Nghiên cứu khả năng phòng và chữa trị ung thư của hoạt chất Paenol tách chiết từ cây xích thược Việt Nam trên chuột được gây u thực nghiệm

I CAM ðOAN Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của tơi, những số liệu trong luận văn này là hồn tồn trung thực và kết quả nghiên cứu chưa từng được sử dụng. Mọi thơng tin trích dẫn trong báo cáo này đã được ghi rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày tháng năm 2010 TÁC GIẢ ðặng Thị Hoè Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... ii LỜI CẢM ƠN ðể hồn thành đề tài này, ngồi sự cố gắng của bản thân, tơi cịn nhận được rất nhiều sự quan tâm giúp đỡ của các thầy cơ giáo, gia đình, bạn bè và đồng nghiệp. Trước hết tơi xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc tới PGS.TS. Phạm Ngọc Thạch trưởng bộ mơn Nội chẩn dược và độc chất, Khoa Thú y, trường ðại Học Nơng Nghiệp Hà Nội và TS. ðỗ Thị Thảo Tổ trưởng Tổ Thử nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, viện Khoa học và cơng nghệ Việt Nam, người đã tận tình hướng dẫn giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn các thầy cơ giáo trong Viện đào tạo sau đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Thú y, Bộ mơn Nội chẩn dược và độc chất Khoa Thú y, Trường ðại Học Nơng Nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ, tạo điều kiện trong suốt thời gian học tập cũng như trong thời gian thực hiện đề tài. Xin chân thành cảm ơn ban lãnh đạo, các anh chị tổ thử nghiệm sinh học, viện cơng nghệ sinh học Viện khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tơi trong quá trình nghiên cứu, thực hiện thí nghiệm, thu thập số liệu tại cơ sở. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 04 tháng 12 năm 2010 Tác giả ðặng Thị Hoè Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... iii MỤC LỤC Lời cam đoan Error! Bookmark not defined. Lời cảm ơn Error! Bookmark not defined. Mục lục Error! Bookmark not defined. Danh mục viết tắt trong đề tài Error! Bookmark not defined. Danh mục bảng Error! Bookmark not defined. Danh mục hình Error! Bookmark not defined. 1. MỞ ðẦU 1 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Mục đích nghiên cứu 3 1.3. Ý nghĩa của đề tài 3 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU 4 2.1. Khái quát về bệnh ung thư 4 2.2. Cây Xích thược và dược tính chống ung thư 16 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1. ðối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 26 3.2. Nội dung nghiên cứu 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu 27 3.4. Xử lý số liệu 32 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 4.1. Kết quả tạo mơ hình u thực nghiệm trên chuột thí nghiệm bằng tế bào LLC 34 4.2. Mức độ tăng trọng và tỉ lệ sống sĩt của chuột thí nghiệm gây u bằng tế bào LLC 35 4.3. Kết quả tạo khối u trên chuột bằng dịng tế bào LLC 38 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... iv 4.4. Kết quả xác định liều độc cấp LD50 của hoạt chất paeonol chiết tách từ cây Xích thược 41 4.5. Mức độ tăng trọng của chuột thí nghiệm khi cho uống bán trường diễn của hoạt chất paeonol 43 4.6. Kết quả kiểm tra một số chỉ tiêu sinh lý, sinh hố máu và hoạt độ một số enzyme cơ bản của chuột khi cho uống bán trường diễn của hoạt chất paeonol 45 4.7. Kết quả mổ trực quan nội tạng chuột thí nghiệm khi cho uống bán trường diễn chế phẩm PAN 48 4.8. Khả năng bảo vệ chung và kéo dài tuổi thọ của PAN 49 4.9. Khả năng duy trì và tăng trọng lượng cho động vật bị u của PAN 52 4.10. Khả năng ức chế khối u phát triển và chống di căn 55 4.11. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của PAN đến các chỉ tiêu huyết học và chức năng gan và thận của chuột bị gây u thơng qua một số chỉ tiêu huyết học 57 4.12. Ảnh hưởng của chế phẩm PAN trên mơ bệnh học của gan, thận, lách chuột gây u thực nghiệm 60 4.13. Kết quả tiêu bản thu được từ khối u chuột thí nghiệm 64 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 67 5.1. Kết luận 67 5.2 ðề nghị 67 TÀI LIỆU THAM KHẢO 68 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... v DANH MỤC VIẾT TẮT TRONG ðỀ TÀI - ALT: Alanine aminotransferase (SGPT) - AST: Aspartate aminotransferase (SGOT) - CDDP: Cisplatin - cs: Cộng sự - DDSL: Dung dịch sinh lý - DMEM: Dullbecco Modified Eagle Medium - DMSO: Dimethyl Sulphoixide - DOX: Doxorubicin - EDTA: Ethylene diamine tetraacetic acid - Eca-109: Human Esophageal Epithelial Cancer Cell Line - FBS: Fetal Bovince Serum - 5-FU: 5-fluorouracil - HepA: Hepar - HPLC: High Performance Liquid Chromatography - LD: Lethal Dose - LLC: Lewis lung carcinoma - NCI: National Cancer Institute - Nxb: Nhà xuất bản - PAN: Hoạt chất paenol - PBS: Phosphate Butfered saline - SEG-1: Human oesphageal adenocarcinoma cell line - TN: Thí nghiệm - WHO: World Health Organization Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1: Thời điểm chuột xuất hiện khối u sau khi tiêm tế bào LLC 35 4.2: Mức độ tăng trọng của chuột thí nghiệm (gram) và tỉ lệ chuột sống/chết ở từng lơ thí nghiệm 1, 2, 3, 4, 5 (n=10 chuột) 36 4. 3: Kết quả tạo khối u trên chuột bằng tế bào LLC 38 4.4: ðộc tính cấp của PAN trên chuột thực nghiệm 42 4.5: Ảnh hưởng của PAN lên sự tăng trọng của chuột khi cho uống bán trường diễn 44 4.6: Ảnh hưởng của chế phẩm PAN lên các chỉ tiêu sinh lý và sinh hố máu chuột 46 4.7: Kết quả mổ trực quan nội tạng chuột thí nghiệm được uống chế phẩm PAN khi cho uống bán trường diễn 48 4.8: Số lượng chuột được gây u chết sau khi cho uống PAN là chất bảo vệ 51 4.9: Kết quả theo dõi mức tăng trọng lượng của chuột tại các lơ thí nghiệm 53 4.10: Kết quả theo dõi và đo thể tích khối u của chuột tại các lơ thí nghiệm 55 4.11: Ảnh hưởng của PAN lên chỉ tiêu huyết học và một số enzyme chức năng gan và thận chuột tiêm LLC 59 4.12: Ảnh hưởng của PAN trên mơ bệnh học của gan, thận, lách, phổi chuột thí nghiệm 61 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2. 1. Ảnh cây Xích thược (Paeonia veitchii Lynch.) 17 2. 2. ðề xuất cơ chế chuyển hĩa của paeonol trong cơ thể chuột 19 2. 3a. Khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào theo chương trình của paeonol đối với dịng tế bào ung thư thực quản 21 2. 3b. Khả năng gây chết tế bào theo chương trình của paeonol đối với dịng tế bào ung thư thực quản SEG-1, Eca-109 22 2. 4a. Tác dụng của cisplatin và tác dụng của cisplatin và paeonol đến dịng SEG-1 23 2. 4b. Tác dụng của cisplatin và tác dụng của cisplatin và paeonol đến dịng Eca-109 23 2. 