Nghiên cứu khả năng sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức năng cho cây khoai tây

cây chịu nhiều tác động của điều kiện khí hậu, chế độ canh tác và nhiều hơn cả là yếu tố phân bón. Phân bón đóng vai trò quan trọng trong việc tăng năng suất cây trồng và tăng độ phì nhiêu của đất, nhờ có phân bón mà diện tích trồng trọt hẹp cũng cho sản lượng nông sản cao. Các nhà khoa học đánh giá, phân bón đã đóng góp 32% - 40% trong các yếu tố làm tăng năng suất cây trồng.[2] Nhưng việc lạm dụng phân bón hoá học đã và đang làm môi trường bị ô nhiễm, giảm khả năng chống chịu của cây trồng dẫn đến bùng nổ dịch bệnh làm suy giảm chất lượng nông sản. Sự ra đời của phân bón vi sinh vật năm 1989 ( Mỹ ) đã là một bước tiến lớn trong sản xuất nông nghiệp. Phân bón vi sinh vật là sản phẩm sinh học có tác dụng nâng cao năng suất và chất lượng nông sản, tiết kiệm phân bón vô cơ, giảm chi phí sản xuất, góp phần quan trọng trong việc bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững. Đồng thời phân vi sinh cũng làm tăng mật độ vi sinh vật hữu ích có trong đất làm cho đất tơi xốp dễ canh tác, cây trồng dễ hấp thu chất dinh dưỡng. Các sản phẩm phân bón vi sinh vật đơn chủng trước đây đã nghiên cứu và sử dụng mang lại hiệu quả như Nitragin, Rhiroda, Phosphobacterin, Azotobacterin, Azogin... Một số nghiên cứu gần đây cho thấy chế phẩm phân bón hỗn hợp có tác dụng đối với cây trồng tốt hơn so với từng loại vi sinh vật riêng rẽ như E2001. Các sản phẩm phân bón thế hệ mới chứa đựng cả một tập hợp các vi sinh vật như cố định nitơ tự do, kích thích sinh trưởng, phân giải phosphate khó tan, kiểm soát vi sinh vật gây bệnh... Hiệu quả sử dụng của các chế phẩm hỗn hợp này đối với từng loại cây trồng và từng tổ hợp vi sinh vật không giống nhau, do sự phong phú đa dạng của hệ vi sinh vật đất và tác động qua lại của các vi sinh vật với nhau, cũng như đối với cây trồng và điều kiện môi trường. Vì vậy nghiên cứu sản xuất các chế phẩm vi sinh vật hỗn hợp cho từng đối tượng cây trồng theo từng vùng sinh thái đang là hết sức cần thiết. Nhằm mục đích tìm kiếm giải pháp nâng cao chất lượng và hiệu quả sử dụng chế phẩm vi sinh vật cho cây khoai tây chúng tôi tiến hành đề tài : "Nghiên cứu khả năng sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức năng cho cây khoai tây " *Mục tiêu của đề tài : Xác định khả năng hỗn hợp các loại vi sinh vật (cố định nitơ, kích thích sinh trưởng, phân giải phốtphat khó tan, đối kháng vi khuẩn héo xanh) sử dụng cho cây khoai tây. *Nội dung nghiên cứu : 1.Đánh giá khả năng hỗn hợp của các vi sinh vật cố định nitơ, kích thích sinh trưởng, phân giải phốtphat khó tan, đối kháng vi khuẩn héo xanh. 2.Xác định khả năng sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức năng cho cây khoai tây. Phần II Tổng quan tài liệu I. Giới thiệu chung về cây khoai tây 1. Nguồn gốc: Vào thế kỷ thứ 16, những nhà thám hiểm đầu tiên người Tây Ban Nha đã phát hiện ra cây khoai tây khi họ đặt chân đến thung lũng Magdalenna (Nam Mỹ). Lúc đó người ta gọi cây khoai tây là Truffer vì hoa của nó có màu sặc sỡ. Và cùng với bước chân đi chinh phục các miền đất mới của những người Tây Ban Nha, cây khoai tây đã có mặt khắp nơi trên thế giới.[1] Đến nay, cây khoai tây đã có mặt ở trên 130 nước trên thế giới và đã trở thành một loài cây lương thực quan trọng đứng thứ 2 sau họ ngũ cốc.[3] Thậm chí ở một số vùng đất, chỉ có cây khoai tây là lương thực chủ yếu. Cây khoai tây thuộc họ cà (solanacea) có dạng thân thảo hay thân ngầm, thân có khả năng phân nhánh ( ít hơn cà chua ), có cấu tạo zic zăc và mọc thẳng, trên thân có lớp lông tơ. Cây khoai tây có lá đơn mọc cách, rễ thuộc loại rễ chùm, củ có màu trắng, vàng, tím, hồng tía..tuỳ theo các giống khác nhau.