Nghiên cứu khả năng sinh Enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

y Cơ trong Bộ mơn Vi sinh đặc biệt là cơ Tuyến và Ths. Phương phụ trách phịng thí nghiệm Vi sinh trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh, quý Thầy Cơ trong khoa Sinh học, cùng tồn thể quý Thầy Cơ đã tận tình giảng dạy trong suốt khĩa học. Tơi xin gởi lời cảm ơn tới Sở Giáo dục đào tạo tỉnh An Giang, Trường THPT Vĩnh Trạch – An Giang, những người thân trong gia đình, bạn bè, đã giúp đỡ, động viên tơi trong suốt thời gian học. Tác giả luận văn DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AMP : Adenozin mono photphat CAP : Cataleolite gene Activator Protein CMCase : Carbomexymethyl cellulase CMC : Carboxymethyl cellulose CBH : Cellobiohydrolase hay Exoglucanase CBHI : Exoglucanase I CBH II : Exoglucanase II DNS : Acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic Enzym : Enzyme EG : Endoglucanase EGI : Endoglucanase I EGII : Endoglucanase II IU : Imeasure Unit (đơn vị hoạt độ) KHV : Kính hiển vi KL : Khuẩn lạc MT : Mơi trường PTN : Phịng thí nghiệm PGA : Potato glucose agar RNM : Rừng ngập mặn VSV : Vi sinh vật MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Sự hiện hữu của rừng ngập mặn (RNM) Cần Giờ là kết quả của hơn 25 năm phục hồi và phát triển bằng các nổ lực to lớn của chính quyền và nhân dân Thành phố Hồ Chí Minh. Vào ngày 21 tháng 1 năm 2000, Ủy ban MAB/ UNESCO đã cơng nhận RNM Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển đầu tiên tại Việt Nam [55]. RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ các nguồn gen sinh vật quí hiếm và bền vững, cĩ khả năng chịu đựng điều kiện sống rất đặc biệt khắc nghiệt. Là nơi cĩ hệ VSV vơ cùng phong phú và đa dạng như nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn…., trong đĩ nấm sợi chiếm số lượng rất lớn. Nấm sợi đĩng vai trị rất quan trọng trong vịng tuần hồn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái RNM, nhờ cĩ khả năng sinh các loại enzym ngoại bào như cellulase, protease, kitinase, amylase, enzym phân giải dầu…..Đặc biệt, enzym cellulase do nấm sợi sống trong RNM sinh ra là rất lớn. Do thảm thực vật dày đặc ở RNM Cần Giờ là nơi sinh sống tốt nhất, nguồn thức ăn dồi dào nhất cho các chủng nấm sợi cĩ khả năng sinh enzym này. Enzym cellulase là hệ enzym bao gồm các loại enzym: C1, Cx, β- glucosidase, cĩ khả năng hoạt động phối hợp để phân giải cellulose thành glucose. Enzym cellulase được ứng dụng trong nơng nghiệp để chế biến thức ăn chăn nuơi, trong cơng nghiệp thực phẩm để chế biến thực phẩm, trong quá trình li trích các chất từ thực vật, trong việc phân hủy các phế liệu giàu cellulose….Theo Bhat (2000), xấp xỉ 20% trong số 1 tỷ USD thu được từ lượng enzym cơng nghiệp được bán ra trên thế giới gồm các enzym cellulase, hemicellulase và pectinase. Đến năm 2005, thị trường enzym cơng nghiệp trên thế giới tăng từ 1,7- 2,0 tỷ USD. Hàng năm, nước ta phải nhập ngoại một lượng lớn những nguồn enzym cellulase để giải quyết vấn đề sản xuất và xử lý ơ nhiễm MT. Việt Nam là nước nhiệt đới cĩ nền nơng nghiệp rất phong phú, đa dạng và đang trên đà phát triển. Vì vậy, lượng phế thải nơng nghiệp rất dồi dào, cùng với sự cơng nghiệp hĩa, hiện đại hĩa đất nước, ơ nhiễm MT đang trở thành nguy cơ thật sự. Thành phần chính trong phế thải rắn trong sinh hoạt cơng, nơng, lâm nghiệp là cellulose. Trong khi đĩ, RNM Cần Giờ là kho dự trữ các chủng VSV cĩ hoạt tính enzym cao chưa được khai thác. Các cơng trình khoa học nghiên cứu về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ cho đến nay vẫn cịn bỏ ngõ. Từ cơ sở khoa học và thực tiễn trên gợi ý cho tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu khả năng sinh enzym cellulase của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”. 2. Lịch sử vấn đề nghiên cứu  Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase Khả năng sinh enzym cellulase chủ yếu được tổng hợp từ nấm sợi Trichoderma và Aspergillus. Ở Mỹ, năm 1983 PTN của Quân đội Mỹ ở Natik và trường đại học Rutgers, sử dụng chủng Trichoderma viride QM6 hoang dại để sản xuất cellulase đầu tiên. Sau đĩ, gây biến chủng và chọn lọc được biến chủng QM9414 cĩ khả năng sinh ra cellulase cao (theo Rehm, 1983) [74]. Năm 1998, YU đã nuơi cấy T. reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột cellulose và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase 232,4 IU/g [68]. Năm 2000, Sonia Couri khảo sát khả năng sinh tổng hợp các enzym như polygalacturonase, cellulase, xylanase và protease từ A. niger 3T5B8 trên nguồn phụ phế liệu nơng nghiệp khác nhau bằng phương pháp lên men bán rắn và ứng dụng enzym trong việc tách chiết dầu thực vật [61]. Năm 2002, theo báo cáo gần đây của CORAL, dịch nuơi cấy A. niger trong MT Czapek-Dox chứa CMC1%, cho chạy điện di trên gel SDS-PAGE (chứa 0,2% CMC) phát hiện cĩ hai vạch cĩ hoạt tính CMCase và trọng lượng phân tử lần lượt là 83.000 và 50.000 Dalton [67]. Ở Việt Nam, năm 1989, Lê Hồng Mai nghiên cứu về sinh tổng hợp và một số đặc tính của cellulase (typ CMCase) ở A. niger VS-1 trên MT lên men bán rắn [40]. Năm 2001, Huỳnh Anh nghiên cứu về nấm sợi T. reesei sinh tổng hợp enzym cellulase trên MT lỏng với nguồn cacbon là CMC [40]. Năm 2002, Kiều Hoa nghiên cứu sinh tổng hợp enzym cellulase với nguồn cacbon là cellulose tinh khiết, cám trấu, bã mía, vỏ cà phê [22]. Năm 2003, Hồng Quốc Khánh nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp và đặc điểm cellulase của A. niger Rnnl 363. Châu Hồng Vũ cũng nghiên cứu thu nhận và tinh sạch enzym cellulase từ nấm mốc T. reesei bằng phương pháp lên men bán rắn [24], [57]. Năm 2004, Trần Thạnh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzym cellulase từ T. reesei và A. niger trên MT lên men bán rắn [40]. Năm 2005, Lê Thị Hồng Nga nghiên cứu sự sinh tổng hợp cảm ứng pectinase và cellulase của một số chủng nấm mốc [27].  Các cơng trình nghiên cứu nấm sợi sinh enzym cellulase từ RNM Cho đến nay, trên thế giới đã cĩ nhiều cơng trình khoa học nghiên cứu về phân lập và phân loại nấm sợi trong hệ sinh thái RNM. Nhưng kết quả nghiên cứu cịn sơ sài, chưa đáp ứng được nhu cầu hiểu biết về sự đa dạng của nấm sợi cũng như vai trị của chúng trong hệ sinh thái RNM [64]. Trước đây, người ta cho rằng điều kiện MT RNM quá khắc nghiệt, khơng thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi. Tuy nhiên, các nghiên cứu gần đây cho thấy trong điều kiện sống đặc biệt như vậy, thì con đường trao đổi chất của nấm sợi cũng khác hơn con đường trao đổi chất của các VSV trên đất liền. Vì vậy, sẽ cĩ những sản phẩm trao đổi chất cĩ tính chất đặc biệt hơn, khác lạ hơn trong đĩ cĩ các enzym, chất kháng sinh mới …[18]. Nhưng đến nay cũng chưa cĩ cơng trình đi sâu nghiên cứu về hoạt tính sinh học của các chủng nấm sợi từ RNM. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 mới chỉ cĩ một thơng báo của Mai Thị Hằng và cs về nấm sợi RNM. Năm 2002, tác giả này tiếp tục nghiên cứu sự đa dạng, nghiên cứu khả năng diệt cơn trùng và khả năng phân giải cacbua hydro của nấm sợi từ RNM ở hai tỉnh Nam Định, Thái Bình. Riêng ở RNM Cần Giờ chỉ cĩ một số ít nghiên cứu về phân lập. Cho đến nay, vẫn chưa cĩ nghiên cứu nào về khả năng sinh enzym cellulase của các chủng nấm sợi ở RNM Cần Giờ [19], [20], [21]. 