5a. Hệ số tương tác của cisplatin và paeonol đến dịng SEG-1 23 2. 5b. hệ số tương tác của cisplatin và paeonol đến dịng Eca-109 23 2. 6. Sự kết hợp của paeonol và cisplantin gia tăng khả năng gây chết dịng SEG-1 và Eca-109 theo chương trình 24 3.1: Hình ảnh buồng đếm Neubauer 32 4. 1. Mức độ tăng trọng của chuột được gây u bằng tế bào LLC 37 4. 2a. Khối u sần ở khu vực hậu mơn chuột bị tiêm LLC sau 30 ngày thí nghiệm – lơ1 40 4. 2b. Khối u cứng ở nách trái chuột bị tiêm LLC sau 30 ngày thí nghiệm – lơ 3 40 4. 3. Ảnh hưởng của PAN lên sự tămg trọng của chuột thí nghiệm khi cho uống bán trường diễn 44 4. 4. Tế bào LLC nuơi cấy in vitro 49 4. 5. Khả năng tăng trọng lượng cho vật bị u của PAN tại các lơ thí nghiệm 54 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... viii 4. 6. Thể tích khối u của chuột được uống PAN ở các lơ thí nghiệm tại các tuần đo 56 4. 7. Ảnh hưởng của PAN lên một số enzyme chức năng gan chuột được tiêm LLC 59 4. 8a. Lách bất bình thường (LðC) 62 4. 8b. U di căn xuất hiện ở tuyến vú 62 4. 8c. U xuất hiện ở phổi 63 4. 8d. U di căn xuất hiện ở thận 63 4. 9a. Cơ đùi chuột bình thường 64 4. 9b. Cơ đùi chuột bị u với tế bào ung thư đang phân chia bất thường 64 4. 10a. Ảnh tiêu bản mơ phổi chuột thí nghiệm bị ung thư 65 4. 10b. Ảnh tiêu bản mơ phổi bình thường 65 4. 11a. Ảnh tiêu bản mơ vú ung thư 66 4. 11b. Ảnh tiêu bản mơ vú bình thường 66 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 1 1. MỞ ðẦU 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Ngày nay, bệnh dịch xảy ra rất nhiều cả trong nhân y và thú y. Ngồi những bệnh đặc thù của thú y như bệnh Dịch tả lợn, bệnh Tai xanh, bệnh Lở mồm long mĩng, bệnh Newcastle gia cầm, … cịn cĩ các bệnh cĩ căn nguyên từ động vật nhưng lại lây lan và gây nguy hiểm trực tiếp đến con người như bệnh cúm gia cầm (H5N1), bệnh cúm lợn (H1N1), bệnh dại, … ðể điều trị và tiêu diệt bệnh dịch thì địi hỏi sự kết hợp chặt chẽ giữa nhân y và thú y. ðặc biệt trong các phịng thí nghiệm để tìm ra nguyên nhân, triệu chứng và cách điều trị các bệnh nan y của con người như bệnh ung thư khơng thể thiếu các con vật trong thú y để thí nghiệm như chuột, thỏ, chim, … Ung thư hiện đang là một căn bệnh nan y và gây tỉ lệ tử vong cao cho người bệnh. Theo thống kê của Tổ chức y tế thế giới (WHO) thì cĩ khoảng 7,9 triệu người chết (chiếm 13% tổng số người chết) vào năm 2007 vì bệnh ung thư. Những bệnh ung thư phổ biến và dẫn đến tỉ lệ tử vong cao hàng năm là ung thư phổi, gan và ung thư vú. Theo dự đốn, trên thế giới tỉ lệ tử vong do căn bệnh này sẽ tiếp tục tăng cao cĩ thể lên tới con số 9 triệu người chết vào năm 2015 và 11,4 triệu người chết vào năm 2030. Tại Việt Nam, căn bệnh ung thư đang hồnh hành ở khắp mọi miền đất nước và ngày càng tăng cao, với ước tính mỗi năm cĩ 150.000 ca mắc mới và 75.000 người tử vong, gấp 7 lần số người chết do tai nạn giao thơng (http:// www.ungthu.net.vn). Việc tìm ra phương cách chế ngự và chữa trị ung thư thực sự là một thử thách được đặt ra cho các nhà khoa học trên thế giới. Việc chữa trị ung thư thực sự gặp rất nhiều khĩ khăn mặc dù hiện nay đã sử dụng nhiều liệu pháp chữa trị như liệu pháp gen, liệu pháp miễn dịch, hố trị, xạ trị, phẫu thuật hoặc kết hợp các liệu pháp này. Các nhà khoa học Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 2 cũng đã đưa ra liệu pháp phịng chống ung thư (cancer chemoprevention) sử dụng các hoạt chất cĩ tác dụng ngăn chặn bệnh hình thành, tiến triển, phát bệnh và di căn (Boone và cs, 1990 [10]). Tuy nhiên, dù là liệu pháp nào thì khả năng phịng chữa bệnh của chúng sau khi được chứng minh ở mức độ in vitro cũng phải tiếp tục được chứng minh ở mức độ in vivo để tạo cơ sở cho nghiên cứu tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng. Trong nỗ lực tìm kiếm thuốc chữa trị ung thư, các nhà khoa học đã hướng sự tập trung vào các hợp chất thiên nhiên cĩ nguồn gốc từ thực vật. Cây Xích thược cĩ tên khoa học Paeonia veitchii Lynch.Var beresowskii Shiff.) thuộc họ Mẫu đơn (Paeoniaceae) cĩ nguồn gốc ở vùng ðơng Á như Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên. Xích thược là một loại cây thuốc quí được trồng lâu đời ở Trung Quốc, Nhật Bản và Bắc Triều Tiên. Vào đầu những năm 1970, cây đã được di thực trồng ở Việt Nam, nhiều nhất là ở tỉnh Lào Cai (Sa Pa). Theo đơng y Xích thược được dùng để chữa đau vùng ngực, bụng, sườn và mồ hơi trộm. Xích thược phối hợp với nhiều dược liệu khác trong bài thuốc chữa sốt xuất huyết. Ngồi ra, trong các bài thuốc Xích thược dùng để chữa băng huyết, bạch đới, đau tức ngực, đau nhĩi vùng tim, chảy máu dưới da, chảy máu do bệnh nhĩêm khuẩn, viêm tắc động mạch, lao xương và lao khớp xương, ... Với những đặc tính trên, nhiều nghiên cứu in vitro đã chứng minh rằng một số thành phần hĩa học của cây Xích thược cĩ khả năng diệt và ức chế tế bào ung thư phát triển, cĩ khả năng tác động đến quá trình tự chết của tế bào thơng qua kích hoạt enzyme Caspase, tác động và ức chế nhiều yếu tố liên quan quá trình tăng sinh, phát triển và bất tử của tế bào ung thư. ðể đánh giá hoạt tính phịng chống ung thư đầy tiềm năng, đặc biệt là hoạt chất Paenol được chiết xuất từ cây Xích thược của Việt Nam, chúng tơi tiến hành nghiên cứu khả năng phịng chữa ung thư của hoạt chất Paeonol ở Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 3 mức in vivo trên chuột được gây u thực nghiệm. Kết quả nghiên cứu của đề tài sẽ tạo cơ sở cho các nghiên cứu tiền lâm sàng và lâm sàng sau này, nhằm đi đến đích cuối cùng làm ra thuốc phịng và chữa trị ung thư cĩ hiệu quả kinh tế, an tồn cho nhân dân. Với các lí do trên, chúng tơi tiến hành đề tài “Nghiên cứu khả năng phịng và chữa trị ung thư của hoạt chất Paeonol tách chiết từ cây Xích thược Việt Nam trên chuột được gây u thực nghiệm”. 1.2. Mục đích nghiên cứu Chúng tơi tiến hành đề tài này với mục đích: 1. Gây u thực nghiệm trên chuột bằng tế bào LLC để tạo mơ hình cho nghiên cứu khả năng phịng chữa ung thư của hoạt chất Paeonol 2. Nghiên cứu khả năng phịng chữa ung thư của hoạt chất Paeonol ở mức in vivo trên chuột bị gây u thực nghiệm. 1.3. Ý nghĩa của đề tài 1.3.1 Ý nghĩa thực tiễn Cung cấp thơng tin và số liệu cụ thể cùng với những luận chứng khoa học về một số vấn đề sau:
Gây u thực nghiệm trên chuột nhắt trắng dịng BALB/c bằng tế bào ung thư LLC
