Nghiên cứu khả năng sinh Enzym protease của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH  VOÕ THÒ BÍCH VAÂN NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH ENZYM PROTEASE CỦA MỘT SỐ CHỦNG NẤM SỢI PHÂN LẬP TỪ RỪNG NGẬP MẶN CẦN GIỜ LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH VẬT MÃ SỐ: 06-005 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS: TRẦN THANH THỦY TP. Hồ Chí Minh. 2010 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến TS. Trần Thanh Thủy, người đã tận tình chỉ dẫn tôi trong suốt quá trình xây dựng đề cương và hoàn thành luận văn. Cô đã động viên, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình thực hiện Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến Ban chủ nhiệm cùng các thầy cô trong Khoa Sinh và Phòng thí nghiệm Vi sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong thời gian thực hiện luận văn. Xin gởi lời cảm ơn đến Phòng Khoa học Công nghệ- Sau đại học Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, đã tạo điều kiện thuận lợi để luận văn được hoàn thành đúng tiến độ. Xin gởi lời cảm ơn đến các thầy cô, bạn bè, anh chị em đồng nghiệp và những người thân trong gia đình đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành luận văn. MÔÛ ÑAÀU NS hay còn gọi là nấm mốc, phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp điều kiện khí hậu nóng ẩm. Trong tự nhiên, NS phân bố rất rộng rải và tham gia tích cực vào các vòng tuần hoàn vật chất, nhất là quá trình phân giải chất hữu cơ hình thành chất mùn. Một trong những đặc điểm nổi bật của NS là có hệ enzym ngoại bào rất phong phú. Trong đó, protease là một trong những enzyme được sử dụng nhiều nhất hiện nay trong một số ngành sản xuất nhờ protease của chúng có tính chất bền vững rất cao và có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease từ động vật, thực vật và vi khuẩn. [22] Trong cơ thể động vật, thực vật quá trình tổng hợp enzym thường gắn liền với yêu cầu sống của cơ thể. Vì vậy, muốn thu được enzym cần phải phá bỏ tổ chức đó, nguồn thu enzym thường phải tươi và quá trình thu enzym phải lệ thuộc vào điều kiện tự nhiên. Bên cạnh đó, thời gian thu họach dài làm cho việc sử dụng động vật, thực vật để sản xuất enzym là không kinh tế và không đáp ứng được nhu cầu ngày càng cao về enzym của con người. Hiện tại và tương lai gần, NS vẫn là một trong những đối tượng quan trọng nhất, kinh tế nhất trong sản xuất enzym ở qui mô công nghiệp vì: - Chúng có hệ enzym vô cùng phong phú với hoạt tính cao hơn các sinh vật khác. - Tốc độ sinh trưởng, phát triển nhanh nên có thể sản xuất lượng lớn enzym trong thời gian ngắn. - Có thể sử dụng nguồn nguyên liệu đơn giản, dễ kiếm, rẻ tiền trong nuôi cấy NS sinh enzym. - Việc tinh chế thu enzym ngoại bào thường dễ dàng với mức chi phí thấp. Các enzym từ NS được sử dụng rộng rải trong CN chế biến thực phẩm (làm tương, nước chấm…), trong CN enzym (sản xuất amylaza, proteaza, cellulaza…), CN dược phẩm (sản xuất KS, steroid…), sản xuất thuốc trừ sâu sinh học, kích thích tố sinh trưởng TV, sản xuất sinh khối NS để phục vụ chăn nuôi và dinh dưỡng cho người (mycoprotein), dùng NS để xử lý ô nhiễm MT. [4] Để tận dụng tối đa nguồn lợi to lớn từ NS đồng thời hạn chế các tác hại do NS gây ra, con người đã tập trung nghiên cứu các vấn đề liên quan đến NS. Trước đây, các nhà nghiên cứu thường tập trung tìm hiểu NS phân bố ở đất liền. Những năm gần đây, con người mới nhận thấy hết được tầm quan trọng của hệ sinh thái RNM - HST có năng suất sinh học cao nhất trong các HST. Với điều kiện sinh thái của RNM con người có thể nghiên cứu khả năng chịu đựng và phục hồi của các tổ hợp gen. Từ đây, có thể tìm được các chủng NS có hệ gen bền vững, mang nhiều đặc tính có lợi cho con người. Hệ sinh thái RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm, bền vững và có khả năng chịu đựng điều kiện sống đặc biệt khắc nghiệt. Đây là nơi có hệ VSV vô cùng phong phú và đa dạng như NS, vi khuẩn, xạ khuẩn …., trong đó NS chiếm số lượng rất lớn. Có thể thấy RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng NS có hoạt tính enzym cao chưa được khai thác. Thảm thực vật và các hệ động vật có trong RNM Cần Giờ thật sự là các nguồn thức ăn tốt nhất cho VSV sống trong RNM đặc biệt là hệ NS. NS có khả năng tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose có trong lá cây, thân cây ở RNM thành glucose để sử dụng. Ngoài ra, NS còn có thể sinh các loại enzym khác như protease, amylase, kitinase… phân hủy xác, vỏ tôm, cua, ốc, xác chết các loài động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng có thể hấp thu. Vậy hệ NS là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố không thể thiếu trong chu trình chuyển hóa vật chất ở RNM Cần Giờ Ở Việt Nam các công trình nghiên cứu về NS sinh protease khá nhiều và chỉ tập trung trên đất liền. Các công trình khoa học chính thức nghiên cứu về NS sinh protease từ RNM Cần Giờ đã có song còn nhiều hạn chế. Để góp phần nâng cao hiểu biết giá trị tài nguyên sinh học từ RNM, đặc biệt là khu hệ NS chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng sinh enzym protease của một số chủng NS phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ” Mục tiêu của đề tài: Phân lập và tuyển chọn một chủng NS có khả năng sinh protease cao từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. Nhiệm vụ đề tài. - Phaân laäp NS từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh -Tuyeån choïn chuûng NS coù hoạt tính protease cao nhất - Nghieân cöùu một số đặc điểm sinh học và phân loại chủng NS được chọn. - Khảo sát caùc yeáu toá aûnh höôûng ñeán sinh tröôûng vaø tổng hợp protease cuûa chuûng NS từ đó xác định động thái quá trình tổng hợp protease của chuûng NS nghiên cứu. - Nghiên cứu một số đặc điểm của chế phẩm protease thô từ NS - So sánh hoạt độ enzym của chủng NS nghiên cứu với chế phẩm enzym trên thị trường. Thời gian, địa điểm làm đề tài - Thời gian: từ tháng 9/2008- 7/ 2009 - Địa điểm thí nghiệm: PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Khaùi quaùt veà RNM Caàn Giôø TP Hồ Chí Minh Huyện Cần Giờ tiếp cận với biển Đông hiện hữu một khu RNM đan xen với hệ thống sông rạch dày đặc chứa đựng các HST mang tính đa dạng sinh học cao với nhiều loài động thực vật đặc hữu của miền duyên hải Việt Nam. Đó là khu RNM Cần Giờ nằm gọn trong địa giới huyện Cần Giờ và rừng Sác huyện Nhơn Trạch tỉnh Đồng Nai Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam thành phố Hồ Chí Minh. Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai, phía Nam giáp biển Đông, phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An, phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa – Vũng Tàu. Tổng diện tích Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó, vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha, và vùng chuyển tiếp 29.880 ha. RNM Cần Giờ giới hạn bởi các đoạn sông, rạch, tắc như sông Soài Rạp, sông Vàm Sát, rạch Đôn, tắc An Nghĩa, sông Lòng tàu, tắc Rổi, sông Đồng Tranh, tắc Nước Hội, sông Thị Vải, sông Gò Gia , sông Cái Mép và biển Đông, từ bắc xuống Nam dài 28km, từ Đông sang Tây dài 30km. Thổ nhưỡng phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông Sài Gòn và sông Đồng Nai mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất Cần Giờ được cấu tạo bởi quá trình trầm tích sét, quá trình phèn hoá và quá trình nhiễm mặn. Khí hậu Cần Giờ nóng ẩm và chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với hai mùa mưa nắng rõ rệt. Lượng mưa: thấp nhất TP. Hồ Chí Minh, trung bình 1300 – 1400mm/năm, mùa mưa thường bắt đầu từ tháng 4 và kết thúc vào tháng 10, lượng mưa thường tập trung vào tháng 6 và tháng 9. [35] - Chế độ nhiệt: Biên độ nhiệt trong ngày từ 5 – 70C, nhiệt độ trung bình 25,80C, nhiệt độ thấp tuyệt đối 18,80C, nhiệt độ cao tuyệt đối 350C [35]. - Độ ẩm không khí: cao hơn các nơi khác trong TP. Hồ Chí Minh. Mùa mưa độ ẩm từ 79 – 83%, mùa khô độ ẩm từ 74 – 77%, ẩm nhất vào tháng 9, khô nhất vào tháng 4 [36]. - Chế độ thuỷ triều: chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn và hai lần nước ròng trong ngày. Các tháng có đỉnh triều cực đại là tháng 10 và tháng 11, đỉnh triều thấp nhất là tháng 4 và tháng 5 [36]. - Độ mặn: trung bình từ 1,5 – 2,5% , tùy theo khu vực có thể lên đến 18% lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém. Nước mặn xâm nhập sâu vào tháng 4 và bị đẩy xa vào tháng 9 và tháng 10 [13]. * Khu hệ thực vật Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ có trên 150 loài TV, các loài chủ yếu như bần trắng, mấm trắng, các quần hợp đước đôi - bần trắng cùng sú, ổi, trang, đưng v.v… và các loại nước lợ như bần chua, các quần hợp mái dầm – ô rô, dừa lá, ráng v.v… Thảm cỏ biển với các loài ưu thế Halophyla sp., Halodule sp., và Thalassia sp.; đất canh tác nông nghiệp với lúa, khoai mỡ, các loại đậu, dừa và các vườn cây ăn trái [34]. * Khu hệ động vật Theo khảo sát sơ bộ của dự án khả thi khu bảo tồn tự nhiên RNM Cần Giờ năm 1999 cho thấy: + Khu hệ ĐV thuỷ sinh không xương sống trên cạn có 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)… [34]. + Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau [35]. Phân vùng khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75.740 ha, trong đó vùng lõi 4.721 ha, vùng đệm 41.139 ha và vùng chuyển tiếp 29.880 ha [35] . * Khu hệ VSV - Vi khuẩn VK cùng với nấm tạo nên một thành phần quan trọng trong hệ sinh thái RNM. Là những SV phân huỷ, chúng đóng vai trò trung tâm về mặt chức năng trong HST này. Số lượng VK trong RNM chiếm tỉ lệ khá cao, đặc biệt là trong trầm tích các quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp 2-3 lần lớp nước trên mặt, các quần thể trên nền bùn lớn gấp vài lần trên nền cát [34]. Nhiều loài sống trên các giá thể bề mặt rắn bằng chất nhầy dính bám. Do đó, VK có thể tạo nên một bề mặt mỏng trên mặt bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển và cây ngập mặn phát triển. - Nấm Khu hệ nấm trong RNM nhiều và rất đa dạng. Phần lớn là vi nấm, chỉ có một số loài có kích thước lớn. Nấm đóng vai trò quan trọng trong RNM, cùng với VK chúng góp phần phân huỷ nhanh xác lá TV (Fell và cộng sự 1975). Người ta có thể phân loại nấm dựa trên môi trường RNM: trên tán cây, trên thân, rễ hô hấp và trong đất, nhưng cũng có một số loài có thể sống được từ hai MT trở lên [33]. Nấm đóng một vai trò rất quan trọng trong HST bởi vì NS tham gia các chu trình sinh địa hóa ở nhiều lưới thức ăn. Khi sống hoại sinh hay cộng sinh, chúng phân hủy những vật chất hữu cơ thành những phân tử vô cơ, rồi sau đó những chất này sẽ được đồng hóa ở TV hay những SV khác [46]. Bản thân NS từ RNM cũng trở thành nguồn thức ăn giàu đạm cho nhiều loài ĐV nhỏ và ấu trùng của một số loài (Odum, 1980; Alongi, 1989). VSV ở RNM ngoài VK và NS còn có nấm men, xạ khuẩn,… chúng đóng vai trò hết sức quan trọng đối với chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái nơi này. Chúng tham gia bảo vệ MT sinh thái RNM nói riêng và MT sinh thái nói chung, cũng như vai trò to lớn trong mối quan hệ sinh học giữa các loài SV. Từ đó, đóng góp vào việc giữ cân bằng cho HST đặc biệt này.  