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi cĩ khả năng sinh enzym cellulase từ RNM Cần Giờ. Đề xuất hướng ứng dụng các chủng nấm sợi phân lập được. 4. Đối tượng nghiên cứu - Hệ sinh thái RNM Cần Giờ. - Nấm sợi cĩ khả năng sinh enzym cellulase ở RNM Cần Giờ. - Enzym cellulase sinh ra từ nấm sợi. 5. Phạm vi nghiên cứu Do hạn chế về thời gian nên đề tài chỉ nghiên cứu phân lập các chủng nấm sợi ở 6 xã của huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã An Thới Đơng, xã Tam Thơn Hiệp, xã Long Hịa, xã Thạnh An, xã Lý Nhơn. Sau đĩ, chỉ nghiên cứu một số chủng nấm sợi cĩ khả năng sinh một loại enzym cellulase trong hệ enzym này. Đề tài được thực hiện tại PTN Vi sinh, khoa Sinh Trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh và PTN Vi sinh, Viện Sinh học Nhiệt đới Thành phố Hồ Chí Minh. 6. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ. - Tuyển chọn một số chủng nấm sợi cĩ khả năng sinh enzym cellulase cao. - Nghiên cứu các đặc điểm hình thái, sinh lí, sinh hĩa và phân loại các chủng nấm sợi được tuyển chọn. - Nghiên cứu các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng phát triển và sinh tổng hợp enzym cellulase của các chủng được chọn. - Bước đầu thử nghiệm sử dụng nấm sợi sinh enzym cellulase vào việc phân hủy các chất phế thải, gĩp phần hạn chế ơ nhiễm MT. 7. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ. - Phương pháp vi sinh. - Phương pháp hĩa sinh. - Phương pháp thực nghiệm. - Phương pháp thống kê tốn học. 8. Dự kiến cấu trúc Luận văn gồm phần mở đầu, 3 chương và phần kết luận kiến nghị được trình bày như sau: Mở đầu Chương 1: Tổng quan Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu Chương 3: Kết quả và bàn luận Kết luận và kiến nghị. Chương 1: TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm tự nhiên RNM Cần Giờ RNM chiếm một phần đáng kể trong các kiểu rừng ngập nước, thường tồn tại ở vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới. Trên thế giới hiện nay cịn khoảng 15 triệu ha RNM phân bố ở các vùng bờ biển cĩ bùn, các cửa sơng lớn, các vịnh cạn và các đầm mặn giáp với biển. RNM Cần Giờ tiếp giáp với Thành phố Hồ Chí Minh, là “lá phổi xanh” của thành phố. Cĩ tác dụng giảm tốc độ giĩ, ngăn bão vào đất liền, hạn chế xĩi lở bảo vệ bờ biển, bờ sơng, điều hịa khí hậu, mở rộng diện tích đất bồi và tạo MT phát triển ngành thủy sản. Bên cạnh đĩ, RNM Cần Giờ cịn là nơi cung cấp thức ăn, là nơi cư trú, sinh sản của các lồi thủy sinh vật và động vật cĩ xương sống ở cạn. Hiện nay, Cần Giờ cịn là địa điểm du lịch hấp dẫn với 3.000 - 5.000 du khách đến tham quan mỗi tuần [83]. RNM Cần Giờ hiện nay cĩ diện tích khoảng 29,380 ha chiếm 41,18 % đất huyện Cần Giờ [87]. Khí hậu nĩng ẩm và chịu chi phối của quy luật giĩ mùa cận xích đạo với mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 10, mùa khơ từ tháng 11 đến tháng 4. Lượng mưa trung bình từ 1.300mm đến 1.400mm hàng năm. Nhiệt độ trung bình là 25,80C, biên độ nhiệt dao động trong ngày từ 5-70C. Chế độ bán nhật triều khơng đều. Độ mặn dao động 18 ‰ – 30 ‰ [1]. Một nghiên cứu mới đây cho biết RNM Cần Giờ đã cĩ 157 lồi thực vật; 63 lồi phiêu sinh vật; 130 lồi Tảo thuộc 3 ngành: Tảo khuê, Tảo giáp, Tảo lam; 100 lồi động vật đáy khơng xương sống như tơm, cua, sị ốc. Ngồi ra, cịn cĩ 120 lồi cá, trong đĩ cĩ các lồi cĩ giá trị kinh tế cao như cá Ngát, cá Dứa, cá Chẽm; 31 lồi bị sát như cá sấu, trăn, rắn, kỳ đà nước; 19 lồi hữu nhũ như khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 lồi chim [83]. Đây là các nguồn thức ăn tốt nhất cho hệ nấm sợi sống trong RNM. Nấm sợi cĩ khả năng tiết ra hệ enzym cellulase phân hủy hợp chất cellulose cĩ trong lá cây, thân cây ở RNM thành glucose để sử dụng. Ngồi ra, nấm sợi cịn cĩ thể sinh các loại enzym khác như protease, amylase, kitinase…phân hủy xác, vỏ tơm, cua, ốc, xác chết các lồi động vật khác thành các chất dinh dưỡng chúng cĩ thể hấp thu [1]. Hình 1.1. Bản đồ RNM Cần Giờ [83] Vậy, hệ nấm sợi là một mắt xích quan trọng trong chuỗi thức ăn, là một nhân tố khơng thể thiếu trong chu trình chuyển hĩa vật chất ở RNM Cần Giờ. Chúng sử dụng chất hữu cơ từ thảm thực vật và hệ động vật phong phú làm thức ăn, đồng thời cĩ tác dụng làm giảm ơ nhiễm MT ở RNM Cần Giờ. 1.2. Nấm sợi tổng hợp enzym cellulase Rất ít VSV cĩ khả năng sinh tất cả các loại enzym cần thiết để phân giải cellulose ở dạng tinh thể. Chúng phải tiết ra hệ enzym phức tạp, cĩ khả năng phân hủy cellulose theo phương thức khác nhau như thủy phân, oxy hố [51], [52]. Cellulose bị phân rã dưới tác dụng của vi khuẩn háo khí và kỵ khí. Song khả năng phân hủy cellulose khơng bằng nấm, do vi khuẩn thường tạo ra enzym cellulase với hàm lượng nhỏ thấp hơn 0,1g/l [51]. Cellulase được sinh tổng hợp chủ yếu từ vi khuẩn trong dạ cỏ Ruminococcus albus (Berger 1963), vi khuẩn hiếu khí Cellulomonas sp (Elberson, 2000), vi khuẩn kỵ khí Clostridium sp (Parsiegla, 1998) [39], các lồi xạ khuẩn Streptomyces, Thermomonospora …[51]. Nấm sợi là nhĩm được nghiên cứu nhiều nhất trong lĩnh vực phân hủy cellulose. Các enzym cellulase sản sinh từ nấm sợi được tạo ra với nồng độ rất cao, khơng cĩ các dạng vật lý phức tạp như cellulase bắt nguồn từ vi khuẩn và cĩ tác dụng phân hủy rất mạnh cellulose. Các chi nấm cĩ khả năng sinh cellulase phổ biến là: Aspergillus, Alternaria tenuis, Celluvirio gilvus, Clasdosporium, Penicillium, Fusarium, Myrotheticum, Trichoderma … [39]. 1.2.1. Đặc điểm hình thái của nấm sợi Nấm sợi là VSV cĩ nhân chuẩn. Thành tế bào nấm chủ yếu cấu tạo từ kitin-glucan, kitozan. Hệ nấm sợi được cấu tạo bởi các sợi nấm (hypha) khơng vách ngang hoặc cĩ vách ngang (septum). Các sợi nấm vừa phát triển theo chiều dài do tăng trưởng ở ngọn, vừa phân nhánh tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) hay cịn gọi là khuẩn ty thể (hình 1.2). Hệ sợi nấm phát triển thành các dạng KL khác nhau tùy theo cơ chất rắn, lỏng hay mềm (hình 1.3). KL nấm sợi thường cĩ dạng hình trịn, hoặc gần trịn. Bề mặt KL cĩ thể mượt, nhẳn bĩng, dạng bột, dạng sợi, dạng hạt, dạng xốp, phẳng, cĩ những vết khía xuyên tâm, hoặc lồi lõm khơng đều. Mép KL trơn, răng cưa…. Hình 1.2. Bào tử mọc ra khuẩn ty [78] Hình 1.3. KL nấm [78] Một số sợi nấm cĩ thể tiết sắc tố vào MT hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm. Các đặc điểm hình thái khác như cĩ bĩ sợi, bĩ giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết, sắc tố hịa tan…, làm KL nấm sợi cĩ tính đặc trưng lồi [78]. Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp phụ qua màng, khơng cĩ cơ quan tiêu hĩa, khơng cĩ khả năng quang hợp. Đa phần là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh, một số gây bệnh trên người và động thực vật [18]. Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử cĩ thể hình thành theo kiểu vơ tính hoặc hữu tính. Bào tử vơ tính. Bao gồm các động bào tử, bào tử trần, bào tử kín. Bào tử trần là dạng bào tử phổ biến nhất. Hình 1.4. Các dạng bào tử trần của nấm sợi [78] Sinh sản hữu tính. Nấm sợi cĩ các hình thức sinh sản hữu tính như: đẳng giao, dị giao, và tiếp hợp. Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [78] Ngồi ra, lớp nấm Túi và nấm Đảm sinh sản hữu tính bằng bào tử túi (ascospores) và bào tử đảm (basidiospores). 