Nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất đối kháng vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt

Trần Thanh Thủy cùng toàn thể Thầy, Cô khoa Sinh trường Đại Học Sư Phạm Tp. HCM đã hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới TS. Lê Thị Châu cùng các cán bộ nghiên cứu tại phòng vi sinh Viện Sinh Học Tây Nguyên; ThS. Nguyễn Khoa Trưởng cùng toàn thể các Thầy, Cô khoa Sinh trường Đại Học Đà Lạt đã giúp đỡ và tạo điều kiện trong suốt thời gian làm đề tài. Cuối cùng, tôi xin được cám ơn những người thân, bạn bè, các chị cùng khóa, các em sinh viên trường Đại Học Đà Lạt đã sát cánh cùng tôi hoàn thành luận văn này. Tp. Hồ Chí Minh, ngày 04 tháng 08 năm 2009 Nguyễn Thị Nhã Vy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là kết quả của quá trình tự tìm tòi nghiên cứu của chính tôi, không sao chép bất cứ thành quả của công trình nghiên cứu nào và tôi hoàn toàn chịu trách nhiệm trước các nội dung đã trình bày trong luận văn. MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa. Lời cám ơn. Lời cam đoan. Mục lục. Danh mục các chữ viết tắt. Danh mục các bảng. Danh mục cách hình vẻ, đồ thị. MỞ ĐẦU Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm sợi...............................................................................................................5 1.1.1 Đặc điểm cơ bản của nấm sợi ................................................................. .5 1.1.2 Phân loại nấm sợi.................................................................................. 14 1.1.3 Vai trò của nấm sợi ............................................................................... 17 1.2 Chất kháng sinh từ nấm sợi ................................................................................18 1.2.1 Lịch sử tìm ra chất kháng sinh ........................................................... 19 1.2.2 Ứng dụng của chất kháng sinh từ nấm sợi.......................................... 22 1.3 Thuốc trừ sâu Sinh học – giải pháp cho một ngành Nông nghiệp xanh, sạch, an toàn.................................................................................................................28 1.3.1 Đặc tính VSV kí sinh gây bệnh cho cây trồng................................... 28 1.3.2 Tình hình phá hoại cây trồng của sâu, bệnh. ..................................... 31 1.3.3 Một số nấm gây bệnh cho cây trồng................................................... 33 1.3.4 Tình hình sử dụng thuốc trừ sâu, bệnh hiện nay ................................ 37 1.3.5 Những chế phẩm VSV trong phòng trừ sâu, bệnh ............................. 39 1.3.6 Tình hình sản xuất rau, hoa tại Đà Lạt ............................................... 42 1.3.7 Tình hình bệnh hại cây Địa Lan (Cymbidium) ................................... 44 1.4 Vài nét giới thiệu về Đà Lạt. ..............................................................................52 1.4.1 Vị trí địa lý .......................................................................................... 52 1.4.2 Địa hình............................................................................................... 52 1.4.3 Tài nguyên rừng.................................................................................. 54 1.4.4 Khí hậu ............................................................................................... 56 Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu ............................................................................................................59 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu ......................................................................... 59 2.1.2 Hoá chất .............................................................................................. 60 2.1.3 Thiết bị, dụng cụ ................................................................................. 60 2.1.4 Các môi trường đã sử dụng khi nghiên cứu........................................ 61 2.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................63 2.2.1 Phương pháp VSV .............................................................................. 63 2.2.2 Phương pháp quan sát hình thái nấm sợi ............................................ 65 2.2.3 Các phương pháp hoá sinh ................................................................. 66 2.2.4 Thử hoạt tính đối kháng với các chủng nấm bệnh cho cây trồng....... 70 2.2.5 Phương pháp kiểm tra độ bền nhiệt của hoạt chất đối kháng. ............ 71 2.2.6 Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên môi trường thạch có lớp dầu khoáng......................................................................................... 72 2.2.7 Phương pháp xử lí số liệu bằng toán thống kê đơn giản. ................... 72 2.2.8 Phương pháp định danh vi nấm bằng phương pháp giải trình tự ở công ty Nam Khoa. ............................................................................. 72 Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 Kết quả phân lập và thuần khiết các chủng nấm sợi từ rừng Đà Lạt ......... 76 3.2 Khảo sát khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập được ........................................................................................................... 77 3.3 Tuyển chọn những chủng nấm sợi có họat tính đối kháng cao ................. 81 3.4 Khảo sát phổ đối kháng với VSV gây bệnh ............................................. 83 3.5 Các đặc điểm sinh học và phân loại của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn............................................................................................................ 90 3.5.1 Đặc điểm hình thái, phân loại. .......................................................90 3.5.2 Một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá của các chủng nấm sợi nghiên cứu ........................................................................................................95 3.6 Bước đầu ứng dụng các chủng nấm sợi được tuyển chọn để phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymbidium) ....................................................... 110 3.6.1 Ứng dụng chủng Trichoderma atroviride trong phòng bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium)......................................................................110 3.6.2 Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ ở cây Địa Lan (Cymdibium)....................................................................................116 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC. DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT BTT : Bào tử trần CKS : Chất kháng sinh DNC : Dịch nuôi cấy ĐKKL : Đường kính khuẩn lạc KL : Khuẩn lạc KS : Kháng sinh HS : Hệ sợi MT : Môi trường NC : Nghiên cứu VK Gr+ : Vi khuẩn Gram dương VK Gr- : Vi khuẩn Gram âm VSV : Vi sinh vật VSVKĐ : Vi sinh vật kiểm định. TBT: Trung bình tháng TBN: Trung bình năm DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1: Hiệu quả việc sử dụng phối hợp glucose và galactose đối với sự phát triển của Aspergillus niger (nuôi cấy tĩnh ở 20oC trong 7 ngày). Bảng 1.2: Diện tích gieo trồng rau và hoa cắt cành từ năm 1996-2005. Bảng 3.1 : Kết quả khảo sát khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm phân lập từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng ở các vị trí lấy mẫu. Bảng 3.2 : Kết quả thống kê hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng. Bảng 3.3 : Những chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao. Bảng 3.4: Khảo sát khả năng đối kháng với VSV gây bệnh ở cây trồng của các chủng nấm sợi được tuyển chọn. Bảng 3.5: Đặc điểm phân loại của chủng nấm sợi ĐTN3.8. Bảng 3.6: : Hoạt tính enzyme của các chủng sợi được tuyển chọn. Bảng 3.7: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon, Nitơ khác nhau của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Bảng 3.8: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH tới sự sinh trưởng, phát triển của các chủng nấm sợi được tuyển chọn. Bảng 3.9: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH lên hoạt tính đối kháng của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển và hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Bảng 3.11: Độ bền nhiệt của dịch chiết hoạt chất đối kháng thô trong dịch lên men DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc sợi nấm Hình 1.2: Sự phát triển của hệ sợi nấm Hình 1.3: Nấm Trichoderma kí sinh trên nấm gây bệnh cho cây trồng. Hình 1.4: Cuống bào tử và bào tử của Pyricularia oryzae (Sharma, 1998). Hình 1.5: Cuống bào tử và bào tử của Curvularia lunata (Sharma, 1998). Hình 1.6 : Vùng rau hoa Vạn Thành, Cam Ly. Hình 1.7: Vườn Hoa Địa Lan Phường 7, Đà Lạt. Hình 1.8: Hình thái cây Địa Lan (Cymbidium) Hình 1.9 : Cảnh quan nơi lấy mẫu nghiên cứu Hình 2.1: Vị trí lấy mẫu trên bản đồ Đà Lạt – Lâm Đồng Hình 2.2: Phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). Hình 3.1: Hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định của chủng ĐTN4.19. Hình 3.2: Hoạt tính đối kháng với VSV kiểm định của các chủng ĐTN3.7, ĐTN3.8, ĐTN3.9. Hình 3.3: Kháng với nấm gây bệnh cho cây trồng bằng hoạt chất đối kháng. Hình 3.4: Kháng với nấm gây bệnh cho cây trồng bằng cách cạnh tranh. Hình 3.5: Hình thái đại thể và vi thể của chủng ĐTN3.8 Hình 3.6: Khuẩn lạc ĐTN4.19 sau 3 ngày nuôi cấy trên Czapek Dox. Hình 3.7: Hình thái đại thể và vi thể của chủng ĐTN4.19 Hình 3.8: Hoạt tính enzyme cellulaza của chủng ĐTN4.19 và ĐTN3.8 Hình 3.9: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau Hình 3.10: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng nghiên cứu. Hình 3.12: Đốt Trấu và Dớn làm giá thể trồng Địa Lan và bổ sung Trichoderma atroviride. Hình 3.13: Cây Địa Lan được trồng trên các loại giá thể khác nhau Hình 3.14: Rễ cây Địa Lan sau 3 tháng trồng trên các loại giá thể khác nhau. Hình 3.15: Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ cho cây Địa Lan DANH MỤC CÁC ĐỒ THỊ Đồ thị 3.1: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Đồ thị 3.2: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau của hai chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng độ pH ban đầu lên hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Đồ thị 3.6: Xác định thời gian sinh tổng hợp hoạt chất đối kháng 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài. Ngành Nông nghiệp đang đối mặt với một đề cực kỳ nghiêm trọng là sự xuất hiện ngày càng nhiều loại sâu, bệnh nguy hiểm gây hại cho cây trồng. Chúng đã gây tổn thất lớn đến năng suất và sản lượng cây trồng. Để đối phó với sâu bệnh, nông dân sử dụng rộng rãi cũng như quá lạm dụng nhiều loại thuốc trừ sâu hóa học và đây cũng chính là mối lo ngại lớn của con người. Bên cạnh đó, có rất nhiều chủng VSV gây bệnh lại lờn thuốc kháng sinh. Một trong những biện pháp hữu hiệu khắc phục tình trạng lờn thuốc của cái các VSV gây bệnh là tìm thêm các kháng sinh mới từ VSV trong thiên nhiên. Trong các nhóm VSV sinh kháng sinh, người ta