Nghiên cứu hoạt tính của Paeonol khi sử dụng làm chất bảo vệ để phịng và ngăn chặn sự phát triển khối u ung thư trên chuột đã được gây u thực nghiệm. 1.3.2. Ý nghĩa khoa học Từ các kết quả nghiên cứu của đề tài gĩp phần tìm ra giải pháp, phương thuốc chữa trị căn bệnh ung thư gây tử vong cao trên thế giới. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 4 2. TỔNG QUAN CÁC VẤN ðỀ NGHIÊN CỨU 2.1. Khái quát về bệnh ung thư 2.1.1. Ung thư là căn bệnh của tế bào Khối u ung thư thường phát triển từ một tế bào ban đầu và phải mất một thời gian cho tới khi cĩ một kích thước đủ lớn để cĩ thể cĩ các dấu hiệu nhận biết được. Thơng thường, các tế bào lành cĩ một tuổi thọ nhất định và tuân thủ chặt chẽ theo một quy luật chung là “phát triển- già- chết”. Các tế bào chết đi lại được thay thế bằng các tế bào mới. Cơ thể cĩ một cơ chế kiểm sốt quy luật này rất nghiêm ngặt và duy trì số lượng tế bào của mỗi cơ quan, mỗi tổ chức ở mức ổn định. Bệnh ung thư bắt đầu khi cĩ một tế bào vượt qua cơ chế kiểm sốt của cơ thể, phát triển, sinh sơi khơng ngừng, hình thành một đám tế bào cĩ chung một đặc điểm là phát triển vơ tổ chức, xâm lấn và chèn ép vào các cơ quan, tổ chức sống xung quanh gây tử vong cho người bệnh (Hiệp hội quốc tế chống ung thư UICC,1993). 2.1.2. Phân loại ung thư theo nguồn gốc tế bào Hiện tại, các loại ung thư được các nhà khoa học phân chia theo nguồn gốc phát sinh tế bào của chúng (Nguyễn Chấn Hùng, 1994) gồm: • Carcinoma (nguồn gốc biểu bì): là dạng ung thư phổ biến nhất, xuất phát từ những tế bào cĩ nguồn gốc từ lá phơi trong (endoderm) và lá phơi ngồi (ectoderm). Các ví dụ hay gặp nhất về loại ung thư này là ung thư phổi, ung thư vú, ung thư trực tràng.v.v. • Sarcoma: là dạng ung thư ít gặp hơn, xuất phát từ những tế bào cĩ nguồn gốc là phơi giữa (mesoderm) và là những tế bào thuộc vào hệ thống chống đỡ cho cơ thể như xương, sụn, mỡ, mơ liên kết và cơ. • Lymphoma: là dạng ung thư tương đối hiếm gặp, xuất phát từ các hạch bạch huyết và các mơ thuộc hệ thống miễn dịch của cơ thể. Ví dụ về loại bệnh này như ung thư Lymphoma Burkit. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 5 • Leukemia: là dạng ung thư nguy hiểm do biểu hiện bệnh rất sớm, ở cả trẻ em và người trẻ tuổi, xuất phát từ các tế bào máu non thuộc tuỷ xương và cĩ xu hướng tích tụ thành số lượng lớn trong hệ máu như trong trường hợp ung thư bạch cầu cấp tính (Human Acute Leukemia). 2.1.3. Các giai đoạn của bệnh ung thư Quá trình phát triển từ một tế bào ung thư ban đầu thành một khối u ung thư và đe doạ tính mạng người bệnh trải qua nhiều giai đoạn. Giai đoạn đầu là hình thành tế bào ung thư khởi phát do ảnh hưởng của các tác nhân nội bào hay ngoại bào nào đĩ. Diễn biến tiếp theo là quá trình phân chia liên tục khơng ngừng của tế bào ung thư này thành một khối u được gọi là quá trình phát triển bệnh. Các tế bào ung thư trong khối u sẽ tiếp tục tăng sinh, tự mất đi các thụ cảm thể nhận biết giới hạn khơng gian phát triển với các tế bào lân cận, sản xuất ồ ạt các cytokine (cell signals) và các enzyme protease dẫn tới phá huỷ màng đệm lĩt và mơi trường ngoại bào bao quanh khiến chúng cĩ liên kết lỏng lẻo, dễ dàng bứt ra khỏi khối u mẹ, theo mạch máu và mạch bạch huyết di chuyển tới các tổ chức và cơ quan mới, bám lại và tiếp tục tăng sinh vơ tổ chức. Quá trình này gọi là sự di căn (metastatic process). Các tế bào ung thư chèn ép hay di căn vào các cơ quan giữ chức năng sống trong cơ thể như não, phổi, gan, thận… khiến bệnh nhân tử vong (Hiệp hội quốc tế chống ung thư UICC, 1993)[5], (Darnell J. và cs, 1990) Như vậy, căn bệnh ung thư cĩ thể được tĩm tắt theo sơ đồ: 2.1.4. Tác nhân gây bệnh ung thư 2.1.4.1. Tác nhân mơi trường: Là hàng loạt các tác nhân hố học, vật lí như: Tế bào ung thư Tế bào bình thường Tác nhân nội hoặc ngoại bào Quá trình tăng sinh và phát triển Bệnh ung thư Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 6 • Trong số rất nhiều các tác nhân gây ung thư, khĩi thuốc lá được xem là mối nguy hại tiềm ẩn lớn nhất cho sức khoẻ cộng đồng với hơn 20 chất hố học cĩ khả năng gây ung thư. Các khí đốt xăng dầu, động cơ, khí thải nhà máy cơng nghiệp.v.v.. cũng được xem là độc hại và gây ơ nhiễm mơi trường, cĩ khả năng gây ung thư cao cho con người (ðái Duy Ban và cs, 2000), (National Cancer Institute – NCI, 2005). • Các nhĩm hố chất gây ung thư (chemical carcinogens) rất đa dạng về mặt cấu trúc hố học và cĩ mặt ở khắp mọi nơi như các nitrosamin cĩ rất nhiều trong thành phần thuốc lá, các alcohol trong rượu, các polycyclic aromatic hydrocarbon (PAH), polyvinyl chlorid (PVC), các thuốc trừ sâu thuộc nhĩm halogen hữu cơ (DDT), chlobenzylat, formaldehydev.v… Tác nhân hố chất gây ung thư theo 2 cách: tác động trực tiếp đến hệ gen hoặc gián tiếp thơng qua việc kích hoạt protein enzyme kinase chịu trách nhiệm trong việc điều khiển quá trình phân chia của tế bào (ðái Duy Ban và cs,2000), (Darnell J và cs,1990). • Các yếu tố phĩng xạ như tia X, tia gamma, các đồng vị phĩng xạ như 3H, 14C, 32P v.v.. dùng trong quân sự, y học, nghiên cứu khoa học v.v,… hay nguồn phĩng xạ tự nhiên từ vũ trụ, từ các đồng vị phĩng xạ trong khơng khí, đất và nước cũng là một trong số những tác nhân cĩ khả năng gây ung thư rất cao cho con người (ðái Duy Ban, Lữ Thị Cẩm Vân, 1995), (Nguyễn Chấn Hùng, 1994). • Ngồi ra cịn cĩ một số tác nhân khác như các gốc tự do trong cơ thể tác động đến hệ gen và gây đột biến nghiêm trọng như tia tử ngoại mơi trường, tia UV, sĩng điện từ, chế độ ăn uống giàu lipit, đạm. v.v…(ðái Duy Ban và cs, 1995), (Nguyễn Chấn Hùng, 1994). 2.1.4.2. Tác nhân sinh học Tác nhân sinh học được đề cập ở đây chủ yếu là một số loại virus và vi khuẩn cĩ khả năng khởi động sự phát triển ung thư khi lây nhiễm vào tế bào Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 7 bình thường (ðái Duy Ban và cs, 2000), (Darnell J. và cs, 1990). Virus gây ung thư cĩ hai loại là virus DNA và virus RNA. Cơ chế gây ung thư của các virus này tương đối phức tạp và chưa được hiểu hết tuy nhiên cĩ thể xem như chúng gây biến đổi và chuyển dạng tế bào chủ bằng cách hợp nhất một số gen của mình vào hệ gene của tế bào bị chúng lây nhiễm khiến cho hoạt động bình thường của các gene bị kích hoạt bất thường, các Proto- oncogene biến đổi thành Oncogene mở đầu cho sự hình thành căn bệnh ung thư (Darnell J. và cs, 1990). 