1.2.2. Đặc điểm phân loại của nấm sợi Trong tự nhiên cĩ khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu lồi nấm nhưng mới định tên được khoảng 10.000 chi và 70.000 lồi. Trung Quốc đã điều tra được 40.000 lồi. Phân loại vi nấm vẫn đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic classifications) dựa vào đặc điểm hình thái, nuơi cấy, một số đặc điểm sinh lý, sinh hĩa và phương thức sinh sản. Trong những năm gần đây, tiến bộ của sinh học phân tử và kỹ thuật kính hiển vi điện tử đã đem lại một diện mạo mới cho việc nghiên cứu phân loại học và sinh lý học nấm. Hiện nay, tồn tại các hệ thống phân loại nấm khơng thống nhất với nhau, chủ yếu là các hệ thống phân loại theo Ainsworth và cộng sự (1973), V.Arx (1981), Ainsworth & Bisby (1995), Alexopoulos & Mins (1996), Robert A. samson (1989), Saccardo P.A (1880-1886), Barron G.L (1968), Ellis M.B (1971), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984) …[78]. Trong luận văn này, chúng tơi dựa vào đặc điểm mơ tả trong các khĩa phân loại: Saccardo P.A (cải tiến), Bùi Xuân Đồng (1977, 1984), Đặng Hồng Miên, Nguyễn Đức Lượng (2003), Nguyễn Lân Dũng (2006) để phân loại [8], [9], [10], [12] [14], [27], [74]. 1.2.3. Khả năng sinh các chất cĩ hoạt tính sinh học của nấm sợi Nấm sợi được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm nhiều do khả năng sinh các chất cĩ hoạt tính sinh học được ứng dụng rộng rãi, lợi ích kinh tế cao như: nguồn enzym, các chất kháng sinh, các axit hữu cơ, các chất cĩ khả năng phân giải nguồn cacbonhydro được ứng dụng trong xử lý ơ nhiễm MT do tràn dầu, khai thác các mỏ dầu trong lịng đất ….[5], [6], [40], [43].  Hoạt tính enzym thủy phân ngoại bào Enzym là những protein cĩ khả năng xúc tác cho các phản ứng hĩa học trong và ngồi cơ thể [29]. Đến nay, các nhà khoa học đã tìm được khoảng 3.500 loại enzym, trong đĩ phần lớn là enzym từ thực vật và VSV. Nấm sợi cĩ tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym ngoại bào mạnh, phân giải và chuyển hố các hợp chất hữu cơ, vơ cơ khĩ tan trong tự nhiên. Một số enzym đã được tinh sạch, nghiên cứu kỹ và ứng dụng phổ biến như: cellulase, protease, amylase, pectinase và kitinase [6].  Enzym cellulase. Xúc tác phân giải các hợp chất ligno - cellulose thành glucose. Ligno-cellulose là thành phần chủ yếu của thành tế bào thực vật gồm cellulose (30-40%), hemi-cellulose và lignin (15-30%). Các chủng nấm sợi Trichoderma, Penicillium, Aspergillus….cĩ khả năng sinh enzym cellulase được sử dụng trong sản xuất thực phẩm, làm phân bĩn, xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose…[19], [20], [21].  Enzym protease. Protein là các polyme cấu tạo từ các axit amin liên kết nhau bằng liên kết peptid rất dễ bị cắt đứt tạo thành các chuỗi polypeptid ngắn. Nấm sợi cĩ khả năng phân giải mạnh protein thường gặp thuộc các chi Aspergillus, Penicillium,… Được sử dụng nhiều nhất trong cơng nghiệp bột giặt, sữa, bia, các lĩnh vực khác như cơng nghiệp dược, cơng nghiệp thuộc da, cơng nghiệp thực phẩm, xử lý chất thải…[5], [6], [29].  Enzym amylase. Xúc tác quá trình thủy phân tinh bột, chất dự trữ chủ yếu của thực vật thành đường glucose. Tổ hợp phức hệ enzym amylase (α-amylase, β-amylase và glucoamylase) sẽ cắt đứt các liên kết α-1,4- glucoside và α-1,6-glucoside trong phân tử tinh bột để tạo ra sản phẩm cuối cùng là glucose. Nấm sợi cĩ khả năng phân giải tinh bột nhanh chĩng là những tác nhân khơng thể thiếu ở RNM như Aspergillus, Penicillium, Trichoderma, Rhizopus, Mucor….. Được ứng dụng trong sản xuất sirơ, sản xuất bia, bánh mì, cồn, nước tương, nước chấm, trong chế biến thực phẩm gia súc, trong cơng nghiệp dệt…[29], [30].  Enzym kitinase. Kitin là các biopolyme chứa các gốc N-acetyl- glucozamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucoside. Trong RNM, lượng kitin trong xác, vỏ tơm, cua, ốc…rất nhiều. Nấm sợi Trichoderma, Glycladium, Chaetomium,… sinh enzym kitanase phân giải kitin, đồng thời tăng cường hiệu quả tiêu diệt các lồi nấm gây bệnh cĩ thành tế bào là kitin, chống các lồi cơn trùng cĩ vỏ kitin. Như vậy, nấm sợi cịn cĩ vai trị làm tác nhân kiểm sốt sinh học chống các VSV gây bệnh và cơn trùng cĩ hại trong nơng-lâm- ngư nghiệp [18], [19]. Các chủng nấm sợi Acremonium, Aspergillus, Penicillium cịn cĩ khả năng sinh enzym phân giải dầu mỏ và khí đốt là hợp chất cĩ cấu tạo phức tạp và khĩ phân giải, gĩp phần xử lý ơ nhiễm dầu do các tai nạn chìm tàu dầu. Đặc biệt là ở RNM Cần Giờ lượng dầu tràn vào từ biển gây ơ nhiễm và độc hại đối với sinh vật sinh sống ở RNM Cần Giờ, các lồi nấm sợi cĩ khả năng phân giải dầu sẽ sử dụng dầu như nguồn thức ăn và bảo vệ MT ở đĩ. Hình 1.6. Hoạt tính enzym của nấm sợi trên MT thạch [78]  Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi Kháng sinh là một trường hợp riêng biệt của tính đối kháng, là hiện tượng một VSV với sản phẩm trao đổi chất của mình cĩ tác dụng kìm hãm hoặc ức chế sự phát triển của VSV khác. Các chất kháng sinh cĩ nguồn gốc từ nấm sợi chiếm tỉ lệ khá lớn. Chất kháng sinh được sử dụng chủ yếu trong y học như: Cephalo-sporin-C, Griseofluvin, Penicillin là một thứ vũ khí chống lại các vi khuẩn gây bệnh viêm màng não, bệnh viêm màng phổi, bạch cầu, uốn ván. Trong phẫu thuật chữa các bệnh nhiễm trùng vết thương. Những vấn đề về chất kháng sinh được sinh ra từ VSV đang là vấn đề quan tâm hàng đầu và phát triển mạnh mẽ trong nhiều lĩnh vực cuộc sống ngày nay [10].  Khả năng sinh các axit hữu cơ và các chất kích thích sinh trưởng Ngày nay, nhu cầu sử dụng axit hữu cơ ngày càng nhiều. Các axit hữu cơ như axit axetic, axit lactic và một số axit hữu cơ khác được ứng dụng nhiều trong cơng nghệ chế biến mủ cao su, trong cơng nghiệp nhẹ và cả trong y học. Năm 2004, Võ Thị Hạnh đã nghiên cứu sản xuất axit xitric bằng nấm sợi A. niger từ rỉ đường mía và bã khoai mì [17]. Ngồi ra, các nhà khoa học Nhật Bản tổng hợp được chất kích thích sinh trưởng Giberrelin từ hai chủng nấm sợi F. monoforme và F. oxysporum [29]. Tuy nhiên, cĩ rất nhiều lồi nấm sợi mọc trên các nguyên vật liệu, đồ dùng, thực phẩm, phá hỏng hoặc làm giảm chất lượng của chúng. Một số nấm sợi tiết độc tố gây ngộ độc hoặc cĩ thể gây ung thư. Ví dụ: A. flavus sinh độc tố Aflatoxin gây ung thư gan. Một số gây bệnh cho người và động vật như hen suyễn, bạch huyết, nấm tay chân…, bệnh nấm rỉ sắt ở thực vật, bệnh vàng lùn, thối cổ bơng ở lúa…[29]. 1.3. Enzym cellulase từ nấm sợi Ngày nay, nguồn enzym từ VSV như amylase, cellulase, protease, kitinase…được chú ý nhiều nhất do cĩ những ưu điểm: Cĩ hoạt tính cao; khối lượng enzym thu được nhiều do tốc độ sinh sản của VSV nhanh; nguyên liệu rẻ tiền; cĩ thể sản xuất theo quy mơ cơng nghiệp …[29]. 1.3.1. Khái quát về enzym  Cấu trúc Enzym là một loại protein được sinh vật tổng hợp nên và tham gia vào các phản ứng sinh học [30]. Enzym cĩ phân tử lượng từ 20.000 đến 1.000.000 Dalton, được cấu tạo từ L-axit amin liên kết nhau bởi liên kết peptid. Bộ phận đặc hiệu tham gia phản ứng gọi là trung tâm hoạt động của enzym. Enzym gồm 2 nhĩm: Nhĩm enzym một cấu tử gồm những enzym cĩ thành phần hĩa học duy nhất là protein và nhĩm enzym hai cấu tử gồm những enzym cĩ hai thành phần: phần protein thuần gọi là apoenzym cĩ vai trị xúc tác, phần thứ hai là coenzym gồm những chất hữu cơ đặc hiệu cĩ vai trị thúc đẩy quá trình xúc tác. Ngồi ra, cĩ một số kim loại như Fe, Cu, Zn, Mn, …đĩng vai trị liên kết giữa enzym và cơ chất, liên kết giữa apoenzym và coenzym, tham gia trực tiếp vào quá trình vận chuyển điện tử [30].  