quan tâm tìm hiểu nhiều nhất là các nhóm nấm sợi và xạ khuẩn. Hiện nay, Khí hậu Đà Lạt đang biến đổi một cách bất thường nhất trong lịch sử hình thành. Trước đây, nhiệt độ trung bình năm ở Đà Lạt là 18-20°C. Nhưng hiện nay, sự khắc nghiệt gia tăng với biên độ nhiệt dãn cách đột biến chưa từng thấy: chênh nhau giữa nhiệt độ cao nhất và thấp nhất bình quân từ 8-10 độ những năm trước lên 12-15 độ. Đà Lạt đã nóng lên 3-4°C so với trước kia; còn sương mù, bây giờ một năm, thỉnh thoảng mới có lại vài lần. Có thể nói sự thu hẹp nhanh hơn rừng nội ô ở thành phố Đà Lạt, việc xây dựng công trình ồ ạt, cộng với hiện tượng El Nino đang diễn ra là nguyên nhân dẫn đến bức tranh khí hậu tồi tệ ở Đà Lạt. Trước tình hình đó, các nhà chuyên môn đã đưa cảnh báo: sự biến đổi khí hậu theo chiều hướng tiêu cực trên chắc chắn sẽ làm sâu, bệnh phát sinh gay gắt trên cây trồng, vật nuôi ở vùng sản xuất rau, hoa cao cấp lớn nhất nước này. Theo quy luật đấu tranh sinh tồn: khi sâu, bệnh gia tăng thì sẽ xuất hiện các chủng sinh vật sinh các hoạt chất đối kháng chống lại các sâu, bệnh đó. Trên con đường tìm kiếm những giống VSV có khả năng kháng sâu, kháng bệnh mới có hoạt tính cao. Chúng tôi nhắm đến nấm sợi và tiến hành nghiên cứu những khả năng tuyệt vời của nó trong phòng trừ sâu, bệnh. Hi vọng trên vùng đất Đà Lạt – Lâm Đồng với đặc điểm khác 2 biệt về địa hình, thời tiết – khí hậu, chúng ta có thể tìm ra những chủng nấm sợi có những đặc tính ưu việt mới trong phòng trừ bệnh hại cây trồng. Theo thông tin mà chúng tôi thu thập được, hiện nay có rất ít các công trình nghiên cứu về khu hệ nấm sợi ở rừng Đà Lạt. Tài liệu duy nhất mà chúng tôi thu thập được đó là đề tài: Nghiên cứu khu hệ vi nấm gây bệnh và có lợi cho cây thông vùng Đà Lạt – Lâm Đồng năm 2004 do Viện Khoa học và công nghệ Miền Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới, Phân viện Sinh học tại Đà Lạt (Nay là Viện Sinh Học Tây Nguyên) thực hiện. Còn các đề tài về tìm hiểu khả năng sinh hoạt chất đối kháng của hệ nấm sợi rừng Đà Lạt chưa thấy có tài liệu nào được công bố. Xuất phát từ thực tế trên, việc tiến hành thực hiện đề tài : “Nghiên cứu khả năng sinh hoạt chất đối kháng VSV gây bệnh cho cây trồng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng Đà Lạt” là việc làm rất cần thiết. 2. Mục đích đề tài Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh hoạt chất đối kháng có thể ức chế, tiêu diệt các VSV gây bệnh cây trồng. 3. Nội dung nghiên cứu đề tài: - Phân lập và thuần khiết các chủng nấm sợi từ rừng Đà Lạt. - Xác định khả năng sinh hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập được và tuyển chọn các chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao. - Thử khả năng ức chế các VSV gây bệnh ở cây trồng để tiến tới chọn ra những chủng nấm sợi tiêu biểu. - Nghiên cứu đặc điểm hình thái, sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm sợi tiêu biểu đã được tuyển chọn và tiến tới định danh những chủng này. - Bước đầu ứng dụng những chủng nấm sợi được tuyển chọn vào mục đích phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymbidium) ở Đà Lạt. 3 4. Phạm vi nghiên cứu : - Vị trí lấy mẫu là Suối Vàng, Thái Phiên, Tà Nung (Rừng Tà Nung là rừng hổn giao rừng cây lá rộng thường xanh và rừng cây lá kim nên xem như là hai vị trí), Lang Biang. - Lấy mẫu 4 lần: mùa nắng, thời điểm giao mùa mưa nắng và mùa mưa. 5. Các phương pháp nghiên cứu: - Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi bằng phương pháp vi sinh. - Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản, phân loại các chủng nấm sợi bằng phương pháp hóa sinh, kỷ thuật di truyền. - Xử lý số liệu thu thập bằng phương pháp sử dụng toán học thống kê. 6. Đối tượng nghiên cứu: - Các chủng nấm sợi được phân lập từ các khu rừng tại Đà Lạt : Suối vàng, Thái phiên, Tà nung, Lang Biang . - VSV kiểm định : Escherichia coli Gram (-) và Bacillus subtilis Gram (+), Saccharosemyces cerevisier, nấm Aspergillus niger; Vi khuẩn Pseudomonas gladioli, Erwnia sp. nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh trường Đại học Đà Lạt và các nấm gây bệnh ở cây trồng nhận từ phòng thí nghiệm vi sinh Đại học Sư Phạm Tp. HCM. 7. Cấu trúc của luận văn Gồm: Mở đầu Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Chương 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN Kết Luận và Kiến nghị 4 8. Nơi thực hiện đề tài - Phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc khoa Sinh – ĐH Sư Phạm Tp. HCM. - Phòng thí nghiệm Vi Sinh thuộc khoa Sinh – ĐH Đà Lạt. - Phòng thí nghiệm Vi Sinh – Viện Sinh học Tây Nguyên. - Vườn Địa Lan 45 Bạch Đằng Phường 7 Đà Lạt. 5 Chương 1 : TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Nấm sợi 1.1.1 Đặc điểm cơ bản của nấm sợi. Nấm học (Mycology) được khai sinh bởi nhà thực vật học người Ý tên là Pier Antonio Micheli (1729) qua tài liệu công bố “giống cây lạ” (Nova Plantarum Genera) nhưng theo Giáo sư Ekriksson Gunnan (1978) thì người có công nghiên cứu sâu về nấm sợi lại là Elias Fries (1794-1874). Theo Elizabeth Tootyll (1984) nấm sợi có khoảng 5.100 giống và 50.000 loài được mô tả. Tuy nhiên, ước tính có trên 100.000 đến 250.000 loài nấm hiện diện trên trái đất. [45] 1.1.1.1 Hình dạng, kích thước, cấu tạo của nấm sợi 1.1.1.1.1 Hình dạng và kích thước Một số ít nấm ở thể đơn bào có hình trứng (yeast=nấm men), đa số có hình sợi (filamentous fungi=nấm sợi), sợi có ngăn vách (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). Sợi nấm (hypha) thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3-5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục centimet. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm. Vào giai đoạn cuối của sự phát triển, khuẩn lạc xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thông mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến toàn bộ hệ sợi nấm. Hiện tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao nhưng lại ít gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp. Hình 6 thái, kích thước, màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc… có ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm. [45] Đầu sợi nấm có hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extensionzone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chóng, vùng này có thể dài đến 30µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và không sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất có một số phần có kết cấu gấp nếp hay xoăn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng có tác dụng tiết xuất các chất nào đó. Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen, hạt volutin, các giọt mỡ [46]. Hình 1.1: Cấu trúc sợi nấm Hình 1.2: Sự phát triển của hệ sợi nấm 7 Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm, sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay mà sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài môi trường và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn có các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường có màu nên khuẩn lạc thường có màu. [46] 1.1.1.1.2 Cấu tạo của nấm sợi Tế bào nấm sợi có thành phần cấu tạo cơ bản như các loài nấm lớn và ở các nhóm sinh vật có nhân thực khác, nghĩa là gồm thành tế bào, chất nguyên sinh, nhân tế bào, không bào và các thể ẩn nhập. Thành tế bào dày khoảng 0,2µm, nhưng có tính phản quang mạnh nên có thể phân biệt được rõ ràng ở kính hiển vi quang học. [4] Vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin và có hoặc không có cellulose. Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina. Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzyme chitin syntase. Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lổ thủng, trong nhân có hạch nhân (nucleolus). Thường có nhiều nhân tập trung ở phần ngọn của sợi nấm. Trong các tế bào phía sau ngọn thường chỉ có 1-2 nhân. Nhân của nấm thường nhỏ, khó thấy rõ dưới kính hiển vi quang học. Nhân của tế bào nấm có hình cầu hay bầu dục với màng đôi phospholipid và protein dầy 0,02µm, bên trong màng nhân chứa ARN và DNA. Trong tế bào nấm chứa mạng nội chất (endoplasmic reticulum), thể ribosomes (ribosome), không bào (vacuoles), bào nang (vesicle), thể Golgi (Golgi body, Golgi apparatus, dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5nm (microbody), các thể Vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitôxôm đường kính 40-70nm (chitosome)…ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid). Đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật. Ngoài ra trong tế bào chất 8 còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemnasome). [46] Tế bào nấm không có diệp lục tố, một vài loài nấm có rải rác trong tế bào một loại sắc tố đặc trưng mà Matsueda và ctv. (1978) đầu tiên ly trích được và gọi là neocercosporin (C29H26O10) có màu tím đỏ ở nấm Cercosporina kikuchi. Tế bào nấm không nhất thiết có một nhân mà thường có nhiều nhân. [45] 1.1.1.2 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá Nấm sợi là những sinh vật dinh dưỡng hoá năng hữu cơ, thuộc loại hoại sinh. Chúng có khả năng thu nhận năng lượng nhờ quá trình oxy hoá hiếu khí hoặc quá trình lên men kỵ khí các chất hữu cơ ngoại bào. Kiểu dinh dưỡng cacbon hữu cơ này được gọi là kiểu dinh dưỡng cacbon dị dưỡng. Chúng có khả năng phân giải các xác hữu cơ hoặc sử dụng các hợp chất hữu cơ bên ngoài các cơ thể sống để làm chất dinh dưỡng. Cũng có những loài thuộc loại ký sinh, chúng sống trên cơ thể của sinh vật khác (người, động vật, thực vật…) và đem lại những ảnh hưởng xấu đối với các cơ thể này. Có những loài lại ký sinh trên cơ thể những loài nấm khác và được gọi là nấm ký sinh trên nấm. [4] Nấm sợi có thể sử dụng những nguồn thức ăn cacbon rất khác nhau. Để thực hiện các quá trình sinh lí khác nhau nấm sợi thường có những nhu cầu không giống nhau về các nguồn thức ăn cacbon. Chúng có thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat, amino acid đến amonia. Sự thích hợp của một nguồn gốc thức ăn cacbon nào đó có thể được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác nhau như mức độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa số lượng bào tử, mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hoá. Sự sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm thường không phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất. Hầu hết các loại nấm sợi có thể đồng hoá trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ đường… Nhiều loại nấm sợi còn có khả năng đồng hoá cả các hợp chất hữu cơ rất bền vững hoặc rất độc đối với nhiều loại sinh vật khác (hợp chất n-alcan, alkaloid, phenol, sterin, nhiều chất kháng sinh, nhiều độc tố). [4], [13] 9 Các loài nấm sợi thường không có những đòi hỏi nghiêm khắc đối với một loại thức ăn cacbon nào. Chúng thường có khả năng sử dụng nhiều loại cacbon khác nhau, tuy nhiên có thể là loại hợp chất cacbon này được đồng hoá tốt hơn loại hợp chất khác. Trong nhiều trường hợp nếu có mặt trong môi trường vài nguồn Cacbon khác nhau chúng sẽ phát triển mạnh mẽ hơn so với khi chỉ có riêng biệt từng loại một. Có thể lấy nghiên cứu của Horr ở bảng 1.1 làm ví dụ: Bảng 1.1: Hiệu quả việc sử dụng phối hợp glucose và galactose đối với sự phát triển của Aspergillus niger (nuôi cấy tĩnh ở 20oC trong 7 ngày). Loại đường Nồng độ (g/l) Trọng lượng khô của hệ sợi nấm Galactose Glucose Galactose + Glucose 10 18 20 2 10 18+2 10+10 45,1 42,4 44,3 145,6 411,0 577,0 1151,6 Khi phát triển trên các môi trường có nguồn thức ăn cacbon thích hợp người ta nhận thấy thời kỳ tiền phát (lag phase) thường rút lại rất ngắn và hệ sợi nấm rất nhanh chóng được tích lũy trong môi trường nuôi cấy. Các loài nấm sợi khác nhau có thể có nhu cầu khác nhau đối với các nguồn thức ăn nitơ. Nấm sợi thường có khả năng sử dụng cả nguồn Nitơ hữu cơ lần các nguồn Nitơ vô cơ. Nhiều loài nấm sợi có khả năng đồng hoá cả muốn amon lẫn nitrat. Có những loài thích hợp sử dụng muốn amon hơn nitrat nhưng ngược lại cũng có những loài thích hợp sử dụng nitrat hơn muốn amon. Đôi khi có những loài vi nấm không phát triển trên các môi trường chứa nguồn Nitơ là muối amon nhưng nguyên nhân không phải ở bản thân gốc NH4+ mà ở độ chua sinh lý do các muối amon tạo ra. Ngược lại với muối amon, nitrat là những muối có tính kiềm sinh lý, sau khi nấm sợi đồng hoá gốc NO3- trong môi trường sẽ tích lũy lại các cation Na+, K+… và do đó làm tăng độ pH của môi trường. 