[3] 2. Giá trị của cây khoai tây: Cây khoai tây là cây trồng có giá trị dinh dưỡng cao. Trong khoai tây có chứa hàm lượng protein cao, các axit amin, các chất khoáng và các vitamin. Một củ khoai tây cỡ trung bình đã cung cấp cho con người 1/2 lượng VitaminC cần cho cơ thể trong 1 ngày mà lúa mì, gạo không thể đem lại được. Trong khoai tây hàm lượng chất béo cũng rất thấp chỉ bằng 5% hàm lượng chất béo có trong lúa mì và bằng 1/4 calo của bánh mì. Theo báo cáo của FAOSTAT (tháng 6 năm 1998) trên thế giới có 2 vùng có mức tiêu thụ khoai tây đứng đầu trên thế giới ( tính theo số kg/ đầu người / năm) đó là châu Âu: 86kg/1người/1năm và Vùng Bắc Mỹ: 63kg/ 1người /năm. Và mức tiêu thụ này vẫn không ngừng tăng trong tương lai. ở châu á, mức tiêu thụ khoai tây năm 1991-1992 là 12kg/1người thì đến năm 1994 - 1996 mức tiêu thụ này là 14kg/1người, tăng 16%. Theo báo cáo của FAO (FAOSTAT), mức tiêu thụ khoai tây ở Châu Phi tính theo đầu người khoảng 8kg/1người . Tuy nhiên dân số của khu vực này tăng rất nhanh so với các khu vực khác. Chính điều này đã làm cho tổng mức tiêu thụ khoai tây hàng năm ở Châu Phi không ngừng tăng và khu vực này đã trở thành một thị trường đầy tiềm năng của khoai tây. Châu Mỹ La Tinh cũng đang dần dần trở thành một thị trường tiêu thụ khoai tây lớn. Trong vài năm gần đây mức tiêu thụ tính theo đầu người tăng tăng 15%, từ 21kg/năm lên đến 24kg/năm. Đặc biệt là một số nước như Colombia năm 1991-1992 mới ở mức 47kg/1người thì đến năm 1994-1996 đã là 56kg/1người; Peru tăng từ 42kg/1người ( năm 1991-1992) đến 63kg/1người ( năm 1994-1996 ). [báo cáo của CIP năm 2001] Từ những số liệu thực tế trên cho thấy, cây khoai tây ngày càng có được thị trường rộng lớn trên thế giới. Đặc biệt là các thị trường tiềm năng như châu á, châu Phi và châu Mỹ La Tinh, khả năng tiêu thụ khoai tây đang ngày càng tăng, và theo đánh giá của FAO thì trong tương lai, mức tiêu thụ khoai tây ở những khu vực này sẽ vượt một số khu vực hiện nay đang dẫn đầu về khả năng tiêu thụ khoai tây. 3. Tình hình sản xuất cây khoai tây trên thế giới và Việt nam: 3.1. Tình hình sản xuất cây khoai tây trên thế giới Sản xuất khoai tây trên thế giới đã đạt được nhiều bước tiến quan trọng vào đầu những năm 1990. Đến giữa thập kỷ 90 nhu cầu thị trường tăng 100 nghìn tấn tăng hơn 30 nghìn tấn so với những năm 1960. Đây chính là con số đã thúc đẩy tình hình sản xuất khoai tây tiến lên một bước mới. Vào những năm 1980 tốc độ tăng trưởng về năng suất đạt khoảng 4,5% năm, và diện tích trồng khoai tây cũng tăng khoảng 2,5%. Nhưng trong những năm gần đây, do tốc độ tăng cầu cực nhanh, đã thúc đẩy tổng sản lượng khoai tây trên thế giới đạt gần 300 triệu tấn ( FAOSTAT, 09-1998 ). Và tổng số diện tích trồng khoai tây cũng không ngừng tăng. Theo con số thông kê gần đây nhất của FAO (tháng 8 năm 2002), trên thế giới hiện nay có khoảng 130 nước trồng khoai tây với tổng diện tích gieo trồng hơn 18 triệu ha. Các nước trồng khoai tây vẫn không ngừng tăng lên theo nhu cầu sử dụng khoai tây. Trong những năn gần đây, Trung Quốc đã dần trở thành quốc gia đứng đầu về sản lượng với 48.000 tấn khoai tây ( FAO, 1995-1997 ). Sau Trung Quốc là các quốc gia khác như Nga, Balan, Mỹ, ấn Độ, Ucraina...Tuy nhiên cùng với sự thu hẹp diện tích sản xuất khoai tây ở châu Âu (dù lục địa này là một trong những nơi sản xuất khoai tây lâu đời nhất trên thế giới) thì trên thế giới lại xuất hiện những trung tâm sản xuất khoai tây lớn khác như Châu á, châu Phi, châu Mỹ La Tinh. Đặc biệt tại vùng Đông nam châu á xuất hiện một số nước có sản lượng lớn như: Indonexia, Malaixia,Việt Nam. Tuy nhiên chất lượng nông sản nói chung và khoai tây nói riêng trên toàn cầu là không đồng đều, đa số chất lượng còn chưa cao, do khoa học kỹ thuật ít được áp dụng và áp dụng chưa đạt hiệu quả cao trong