Cơ chế hoạt động Hoạt động của phân tử enzym được biểu hiện trong trung tâm hoạt động. Trung tâm hoạt động của enzym (E) cĩ cấu trúc khơng gian tương ứng với cơ chất (S) mà chúng tham gia. Phản ứng khơng cĩ sẳn mà được hình thành trong quá trình enzym tiếp xúc với cơ chất giống như chìa khĩa vào ổ khĩa tạo thành enzym - cơ chất (E-S). Cơ chế tác động của enzym vào cơ chất qua ba giai đoạn: Giai đoạn 1: Enzym (E) tương tác với cơ chất (S) bằng những liên kết yếu tạo thành phức enzym - cơ chất (E-S). Giai đoạn 2: Khi cơ chất (S) tạo phức với enzym (E) sẽ bị thay đổi cấu hình khơng gian và mức độ bền vững các liên kết. Các liên kết bị phá vỡ và tạo ra sản phẩm. Phức enzym cơ chất (E-S) sẽ được tách ra. Giai đoạn 3: Enzym sẽ được giải phĩng, cơ chất sẽ chuyển thành sản phẩm và tách khỏi enzym. Phản ứng tổng quát: E + S  E-S  E + P E- enzym (enzyme) ; S- cơ chất (substracte) ; P- sản phẩm (Products) 1.3.2. Cellulose và enzym cellulase 1.3.2.1. Cellulose Cellulose là polymer sinh học phong phú nhất trên trái đất (Murashima, 2002), được sinh tổng hợp chủ yếu bởi thực vật với tốc độ 4.109 tấn/năm. Hàng năm cĩ khoảng 232 tỷ tấn chất hữu cơ được thực vật tổng hợp thành nhờ quá trình quang hợp. Hàng ngày, hàng giờ một lượng lớn cellulose được tích lũy trong đất. Do các sản phẩm tổng hợp của thực vật thải ra, cây cối chết đi, cành lá rụng xuống, một phần do con người thải ra dưới dạng rác rưởi, giấy vụn, mùn cưa…[5], [6]. Trong số này cĩ đến 30% là màng tế bào thực vật mà thành phần chủ yếu là cellulose. Cellulose chiếm đến 89% trong bơng và 40-50% trong gỗ [52]. Cellulose là polymer mạch thẳng, mỗi đơn vị là một disaccharit gọi là cellobiose cĩ cấu trúc từ hai phân tử D-glucose được nối với nhau qua liên kết β-D-1,4-glucoside. Cellulose cấu tạo dạng sợi, các sợi liên kết lại tạo thành những bĩ nhỏ gọi là các micrơfibrin cĩ cấu trúc khơng đồng nhất. Cĩ những phần đặc gọi là phần kết tinh và phần xốp hơn gọi là phần vơ định hình. Hình 1.7. Cấu trúc đơn vị cellulose [84] Hình 1.8. Liên kết hydro trong cấu trúc phân tử của cellulose [84] Hình 1.9. Cấu tạo của phân tử cellulose trong khơng gian [84] 1.3.2.2. Enzym cellulase  Cấu trúc Trong thiên nhiên khơng gặp cellulase ở dạng tinh khiết. Nĩ thường tồn tại ở dạng kết hợp với các enzym khác như: cellulase, hemicellulase, pentozanase thành hệ enzym gọi là Citolase [39]. Cellulase là một phức hệ enzym bao gồm các enzym C1, Cx và β-glucosidase tham gia những phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose tạo thành glucose [29]. Hình 1.10. Cấu trúc enzym cellulase trong khơng gian [86]  Enzym C1: Cĩ tác dụng cắt đứt liên kết hydro biến cellulose tự nhiên thành cellulose phản ứng (cellulose vơ định hình).  Enzym Cx: Cịn gọi là enzym β-1,4 glucanase, thủy phân cellulose phản ứng thành cellobiose. Enzym này được chia thành hai loại: - - Endocellulase hay Endoglucanase (EG) (EC.3.2.1.4): Cĩ tác dụng thủy phân liên kết β-1,4-glucozit tại các điểm bất kỳ trên mạch phân tử cellulose. Được chia làm hai loại EGI, EGII. Cả hai loại enzym này cĩ thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao. Hình 1.11. Cấu trúc tinh thể của endoglucanase [81] - Exocellulase hay exoglucanase (CBH) (EC.3.2.1.91): Phân giải chuỗi trên thành disaccarit gọi là cellobiose từ đầu khơng khử. Bao gồm hai loại CBHI và CBHII: * CBHI cĩ trọng lượng phân tử khoảng 65KD, chứa khoảng 496 axit amin. Enzym này tác động lên cellulose vơ định hình, ưu tiên liên kết với vùng tinh thể của cellulose, khơng tác động lên cellulose biến tính như CMC. * CBHII cĩ trọng lượng phân tử là 53KD, chứa khoảng 471 axit amin. CBHII liên kết với cả vùng tinh thể và vùng vơ định hình, khơng tác động lên cellulose biến tính [52]. Hình 1.12 . Cấu trúc CBH [80] Hình 1.13. Vị trí cắt exoglucanase [80]  β-glucosidase hay cellobiase (EC.3.2.1.21): Thủy phân cellobiose thành glucose. Là nhĩm enzym khá phức tạp, cĩ khả năng hoạt động ở pH rất rộng từ 4,4 đến 8,4. Trọng lượng phân tử 50- 95 KD, cĩ thể hoạt động ở nhiệt độ cao.  Cơ chế hoạt động Cellulose phản ứng Glucose Cellobiose C1 Cx β-Glucosidase Cellulose Hình 1.14. Cơ chế tác động của enzym cellulase [39] Theo Mandels và Reese (1964), đầu tiên, enzym C1 phá vỡ liên kết hydrogen trong phân tử cellulose tạo thành cellulose phản ứng. Sau đĩ Cx tiếp tục thủy phân cellulose phản ứng thành các phân tử cellobiose. Cuối cùng, β-glucosidase phân cắt cellobiose thành glucose.  Điều hịa sinh tổng hợp enzym cellulase Khả năng sinh tổng hợp cellulase trong các lồi nấm sợi được điều hịa ở mức độ phiên mã, mức độ mRNA mã hĩa cho CBHI luơn cao nhất (Pettila, 1993). Tỷ lệ enzym CBHI cao nhất chiếm khoảng 50% trong hổn hợp cellulase được tiết ra bởi T. reesei (theo Gritzali và Brown, 1979), mức độ mã hĩa các thành phần khác của enzym cellulase luơn ở trạng thái ổn định [40] Quá trình sản sinh enzym cellulase được kiểm sốt theo cơ chế cảm ứng và ức chế bởi glucose. Cellulase được sinh ra khi nấm sợi sinh trưởng trên MT cĩ chứa cellulose, dẫn xuất của cellulose, lactose. Cịn trên MT cĩ chứa glucose, fructose hoặc glycerol thì cellulase khơng tạo thành enzym cellulase (Biaria và Mishra, 1989). Hơn nữa, hoạt tính cellulase cịn phụ thuộc vào sự cĩ mặt của các chất ức chế trong MT nuơi cấy. Nhiều hợp chất phenol đã được chứng minh là cĩ tác dụng kìm hãm sự phát sinh cellulase ở S. commune [52]. Khi nuơi cấy nấm cũng xảy ra hiện tượng hoạt hĩa cellulase. Chẳng hạn, hai loại proteaza axit được tạo ra trong điều kiện phân hủy cellulose cĩ khả năng làm tăng 10 lần hoạt tính endoglucanase của P. chrysosporium [52]. Quá trình tổng hợp enzym cellulase cảm ứng cịn chịu tác động của AMP vịng (AMPv). Chất này cĩ tác dụng kích thích quá trình sao chép mã của các operon phân giải nhờ một loại protein đặc biệt làm trung gian gọi là protein nhận AMPv (CAP). Khi AMPv kết hợp với CAP tạo thành phức hợp cĩ tác dụng hoạt hĩa gen operator làm cho RNA-polymerase dễ dàng kết hợp với chúng để bắt đầu sao chép mã [30]. Nấm sợi chịu tác động trực tiếp của các yếu tố bên ngồi rất mạnh và phản ứng lại với tác động đĩ rất nhanh. Vì thế, cĩ thể sử dụng pH, nhiệt độ và đặc biệt là cơ chất mà chúng tham gia phân hủy để điều khiển tổng hợp enzym. Khi ta cho cơ chất với liều lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzym cảm ứng sẽ tăng dần. Nếu cứ tiếp tục tăng liều lượng cơ chất thì sẽ đến một mức nào đĩ quá trình này sẽ chựng lại và giảm do tăng áp suất thẩm thấu bởi cơ chất [30]. 1.3.3. Các yếu tố MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tạo thành enzym cellulase của nấm sợi trên MT lên men bán rắn 1.3.3.1. Thành phần MT nuơi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase  Nguồn dinh dưỡng cacbon Trong MT nuơi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase nhất thiết phải cĩ cellulose là chất cảm ứng và nguồn cacbon. Nấm sợi cĩ khả năng đồng hĩa rất nhiều nguồn cacbon khác nhau. Nguồn cacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đĩ glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phản ứng trong ba chu trình chuyển hĩa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và Entner Doudoroff. Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase thường là giấy lọc, bơng, bột cellulose, cám, lõi ngơ, mùn cưa, bã mía, trấu, rơm, than bùn, CMC, ….Các chủng Trichoderma nuơi trên MT cĩ nguồn cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzym cao nhất [38]. Ngày nay, bã mía được dùng như một cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh enzym cellulase. Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu tấn/năm. Ở Việt Nam, bã mía phần lớn dùng để đốt lị hơi, làm phân bĩn hữu cơ, bột giấy, trồng nấm ăn….Tuy nhiên, khơng sử dụng hết và đã gây ơ nhiễm MT xung quanh. Bã mía cĩ hàm lượng cellulose rất cao 46% (theo A.G.Keller, 1964), ngồi ra cịn chứa hemicellulose, lipid và sáp, chất khống, lignin, silic nên là một cơ chất cảm ứng tuyệt vời cho nấm sợi sinh enzym. Ngồi ra, cám mì thường được sử dụng với tỉ lệ (6 : 4) do nĩ cĩ chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzym của nấm sợi, cĩ tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượ._.ng dinh dưỡng cần thiết.  Nguồn dinh dưỡng nitơ Các nguồn nitơ thích hợp nhất đối với các sinh vật sinh cellulase là muối nitrat. Natri nirat làm cho MT kiềm hĩa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thành cellulase. Các hợp chất nitơ hữu cơ cĩ tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase tùy vào đặc tính sinh lý của từng chủng. Cao nấm men cĩ tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase, cao ngơ cĩ khả năng sinh tổng hợp exoglucanase và endoglucanase mạnh hơn nấm men. Nước chiết nấm men chủ yếu kích thích sự tạo thành endoglucanase, cịn cao ngơ kích thích CHBI và CBHII. Tác dụng kích thích của các hợp chất này là do sự cĩ mặt của các axit amin, các nguyên tố khống và những nhân tố kích thích sinh trưởng [38], [39], [40].  Nguồn dinh dưỡng khống Các chất khống như Fe, Mn, Zn, Mo, Cu… cĩ vai trị quan trọng như tham gia vào quá trình chuyển hĩa vật chất qua màng và thành tế bào nấm sợi, tham gia vào thành phần cấu tạo prơtêin, enzym, điều hịa pH MT nuơi cấy nên ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp cellulase. Nồng độ tối thích của Zn là 0,11- 2,2 mg/l, Fe 2 - 10 mg/l, Mn 3,4 - 27,2 mg/l. Biotin và Tiamin khơng cĩ ảnh hưởng đến sự tổng hợp enzym này [38]. 1.3.3.2. Yếu tố MT ảnh hưởng đến khả năng sinh enzym cellulase Ảnh hưởng của độ ẩm Độ ẩm trong MT lên men bán rắn là hàm lượng nước cĩ trong cơ chất rắn. Các cơ chất khác nhau cĩ khả năng giữ nước khác nhau từ 30- 80% (Moo-Young, 1983). Trong quá trình nuơi cấy nấm sợi thu enzym cellulase độ ẩm cĩ ảnh hưởng rất lớn đến khả năng sinh enzym và hoạt tính của enzym. Độ ẩm tối ưu để nuơi cấy nấm sợi là 50-60%, nếu độ ẩm vượt quá 60% tạo điều kiện cho vi khuẩn phát triển, nếu độ ẩm <60% gây hiện tượng tạo nhiều bào tử ở nấm sợi, hoạt tính của enzym sẽ giảm. Kim (1985) cho biết tốc độ sinh trưởng tối ưu của T. reesei ở độ ẩm 60%, nhưng khả năng sinh tổng hợp cellulase ở độ ẩm thấp hơn xấp xỉ 50% [38], [40]. Ảnh hưởng của pH Sự sinh trưởng của nấm sợi sẽ gây ra sự thay đổi pH đáng kể trong cơ chất. Cơ chất bị oxy hĩa khơng hồn tồn sẽ sinh ra acid, hoặc hấp thụ ion amonium sẽ làm giảm pH. Ngược lại, sự giải phĩng ammonia qua sự loại nhĩm amin của urea hoặc các amin khác sẽ làm tăng pH. pH tối ưu cho các lồi nấm sợi khác nhau được sử dụng trong lên men bán rắn cĩ giá trị từ thấp nhất là 3 đến cao nhất là 8 (Prior, 1992) tùy vào từng chủng nấm sợi khác nhau. Nấm sợi Aspergillus, Penicillium và Rhizopus cĩ thể giảm pH của MT xuống dưới 3, Đối với các chủng nấm Trichoderma, Sporotrichum, Pleurotus, pH ổn định hơn ở khoảng 4 và 5 [40]. Trong suốt quá trình nuơi cấy nấm sợi ta cĩ thể điều chỉnh pH của MT bằng axit HCl, H2SO4, NaOH, KOH. Durand (1988) đã điều chỉnh pH trong nuơi cấy T. viride ở qui mơ pilot trên MT hạt cà phê-đường bằng cách phun dung dịch urea, do hoạt động của urease của nấm sợi làm tăng pH qua việc tạo ammonia [29]. Ngồi ra, việc điều chỉnh pH thích hợp trong quá trình nuơi cấy nấm sợi hạn chế sự tạp nhiễm vi khuẩn làm ảnh hưởng đến hoạt tính enzym [73].  Ảnh hưởng nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng rất lớn đến tốc độ sinh trưởng và khả năng sinh enzym cellulase. Nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của đa số nấm sợi từ 280C-320C, tối đa dưới 500C [40], [73]. Nếu nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp cĩ thể kìm hãm sự sinh trưởng thậm chí cĩ thể giết chết sợi nấm, quá trình tổng hợp enzym sẽ bị ức chế. Theo Raimbaut & Alazard (1989) cho biết nhiệt độ tối ưu cho sự sinh trưởng của A. niger trên MT bột khoai mì là 35- 400C, ngược lại ở 450C, sự nảy mầm của sợi nấm bị ức chế, khả năng sinh enzym giảm [40].  Ảnh hưởng của MT khí MT khơng khí quan trọng nhất là khoảng khơng gian giữa các tiểu phần cơ chất, vì đây là nơi mà sinh khối nấm sợi sinh trưởng. Oxygen phải khuếch tán từ khoảng khơng giữa các hạt cơ chất vào sinh khối, và CO2 phải khuếch tán từ sinh khối vào khoảng khơng giữa các hạt cơ chất. Trong nuơi cấy người ta thường thiết kế dụng cụ nuơi cấy sao cho sự lưu thơng khơng khí dễ dàng và cao nhất. Nuơi trên khay thì phía dưới đáy các khay cĩ đục lỗ để khơng khí dễ lưu thơng, nuơi trong hộp thì thiết kế xung quanh hộp cĩ đục lỗ vừa nhỏ sao cho MT khơng bị thốt ra ngồi, đồng thời cĩ tác dụng thơng khí, nấm sợi sẽ phát triển đều ở tất cả các mặt cĩ tiếp xúc với khơng khí…. Trong nuơi cấy nấm sợi sinh enzym cellulase, để tạo khả năng thống khí tốt hơn, người ta thường cho thêm trấu với lượng khoảng 20- 25% sẽ làm tăng độ xốp của MT, tạo nên những khoảng trống để khơng khí cĩ thể lưu thơng trong lịng MT, đồng thời trấu cịn là cơ chất cảm ứng cho sự tổng hợp của enzym cellulase [38].  Ảnh hưởng của cơ chất và các chất kìm hãm Ở giai đoạn đầu, khi nồng độ cơ chất tăng, tốc độ phản ứng sẽ tăng, nhưng khi tốc độ phản ứng đạt cực đại, dù ta cĩ tăng nồng độ cơ chất, tốc độ phản ứng cũng sẽ hồn tồn khơng cĩ khả năng tăng theo [39]. Nguồn cacbon và nitrogen ảnh hưởng mạnh đến tốc độ sinh trưởng và hoạt tính enzym. Do đĩ, nếu cơ chất khơng chứa đủ các thành phần dinh dưỡng thì phải bổ sung thêm kịp thời. Các chất kìm hãm là những chất hĩa học cĩ thể làm giảm hoặc mất hoạt tính enzym, thường là những ion, các phân tử vơ cơ, hữu cơ… Các chất kìm hãm cạnh tranh cĩ cấu trúc khơng gian tương tự cấu trúc khơng gian của cơ chất nên sẽ kết hợp với enzym ở trung tâm hoạt động, kết quả là enzym khơng thể kết hợp được với cơ chất. Các chất kìm hãm khơng cạnh tranh kết hợp với enzym ở vị trí ngồi trung tâm hoạt động của enzym làm giảm tốc độ phản ứng của enzym [30]. 1.3.4. Ứng dụng của enzym cellulase  Một số chế phẩm enzym cellulase trên thế giới và Việt Nam Ngày nay, trên thế giới và cả Việt Nam, các chế phẩm sinh học chứa các VSV cĩ khả năng sinh các loại enzym được sản xuất và sử dụng ngày càng rộng rãi và phổ biến trong các lĩnh vực chăn nuơi, trồng trọt,…. Điều này giúp giảm bớt giá thành sản xuất, hạn chế được tình trạng ơ nhiễm MT. Enzym cellulase kỹ thuật chủ yếu được thu nhận từ Trichoderma reesei, Aspergillus niger…và gần đây là các chủng vi khuẩn [30]. Ở Đan Mạch, hãng Novo Nordisk cĩ chế phẩm “Celluclast” dùng trong thức ăn gia súc [40]. Ở Pháp, hãng Lyven dùng “Cellulases” từ T. reesei và từ A. niger trong cơng nghiệp thực phẩm [40]. Ở Nhật, hãng Amano hàng năm đã sản xuất trên 8000 tấn chế phẩm enzym các loại để dùng trong nơng nghiệp. Enzym “Panxenlase” chứa cellulase, hemicellulase, protease và amylase, hoạt tính dùng trong chăn nuơi. Chế phẩm “Cellubrix”, “Cellusoft”, “Onozuka” dùng trong cơng nghiệp làm mềm vải, trong thức ăn gia súc [40]. Ở Canada, hãng Logen sử dụng “Cellulase” trong thức ăn gia súc, cơng nghiệp giấy, chế biến hạt, sản xuất ethanol [77]. Ở Liên Xơ, chế phẩm “Cellolignorin” được sử dụng trong chăn nuơi, hoạt tính 1-50 đơn vị/g, chứa cellulase, hemicellulase, pectinase [77]. Ngồi ra, cịn cĩ các chế phẩm cellulase khác được tạo ra bởi các nhà sản xuất: Cellulaset và Novozyme 234 [NO], Econase C15 [AO], Rohament CT [RM], Avizyme [FR], Sumizyme c [SN], Meicelase MC [MJ], Cellulase TAP [AM], Cytolase [GR] [74]. Ở Việt Nam, Viện Sinh học nhiệt đới đã sản xuất các chế phẩm BioI, BioII, BioIII … cĩ dạng bột, chứa các enzym amylase, protease, cellulase và các VSV dùng bổ sung vào thức ăn cho bị, heo, cá. Chế phẩm cĩ tác dụng phịng chống các chứng rối loạn tiêu hĩa, kích thích tăng trọng, giảm tiêu hao thức ăn, phân hủy những thức ăn thừa và khí thải ở đáy ao…[78] Trung tâm Cơng nghệ sinh học Tp. Hồ Chí Minh sản xuất chế phẩm Trichotech chứa vi nấm Trichoderma, chế phẩm này cĩ dạng rắn, tơi xốp, nhẹ, màu xám nâu đậm, giúp cây trồng chống được các loại nấm bệnh….