10 Nhiều tác giả nhận thấy khả năng đồng hoá amon sunfat của nấm sợi sẽ được tăng cường rõ rệt khi bổ sung thêm vào môi trường một số ít acid hữu cơ như acid lactic, acid malic. Ngoài các nguồn Nitơ vô cơ, nấm sợi còn có thể sử dụng tốt nhiều nguồn Nitơ hữu cơ như protein, pepton, peptide, acid amin…[4] Một số loài như Aspergillus flavus, Tricoderma lignorum, Myrothecium verrucaria… có khả năng đồng đó trực tiếp Nitơ phân tử [13] Bằng các phương pháp phân tích quang phổ người ta đã xác định được tất cả các chất khoáng có chứa trong tế bào vi nấm. Một số các nguyên tố khoáng có những chức năng sinh lý và chức năng cấu trúc đã được biết rõ, nhưng nhiều nguyên tố khoáng khác cho đến nay vẫn chưa được làm sáng tỏ về vai trò sinh lý của chúng. Theo Alexopoulos và Mims (1979) cho biết nguồn dưỡng chất cần thiết cho nấm được xếp theo thứ tự sau: C, O, H, N, P, K, Mg, S, B, Mn, Cu, Zn, Fe, Mo và Ca. Các nguyên tố này hiện diện trong các nguồn thức ăn vô cơ đơn giản như glucose, muối ammonium... sẽ được nấm hấp thu dễ dàng, nếu từ nguồn thức ăn hữu cơ phức tạp nấm sẽ sản sinh và tiết ra bên ngoài các loại enzyme thích hợp để cắt các đại phân tử này thành những phân tử nhỏ để dể hấp thu vào trong tế bào. [45] Các nguyên tố đa lượng có thể kể đến như S, P, K, Ca, Mg. Chúng thường chiếm từ vài phần nghìn đến vài phần trăm so với trọng lượng khô của sợi nấm. Các nguyên tố vi lượng mà vi nấm cần có thể kể đến là Mn, Mo, Zn, Cu,Co, Ni, B…Các nguyên tố vi lượng có liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh học trong tế bào nấm sợi. Các loại nấm sợi có quan hệ rất khác đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng. Nhu cầu về chất sinh trưởng của một loài nấm sợi có thể thay đổi tuỳ theo điều kiện nuôi cấy, tuỳ theo tuổi giống. Ngoài các chất dinh dưỡng nấm sợi cũng như tất cả các sinh vật khác còn có nhu cầu về nước cho các hoạt động sinh lý, sinh hoá của tế bào. Liên quan đến 11 lượng nước còn có độ ẩm. Các yếu tố này ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng (độ ẩm không khí không thấp hơn 60%). Khả năng hấp thụ hay thoát nước của nấm đều liên quan với nhiệt độ môi trường, khoảng 15-30oC, tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25-30oC, tuỳ loài. Hầu hết các loài nấm sợi không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950). Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2oC đến 5oC, tối hảo từ 22oC đến 27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 0oC và ở 60oC. Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi rõ rệt là pH, bình thường chúng tăng trưởng ở pH=6 nhưng pH tối hảo là 5-6,5, một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967). Môi trường kiềm hoặc acid, thì nấm sợi không hoặc tăng trưởng rất yếu. [13][45]. Oxi cũng cần cho sự phát triển của nấm sợi vì chúng là nhóm hiếu khí bắt buộc và sự phát triển sẽ ngưng khi không có oxi và dĩ nhiên nước là yếu tố cần thiết cho sự phát triển. Theo Alexopoulos và Minns (1979) cho biết nấm sợi có thể phát triển liên tục trong 400 năm hay hơn nếu các điều kiện môi trường đều thích hợp cho sự phát triển của chúng. Nấm sợi không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống sót và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể động vật hay thực vật) hay hoại sinh (saprophytes) trên xác bã hữu cơ, cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định. [45] 1.1.1.3 Sinh sản của nấm sợi Nói chung, nấm sợi sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính. Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái. 12 1.1.1.3.1 Sinh sản vô tính The Alexopoulos và Mims (1979), nấm sợi sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử. Một số loài nấm có những bào tử đặc trưng như sau: a. Bào tử túi (bào tử bọc)(sporangiospores): các bào tử động (zoospores) có ở nấm Saprolegnia và bào tử túi (sporangiopores) ở nấm Mucor, Rhizopus chứa trong túi bào tử động (zoosporangium) và túi bào tử (sporangium) được mang bởi cuống túi bào tử (sporangiophores). b. Bào tử đính (conidium): các bào tử đính không có túi bao bọc ở giống nấm Aspergillus, Penicillium,... Hình dạng, kích thước, màu sắc, trang trí và cách sắp xếp của bào tử đính thay đổi từ giống này sang giống khác và được dùng làm tiêu chuẩn để phân loại nấm. Cuống bào tử đính dạng bình có thể không phân nhánh như ở Aspergillus hay dạng thẻ phân nhánh như ở Penicillium. Bào tử đính hình thành từ những cụm (cluster) trên những cuống bào tử đính ở Trichoderma. Ở giống Microsporum và Fusarium, có hai loại bào tử đính: loại nhỏ, đồng nhất gọi là tiểu bào tử đính (microconidia), loại lớn, đa dạng gọi là đại bào tử đính (macroconidia). c. Bào tử tản (Thallospores): trong nhiều loài nấm men và nấm sợi có hình thức sinh sản đặc biệt gọi là bào tử tản. Bào tử tản có thể có những loại sau: - Chồi hình thành từ tế bào nấm men: Cryptococcus và Candida là những loại bào tử tản đơn giản nhất, gọi là bào tử chồi (blastospores) 13 - Giống Ustilago có những sợi nấm có xuất hiện tế bào có vách dầy gọi là bào tử vách dầy còn gọi là bào tử áo (chlamydospores). Vị trí của bào tử vách dầy ở sợi nấm có thể khác nhau tùy loài. - Giống Geotrichum và Oospora có sợi nấm kéo thẳng, vuông hay chử nhật và tế bào vách dầy gọi là bào tử đốt (arthrospores). 1.1.1.3.2 Sinh sản hữu tính Sinh sản hữu tính xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân. ._.Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn: - Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần (protoplast) của 2 giao tử. - Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội (diploid). - Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội). Theo Machlis (1966) tất cả các giai đoạn trên kể cả giai đoạn tạo cơ quan sinh dục được điều khiển bởi một số kích thích tố sinh dục (sexual hormones). Cơ quan sinh dục của nấm sợi có tên là túi giao tử (gametangia) có 2 loại: cơ quan sinh dục đực gọi là túi đực (antheridium) chứa các giao tử đực (antherozoids), còn cơ quan sinh dục cái gọi túi noãn (oogonium) chứa giao tử cái hay noãn, khi có sự kết hợp giữa giao tử đực và noãn sẽ tạo thành bào tử, bào tử di động được gọi là bào tử động (zoospores). Kiểu hai sợi nấm có giới tính đực và cái tiếp hợp nhau sinh ra bào tử có tên là tiếp hợp tử (myxospores), tiếp hợp tử là đặc trưng của nhóm nấm Myxomycetes. 14 Bào tử sinh dục khi hình thành có dạng túi gọi là nang (ascus) và túi này chứa những bào tử gọi là bào tử nang (ascospores). Nang và bào tử nang là đặc trưng của nhóm Ascomycetes. Trong nhóm Basidiomycetes, 4 bào tử phát triển ở phần tận cùng của cấu trúc thể quả gọi là đãm (basidium) và bào tử được gọi là bào tử đãm (basidiospores) Nhóm Nấm bất toàn (Deuteromycetes=Deuteromycotina)) gồm những nấm cho đến nay chưa biết rõ kiểu sinh sản hữu tính của chúng. [45] 1.1.2 Phân loại nấm sợi Việc phân loại vi nấm nói chung và nấm sợi nói riêng vẫn đang ở thời kì phân loại học hình thái dựa vào các đặc điểm hình thái nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá và phương thức sinh sản. Tuy nhiên, ngày nay, phương pháp định danh bằng sinh học phân tử đang phát triển nhanh chóng, cung cấp nhiều thông tin cho định danh và định typ VSV, chính xác và hiệu quả. 1.1.2.1 Phương pháp sinh hóa Nhà nấm học Italia P.A. Saccardo (1845-1920) đã chỉnh lý các nghiên cứu về nấm và biên soạn bằng tiếng La Tinh 25 tập Kỷ yếu nấm. Các thành tựu nghiên cứu đã được tổng kết khá đầy đủ trong 5 tập sách Giới nấm (The Fungi) của G.C. Ainsworth và cộng sự (Vol 1, 2, 3, 4A, 4B. New Yord and London: Academic Press, 1963-1973). Năm 1995 đã tái bản lần thứ 8 cuốn từ điển về nấm (Dictionary of the Fungi) của Ainsworth và Bisby. Nấm được chia thành 4 ngành (Division, Phylum): - Ngành Chytridiomycota - Ngành Zygomycota - Ngành Ascomycota - Ngành Basidiomycota 15 Các loài nấm không tìm thấy (đúng ra là chưa tìm thấy) dạng sinh sản hữu tính được xếp chung vào nhóm Nấm bất toàn – Fungi imperfecti. Theo hệ thống phân loại của Saccardo (1880,1886) thì các nấm này được xếp thành một lớp - Lớp Deuteromycetes. Khi phát hiện thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì người ta đổi tên loài và xếp sang một lớp khác. Ví dụ nấm lúa von trước kia được gọi là Fusarium moniliforme, nhưng sau khi tìm thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì lại chuyển thành loài Gibberella fujikuroi. Các nấm bất toàn hiện được xếp trong các nhóm conidial Ascomycetes hay conidial Basidiomycetes. Nấm bất toàn (Deuteromycota), nấm đảm (Basidiomycetes), nấm túi (Ascomycetes) được xếp vào nhóm nấm bậc cao (Michael J. Carlile at al, 2001). Nấm bất toàn là giai đoạn vô tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm. [46 ] Khoá phân loại đến lớp (Robert A.Samson,1984):[48] NẤM TÚI (ASCOMYCETES) Bào tử sinh ra trong túi bào tử NẤM TIẾP HỢP (ZYGOMYCETES) Bào tử hoặc bào tử trần không sinh ra trong túi bào tử. Hệ sợi không có hoặc có rất ít vách ngăn, thường rộng, bào tử kín sinh ra trong các nang bào tử kín NẤM BẤT TOÀN (DEUTEROMYCETES) Sợi nấm thường có vách ngăn, bào tử trần không sinh ra trong các nang bào tử kín. - Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất toàn được chia thành 3 nhóm: - Nhóm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bó sợi, bó giá). - Nhóm Coelomycetes: Gồm các nấm bất toàn có túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata. - Nhóm Agonomycetes: Gồm các nấm bất toàn không có bào tử trần. 16 1.1.2.2 Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp định danh bằng sinh học phân tử được gọi là phương pháp giải trình tự dựa trên phương pháp PCR (Polymerase Chain Reation – phản ứng tổng hợp di chuyền nhờ polymerase). Ngày nay, Phương pháp giải trình tự