Vai troø cuûa RNM Một số loài TV ở RNM có thể xếp vào nhóm công dụng chủ yếu: 30 loài cây cho gỗ, than, củi, 14 loài cây cho tannin, 24 loài cây làm phân xanh, 21 loài cây dùng làm thuốc, 9 loài cây chủ thả kiến cánh đỏ, 21 loài cây cho mật nuôi ong, 1 loài cây cho nhựa để sản xuất nước giải khát [2]. Ngoài ra, RNM còn có nguồn tài nguyên ĐV phong phú như 9 loài lưỡng cư, 22 loài bò sát, 67 loài chim, 21 loài thú,… Các SV ở nước rất phong phú gồm 64 loài cá thuộc 35 họ, 25 loài tôm, 66 loài TV phiêu sinh, 26 loài ĐV phiêu sinh và 22 loài ĐV đáy [2] . Ngoài ra các nhà khoa học thuộc Trung tâm Nghiên cứu Hệ sinh thái RNM đã phát hiện trong đất RNM có vi khuẩn Bacillus thuringiensis (Bt) và chủng NS Paecilomyces farinosUIs. Các loại vi sinh vật này tạo được protein tinh thể độc, có khả năng tiêu diệt một số loài côn trùng gây hại cho người và động thực vật như các loài sâu róm, sâu tơ, bọ nẹt, ấu trùng muỗi sốt rét Anopheles minimus, muỗi gây sốt xuất huyết Aedes aegypti và muỗi Culex quinquefasciatus gây bệnh chân voi. Bên cạnh các giá trị về lâm sản như than, gỗ, củi, thức ăn, thuốc… RNM còn đóng vai trò quan trọng trong việc điều hòa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi, hạn chế xói lở và quá trình xâm thực bờ biển. RNM cung cấp chất hữu cơ để tăng năng suất cho vùng ven biển, là nơi sinh sản hoặc ươm nuôi của nhiều loài hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm, cua, cá,… Mặt khác, RNM còn có tác dụng làm chậm dòng chảy và phát tán rộng nước triều, làm giảm mạnh độ cao của sóng khi triều cường. Hạn chế tác hại của sóng thần và bão lớn, hạn chế xâm nhập mặn và bảo vệ nước ngầm. RNM bảo vệ đa dạng sinh học, điều chỉnh nồng độ muối của MT, làm sạch MT nước khi có lũ lụt, lũ quét, sạt lở đất [4][18]. 1.2 Sơ lược veà NS RNM Cần Giờ 1.2.1 Vị trí phân loại. Theo G.C.Ainsworth (1973): Hệ thống của giới nấm bao gồm hai ngành: Myxomycota và Eumycota. Eumycota bao gồm 5 ngành phụ: Mastigomycotina, Deuteromycotina, Zygomycotina, Ascomycotina và Basidiomycotina [41] Ngành phụ Deuteromycotina được chia theo 3 lớp: [42] + Blastomycetes: Khuẩn ty không phát triển hoặc phát triển yếu; dạng cơ thể giống như nấm men và có sự nảy chồi. + Hyphomycetes: Khuẩn ty thật, không nảy chồi; sợi nấm bất dục hoặc sinh BT trên cuống, không có sự tập trung thành túi BT hay cụm cuống BT. + Coelomycetes: Khuẩn ty thật, BT tập trung trong túi BT hoặc trên cụm cuống BT: Lớp Hyphomycetes được chia thành 3 bộ: Moniliales, Melanconiales và Sphaeropsidales. Theo C. J. Alexopoulos (2002), nấm có 3 phần trong giới nấm, giới Stramenopila (một giới mới bao gồm các SV có cấu trúc lông roi được tách ra từ protista) và giới Protista. Giới nấm có 4 ngành: Chytridiomycota, Zygomycota, Ascomycota, Basidiomycota. Phần của nấm trong giới Stramenopila có 3 ngành: Oomycota, Hyphochytriomycota, Labryrinthulomycota. Bốn ngành khác của nấm được xem như là các SV nguyên sinh trong giới protista: Plasmodiomycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota, Myxomycota. Lý do của sự phân chia này là từ những bằng chứng mới của các nghiên cứu về rRNA và hoá sinh học. Các bằng chứng chứng minh sự tồn tại của 3 nhóm nấm khác nhau. Gần đây, sau khi hệ thống phân loại giới xuất hiện, giới nấm được tái cấu trúc và sắp xếp lại. Tất cả các phần trong các giới khác nhau được tập hợp lại chỉ trong một giới nấm. Các nhà nấm học phân chia giới này thành hai phần: nấm giả, bao gồm 7 ngành: Oomycota, Hyphochytridiomycota, Labyrinthulomycota, Plasmodiophoromycota, Dictyosteliomycota, Acrasiomycota và Myxomycota và nấm thật là những phần còn lại [43]. 1.2.2 Hình thái, cấu trúc Các nấm bậc thấp thường có sợi nấm không vách ngăn. Ngược lại, các nấm bậc cao thường mang sợi nấm có vách. Sợi nấm không vách ngăn mang nhiều nhân nhưng vẫn có thể gọi là đơn bào. Ở các nấm không vách ngăn thì vách ngăn vẫn có thể hình thành khi cơ thể sinh sản hoặc tại các bộ phận sợi nấm bị thương tổn. Đó là loại vách ngăn liền, không có lỗ thủng, có tác dụng bảo vệ cơ thể [5]. Sợi nấm có vách ngăn là cơ thể đa bào. Mỗi tế bào có 1 nhân hoặc nhiều nhân. Tuy nhiên, sợi nấm vẫn không phải do nhiều tế bào hợp thành mà là do các vách ngăn tách sợi nấm ra thành nhiều tế bào. Vách ngăn ngang được hình thành từ thành tế bào. Lúc đầu là một gờ nhỏ hình khuyên sao đó tiến dần vào trong và lấp kín lại. Tuy nhiên, vách ngăn thường có một hay nhiều lỗ thủng. Các lỗ có kích thước bằng nhau hay có một lỗ lớn nhất ở giữa và nhiều lỗ nhỏ ở xung quanh. Sợi nấm (hypha) có dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh có thể chuyển động, đường kính 1-30µm (thông thường là 5-10 µm). Đỉnh sợi nấm có hình chóp nón không tăng trưởng, có tác dụng bảo vệ phần ngọn của sợi nấm. Phần này chất nguyên sinh không có nhân và chứa ít cơ quan tử. Tiếp đến là phần tăng trưởng chứa nhiều nhân, nhiều cơ quan tử và nhiều enzym. Đây là phần quyết định sự tăng trưởng và phân nhánh của sợi nấm. Dưới nữa là phần thành cứng - phần thành thục của sợi nấm. Bắt đầu từ phần này trở xuống là chấm dứt sự tăng trưởng của sợi nấm [4] [44]. Nhân tế bào được bao bọc bởi màng nhân, trên màng nhân có nhiều lỗ nhỏ, trong nhân có hạch nhân (nucleolus). Trong tế bào nấm còn có ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay không bào (vacuolus), ribosome, bào nang (vesicle), thể golgi [4], các giọt lipid, các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể vôrônin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể chitô đường kính 40-70 nm (chitosome)… Ngoài ra trong tế bào chất còn có các vi quản rỗng ruột, đường kính 25 nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5-8 nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome) Hình 1.1: Sợi nấm có vách ngăn và sợi nấm không có vách ngăn Ribosome của nấm thuộc loại 80S đường kính khoảng 20-25nm, gồm 2 tiểu phần: tiểu phần lớn 60S và tiểu phần nhỏ 40S [45] Phần lớn sợi nấm có dạng trong suốt, ở một số nấm có sợi mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm còn tiết ra ngoài MT và làm đổi màu khu vực có nấm phát triển. Một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt KL. Vì BT của nấm thường cũng có màu nên cả KL thường có màu. Ngoài những đặc điểm chung thì NS từ RNM còn có những đặc trưng riêng đáng được quan tâm và cần có nhiều công trình nghiên cứu hơn nữa trên những đối tượng này bởi các lý do sau: Ở MT sống khắc nghiệt, kiểu trao đổi chất của chúng sẽ khác biệt hơn so với các nấm ở đất liền. Do đó, các sản phẩm trao đổi chất, đặc biệt là chất KS cũng mang tính chất khác lạ hơn [14]. Điều kiện MT khắc nghiệt mang tính cạnh tranh cao làm tăng khả năng thích nghi của NS từ RNM. Do đó, phần lớn các NS từ RNM đều có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính sinh học nhằm giúp chúng thích ứng với điều kiện sống. Điển hình là khả năng sinh nhiều loại enzym, nhất là các enzym ngoại bào có chức năng phân giải xác động thực vật là thành phần hữu cơ chính của RNM, các chất KS và các độc tố giúp làm tăng khả năng đối kháng của NS trong quá trình cạnh tranh ở MT sống. Gần đây, người ta phát hiện ra nấm biển và NS ở RNM là nguồn VSV có tiềm năng sinh các chất KS mới, chống lại các VSV nhờn thuốc. Sống trong MT biến động, MT chịu ảnh hưởng của chất thải từ đất liền, ô nhiễm do tràn dầu…đã tạo cho các nấm sợi RNM có những cơ chế phản ứng lại với những tác động này bằng khả năng sinh tổng hợp được hệ enzym phân giải các chất độc hại. RNM là một HST chịu nhiều tác động của gió bão. Sau những tác động trên, vấn đề ô nhiễm là điều không thể tránh khỏi, nhất là ô nhiễm VSV gây bệnh [13]. Nhờ có những đặc tính sinh học (a) Cấu tạo của phần ngọn sợi nấm Hình 1.2: Cấu tạo phần ngọn và cấu trúc của sợi (b) Cấu trúc của sợi nấm Vách tế bào Màng tế bào Nhân Thể golgi Không bào Ti thể Luới nội chất Nhân đáng quí như khả năng sinh ra các sản phẩm giúp khống chế VSV có hại mà NS có thể cải thiện MT sống cũng như giúp con người nâng cao khả năng điều trị bệnh tật. Đa số các NS từ RNM đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng có thể sinh trưởng ở nồng độ muối từ 1,5 % - 2,5%. Thậm chí, một số nấm sợi RNM còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối 30% [13]. Đây là một đặc điểm rất có ý nghĩa sinh thái đối với RNM. Tóm lại, NS ở RNM có những đặc tính sinh học rất đáng quí cần được khai thác nhằm phục vụ nhu cầu và lợi ích của con người. Tuy nhiên, những nghiên cứu về NS RNM còn rất khiêm tốn, chưa tương xứng với qui mô và tiềm năng của chúng, 1.2.3 Sinh sản của NS Nói chung, NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính Sinh sản vô tính NS sinh sản vô tính thể hiện qua 2 dạng: sinh sản dinh dưỡng bằng đoạn sợi nấm phát triển dài ra hoặc phân nhánh và sinh sản bằng các loại bào tử. Bào tử kín: được tạo thành từ đỉnh một sợi nấm được phân hóa làm nhiệm vụ sinh sản. Bào tử trần: là loại bào tử vô tính thường gặp nhất ở nấm. Chúng có hình dạng, kích thước, kết cấu hết sức phong phú. Tế bào sinh bào tử trần gọi là giá (hay cuống) bào tử trần (conidiophore). Hình 1.3 Bào tử kín (a) và bào tử trần ( b) của NS Sinh sản hữu tính Xảy ra khi có sự kết hợp giữa hai giao tử đực và cái (gametes) có trải qua giai đoạn giảm phân. Quá trình sinh sản hữu tính trải qua 3 giai đoạn:  Tiếp hợp tế bào chất (plasmogamy) với sự hòa hợp 2 tế bào trần (protoplast) của 2 giao tử  Tiếp hợp nhân (karyogamy) với sự hòa hợp 2 nhân của 2 tế bào giao tử để tạo một nhân nhị bội (diploid)  Giảm phân (meiosis) giai đoạn này hình thành 4 bào tử đơn bội (haploid) qua sự giảm phân từ 2n NST (nhị bội) thành n NST (đơn bội). a b b Hình 1.4: Sự tiếp hợp của NS 1.2.4 Vai troø cuûa NS NS được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất có họat tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất có khả năng phân giải nguồn cacbonhydrat [5],[9].  Họat tính enzym thủy phân ngoại bào. Enzym là những protein có khả năng xúc tác cho các phản ứng hóa học trong và ngoài cơ thể [22]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong đó phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. NS có tiềm năng lớn nhất sinh các lọai enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ, vô cơ khó tan trong tự nhiên. Một số enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: xellulase, protease, amylase, pectinase và kinase [5].  Enzym cellulase: Cellulase là một nhóm nhiều enzym xellulase C1( endo cellulase), cellulase Cx(exoxellulase) và xellobiaza có tác dụng thủy phân cellulose tạo thành glucose. Các VSV có hoạt tính cellulase cao là các loài vi khuẩn, xạ khuẩn chịu nhiệt và NS. Trong đó, các chủng NS thuộc chi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus,….có khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong chăn nuôi để nâng cao sự tiêu hóa cellulose ở động vật. Ngoài ra chúng còn được dùng trong sản xuất glucose từ bã và sản phẩm thải ở của công nghiệp rừng, làm phân bón, xử lí rác thải[17],[18].  