nông nghiêp. Vì vậy dù nhu cầu khoai tây trên thế giới là khá cao và không ngừng tăng, nhưng con số các nước (trong hơn 130 nước sản xuất khoai tây) có thể xuất khẩu khoai tây là rất nhỏ. Hầu hết các nước sản xuất khoai tây mới chỉ phục vụ thị trường trong nước của chính mình. Trong khi đó các thị trường lớn như Châu Âu lại không ngừng tăng nhu cầu, do truyền thống sử dụng khoai tây lâu đời, cũng như diện tích sản xuất của vùng này càng thu nhỏ do chuyển hướng sản xuất sang những mặt hàng có giá trị kinh tế hơn. 3.2. Tình hình sản xuất khoai tây ở Việt Nam. Khoai tây được nhập nội từ Châu Âu do người Pháp đưa vào năm 1890. Cây khoai tây thích hợp với khí hậu ôn đới, nhiệt đới và cận nhiệt đới nên được chọn là cây trồng chính trong vụ đông - xuân ở đồng bằng Bắc Bộ. Đầu những năm 60, diện tích trồng khoai tây ở nước ta là 3000 ha, đến năm 1970 thì tăng lên là 8000 ha. Năm 1979 được coi là năm đỉnh cao trong lịch sử trồng khoai tây ở nước ta với tổng diện tích 103.000 ha, năng suất củ trung bình đạt 12,5 tấn. Nhưng sau đó diện tích trồng khoai tây giảm dần, hiện nay còn khoảng 30.000 - 40.000 ha với năng suất củ bình quân 10,5 tấn/ha.[1] Một trong những nguyên nhân hạn chế sự phát triển sản xuất và giảm năng suất khoai tây ở nước ta là do vi sinh vật gây hại, đặc biệt là bệnh héo xanh khoai tây do vi khuẩn. Để cung cấp đủ khoai tây giống cho người sản xuất, ngoài một lượng lớn nhập khẩu, ta đang tiến hành nhân giống ở trên các vùng núi cao vào muà hè. Chương trình được thực hiện ở một số địa phương như Sapa, Yên bái, Lào cai...với diện tích khoảng 7 - 8 ha một khu vực.[4] II.Tình hình sản xuất, sử dụng phân bón vi sinh vật trên Thế giới và Việt Nam “Phân bón vi sinh vật (VSV) là những chế phẩm hay sản phẩm trong đó có chứa các VSV sống (có lợi cho môi trường, cây trồng), đã được tuyển chọn từ tự nhiên, có chất lượng, mật độ phù hợp với các tiêu chuẩn đã ban hành”.[5] 1. Tình hình sản xuất, sử dụng phân bón vi sinh vật trên Thế giới Vào năm 1898, tại Mỹ sản phẩm phân bón vi sinh đầu tiên trên thế giới đã ra đời. Công ty phân bón Nitragin đã cho ra đời một sản phẩm có tên Nitragin có chứa chủng vi khuẩn nốt sần Rhizobium, có khả năng cung cấp đạm cho đất như các chất phân bón hoá học khác, mà không ảnh hưởng đến môi trường. Từ đó đến nay, phân bón vi sinh đã trở nên quen thuộc với người nông dân trên toàn thế giới. Và nó đã trở thành hàng hoá và được sử dụng ở nhiều quốc gia trên thế giới. Hàng năm, doanh số thu được từ phân bón vi sinh vật là rất lớn. Ví dụ như tại Mỹ, doanh thu hàng năm, chỉ với phân bón có chứa vi khuẩn nốt sần đã là 19 triệu USD. Với doanh thu cũng như các tính chất, hiệu quả ưu việt của phân bón vi sinh, trên thế giới đã xuất hiện rất nhiều các tập đoàn và các công ty lớn chuyên sản xuất và buôn bán phân vi sinh như: Helibioagri (Italia); Lipha (Pháp); Agricultural Genetic (Anh) ... Ngoài các loại phân có chứa vi khuẩn nốt sần Rhizobium, ngày nay trên thế giới có rất nhiều loại phân vi sinh khác nhau. Như các loại phân có khả năng cố định Nitơ từ Azotobacter, Clostridium, tảo lam cố định Nitơ từ Azospirillum; Phân giải phosphat khó tan từ Bacillus, Pseudomonas... tăng sức đề kháng của cây trồng v.v.. 2. Tình hình sản xuất, sử dụng phân bón vi sinh vật ở Việt Nam: Trước những lợi ích của phân vi sinh đã đem lại, vào đầu những năm 80 nhà nước ta đã cho phép tiến hành hàng loạt các đề tài nghiên cứu thuộc nhiều chương trình khoa học khác nhau như: chương trình công nghệ sinh học phục vụ nông nghiệp 1986-1990; chương trình công nghệ sinh học 1991-1995, 1996-1998... Và các công trình nghiên cứu này đã đem lại không ít hiệu quả trong việc cải tiến, nâng cao nền nông nghiệp nước ta trong những năm gần đây. Sau nhiều năm hợp tác và nghiên cứu, các viện khoa