DNA phát triển nhanh chóng. Phương pháp này có tính chính xác và đưa lại nhiều thông tin nhất cho định danh và định typ VSV. Phương pháp giải trình tự DNA là xác định chính xác trình tự chuỗi DNA của một vùng quy định trên nhiễm sắc thể. Kết quả so sánh sự tương đồng của trình tự gene nghiên cứu trở thành phương pháp phân loại chuẩn trong nghiên cứu hệ thống học và cây phả hệ di truyền giữa các đối tượng nghiên cứu. Phương pháp giải trình tự DNA theo nguyên tắc tạo ra các mảnh DNA để đánh dấu tại đầu 5’ hoặt 3’. Các mảnh có các base đánh dấu được tách ra trên gel polyacrylamid. Các mảnh được phân biệt về vị trí trên gel với sự sai khác chỉ với một nucleotid. Việc đánh dấu và đọc kết quả theo các kỹ thuật và phương pháp khác nhau. Việc tạo ra các mảnh DNA sai khác nhau về 1 nucleotid được trình bày theo 2 phương pháp : Phương pháp hóa học (Maxam & Gilbert, 1997) và phương pháp enzyme kết thúc phản ứng chuỗi (Sanger, 1997). Ngày nay phương pháp enzyme được dùng phổ biến hơn cả. Phương pháp enzyme kết thúc phản ứng chuỗi của Sanger : Phương pháp kết thúc phản ứng chuỗi được thực hiện dựa trên việc nhân DNA từ sợi khuôn khi có đoạn DNA mồi với xúc tác của Klenow hay T7-DNA polymerase và 4 loại deoxyribonucleotid (dNTPs). Như vậy, có 4 phản ứng được tiến hành đồng thời và trong mỗi phản ứng thì có một loại dNTP bị thay đổi bởi một dẫn xuất để làm dừng phản ứng (ddNTP). Kết quả là phản ứng chuỗi bị dừng đặc hiệu cho mỗi một base xác định xảy ra một cách ngẫu nhiên trong mỗi phản ứng. Trình tự của DNA được xác định trên gel. Đầu tiên phương pháp này được xây dựng cho xác định trình tự sợi DNA đơn tạo ra bằng cách tách dòng DNA vào vectơ 17 thực khuẩn thể M13 (Sanger và cộng sự, 1978). Sau đó phương pháp xác định trình tự sợi đôi DNA đã được Chen, Walliam (1986) mô tả khi tách dòng DNA vào plasmid. Ngày nay người ta lựa chọn phương pháp Sanger để giải trình tự DNA cho nghiên cứu phân loại và xác định typ VSV thay cho phương pháp hóa học. Một số lợi thế của phương pháp này ở chổ: Phương pháp này đơn giản và không tốn nhiều thời gian như phương pháp hóa học. Khi nghiên cứu phân loại và xác định typ thì các gene nghiên cứu có độ bảo thủ nhất định vì vậy ta có thể dùng chung mồi cho nhiều đối tượng khác nhau. Một trong hạn chế của phương pháp này ở chổ các đoạn DNA cần được tách dòng trước khi tiến hành giải trình tự DNA. Tuy nhiên cho đến nay người ta cải tiến phương pháp này để có thể giải trình tự trực tiếp sản phẩm PCR. Có hai phương pháp : Phương pháp giải trình tự truyền thống đọc kết quả trên bản gel (đánh dấu bằng phóng xạ là chủ yếu) và phương pháp giải trình tự và đọc kết quả tự động (đánh dấu bằng hóa chất huỳnh quang). [81] 1.1.3 Vai trò của nấm sợi Một số loài nấm sợi rất hữu ích trong sản xuất và đời sống (Penicillium notatum tổng hợp nên penicillin, Penicillium griseofulvum tổng hợp nên griseofulvin...), nấm Aspergillus niger tổng hợp các acid hữu cơ như acid citric, acid gluconic, nấm Gibberella fujikuroi tổng hợp kích thích tố gibberellin và một số loài nấm thuộc nhóm Phycomycetina hay Deuteromycetina có thể ký sinh trên côn trùng gây hại qua đó có thể dùng làm thiên địch diệt côn trùng. Ngoài ra, những loài nấm sống cộng sinh với thực vật như Nấm rễ (Mycorrhizae), giúp cho rễ cây hút được nhiều hơn lượng phân vô cơ khó tan và cung cấp cho nhu cầu phát triển của cây trồng. Nấm còn là đối tượng nghiên cứu về di truyền học như nấm Neurospora crassa, nấm Physarum polycephalum dùng để tổng hợp DNA và những nghiên cứu khác. 18 Bên cạnh đó, Nấm sợi có ảnh hưởng xấu đến cuộc sống con người một cách trực tiếp bằng cách làm hư hỏng, giảm phẩm chất lương thực, thực phẩm trước và sau thu hoạch, trong chế biến, bảo quản. Nấm sợi còn gây hư hại vật dụng, quần áo... hay gây bệnh cho người, động vật khác và cây trồng. Một số loài thuộc giống Rhizopus, Mucor, Candida gây bệnh trên người, Microsporum gây bệnh trên chó, Aspergillus fumigatus gây bệnh trên chim; Saprolegnia và Achlya gây bệnh nấm ký sinh trên cá. Những loài nấm gây bệnh trên cây trồng như Phytophthora, Fusarium, Cercospora.... đặc biệt nấm Aspergilus flavus và Aspergillus fumigatus phát triển trên ngũ cốc trong điều kiện thuận lợi sinh ra độc tố aflatoxin. Ngoài ra, các qui trình chế biến thực phẩm có liên quan đến lên men đều cần đến sự có mặt của VSV trong đó có nấm sợi. Nấm sợi cũng giúp tổng hợp acid hữu cơ (acid oxalic, citric, gluconic...), vitamin (nhóm B, riboflavin), kích thích tố (gibberellin, auxin, cytokinin), một số enzyme và các hoạt chất khác dùng trong công nghiệp thực phẩm và y, dược ... đã được sử dụng rộng rãi trên thế giới, nấm sợi còn giữ vai trò quan trọng trong việc phân giải chất hữu cơ trả lại độ màu mỡ cho đất trồng. Đặc biệt, Nấm sợi có khả năng tổng hợp rất nhiều loại kháng sinh (penicillin, griseofulvin…) [45]. 1.2 Chất kháng sinh từ nấm sợi Kháng sinh (antibiotics, chemotherapeutics) là những chất ngay ở nồng độ thấp đã có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt vi khuẩn một cách đặc hiệu, bằng cách gây rối loạn phản ứng sinh học ở tầm phân tử (nồng độ thấp: nồng độ sử dụng để điều trị nhỏ hơn nhiều lần so với liều độc đối với cơ thể người; đặc hiệu: mỗi kháng sinh chỉ có tác dụng trên một loại vi khuẩn hay một nhóm vi khuẩn). Kháng sinh, thoạt đầu là do các tế bào tiết ra nên chúng được coi là yếu tố sinh học ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn. Đến nay kháng sinh còn là những dẫn xuất thu được sau những biến đổi hoá học (gọi là kháng sinh bán tổng hợp) hay bằng đường sinh tổng hợp trong phòng thí nghiệm (ví dụ sulfamid). Vì vậy, định 19 nghĩa về chất kháng sinh đã được mở rộng, không phải duy nhất chỉ do VSV sinh ra. [2] 1.2.1 Lịch sử tìm ra chất kháng sinh Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Bệnh truyền nhiễm trước đây trong một thời gian dài đã là mối đe dọa rất lớn đối với loài người và các sinh vật khác. Do vậy, việc tìm kiếm chữa bệnh cho con người, vật nuôi, cây trồng từ lâu đã là mơ ước của nhiều nhà khoa học nói riêng và của cả nhân loại nói chung. Từ đó đã có nhiều chất kháng sinh phát hiện từ nấm sợi như : Penicillin: Năm 1928, ở bệnh viện Saint Marie, chất kháng sinh được phát hiện tình cờ. Trong khi làm vệ sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp petri nuôi Staphylococcus bị nhiếm nấm sợi Penicillium notatum có xuất hiện hiện tượng vòng vô khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm. Khi ông cấy nấm sợi trên thử nghiệm lại trên một số loài vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiện tượng tương tự xảy ra. Từ đó, ông kết luận là nấm sợi đã tiết ra môi trường một chất nhất định làm tan vi khuẩn và ông đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh này (1929). Công trình khoa học của Fleming ngay lập tức thu hút được sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới, trong đó có các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành công penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931). Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đó mọi nổ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đó vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên. Mãi đến 1945, ông mới nhận được giải Nobel. [2], [27] Năm 1938, ở Oxford, Ernst Boris Chain và Norman Heatley đưa Penicillium vào sản xuất thử. Và chỉ sau hai năm đã tinh chế một lượng penicillin đủ để thử nghiệm trên chuột thí nghiệm và kết quả điều trị đã thành công mỹ mãn ngày 25/05/1940 và mở ra kỷ nguyên dùng kháng sinh để điều trị bệnh nhiễm trùng. [2] [27] 20 Năm 1940, Dorothy Hodgkin xác định được cấu trúc phân tử của penicillin. Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium chrysogesrum có khả năng sinh kháng tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium notatum tìm ra trước đó. Năm 1946-1950, hàng loạt chất kháng sinh được phát hiện, hàng loạt nhà máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủ yếu là Penicillium, khẳng định giá trị to lớn của Penicillin sử dụng trong chữa bệnh. [20] Tiếp theo Penicillin hàng loạt chất kháng sinh đã được tìm kiếm và phát hiện. Streptomicin : Năm 1944, Waksman và Schatz phân lập được chủng Streptomyces grieus (sau này đổi tên là Streptomyces streptomixin) có khả năng sinh tổng hợp Streptomicin và cho đến nay nó mang nhiều tên khác nhau như: Streptomicin, Strepocvin, Strizolin. Loại kháng sinh nay có thể tiêu diệt nhiều VSV khác nhau (cả Gr+ và Gr-) [20] Tetraxyclin : Đây là nhóm kháng sinh có chung một phân nhóm –N(CH3)2, nhóm CONH2, nhóm phenohydroxyl và hai hệ thống nối đôi liên hợp chứ etol và enol. Nhóm tetraxyclin có nhiều loại. Các loại tetraxyclin được ứng dụng nhiều trong chữa bệnh cho người và gia súc bao gồm: Tetraxyclin, Clotetraxyclin, Oxytetraxyclin, Demetyltetraxyclin. Sản phẩm Tetraxyclin hiện nay có bán trên thị trường được sản xuất bằng phương pháp sinh học và phương pháp hoá học từ Clotetraxyclin. Kháng sinh Tetraxyclin có khả năng tiêu diệt vi khuẩn Gr- tốt hơn vi khuẩn Gr+. Trong sản xuất kháng sinh này, người ta thường sử dụng Streptomyces aureofaciens và Str. Rimosus. [20] Cephalosporin : Năm 1948, Brotzu chiết từ chủng nấm sợi thuộc giống Cephalosporium sp. có khả năng chống được cả VK Gr+ và VK Gr- đặc biệt là Vibriocholerac. Ngày nay, người ta phát hiện nhiều loại nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn khác nhau có khả năng tổng hợp cephalosporin. Tuy nhiên, hoạt tính của Cephalosporin thì kém hơn hoạt tính của Penicillin. 21 Griseofulvin : Năm 1959, Oxford và đồng sự phát hiện do chiết được từ một số loài nấm sợi thuộc giống Penicillium (Pen. Urticae, Pen. Nigricans, Pen. Raistrichi..). Griseofulvin không có hoạt tính chống vi khuẩn nhưng có khả năng chống nấm khá mạnh nên dùng để chữa bệnh nấm cho người và gia súc. Năm 1959, các nhà khoa học Anh, Mỹ đã tách được vòng penicillin, mở đầu cho hàng loạt các loại kháng sinh tổng hợp. Năm 1960, người ta đã bắt đầu tổng hợp được Griseofulvin bằng con đường nhân tạo. Kháng sinh được chiết suất từ nấm sợi như Citrinin (P.citrinum), Fumagilin (A. fumigatus), Nudulin (A. nidulans), Humicolin (A. humicola), Viridin (T.viride)… Có nhiều công trình nghiên cứu về Trichoderma, đã xác định nó có khả năng chữa bệnh. Trong đó chú ý nhất là loài Trichoderma viride, phân tán khắp nơi trong đất. Glytoxin là chất kháng sinh từ giống Trichoderma viride, ngoài ra người ta còn phát hiện ở Aspergillus fumgitus, một vài lòai Penicillium. Glytoxin không bền vững và bị phân hủy nhanh trong ánh sáng. Phổ kháng sinh của nó chống các vi khuẩn Gr+ và các nấm gây bệnh. Trong kết quả thực nghiệm glytoxin không thể hiện hiệu quả chống nhiễm trùng lao của chuột, không ngăn cản sự phát triển của u ác tính. Hoạt tính kháng sinh của glytoxin liên quan tới sự có mặt trong phân tử là nhóm chứa lưu huỳnh. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hỗ trợ của nhiều nhà khoa học khác đã tạo điều kiện thuận lợi cho lĩnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu to lớn lao. Các phương pháp hiện đại về kỹ thuật di truyền, công nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dòng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần đã nâng cao khả năng sinh tổng hợp CKS trong thời gian ngắn. Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như DNA tái tổ hợp, kỹ thuật tách dòng gen và biểu thị sự tổng hợp ở VK E.coli không những đem lại kết quả to lớn trong việc phát triển chủng, giống mà còn mở ra phương hướng đầy triển 22 vọng trong sản xuất các chất kháng sinh. Kỹ thuật enzyme bất động được coi là một trong những phương hướng nghiên cứu, sản xuất CKS trong những năm cuối thế kỷ 20 và đầu thế kỷ 21. Ngày nay, tuy đã có hàng ngàn CKS mới được phát hiện nhưng các nhà nghiên cứu trên thế giới vẫn đang chạy đưa trong việc tìm tòi và tổng hợp CKS mới, đặt biệt là CKS chống virus và chống ung thư. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và sản xuất CKS bắt đầu từ năm 1949 do Giáo sư Bác sĩ Đặng Văn Ngữ tiến hành với chủng Penicillium và thu được dịch lọc penicilin (sử dụng trong điều trị vết thương cho các bệnh binh). Sau kháng chiến 9 năm, công trình được tiếp tục nghiên cứu ở ĐH Y Dược Hà Nội. Cho đến nay nghiên cứu CKS đã được quan tâm của nhiều nhà khoa học đầu ngành. Mặc dù có nhiều cố gắng nhưng những nghiên cứu về CKS của chúng ta vẫn còn hạn chế so với thế giới. [27 ] 1.2.2 Ứng dụng của chất kháng sinh từ nấm sợi. 1.2.2.1 Ứng dụng kháng sinh từ nấm sợi trong điều trị bệnh nhiễm trùng và hiện tượng lờn thuốc của VSV gây bệnh. VSV là căn nguyên của các bệnh nhiễm trùng. Bệnh nhiễm trùng đã xuất hiện cùng với loài người từ xa xưa và thực sự loài người đã biết về nó một cách khoa học hơn một thế kỷ. Thế nhưng, hiện nay, bệnh nhiễm trùng vẫn còn là vấn đề lớn trong bệnh tật của thế giới. Các bệnh nhiễm khuẩn, nhờ có thuốc kháng sinh và vacxin được khống chế ở các nước phát triển. Nhưng ở các nước đang phát triển thì nhiễm khuẩn vẫn là vấn đề rất nặng nề. Bên cạnh những bệnh nhiễm khuẩn cũ thì gần đây còn nổi lên một số bệnh nhiễm khuẩn mới như do E.coli gây tiêu chảy, xuất huyết tiêu hoá và tiết niệu (do nhóm EHEC), hoặc gây viêm loét dạ dày do Helicobacter pylori. Vi khuẩn này còn là căn nguyên gây ung thư dạ dày. Một số nước Nam Á còn xuất hiện một týp vi khuẩn tả mới là V.cholerae O139 khác với týp V.cholerae O1 vẫn gây dịch ở 23 nhiều nước trên thế giới. Riêng HIV/AIDS đang gây đại dịch toàn cầu và là vấn đề nổi cộm của toàn thế giới. Gần đây nhiều nước (trong đó có Việt Nam) xuất hiện một loại dịch bệnh viêm phổi cực kỳ nguy hiểm (SARS), do một loại virus mới giống như Coronaviridae và gọi là virus SARS-COV. Tuy chưa lây lan ra toàn cầu và số người nhiễm khoảng 8000 người, nhưng tỷ lệ tử vong khá cao (gần 10%). [2] Dịch cúm A/H1N1 bùng phát ở Mê-xi-cô hồi tháng 4/2009, sau đó lan tràn rộng khắp ở nhiều quốc gia trên trên thế giới gây nên mối đe doạ cho hàng triệu người. Ngày 11/06/2009, Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) tuyên bố đại dịch cúm trên quy mô toàn cầu trong vòng 40 năm qua. Khác với các virus cúm theo mùa thông thường, H1N1 có khả năng tấn công sâu vào các tế bào phổi, nơi nó gây ra chứng viêm phổi và thậm chí dẫn tới tử vong trong trường hợp nghiêm trọng. Trái lại, virus cúm theo mùa thường chỉ tấn công các tế bào thuộc phần trên của hệ hô hấp. [50] [51] [52] Từ khi Penicillin được sản xuất đề đưa vào điều trị, sự phát triển của kỹ thuật công nghệ kháng sinh đã giúp cho thầy thuốc những công cụ hữu hiệu trong việc kiểm soát và khống chế các bệnh nhiễm khuẩn. Việc sản xuất CKS, sử dụng CKS trong trị liệu cùng với thời gian, nhiều chế phẩm bán tổng hợp và tổng hợp ra đời. Song song với hiện tượng này, con người biết đến hiện tượng lờn thuốc mà bản chất là sự phát triển tính đề kháng kháng sinh của tác nhân gây bệnh. Tỉ lệ đề kháng của vi khuẩn và số thuốc bị đề kháng đang ngày càng gia tăng. Nhờ dày công nghiên cứu, trước sự tấn công của vi trùng, các nhà bác học đã tìm ra ngày càng nhiều kháng sinh hữu hiệu hơn, tiêu diệt được nhiều loại vi trùng lờn thuốc. Tuy nhiên, một kháng sinh mới được sử dụng thì trong một thời gian ngắn lại có một số vi trùng coi thường. Cephalosporidines thế hệ thứ 3, thứ 4, Aminoglycosides, Quinolones các thế hệ mới đều đã bị lờn từ 25% đến 50%. Vì vậy, nhiều biện pháp đang được nghiên cứu để chống lại sự lờn thuốc của các VSV gây bệnh. Một trong số các biện pháp hữu hiệu nhất là tìm các kháng sinh 24 mới từ các loài VSV trong thiên nhiên. Ngày nay, các nhà khoa học đang quay lại nhóm VSV đầu tiên sinh ra CKS – đó là nấm sợi nói riêng và nấm nói chung, hy vọng tìm được giải pháp hữu hiệu chống các VSV lờn thuốc. [27] 1.2.2.2 Sử dụng kháng sinh của nấm sợi trong phòng chống nấm bệnh hại cây trồng. Giữa các loài VSV với nhau, thường xảy ra hiện tượng đối kháng. Sở dĩ như vậy là vì VSV tiết ra CKS trong quá trình hoạt động sống, có nghĩa là CKS đó chỉ có ảnh hưởng đến một số loài VSV nhất định. VSV đối kháng và CKS do chúng tiết ra có ý nghĩa quan trọng trong công tác phòng chống bệnh cho cây.[38] Trong thời gian gần đây, nhiều CKS còn được sử dụng có hiệu quả trong đấu tranh sinh học. Trong bảo vệ thực vật, người ta tăng cường phương pháp bảo vệ thực vật bằng phương pháp sinh học. Trong số các “biện pháp đấu tranh sinh học” trong bảo vệ thực vật theo Cook và Baker (1953) là sử dụng một hay nhiều VSV để kiềm chế bệnh thực vật. CKS và dịch lên men các chủng sinh kháng sinh được dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên ngoài và trong hạt, diệt bệnh ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất. Nhìn chung, so với y học, việc sử dụng kháng sinh trong bảo vệ thực vật còn mới mẻ. Tuy nhiên, nhờ những thành tựu của khoa học sinh học hiện đại và xu hướng phát triển tất yếu trong công nghệ sản xuất kháng sinh hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng của kháng sinh trong nền nông nghiệp hiện đại. Kháng sinh diệt nấm sử dụng trong nông nghiệp có hiệu quả cao như strobilurin phân lập từ Strobilurus tenacellus. [27] Trong thực tế sản xuất ở nhiều nước đã áp dụng phương pháp bón vào đất các loại vi sinh đối kháng để tiêu diệt những VSV gây bệnh cho cây. Những VSV đối kháng này hoàn toàn không gây hại cho cây trồng. [38] Từ năm 1935, một số nhà khoa học Liên Xô (cũ) đã dùng một số loài vi khuẩn, Pseudomonas bón vào đất đế chống nấm Selerotia và Botrytis bảo vệ nhiều loại cây trồng khác nhau. 25 Hoạt động đối kháng của nấm Trichoderma cũng đã được biết từ lâu. Những nghiên cứu về tác dụng đối kháng của nấm Trichoderma trong đấu tranh sinh học với các nấm gây bệnh ở cây trồng đã đạt được những thành tựu tốt đẹp. Nếu bón vào trong đất ẩm với một lượng lớn nấm này, chúng sẽ đàn áp sự phát triển nấm gây bệnh chết lụi ở cây trồng. [38 ] Người ta sử dụng CKS để kiểm soát dịch bệnh do VSV gây ra cho cây trồng. CKS có tác dụng nhanh, dễ phân hủy lại có tác dụng chọn lọc cao. Dịch lên men của một số VSV sinh CKS không chỉ chống bệnh cho cây mà còn dùng để xử lí hạt giống tiêu diệt mầm bệnh, có thể kích thích cây sinh trưởng và tăng số lượng VSV có ích cho vùng rễ. Nhiều nước đã áp dụng phương pháp bón vào đất các loại VSV đối kháng để tiêu diệt các loại VSV gây bệnh cho cây. Những VSV đối kháng này hoàn toàn không gây hại cho cây trồng. Những ứng dụng của nấm Trichoderma trong đấu tranh sinh học với các nấm gây bệnh ở cây trồng đã đạt được những thành tựu tốt đẹp ở các nước châu Âu, Liên xô… Công trình nghiên cứu của Wells và cộng sự (1972) đã thông báo ở điều kiện ngoài đồng ruộng Tri.harzianum đã ngăn chặn được bệnh do nấm Sclerotium rolfsii. Backman, Redriguer – Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm Tri. herzianum ngăn chặn bệnh do nấm Scherotium rolfsii, Pythium sp. bảo vệ cây họ đậu và củ cải tránh được bệnh chết ẻo. Theo Emxep V.T (1989) cho biết nấm Trichoderma không chỉ tiêu diệt nhiều loài nấm gây bệnh cho cây trồng trong đất mà còn có tác dụng cải thiện cấu trúc, thành phần hóa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển của vi khuẩn nốt sần cố định đạm có ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển cây trồng. Các VSV đối kháng không chỉ ức chế các VSV gây bệnh ở vùng rễ mà những CKS do chúng tiết ra (Trichoderma, Giltoxin) có thể xâm nhập vào mô bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. Vì vậy, một số chủng nấm Trichoderma theo các nhà khoa học các nước thì hoàn toàn có thể sử dụng trong đấu tranh sinh học. Các chủng nấm sợi như Trichoderma spp trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh không những cung cấp nguồn phân bón an 26 toàn, hiệu quả mà còn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được các ổ sinh thái phòng bệnh lâu dài trong tự nhiên. [27],[38]. Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma spp đó là khả năng kiểm soát sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật. Những loài phổ biến là T. hamatum, T.harzianum. Các nấm Tricoderma có thể kìm hãm nấm gây bệnh cây thông qua các cơ chế tiết kháng sinh, men đặc trưng và có thể ký sinh trên các nấm gây bệnh cây. Hiện tượng ký sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cây được gọi là hiện tượng “giao thoa sợi nấm”. Trước tiên sợi nấm của Trichoderma vây quanh sợi nấm gây bệnh, sau đó sợi nấm Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh, cuối cùng nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm gây bệnh làm thủng màng ngoài của nấm gây bệnh, gây nên sự phân huỷ các chất nguyên sinh trong sợi nấm gây bệnh cây (minh họa bằng hình 1.3). Nấm Trichoderma thắt chặt sợi nấm gây bệnh Pythium. Nấm Trichoderma xuyên qua sợi nấm bệnh Pythium Pythium Trichoderma 27 Sợi nấm Trichoderma harzianum quấn quanh, siết chặt sợi nấm gây bệnh Rhizoctonia solani. Hình 1.3: Nấm Trichoderma kí sinh trên nấm gây bệnh cho cây trồng. [79] Đây là một số nấm đối kháng thường gặp: Các nấm Penicillium oxalicum, P. frequentans, P. vermiculatum. P. nigricans, P.chrysogetum là những loài đối kháng của nấm Pythium spp., Rhioctonia solani, Sclerotium cepivorum, Verticillium alboatrum (martin et al., 1985). Cơ chế tác động của nấm Penicillium chưa được biết rõ ràng. Nấm Aspergillus niger đối kháng với các nấm Fusarium solani, Rhizoctonia solania, Alternaria alternata. Nấm Aureobasidium pollulans và Sporobolomyces roseus đối kháng với nấm Septoria nodorum. Nấm Cercospora kikuchii đối kháng với nấm Diaporthe phaseolorum var. sojae. [34] Các kết quả nghiên cứu của trường Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu của Đồng bằng sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện sinh học Nhiệt đới đã cho thấy vai trò của nấm sợi đối với cây trồng. Như nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Fusarium solani (gây bệnh thối rễ). Hoặc để phòng trừ bệnh thối gốc chảy mũ trên cây bưởi (do nấm Phythophthora sp gây ra) thì dùng một kg chế phẩm nấm Trichoderma harzianum trộn đều với 40kg phân chuồng rồi rải xung quanh cây từ 3-5kg tùy theo cây lớn nhỏ. Dùng các chủng nấm Trichoderma xử lí đất trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp hay trộn nấm sợi 28 với phân chuồng hoai mục trước khi bón ruộng 5-10 ngày, rồi rải lên ruộng trước khi gieo hạt có tác dụng hạn chế bệnh khô vằn hại bắp [23], [27]. Hiện nay, các chủng Trichoderma spp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thương mại. Ở Việt Nam, các bệnh do nấm, vi khuẩn, virus đã gây tổn thất lớn cho cây trồng. Việc dùng thuốc hóa học đã mang lại hiệu quả tốt, làm giảm đáng kể sự thất thu sản lượng cây trồng. Tuy nhiên, việc dùng thuốc hóa học cũng gây hậu quả nặng nề cho sức khỏe của người tiêu dùng. Nhiều hóa chất còn tồn lưu trong sản phẩm là nguyên nhân gây ung thư cho người sử dụng. [4]. Việc sử dụng nấm sợi có khả năng sinh KS để bảo vệ cây trồng là biện pháp an tòan và hiệu quả, làm tăng năng suất cây trồng, giữ được phẩm chất nông sản [27]. 