2.1.5. Khái quát về tế bào ung thư 2.1.5.1. Các đặc tính của tế bào ung thư Các tế bào ung thư thường cĩ rất nhiều nhiễm sắc thể bất thường và khơng ổn định. Xét về mặt hình thái, các tế bào ung thư cĩ tỉ lệ nhân/ TBC (tế bào chất) cao, nhân to, xuất hiện rất nhiều sợi phân bào so với tế bào bình thường khác. Tế bào ung thư nhìn chung kém biệt hố so với tế bào bình thường do sự phân chia quá nhanh chĩng và diễn ra liên tục (Darnel J. và cs, 1990). ðặc tính đặc trưng, nguy hiểm nhất của tế bào ung thư là khả năng xâm lấn và di căn. Các tế bào ung thư khơng khu trú tại chỗ mà chúng tăng cường xâm lấn vào các tổ chức sống lân cận, xâm nhập vào cả hệ thống tuần hồn và bạch huyết để di chuyển tới những vị trí cách xa nơi tế bào ung thư phát sinh. Hiện nay, đặc thù này của tế bào ung thư vẫn chưa hồn tồn sáng tỏ trên cơ sở khoa học (Darnel J. và cs, 1990). Trong cơ thể con người, mỗi phút cĩ tới 10 triệu tế bào sinh sơi. Quá trình phân chia này diễn ra theo một khuơn mẫu và được kiểm sốt chặt chẽ. Tuy nhiên, khi một tế bào trở thành ung thư, nĩ sẽ cĩ hoạt động phân chia bất thường. Cụ thể, quá trình phân chia diễn ra nhanh hơn và các tế bào con cháu được sinh ra sẽ khơng trưởng thành và chết đi như các tế bào bình thường khác, ngược lại chúng lại tiếp tục phân chia vơ tổ chức và ngày càng trở nên Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 8 khác biệt di truyền với tế bào mẹ ban đầu (Darnel J. và cs, 1990). Một trong những đặc tính đáng chú ý khác của tế bào ung thư là chúng cĩ khả năng vượt qua sự kiểm sốt của hệ miễn dịch để tồn tại và phát triển. Trong hệ máu cĩ những tế bào “giết tự nhiên”(Natural Killer Cell) cĩ thể ngay lập tức nhận dạng và tiêu diệt những tế bào lạ xâm nhập hay xuất hiện trong cơ thể. Tuy vậy, đáng ngạc nhiên là tế bào ung thư cĩ những thay đổi đáng kể khác lạ với tế bào bình thường nhưng lại thốt khỏi sự phát hiện và tìm diệt của hệ miễn dịch. Tế bào ung thư là tế bào của chính cơ thể bệnh nhân nhưng thối hố, biến chất nguy hiểm mà hệ miễn dịch khơng nhận biết được (Darnel J. và cs, 1990). 2.1.5.2. Tình hình nuơi cấy in vitro tế bào ung thư phục vụ nghiên cứu Tế bào là đơn vị sống tồn vẹn của một cơ thể động vật. Cách đây trên 100 năm các nhà khoa học đã tìm cách nuơi cấy tế bào động vật và đã thành cơng. ðến năm 1991, khi H. Lewis thành cơng trong việc sản xuất mơi trường nhân tạo để nuơi cấy tế bào động vật thì cơng nghệ nuơi cấy tế bào động vật invitro được xem là chính thức hình thành. Việc nuơi cấy tế bào động vật phục vụ cho các nghiên cứu khoa học trở thành các kĩ thuật rất hiệu quả trong phịng thí nghiệm (Bradley L. A. và cs, 2002). Từ những nguyên lý chung của cơng nghệ tế bào động vật, một câu hỏi được đặt ra: “ Tế bào động vật cĩ thể nuơi cấy được vậy tế bào ung thư thì sao?”. Câu trả lời đã xuất hiện khi tế bào ung thư Hella tách từ tử cung một phụ nữ là dịng tế bào ung thư đầu tiên được nuơi cấy và vẫn được nuơi cấy cho đến nay để sử dụng vào mục đích nghiên cứu ung thư và tìm thuốc điều trị ung thư. Tới nay, hơn 200 loại ung thư đều đã cĩ các dịng tế bào chuẩn được nhân nuơi, lưu giữ trong các ngân hàng tế bào (như ATCC ở Hoa Kỳ, HTCB ở ðức, RIKEN ở Nhật v.v…) để cung cấp cho các phịng nghiên cứu (Bradley L. A. và cs, 2002). Một trong những tế bào được nuơi cấy và sử dụng để nghiên cứu căn Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 9 bệnh ung thư là tế bào LLC (Lewis lung carcinoma). Tế bào LLC được tiến sĩ MargaretR. Lewis phân lập vào năm 1951 (http:// cancerweb.ncl.ac.uk/cgi- bin). Sau đĩ nĩ tiếp tục được các nhà khoa học khác nghiên cứu, ví dụ như Sacchi đã nhận thấy các khối u hình thành ở chuột thí nghiệm sau khi tiêm LLC một thời gian và phát triển rất ác tính (Sacchi và cs, 1979),v.v…Cho đến nay, tại nhiều viện nghiên cứu trên thế giới, dịng tế bào LLC được sử dụng như dịng chuẩn để đánh giá hiệu quả thử nghiệm invivo của thuốc phịng chống ung thư mới (Yang và cs, 2007). 2.1.6 Nuơi cấy tế bào động vật 2.1.6.1. Lịch sử nuơi cấy tế bào động vật in vitro Việc nuơi cấy tế bào động vật bắt đầu từ cơng trình của Withelm Roux vào năm 1885, ơng đã duy trì được sự sống của tế bào phơi gà trong vài ngày trong dung dịch sinh lý Tuy nhiên, nuơi cấy tế bào được xem là thực sự bắt đầu từ cơng trình của Harrison vào năm 1907. Giai đoạn đầu của nuơi cấy tế bào động vật chỉ cĩ ý nghĩa về mặt lý thuyết, nhưng càng về sau khả năng ứng dụng của nuơi cấy tế bào động vật vào thực tế càng được nhiều người thừa nhận (Phan Thị Phi Phi,1990). Việc nuơi cấy tế bào khơng chỉ sử dụng để giải quyết những vấn đề thuộc phơi thai học, virus học, truyền nhiễm học mà cịn sử dụng trong nghiên cứu sinh lý học tế bào, di truyền học… và đặc biệt là trong ung thư học (Willmer E.N. và cs, 1965). 2.1.6.2. ðặc điểm nuơi cấy tế bào động vật in vitro Nuơi cấy tế bào động vật in vitro phải đảm bảo các điều kiện gần giống in vitro. Một số điều kiện cơ bản là; Vơ trùng Việc nhiễm khuẩn là vấn đề lớn trong nuơi cấy tế bào. Vi khuẩn, vi nấm, nấm men, bào tử nấm và thực khuẩn thể cĩ thể nhiễm vào chai nuơi cấy Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 10 thơng qua người làm việc, khơng khí, bề mặt nơi làm việc…Do vậy, việc áp dụng nghiêm ngặt các kỹ thuật vơ trùng là rất quan trọng. Sự lây nhiễm cĩ thể rất nhỏ, giới hạn trong một hoặc hai chai mơi trường nhưng cĩ thể lan rộng giữa một vài mơi trường và ảnh hưởng đến tồn bộ thí nghiệm. Theo Willmer E. N. ,1965 nuơi cấy tế bào cần cĩ: - Phịng nuơi cấy vơ trùng, trong đĩ cĩ tủ cấy và tủ nuơi ủ tế bào - Phịng chuẩn bị nuơi cấy - Phịng rửa dụng cụ hấp sấy, khử trùng, … Kỹ thuật vơ trùng đúng sẽ tạo ra hàng rào bảo vệ ngăn giữa các vi sinh vật ở bên ngồi với mơi trường nuơi cấy sạch. Do vậy, tất cả các nguyên vật liệu mà tiếp xúc với mơi trường nuơi cấy phải được khử trùng cẩn thận và mơi trường nuơi cấy phải thường xuyên được kiểm tra sự nhiễm khuẩn dưới kính hiển vi. Nhiệt độ Nhiệt độ cần cho sự phát triển của tế bào động vật là từ 35 – 380C, nhiệt độ này là thân nhiệt của động vật máu nĩng. Ở 40C một số tế bào cĩ thể sống trong một thời gian và cĩ thể bảo quản những tế bào này ngắn hạn ở 40C. Ở 20 – 250C tế bào sống được nhưng phát triển chậm. Trên 400C tế bào chỉ sống được vài giờ, ở 450C tế bào sẽ chết sau 30 phút, dưới 00C tế bào bị chết. Dưới -400C đến -1960C, trong điều kiện bảo quản đặc biệt tế bào cĩ thể sống được vài tháng đến hàng chục năm (Phan Thị Phi Phi, 1990), (Willmer E. N.,1965). Do vậy, hiện nay nhiều phịng thí nghiệm sử dụng Nitơ lỏng để tạo ra nhiệt độ -1960C để bảo quản tế bào dài hạn,… Trong nuơi cấy tế bào động vật, khơng chỉ cần nhiệt độ thích hợp mà tế bào động vật cũng địi hỏi sự ổn định nhiệt độ (Willmer E. N., 1965). Như