học, các trường đại học đã thành công trong việc xây dựng một số qui trình sản xuất phân vi sinh như : qui trình sản xuất phân vi sinh vật cố định Nitơ, phân vi sinh vật cố định phân giải lân... Sau đây là một số qui trình và các loại phân bón đã được công nhận và đăng kí trong danh mục các loại phân bón được sử dụng: -Phân VSV cố định Nitơ cho cây họ đậu Quyết định số 219-1998/QĐ-BNN-KHCN / 30-12-1998 - Phân VSV cố định Nitơ cho lúa. Quyết định số 219-1998/QĐ-BNN-KHCN / 30-12-1998 -Phân lân hữu cơ vi sinh Komix Quyết định số 123-1998/QĐ-BNN-KHCN / 25-08-1998 -Phân bón sinh tổng hợp Biomix Quyết định số 2084/QĐ-BNN-KHCN / 20-07-1998 -Phân hữu cơ sinh học Humix Quyết định số 1283/QĐ-BNN-KHCN / 14-04-1999...[6] Tại Viện KHKT nông nghiệp Việt Nam, sau nhiều năm đi đầu trong việc thu thập, phân lập, tuyển chọn đã xây dựng và lưu giữ được một quỹ gen vi sinh vật phong phú và đa dạng. Đây là bộ sưu tập của hơn 30 họ vi khuẩn, nấm, xạ khuẩn, nấm men, với số lượng hơn 500 chủng. [7] Hàng năm, quỹ gen được bổ sung thêm từ 30-50 các chủng giống vi sinh khác nhau thông qua các hoạt động hợp tác với các viện nghiên cứu khác trong nước cũng như nước ngoài. Sau nhiều năm nghiên cứu và thử nghiệm trên đồng ruộng Việt Nam, phân bón vi sinh vật đã đạt những hiệu quả nhất định. Phân bón vi khuẩn nốt sần đã cho thấy tác dụng nâng cao hiệu quả đối với cây lạc ở hầu hết các tỉnh. ở miền Bắc và miền Trung năng suất lạc tăng 13,8-17,5% và 22% ở các tỉnh miền Nam.[8] Lợi nhuận do vi khuẩn nốt sần được Võ Minh Kha và cộng sự (1995) xác định đạt khoảng 442.000 VNĐ / ha với tỷ lệ lãi suất trên 1 đồng chi phí đạt 9,8 lần. Tác dụng tương tự cũng được ghi nhận đối với phân vi sinh vật cố định Nitơ hội sinh, cố định Nitơ tự do và rất nhiều loại phân bón vi sinh khác. Tuy vậy, phân bón vi sinh vẫn chưa phải là sự lựa chọn số một trên hầu hết đồng ruộng Việt Nam. Đây không phải do phân VSV không tự khẳng định được ưu thế trên đồng ruộng. Mà do phần lớn nông dân nước ta vẫn còn hiểu biết rất ít về phân bón vi sinh. Họ không sử dụng, chưa sử dụng hoặc đã sử dụng nhưng hiệu quả còn chưa cao do không được hướng dẫn sử dụng. Mặt khác, năng lực sản xuất phân bón vi sinh của chúng ta vẫn chưa đáp ứng được nhu cầu sử dụng trên thực tế. Chính điều này đã góp một phần không nhỏ vào việc bà con nông dân chưa được tiếp cận với sản phẩm này. Tuy nhiên, hiện nay tại những vùng đất đã sử dụng phân bón vi sinh, thì phân bón vi sinh đã tỏ rõ ưu việt của mình. Và đã được bà con nông dân các vùng đó tin dùng sử dụng trên đồng ruộng của mình. III. Một số vi sinh vật vùng rễ cây trồng. 1. VSV cố định Nitơ. Nitơ có sẵn trong tự nhiên và tồn tại chủ yếu dưới dạng khí, nên người và động thực vật không thể sử dụng khí Nitơ làm nguồn dinh dưỡng cho mình được. Vì vậy sử dụng đạm luôn là vấn đề thời sự cho nhu cầu của con người và nông nghiệp. Trong cây đạm tồn tại dưới dạng các axit amin, polypeptit, protein, proteit. Chúng là các thành phần quyết định sự sinh trưởng và phát triển của cây trồng. Tỷ lệ đạm tích luỹ trong cây trung bình 1-3% trọng lượng khô của cây. Mặc dù tỷ lệ đạm trong cây không nhiều nhưng có vai trò rất quan trọng. Nếu thiếu đạm cây thường mọc cằn cỗi, lá màu xanh nhạt hoặc vàng, ra hoa sớm thưa thớt, quả ít chất lượng kém. Nhưng nếu bón quá nhiều đạm cây kéo dài sinh trưởng, cây ra lá xanh um tùm, ra hoa chậm, dễ rụng, rễ kém phát triển, cây yếu dễ bị sâu bệnh. Hàng năm cây trồng đã lấy đi từ đất hàng trăm tấn đạm, nhưng con người mới chỉ trả lại được một phần cho đất. Trong tự nhiên có một số loại VSV có thể sử dụng khí Nitơ làm nguồn dinh dưỡng và tạo nên các hợp chất Nitơ mà cây trồng có thể hấp thụ được. Chúng có khả năng đồng hoá nitơ tạo nên các hợp chất nitơ mà cây trồng có thể hấp thu được. Quá trình