1.3 Thuốc trừ sâu Sinh học – giải pháp cho một ngành Nông nghiệp xanh, sạch, an toàn 1.3.1 Đặc tính VSV kí sinh gây bệnh cho cây trồng [23] Cây thường bị nhiễm bệnh sau một quá trình xâm nhiễm và gây bệnh của một loại kí sinh trùng hay do sự tác động một thời gian tương đối dài của một yếu tố môi trường. Bệnh do môi trường hay còn gọi là bệnh không truyễn nhiễm, bệnh sinh lý. Bệnh truyền nhiễm là nhóm bệnh kí sinh trùng gây ra. Đó là những bệnh do VSV hay do những động vật bậc thấp gây hại. Ví dụ: bệnh do virus, vi khuẩn, nấm, Phytoplasma, Viroide, tuyến trùng, Protozoa, thực vật thượng đẳng ký sinh gây ra. 1.3.1.1 Sự tác động của VSV gây bệnh vào cây trồng. VSV gây bệnh khi tấn công vào cây thường gây ra những hiện tượng sau: - Sử dụng vật chất dinh dưỡng của cây để nuôi sống cơ thể chúng. - Phá hủy quá trình vận chuyển và tích lũy chất dinh dưỡng ở cây làm hỏng bó mạch, hủy hoại bộ rễ cây. 29 - Trong khi kí sinh trên mô bệnh, chúng thường sinh ra các hoạt chất sinh học, thực chất là chất độc và men đầu độc, phân giải tế bào cây và làm rối loạn, phá vỡ quá trình trao đổi chất ở cây. Như vậy, VSV gây bệnh là những sinh vật dị dưỡng bằng cách lấy dinh dưỡng của cây kí chủ để sống, phát triển và sinh sản. Cây kí chủ là cây mà ở đó kí sinh sống, phát triển và là nguồn cung cấp dinh dưỡng cho kí sinh. Vì vậy, thực chất mối quan hệ kí sinh là sự thiết lập quan hệ kí sinh và kí chủ. Mối quan hệ này sẽ xảy ra khi kí sinh xâm nhập và gây bệnh được trên cây kí chủ - kí sinh thắng được mọi sự đề kháng của kí chủ để thiết lập mối quan hệ kí sinh. Kết thúc của mối quan hệ này là cây bệnh bị nhiễm bệnh. 1.3.1.2 Phân chia tính kí sinh Tùy theo tính chất và phương thức kí sinh mà chia các VSV kí sinh thành các nhóm: - Nhóm VSV kí sinh chuyên tính (kí sinh bắt buộc): là nhóm kí sinh chỉ có khả năng sử dụng các vật chất hữu cơ sẵn có trong mô cây sống và đang phát triển. Chúng không sử dụng hay không phát triển trên các mô cây đã chết (tàn dư cây trồng). Ví dụ: Các loài nấm sương mai, gỉ sắt, nấm phấn trắng hại cây, trong nhóm kí sinh chuyên tính có thể kể đến các virus, phytoplasma, viroide, nhưng có quan niệm cho rằng 3 kí sinh vật này có mức độ kí sinh cao hơn có thể gọi là kí sinh tuyệt đối ở mức độ tế bào, kh._. enzyme ngoại bào như cellulaza, amylaza, proteaza. Hai chủng ĐTN3.8 và ĐTN4.19 có hoạt tính sinh cellulaza rất mạnh. Đây là một đặc tính đáng quý. Điều này có ý nghĩa rất lớn vì ngoài khả năng phòng trị bệnh cho cây trồng còn giúp phân giải các hợp chất hữu cơ, làm tăng độ phì nhiêu cho đất. Enzyme cellulaza là enzyme thuỷ phân có vai trò chủ đạo trong việc phân giải các biopolymer trong tự nhiên, khoáng hoá các đại phân tử này. Hai chủng nấm tuyển chọn đều có nguồn gốc từ Đất. Nhờ có hệ enzyme phong phú này mà chúng dễ dàng tồn tại. Hệ nấm sợi có ý nghĩa rất lớn trong hệ sinh thái rừng Đà Lạt để phân giải các chất lignocelluloza (lá rụng, cành cây chết, hoa, quả, cỏ…). Chính chúng là tác nhân tham gia tích cực phân giải các cơ chất lignocelluloza, protein, tinh bột ở rừng Đà Lạt. Hình 3.8: Hoạt tính enzyme cellulaza của chủng ĐTN4.19 và ĐTN3.8 Khả năng sinh enzyme cellulaza của chủng ĐTN3.8 97 3.5.2.2. Khảo sát ảnh hưởng của một số điều kiện môi trưởng lên sự sinh trưởng và hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi nghiên cứu. Để hiểu sâu hơn về các chủng ĐTN4.19 và ĐTN3.8, chúng tôi tiến hành nghiên cứu một số đặc điểm sinh lý, sinh hoá như thử khả năng đồng hoá các nguồn hydrat cacbon, nitơ; ảnh hưởng của độ pH, thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển và hoạt tính đối kháng; độ bền nhiệt của hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn 3.5.2.2.1 Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon, Nitơ khác nhau Mục đích thí nghiệm: Chọn được nguồn Cacbon, Nitơ thích hợp để nuôi cấy các chủng nấm sợi được tuyển chọn sinh trưởng tốt nhất. Tiến hành thí nghiệm: Cấy các chủng nghiên cứu trên các [MT1]. Sau đó quan sát sự sinh trưởng của các chủng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc. Kết quả thu được ghi ở bảng 3.7 và đồ thị 3.1, 3.2. 98 Bảng 3.7: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon, Nitơ khác nhau của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. 99 ¾ Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon khác nhau (minh họa bằng hình 3.9) Đồ thị 3.1: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Khả năng đồng hóa nguồn cacbon hai chủng nấm sợi được tuyển chọn 0 20 40 60 80 100 120 Glucose Sucrose Fructose Lactose Maltose CMC Nguồn cacbon ĐKKL(mm) ĐTN4.19 ĐTN3.8 A: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon của chủng ĐTN3.8 CMC Rỉ đường D-Glucose Tinh bột Maltose Sucrose Fructose Lactose D-Glucose 100 B: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon của chủng ĐTN4.19 Hình 3.9: Khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau A: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon của chủng ĐTN3.8 B: Khả năng đồng hoá nguồn Cacbon của chủng ĐTN4.19 Qua bảng 3.7 và đồ thị 3.1 cho thấy các chủng nấm sợi tuyển chọn đều có khả năng đồng hóa nguồn Cacbon khác nhau. Chúng phát triển tốt trên tất cả các nguồn Cacbon đem thử. Trong đó nguồn Cacbon là rỉ đường thì các chủng nấm sợi nghiên cứu phát triển tốt nhất. Lý do là trong rỉ đường ngoài đường saccharose ra còn chứa rất nhiều chất hữu cơ, vô cơ, các chất thuộc vitamin và các chất kích thích sinh trưởng. Đặc biệt, cả hai chủng này vẫn sinh trưởng tốt trên môi trường CMC chứng tỏ các nấm sợi này có các enzyme phân giải cellulose rất mạnh. Riêng với chủng ĐTN4.19 thì khả năng phân giải tinh bột không được tốt. D-Glucose Rỉ đường D-Glucose Tinh bột Sucrose Tinh bột Lactose Maltose CMC 101 ¾ Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ khác nhau (minh họa bằng hình 3.10). Đồ thị 3.2: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau của hai chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Khả năng đồng hóa nguồn nitơ của hai chủng tuyển chọn 0 20 40 60 80 100 120 NaNO3 Cao t hịt Bột đậu NH4H2PO4 NH4Cl (NH4)2SO4 Cazein NH4C5H6O7 NH4HCO3 (NH4)6Mo7O24 NH4NO3 NaNO2 Nguồn Nitơ ĐKKL(mm) ĐTN4.19 ĐTN3.8 A: Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ của chủng ĐTN3.8 NH4NO3 NaNO2 NH4C6H5O7 NH4H2PO4 Cao thịt (NH4)SO4 (NH4)6Mo7O24 NH4HCO3 Bột Đậu 4 Ngày NH4Cl 102 B: Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ của chủng ĐTN4.19 Hình 3.10: Khả năng đồng hóa nguồn Nitơ khác nhau A: Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ của chủng ĐTN3.8 B: Khả năng đồng hoá nguồn Nitơ của chủng ĐTN4.19 Qua bảng 3.7 và đồ thị 3.2 cho thấy các chủng nấm sợi tuyển chọn đều có khả năng đồng hoá nguồn Nitơ khác nhau, ở các mức độ mạnh và yếu khác nhau. Chúng đều đồng hoá tốt nguồn Nitơ hữu cơ (như cao thịt, bột đậu cũng như vô cơ là NO-3 nhưng khả năng đồng hoá NH4+, NO2- lại ở mức trung bình. Qua nghiên cứu các loại muối NH4+ khác nhau, chúng tôi nhận thấy các nấm sợi được tuyển chọn phát triển khác nhau trên các môi trường này. Như vậy nguyên nhân chính không phải ở bản thân gốc NH4+ mà do anion kết hợp với nó tức là do độ chua sinh lý của các muối này gây ra. Sau khi đồng hóa NH4+, môi trường sẽ tích lũy các anion sẽ làm giảm rất nhiều trị số pH của môi trường. Kết quả này phù hợp với kết quả của Nguyễn Đức Lượng. Như vậy, Cả hai chủng nấm sợi được tuyển chọn có khả năng đồng hoá tốt trên tất cả các nguồn Cacbon được thử và có khả năng đồng hoá các nguồn Nitơ NH4Cl NH4NO3 NaNO2 NH4C6H5O7 NH4H2PO4 Cao thịt (NH4)SO4 (NH4)6Mo7O24 NH4HCO3 NaNO3 NaNO3 Bột đậu 4 Ngày 103 khác nhau. Trong đó, rỉ đường - bột đậu là nguồn nguyên liệu thô, rẻ tiền, dễ kiếm so với nguồn glucose - cao thịt. Trong nuôi cấy, giá nguyên liệu rất quan trọng quyết định giá thành sản phẩm. Vì vậy, nếu các chủng tuyển chọn sử dụng được các nguyên liệu thô như rỉ đường, bột đậu là một yếu tố thuận lợi giúp cho việc nuôi cấy các chủng nói trên. 3.5.2.2.2 Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh hoạt chất đối kháng của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Mục đích thí nghiệm: Chọn được độ pH thích hợp để các chủng nấm sợi được tuyển chọn nuôi cấy sinh trưởng, phát triển tốt nhất và sinh hoạt chất đối kháng cao nhất. Tiến hành thí nghiệm: Hai chủng nấm sợi được tuyển chọn được nuôi cấy trên [MT1], điều chỉnh pH trong môi trường ban đầu, đo ĐKKL ở ngày thứ 2, 3, 4 sau khi cấy (minh họa bằng hình 3.11). Sau 4 ngày nuôi cấy thử hoạt tính đối kháng theo phương pháp Kiểm tra hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi ở mục 2.2.3.2 với chủng kiểm định là B. subtilis. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.8, 3.9 và đồ thị 3.3, 3.4. 104 A: Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng ĐTN3.8 B: Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng ĐTN4.19 Hình 3.11: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của các chủng nghiên cứu. A: Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng ĐTN3.8 B: Ảnh hưởng của pH tới sự sinh trưởng, phát triển của chủng ĐTN4.19 Bảng 3.8: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH tới sự sinh trưởng, phát triển của các chủng nấm sợi được tuyển chọn. pH=4 ĐTN4.19 pH=5 pH=7 pH=8 pH=6 4 ngày ĐTN3.8 pH=5 pH=4 pH=6 pH=7 pH=8 3 105 Đồ thị 3.3: Ảnh hưởng của pH đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Ảnh hưởng của độ pH đến sự sinh trưởng của các chủng nấm sợi 0 20 40 60 80 100 120 1 2 3 4 5 6 7 8 9 pH Đ KK L (m m ) ĐTN4.19 ĐTN3.8 Qua bảng 3.8 và đồ thị 3.3 chúng ta thấy độ pH của môi trường ảnh hưởng rất lớn trong nuôi cấy VSV như khả năng sinh trưởng, phát triển của nấm sợi. Chủng ĐTN3.8 có khả năng mọc ở pH từ 4 đến 8 và chủng ĐTN4.19 có khả năng mọc ở pH từ 4 đến 7. Như vậy, các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn từ rừng Đà lạt có khả năng phát triển tốt ở độ pH từ 4-7 nhưng độ pH thích hợp nhất là 5-6,5. Bảng 3.9: Khảo sát ảnh hưởng của độ pH lên hoạt tính đối kháng của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. 106 Đồ thị 3.4: Ảnh hưởng độ pH ban đầu lên hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn. Ảnh hưởng của môi trường pH ban đầu lên họat tính đối kháng 0 5 10 15 20 25 30 3 4 5 6 7 8 Độ pH ban đầu (D-d,mm) ĐTN4.19 ĐTN3.8 Qua bảng 3.9 và đồ thị 3.4 cho thấy pH ảnh hưởng lớn sinh tổng hợp hoạt chất đối kháng. pH quá cao hoạt quá thấp đều không có lợi cho khả năng sinh trưởng, phát triển cũng như tổng hợp hoạt chất đối kháng. Chủng ĐTN4.19 có khả năng sinh hoạt chất đối kháng ở pH từ 4 đến 7, chủng ĐTN3.8 có hoạt chất đối kháng ở pH từ 3 đến 7 nhưng pH thích hợp nhất là pH trung tính và hơi acid từ 5- 6. Tóm lại, pH ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng, phát triển và khả năng sinh hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. Các chủng nấm sợi sinh trưởng, phát triển tốt và sinh hoạt chất đối kháng ở pH từ 4 đến 7 nhưng thích hợp nhất là từ 5-6. 3.5.2.2.3 Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển của 2 chủng nấm sợi tuyển chọn Mục đích thí nghiệm: Chọn được thời điểm thích hợp để nuôi cấy các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn sinh trưởng, phát triển tốt nhất và sinh hoạt chất đối kháng cao nhất. Xác định thời gian nào cho hoạt tính đối kháng cao là 107 việc làm cần thiết để từ đó biết dừng lại ở thời gian thích hợp khi nuôi cấy tạo chất đối kháng. Tiến hành thí nghiệm: Hai chủng nấm sợi đã được tuyển chọn được nuôi cấy trên [MT1]. Từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 đo ĐKKL. Sau đó, dùng phương pháp Thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm sợi ở mục 2.2.3.2 để thử hoạt tính đối kháng qua từng ngày nuôi cấy sau khi cấy với VKKĐ là B. subtilis. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.10 Bảng 3.10: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển và hoạt chất đối kháng của 2 chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. ĐKKL (mm) Hoạt tính đối kháng (D-d, mm) Ký hiệu chủng ĐTN3.8 ĐTN4.19 ĐTN3.8 ĐTN4.19 Ngày 1 20 16 0 0 Ngày 2 53 25 0 0 Ngày 3 107 50 8 12 Ngày 4 119 83 20 24 Ngày 5 120 90 18 28 Ngày 6 121 97 14 22 Ngày 7 122 100 5 9 108 Đồ thị 3.5: Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng, phát triển của hai chủng nấm sợi được tuyển chọn. Ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng và phát triển của các chủng nấm sợi 0 20 40 60 80 100 120 140 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian Đ KK L (m m ) ĐTN4.19 ĐTN3.8 Đồ thị 3.6: Xác định thời gian sinh tổng hợp hoạt chất đối kháng Xác định thời gian sinh tổng hợp hoạt chất đối kháng 0 5 10 15 20 25 30 1 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày) (D-d, mm) ĐTN4.19 ĐTN3.8 Qua bảng 3.10 và đồ thị 3.5, 3.6 cho thấy: Khuẩn lạc các chủng nấm sợi tuyển chọn lớn dần theo thời gian. Chủng ĐTN3.8 sinh trưởng, phát triển rất nhanh. Điều này liên quan đến khả năng đối kháng mạnh mẽ bằng cách cạnh tranh của nó đối với các chủng nấm sợi gây bệnh cho cây trồng. Chủng ĐTN3.8 có khả 109 năng sinh hoạt chất đối kháng mạnh nhất vào ngày thứ 4 còn chủng ĐTN4.19 vào ngày thứ 5. 3.5.2.3. Độ bền nhiệt Chúng tôi tiến hành khảo sát khả năng chịu nhiệt của dịch chiết hoạt chất đối kháng thô từ chủng khi nuôi cấy trên [MT2] không có agar. Dịch chiết hoạt chất đối kháng thô đem giữ ở nhiệt độ 60oC, 80oC, 100oC, 115oC, 121oC với thời gian nhất định rồi thử hoạt tính kháng sinh trên VK B. subtilis. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.11. Bảng 3.11: Độ bền nhiệt của dịch chiết hoạt chất đối kháng thô trong dịch lên men 110 Qua bảng 3.11 chúng tôi nhận thấy dịch chiết hoạt chất đối kháng thô này rất bền với nhiệt độ, hoạt chất đối kháng này không hề giảm hoạt tính khi ở nhiệt độ cao, kể cả nhiệt độ 121oC trong vòng 60 phút. Điều này thuận lợi trong khâu tách chiết, tinh chế, sử dụng trong nông nghiệp và bảo quản. Kết quả này phù hợp với kết quả của Nguyễn Thị Thu và Phan Thanh Phương. 3.6 Bước đầu ứng dụng các chủng nấm sợi được tuyển chọn để phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium) ở Đà Lạt. Các nông dân trồng Địa Lan tại Đà Lạt đang lao đao vì căn bệnh thối củ Địa Lan, nhiều vườn Địa Lan đang chết dần chết mòn và được coi là “vô phương cứu chữa”. Tỷ lệ vườn bị bệnh vào cuối năm 2007, đầu năm 2008 đã lên đến 70- 80%, trong đó tỷ lệ cây chết từ 30-60%, thậm chí nhiều vườn chết 100%. Do đó, ứng dụng khả năng đối kháng của các chủng nấm được tuyển chọn vào công tác phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium) là việc làm rất thiết thực. 3.6.1. Ứng dụng chủng Trichoderma atroviride trong phòng bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium) Mục đích thí nghiệm: - Phòng bệnh cho cây Địa Lan cũng như bổ sung thêm VSV có ích cho giá thể, tăng độ phì nhiêu cho giá thể trồng Địa Lan. - Tận dụng được lượng Dớn thải đang bị lãng phí. Chuẩn bị thí nghiệm: - Giống: Hai luống Địa Lan 1 năm tuổi. - DNC của Trichoderma atroviride sau 4 ngày nuôi cấy. - Giá thể trồng Địa Lan: + Rễ cây Địa Lan mọc bám trên vỏ cây, mặt đất (bì sinh hay phụ sinh); có loài rễ ăn sâu trong bọng cây, trong đất mùn (địa sinh hay 111 thực sinh) do đó giá thể để trồng cây rất quan trọng cho sự sinh trưởng và phát triển của cây. + Dớn là loại giá thể truyền thống mà người Nông dân Đà Lạt sử dụng để trồng Địa Lan. Giá thể dớn chứa nhiều đạm, kali, pH thích hợp và chậm phân huỷ. Nhưng dớn lại giữ nước rất tốt. Do vậy, khi trời mưa dầm, loại giá thế này sẽ giữ nước nhiều. Điều kiện ẩm ướt khiến dớn ở đáy chậu mục nhanh cùng sợi dớn bện lại làm bít lổ thoát nước trong chậu, điều này lại làm tăng lượng nước tích trong chậu. Sau mùa mưa, nhiệt độ ấm lên sẽ tạo điều kiện thuận lợi để VSV phát triển, gây bệnh cho cây. Ngoài ra, để có giá thể này trồng Địa Lan, người ta đã khai thác quá mức nguồn tài nguyên Dương sỉ từ rừng, do đó giá thành của nó tương đối cao. Người ta đã cải tiến thay dớn bằng các loại giá thể khác nhau như vỏ cà phê, xơ dừa hay bổ sung thêm vào dớn các loại vật liệu khác như vỏ thông, trấu, than, mùn cưa, bột nấm v.v… để tăng độ xốp cũng như giảm giá thành giá thể cho cây. Để giảm bệnh ở cây, ngoài việc kéo dàn nilon để ngăn nước mưa, chúng tôi đã dùng trấu để tăng độ xốp cho dớn theo tỉ lệ 1/1 trong thời gian 2 năm gần đây nhưng tình hình cây phát triển không tốt bằng dớn thuần túy. Mặc dù, số cây mắc bệnh có giảm nhưng không đáng kể. Bên cạnh đó, một lượng dớn thải đã bị bỏ phí. Sau khi có cây bị bệnh, nông dân phải mang cây bệnh sang khu vực cách li, xử lý bằng phun thuốc sát trùng khu vực có Địa Lan bệnh. Cây Địa Lan bị bệnh sẽ bị nhổ bỏ và ngay cả chậu và lượng dớn thừa của những cây này, nông dân cũng không thể tái sử dụng. Mặc dù, họ đã sử dụng nhiều biện pháp xử lý chậu như rải vôi, cọ rửa bằng thuốc sát trùng… nhưng khi trồng lại cây Địa Lan sau vẫn tiếp tục nhiễm bệnh, chúng tôi phải chọn giải pháp chậu nhựa thay cho chậu đất trước đây. 112 Vì những lý do trên, chúng tôi quyết định chọn giá thể trấu và dớn đốt để trồng cây Địa Lan. + Đốt hun loại hỗn hợp trấu và dớn (tỷ lệ 1/1) (minh họa bằng hình 3.12) trong 12 giờ để khử trùng nhằm tái sử dụng nguồn dớn cũ ở trang trại đang bị lãng phí. Tưới nước sạch để làm nguội hỗn hợp. Đốt trấu và dớn Trấu và dớn sau khi đốt hun và bổ sung T.atroviride 1%. Hình 3.12: Đốt Trấu và Dớn làm giá thể trồng Địa Lan và bổ sung Trichoderma atroviride. Bố trí thí nghiệm: - Chúng tôi chia hỗn hợp trấu và dớn đốt thành 2 phần: + 1 phần chúng tôi bổ sung thêm ĐTN3.8 (Trichoderma atroviride) tỷ lệ 1% (1l dịch nuôi cấy/100kg hỗn hợp) do chủng này vừa có khả năng sinh hoạt chất đối kháng, vừa có khả năng đối kháng bằng cách cạnh tranh rất mạnh với các VSV gây bệnh có trong giá thể trồng Địa Lan và có khả năng sinh enzyme cellulaza rất mạnh để tăng độ phì nhiêu cho giá thể trồng Địa Lan. 113 + 1 phần không bổ sung ĐTN3.8 (Trichoderma atroviride) để đối chứng. - Lô 1 (Lô đối chứng): Giá thể trồng Địa Lan là dớn và trấu đốt. - Lô 2 (Lô thí nghiệm): Giá thể trồng Địa Lan là Dớn và trấu đốt có bổ sung Trichoderma atroviride. Kết quả thí nghiệm: - Do cây Địa Lan là cây đa niên nên chúng tôi chỉ quan sát thấy rõ sự phát triển của cây sau 3 tháng (kết quả minh họa bằng hình 3.13, 3.14) trong đó: + Thân, Lá: Cây Địa Lan được trồng bằng giá thể dớn và trấu đốt có bổ sung Trichoderma atroviride (minh họa bằng hình 3.13B) phát triển mạnh hơn, nhanh hơn, lá xanh hơn cây Địa Lan được trồng bằng giá thể dớn và trấu đốt không có bổ sung Trichoderma atroviride (minh họa bằng hình 3.13A). Cây Địa Lan được trồng bằng giá thể dớn và trấu đốt có bổ sung Trichoderma atroviride phát triển tương đương với cây Địa Lan được trồng bằng dớn (minh họa bằng hình 3.13C) nhưng cây Địa Lan được trồng bằng giá thể trấu và dớn đốt có bổ sung Trichoderma atroviride có sức sống mạnh hơn, lá cũng xanh hơn. + Hệ rễ: Cây Địa Lan được trồng bằng giá thể dớn và trấu đốt có bổ sung Trichoderma atroviride (minh họa bằng hình 3.14B) có tốc độ ra rễ nhanh, nhiều, mập, trắng hơn so với cây Địa Lan trồng bằng trấu và dớn đốt không có bổ sung Trichoderma atroviride (minh họa bằng hình 3.14A) và cây Địa Lan được trồng bằng dớn (minh họa bằng hình 3.14C). 114 A: Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt B: Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt có bổ sung T.atroviride C: Địa Lan trồng bằng Dớn. Hình 3.13: Cây Địa Lan được trồng trên các loại giá thể khác nhau A: Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt B: Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt có bổ sung T.atroviride C: Địa Lan trồng bằng Dớn Lô 2: Lô thí nghiệm Lô 1: Lô Đối chứng 115 A: Rễ cây trồng bằng trấu và dớn đốt. B: Rễ trồng bằng trấu, dớn đốt có bổ sung T. atroviride C: Rễ cây Địa Lan trồng bằng Dớn Hình 3.14: Rễ cây Địa Lan sau 3 tháng được trồng trên các loại giá thể khác nhau. A: Rễ cây Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt B: Rễ cây Địa Lan trồng bằng Dớn và Trấu đốt có bổ sung T.atroviride C: Rễ cây Địa Lan trồng bằng Dớn. 116 3.6.2. Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ ở cây Địa Lan (Cymdibium) Mục đích thí nghiệm: Chữa bệnh thối rễ cho cây Địa Lan (Cymdibium). Chuẩn bị và bố trí thí nghiệm: - Đối chứng: 100 cây Địa Lan bị bệnh thối rễ. - Thí nghiệm: 100 cây Địa Lan bị bệnh thối rễ được chia thành 4 lô. Mỗi lô 25 cây: + Lô 1: Được bơm DNC nguyên chất của chủng nấm ĐTN4.19. + Lô 2: Được bơm DNC với tỷ lệ pha loãng 1/2 của chủng nấm ĐTN4.19. + Lô 3: Được bơm DNC với tỷ lệ pha loãng 1/3 của chủng nấm ĐTN4.19. + Lô 4: Được bơm DNC với tỷ lệ pha loãng 1/4 của chủng nấm ĐTN4.19. - DNC của chủng nấm ĐTN4.19 được pha loãng với tỷ lệ 1/2, 1/3, 1/4 và nguyên chất sau 5 ngày nuôi cấy. Bơm vào gốc cây bệnh 1 ngày 1 lần trong 10 ngày. Chúng tôi không sử dụng phân chuồng mà sử dụng phân bón đá (phân vô cơ) và phân bón lá (phân hữu cơ) để cách li mọi nguồn lây nhiễm. Bệnh thối rễ ở cây Địa Lan ban đầu rất ít biểu hiện nên việc phát hiện bệnh thường khó nhận biết sớm, chỉ xác định được khi thấy lá bị héo vàng/héo khô. Mụt con thối đen và dễ dàng rút khỏi thân cây. Lúc này nhổ cây lên thì bộ rễ đã thối gần hết. Khi bệnh nặng giả hành bị hư mô, mục rữa và chết hẳn. Do đó, 3 tháng sau khi bơm dịch nuôi cấy, chúng tôi mới nhổ cây lên để quan sát bộ rễ. 117 Kết quả thí nghiệm: - Đối chứng: Hệ rễ của cây Địa Lan thối hết; thân và lá chuyển sang vàng, nâu rồi đen, thối dần, giả hành bị hư mô, mục rữa và chết hẳn. Số cây Địa Lan chết 90%. - Thí nghiệm: + Lô 1: Hệ rễ của cây Địa Lan có dấu hiệu phục hồi. 17/25 cây đã xuất hiện rễ con (tỷ lệ 70%) (minh họa bằng hình 3.15). Tỷ lệ cây chết là 3/25 chiếm 12%. + Lô 2: Hệ rễ cây Địa Lan có dấu hiệu phục hồi, số lượng rễ con xuất hiện ít. Tỷ lệ cây chết là 8/25 cây chiếm 32%. + Lô 3: Hệ rễ của cây Địa Lan ít đen hơn lô đối chứng, quá trình thối rễ diễn ra chậm và cây chết chậm hơn so với lô đối chứng. Số cây chết 13/25 chiếm 52%. + Lô 4: Hệ rễ của cây Địa Lan thối gần hết; thân và lá chuyển sang vàng, nâu rồi đen, thối dần, giả hành đen, mục và chết. Số cây Địa Lan chết ít hơn so với lô đối chứng. Số cây chết 20/25 chiếm 80%. 