Enzym protease: Protease là nhóm enzym thủy phân protein thành peptit và axit amin bằng cách cắt đứt các liên kết peptid. Protease gồm có proteinaza và peptidaza chúng có tính đặc hiệu tương đối rộng. Protease NS có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật và vi khuẩn, người ta chia protease NS thành ba nhóm: protease axit, protease kiềm và protease trung tính. NS có khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Penicillium, Aspergillus… Protease NS thường được dùng nhiều trong sản xuất nước chấm, sản xuất bánh mì, bánh quy ….[8], [10],[20].  Enzym amylase: Xúc tác quá trình phân giải glycogen và các polysacarit thành đường glucose. Nhiều loại NS có khả năng sinh amylase. Tổ chức phức hệ enzym amylase của NS gồm α amylase, γ amylase (glucoamylase), α- glucozidaza (mantaza) và dextrinaza sẽ cắt đứt các liên kết α- 1,4- glucoside và α- 1,6 glucoside trong phân tử tinh bột, glycogen và các polysacarit tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. NS có khả năng phân giải tinh bột nhanh chóng là các chủng thuộc chi Penicillium, Aspergillus, Trichoderma Rhizopus, Mucor,… Amylase được dùng trong sản xuất siro, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, …[20], [21].  Enzym kitinase: Kitinase phân giải kitin, kitin là các biopolyme chứa các gốc N- acetyl- glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β- 1,4- glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong vỏ tôm, cua, ốc …rất nhiều. NS thuộc chi Trichoderma, Chaetominum,… sinh enzym kitinase phân giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh có thành tế bào là kitin, chống các loài côn trùng có vỏ kitin. Như vậy, NS còn có vai trò làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng có hại trong nông – lâm – ngư – nghiệp [16]. Các chủng NS thuộc các chi Acremoium, Penicillium, Aspergillus còn có khả năng sinh enzym phân giải dầu mỏ là hợp chất có cấu tạo phức tạp và khó phân giải, góp phần xử lí ô nhiễm dầu. Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ, các loài NS có khả năng phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đó.  Khả năng sinh kháng sinh của NS. KS là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình có tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. Các chất KS có nguồn gốc từ NS chiếm tỉ lệ khá lớn, đa số thuộc lớp nấm bất toàn. Chất KS được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephaco- sporin- C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch hầu, uốn ván… Trong phẫu thuật , KS dùng để chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương. Chất KS được sinh ra nếu kết hợp với các enzym thủy phân protein là một trong những phương thức có nhiều triển vọng nâng cao hiệu quả điều trị của KS. Những vấn đề về chất kháng có nguồn gốc từ VSV của RNM đang được quan tâm nghiên cứu hàng đầu và ứng dụng mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực hiện nay [14].  Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng. Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ từ VSV ngày càng nhiều. Các axit hữu cơ như axit acetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong công nghệ chế biến mủ cao su, trong công nghiệp nhẹ và cả trong y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit citric bằng A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì. Ngoài ra, các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberelin từ hai chủng F. monoforme và F. oxysporum [19], [20] 1.2.5 Tình hình nghiên cứu nấm sợi RNM trên thế giới và Việt Nam Hiện nay, có khoảng 800 - 1000 loài nấm biển được định loại (Hawkswworth et al., 1995; Jones, 1995), trong khi đó có một số lượng lớn các loài nấm trên đất liền đã được phân loại. Sự hiểu biết của loài người về nấm RNM và vai trò của chúng đối với khu HST này còn quá ít và chưa đầy đủ (Agate A.D., Subramania, C.V và Anuci, V.1998). Sự nghiên cứu về nấm RNM mới chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ năm 1950. Theo cơ sở dữ liệu (chưa đầy đủ) của mạng nấm RNM toàn cầu có thể thấy nhiều nước đã và đang tích cực nghiên cứu phân loại và hệ thống hoá các loài nấm biển có mặt ở vùng RNM của họ. Cụ thể: Ấn Độ đã phân loại được 170 loài, Hồng Kông: 170 loài, Đài Loan: 7 loài, Trung Quốc: 2 loài, Singapore: 116 loài, Nhật: 26 loài, Úc: 67 loài, Mỹ: 18 loài, Malaysia: 164 loài, Indonesia: 7 loài, Thái Lan: 83 loài, Brasil: 48 loài, Mexico: 94 loài, Kuwait: 14 loài, Đức: 4 loài. Qua đó, có thể thấy phân loại nấm biển RNM còn rất ít và chưa đáp ứng đủ yêu cầu cấp bách cho sự tiến bộ của ngành VSV học [35]. Năm 1988, Agate A.D, Subramania C.V và Vanuci M đã nêu ra tám lĩnh vực nghiên cứu cấp bách của VSV học RNM cần được các nhà khoa học giải quyết. Trong đó, có lĩnh vực phân loại và hệ thống hoá cơ bản các loài VSV của RNM trên thế giới. Năm 1979, Kohlmeyer là người đầu tiên đánh giá vai trò quan trọng của các nấm đối với các chu trình tuần hoàn vật chất trong hệ sinh thái RNM. Ông đã nhận dạng được 43 loài nấm bậc cao, bao gồm 23 loài thuộc Ascomycetes, 17 loài thuộc Deuteromycetes và 3 loài thuộc Basidiomycetes. Năm 1990, Hyde đã liệt kê 120 loài nấm RNM trên toàn thế giới. Trong đó, bao gồm 87 loài thuộc Ascomycetes, 31 loài thuộc Deuteromycetes và 2 loài thuộc Basidiomycetes. Những nghiên cứu gần đây đã phát hiện ra một số lượng lớn loài mới, thậm chí là chi mới. Bộ sưu tập nấm RNM ở Macau và Hồng Kông tìm được 45 loài mới, 28 loài trong số mới này tìm được ở Macau và 21 loài được tìm thấy ở Hồng Kông (Vrijmoed et al., 1994) Năm 1990, Sivakumar và Kathiresan đã phân lập được 10 loài nấm từ bề mặt lá của 7 loài cây ngập mặn. Trong số đó, loài chiếm ưu thế trên bề mặt lá là các loài Alternaria alternate, Rhizopus nigricans, Aspergillus sp [41]. Một số NS còn có hoạt tính diệt côn trùng mạnh, có thể sử dụng để sản xuất các chế phẩm diệt côn trùng một cách an toàn. Đây là một nguồn gen quí, rất có giá trị đối với sinh học và y học (theo Mai Thị Hằng và cộng sự ) [11]. Theo nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh (2007) đã phân lập, tuyển chọn các chủng NS có hoạt tính cellulaza cao, có khả năng đường hoá giấy in, giấy báo cũ, chuyển hoá nhanh rơm rạ thành mùn làm phân bón cho cây trồng. Với đặc tính này NS góp phần quan trọng giúp phân giải xác TV ở RNM Cần Giờ [1]. Bên cạnh đó, công trình nghiên cứu của Phạm Thị Thanh Thuý (2007) đã tuyển chọn được các chủng NS có khả năng phân giải dầu, góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu, xử lý ô nhiễm MT dầu ngày nay [20]. NS ở RNM có vai trò lớn đối với việc làm sạch MT sống và với việc phân giải các chất độc hại trong MT như dầu mỏ, các chất hóa học có cấu trúc mạch vòng [13]. Bên cạnh đó chúng còn có chức năng là tác nhân kiểm soát sinh học hữu hiệu trong việc giữ cân bằng sinh thái, bảo vệ môi trường. Kết quả nghiên cứu của Phan Thanh Phương (2007) đã tuyển chọn được các chủng NS có hoạt tính đối kháng với VSV gây bệnh, hoạt tính phân giải phốt phát khó tan, cùng với khả năng chịu mặn. Điều này, có ý nghĩa hết sức quan trọng trong chu trình photpho của RNM Cần Giờ [18]. Năm 2009 công trình nghiên cứu của Nguyễn Thị Lan Hương đã tuyển chọn được các chủng NS có hoạt tính amylase cao. Với đặc tính này của NS người ta có thể sử dụng những nguyên liệu rẻ tiền như bã mía, bã khoai mì để sản xuất rượu, bia cho năng suất cao. Cùng năm 2009 Võ Thị Bích Viên đã khảo sát tính đối kháng của một số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh. Đây là một nguồn gen quí, rất có giá trị trong y học. 1.3 Protein và enzym protease 1.3.1 Protêin Protein là một loại hợp chất hữu cơ cao phân tử có kết cấu hoá học phức tạp. Protein được cấu thành từ 4 nguyên tố chính là cácbon, hiđro, oxy và nitơ. Các loại prôtêin đơn giản gồm các axit amin nối nhau nhờ các ._.liên kết peptit bền vững. Các loại prôtêin phức tạp hơn có liên kết thêm với các nhóm bổ sung. Prôtêin chiếm tới trên 50% khối lượng khô của tế bào và là vật liệu cấu trúc của tế bào. Cấu trúc của prôtêin Các axit amin nối với nhau bởi liên kết peptit hình thành nên chuỗi pôlipeptit. Đầu mạch pôlipeptit là nhóm amin (của axit amin thứ nhất), cuối mạch là nhóm cacbôxyl (của axit amin cuối cùng). Một phân tử prôtêin đơn giản có thể chỉ được cấu tạo từ vài chục axit amin nhưng cũng có những phân tử prôtêin bao gồm nhiều chuỗi pôlipeptit với số lượng axit amin rất lớn. Chức năng của protein Prôtêin là thành phần không thể thiếu được của mọi cơ thể sống. Chúng đóng vai trò cốt lõi của cấu trúc nhân, của mọi bào quan, đặc biệt là hệ màng sinh học Các enzym có bản chất là prôtêin đóng vai trò xúc tác cho các phản ứng sinh học. Một số prôtêin có vai trò như những “xe tải” vận chuyển các chất trong cơ thể (ví dụ hêmôglôbin). H2O Tham gia cấu thành các kháng thể có tác dụng bảo vệ cơ thể tránh khỏi sự xâm hại của vi khuẩn, nâng cao sức đề kháng của cơ thể Điều tiết áp lực thẩm thấu: Nếu trong bữa ăn bị thiếu protein lâu ngày, hàm lượng protein trong huyết tương sẽ hạ thấp, thành phần nước trong máu sẽ thấm quá nhiều vào các mô xung quanh, gây ra phù nề do thiếu dinh dưỡng. Các hoocmôn - phần lớn là prôtêin – có chức năng điều hoà quá trình trao đổi chất trong tế bào và trong cơ thể (ví dụ insulin điều hoà lượng đường trong máu). . Nhiều loại prôtêin tham gia vào chức năng vận động của tế bào và cơ thể (ví dụ miozin trong cơ, các prôtêin cấu tạo nên đuôi tinh trùng). Lúc thiếu hụt cacbohiđrat và lipit, tế bào có thể phân giải prôtêin dự trữ cung cấp năng lượng cho tế bào và cơ thể hoạt động. Tham gia cấu thành và bồi bổ các tổ chức của cơ thể: là công dụng sinh lý chủ yếu nhất của protein thần kinh, cơ bắp, nội tạng,…Sự sinh trưởng phát triển của cơ thể, sự đổi mới của các tổ chức suy lão, sự phục hồi các tổ chức sau tổn thương đều cần đến protein [40]. Ngoài ra, một số prôtêin còn có vai trò là giá đỡ, thụ thể… Sự đa dạng của cơ thể sống do tính đặc thù và tính đa dạng của prôtêin quyết định. 1.3.2 Đặc điểm của protease từ NS. Enzyme protease là nhóm enzym xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptit (-CO- NH-)n trong phân tử protein hoặc các polypeptit đến sản phẩm cuối cùng là các axit amin. Ngoài ra, nhiều protease cũng có khả năng thuỷ phân liên kết este và vận chuyển axit amin. Hình 1.5 : Enzyme protease xúc tác thủy phân liên kết peptid. Protease cần thiết cho các sinh vật sống và enzym này có trong nhiều đối tượng từ vi sinh vật (vi khuẩn, nấm và virus) đến thực vật (đu đủ, dứa...) và động vật (gan, dạ dày bê...). So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt. Trước hết, hệ protease VSV là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất. H2NCH CO N H CHCO – NH CH COOH  R1 R2 Rn H2N CH COOH + H2NCHCO – NHCHCOOH R1 R2 Rn H2O Cũng do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng rãi cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng. Protease VSV được phân loại một cách đơn giản hơn thành ba nhóm: - Protease acid : pH 2- 5 - Protease trung tính : pH 7-8 - Protease kiềm : pH 9.5 - 10.5 Phần lớn những protease acid thương mại được thu từ NS. Các NS được nghiên cứu kỹ nhất và được sử dụng nhiều nhất để thu enzym là Asperillus saitoi, Asperillus niger, Asperillus oryzae ( Keay etal). Khá nhiều protease acid khác được thu từ Rhizopus sp ( Wang và Hesseltine ) đã được nghiên cứu. 1.3.3 Tình hình nghiên cứu, ứng dụng protease NS trên thế giới và Việt Nam. Protease VSV được nghiên cứu và thu nhận đầu tiên vào năm 1884 do người Nhật tên là Takamine. Đó là chế phẩm được tách từ chủng nấm mốc Asperillus oryzae (Kretovitch). Tiếp theo đó, vấn đề nâng cao khả năng tạo protease của các chủng nấm mốc ứng dụng cho công nghiệp rượu bia đã được nghiên cứu ở Nhật (Yosida, ) và ở Mỹ ( Matsushima, ). Đến những năm 70, chế phẩm protease của các chủng nấm mốc Asperillus oryzae có tên thương mại là Proteorizin Px đã được dùng nhiều ở Liên Xô (Iarovenko, 1973). Protease của các NS có tính chất bền vững rất cao và tùy thuộc vào từng chủng giống và điều kiện nuôi cấy mà nó mang tính chất kiềm, axit hay trung tính (Harigara, 1971). Trong công nghệ thực phẩm người ta sử dụng protease NS để sản xuất phomat ( Mohanty et al, 1999), sản xuất bánh mì (Hozova et al, 2003) hay chế biến các sản phẩm từ đậu tương (Ghazi et al ,2003; Ma et al, 2004) Ở Việt Nam, năm 1993- 1994 TS. Trương Thị Hòa và các cộng sự Viện Công nghiệp thực phẩm đã nghiên cứu và ứng dụng enzym protease của A.oryzae để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc tạo điều kiện xử lí bia tốt hơn. Từ năm 2000-2001 nhóm tác giả Lê Thị Bích Phượng, Võ Thị Hạnh cùng các cộng sự phòng vi sinh, Viện Sinh học nhiệt đới đã nghiên cứu cải thiện quy trình công nghệ sản xuất nước tương bằng phương pháp sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus oryzae . Quy trình mới này rút ngắn được thời gian sản xuất, cho chất lượng nước tương ổn định, mùi vị thơm ngon tự nhiên. Năm 2003, Lê Thị Cẩm Tú tiến hành chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải protêin cao và chịu mặn. Luận văn thạc sĩ sinh học Trường ĐHKHTN – TP.HCM. Năm 2007 Th.S Phan Thị Thanh Quế sử dụng hệ enzym protease của nấm mốc Aspergilus oryzae để thủy phân protein thịt cá trong chế biến nước mắm. Ngoài những nghiên cứu về protease của NS còn có những công trình nghiên cứu về các chất có hoạt tính sinh học từ NS như: Các chế phẩm từ NS được nghiên cứu và sử dụng phòng trừ nhiều loại côn trùng, VSV gây hại trên nhiều loại cây trồng khác nhau ( Harman và Kubicek, 1998) Từ NS RNM người ta đã thu được một số chất kháng sinh mới có khả năng chống các VSV gây bệnh đã nhờn các loại thuốc kháng sinh hiện có ( Isaka M, Suyarnsestakorn C, Tanticharoen M, Kongsaeree P, Thebtaranonth Y, 2002) Năm 2007 Phan Thanh Phương khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. Năm 2001 Nguyễn Quang Huy, Cù Việt Nga, Lưu Thị Bích Thảo, Đặng Thị Cẩm Hà phân lập được một số chủng NS phân giải các thành phần hydrocacbua thơm và các hợp chất mạch vòng benzen trong dầu mỏ. Năm 2007 Phạm Thị Thanh Thuý đã nghiên cứu khả năng phân giải carbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ.  Một số ứng dụng của protease [39], [28] Trong chế biến thực phẩm Trong công nghiệp chế biến thịt, protease được dùng làm mềm thịt nhờ sự thủy phân một phần protein trong thịt. Sử dụng protease để sản xuất dịch đạm: từ Streptomyces fradiae tách được chế phẩm keratineza thuỷ phân được keratin rất có giá trị để sản xuất dịch đạm từ da, lông vũ. Để thuỷ phân sâu sắc và triệt để protein (trong nghiên cứu, chế tạo dịch truyền đạm y tế) cần dùng các protease có tính đặc hiệu cao và tác dụng rộng. Muốn vậy, người ta thường dùng phối hợp cả 3 loại protease của 3 loài: vi khuẩn, nấm mốc, thực vật với tỷ lệ tổng cộng 1- 2% khối lượng protein cần thuỷ phân Trong chế biến thuỷ sản: Khi sản xuất nước mắm (và một số loài mắm) thời gian chế biến thường dài, hiệu suất thuỷ phân (độ đạm) lại phụ thuộc rất nhiều địa phương, phương pháp gài nén, nguyên liệu cá. Hiện nay, quy trình sản xuất nước mắm ngắn ngày đã được hoàn thiện, trong đó sử dụng chế phẩm protease thực vật (bromelain và papain) và từ VSV để rút ngắn thời gian làm và cải thiện hương vị của nước mắm. Trong công nghiệp sữa, protease được dùng trong sản xuất phomat nhờ hoạt tính làm đông tụ sữa của chúng. Protease từ một số vi sinh vật như A. candidus, P. roquerti, B. mesentericus,… được dùng trong sản xuất pho mát . Trong công nghiệp sản xuất bánh mì, bánh quy... protease làm giảm thời gian trộn bột, tăng độ dẻo, làm nhuyễn bột, tạo độ xốp và nở tốt hơn. Trong sản xuất bia, chế phẩm protease có ý nghĩa quan trọng trong việc làm tăng độ bền của bia và rút ngắn thời gian lọc. Protease của A. oryzae được dùng để thủy phân protein trong hạt ngũ cốc, tạo điều kiện xử lý bia tốt hơn [6]. Công nghiệp dệt Trong công nghiêp dệt, protease VSV được sử dụng để làm sạch tơ tằm, tẩy tơ nhân tạo để sợi được bóng, dễ nhuộm. Protease có tác dụng thủy phân lớp protein serisin đã làm dính bết các sợi tơ tự nhiên, làm bong và tách rời các loại tơ tằm, do đó làm giảm lượng hoá chất để tẩy trắng. Công nghiệp thuộc da Protease được sử dụng để làm mềm da, làm sạch và tẩy lông da. Các protease sẽ làm mềm lớp biểu bì, phân giải không sâu sắc protein, loại bỏ chất nhầy và thủy phân một số liên kết của sợi colagen. Khi xử lý bằng enzym, tính đàn hồi của da cũng tăng lên, rút ngắn được quá trình tẩy lông. Ở Mỹ, chế phẩm enzyme protease được sản xuất có tên là M-Zim dùng trong sản xuất da. Kết quả đã loại bỏ khỏi da các chất nhớt và làm cho da có độ mềm dẻo nhất định, tính chất đó được hoàn thiện hơn sau khi thuộc da. Trước đây, để làm mềm da người ta dùng protease được phân lập từ cơ quan tiêu hóa của động vật. Hiện nay, việc đưa các protease tách từ vi khuẩn (B. mesentericus, B. subtilis), nấm mốc (A. oryzae, A. flavus) và xạ khuẩn (S. fradiae, S. griseus, S. rimosus...) vào công nghiệp thuộc da đã đem lại nhiều kết quả và dần dần chiếm một vị trí quan trọng [4] . Chế biến các loại bột giặt Ngày nay, enzyme được dùng nhiều trong việc chế biến các loại bột giặt, nhiều chức năng tẩy vết bẩn protein, vết máu, vết hồ... Hương mỹ phẩm Chế phẩm protease có thể pha chế trong mỹ phẩm như xà bông, dầu gội, kem xoa, dầu chải tóc, có tác dụng làm da, tóc mềm mại, tách biểu bì đã chết, tạo sự phát triển lớp da non. Ngoài ra, protease còn được ứng dụng rộng rãi trong số ngành khác như: - Điều chế dịch đạm thủy phân dùng làm chất dinh dưỡng, chất tăng vị trong thực phẩm và sản xuất một số thức ăn kiêng. - Protease của nấm mốc và vi khuẩn phối hợp với amylase tạo thành hỗn hợp enzyme dùng làm thức ăn gia súc có độ tiêu hóa cao. - Điều chế môi trường dinh dưỡng của vi sinh vật để sản xuất vaccine, KS 1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh trưởng và tổng hợp protease của NS a. Nguồn cacbon Trong MT nuôi cấy NS sinh protease nhất thiết phải có protein làm chất cảm ứng và nguồn cacbon. NS có khả năng đồng hóa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbohydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff [24],[25]. Nguồn cacbon cho sinh trưởng của NS thường dùng là glucose. b. Nguồn nitơ Các nguồn nitơ có ý nghĩa rất quan trọng đối với sự phát triển của NS. Nguồn nitơ dễ hấp thụ nhất là NH4 + và NO3 - , chúng thâm nhập vào tế bào dễ dàng và ở đó chúng tạo nên các nhóm imin và amin. Các muối amon của axit hữu cơ thích hợp đối với dinh dưỡng của NS hơn là muối amon vô cơ. Cơ chất dùng để cảm ứng NS sinh protease thường là bột đậu nành, cám, ngô, casein, cao thịt,…[28]. c. Độ ẩm Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước có trong cơ chất rắn. Các cơ chất khác nhau có khả năng giữ nước khác nhau từ 30-80% (Moo-Young, 1983). Trong quá trình nuôi cấy NS thu protease, độ ẩm tối ưu là 50-60%. Nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo điều kiện cho VK phát triển, nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở NS, hoạt tính enzym sẽ giảm.[25] d. pH Sự sinh trưởng của NS sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ chất. Cơ chất bị oxy hóa không hoàn toàn sẽ sinh ra axit hoặc hấp thụ ion amonium sẽ làm giảm pH. Ngược lại, sự giải phóng amonium qua sự loại nhóm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH. pH tối ưu cho các loài NS khác nhau từ 3-8 ( Prior, 1992) tùy vào từng chủng . Nhưng đa số NS pH tối thích là 5 - 6,5, một số loài phát triển tốt ở pH 9 [26]. e. Nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh protease. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số NS từ 30-320C [26]. Nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35 - 400C, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở 00C và ở 600C. Nếu nhiệt độ xuống dưới 240C NS phát triển chậm , sinh bào tử yếu, thời gian nuôi cấy dài dẫn đến làm giảm khả năng sinh tổng hợp enzym. Nếu nhiệt độ quá cao có thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym bị ức chế [25]. f. Thời gian Thời gian nuôi cấy NS thu enzym trong khoảng 36-60 giờ. Tùy từng chủng và tùy loại enzym mà thời gian nuôi cấy có thể ngắn hơn hay dài hơn. Đối với A.oryzae và A. awamori nuôi trên MT cám để sản xuất amylase khoảng 36-40 giờ, nhưng nuôi A .oryzae để thu protease khoảng 48 – 52 giờ [25]. 1.3.5 Nuôi cấy và thu nhận enzym từ NS [20] Nuôi cấy Nuôi cấy NS để thu enzym người ta thường dùng MT bán rắn Môi trường bán rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên như: cám, ngô, bột đậu tương,… Môi trường bán rắn hay dùng nhất là cám. Chất lượng cám ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp enzym, muốn nâng cao hoạt tính một số enzym cần thêm vào cám các chất cảm ứng như bột đậu tương giàu protein, bã khoai mì giàu tinh bột, củ cải đường giàu pectin và xelullose,….Ngoài ra, cần bổ sung thêm khoảng 15 – 20% trấu, rơm băm vụn, mùn cưa…để tạo độ xốp.cho MT. Môi trường bán rắn cần được làm ướt tới độ ẩm 60 – 65% rồi đem thanh trùng. Môi trường được tãi mỏng ra các khay đã được thanh trùng với lớp dày khoảng 2-2.5cm hoặc trong các bình tam giác, để nguội tới 300C thì tiến hành cấy giống. Quá trình nuôi cấy NS trên môi trường bán rắn được chia làm 3 thời kì: Khoảng 10-14 giờ đầu bào tử trương nở bắt đầu nảy mầm, thời kì này chưa hình thành enzym Thời kì giữa kéo dài khoảng 14-18 giờ, mốc phát triển nhanh hô hấp mạnh, sợi nấm có thể quan sát thấy bằng mắt thường Thời kì thứ ba kéo dài trong khoảng 10-20 giờ ,thời gian này các quá trình trao đổi chất vẫn tiếp tục nhưng yếu dần việc tạo thành enzym của tế bào vẫn tiếp tục Tùy thuộc vào đặc tính sinh lý của từng chủng NS, thời gian nuôi cấy có thể kết thúc tại điểm mà lượng enzym tạo thành tối đa. Các phương pháp thu nhận enzym [20], [24] * Chiết rút enzym từ MT bán rắn : Nguyên tắc: dựa trên khả năng hòa tan trong nước của các enzym Các bình tam giác đã cấy giống sau khi nuôi đủ thời gian, thu lấy MT đem nghiền mịn bằng cách giã trên cối với sự trợ giúp của cát thạch anh hoặc bột thủy tinh đã được rửa sạch và sấy khô. Cát hay bột thủy tinh làm tăng khả năng phá vỡ tế bào của VSV mà không làm thay đổi bản chất enzym. Sau khi nghiền MT, cho vào đó lượng nước (ở nhiệt độ 25- 28 0C) gấp 4-5 lần khối lượng MT để hòa tan enzym. Để tránh tạp nhiễm nên thêm vào nước một ít focmalin hoặc chất sát trùng khác. Dịch chiết thu được có màu sẫm , khá trong, chứa 10-15% chất khô hoà tan. Tiến hành lọc hoặc quay ly tâm 3000 vòng/ phút /15 phút, thu và bảo quản dịch lọc trong tủ lạnh 40C. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thô. * Thu nhận enzym từ dịch nuôi cấy chìm: Dịch nuôi cấy chìm sau khi lọc sinh khối NS và các tạp chất rắn không tan để thu nhận enzym. Về nguyên tắc tách enzym từ dịch lọc nuôi cấy chìm cũng tương tự như tách từ dịch chiết từ MT bán rắn. Tinh sạch enzym Nguyên tắc: Dung môi hữu cơ vào dung dịch protein sẽ làm giảm hằng số điện ly của dung dịch, kết quả là làm protein mất nước và tạo tủa. Trong dung dịch, protein tồn tại nhờ sự cân bằng giữa các lực tỉnh điện và các tương tác kị nước. Vì thế, khi ta đưa muối vào với nồng độ cao, sự cân bằng trên sẽ bị phá vỡ dẫn đến sự tạo thành tập hợp các protein và tạo tủa. Tiến hành: Tủa với các tác nhân : ethanol 960, acetone, muối sunfatamon bão hòa ở nồng độ thích hợp. Thời gian tủa tùy theo tác nhân tủa, thường trong khoảng 30-45 phút. Đối với ethanol và acetone quá trình tủa phải đảm bảo ở nhiệt độ lạnh. CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1.1 Đối tượng - Caùc chuûng naám sôïi phaân laäp töø caùc maãu ñaát, thaân, laù caây ôû 4 xã RNM Caàn Giờ TP. HCM: Tam Thôn Hiệp, An Thới Đông, Long Hòa, Lý Nhơn - Bột đậu tương ,mua ở chợ Tân Định – TP. HCM - Cám gạo, trấu mua ở Vĩnh Long - Các VSV kiểm định: E.coli, B. subtilis được cung cấp từ viện Pasteur – TP. HCM - Chế phẩm enzym protease của Công ty TNHH dinh dưỡng Á Châu (VN) tỉnh Đồng Nai. 2.1.2 Hóa chất – thiết bị  Hóa chất - Glucose, sorbitol, maltose, sucrose, lactosse, pepton, cazein, kitin, tinh bột tan, agar, cồn. - K2HPO4, KCl, NaCl, NaOH, NaNO3, MgSO47H2O, HgCl2, NH4NO3  Thiết bị, dụng cụ - Các thiết bị: Nồi hấp vô trùng Huxley (Đài Loan) Tủ cấy vô trùng ( Việt Nam) Tủ sấy Memmert (Đức) Tủ ấm Binder (Đức) KHV quang học, máy chụp hình kỷ thuật số Olympus 5.1 (Nhật) Tủ lạnh (National - Nhật) Máy đo pH Hana (Nhật) Máy li tâm Heraeus( Đức) Cân điện tử Scientech ( Mỹ) Máy lắc (Gerhardt - Đức) - Các dụng cụ thí nghiệm: Thước đo khuẩn lạc, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que gạt, que cấy, giấy lọc, lame, lammel, bông mỡ , bông thấm nước…. 2.1.3 Môi trường  MT1: (Czapek) Môi trường phân lập NS [22], [32] NaNO3 3,0g K2HPO4 1,0g MgSO4 0,5g KCl 0,5g FeSO4 0,1g Glucose 20g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT2: Glucose Yeast Agar (YEA) MT nuôi cấy NS [32] Cao nấm men 4g Agar 20g Glucose 20g Nước biển 1000ml pH = 5,5 – 6.0. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT3 thử hoạt tính enzym cellulose [30] NaNO3 3,5g K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 .7H2O 0,01g CMC 10g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT 4: thử họat tính protease [14] K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 .7H2O 0,01g Cazein 10g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT 5: thử hoạt tính amylase [30] NaNO3 3,5g K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 .7H2O 0,01g Tinh bột tan 15g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT6 thử hoạt tính kitinase [16] NaNO3 3,5g K2HPO4 1.5g MgSO4.7H2O 0,5g KCl 0,5g FeSO4 .7H2O 0,01g Bột kitin 10g Agar 20g Nước biển 1000ml pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/30 phút  MT7 :Môi trường nuôi cấy NS tạo enzym protease [16] Cám :70% Trấu :25% Các nguyên liệu chứa chất cảm ứng:(Bột đậu nành ) :5% Độ ẩm môi trường 60-65% Khử trùng 1210C trong 30 phút  MT 8: thử hoạt độ enzym protease [20] Dung dịch NaOH 0,5N Acid trichloacetic 10% Casein 1% (R55) Tyrosine (R57) Thuốc thử Folin- Ciocalteu (R56)  MT9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [21] KH2PO4: 3.3g MgSO4: 0.4g KNO3 : 3g Na2HPO4 : 0.7g Nước biển : 1000ml Dầu DO: 5ml pH = 5.5 -6.0.Khử trùng ở 1atm/30 phút.  MT10 : Meat peptone agar ( MPA): MT nuôi cấy giữ giống VK kiểm định [19] Pepton : 5g NaCl: 5g Cao thịt: 5g Agar : 20g nước cất: 1000ml pH: 7,5. khử trùng 1atm/30 phút  MT11 MT cơ chất cảm ứng MT 11.1 : cám – trấu- đậu nành ( 70% : 5%: 25%) MT11.2 : cám - trấu - bột bắp ( 70% : 5%: 25% 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1.Các phương pháp vi sinh 2.2.1.1 Lấy mẫu Phân lập các chủng NS từ các mẫu lá vàng trên cành (Ký hiệu là L), lá mục (LM), cành khô (CK), cành mục (CM), đất mặt (Đ), đất sâu 5 – 10cm (ĐS) từ RNM Cần Giờ. Tiến hành thu mẫu 3 đợt vào tháng 9, tháng 12 năm 2008 và tháng 3 năm 2009 tại 4 xã Long Hoà, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp huyện Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Cách lấy: Dùng dao kéo vô trùng cắt khoảng 10 g mẫu cho vào túi nilon vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm, ngày tháng lấy mẫu. Các mẫu được bảo quản lạnh và phân lập ngay không quá 24 giờ [32], [37] Với mục đích thu được nhanh các chủng có khả năng sinh protease như mong muốn, chúng tôi chuẩn bị sẵn MT có chất cảm ứng sinh protease ( ghi ở mục 2.1.3) trong bình tam giác đặt ở nhiều vị trí khác nhau như : ở mặt đất, thân cây, cành cây tại RNM Cần Giờ. Sau một tuần thu các bình tam giác lại để phân lập. Hình1.6 Baûn ñoà RNM Caàn Giôø vaø ñòa ñieåm laáy maãu. 2.2.1.2 Phân lập NS theo phương pháp pha loãng mẫu (theo F. Uyenco (1988) [32], [37]. a. Nguyên tắc Tách rời các bào tử NS . Nuôi cấy các BT trên MT dinh dưỡng đặc trưng để cho KL riêng rẽ, cách biệt nhau. b. Tiến hành Cân 10g đất, lá, thân (đã nghiền nhỏ) cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển. Sau đó đưa vào máy nghiền mẫu trong vòng 2 phút, tốc độ 230 vòng/ phút, thu được dịch lọc có độ pha loãng 10-1. Lắc đều rồi hút 1ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loãng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha loãng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5, 10-6. Nhỏ 0,1ml (2giọt) dung dịch ở mỗi nồng độ lên hộp petri có chứa môi trường (MT2). Dùng que trang trải đều khắp trên mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục sang đĩa MT 2 và 3. Sau đó, ủ các đĩa ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Tách các KL riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cuối cùng, cấy giống sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm sinh học của NS [32], [43]. c. Yêu cầu Các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và được kí hiệu để nhận biết. 2.2.1.3 Giữ giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng a. Nguyên tắc: Tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng và phát triển của NS . b. Tiến hành Cho 0,2 ml dầu khoáng (như paraffin lỏng hay vazơlin) vào ống eppendoff, khử trùng bằng cách hấp ở 1210C trong 30 phút, để nguội. Nuôi cấy NS đạt đến độ trưởng thành. Dùng que cấy vô trùng lấy một lượng BT cho vào ống eppendoff, đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống và bảo quản ở điều kiện lạnh 4- 6 0C [32]. 2.2.1.4 Quan sát hình thái NS * Quan sát đại thể NS NS sau khi cấy chuyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo KL khổng lồ theo các bước sau: - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vô trùng. - Dùng que cấy lấy một ít BT của NS từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm trên chứa 5ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chóng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2, 3 hộp. Lưu ý không để điểm chấm loang trên mặt thạch. - Nuôi cấy NS trong tủ ấm 3-7 ngày rồi quan sát.và mô tả các đặc điểm KL: + Hình dạng, kích thước KL. + Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố NS tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL. + Giọt nước đọng, mùi, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL …[5] * Quan sát vi thể NS - Phương pháp cấy khối thạch (J.T.Dunean ) Chuẩn bị MT thích hợp (YEA), đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. Khi thạch đã đông thì dùng dao vô trùng cắt từng mẫu hình vuông, diện tích 1cm2. Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bông (hoặc giấy thấm) nước vô trùng. Đặt khối thạch lên phiến kính. Cấy một ít BT lên bề mặt xung quanh khối thạch. Đậy lá kính lại và cho vào hộp petri có sẵn bông (hoặc giấy thấm) được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày, ở 270C. Sau 3-4 ngày nuôi, khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch. Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần NS trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên ta được tiêu bản để quan sát hình thái NS. Quan sát dưới vật kính 40, 100 và mô tả các đặc điểm: + Giá BTT, thể bình và cuống thể bình. + Sợi nấm có hay không có sự phân nhánh và vách ngăn. + Màu sắc, hình dạng BT, có gai hay không có gai. 2.2.1.5. Hoạt tính enzym ngoại bào của NS [30] a. Nguyên tắc Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu đặc trưng, phần cơ chất bị enzym của NS phân hủy sẽ không tạo màu mà tạo thành vòng trong suốt quanh KL b.Tiến hành  Phương pháp cấy chấm điểm Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT6, MT7, MT8, MT9, MT10. Cấy chấm điểm các chủng NS lên bề mặt MT ( 3 điểm/ hộp) Ủ các hộp petri trên trong tủ ấm 300C trong 3-5 ngày. c. Kiểm tra kết quả Kiểm tra họat tính xellulase, amylase, kitinase. Cả ba loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch: - Nếu NS có hoạt tính xellulase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL do cellulose bị phân giải. Vùng cellulose chưa bị phân giải có màu tím hồng nhạt. - Nếu NS có hoạt tính amylase sẽ tạo vòng trong suốt quanh KL . Vùng tinh bột chưa bị phân giải có màu xanh tím đậm - Nếu NS có hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giả có màu nâu đỏ nhạt Kiểm tra hoạt tính protease : Dùng HgCl2 10% nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu NS sinh ra protease, sẽ có một vòng trong suốt quanh KL do các phân tử protein bị phân giải không còn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải có màu trắng đục do khi phản ứng với HgCl2 protein bị kết tủa. d. Đánh giá khả năng tạo enzym Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d). (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh (D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu 2.2.1.6 Khả năng chịu mặn của NS [6] a. Nguyên tắc Mỗi loài NS thích nghi với nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ muối nó thể hiện khả năng sinh trưởng và hoạt tính protease khác nhau. b. Tiến hành Chuẩn bị MT YEA (MT1), có bổ sung các nồng độ muối NaCl từ 0%, 2%, 3%, 5%, 7%, 10%. Cấy 3 điểm các chủng NS nghiên cứu lên bề mặt các MT nghiên cứu có các nồng độ muối khác nhau. Nuôi trong tủ ấm 3 ngày, ở 280 – 300C. Mẫu đối chứng nuôi trên MT không NaCl. c. Kết quả Dựa vào đường kính KL d (mm) của các chủng NS nghiên cứu để đánh giá ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh trưởng. Thử hoạt tính enzym ngoại bào theo phương pháp 2.2.1.5 ứng với từng nồng độ muối. 2.2.1.7 Khả năng phân giải dầu [21]. Cấy NS trong bình tam giác 100ml có chứa 50ml MT khoáng MT8. Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, sau đó đo sinh khối của NS, sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải của NS. Sau khi nuôi cấy 15 ngày, tiến hành quan sát bình tam giác. Nếu NS sinh trưởng được có nghĩa NS đó có khả năng phân giải dầu, ngược lại NS chết thì NS đó không có khả phân giải dầu. 2.2.1.8. Kiểm tra hoạt tính kháng sinh (Egorov và cộng sự, 1969) [19]. a. Nguyên tắc Nếu VSV trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất kháng sinh thì chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các VSV kiểm định và tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. b. Tiến hành thí nghiệm Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu và các MT thích hợp, không dùng nước biển mà dùng nước cất thay thế. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có chủng NS cần thử hoạt tính kháng sinh. Đặt các khối thạch vào đĩa petri có MT đã cấy VSV kiểm định. c. Kiểm tra kết quả Dùng thước đo đường kính vòng phân giải (D) và đo đường kính KL (d). (D-d)  25mm : hoạt tính rất mạnh; (D-d)  20mm : hoạt tính mạnh (D-d)  10 -19,5mm : hoạt tính trung bình; (D-d)≤ 10mm : hoạt tính yếu 2.2.2 Phương pháp hóa sinh 2.2.2.1 Xác định hoạt độ protease [16] Định nghĩa Hoạt độ của protease được biểu thị là số micromole tyrosine sinh ra do thủy phân casein bởi 1ml dung dịch hay 1mg hỗn hợp chứa protease trong 1 phút ở điều kiện chuẩn ( 35,50C, pH 7.6) Nguyên tắc: Cho protease tác dụng với cơ chất là casein( hoặc hemoglobin), sản phẩm tạo thành là các peptid ngắn hay acid amin, trong các loại acid amin, tyrosine chiếm đa số. Xác định tyrosine bằng phản ứng màu với thuốc thử folin, từ đó xác định hoạt độ protease. Hóa chất: Dung dịch Na2HPO41/15M: hòa tan 5,96g Na2HPO4 . 12H2O trong nước thành 250ml. Dung dịch KH2PO4 1/15M: hòa tan 0,9072g KH2PO4 trong nước thành 100ml. Dung dịch đệm Sorensen 1/15M, pH 7.6: trộn 177mldung dịch Na2HPO41/15M và 23 ml dung dịch KH2PO4 1/15M đo và chỉnh lại pH cho đúng . Dung dịch casein 1%: đun sôi cách thủy 1g casein trong đệm Sorensen đến tan hoàn toàn rồi sau đó định mức bằng Sorensen cho đủ 100ml. Dung dịch TCA (tricloro acid) 10%: hòa tan 10g TCA trong nước cho đủ 100ml. Dung dịch NaOH 0,5N: hòa tan 10g NaOH trong nước cho đủ 500ml. Dung dịch HCl 0,2N: trộn 4,25 ml HCl đậm đặc với nước cho đủ 500ml. Dung dịch tyrosine 20mM/l: khuấy nghiền 0,118g tyrosine trong dịch HCl 0,2N vừa đủ 50ml. Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l: pha loãng 5ml tyrosine 20mM/l trong HCl 0,2N thành 100ml. Tiến hành: Dựng đường chuẩn tyrosine: Ống nghiệm 0 1 2 3 4 5 Dung dịch tyrosine chuẩn 1mM/l 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Dung dịch HCl 0,2N 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 Dung dịch NaOH 0,5N 2 2 2 2 2 2 Thuốc thử folin (ml) 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 0.6 Lượng tyrosine (micromole) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 Lắc và để yên 10 phút đem đo mật độ quang ở bước sóng 660 nm. Vẽ đồ thị biểu diễn sự biến thiên mật độ quang (∆ OD) theo lượng tyrosine ở các ống. Xác định lượng tyrosine trong dung dịch nghiên cứu: Dung dịch hóa chất Ống nghiệm Thử thật (3 ống) Thử không (3 ống) Casein 1%(ml) 5 5 TCA 10%(ml) 0 5 Dịch enzym mẫu (ml) 1 0 Lắc đều và giữ ở 35,50C trong 30 phút. TCA 10%(ml) 5 0 Dịch enzym mẫu (ml) 0 1 Lọc, lấy 1ml dịch lọc thực hiện phản ứng màu Dịch lọc (ml) 1 1 Dung dịch NaOH 0,5N (ml) 2 2 Thuốc thử folin 0.6 0.6 Lắc đều và để 10 phút, đo OD ở bước sóng 660 nm Cách tính: Hoạt độ protease: Hoặc HT (UI) = mvT KVX .. .. (UI/g) X: số µ mol tyrosine suy ra từ đường chuẩn V: tổng thể tích hỗn hợp phản ứng (11ml) v: thể tích lọc đem phân tích (1ml) K: độ pha loãng mẫu T: thời gian phản ứng (phút) m: Khối lượng mẫu enzim đem xác định hoạt tính (g) 1UI (Anson) = 1 micromol tyrosine/ml/ phút hoặc = 1 micromol tyrosine / g /phút 2.2.2.2 Phân loại NS bằng Di truyền phân tử Nguyên tắc Nguyên tắc của phương pháp PCR là khuếch đại 1 trình tự gen lên nhiều lần bằng một cặp._.m trên 60% vi khuẩn dễ phát triển, dễ gây tạp nhiễm, khó thông khí. Đặc biệt ở độ ẩm 75%, MT bị bết lại vì quá nhiều nước làm NS sinh trưởng rất yếu nên hoạt độ enzym giảm rất mạnh còn độ ẩm là 45 - 50 % thì MT quá khô, NS sinh bào tử mạnh và làm giảm hoạt tính của enzym tạo thành. Như vậy để chủng A. oryzae có hoạt độ protease cao ta nên nuôi ở MT có độ ẩm 55%. Kết quả phù hợp với nghiên cứu của Lê Thị Cẩm Tú (2003) , Nguyễn Thị Lan Hương ( 2009) độ ẩm thích hợp cho sự tạo enzym của A. oryzae là 55%. H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) 0 0.5 1 1.5 45 50 55 60 65 70 Độ ẩm (%) Đồ thị 3.7 Ảnh hưởng của độ ẩm lên sự tạo enzym protease của A.oryzae Dưới đây là bảng tổng hợp các điều kiện tối ưu cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae Bảng 3.19: Tổng hợp các điều kiện thích MT hợp cho quá trình tổng hợp protease của chủng A.oryzae Các yếu tố khảo sát Các điều kiện thích hợp Hoạt độ (UI/ml) H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) 3.4.3. Động thái quá trình sinh tổng hợp protease của A.oryzae Tiến hành nuôi cấy chủng A.oryzae ở những điều kiện thích hợp đã khảo sát ở trên và nghiên cứu động thái quá trình sinh tổng hợp protease với 3 thông số pH, nhiệt độ và hoạt độ của enzym tại các thời điểm 24h, 36h, 48h, 60h, 72h. Kết quả trình bày ở bảng sau: Bảng 3.20 Kết quả động thái quá trình sinh tổng hợp protease Thời gian (giờ) Các giá trị Nhiệt độ(0C) pH Hoạt độ (UI/ml) 0 30 6.5 0 24 30.5 6.6 0.511 36 34 6.8 0.876 48 33 7.2 1.391 60 32 8.1 1.332 72 31 7.4 0.983 Kết quả bảng 3.20 cho thấy tại thời điểm 48 đến 60 giờ, chủng A.oryzae cho hoạt độ protease có giá trị cao hơn hẳn so với các thời điểm khác. Đây chính là thời điểm thích hợp để thu enzym. Tương ứng với sự tăng hoạt độ enzym, pH của MT cũng tăng theo. Sau các thời điểm này thì hoạt độ enzym giảm rõ rệt. Tuy nhiên, theo thời gian pH ngày càng tăng. Điều này có thể giải thích do MT nuôi cấy sử dụng nguồn bột đậu nành bổ sung đã làm MT ngày càng chuyển sang trung tính, hơi ngã sang kiềm. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả nghiên cứu của Fenikxova, Silova ( 1960 ). Nhiệt độ của mẫu nuôi cấy cũng tăng theo thời gian, nhiệt độ tăng nhanh khoảng 24 -36 giờ đầu lúc này A.oryze sinh trưởng mạnh và bắt đầu tổng hợp enzym, sau 40 giờ nuôi cấy thì nhiệt độ giảm dần do A.oryze sinh trưởng chậm lại MT nuôi cấy (%) Cám : trấu : đậu nành tỉ lệ 70: 25: 5 1.277 pH 7.0 1.257 Nhiệt độ (0C) 35 1.214 Thời gian (h) 48 1.391 Độ mặn (%) 3 1.416 Độ ẩm (%) 55 1.282 Như vậy qua đồ thị động thái quá trình sinh tổng hợp proteae của chủng nghiên cứu cho thấy có sự tương quan thuận giữa hoạt độ protease với nhiệt độ và pH của MT. Đồ thị này khẳng định một lần nữa là thời gian thích hợp nhất để thu protease trong khoảng 48 – 60h, tốt nhất ở 48h. Kết quả này hoàn toàn thống nhất với kết quả khảo sát trong phần 3.4.2 (tr 66) của chúng tôi. Đồ thị 3.8 Động thái quá trình sinh tổng hợp protease của A.oryzae Tổng hợp kết quả trong phần 3.4.1 và 3.4.2 trong bảng sau Điều kiện nuôi cấy Sinh trưởng Sinh tổng hợp protease Nguồn cacbon (%) Glucose Cám gạo Nguồn nitơ (g) Bột đậu nành Bột đậu nành Nhiệt độ (0C) 30 35 Độ ẩm (%) 55 55 pH 6,5 7,0 Độ mặn (%) 3 3 Thời gian (h) 48-60 48 3.4.4 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học khác của chủng A.oryzae a. Hoạt tính enzym ngoại bào Tiến hành theo phương pháp ở mục 2.2.1.5 để kiểm tra xem A.oryzae ngoài sinh protease ra còn có khả năng sinh các loại enzym ngoại bào khác nữa hay không. Kết quả trình bày ở bảng 3.21 Bảng 3.21 Hoạt tính enzym ngoại bào của chủng A.oryzae Chủng Hoạt tính enzym ngoại bào (D-d), mm Protease Cellulase Amylase Kitinase A.oryzae 26 18 8 19 Kết quả ở bảng 3.21. cho thấy chủng A.oryzae có khả năng sinh một số loại enzym ngoại bào khá cao. Các enzym trên đều là những enzym thủy phân giữ vai trò chủ đạo trong việc phân giải các chất hữu cơ trong tự nhiên. Các enzym này giúp NS dễ dàng phân giải nguồn cơ chất tự nhiên ở RNM Cần Giờ như xác động vật gồm các loài giáp xác, vỏ tôm cua đặc biệt là thảm TV, cung cấp nguồn nguyên liệu cho quá trình sống của chúng. Điều này cũng nhấn mạnh hơn nữa vai trò quan trọng của hệ NS đối với hệ sinh thái Cần Giờ. Hình 3.3 Hoạt tính protease Hình 3.4 Hoạt tính amylase Hình 3.5 Hoạt tính cellulase Hình 3.6 Hoạt tính kitinase b. Khả năng phân giải dầu Tiến hành thí nghiệm theo phương pháp ở mục 2.2.1.7. Cấy chủng A.oryzae trong bình tam giác 100ml có chứa 50ml MT khoáng MT8. Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh ở nhiệt độ phòng, sau đó quan sát sự sinh trưởng của A.oryzae, sự phân bố các giọt dầu và mùi dầu để đánh giá khả năng phân giải dầu của A.oryzae. Kết quả trình bày ở bảng 3.22 Bảng 3.22 Khả năng phân giải dầu của A.oryzae Chủng A.oryzae Khả năng phân giải dầu mg/ml 0 Từ kết quả trên cho thấy A.oryzae không có khả năng phân giải dầu, đây là một đặc tính quí nếu có sẽ góp phần làm sạch MT c. Hoạt tính đối kháng với VK kiểm định. Tiến hành theo phương pháp ở mục 2.2.1.8 nhằm khảo sát chủng A.oryzae có khả năng đối kháng với một số VK kiểm định hay không. Kết quả trình bày ở bảng 3.23 Bảng 3.23 Hoạt tính đối kháng của A.oryzae Chủng A.oryzae E.coli (D-d), mm B. subtillis (D-d), mm 0 9 Kết quả bảng 3.23 cho thấy A.oryzae chỉ có khả năng đối kháng được với VK gram dương (B. subtillis ) nhưng ở mức độ yếu và không đối kháng được với VK gram âm. Hình 3.7 Khả năng đối kháng với B. subtillis của chủng A.oryzae 3.4.5 Khảo sát một số đặc tính của enzym thô từ chuûng A.oryzae a. Thu nhận protease thô Sau khi nuôi chuûng A.oryzae trên MT ở các điều kiện thích hợp để sinh protease cao nhất , tiến hành thu enzym theo phương pháp ở mục 2.2.3 với các tác nhân tủa khác nhau. Kết quả trình bày ở bảng sau: Bảng 3.24 Thu nhận protease bằng các tác nhân tủa Tác nhân tủa Ethanol 960 Acetone (NH4)2SO4 Enzym/ DM (v/v) Hiệu suất thu nhận Enzym/ DM (v/v) Hiệu suất thu nhận Nồng độ Hiệu suất thu nhận 1:3 3.2g/100ml 1:2 2.9g/100ml 70% 2.7g/100ml Tiến hành thí nghiệm khảo sát với 0,1g chế phẩm protease thu được theo từng tác nhân tủa hòa tan trong 150ml nước cất. Đo hoạt độ protease bằng phương pháp Anson thu được kết quả như bảng sau: Bảng 3.25 Hoạt độ protease thô theo tác nhân tủa khác nhau Tác nhân tủa Hoạt độ protease (UI/g) Ethanol 960 1892,0 Acetone 1589.5 (NH4)2SO4 1254,0 Kết quả trên cho thấy sử dụng tác nhân tủa là ethanol 960 cho hiệu suất tủa cao nhất và đồng thời hoạt độ của enzym cũng được giữ lại cao nhất. Vì vậy trong các thí nghiệm sau chúng tôi sử dụng cồn ethanol 960 làm tác nhân tủa để nghiên cứu các tính chất của enzym thô. b. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của chế phẩm protease thô Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng NS ở các điều kiện MT tối ưu như trên để thu được protease có hoạt độ cao nhất sau đó đo hoạt độ protease ở các nhiệt độ khác nhau: 300C, 400C, 500C, 600C, 700C, 800C theo phương pháp Anson. Bảng 3.26 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của chế phẩm protease thô Nhiệt độ (0C) 30 40 50 60 70 80 Hoạt độ protease của CP enzym thô (UI/ml) 0.912 1.312 0.815 0.803 0.427 0.064 Kết quả thu được ở bảng 3.26 cho thấy, protease hoạt động mạnh trong khoảng 30 đến 60oC. Hoạt động protease đạt giá trị cao nhất ở 40oC , kết quả này phù hợp với những công bố của Amos (1965), Liphsis và Bragnitsenko (1977) và Ashok Pandey và cộng sự (2000) về nhiệt độ tối thích cho sự hoạt động của protease thu từ NS. Đây cũng là thuận lợi để sử dụng enzym của chủng này trong việc bổ sung vào thức ăn chăn nuôi. Đồ thị 3.9 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động của chế phẩm protease c. Độ bền nhiệt của protease thô. Nuôi cấy chủng NS ở điều kiện tối ưu. Dịch enzym thu được xử lý ở các nhiệt độ 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 1000C, sau đó đo hoạt độ protease so với đối chứng 40C để khảo sát độ bền của enzym với nhiệt độ. Bảng 3.27. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của protease thô Nhiệt độ (oC) ĐC (4oC) 30 40 50 60 70 80 90 100 Hoạt độ protease còn lại (%) 100 100 99.1 83.5 77.6 62.1 18.9 9.8 0.0 Qua bảng 3.27 chúng ta thấy, nhiệt độ càng tăng cao thì hoạt tính protease càng giảm, đến 100oC thì enzym bị bất hoạt hoàn toàn. Hoạt tính protease của chủng vẫn cao nhất ở khoảng 30 đến 70oC, nhưng giảm mạnh từ khoảng 70, 80oC trở đi Qua đây, chúng ta thấy độ bền nhiệt của chủng với nhiệt độ cũng khá cao, phù hợp với nhận định của tác giả Nguyễn Đức Lượng là enzyme này thường bất hoạt từ 70oC trở đi [16]. Độ bền với nhiệt độ của protease thu được từ chủng NS này là ưu điểm cho việc sản xuất và nhất là ứng dụng trong bổ sung chế phẩm enzym vào thức ăn chăn nuôi (thường được ủ ở nhiệt độ cao trong nhiều giờ). 0 0.5 1 1.5 30 40 50 60 70 80 Nhieät ñoä (oC) H o a ït ñ o ä p ro te a se ( U I/ m l) Đồ thị 3.10 : Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của chế phẩm protease d. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt động của chế phẩm protease Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng NS ở các điều kiện MT tối ưu như trên để thu được protease có hoạt độ cao nhất sau đó đo hoạt độ protease theo phương pháp Anson. ở các thời gian khác nhau:10’, 20’,30’, 40’, 50’, 60’, 70’, 80’, 90’, 100’. Kết quả trình bày ở bảng sau: Bảng 3.28 Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt động của chế phẩm protease thô Thời gian (phút ) 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Hoạt độ protease UI/ml 1.002 1.523 1.686 1.733 1.740 1.762 1.760 1.760 1.754 1.753 Chủng A. oryzae có hoạt độ protease tăng nhanh từ 10 đến 30 phút và sau đó ổn định từ 40- 100 phút. Điều này cho thấy, protease của chủng NS này khá bền theo thời gian và có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. Đồ thị 3.11: Ảnh hưởng của thời gian hoạt động của chế phẩm protease e Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của chế phẩm protease Chúng tôi tiến hành nuôi cấy chủng NS ở các điều kiện MT tối ưu như trên để thu được protease có hoạt độ cao nhất sau đó đo hoạt độ protease ở các pH khác nhau : 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, 7.0, 7.5 theo phương pháp Anson. Kết quả trình bày ở bảng sau Bảng 3.29 Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của chế phẩm protease pH 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 H o ạt đ ộ pr o te as e (U I/ m l) Hoạt độ protease (UI/ml ) 0.721 0.865 1.124 1.246 1.337 0.850 Bảng 3.29 cho thấy protease của chủng hoạt động mạnh ở pH axit hơi ngã sang trung tính. Hoạt động enzym tăng mạnh từ pH 6.0 đến 7.0, sau đó giảm dần ở pH =7.0 – 7.5. Kết quả này cũng phù hợp với nhận định của Nguyễn Đức Lượng [16] khi cho rằng pH tối thích cho hoạt động của protease NS là 5.5 đến 7.5. Đồ thị 3.12:Ảnh hưởng của pH đến hoạt động của chế phẩm protease Kết luận. Protease của A.oryzae hoạt động mạnh ở nhiệt độ 400C, pH tối thích là 7.0. Độ bền với thời gian của protease thu được từ chủng A.oryzae là 60 phút. Với các giá trị này thì chế phẩm protease của chủng A.oryzae có tiềm năng ứng dụng trong sản xuất công nghiệp. 3.4.6 So sánh hoạt độ protease của chủng A.oryzae với chế phẩm protease trên thị trường. Chế phẩm protease trên thị trường mà chúng tôi sử dụng để so sánh là enzym của Công ty TNHH dinh dưỡng Á Châu ( VN), địa chỉ: xã Bắc Sơn - huyện Thống Nhất - tỉnh Đồng Nai. Đây là loại chế phẩm enzym đang được sử dụng rộng rãi để bổ sung vào các sản phẩm thức ăn chăn nuôi. Tiến hành khảo sát với 0,1g chế phẩm protease mỗi loại hòa tan trong 150ml nước cất. Đo hoạt độ protease bằng phương pháp Anson thu được kết quả như bảng sau. Bảng 3.30 So sánh hoạt độ protease của A.oryzae với chế phẩm protease trên thị trường Loại enzym Hoạt độ (UI/g) Protease của chủng A.oryzae 1686.5 Protease trên thị trường 2458.5 H o ạt đ ộ p ro te as e( U I/ m l) Từ kết quả trên cho thấy protease của chủng A.oryzae phân lập từ RNM Cần Giờ khá tốt nhưng thấp hơn 1-2 lần chế phẩm protease trên thị trường. Điều này cũng dễ hiểu bởi vì chế phẩm enzym chuẩn dùng để so sánh đều là những enzym được thu được từ các chủng VSV có chọn lọc, gây đột biến và là enzym được sản xuất theo quy trình công nghệ nhằm bảo đảm hoạt tính enzym không bị giảm nhiều sau quá trình sản xuất. Ngoài ra, đây cũng là những chế phẩm dưới dạng cô đặc nên hoạt tính cũng tăng lên nhiều KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN: Từ những kết quả trên, chúng tôi đưa ra một số kết luận sau: 1. Phân lập được 333 chủng NS khác nhau từ 4 xã RNM Cần Giờ 2. Xác định được 222/333 chủng có enzym protease chiếm 66.7% trong đó chủng mạnh: 2/222 chiếm 0.9%, khá mạnh: 9/222 chiếm 4.05%, trung bình: 53/222 chiếm 23.9%, yếu: 158/222 chiếm 71.15% Tuyển chọn một chủng có hoạt độ protease cao nhất là: C-Ư 68 (UI = 1.259) nghiên cứu tiếp 3. Kết quả định danh bằng phương pháp phân loại truyền thống kết hợp với phương pháp định danh bằng Di truyền phân tử cho thấy chủng C-Ư 68 thuộc loài Aspergillus oryzae 4. Đã xác định được điều kiện MT tối ưu cho chủng A.oryzae Sinh trưởng như sau: Nguồn Cacbon (g): glucose Nguồn Nitơ (g): bột đậu nành pH: 6.5 Nhiệt độ (0C): 30 Thời gian(giờ): 48-72 Độ mặn (%): 3 Sinh tổng hợp protease như sau: MT 5 có thành phần cám : trấu: bột đậu nành với tỉ lệ (%) 70 : 25: 5 pH: 7.0 Nhiệt độ (0C): 35 Thời gian( giờ): 48 Độ mặn (%): 3 Độ ẩm (%): 55 5. Chủng A. oryzae có khả năng sinh được 4 loại enzym ngoại bào là protease (mạnh), amylase (yếu ), cellulase và kitinase ( khá mạnh) . Ngoài ra Asperillus. oryzae còn có khả năng đối kháng với VK gram dương là B.subtilus. và không kháng được VK gram âm. 6. Để thu nhận chế phẩm enzym thô có thể dùng tác nhân tủa là Ethanol 960 Chế phẩm protease thô thu được từ chủng A. oryzae có độ bền ở nhiệt độ 30 - 40oC , độ bền về thời gian là 60 phút và pH = 7.0 . 7. So sánh hoạt độ protease của chủng A.oryzae với chế phẩm protease của Công ty TNHH dinh dưỡng Á Châu cho thấy hoạt độ của chủng A.oryzae đạt mức khá mạnh nhưng thấp hơn so với chế phẩm protease của Công ty TNHH dinh dưỡng Á Châu 1-2 lần. Loại enzym Hoạt độ (UI/g) Protease của nấm A.oryzae 1686.5 Protease trên thị trường 2458.5 ĐỀ NGHỊ Để có thể sớm đưa chủng này vào ứng dụng trong thực tiễn, tôi thấy cần được tiếp tục nghiên cứu các chỉ tiêu sau:  Khảo sát sâu các điều kiện tối ưu cho khả năng sinh tổng hợp enzym protease ở qui mô lớn hơn.  Bước đầu thử nghiệm chế phẩm trong việc xử lý trùn quế bổ sung vào thức ăn cho gia súc, gia cầm. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tieáng Vieät 1. Khưu Phương Yến Anh ( 2007), Nghiên cứu khả năng sinh enzym xellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trường ĐHSP Thành phố HCM 2. Kieàu Höõu Aûnh (1999),Giaùo t rình vi sinh vaät hoïc coâng nghie äp, NXB Khoa hoïc vaø Kyû thuaät Haø Noäi, trang 15-21 3. Nguyễn Ngọc Ân, Nguyễn Đình Cương, Nguyễn Đình Quý (1998), Hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ và biện pháp quản lí, phát triển ,NXB Nông nghiệp Tp. Hồ Chí Minh 4. Trần Văn Ba, Phan Nguyên Hồng, Hoàng Thị Sản, Lê Thị Trễ, Nguyễn Hoàng Trí, Mai Sĩ Tuấn, Lê Xuân Tuấn (1997), Vai trò của rừng ngập mặn mặn Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 78-96 5. Nguyễn Thị Kim Cúc(2001), Đánh giá hoạt tính CMCaza của một số chủng vi sinh vật phân hủy xellulose, Tạp chí sinh học, tháng 3 năm 2001, trang 37-43 6. Nguyeãn Laân Duõng, Phaïm Thò Traân Chaâu, Nguyeãn Thanh Hieàn, Leâ Ñình Löông, Ñoaøn Xuaân Möôïu, Phaïm Vaên Ty (1978),Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu vi sinh hoïc (taäp 3) , NXB Khoa hoïc vaø Kyû thuaät Haø Noäi, trang 22-36 7. Nguyeãn Laân Duõng, Nguyeãn Ñình Quyeán, Phaïm Vaên Ty(2000), Vi sinh vaät hoïc (tập 1,2) NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp Hà Nội, trang 5-16 8. Nguyeãn Thaønh Ñaït(2005 ) Cô sôû sinh hoïc vi sinh vaät- taäp 2, NXB Ñaïi hoïc Sö phaïm, trang 28-31 9. Nguyeãn Thaønh Ñaït (chuû bieân), Mai Thò Haèng (2000), Sinh hoïc vi sinh vaät NXB Giaùo duïc, trang 17-22 10. Bùi Xuân Đồng (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, NXB Khoa hoïc kyõ thuaät Haø Noäi, trang 154-160, 184 -198 11. Nguyễn Vĩnh Hà, Mai Thị Hằng (2002), Khả năng diệt côn trùng của một số nấm sợi trong vùng rừng ngập mặn Giao thủy, Tổ CNSH-VS, Khoa Sinh –KTNN, Đại học Sư phạm Hà Nội 12. Mai Thị Hằng, Phan Nguyên Hồng (2002), Đánh giá vai trò của vi sinh vật trong hệ sinh thái Rừng ngập mặn, Trường ĐH Sư Phạm Hà Nội, trang 8-24, 101-128. 13. Nguyễn Thị Hiên (2005), Nghiên cứu phân loại các chủng thuộc chi Penicillium phân lập từ RNM Nam Định, Thái Bình, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP Hà Nội, tr 5 – 15 14. Phan Nguyên Hồng (1994),” Nguyên nhân và Hậu quả của sự suy giảm tài nguyên môi trường RNM ở Việt Nam”, Hội thảo Quốc gia: Trồng và phục hồi Rừng ngập mặn ở Việt Nam- Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh, 06-08/08-1994, trang 24-39. 15. Nguyễn Thị Lan Hương ( 2009), Phân lập, tuyển chọn một số chủng nấm sợi sinh amylase cao từ RNM Cần Giờ. Luận văn Thạc sĩ Sinh học Trường ĐHSP Thành phố HCM 16. Nguyeãn Ñöùc Löôïng (2003), Thí nghiệm công nghệ sinh học tập 2, NXB ĐHQG Tp. Hồ Chí Minh, trang 108-116, 335-339 17. Löông Ñöùc Phaåm (2006) Coâng ng heä sinh hoïc t rong baûo quaûn v aø cheá bieán thöïc phaåm , NXB Haø Noäi , trang 262-277 18. Trần Thạnh Phong (2004), Khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên môi trường lên men bán rắn . Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHKHTN – TP.HCM 19. Phan Thanh Phương (2007), Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP, Tp Hồ Chí Minh, tr 90,91. 20. Nguyễn Xuân Thành, Nguyễn Bá Hiên, Hoàng Hải, Vũ Thị Hoan (2005), Giáo trình VSV học công nghiệp, NXB Giáo dục, trang 33-37. 