vậy, nhiệt độ ổn định tế bào sẽ phát triển bình thường. Nhiều kết quả thí nghiệm cho thấy sự dao động nhiệt độ khơng nên lớn hơn 50/1phút và tốt nhất Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 11 ở khoảng 10C/ 5 phút. CO2 và bicacbonat CO2 xuất hiện trong mơi trường nuơi cấy dưới dạng hồ tan, ở trạng thái cân bằn với HCO3 -. Áp lực CO2 khơng khí, cũng giống như nhiệt độ, sẽ điều hồ nồng độ CO2 hồ tan. Do vậy, khi nuơi cấy tế bào trong tủ ấm 370C ta phải nạp khí CO2 (Bulter M. và cs, 1994). Thực tế cho thấy hàm lượng CO2 trong khơng khí mơi trường nuơi là 5%, nồng độ này thích hợp với nhiều dịng tế bào. Mơi trường nuơi cấy Năm 1991, H. Lewis chế thử mơi trường lỏng đầu tiên, bao gồm một số thành phần quen thuộc như: muối khống, pepton, huyết thanh, chất chiết xuất phơi. Cùng với việc nhân giống các dịng tế bào thì nhu cầu về lượng mơi trường nuơi cấy lớn hơn, chất lượng ổn định hơn đã dẫn đến sự ra đời của các mơi trường nuơi cấy mới dựa trên cơ sở những phân tích về dịch cơ thể và hố sinh dinh dưỡng (Skehan và cs,1990), (Willmer E. N,1965). Cho đến nay, đã cĩ rất nhiều loại mơi trường khác nhau thích hợp cho từng loại tế bào động vật. Các mơi trường đĩ đều cĩ thành phần chính gồm acid amin, khống, vitamin,… như mơi trường RPMI (Roswell Park Memorial Instutite), MEM (Minimal Essential Midium) của Eagle, DMEM (Dulbecco Minimal Essential Midium) của Dulbecco cải tiến trên mơi trường của Eagle, … (Hee – Byung Chai và cs, 2000). 2.1.7. Khả năng phịng và chữa trị bệnh ung thư 2.1.7.1. Liệu pháp sinh học ( Biological therapy) Liệu pháp sinh học hay cịn được gọi là liệu pháp miễn dịch là phương pháp sử dụng hệ miễn dịch của cơ thể một cách trực tiếp hoặc gián tiếp để chống lại bệnh ung thư hoặc thơng qua việc làm giảm thiểu các tác dụng phụ của các liệu pháp chữa trị ung thư khác. Liệu pháp này bao gồm Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 12 việc sử dụng các interferon, interleukin, kháng thể đơn dịng, vaccine, can thiệp vào hệ gen (gene therapy) và các chất tăng cường miễn dịch khơng đặc trưng để chống lại tế bào ung thư (Darnell J. và cs, 1990), (National Cancer Institute, 2005). 2.1.7.2. Liệu pháp hố trị Là liệu pháp sử dụng dược liệu hố chất cĩ khả năng tiêu diệt hoặc ngăn chặn sự phát triển của tế bào ung thư. Các hoạt chất được sử dụng tuỳ theo các loại ung thư khác nhau và theo liều lượng khác nhau. Cho đến nay, liệu pháp hố trị được xem là hiệu quả tuy nhiên liệu pháp này thường đi kèm với nhiều tác dụng phụ khơng mong muốn như nơn mửa, rụng tĩc v.v…(ðỗ Trung ðàm, 1995). 2.1.7.3. Liệu pháp xạ trị Là liệu pháp sử dụng nguồn năng lượng cao từ tia X, tia gamma, neutron và các nguồn phĩng xạ khác để tiêu diệt tế bào ung thư và các khối u khu trú tại chỗ. Liệu pháp này sử dụng máy chiếu phĩng xạ từ ngồi cơ thể hoặc thơng qua một số nguồn vật liệu phĩng xạ được chuyển vào cơ thể ở vị trí gần khối u ung thư. Ngồi ra, liệu pháp này cịn sử dụng các cơ chất phĩng xạ như các kháng thể đơn dịng gắn đồng vị phĩng xạ để tăng cường tính hiệu quả và đặc hiệu, tránh làm tổn thương các tế bào lành khác trong quá trình điều trị bệnh (Nguyễn Thanh ðạm và cs, 2002). 2.1.7.4. Liệu pháp phẫu thuật Là phương pháp sử dụng phẫu thuật để cắt bỏ khối tế bào bệnh. Liệu pháp này thực sự đem lại hiệu quả chữa trị nếu đây là giai đoạn đầu của bệnh ung thư, khối u vẫn cịn khu trú tại chỗ. Trong trường hợp căn bệnh đã di căn tới các khu vực kh._.ác nhau trong cơ thể thì liệu pháp phẫu thuật sẽ chỉ là giải pháp tình thế và cần kết hợp với các liệu pháp khác để điều trị tích cực và triệt để (ðái Duy Ban và Lữ Thị Cẩm Vân,1995). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 13 2.1.7.5. Liệu pháp phịng chống ung thư (cancer chemoprevention) Khác với mục đích của liệu pháp chữa trị ung thư (cancer chemotherapy) nhằm tiêu diệt tế bào ung thư để ngăn ngừa sự tiến triển của căn bệnh, thì liệu pháp phịng chống ung thư lại nhằm ngăn chặn bệnh ngay từ đầu, là giai đoạn xuất hiện sự chuyển dạng của những tế bào bình thường thành những tế bào ung thư (National Cancer Institute, 2005). Các nhĩm hoạt chất phịng chống ung thư hoạt động theo 2 phương cách: 1. Phịng chống hoặc ngăn chặn những đột biến gen cĩ khả năng dẫn tới bệnh ung thư (National Cancer Institute, 2005). 2. Phịng chống hoặc ngăn chặn quá trình tăng sinh liên tục của các tế bào bệnh dẫn tới hình thành khối u (National Cancer Institute, 2005). Hiện tại, Viện nghiên cứu ung thư của Mỹ- NCI đã đưa liệu pháp phịng chống ung thư lên thành một trong những vấn đề được ưu tiên hàng đầu với hơn 400 hoạt chất cĩ tiềm năng đang được tích cực nghiên cứu. Cho đến nay, một số hoạt chất đã chính thức được sử dụng rộng rãi và được chứng minh là cĩ khả năng phịng chống sự hình thành và phát triển của tế bào ung thư ở những giai đoạn sớm như các vitamin A, C, D, E, các hoạt chất như β- caroten, tamoxifen.v.v.(Cragg G. M. và cs, 1994) và hoạt chất paenol trong cây xích thược. ðể đối phĩ được với căn bệnh hiểm nghèo nêu trên, việc tìm kiếm nguyên liệu thuốc từ thực vật, động vật và vi sinh vật trên đất liền cũng như dưới biển đã trở thành một trong những hướng nghiên cứu quan trọng của nhiều phịng thí nghiệm trên thế giới cũng như các quốc gia. Các thành phần hĩa học của chúng, thể hiện hoạt tính sinh học lên các tế bào của động vật và con người được chia làm 2 nhĩm phụ thuộc vào nồng độ cũng như chức năng cơ bản của nĩ: các chất trao đổi sơ cấp (được tích tụ để đảm bảo nhu cầu về dinh dưỡng và cấu trúc) và các chất trao đổi thứ cấp (hoạt động như các Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 14 hoocmơn, dược liệu và độc tố). Một số chất trao đổi thứ cấp được xem như sản phẩm thải của quá trình trao đổi chất, chẳng hạn như, các alcaloit cĩ thể giữ chức năng như là các chất thải chứa nitơ. Tuy nhiên, một phần quan trọng của các sản phẩm bắt nguồn từ con đường trao đổi thứ cấp cĩ vai trị như là các tác nhân bảo vệ chống lại các con đường gây bệnh (như cơn trùng, nấm hay vi khuẩn) hay các phân tử điều tiết sự phát triển (các hợp chất dạng hoocmơn kích thích hay kìm hãm sự phân chia tế bào và sự phát triển hình thái). Từ các chức năng sinh lý này, các sản phẩm trao đổi thứ cấp là các thuốc điều trị ung thư tiềm tàng, bởi vì tính độc tế bào của chúng ảnh hưởng đến các tế bào ung thư hay quá trình phát triển của khối u bị điều chỉnh, và thậm trí ức chế sự phát triển của khối u. Liệu pháp sử dụng các hợp chất này ở nồng độ thấp cĩ thể gây tử vong cho các vi sinh vật và động vật nhỏ bé, nhưng ở các động vật lớn hơn (gồm cả con người) chúng cĩ thể ảnh hưởng đặc hiệu lên các mơ phát triển nhanh nhất như các khối u. Việc nghiên cứu sử dụng các hợp chất thiên nhiên làm thuốc điều trị các bệnh hiểm nghèo (trong đĩ cĩ bệnh ung thư) đã được con nguời biết đến và nghiên cứu từ lâu. Quá trình nghiên cứu các hợp chất thiên nhiên cĩ nguồn gốc từ thực vật nhằm tạo ra các chế phẩm thuốc điều trị ung thư đã trải qua lịch sử hàng ngàn năm và đã đạt được nhiều thành tựu quan trọng. ðến những năm cuối của thập kỷ 60, các nghiên cứu về hợp chất thiên nhiên biển theo hướng chống ung thư mới thự sự diễn ra mạnh mẽ. 2.1.8. Tình hình gây u thực nghiệm trên chuột phục vụ cho việc nghiên cứu, phát triển thuốc phịng chữa ung thư Aristotle từng làm thí nghiệm trên động vật để tìm hiểu cơ chế bệnh tật. Nhưng thí nghiệm y khoa trên động vật chỉ được hợp thức hố vào thập niên 1960s. Sau thảm nạn thalidomide vào 1956 đến đầu thập niên 1960s, mà theo đĩ hàng vạn trẻ em ở Châu Âu sinh ra với dị tật nghiêm trọng do các bà mẹ sử dụng thuốc chống thai thalidomide trong khi cĩ thai, việc thí nghiệm y Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 15 khoa trên chuột được hợp pháp hố ở Anh. Năm 1961, chính phủ Anh ban hành đạo luật cho phép các nhà nghiên cứu thử nghiệm các thuốc trên chuột và động vật trước khi sử dụng cho con người. Ở Châu Âu, Robert Hook được coi là người đầu tiên sử dụng chuột để nghiên cứu thực nghiệm về oxy trong cơ thể vào năm 1614. Năm 1902, các dịng chuột nuơi trở thành những con vật đầu tiên được giáo sư Ernest Castle đưa vào phịng thí nghiệm của ðại học Harvard và sau đĩ là ðại học Pennsylvania, khi chúng được phát hiện thấy cĩ mọc các khối u. Theo tính tốn cho tới nay trên thế giới đã sử dụng tới 25 triệu con chuột cho hoạt động nghiên cứu khoa học ( Với sự tương đồng hệ gen giữa người và chuột lên đến 99% mà hầu như bất cứ kiên thức nào về bệnh tật và thuốc đặc trị cũng đều được tiếp cận hay thu nhập qua nghiên cứu trên chuột. Ung thư là căn bệnh nan y và gây ra tỉ lệ tử vong cao cho người bệnh. Việc chữa trị ung thư thực sự gặp rất nhiều khĩ khăn mặc dù hiện nay đã sử dụng nhiều liệu pháp chữa trị như liệu pháp gen, liệu pháp miễn dịch, xạ trị, phẫu thuật hoặc kết hợp các liệu pháp này. Các nhà khoa học cũng đã đưa ra liệu pháp phịng chống ung thư (cancer chemoprevention) sử dụng các hoạt chất cĩ tác dụng ngăn chặn bệnh hình thành (initiation), tiến triển (promotion), phát bệnh (progression) và di căn (metastasis) (Boone và cs, 1990). Tuy nhiên, dù là liệu pháp nào thì khả năng phịng chữa bệnh của chúng sau khi được chứng minh ở mức độ invitro cũng phải tiếp tục được chứng minh ở mức độ invivo để tạo cơ sở cho nghiên cứu tiền lâm sàng và thử nghiệm lâm sàng. Ở các thí nghiệm invivo, việc gây ung thư thành cơng trên chuột là một trong những bước quan trọng để tạo cơ sở cho việc thực hiện các bước thử nghiệm trong quy trình phát triển biệt dược dùng cho người. Hiện nay trên thế giới cĩ khá nhiều các cơng trình các cơng trình nghiên cứu để tìm ra được phương pháp gây ung thư thực nghiệm cho chuột một cách hiệu quả nhât. Tại Việt Nam Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 16 việc gây ung thư thực nghiệm trên chuột cũng đã được thực hiện trong thời gian qua như gây u thực nghiệm tại Tổ Thử nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện khoa học và Cơng nghệ Việt Nam (ðỗ Thị Thảo và cs, 2008), cơng trình gây ung thư bằng dưa khú và mắm tơm của GS.TSKH ðái Duy Ban. Ngồi ra một số nơi cũng đã thành cơng trong việc gây ung thư, gây u báng trên chuột với những mục đích khác nhau như Viện vệ sinh dịch tễ Trung Ương, ðại học Quốc gia Hà Nội v.v…Mặc dù việc gây ung thư thực nghiệm trên chuột tại Việt Nam đã được biết đến và cĩ một số kết quả nhất định nhưng vẫn chưa cĩ nhiều những cơng trình nghiên cứu về vấn đề này. 2.2. Cây Xích thược và dược tính chống ung thư Cây Xích thược (Paeonia veitchii Lynch. var beresowskii Shiff.) thuộc họ Mẫu đơn (Paeoniaceae). ðây là một loại cây thảo, sống lâu năm, cao từ 50-80 cm, rễ củ mập, vỏ ngồi màu nâu đỏ. Thân hình trụ nhẵn, lá mọc so le, cĩ cuống dài, chia nhiều thuỳ rất hẹp, mép nguyên, hai mặt nhẵn. Hoa to mọc riêng ở kẽ lá và ngọn thân, màu đỏ, nhị vàng. Cũng như một số lồi khác thuộc cùng chi với Xích thược cĩ nguồn gốc ở vùng ðơng á như Trung Quốc, Nhật Bản, Triều Tiên. Xích thược là một cây thuốc quí được trồng lâu đời ở Trung Quốc, Nhật Bản và Bắc Triều tiên, sau được di thực sang châu Âu làm cảnh. Tại các nước này hoa nở vào tháng 5 – 7, kết quả vào tháng 7 – 8. Vào đầu những năm 1970, cây đã được di thực trồng ở Việt Nam, nhiều nhất là ở tỉnh Lào Cai (SaPa). Cây trồng sinh trưởng phát triển khá tốt và ra hoa quả. Trước đây vào gần ngày tết, nước ta cĩ nhập từ Trung Quốc cả cây về để làm cảnh, nhưng giá thành rất đắt. Gần đây ít nhập cây mà chỉ nhập vỏ cây dùng làm thuốc (Lã ðình Mỡi, 2005 và ðỗ Tất Lợi, 1999). Những nghiên cứu về thành phần hố học cho thấy rễ cây chủ yếu là paeoniflorin với hàm lượng khoảng 2% rễ khơ, ngồi ra cịn cĩ paeonol và một monotecpen glycosid thu được bằng cách xử lý paeoniflorin với kali cacbonat trong metanol. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 17 Hình 2.1. Ảnh cây Xích thược (Paeonia veitchii Lynch.) Hoạt chất paeonol (2-hydroxy-4-methoxyacetophenone), một hợp chất được coi là thành phần chính trong các lồi thực vật thuộc chi Paeonia (tài liệu y học trung quốc cịn gọi là Botan-pi (Nagai N. và cs, 1887). Vào đầu những năm 1981 các nghiên cứu cho thấy hoạt chất paeonol cĩ khả năng hạ sốt (antipyretic), cĩ tác dụng giảm đau và an thần, cĩ khả năng kháng viêm (Harada M. and Yamashita A. và cs, 1972) và kháng khuẩn (T. Ohta và cs, 1969). Kunio Mimura và cộng sự đã sử dụng phương pháp đồng vị bền để tiến hành nghiên cứu sự chuyển hĩa của hoạt chất paeonol trong cơ thể bệnh nhân tự nguyện. Kết quả nghiên cứu vào thời điểm này cho thấy trong cơ thể bệnh nhân tự nguyện hoạt chất paeonol khơng bị biến đổi (Kunio Mimura and Shigeo Baba, 1981). Nghiên cứu tác dụng lợi tiểu của hoạt chất paeonol được sử dụng với các mức liều 62,5-250 mg/kg thể trọng, đối tượng được sử dụng là chuột nhắt với trọng lượng cơ thể là 196 g. Kết quả nghiên cứu cho thấy paeonol cĩ tác dụng lợi tiểu với cơ chế khác rất nhiều so với lợi tiểu thiazide Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 18 (Koichiro