cố định đạm sinh học của các chủng VSV này đã góp phần to lớn cho sự cân bằng đạm trong tự nhiên, bù đắp phần thiếu hụt mà con người không thể trả lại cho đất. Hiệu quả của quá trình cố định nitơ sinh học đạt 10kg - 60kgNitơ/ha/năm.Các nhóm vi sinh vật đáng chú ý là VSV cố định nitơ sống cộng sinh với cây họ đậu, sống tự do trong đất và hội sinh với cây trồng. VSV cố định Nitơ tự do gồm các loài sống trong đất, nước có thể cố định nitơ hầu như không phụ thuộc vào cây chủ. Năm 1901 W.Beijerinsk phân lập được hai chủng vi khuẩn hiếu khí có khả năng cố định nitơ tự do là Azotobacter chrococcum và Azotobacter agilis. Đến nay các nhà khoa học đã phát hiện được nhiều loài vi khuẩn có khả năng cố định nitơ tự do như : Azotobacter, Azomonas (vi khuẩn hiếu khí); Bacillus polymixa, Klebsiella (vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc); Clostridium, Desulphovibrio (vi khuẩn kỵ khí bắt buộc)...Việc nghiên cứu sử dụng các loại vi khuẩn này dưới dạng phân vi sinh vật cố định nitơ đã được nhiều nước trên thế giới quan tâm. Hiện nay, hơn 100 triệu ha đã được bón phân vi sinh vật cố định nitơ. Và chúng có ý nghĩa rất quan trọng trong sản xuất nông nghiệp. Sử dụng chế phẩm phân bón vi sinh vật cố định nitơ- Nitragin cho lúa và cây trồng cạn cho thấy : giảm bớt được 1 kg đạm urê cho mỗi sào lúa bón phân vi sinh, năng suất vẫn tăng so với đối chứng15-20%, làm tăng sản lượng thu hoạch khoai tây 20 - 30%.[9] Hiệu quả sử dụng Azogin ở Thái Bình tăng 300-500 kg thóc/ha, thay thế 1-1,5 kg urê/sào.[10] 2. Vi sinh vật phân giải phốtphat khó tan Phốpho (lân) là yếu tố quan trọng thứ hai trong ba nguyên tố đa lượng chính của cây trồng ( NPK ). Là thành phần của axit Nucleic, phốtphorit, phytin, phốpho có tác động trực tiếp đến quá trình tích luỹ đường, protein, vitamin... của cây trồng. Đặc biệt phốtpho là thành phần không thể thiếu của ATP, ADP kiểm soát, điều khiển quá trình trao đổi năng lượng của cây. Trong cây lân thường chiếm 0,3-0,4% trọng lượng khô và tích luỹ nhiều trong hạt. Trong tro của hạt đậu, hạt lạc có đến 50% P2O5. Phốtpho có tác dụng thúc đẩy quá trình phát triển và tăng khả năng chống chịu của cây trồng. Thiếu phốtpho cây phát triển kém, ít phân cành đẻ nhánh, phiến lá nhỏ màu xanh xám hay đỏ tía, rễ kém phát triển, ảnh hưởng đến sự hình thành quả. Thiếu phospho năng suất cây trồng bị giảm sút nghiêm trọng ngay cả khi được cung cấp đủ nitơ. Vi sinh vật phân giải các hợp chất phospho khó tan là các vi sinh vật có khả năng chuyển hóa hợp chất phốtphat khó tan thành dạng dễ tiêu cho cây trồng sử dụng. Điển hình là một số loài Bacillus, Pseudomonas, Micrococus, Flavobacterium... với sản phẩm phân bón vi sinh vật phân giải hợp chất phốtphat khó tan Phosphobacterin. Các vi sinh vật này không chỉ phân giải phốtphat canxi mà cả phốtphat nhôm, sắt, kể cả quặng. Vi khuẩn Bacillus có khả năng phân giải 12-20% nguồn phốtphat từ quặng ( Gaur et.al 1973 ). Và nhờ vi sinh vật phân giải các hợp chất phốtpho khó tan mà cây trồng có thể dễ hấp thụ, chúng không chỉ khoáng hoá phốtpho hữu cơ mà còn chuyển hoá phốtphat khó tan thành dễ tiêu giúp cho cây trồng. Khi bổ sung vi sinh vật phân giải hợp chất phốtphat khó tan vào đất đã làm tăng năng suất cây trồng, nâng cao khả năng sử dụng phospho và kích thích sinh trưởng cây trồng [17] , làm tăng chất lượng nông sản. Những kết quả nghiên cứu gần đây ở Ân Độ, Canada cho thấy hiệu quả của vi sinh vật phân giải hợp chất phốtphat khó tan có thể thay thế 50-70% lượng lân cần bón cho cây. Ngoài tác dụng phân giải phốtphat khó tan các vi sinh vật này còn có khả năng sản sinh các chất kích thích sinh trưởng thực vật như IAA, gebberelin [16] hay chất kháng sinh giúp cây phát triển tốt hơn, tăng khả năng chống chịu điều kiện ngoại cảnh bất lợi cho cây trồng.