[82]. Cơng ty TNHH TM và sản xuất Mai Xuân (TP. Hồ Chí Minh) sản xuất chế phẩm TRICHO-MX chứa vi nấm Trichoderma, cĩ dạng bột. Cĩ tác dụng hạn chế nấm hại, cải tạo đất, ủ phân bĩn cho cây trồng. Cơng ty TNHH TM và sản xuất thuốc thú y- thuốc thủy sản Minh Dũng (Bình Dương) đã sản xuất nhiều chế phẩm chứa vi nấm Aspergillus sinh enzym cellulase, dùng xử lý nước ao nuơi tơm cá, kích thích tiêu hĩa, ở gia súc…như: MD-Bio-Zemix, Biofat, Bio vitamin, Biolaczym…..  Ứng dụng của enzym cellulase Enzym cellulase thu hút được sự chú ý của các nhà cơng nghệ vì chúng cĩ thể được ứng dụng rất nhiều trong các lĩnh vực sau:  Ứng dụng trong xử lý chất thải hữu cơ chứa cellulose Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khĩ phân hủy. Trong điều kiện tự nhiên thời gian phân hủy rất lâu (trên 8 tháng), ở điều kiện khí hậu nhiệt đới. Thời gian phân hủy các chất thải này càng lâu càng gây ơ nhiễm đất, nước, khơng khí. Các chất thải này cũng khĩ tham gia vào dây chuyền chuyển hố vật chất của thiên nhiên, gây mất cân bằng sinh thái. Để khắc phục tình trạng này, các nhà khoa học đã đưa vào khối ủ chế phẩm VSV giàu cellulase, kết quả là các chất thải bị phân hủy trong thời gian dưới 1 tháng, gĩp phần hạn chế MT [38].  Ứng dụng trong sản xuất sản phẩm thực phẩm, thực phẩm gia súc Các sản phẩm thực phẩm được sản xuất từ các nguyên liệu thực vật chứa nhiều cellulose gây ra hiện tượng khĩ tiêu hĩa ở người. Người và những động vật khơng nhai lại thường thiếu VSV phân giải cellulose trong đường tiêu hĩa. Do đĩ, việc chế biến thực phẩm nhất là một số sản phẩm đồ hộp bằng chế phẩm cellulase cĩ ý nghĩa làm tăng hiệu suất sử dụng thức ăn. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc thêm chế phẩm cellulase vào thực phẩm gia súc làm tăng trọng đàn lợn và tăng chất lượng thịt [38].  Ứng dụng làm phân bĩn VSV Các chế phẩm VSV cĩ khả năng tổng hợp cellulase mạnh, khi được bĩn vào đất trồng cĩ nhiều chất hữu cơ chứa cellulose sẽ phân hủy nhanh các chất hữu cơ tạo thành mùn, giúp cây trồng phát triển nhanh [29], [38].  Ứng dụng trong kỹ thuật di truyền Enzym cellulase sẽ phá vỡ thành tế bào thực vật để tạo tế bào trần, rất cần thiết trong quá trình chuyển gen của tế bào thực vật [38].  Ứng dụng trong cơng nghệ bột cellulose và giấy, cơng nghệ sợi dệt, cơng nghiệp chất tẩy rửa Đây là hướng được các nhà sản xuất quan tâm nhiều trong những năm gần đây. Sử dụng enzym cellulase để tách mực khỏi giấy báo và tạp chí cũ, cải thiện tính chất quang học cũng như độ bền cơ lý của giấy sản xuất từ bột khử mực. Ở Mỹ, hơn 40%, ở Nhật Bản khoảng 55% tổng lượng giấy sử dụng là bắt nguồn từ giấy loại. Trong cơng nghệ sợi dệt, enzym này được sử dụng để xử lý quần áo bị, làm bĩng vải bơng, vải sợi nhân tạo giúp vải mềm mại hơn, độ hút ẩm tăng lên, bề mặt vải đẹp hơn. Trong cơng nghiệp chất tẩy rửa, các chất tẩy rửa chứa enzym cellulase làm sạch các chất bẩn trong lịng xơ bơng tốt hơn sử dụng phương pháp tẩy rửa thơng thường [54]. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu  Đối tượng nghiên cứu - Nấm sợi sinh enzym cellulase phân lập từ RNM Cần Giờ. - Các VSV kiểm định: E. coli, Bacilllus subtilis được cung cấp từ Viện Pasteur.  Hĩa chất - Các hĩa chất cĩ nguồn gốc từ Việt Nam: Glucose, dầu DO, pepton, cazêin, kitin, tinh bột tan, agar, cồn đốt, nước cất, nước biển. - Các hĩa chất cĩ nguồn gốc từ Trung Quốc: K2HPO4 , KH2PO4., KCl, NaCl, NaOH, NaNO3, MgSO4. 7H2O, FeSO4.7H2O, HgCl2, Na-acetate, lugol, lactophenol, xanh metylen Loeffler…. - Hĩa chất cĩ nguồn gốc từ Đức: thuốc thử DNS, Yeast extract, …. - Hĩa chất cĩ nguồn gốc từ Nhật Bản: CMC, muối Tartrat K Natri…  Cách pha chế thuốc thử DNS (2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid) [32]. - Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic: Cân 10g DNS cho vào becher (cốc thủy tinh) 1000ml, thêm 400ml nước cất, đặt becher vào nước 800C, khuấy đều. Thêm dung dịch NaOH (16g NaOH trong 150 ml nước cất) từ từ vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C. Thêm 300g muối Tartrat K Natri vào dung dịch DNS, khuấy ở nhiệt độ 800C, làm lạnh đến nhiệt độ phịng vào bình định mức 1000ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. Bảo quản dung dịch DNS trong chai màu nâu cĩ nắp. - Dung dịch lactose: Hịa tan 0,12g lactose với 80ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều. - Dung dịch DNS-lactose: Trộn 150ml DNS với 50ml dung dịch lactose.  Thiết bị, dụng cụ  Các thiết bị Nồi hấp vơ trùng Autoclave (Đài Loan) Tủ cấy vơ trùng (Việt Nam) Tủ sấy Memmert (Đức) Tủ ấm Sanyo (Nhật) Tủ giữ mẫu Sanyo (Nhật) Kính hiển vi Olympus (Nhật Bản) Tủ lạnh National (Tokyo, Nhật Bản) Máy đo pH Hana (Nhật) Máy li tâm Heraeus (Đức) Cân điện Sartorius (Đức) Cân phân tích điện tử Scientech (Mỹ) Máy chụp ảnh kỹ thuật số Olympus (Nhật) Máy nghiền mẫu (Đức) Máy đo độ ẩm Sartorius (Đức) Máy lắc Gerhardt (Đức) Máy li tâm Hettich (Đức) Máy đo quang phổ UV/ Visible Spectrophometer (Nhật)  Các dụng cụ thí nghiệm Thước đo KL, lị điện, cốc thủy tinh, bình tam giác, ống nghiệm, đĩa petri, đèn cồn, diêm quẹt, que trang, que cấy, giấy quỳ, giấy lọc, giấy báo cũ, lame, lammel, bơng mỡ, bơng thấm nước….  Mơi trường  MT phân lập, nuơi cấy và giữ giống, định danh nấm sợi  MT1: MT Czapek- Dox cải tiến [29], [58] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Glucoza : 20 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút  MT 2: MT D [20], [58] - Glucoza : 0,05 g - Peptone : 0,05 g - Yeast extract : 0,05 g - Agar : 30 g - Nước biển : 1000 ml - pH = 6,5. Khử trùng 1atm trong 30 phút  MT 3: MT cao men agar-Yeast extract agar (YEA) [20], [58] - Cao nấm men : 4 g - Glucoza : 20 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000 ml - pH = 5,5 – 6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút  MT 4: MT Potato glucose agar (PGA) [7] - Nước chiết khoai tây : 200 ml - Glucoza : 20g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000 ml - pH = 5,5- 6,0. Khử trùng 1atm trong 30 phút * Cách chế nước chiết khoai tây Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 200g, xắt lát, thêm 1 lít nước cất, đun sơi trong 30 phút. Lọc lấy dịch trong.  