Kawashima và cs, 1985). Nghiên cứu những biến đổi của hoạt chất dưới các tác động của các yếu tố nội tại đúng vai trị rất quan trọng trong định hướng nghiên cứu hoạt chất này. Nhằm thực hiện ý tưởng trên, Tung Hu Tsai và cộng sự đã thực hiện các nghiên cứu về động dược học của hoạt chất paeonol trên chuột sau khi cho chuột uống paeonol. Trong nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng hệ thiết bị HPLC với đầu dị Photodio array để nghiên cứu nồng độ của hoạt chất paeonol trong huyết tương chuột. Huyết tương được lấy ở các thời điểm khác nhau sau khi cho chuột uống paoenol ở các mức liều 2,5; 5 và 10 mg/kg thể trọng. Kết quả nghiên cứu trên cĩ thể xác định khả năng hấp thụ và bài tiết hoạt chất paeonol trong cơ thể chuột ở mức liều 2,5- 10mg/kg thể trọng (Tung Hu Tsai và cs, 1994). Trong lâm sàng, các kết quả nghiên cứu động dược học được áp dụng cho các loại dược phẩm nhưng nguyên lý của nĩ cĩ thể được áp dụng cho bất cứ một chất nào được đưa từ bên ngồi vào như các chất dinh dưỡng, các hormone, độc tố. Tuy nhiên, các nghiên cứu về động dược học của paeonol nêu trên chưa đưa ra được một bức tranh trọn vẹn về cơ chế động dược học của hoạt chất này. Thêm vào đĩ các kết quả nghiên cứu trên chưa nêu được sự tương tác giữa hoạt chất này và hoạt chất khác trong khi sử dụng hoạt chất này với sự cĩ mặt của một vài hợp chất khác. Kết quả nghiên cứu chính xác quá trình kết hợp hoặc khơng kết hợp của hoạt chất trong quá trình nghiên cứu động dược học của hoạt chất paeonol đã được Takaaki Yasuda và cộng sự thực hiện trên thiết bị HPCL kết hợp với đầu dị Photodio array. Trong nghiên cứu này các tác giả đã đề xuất con đường chuyển hĩa của hoạt chất paeonol trong cơ thể chuột sau khi cho uống paeonol (hình 2.2) (Takaaki Yasuda và cs, 1999). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 19 C O C H 3 O H O C H 3 C O C H 3 O S O 3 O C H 3 P 4 C O C H 3 O H O C H 3 O S O 3 P 3 C O C H 3 O S O 3 O H C O C H 3 O H O H P 2 P 5 C O C H 3 O H O H O S O 3 P 1 P a e o n o l Hình 2.2. ðề xuất cơ chế chuyển hĩa của paeonol trong cơ thể chuột Theo các tác giả đề xuất, hoạt chất paeonol sau khi đi vào cơ thể đã chuyển hĩa thành 2,4-dihydroxyacetophenone-5-O-sulfate (P1), resacetophenone-2-O-sulfate (P2), 2-hydroxy-4-methoxyacetophenone-5-O- sulfate(P3) và paeonol-2-O-sulfate(P4), resacetophenone (P5) và một lượng rất nhỏ paeonol. Kết quả này được khẳng định thơng qua các bước phân tích mẫu nước tiểu, mẫu huyết tương và mật của chuột được uống paeonol. Như vậy cĩ thể nhận thấy hoạt chât paeonol khi đi vào cơ thể chuột đã bị hydroxy hĩa và sau đĩ bị sulfate hĩa ở vị trí C-5 để cĩ thể bài tiết ra theo nước tiểu (Takaaki Yasuda và cs, 1999). Năm 2005, Mukesh Doble và cộng sự đã tổng hợp một vài dẫn xuất đi từ chất đầu là paeonol, các dẫn xuất tổng hợp đều dựa trên cơ sở quá trình chuyển hĩa của paeonol khi vào cơ thể chuột. Các dẫn xuất này đã được đánh giá hoạt tính ức chế quá trình chống đơng máu. ðiều đặc biệt là các tác giả trên đã sử dụng mơ hình cấu trúc và hoạt tính để nghiên cứu tác động của các thơng số vật lý như điện tích, liên kết hydro, HOMO và độ phân cực v.v. lên hoạt tính chống đơng của các dẫn xuất. Kết quả nghiên cứu đã chi ra được 5 yếu tố vật lý cĩ ảnh hưởng nhiều đến hoạt tính của các dẫn xuất. Kết quả Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 20 nghiên cứu mối liên quan giữa cấu trúc và hoạt tính giúp cho việc hiểu được sự ảnh hưởng của các thơng số trên cấu trúc đến hoạt tính, từ đĩ giúp cho việc định hướng lựa chọn hoạt chất cĩ hoạt tính cao (Mukesh Doble và cs, 2005). Nghiên cứu của Yu Ling Ma và cộng sự cịn cho thấy paeonol cĩ tác dụng lên lực co bĩp cơ tim và trợ tim (Yu-ling Ma và cs, 2006). Các nghiên cứu nêu trên cĩ đề cập đến khả năng kháng viêm của hoạt chất paeonol. Tuy nhiên, khả năng điều trị chứng viêm ruột kết và cơ chế kháng viêm theo cơ chế ức chế sự hoạt hĩa của yếu tố nhân NF-κB của hoạt chất paeonol hiện mới được thơng báo (Kazuhiro Ishiguro và cs, 2006). Năm 2007, Inrina Tsoy Nizamutdinova và cộng sự đã nghiên cứu ảnh hưởng của paeonol đến quá trình phát triển khối u theo cơ chế ức chế sự hoạt hĩa của các yếu tố nhân. Kết quả nghiên cứu cho thấy paeonol cĩ khả năng ức chế sự hoạt hĩa của NF-kB (Inrina Tsoy Nizamutdinova và cs, 2007). Nhĩm nghiên cứu Shu Ping Xu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu tác dụng ngăn chặn sự xuất hiện của một vài loại ung thư của paeonol trên một số dịng tế bào ung thư như: dịng tế bào ung thư bạch cầu (K562), dịng ung thư vú (T6- 17), dịng ung thư gan (Bel-7404), dịng ung thư cổ tử cung (Hela) [32]. Bình thường, tế bào ung thư bị ức chế bởi 2 chức năng ngừa ung thư chính của tế bào là: tế bào chết theo chương trình (apoptosis) và tế bào già cỗi (senescence). Hai chức năng này ngăn ngừa sự tăng trưởng của tế bào ung thư. Dựa trên nguyên lý trên, Shu Ping Xu và cộng sự đã thiết kế mơ hình nghiên cứu tác dụng của paeonol đối với khả năng chống sự tăng sinh, gây chết theo chương trình và chu kỳ sống của tế bào ung thư gan người. Trong mơ hình này, các tác giả đã sử dụng paeonol tinh khiết và paeonol cĩ kết hợp với các tác nhân chống ung thư đang được dùng để điều trị bệnh ung thư như Cisplatin (CDDP), doxorubicin (DOX) và 5-fluorouracil (5-FU) để so sánh. Trong mơ hình nghiên cứu này, paeonol thể khả năng ức chế sự tăng sinh của dịng tế bào ung thư gan người (HepG-2) với giá trị IC50 = 104,77 mg/L. Khi Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 21 sử dụng paeonol với các tác nhân chống ung thư thì sự cĩ mặt của paeonol làm tăng khả năng của các tác nhân này. Các nghiên cứu này cịn chỉ ra rằng sự kết hợp của paeonol với tác nhân Cisplatin với liều lượng phù hợp sẽ gĩp phần làm giảm buồn nơn, bị mửa và một số triệu trứng gây độc thận khi dùng người bệnh dùng Cisplatin (Shu Ping Xu và cs, 2007). Khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào ung thư thực quản của paeonol với hai dịng tế bào ung thư thực quản được sử dụng là: dịng ung thư thực quản người với biểu hiện xuất hiện tại phần dưới của thực quản (Human oesphageal adenocarcinoma cell line SEG-1) và dịng ung thư thực quản người với biểu hiện xuất hiện tại phần phía trên của thực quản (Human squamous cell carcinoma cell line Eca-109) (X.A. Wan và cs, 2008). Kết quả nghiên cứu cho thấy paeonol cĩ tác dụng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào theo chương trình đối với hai dịng tế bào ung thư