[2] 3. Vi sinh vật kích thích sinh trưởng thực vật. Các phytohormon như Indol -3 axetic axit (IAA), xitokinin, gibberellin có tác dụng điều hoà sinh trưởng do bản thân thực vật sinh ra trong quá trình sống. IAA có tác dụng lên sự phát triển của rễ cây, xitokinin và gibberellin ảnh hưởng nhiều đến thân, lá, hoa quả. Các phytohormon này đã được nghiên cứu và sản xuất bằng phương pháp nhân tạo nhưng chưa được sử dụng rộng rãi do giá thành cao. Nhiều loại vi sinh vật sống ở trong đất, nhất là vi sinh vật vùng rễ có khả năng sinh tổng hợp phytohormon. Vì vậy ngoài các hoạt tính cố định nitơ, phân giải hợp chất phốtphat khó tan...thì tác dụng của phytohormon đối với cây trồng đang là vấn đề được các nhà khoa học quan tâm. Lượng phytohormon mà vi sinh vật sinh ra không lớn nhưng do mật độ của vi sinh vật cao lại tạo ra liên tục nên có tác dụng lớn đến sự phát triển cũng như năng suất của cây trồng. Một số vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp chất kích thích sinh trưởng thực vật như Azotobacter, Agrobacterium, Azospirillum, Bacillus, Gibberella...Trong ba phytohormon thì IAA được nhiều vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp hơn cả. Trước đây ở Liên xô cũ người ta ủ hạt với Azotobacter trước khi gieo thấy hạt nảy mầm khoẻ hơn, năng suất cao hơn. Đến năm 1961, họ mới xác định được Azotobacter chrococcum đã tạo ra GA3 với lượng 20 mg/ml trong dịch ủ hạt giống. Azospirillum là vi sinh vật sống trong vùng rễ cây hoà thảo (lúa, lúa mì, ngô, kê ... ) có hoạt tính cố định nitơ và sinh tổng hợp phytohormon mạnh. Okon (1985) đã xác định trong dịch nuôi cấy có 1,9-24,4 mm/ml IAA ; 0,05 mg/ml GA3 ; 0,001 mg/ml xitokinin.[2] Việc sinh tổng hợp phytohormon của vi sinh vật làm cho cây phát triển mạnh hơn, khả năng chống chịu các điều kiện bất lợi của cây cao hơn, dẫn đến tăng năng suất và chất lượng nông sản. Việc sản xuất chế phẩm phân bón vi sinh vật chỉ với mục đích điều hoà sinh trưởng thường ít được quan tâm. Hiện nay trên thế giới cũng như ở Việt Nam rất quan tâm đến nghiên cứu và sử dụng chế phẩm hỗn hợp vi sinh vật. Các chế phẩm phân bón vi sinh vật này có thể gồm các chủng có khả năng sinh tổng hợp phytohormon cao, chủng có hoạt tính cố định nitơ, phân giải lân, phân giải xelluza...Các chế phẩm được biết đến như E-2001, B-99, Heaven Green... 4. VSV gây bệnh héo xanh. Năm 1875, Hallier lần đầu tiên phát hiện ra loại vi khuẩn gây thối củ khoai tây. Sau đó E.F Smith đã tiến hành nghiên cứu trên nhiều loại vi khuẩn và trên hầu hết các loại cây trồng và năm 1896, ông đã mô tả bệnh héo xanh do vi khuẩn Pseudomonas solanacearum ở khoai tây, cà chua, cà tím, ớt, cây họ đậu...vi khuẩn gây bệnh héo xanhlà loài đa thực có phổ kí chủ rộng, có thể xâm nhiễm kí sinh trên nhiều loại cây trồng có trên 200 loại thực vật bị bệnh héo xanh do vi khuẩn (Kelman, 1953). E.F Smith coi bệnh héo xanh là bệnh thực vật quan trọng nhất có nguồn gốc từ vi khuẩn trên toàn thế giới. Chúng làm cho thân và lá cây bỗng trở nên héo rũ nhưng vẫn giữ được màu xanh. Sau vài ngày cây bị khô, lá trở thành xanh nâu, thân đen hay nâu sẫm từ gốc và cuối cùng cây chết. ở vùng nhiệt đới do diễn biến bệnh quá nhanh nên những lá rũ xuống thường có màu xanh xám hoặc đen nhạt. Triệu chứng bệnh héo xanh do vi khuẩn Pseudomonas solanacearum Smith gây ra đôi khi khiến ta nhầm lẫn với vi khuẩn Corynabacterium sepedonicum. Tuy nhiên tác hại mà Corynabacterium sepedonicum gây ra không nhiều và rộng như Pseudomonas solanacearum Smith.