MT thử hoạt tính enzym bằng phương pháp khuếch tán trên thạch  MT 5: MT thử hoạt tính cellulase [47] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - CMC : 10 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút  MT 6: MT thử hoạt tính protease [10] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Cazêin : 15 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút  MT 7: MT thử hoạt tính amylase [47] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Tinh bột tan : 15 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút  MT 8: MT thử hoạt tính kitinase [22] - NaNO3 : 3,5 g - K2HPO4 : 1,5 g - MgSO4.7H2O : 0,5 g - KCl : 0,5 g - FeSO4.7H2O : 0,01 g (vết) - Bột kitin : 10 g - Agar : 20 g - Nước biển : 1000ml - pH = 6,5. Khử trùng 1 atm/ 30 phút * Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tơm - Vỏ, đầu tơm rửa sạch, sấy khơ. - Xử lý tách protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70-750C/ 4 giờ, sau đĩ rửa sạch bằng nước cất. - Tách khống bằng dung dịch HCl 8% ở 26- 300C/ 16 giờ, rửa sạch. - Sấy khơ, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh.  MT 9: MT phát hiện khả năng phân giải dầu [29] - KH2PO4 : 0,3 g - MgSO4 : 0,4g - KNO3 : 3 g - Na2HPO4 : 0,7 g - Nước biển : 1000ml - Dầu DO : 5ml - pH = 5,5- 6,0. Khử trùng ở 1atm/ 30 phút  MT nuơi cấy nấm sợi tạo enzym  MT 10: MT xốp cơ sở [18], [30] - Cám : 60% - Bột đậu nành : 30% - Bột ngơ : 10% - Trấu : bổ sung thêm 25% - Độ ẩm : 60% - pH = 5,0 – 5,5. Khử trùng 1atm/ 60 phút  MT nuơi cấy giữ giống vi khuẩn kiểm định  MT 11 : MT Meat pepton agar (MPA) [27] - Pepton : 5g - NaCl : 5g - Cao thịt : 5g - Agar : 20g - Nước cất : 1000 ml - pH= 7,5. Khử trùng 1atm/ 30 phút 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp lấy mẫu từ RNM Cần Giờ [58] Tiến hành lấy mẫu ở các xã thuộc huyện Cần Giờ: xã Bình Khánh, xã Tam Thơn Hiệp, xã An Thới Đơng, xã Long Hịa, xã Bình Khánh, Lâm Viên….Đi sâu vào các rừng già, cách biển khoảng 2 km, các điểm lấy mẫu cách nhau khoảng 200m. Vị trí lấy mẫu theo những vị trí chấm đỏ trên bản đồ (hình 2.1). Lấy mẫu phân lập trong 3 tháng (tháng 7, 8, 9), mỗi tháng lấy mẫu một lần. Khu vực lấy mẫu là vùng nước lợ cĩ độ mặn 30 ‰ , nhiệt độ khoảng 290C, pH 7,6. Hình 2.1. Vị trí lấy mẫu ở RNM Cần Giờ Lấy các mẫu đất mặt, đất cách bề mặt 5- 10 cm, lá vàng sắp rụng, lá rụng bị mục, thân cành chết khơ cịn trên cây, thân cành chết đang bị phân hủy trên mặt đất. Cách lấy: Dùng dao, kéo vơ trùng cắt khoảng 20g mẫu cho vào túi nilon vơ trùng buộc kín, đánh số, ghi địa điểm lấy mẫu, ngày tháng, bảo quản trong thùng nước đá vận chuyển về PTN và giữ ở tủ giống 40C. Các mẫu được phân lập ngay khơng giữ quá 24 giờ. 2.2.2. Phương pháp vi sinh 2.2.2.1. Phương pháp phân lập mẫu trực tiếp và pha lỗng mẫu theo Uyenco, 1988 [58], [78] a- Lấy mẫu và pha lỗng mẫu Lấy 10g mẫu lá, đất, thân, cho vào túi lọc mẫu, thêm 90ml nước biển Cần Giờ vơ trùng. Dập mẫu bằng máy nghiền mẫu trong vịng 2 phút, tốc độ 230 vịng/ phút. Túi lọc mẫu giữ lại chất hữu cơ, phần dịch hơi đục chảy ra bên ngồi. Lấy dịch lọc ta được dung dịch pha lỗng 10-1. Lắc đều, rồi hút 1 ml dung dịch 10-1 cho vào ống nghiệm chứa 9ml nước biển vơ trùng ta được dung dịch pha lỗng nồng độ 10-2. Tiếp tục pha lỗng như thế ta được dung dịch nồng độ 10-3, 10-4, 10-5. b- Cấy mẫu Nhỏ 2 giọt dung dịch ở mỗi nồng độ lên đĩa petri chứa MT1, MT2, MT3. Dùng que trang trải đều khắp mặt thạch. Sau đĩ sử dụng que trang đĩ trải tiếp hai đĩa tiếp theo. c- Ủ mẫu Lật ngược đĩa petri, gĩi vào giấy báo cũ, ủ ở nhiệt độ phịng từ 3 – 7 ngày. Chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang ống nghiệm thạch nghiêng. d- Làm thuần Lấy một KL riêng rẽ trong ống thạch nghiêng, hịa vào nước biển vơ trùng, trải lên đĩa lần hai. Nếu các dạng KL đồng đều, cĩ màu sắc giống nhau, soi dưới KHV đều cĩ một dạng tế bào chứng tỏ giống phân lập thuần khiết. Sau đĩ chọn KL riêng rẽ cấy truyền sang 3 ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm hình thái sinh lí, sinh hĩa. 2.2.2.2 Phương pháp bảo quản giống nấm sợi trên MT thạch cĩ lớp dầu khống [6] Dầu khống là parafin hay vaselin, hấp vơ trùng ở 1210C trong 2 giờ rồi sấy khơ ở 1700C trong 1- 2 giờ, để nguội. Chuẩn bị 3 ống giống đã nuơi ở nhiệt độ phịng và thời gian thích hợp. Đổ lớp dầu khống đã vơ trùng lên bề mặt. Hàn kín ống nghiệm bằng parafin bảo quản ở nhiệt độ 40C. Phương pháp này cĩ thể bảo quản trong 1- 3 năm. 2.2.2.3. Phương pháp quan sát đại thể nấm sợi [5], [6], [11] Nấm sợi sau khi cấy truyền sang thạch nghiêng, ta tiến hành tạo khuẩn lạc (KL) khổng lồ theo các bước sau: - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước biển vơ trùng. - Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm. Lắc đều tạo dung dịch huyền phù. - Dùng que cấy chấm vào dung dịch huyền phù rồi nhanh chĩng chấm điểm vào mặt thạch ở giữa hộp petri. Làm 2,3 hộp. - Ủ ấm trong một tuần để tạo KL. Hàng ngày lấy ra quan sát. Dùng kính lúp ba chiều soi mơ tả các đặc điểm: + Kích thước KL để biết tốc độ phát triển của nĩ. + Hình dạng KL. + Màu sắc KL mặt phải, mặt trái và sự thay đổi màu sắc. + Màu sắc của MT do sắc tố nấm sợi tạo ra. + Dạng sợi nấm mọc ở mặt trên MT. + Đặc điểm của mép KL. + Giọt nước đọng, chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt KL……. 2.2.2.4. Phương pháp quan sát vi thể nấm sợi [6] Phương pháp cấy khối thạch của J.T.Dunean - Chuẩn bị MT thích hợp, đổ một lớp thật mỏng (khoảng 1mm) trong các đĩa petri. - Dùng khoan nút chai vơ trùng cĩ d = 8 mm, khoan các khối thạch. - Chuẩn bị các đĩa petri sạch, phiến kính, lá kính, bơng thấm nước, nước cất vơ trùng. - Đặt 1 hoặc 2 khối thạch trên mỗi phiến kính. Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vơ trùng lên trên bề mặt các khối thạch. - Các phiến kính cĩ khối thạch cấy nấm sợi nghiên cứu được đặt trong các hộp petri cĩ sẳn một ít bơng thấm nước được làm ẩm bằng nước cất vơ trùng. Giữ các hộp petri này trong tủ ấm 3-4 ngày. - Khẽ gỡ lá kính ra, úp lên một phiến kính sạch cĩ một giọt thuốc nhuộm lactophenol, ta được tiêu bản thứ nhất. - Gỡ bỏ lớp thạch và để nguyên phần nấm sợi trên phiến kính, nhỏ giọt lactophenol, đậy lá kính lên trên là ta được tiêu bản thứ hai. - Dùng kính hiển vi (KHV) quan sát, vẽ và mơ tả các đặc điểm: + Hình dạng cuống sinh bào tử. + Hình dạng thể bình. + Hình dạng các thể bọng. + Sợi nấm cĩ hay khơng cĩ sự phân nhánh và vách ngăn. + Đặc điểm bào tử đính. + Màu sắc, kích thước bào tử… - Chụp hình trên KHV quang học ở độ phĩng đại 400-1000 lần. 2.2.2.5. Phương pháp lên men bán rắn để thu nhận enzym cellulase [3], [22], [29], [34],[36], [40], [42] a. Nguyên tắc Nấm sợi sử dụng chất dinh dưỡng cĩ sẳn trong MT để sinh trưởng tạo thành một lượng lớn enzym ngoại bào lẫn trong MT, ta thu được sinh khối nấm sợi lẫn enzym thơ. b. Cách tiến hành Nấm sợi được nuơi cấy trong ống nghiệm thạch nghiêng chứa MT PGA ủ trong tủ ấm trong thời gian 4-5 ngày. Rửa bào tử từ bề mặt thạch nghiêng với dung dịch chứa Tween 80 0,1%, thu được huyền phù bào tử của từng chủng. Cho vào bình tam giác chứa 30g MT 11 đã làm ẩm và hấp khử trùng ở 1atm trong 60 phút. Nuơi ủ ở nhiệt độ phịng trong 3- 4 ngày. Sau khi nuơi đủ thời gian, thu lấy MT đem sấy nhẹ, cĩ quạt giĩ ở nhiệt độ 400C để đạt độ ẩm 8- 12%, nghiền nhỏ, bảo quản trong chai, lọ sứ thuỷ tinh. Chế phẩm này gọi là chế phẩm enzym thơ [40], [29], [14]. 