21. Lưu Thị Bích Thảo,Nguyễn Quang Huy, Cù Việt Nga, Đặng Thị Cẩm Hà (2001), Khả năng phân giải Phenantrenen của ba chủng NS phân lập được tại một số vùng dầu bị ô nhiễm, Tạp chí Sinh học. 22. Phạm Thị Thanh Thuý (2007), Nghiên cứu khả năng phân giải Carbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ Chí Minh, tr 85,86. 23. Trần Thanh Thuỷ (1998), Hướng dẫn thực hành VSV học, NXB Giáo dục. trang 54,70,71,85,168-172. 24. Nguyễn Hoàng Trí, Phan Nguyên Hồng (1995), “ Rừng ngập mặn Việt Nam, con người và HST phát triển bền vững”, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 189-204. 25. Nguyễn Hoàng Trí (1999), Sinh thái học Rừng ngập mặn, NXB Nông nghiệp Hà Nội, trang 21-37, 128-138. 26. Lê Đức Tuấn (2006), Nghiên cứu sinh thái nhân văn khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh, Luận án Tiến sĩ Trường ĐH Khoa Học tự nhiên, trang 47-68. 27. Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang 6-17. 28. Lê Ngọc Tú, La Văn Chứ, Phạm Trân Châu, Nguyễn Lân Dũng(1982), Enzym vi sinh vật tập 2, NXB- KHKT Hà Nội 29. Lê Thị Cẩm Tú (2003), Chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải protêin cao và chịu mặn . Luận văn thạc sĩ sinh học Trường Đại học KHTN – TP.HCM 30.Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật môi trường, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, trang 57-63. 31. Võ Thị Bích Viên( 2009) Khảo sát đặc điểm sinh học một số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium từ Rừng ngập mặn Cần Giờ, Thành phố Hồ Chí Minh”. Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐHSP Tp Hồ Chí Minh Tiếng Anh 32. A.D.Agate C.V. Subramania M. Vannucci (1988), Mangrove microbiology, UNDP/UNESCO Regional Project RAS/86/1988, pp 9-18 33. Hawksworth DL (2006). “The fungal dimensi on of biodiversity: magnitude, significance, and conservation”. Mycol. Res. 95, pp 641–655. 34. Mueller G.M., Schmit J.P. (2006). “Fungal biodiversity: what do we know? What can we predict?”. Biodivers Conserv 16, pp 4 35. Katsuhiko Ando, (2002), Identification of Fungi Imperfecti, NITE Biological Resource Center National Intitute of Technology and Evaluation. 36. Dr. N. Rajendran - Research Officer Dr. S. Baskara Sanjeevi - Research Assistant, (2002), “ Mangroves of India” Environmental information system centre pp18 – 22. Trang Web 37. và Nguyễn Lân Dũng , Nguyễn Liên Hoa, Lê Hoàng Yến, Đào Thị Lương –000 38. 39. 40. 41. 42.. 43. 44. 45. 46. http: //www.cbs.knaw.nl (Ủy ban Quốc tế về Aspergillus và Penicillium) PHỤ LỤC Phụ lục 1: Kí hiệu 333 chủng nấm sợi phân lập được từ RNM Cần Giờ. Địa điểm lấy mẫu Kí hiệu chủng Đất mặt 45 chủng Đ238, Đ239, Đ242, Đ272, Đ267, Đ240, Đ246, Đ24, Đ244, Đ279, Đ48, Đ269, Đ7, Đ100, Đ11, Đ10, Đ273, Đ2, Đ9, Đ4, Đ234, Đ274, Đ275, Đ271, Đ277, Đ247, Đ34, Đ237, Đ49, Đ279, Đ241, Đ270, Đ4.1, Đ6, Đ5, Đ3, Đ8, Đ235, Đ39, Đ243, Đ249, Đ248, Đ276, Đ268, Đ151 Đất sâu 10cm 21 chủng ĐS77, ĐS79, ĐS266, ĐS253, ĐS253.1, ĐS46, ĐS46.1, ĐS1, ĐS255, ĐS256, ĐS256.1, ĐS260, ĐS262, ĐS263, ĐS265, ĐS258, ĐS259, ĐS267, ĐS261, ĐS262, ĐS43 Lá vàng 25 chủng L6, L90, L72, L67, L89, L91, L66, L74, L60, L76, L83, L90.1, L67.1, L3, L69, L63, L77, L95, L87, L63.1, L94, L71, L60.1, L64, L349 Lá mục 50 chủng LM122, LM108, LM120, LM122.1, LM138, LM125, LM89, LM131, LM136, LM137, LM191, LM117, LM1, LM110, LM61, LM204, LM112, LM1.1, LM109, LM105, LM78, LM132, LM44, LM86, LM75, LM118, LM78.1, LM27, LM115, LM11, LM99, LM130, LM113, LM124, LM102, LM96, LM123, LM58, LM106, LM139, LM48, LM49, LM155, LM129, LM116, LM43, LM101, LM111, LM29, LM78.1 Thân khô 31chủng TK146, TK147, TK144, TK141, TK1, TK2, TK145,TK143, TK344,TK53, TK140, TK142, TK145,TK208, TK195, TK43, TK30, TK216, TK192, TK229, TK172 Thân mục 70 chủng TM196, TM198, TM162, TM153, TM186, TM200, TM221, TM161, TM165, TM179, TM120, TM212, TM135, TM232, TM228, TM214, TM342, TM217, TM215, TM221, TM150, , TM1, TM53, TM201, TM174, TM197, TM207, TM178, TM167, TM151,TM164, TM187, TM169, TM149, TM160, TM163, TM158, TM189, TM156, TM209, TM45, TM20, TM142, TM179, TM312, TM211, TM302, TM210, TM193, TM21, TM231, TM202, TM61, TM140, TM226, TM218, TM223, TM152, TM225, TM45, TM222, TM333, TM213, TM203, TM230, TM1.5, TM179, TM37, TM168, TM184, MT có chất cảm ứng 101 chủng C-Ư16, C-Ư16.2, C-Ư9, C-Ư25.1, C-Ư13, C-Ư20.1, C-Ư32, C-Ư3, C-Ư20, C-Ư24.1, C-Ư1, C-Ư56, C-Ư68, C-Ư36.1, C-Ư23, C-Ư8, C-Ư20.2, C- Ư16.1, C-Ư24.1, C-Ư25.2, C-Ư29, C-Ư41, C-Ư45, C-Ư70, C-Ư35.1, C- Ư44, C-Ư50, C-Ư63, C-Ư35, C-Ư39, C-Ư29.2, C-Ư15, C-Ư14.1, C-Ư14, C-Ư12, C-Ư7, C-Ư3, C-Ư29.1, C-Ư33, C-Ư4, C-Ư6, C-Ư31, C-Ư11, C- Ư17,C-Ư18, C-Ư5.1, C-Ư90, C-Ư81, C-Ư89, C-Ư83, C-Ư82, C-Ư85, C- Ư88, C-Ư84, C-Ư80, C-Ư86, C-Ư87, C-Ư34.2, C-Ư44, C-Ư42, C-Ư57, C- Ư45, C-Ư54, C-Ư38, C-Ư53, C-Ư34.3, C-Ư48, C-Ư40, C-Ư41, C-Ư66, C- Ư62, C-Ư52, C-Ư34, C-Ư59, C-Ư64, C-Ư60, C-Ư71, C-Ư72, C-Ư75, C- Ư61, C-Ư36, C-Ư47, C-Ư46, C-Ư37, C-Ư5.2, C-Ư69, C-Ư74, C-Ư73, C- Ư51, C-Ư58, C-Ư25.1, C-Ư70.1, C-Ư43, C-Ư21, C-Ư19, C-Ư27, C-Ư28, C-Ư67, C-Ư10, C-Ư30, C-Ư2 Phụ lục 2: Tương quan hàm lượng tyrosine (mg/ml) và độ hấp thụ Hàm lượng tyrosine OD Số lần đo 0 0 0 0.2 0.244 0.240 0.247 0.246 0.4 0.543 0.540 0.546 0.542 0.6 0.868 0.867 0.861 0.872 0.8 1.256 1.265 1.250 1.251 1.0 1.690 1.72 1.74 1.60 Dựng đường chuẩn tyrosine Ống nghiệm 1 2 3 4 5 6 Lượng tyrosine (micromole) 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 OD 0 0.244 0.543 0.868 1.256 1.690 Đường chuẩn tyosine là đường thẳng y=ax ( với 0x1mol/ml) x y a = y/x 0.2 0.244 1.22 0.4 0.543 1.36 0.6 0.868 1.45 0.8 1.256 1.57 1.0 1.690 1.69 Ta chọn giá trị gần đúng của a là giá trị trung bình cộng của các giá trị a . a = (1.22 + 1.36 + 1.45 + 1.57 + 1.69)/5 = 1.458 Vậy y= 1.46 x là đường chuẩn tyosine Sau đây là các giá trị x, y của biểu đồ. x 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 y 0 0.244 0.543 0.868 1.256 1.690 Phụ lục 3: Hàm lượng Tyrosine được tạo thành của 6 chủng nấm sợi STT Chủng Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 1 TM217 0.360 0.525 0.510 0.550 0.515 0.88 2 Đ238 0.438 0.640 0.630 0.650 0.638 1.071 3 C-Ư68 0.515 0.753 0.701 0.773 0.786 1.259 4 C-Ư32 0.389 0.569 0.577 0.567 0.562 0.951 5 C-Ư46 0.287 0.419 0.503 0.429 0.325 0.702 0 0.5 1 1.5 2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 y= 0.7377 R2= 0.9923 Đồ thị : Đường chuẩn Tyrosine 6 CƯ25.1 0.241 0.352 0.317 0.437 0.301 0.589 Phụ lục 4: Ảnh hưởng nguồn Cacbon đến khả năng sinh protease của A. oryzea MT Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) MT1 0.405 0.590 0.564 0.641 0.559 0,989 MT2 0.446 0.650 0.677 0.617 0.658 1.089 MT3 0.480 0.70 0.724 0.699 0.668 1.173 MT4 0.502 0.733 0.745 0.725 0.728 1.223 MT5 0.522 0.762 0.789 0.763 0.736 1.277 Phụ lục 5: Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng sinh protease của A. oryzea Phụ lục 7: Ảnh hưởng của pH đến khả năng sinh enzym protease của A. oryzea pH Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) Thời gian(h) Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 24 0.336 0.490 0.486 0.496 0.487 0.821 36 0.364 0.531 0.536 0.515 0.541 0.890 48 0.569 0.830 0.825 0.836 0.829 1.391 60 0.511 0.745 0.740 0.736 0.758 1.249 72 0.471 0.687 0.682 0.685 0.693 1.152 pH=5 0.412 0.601 0.589 0.616 0.597 1.007 pH=5.5 0.428 0.625 0.615 0.638 0.622 1.046 pH=6 0.486 0.709 0.675 0.684 0.725 1.188 pH=6.5 0.566 0.866 0.841 0.811 0.832 1.383 pH=7 0.476 0.695 0.724 0.699 0.705 1.163 pH=7.5 0.405 0.590 0.564 0.641 0.559 0.99 pH=8 0.401 0.585 0.545 0.643 0.567 0.98 Phụ lục 8: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng sinh enzym protease của A. oryzea Nhiệt độ Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 200C 0.287 0.419 0.503 0.429 0.325 0.701 250C 0.303 0.442 0.434 0.452 0.439 0.740 300C 0.446 0.650 0.677 0.617 0.658 1.090 350C 0.496 0.742 0.740 0.751 0.736 1.212 400C 0.348 0.508 0.506 0.515 0.504 0.850 450C 0.241 0.352 0.317 0.437 0.301 0.589 500C 0.063 0.092 0.087 0.112 0.076 0.154 Phụ lục 9: Ảnh hưởng của độ mặn đến khả năng sinh enzym protease của A. oryzea Độ mặn Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 0% 0.486 0.709 0.675 0.684 0.725 1.187 0.558 0.813 0.804 0.821 0.815 1.363 1% 0.573 0.835 0.842 0.851 0.813 1.399 2% 0.579 0.845 0.835 0.851 0.849 1.416 3% 0.530 0.773 0.761 0.778 0.781 1.296 4% Phụ lục 10: Ảnh hưởng của độ ẩm đến khả năng sinh enzym protease của A. oryzea Độ ẩm Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 50% 0.483 0.705 0.713 0.715 0.688 1.180 55% 0.524 0.765 0.763 0.759 0.773 1.280 60% 0.501 0.730 0.720 0.739 0.735 1.224 65% 0.429 0.625 0.611 0.630 0.634 1.048 70% 0.346 0.505 0.510 0.489 0.517 0.846 75% 0.342 0.499 0.478 0.516 0.503 0.836 Phụ lục 11: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt độ enzym protease của A. oryzea Nhiệt độ Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 250C 0.178 0.211 0.204 0.221 0.209 0.435 300C 0.277 0.409 0.501 0.427 0.323 0.677 350C 0.402 0.679 0.674 0.682 0.689 0.983 400C 0.492 0.740 0.739 0.750 0.735 1.203 450C 0.446 0.650 0.677 0.617 0.658 1.090 500C 0.348 0.508 0.506 0.515 0.504 0.850 550C 0.281 0.411 0.502 0.428 0.325 0.687 600C 0.245 0.356 0.319 0.438 0.304 0.599 Phụ lục 12: Ảnh hưởng của nhiệt độ đến độ bền của enzym protease của A. oryzea Nhiệt độ Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 200C 0.291 0.425 0.475 0.394 0.415 0.711 300C 0.566 0.825 0.846 0.798 0.834 1.383 400C 0.620 0.905 0.919 0.894 0.913 1.515 500C 0.533 0.779 0.795 0.775 0.765 1.302 600C 0.093 0.135 0.139 0.131 0.134 0.227 700C 0.067 0098 0.085 0.102 0.106 0.164 Phụ lục 13: Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt độ enzym protease của A. oryzea Nhiệt độ Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 10’ 0.410 0.599 0.612 0.587 0.595 1.002 20’ 0.623 0.908 0.912 0.915 0.899 1.523 30’ 0.690 1.006 1.003 1.009 1.004 1.686 40’ 0.709 1.035 1.059 1.016 1.017 1.733 50’ 0.712 1.038 1.065 1.018 1.026 1.740 60’ 0.721 1.051 1.041 1.057 1.060 1.762 70’ 0.537 0.783 0.795 0.774 0.781 1.312 80’ 0.472 0.688 0.684 0.687 0.692 1.153 90’ 0.419 0.612 0.625 0.613 0.592 1.024 100’ 0.331 0.483 0.487 0.479 0.481 0.809 Phụ lục 14: Ảnh hưởng của pH đến hoạt độ enzym protease của A. oryzea pH Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/ml) 5.0 0.350 0.511 0.523 0.514 0.497 0.855 5.5 0.354 0.518 0.530 0.512 0.509 0.865 6.0 0.547 0.798 0.805 0.766 0.823 1.337 6.5 0.510 0.743 0.760 0.753 0.723 1.246 7.0 0.460 0.671 0.668 0.655 0.694 1.124 7.5 0.295 0.431 0.435 0.437 0.428 0.721 Phụ lục 15 : Hoạt độ protease với các tác nhân tủa khác nhau Tác nhân tủa Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/g) Ethanol 960 0.344 0.502 0.504 0.540 0.463 1892 Acetone 0.289 0.422 0.429 0.398 0.440 1589.5 (NH4)2SO 4 0.228 0.333 0.352 0.323 0.325 1254 Phụ lục 16 : Hoạt độ protease của nấm A.oryzea với enzym protease ngoài thị trường. Enzym Hàm lượng tyrozine OD Số lần đo Hoạt độ (UI/g) Enzym của nấm A.oryzea 0.343 0.501 0.495 0.482 0.528 1686.5 Enzym ngoài thị trường 0.447 0.652 0.624 0.676 0.657 2458.5 ._.