[11] Bệnh héo xanh vi khuẩn lan truyền rộng khắp các vùng nhiệt đới, cận nhiệt đới và ở cả vùng khí hậu ôn hoà. ở nước ta bệnh héo xanh vi khuẩn đã phát sinh ở hầu hết các địa phương trồng khoai tây, cà chua, lạc, thuốc lá, đậu tương... như ở Hà nội, Hà tây, Bắc giang, Bắc ninh, Thái nguyên, Hải dương...Tại một số nơi bệnh gây thiệt hại nặng tới mức không thể tiếp tục trồng cây vụ màu được nữa. Chính vì vậy, những nghiên cứu nhằm tìm ra các giải pháp để hạn chế sự gây hại của vi khuẩn này là rất cần thiết. Pseudomonas solanacearum Smith là vi khuẩn háo khí, hình que có kích thước tế bào 0,5 x 1,5àm, không hình thành bào tử và nhuộm gram âm. Vi khuẩn này có khả năng tổng hợp poly-b-hydraxitbutyrat như là nguồn cacbon dự trữ. Nó không tạo ra sắc tố phát huỳnh quang nhưng có thể tạo ra một số sắc tố màu nâu khuyếch tán trong môi trường thạch có chứa Tyrosin. Vi khuẩn Pseudomonas solanacearum Smith phát triển ở pH thích hợp là 7,0-7,2 và nhiệt độ thích hợp là 280C -330C, với nhiệt độ tối thiểu là 100C và tối đa là 410C (C.A Kelman, 1954). Phần III Vật liệu và phương pháp nghiên cứu I. Vật liệu nghiên cứu : 1. Giống khoai tây Hai giống khoai tây Việt Đức (VĐ02) và KT03 do Trung tâm cây có củ -Viện KHKTNNVN cung cấp, có năng suất trung bình khoảng 18-25 tấn/ha, cây sinh trưởng khoẻ thời gian sinh trưởng từ 70-90 ngày. 2. Chủng giống vi sinh vật nghiên cứu Các chủng giống vi sinh vật nghiên cứu do quỹ gen bộ môn Vi sinh vật cung cấp. Bảng 1: Danh sách các chủng vi sinh vật sử dụng trong nghiên cứu. STT Chủng VSV Ký hiệu Hoạt tính sinh học 1 Azotobacterium Bejerinskii AT03 Sinh tổng hợp IAA (kích thích sinh trưởng) 2 Azotobacter chrococcum AT19 Sinh tổng hợp IAA (cố định Nitơ) 3 Bacillus polymixa B14 Phân giải Ca3(PO4)2 4 Bacillus sp Bs16(2) Kháng vi khuẩn héo xanh. 3. Chất mang Trong nghiên cứu sử dụng loại than bùn có nguồn gốc từ Ba Vì- Hà Tây. Thành phần lý hoá than bùn được xác định tại bộ môn Hoá đất Viện KHKTNN Việt Nam với một số thành phần như sau : pH: 3,7 Độ ẩm ban đầu(%): 28 Độ xốp (%): 60 Nitơ tổng số (%): 1,82 Phốtpho tổng số (%): 0,241 Kali tổng số (%): 0,732 Khả năng giữ nước (%): 275,31 4. Môi trường nuôi cấy Trong khoá luận đã sử dụng một số môi trường chính như sau: 4.1. Môi trường tổng hợp để xác định đặc điểm hình thái , hoạt tính sinh học của các chủng vi sinh vật nghiên cứu - Môi trường Azotobacter Chrococcum cho vi khuẩn kích thích sinh trưởng AT03 CaCO3 20,0g Glucoza 20,0g K2HPO4 0,8g MgSO4.7H2O 0,5g KH2PO4 0,2g FeCl3.6H2O 0,1g Na2MoO4.2H2O 0,05g Agar 12,0g Nước cất 1000ml pH 6,8- 7,2 - Môi trường Ashby cho vi khuẩn cố định Nitơ tự do AT19 Manitol 20,0g K2HPO4 0,2g MgSO4.7H2O 0,2g NaCl 0,2g K2SO4 0,1g CaCO3 5,0g Agar 12,0g Nước cất 1000ml pH 6,8- 7,2 - Môi trường phân giải lân cho vi khuẩn phân giải phosphate khó tan B14 Glucoza 10,0g MgSO4.7H2O 0,1g KCl 0,2g Ca3(PO4)2 5,0g (NH4)2SO4 0,5g Cao nấm men 1,0g Dung dịch vi lượng 2,0ml Agar 12,0g Nước cất 1000ml pH 6,8- 7,0 Thành phần của dung dịch vi lượng: FeCl3 1,0g CaCl2 2,0g Na2MoO4 0,2g Nước cất 100ml - Môi trường thạch thường cho vi khuẩn kháng bệnh héo xanh Bs162 Cao thịt 5,0g Pepton 10,0g NaCl 5,0g Agar 12,0g Nước cất 1000ml pH 7,0-7,2 4.2. Môi trường tự nhiên để thu sinh khối của các chủng vi sinh vật nghiên cứu - Môi trường nước chiết đậu thay thế 5% sacaroza và 5% glucoza bằng 10% rỉ đường. Đậu 50,0g KH2PO4 0,5g K2HPO4 0,5g MgSO4.7H2O 0,3g (NH4)2SO4 1,0g CaCO3 0,5g Rỉ đường 10,0g Nước cất1 lần 1000ml. pH 6,8-7,0 5. Đất trồng cây thí nghiệm Thí nghiệm tiến hành trồng trên đất phù sa sông Hồng tơi xốp có thành phần cơ giới nhẹ. Với một số chỉ tiêu nông hoá (đối với từng loại thí nghiệm) như sau. *Thí nghiệm chậu vại: Nitơ : 0,07% P2O5: 0,07% K2O : 1,57% M0 : 1,57% pHHCl : 6,8 *Thí nghiệm đồng ruộng: Nitơ : 0,08% P2O5: 0,12% K2O : 1,41% M0 : 0,5% pHHCl : 6,8 6. Máy móc thiết bị, hoá chất và dụng cụ. - Các máy móc thiết bị sau đây được sử dụng trong quá trình nghiên cứu tại bộ môn vi sinh vật Viện KHKTNNVN. .Cân điện tử : Chyo (Max: 310g, d: 0,001g) .Lò vi