118 Cây Địa Lan bị bệnh thối rễ Cây Địa Lan bị bệnh thối rễ khi nhổ gốc lên. Hình 3.15: Ứng dụng chủng ĐTN4.19 trong trị bệnh thối rễ cho cây Địa Lan Vì thời gian đề tài có hạn mà cây Địa Lan là cây lâu năm nên kết quả chỉ là sơ bộ bước đầu. Chúng tôi vẫn tiếp tục quan sát sự phát triển của những cây Địa Lan đang hồi phục. Rễ thối Rễ thối Cây Lan bệnh thối rễ Rễ con mới mọc khỏe mạnh KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1.1 Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi có khả năng sinh hoạt chất đối kháng từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng. - Từ 297 chủng nấm sợi thuần khiết phân lập được từ rừng Đà Lạt – Lâm Đồng, chúng tôi đã tiến hành khảo sát hoạt tính đối kháng. Có 86 chủng có hoạt tính đối kháng trong đó 28/297 chủng có phổ kháng khuẩn rộng, kháng cả vi khuẩn Gr+ và Gr-. - Đã chọn được 4 chủng nấm sợi có hoạt tính đối kháng cao và phổ kháng khuẩn rộng (vừa kháng VK Gr+ và Gr-) để tiếp tục nghiên cứu. - Từ 4 chủng được tuyển chọn, đã tiến hành thử khả năng kháng các nấm, vi khuẩn gây bệnh ở cây trồng. Kết quả đã chọn được 2 chủng: + Chủng ĐTN3.8 (được định danh là Trichoderma atroviride) kháng được tất cả 6 chủng nấm sợi gây bệnh được thử, 2 chủng vi khuẩn gây bệnh ở cây Địa Lan. + Chủng ĐTN4.19 có khả năng kháng tất cả 6 chủng nấm sợi gây bệnh được thử, 2 chủng vi khuẩn gây bệnh ở cây Địa Lan. 1.2 Đã nghiên cứu đặc điểm sinh học cơ bản của các chủng nấm sợi được tuyển chọn - Cả 2 chủng nấm sợi được tuyển chọn có enzyme cellulaza rất mạnh, riêng hoạt tính enzyme proteaza và amylaza kém. - Cả 2 chủng phát triển tốt trên nguồn Cacbon là rỉ đường, nguồn Nitơ là bột đậu. Nguồn rỉ đường, bột đậu đều là nguồn nguyên liệu thô. Điều đó có ý nghĩa thực tiễn trong việc chọn nguồn dinh dưỡng cho việc nuôi cấy 2 chủng sau này. - Cả 2 chủng nấm sợi sinh trưởng, phát triển tốt và sinh hoạt chất đối kháng ở pH từ 4 đến 7 nhưng thích hợp nhất là từ 5-6. - Cả 2 chủng đều có hoạt tính đối kháng từ ngày thứ 3 sau khi cấy. Chủng ĐTN3.8 hoạt tính đối kháng mạnh nhất vào ngày thứ 4 sau khi cấy. Chủng ĐTN4.19 có hoạt tính đối kháng mạnh nhất vào ngày 5 sau khi cấy. - Dịch chiết hoạt chất đối kháng thô của 2 chủng nấm tuyển chọn rất bền với nhiệt độ. - Chủng ĐTN3.8 được định danh là Trichoderma atroviride. - Chủng ĐTN4.19 là chủng nấm sợi có nhiều đặc điểm hình thái (vi thể và đại thể) rất mới lạ. Đã gửi đi định danh ở các phòng thí nghiệm khác nhau nhưng vẫn chưa định danh loài này được. Từ đó, chúng tôi tiên đoán có thể đây là một nấm sợi mới. Cần được tiếp tục nghiên cứu để xác định vị trí phân loại của chủng này. 1.3 Đã bước đầu thử nghiệm khả năng ứng dụng các chủng nấm sợi được chọn trong phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan (Cymdibium) ở Đà Lạt. - Trên giá thể trồng cây Địa Lan là Trấu và Dớn đốt hun có bổ sung Trichoderma atroviride cây phát triển tốt, lá xanh, rễ con ra nhanh, trắng, mập so với lô đối chứng không có bổ sung Trichoderma atroviride. - Đã dùng DNC của chủng ĐTN4.19 để trị bệnh thối rễ trên cây Địa Lan. Kết quả cho thấy cây có dấu hiệu phục hồi so với lô đối chứng. Ở lô thí nghiệm bằng dịch nuôi cấy nguyên chất và tỷ lệ 1/2, cây bệnh đã có rễ con đã xuất hiện sau 3 tháng theo dõi. 2. Kiến nghị. Vì thời gian thực hiện đề tài có hạn, các trang thiết bị ở phòng thí nghiệm chỉ ở mức cơ bản. Mong rằng các nghiên cứu sau sẽ tiếp tục khảo sát sau hơn về các chủng nấm sợi ở rừng Đà Lạt: - Xác định bản chất hoạt chất đối kháng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn. - Tiếp tục theo dõi việc sử dụng các chủng đã tuyển chọn để phòng và trị bệnh cho cây Địa Lan ở Đà Lạt. - Chủng ĐTN4.19 có những đặc điểm mới lạ nên tiếp tục nghiên cứu để xác định vị trí phân loại của chủng này. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Lê Huy Bá (2004), “Môi trường” – NXB Đại học Quốc gia TP. HCM 2. Bộ Y Tế (2007), “VSV Y học” , NXB Y học 3. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyễn (2003), “Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng”, NXB Nông Nghiệp Tp. HCM. 4. Lê Thị Châu (2004), “Nghiên cứu khu hệ vi nấm gây bệnh và có lợi cho cây thông vùng Đà Lạt , Lâm Đồng”, Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới, Phân viện Sinh học tại Đà Lạt. 5. Phạm Thị Kim Chi , “Nghiên cứu Đặc điểm sinh lý, sinh hóa của các chủng nấm mốc được phân lập từ chế phẩm EM có khả năng sinh kháng kháng sinh kháng nấm gây bệnh ở cây trồng”, Luận văn tốt nghiệp cử nhân Đại học Sư Phạm Tp. HCM niên khoá 1997-2001. 6. Lê Đình Đôn, “Nguyên cứu nguyên nhân và biện pháp phòng trừ bệnh chết cây địa lan tại Đà Lạt-Lâm Đồng”, Đại học Nông Lâm thành phố Hồ Chí Minh (đề tài cấp Sở khoa học và Công nghệ Lâm Đồng) 2004-2005. 7. Nguyễn Lân Dũng, “Sử dụng VSV để phòng trừ sâu hại cây trồng”, NXB Khoa học Kỹ thuật Hà Nội. 8. Nguyễn Văn Đàn, Lê Nguyên Công (1983), “Sử dụng thuốc trừ sâu trong nông nghiệp”, Tạp chí Hoạt động Khoa học. 9. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978), “Một số phương pháp nghiên cứu VSV học Tập 3” , NXB Khoa học và Kỹ thụât Hà Nội. 10. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (1998), “VSV học”, NXB Giáo Dục. 11. Nguyễn Lân Dũng , “VSV tổng hợp” , NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 12. Nguyễn Thành Đạt (2005), “Cơ sở sinh học VSV Tập 1,2” , NXB ĐH Sư Pham Hà Nội. 13. Bùi Xuân Đồng (2004), “Nguyên lý phòng chống nấm mốc & mycotoxin”, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 14. Mai Thị Hằng, Phan Nguyên Hồng (2002), Đánh giá vai trò của VSV trong hệ sinh thái rừng ngập mặn”, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội 15. Trương Phước Thiên Hoàng (2007), “Khảo sát hoạt tính một số hệ enzyme thủy phân amylase, cellulase, peectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ miền Đông Nam bộ”, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên Tp. HCM 16. Nguyễn Thị Quảng Hoa (1995), “Tính khả thi về mặt khoa học của việc sản xuất chế phẩm B. thuringiensis tại Đà Lạt”. 17. TS Lê Thanh Hoà, GS. TSKH Đái Duy Ban (2002), “Công nghệ sinh học đối với cây trồng và vật nuôi Tập 2”, NXB Nông Nghiệp 18. Phạm Thành Hổ (2005), “Nhập môn công nghệ sinh học”, NXB Giáo Dục. 19. Hội thảo khoa học năm 2002, “Kết quả nghiên cứu khoa học và nâng cao nhận thức cho cộng đồng ở các vùng rừng ngập mặn thuộc Thái Bình và Nam Định”, Hà Nội. 20. Nguyễn Đức Lượng (2002), “Công nghệ vi sinh (T1,T2)”, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM. 21. Nguyễn Đức Lượng (2006), “Thí nghiệm Công nghệ sinh học (T1,2)”, NXB Đại học Quốc gia Tp. HCM. 22. Vũ Triệu Mân (2007), “Giáo trình bệnh cây chuyên khoa”, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội. 23. Vũ Triệu Mân (2007), “Giáo trình bệnh cây đại cương”, Đại học Nông Nghiệp I Hà Nội. 24. Biền Văn Minh (2000), “Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên”, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội. 25. Đặng Vũ Hồng Miên (1999), “Bảng phân loại các loài nấm mốc thường gặp”, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 26. Lê Thị Thanh Nga (2001), “Nghiên cứu đặc điểm chủng xạ khuẩn THSD sinh kháng sinh chống bệnh hại cây trồng”, Luận văn thạc sĩ sinh học trường ĐH Sư phạm Tp. HCM. 27. Phan Thanh Phương (2007), “Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ Tp. HCM”, Luận văn thạc sĩ trường ĐH Sư Phạm Tp.HCM. 28. Lê Xuân Phương (2001), “VSV Công nghiệp”, NXB Xây dựng ĐH Đà Nẵng. 29. Lương Đức Phẩm (2007), “Công nghệ VSV”, NXB Nông Nghiệp. 30. Lương Đức Phẩm (2007), “Các chế phẩm sinh học dùng trong chăn nuôi và nuôi trồng thuỷ sản”, NXB Nông Nghiệp. 31. Lương Đức Phẩm, Hồ Sưởng (1978), “Vi sinh tổng hợp”, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 32. TS Trần Thị Thanh (2007), “Công Nghệ Vi Sinh” , NXB Giáo Dục 33. Nguyễn Xuân Thành (chủ biên), Nguyễn Như Thành, Dương Đức Tiến (2004), “VSV Nông nghiệp”, NXB Đại học Sư Phạm 34. Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản (2003), “Giáo trình Công nghệ VSV trong sản xuất Nông Nghiệp và xử lý ô nhiễm môi trường”, NXB Nông Nghiệp. 35. Trần Thanh Thuỷ (1999), “Hướng dẫn thực hành VSV học” , NXB Giáo dục 36. Nguyễn Thị Thu (2005), “Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng sinh kháng sinh của các chủng Streptomyces phân lập từ rừng ngập mặn Việt Nam”, Luận văn tốt nghiệp Trường ĐH Sư Phạm Hà Nội. 37. Lê Đức Tuấn (2002), “Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần Giờ”, NXB Nông Nghiệp Tp.HCM. 38. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang (1997), “Bảo vệ cây trồng bằng các chế phẩm từ vi nấm”, NXB Nông Nghiệp Tp. HCM 39. Ủy ban nhân dân tỉnh Lâm Đồng (2008), “Địa Chí Đà Lạt”, NXB Tổng hợp TP.HCM. 40. Phân viện Khoa học Việt Nam (1976 – 1982), “Nghiên cứu sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh Bt” 41. Liên hiệp khoa học sản xuất thuốc trừ sâu vi sinh B. thuringiensis. (1984). 42. Viện Sinh học Nhiệt Đới (1998), “Tuyển tập các công trình nghiên cứu khoa học (1993 – 1998), (1999-2000)”, NXB Nông Nghiệp Tp. HCM. 43. Các báo cáo của Viện Khoa học, “Sử dụng VSV chống côn trùng và các bệnh có hại cho cây trồng”. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. toan-cau.htm 52. contrung/24428_Virus_H1N1_nguy_hiem_hon_nhieu_so_voi_suy_nghi_cu a_con_nguoi.aspx 53. 54. 55. thuong 56. ries/37/Default.aspx 57. 9 58. 59. 60. 61. kha-nang-khang-thuoc.html 62. 63. 64. 65. 66. 67. 68. 69. 70. 71. 72. 73. 74. 75. 76. 77. 78. 79. 80. 81. cleID=1106 82. D=15 83. PHỤ LỤC Khuẩn lạc chủng T. atroviride trên môi trường Czapek Dox sau 4 ngày nuôi cấy Khuẩn ty và cuốg sinh bào tử của chủng Trichoderma atroviride. Khuẩn lạc chủng ĐTN4.19 trên môi trường khoai tây sau 4 ngày nuôi cấy. Hình thái vi thể của chủng ĐTN4.19 Hình thái vi thể của chủng ĐTN4.19 Hoạt tính đối kháng với B. subtilis và E. coli của chủng ĐTN4.19 (mặt sau đĩa petri) Khả năng bền nhiệt của dịch chiết hoạt chất đối kháng thô của chủng ĐTN4.19 ở nhiệt độ 121oC. Cây Địa Lan - Cam Lửa bị bệnh thối rễ. Cây Địa Lan phát triển mạnh trên hỗn hợp Trấu và Dớn đốt có bổ sung Trichoderma atroviride so với cây Địa Lan trồng trên hỗn hợp Trấu và Dớn không đốt. Địa Lan trồng trên Trấu và Dớn đốt có bổ sung Trichoderma atroviride rễ phát triển nhanh và trắng hơn trồng trên Dớn. ._.