2.2.2.6. Phương pháp ly trích enzym cellulase [29] a. Nguyên tắc Dựa trên khả năng hịa tan trong nước của các enzym trong nước cất tạo thành dịch enzym. b. Cách tiến hành Chế phẩm enzym thơ thu được đem sấy khơ ở 400C, nghiền mịn, cho nước cất vào với tỉ lệ 1: 3, lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vịng /phút/ 1 giờ. Sau đĩ ly tâm với tốc độ 3000 vịng/ phút/ 15 phút, thu dịch trong, làm lạnh. Để giảm ảnh hưởng của đường tự do cĩ trong mơi trường lên men, đem tủa dịch lọc bằng cồn 960 đã làm lạnh theo tỉ lệ (1:3). Thu tủa và hịa lại bằng dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH5, ta được dịch enzym sử dụng dần. 2.2.3. Phương pháp hĩa sinh 2.2.3.1. Phương pháp xác định hoạt độ enzym carboxymethyl cellulase (CMCase) [28], [40] a. Nguyên tắc Một đơn vị hoạt tính CMCase là lượng enzym cần thiết để giải phĩng ra đường khử (như glucose) khi thủy phân CMC ở tốc độ 1µmol/phút dưới các điều kiện phản ứng. Phương pháp này dựa vào sự thủy giải cơ chất carboxymethyl cellulose (CMC) bằng enzym carboxymethyl cellulase (CMCase) ở pH 5,0 và 400C. Sau phản ứng sẽ tạo ra một lượng đường khử, đường khử sẽ phản ứng với 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic acid tạo thành phức màu đỏ sậm và được xác định bằng máy đo mật độ quang ở bước sĩng 540nm. b. Cách tiến hành Các hĩa chất cần chuẩn bị: - Dung dịch cơ chất CMC 1%: Cân chính xác 1,0g CMC, hịa tan trong 80 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5, chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm dung dịch đệm đến vạch và lắc đều. - Dung dịch enzym: Pha lỗng dịch enzym với dung dịch đệm Na- acetate 50 mM, pH 5,0 đến độ pha lỗng thích hợp. - Dung dịch acid 2-hydroxy-3,5-dinitrobenzoic (DNS). - Dung dịch lactose. - Dung dịch DNS-lactose. * Dựng đường glucose chuẩn Hịa tan 100 mg glucose với 80 ml nước cất và chuyển vào bình định mức 100 ml, thêm nước cất đến vạch và lắc đều, ta được dung dịch glucose nồng độ 1mg/ml. Thực hiện một loạt 7 ống nghiệm theo bảng sau đây: Số thứ tự các ống/ nồng độ glucose (mg/ml) 1/0 2/0,1 3/0,2 4/0,3 5/0,4 6/0,5 7/0,6 - dd glucose 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 - dd CMC 1% 1 1 1 1 1 1 1 - dd DNS- lactose 2 2 2 2 2 2 2 C ác c hấ t b ổ s un g (m l) - Nước cất 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 Lắc đều các ống nghiệm này, đem đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong một chậu nước mát. So màu trên máy quang phổ UV/Visible Spectrophometer, bước sĩng 540 nm. Dựa vào sự tương quan giữa nồng độ glucose chuẩn và độ hấp thụ OD dựng đường biểu diễn sự biến thiên của OD và nồng độ glucose chuẩn. Đường này là một đường thẳng đi qua gốc tọa độ. * Tiến hành phản ứng - Hút 1ml dung dịch enzym cho vào ống nghiệm thử thật (ống TN), thay 1 ml dung dịch đệm Na-acetate 50mM, pH 5 đối với ống đối chứng (ĐC) - Đặt vào bể ổn nhiệt 400C/5 phút. Đồng thời ta cũng để chai chứa lượng dung dịch CMC 1% thích hợp ở 400C/5 phút. - Sau đĩ, thêm 1 ml dung dịch CMC 1% vào ống nghiệm chứa enzym và lắc đều. Để phản ứng ở 400C chính xác 10 phút. - Thêm 2 ml dung dịch DNS-lactose, lắc đều để phản ứng enzym. - Đem đun sơi cách thủy trong 15 phút. Làm lạnh đến nhiệt độ phịng trong một chậu nước mát. - So màu ở bước sĩng 540nm, dựa theo đường glucose chuẩn tính được nồng độ glucose của mẫu thí nghiệm. c. Tính kết quả - Giá trị hệ số glucose trung bình (F): F = (0,1/AG0,1 + 0,2/AG0,2 +….+0,6/AG0,6)/6 - Hoạt tính enzym : CMCase (IU/g) = ( AT – AB) x F x (1.000/180) x (1/10phút) x (1/1.0 ml) x (1/C) Trong đĩ: F : Hệ số glucose (mg/ml) AG : Độ hấp thu OD của dung dịch glucose chuẩn. AT : Độ hấp thụ của dung dịch cĩ phản ứng enzym (ống TN) AB : Độ hấp thu của dung dịch khơng cĩ phản ứng enzym (ống ĐC). 1.000: Hệ số chuyển đổi mg thành µg. 180 : Trọng lượng phân tử của glucose, đổi từ µg sang µmol. 10 phút: Thời gian phản ứng. 1.0 : Thể tích dung dịch enzym (ml). C: Nồng độ dung dịch mẫu (g/ml). 2.2.3.2. Phương pháp xác định hoạt độ enzym ngoại bào của nấm sợi bằng cách đo đường kính vịng thủy phân [47] a. Nguyên tắc Cho enzym tác dụng lên cơ chất trong MT thạch, cơ chất bị phân hủy, độ đục MT giảm, MT trở nên trong suốt. Độ lớn của phần MT trong suốt phản ánh hoạt động của enzym. Phương pháp này chỉ định tính enzym, chỉ đánh giá sơ bộ chứ chưa nghiên cứu sâu. b. Tiến hành thí nghiệm * Phương pháp cấy chấm điểm - Chuẩn bị các chủng nấm sợi nghiên cứu và các MT thử hoạt tính enzym ngoại bào với các cơ chất tương ứng MT 6, MT7, MT8, MT9, MT10. - Cấy chấm điểm các chủng nấm sợi (3 điểm) lên bề mặt MT. - Ủ trong tủ ấm 300C trong 3-4 ngày. * Phương pháp khuếch tán trên MT thạch - Thu dịch nuơi cấy: Lấy 10g MT nuơi cấy nấm sợi trên MT11 đã ủ 3 ngày trong tủ ấm, sấy khơ, nghiền với 100ml nước cất, ly tâm 10 phút, tốc độ quay 5000 vịng/ phút. Thu được dịch enzym thơ. - Dùng khoan nút chai (d=8mm) vơ trùng, khoan các lỗ thạch trên MT thử hoạt tính các enzym cellulase, protease, amylase, kitinase trên các đĩa petri. Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1ml dịch enzym vào các lỗ khoan. Giữ các hộp petri ở tủ lạnh 40C trong 1- 2 giờ, sau đĩ chuyển sang giữ trong tủ ấm trong 24 giờ. Sau 24 giờ dùng thuốc thử lugol, HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch và đo đường kính vịng phân giải bằng thước đo KL. c. Kiểm tra kết quả - Kiểm tra hoạt tính cellulase, amylase, kitinase. Cả ba loại enzym này đều dùng thuốc thử lugol nhỏ lên bề mặt thạch:  Nếu nấm sợi cĩ hoạt tính cellulase sẽ tạo vịng trong suốt quanh KL hoặc lỗ khoan chứa dịch enzym do cellulose bị phân giải.Vùng cellulose chưa bị phân giải cĩ màu tím hồng nhạt.  Nếu nấm sợi cĩ hoạt tính amylase sẽ tạo vịng trong suốt xung quanh KL hoặc lỗ khoan cĩ chứa dịch enzym.Vùng tinh bột chưa bị phân giải cĩ màu xanh tím đậm.  Nếu nấm sợi cĩ hoạt tính kitinase, vùng kitin chưa bị phân giải cĩ màu nâu đỏ nhạt. - Kiểm tra hoạt tính protease: Dùng HgCl2 nhỏ lên bề mặt thạch. Nếu nấm sợi sinh ra protease, sẽ cĩ một vịng trong suốt quanh KL hoặc quanh lỗ khoan, do các phân tử protein bị phân giải khơng cịn phản ứng với HgCl2. Vùng chứa protein chưa bị phân giải cĩ màu trắng đục do khi phản ứng vớI HgCl2 protein bị kết tủa. d. Đánh giá khả năng tạo enzym Đặt sấp hộp petri. Dùng thước đo đường kính vịng phân giải (D) và đo đường kính KL (d), hoặc đường kính lỗ thạch (d=8mm). Dựa vào kết quả (D-d, mm) để đánh giá hoạt tính enzym của các chủng nấm sợi. Nếu giá trị (D-d) càng lớn thì khả năng sinh enzym của nấm sợi càng cao. - Quy ước:  D-d ≥ 25mm : hoạt tính enzym mạnh.  D-d ≥ 20mm : hoạt tính enzym khá mạnh  D-d ≥ 15mm : hoạt tính enzym trung bình.  D-d ≤ 10mm : hoạt tính enzym yếu. 2.2.3.3. Phương pháp kiểm tra hoạt tính kháng sinh [21] a. Nguyên tắc Chất kháng sinh do nấm sợi sinh ra sẽ ức chế sự phát triển của VSV kiểm định làm cho VSV khơng phát triển được xung quanh lỗ khoan chứa dịch kháng sinh hay khối thạch chứa nấm tạo thành vịng vơ khuẩn trong suốt. b. Cách tiến hành - Cấy nấm sợi trên MT YEA khơng cĩ thạch, rồi ủ ba ngày ở nhiệt độ phịng. Ly tâm 3000 vịng/ 10 phút, thu dịch kháng sinh. - Dùng khoan nút chai khoan các khối thạch của MT cĩ chứa VSV kiểm định (E.coli, Bacillus subtilis). - Dùng pipet vơ trùng nhỏ 0,1ml dịch kháng sinh vào các lỗ khoan. - Để trong tủ lạnh 40C trong 8 giờ để dịch kháng sinh khuếch tán vào trong thạch. Sau đĩ chuyển sang tủ ấm 300C. Kiểm tra vịng ức chế sau 24h. c. Kiểm tra kết quả Nếu nấm nghiên cứu sinh ra chất kháng sinh sẽ cĩ một vịng trong suốt xung quanh khối thạch do các chất kháng sinh đã ức chế sự phát triển của VSV kiểm định tạo thành vịng trịn trong suốt (vịng vơ khuẩn) xung quanh lỗ khoan. Khả năng sinh kháng sinh được đáng giá bằng hiệu số (D-d, mm). Quy ước:  D-d ≥ 25mm : hoạt tính kháng sinh rất mạnh.  D-d ≤ 20mm : hoạt tính kháng sinh mạnh.  D-d= 15 ÷18mm : hoạt tính kháng sinh trung bình.  D-d < 15mm : hoạt tính kháng sinh yếu. 2.2.3.4. Phương pháp kiểm tra khả năng phân giải dầu [29] Cấy nấm sợi trong bình tam giác 100 ml cĩ chứa ._.