồi con. Chồi con lớn dần, khi chồi con bằng chồi mẹ nĩ được tách ra sống riêng lẻ. Một tế bào mẹ tạo một lần được một hoặc nhiều chồi con. Các chồi con sắp xếp trên tế bào khơng nhất thiết cùng một vị trí. Thời gian sinh trưởng tốt nhất của Rhodotorula trong khoảng 24 - 48 giờ nếu mơi trường cung cấp đủ các chất cần thiết. Nấm men Rhodotorula phân bố rất rộng rãi trong tự nhiên: trong trái cây, nước nho ép trước khi lên men thành rượu, rượu vang, bia, bột mì, thịt bị, thịt gia cầm, cá, hải sản, động vật cĩ vỏ, xúc xích, thịt giăm bơng [23]. Đặc điểm sinh hĩa Nấm men Rhodotorula cĩ một số đặc tính sinh hĩa sau: Khơng lên men được các loại đường: glucose, galactose, sucrose, maltose, lactose, raffinose nhưng chúng lại sử dụng được các loại đường này (trừ lactose) để cung cấp nguồn cacbon cho việc xây dựng tế bào. Sử dụng được ethanol như là nguồn cacbon và khơng đồng hĩa KNO3. Tạo enzyme urease. Đồng hĩa DBB (Diazonium Blue B). Cĩ khả năng tổng hợp sắc tố carotenoid. Khơng đồng hĩa được inositol, đây là nét đặc trưng cơ bản nhất của Rhodotorula khác với giống nấm men Candida, Cryptococcus. Khơng tạo thành hợp chất loại tinh bột[5]. Sắc tố của nấm men Rhodotorula Nhiều sắc tố đã được phân lập từ nấm men, đặc biệt là từ Rhodotorula và cĩ nhiều phương pháp hiện đại đã chứng minh sự hiện diện của sắc tố với lượng tương đối cao trong vài lồi nấm men. Nakayama, Mackinney và Phaff (1954) đã tìm thấy “nấm men vàng” của Rhodotorula và Cryptococcus cĩ chứa β-carotene như là sắc tố chính. Sắc tố chủ yếu cĩ trong Rhodotorula là torularhodin, torulene, β-carotene và γ-carotene. Hình 2.14: Các sắc tố của nấm men Rhodotorula [20] Carotene là một trong hai nhĩm của carotenoid. Nhĩm 1- carotene: những hợp chất hydrocacbon carotenoid, nhĩm 2- xanthophyll: những dẫn xuất của carotene với nhĩm chức chứa oxy. β-carotene là một trong những chất thuộc nhĩm carotene, là màu tím đỏ trong bảng màu tự nhiên và được biết như là tiền vitamin A. β-carotene xuất hiện trong tự nhiên trong cà rốt, khoai lang, bơ, lịng đỏ trứng gà, dầu cá … β-carotene được sản xuất bởi Rh. flava, Rh. gracilis, Rh. pallid đã được nghiên cứu bởi Deufel và Clark (1958). Hĩa tính và hĩa sinh chung của các caroteniod được nhiều tác giả đề cập (Goodwin, 1965; Davies, 1965; Porter và Anderson, 1967). Carotenoid của vi khuẩn (Jensen, 1965), của nấm (Goodwin, 1952; Valadon, 1966). Nhiệt độ nĩng chảy cao khoảng 130-220°C. Độ hịa tan thay đổi tùy loại dung mơi. Tinh thể carotenoid khơng tan trong nước, tan tốt trong dung mơi như cloroform, dichlorothane. Hầu như tất cả carotenoid đều tan trong chất béo và các dung mơi khơng phân cực. Dễ bị oxy hĩa bởi khơng khí và nhiệt độ, ion kim loại. Sản lượng β-carotene đạt từ 5,2 – 120,8 μg/g tế bào khơ khi nuơi cấy trên mơi trường bán tổng hợp. Những nhà nghiên cứu đã tìm thấy sắc tố carotenoid của loại sắc tố đỏ và vàng được tách chiết trực tiếp từ tế bào Rhodotorula với acetone lạnh bằng mơi trường tổng hợp Wickerham trong 72 giờ trên máy lắc. Sắc tố được chuyển từ acetone sang ether dầu hỏa và được mơ tả bởi phương pháp sắc kí và quang phổ. Sắc tố sẽ thay đổi hoặc bị phá hủy bởi việc xử lý sơ bộ tế bào nấm men bằng HCl và nhiệt[14][26][33]. Ứng dụng của Rhodotorula trong sản xuất chất béo Mặc dù chất béo được sản xuất bởi nhiều lồi vi sinh vật trong những điều kiện nuơi cấy đặc biệt . Tuy nhiên trong tự._.