sóng : Electrolux (Thụy Điển) .Máy lắc : Karlkolb (CHLB Đức) .Máy lắc nhu động : .Máy nghiền : .Nồi khử trùng : Webcokarlkolb (CHLB Đức) .Tủ ấm : Yamato (Nhật) .Tủ cấy : Bassaire (Anh) .Tủ lạnh : National (Nhật) .Tủ sấy : Gallenkamp (Anh) - Các hoá chất dùng làm môi trường nuôi cấy vi sinh vật trong phòng thí nghiệm của bộ môn vi sinh. .Các loại đường: D(+)glucoza (Tây Đức), sacaroza (Hungari) .Các loại muối : K2HP04 , KH2P04 (Trung Quốc), MgSO4.H2O (Tiệp Khắc), (NH4)2SO4 , K 2SO4 , CaC03 , KCL, Ca3P04 . .Các loại hoá chất khác: Pepton (Hungari), Cao nấm men, Cao thịt, Agar bột (Việt nam). .Các dụng cụ thí nghiệm của Đức : Bình tam giác dung tích 250 ml Đĩa peptri Φ=10 cm Pipet 0,001 ml-1 ml ống nghiệm Φ=18 mm, ống đong dung tích 100 ml, 250 ml, 500 ml. II. Phương pháp nghiên cứu : 1. Xác định đặc điểm sinh học của các chủng VSV. - Hình thái khuẩn lạc được xác định theo phương pháp nuôi cấy trên môi trường thạch đĩa, quan sát đặc điểm khuẩn lạc về hình dạng, kích thước, bề mặt mép, độ chắc và màu sắc khuẩn lạc. - Để xác định sự phát triển của các chủng vi sinh vật trên môi trường dịch thể tiến hành nuôi cấy trong môi trường đặc hiệu của từng chủng. Nuôi cấy lắc (120 vòng/phút) ở 25°C-35°C trong 2-3 ngày (tuỳ theo từng chủng vi sinh vật). Sau thời gian nuôi cấy quan sát khả năng phát triển, màu sắc và mùi của môi trường nuôi cấy. 2. Kiểm tra mật độ vi sinh vật ( phương pháp Koch). 2.1.Chuẩn bị - Các dụng cụ thí nghiệm bằng thuỷ tinh như đĩa peptri, bình tam giác. Bằng nhựa như đầu côn được rửa sạch sấy khô, gói lại rồi đem đi khử trùng. - Cân và hoà tan các thành phần môi trường theo thứ tự, sử dụng ống đong phân môi trường vào các bình tam giác rồi làm nút bông đậy kín và đem đi khử trùng. Khi khử trùng thì tuỳ vào thành phần môi trường mà ta đặt ở các chế độ khác nhau như môi trường nước chiết đậu thì để ở 0,5 atm trong 15 phút. Môi trường khử trùng xong lấy ra để nguội tới nhiệt độ 400C - 450C thì đổ vào các đĩa peptri đã khử trùng. Đối với các môi trường lỏng (không chứa thạch) cũng được chuẩn bị như trên để sẵn ở trong các bình tam giác. - Chuẩn bị một số ống nghiệm chứa 9 ml nước cất, làm nút bông, giàn ống ependof có 0,9 ml nước cất và mang đi khử trùng ở 1210C trong 30 phút. 2.1. Tiến hành Dùng pipet hút 1ml dịch vi khuẩn cho vào ống nghiệm có 9 ml nước cất vô trùng, cho lên máy lắc nhu động lắc đều. Sau đó lấy từ ống nghiệm này ra 0,1 ml dung dịch cho vào ống ependof cũng có 0,9 ml nước cất vô trùng rồi lắc đều. Tiến hành tương tự cho đến ống nghiệm thứ 9, như vậy quá trình pha loãng đã được thực hiện xong. Từ các ống nghiệm 3,4,5,6,7,8,9 hút 0,5 ml cho vào 1 đĩa peptri chứa môi trường thạch (mỗi nồng độ làm 3 đĩa). Dùng que trang thuỷ tinh đã được đốt trên ngọn lửa đèn cồn trang đều dung dịch trên bề mặt thạch cho đến khi mặt thạch se lại. Trang xong úp ngược đĩa peptri rồi đưa vào tủ ấm ở 280C trong 48h. Sau thời gian nuôi cấy lấy các đĩa peptri ra và đếm số lượng khuẩn lạc mọc trong đĩa thạch. Số lượng vi khuẩn trong 1ml dịch được tính theo công thức : A = a x 20 x 10d Trong đó: A : số tế bào/1ml dịch a : số khuẩn lạc trung bình có trong đĩa peptri d : nồng độ pha loãng 20 : số giọt trong 1ml dịch. Số lượng khuẩn lạc trung bình được tính là trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa peptri được cấy từ nồng độ pha loãng, trong đó chỉ tính các đĩa chứa 5-30 khuẩn lạc. Số lượng khuẩn lạc trung bình cũng có thể được tính là trung bình cộng số khuẩn lạc của các đĩa peptri được cấy từ hai nồng độ pha loãng kế tiếp nhau, bằng cách: tính số khuẩn lạc trung bình cộng ở mỗi độ pha loãng, số khuẩn lạc ở độ pha loãng cao hơn được nhân với 10, sau đó lấy trung bình cộng của hai giá trị trên nếu tỉ số giữa giá trị lớn và giá trị nhỏ không lớn hơn hai. Nếu ._.