thực quản (hình 2.3a, b) Hình 2.3a. Khả năng ức chế sự tăng sinh và gây chết tế bào theo chương trình của paeonol đối với dịng tế bào ung thư thực quản Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 22 Hình 2.3b. Khả năng gây chết tế bào theo chương trình của paeonol đối với dịng tế bào ung thư thực quản SEG-1, Eca-109 Trong hĩa trị liệu điều trị bệnh ung thư việc dùng riêng biệt một biệt dược cĩ thể gây ra các hiệu ứng phụ, cisplatin là một ví dụ. Khi sử dụng riêng cisplatin trong điều trị bệnh ung thư thực quản thường gây ra các hiệu ứng gây độc thận cho người bệnh. Những hạn chế khi sử dụng biệt dược riêng biệt đã được các nhà khoa học khắc phục bằng cách sử dụng biệt dược với một số chất phụ thêm. Sự cộng hợp của các chất sẽ làm giảm các hiệu ứng phụ khơng mong muốn đối với người bệnh. Hoạt chất paeonol cũng đã được nghiên cứu và sử dụng cùng với cisplatin trong hĩa trị liệu điều trị bệnh ung thư thực quản (X.A. Wan và cs, 2008). Trong mơ hình nghiên cứu này các tác giả đã sử dụng paeonol riêng, cisplatin riêng và kết hợp giữa cisplatin và peonol với nồng độ phù hợp để nghiên cứu tác dụng điều trị bệnh ung thư thực quản. Hai dịng tế bào ung thư thực quản được sử dụng đĩ là : dịng ung thư thực quản người với biểu hiện xuất hiện tại phần dưới của thực quản (Human oesphageal adenocarcinoma cell line SEG-1) và dịng ung thư thực quản người với biểu hiện xuất hiện tại phần phía trên của thực quản (Human squamous cell carcinoma cell line Eca-109). Kết quả nghiên cứu cho thấy khi sử dung chỉ riêng paeonol tác dụng của paeonol lên hai dịng tế bào ung thư cĩ sự khác biệt đáng kể, dịng SEG-1 khá nhạy đối với tác dụng của paeonol với giá trị IC50 = 57,73 mg/L, trong khi đĩ tác dụng của paeonol trên dịng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 23 Eca-109 cĩ giá trị IC50 = 124,77 mg/L. Khi sử dụng kết hợp paeonol (7,81; 15,63 và 31,25 mg/L) với cisplatin ở tỉ lệ 1/1, kết quả cho thấy sự kết hợp của paeonol với cisplatin làm tăng khả năng gây độc dịng tế bào SEG-1 (hình 2.4a) và Eca-109 (hình 2.4b). Hình 2.4a. Tác dụng của cisplatin và tác dụng của cisplatin và paeonol đến dịng SEG-1 Hình 2.4b. Tác dụng của cisplatin và tác dụng của cisplatin và paeonol đến dịng Eca-109 Kết quả tính tốn hệ số tương tác giữa các thuốc cho thấy paeonol và ciplastin cùng cộng hợp tác dụng đến dịng SEG-1 (hình 2.5a), tác dụng mạnh khi nồng độ ciplastin thấp (khoảng 0,0078 mg/L). Tương tự đối với dịng Eca-109 (hình 2.5b) hệ số tương tác giữa hai thuốc bằng 1 cho thấy cả paeonol và cisplatin cùng cĩ tác dụng đến dịng Eca-109. Hình 2.5a. hệ số tương tác của cisplatin và paeonol đến dịng SEG-1 Hình 2.5b. hệ số tương tác của cisplatin và paeonol đến dịng Eca- 109 Kết quả nghiên cứu khả năng gây chết tế bào theo chương trình cũng cho thấy sự kết hợp của paeonol và cisplantin làm gia tăng khả năng gây chết hai dịng SEG-1 và Eca-109 theo chương trình (hình 2.6). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 24 Hình 2.6. Sự kết hợp của paeonol và cisplantin gia tăng khả năng gây chết dịng SEG-1 và Eca-109 theo chương trình Như vậy, kết quả nghiên cứu của nhĩm tác giả (X.A. Wan và cs, 2008) cho thấy sự kết hợp của paoenol và cisplatin làm tăng khả năng ức chế và gây chết tế bào ung thư thực quản so với khi sử dụng đơn paeonol và cisplatin. Hiệu quả của sự kết hợp giữa các hoạt chất khơng chỉ dừng lại trong việc điều trị các bệnh ung thư thực quản, trong nghiên cứu điều trị ung thư gan các nhà khoa học cũng chứng minh được rằng sự kết hợp giữa các hoạt chất với liều lượng phù hợp sẽ gĩp phần gia tăng liệu pháp điều trị. Với các nghiên cứu nêu trên, hoạt chất paeonol đã được sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu trong lĩnh vực điều trị ung thư gan. Qua phân tích các tác dụng của paeonol như tác dụng ức chế sự tăng sinh của tế bào ung thư, tác dụng giảm đau, tác dụng an thần, kháng sinh, chống ơ xy hĩa, kháng viêm, điều hịa miễn dịch và chống khơi u. (G.P Sun và cs, 2008) nhận thấy nghiên cứu làm rõ cơ chế chống khối u của paeonol sẽ gĩp phần ứng dụng thực tiễn hoạt chất này trong điều trị ung thư. Các tác giả đã xây dựng mơ hình nghiên cứu chống khối u của paeonol trên mơ hình gây u chuột mang tế bào ung thư gan HepA. Kết quả nghiên cứu cho thấy paeonol cĩ tác dụng ức chế sự phát triển của tế bào ung thư HepA trên chuột mang u gây ra bởi tế bào ung thư HepA. Trên mơ hình nghiên cứu in vivo cũng cho thấy paeonol cĩ tác dụng gây chết tế bào ung thư theo chương trình. Như vậy, thơng qua mơ hình nghiên cứu các tác giả đã khẳng định được tác dụng chống khối u của paeonol thơng qua quá Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 25 trình ức chế sự phát triển của khối u gây ra bởi tế bào HepA trên chuột, sự ức chế này thơng qua quá trình gây chết tế bào HepA theo chương trình và điều biển sự sản sinh IL-2 và TNF-α. Kết quả nghiên cứu này đã cung cấp cho các nhà khoa học một bằng chứng khoa học trong việc ứng dụng hoạt chất cĩ nguồn gốc từ thảo dược trong các liệu pháp điều trị bệnh ung thư gan. Bên cạnh lĩnh vực nghiên cứu chống ung thư, hiện nay lỗng xương cũng là một vấn đề hiện đang được các nhà nghiên cứu trên thế giới quan tâm, vì quy mơ lớn và hệ quả nghiêm trọng của căn bệnh này trong cộng đồng. Lỗng xương được biết đến như là một bệnh nội tiết với hai đặc điểm chính: lực của xương bi suy yếu và cấu trúc của xương bị thay đổi (Anonymous, 1993). Các nhà khoa học đã tìm kiếm được rất nhiều hoạt chất chống lỗng xương từ tự nhiên, trong xu hướng tìm kiếm các hoạt chất chống lỗng xương cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên, hoạt chất paeonol cũng đã được các nhà khoa học nghiên cứu hoạt lực của hoạt chất đối với tác dụng chống lỗng xương. Dựa trên các nghiên cứu về vai trị của những sinh hĩa tố liên quan đến quá trình lỗng xương, các tác giả này đã thử nghiệm ảnh hưởng của paeonol đến quá trình hình thành tế bào tủy xương. Kết quả thử nghiệm cho thấy paeonol ức chế sự phát triển của tế bào tủy xương và cĩ khả năng kéo dài sự bền vững của xương trong quá trình điều trị chứng lỗng xương (Huei-Yann Tsai và cs, 2008). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 26 3. ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. ðối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. ðối tượng nghiên cứu • Dịng tế bào ung thư LLC (Lewis lung carcinoma) do trường ðại học Universit degli Studi di Milano (Italia) cung cấp. • Chuột nhắt trắng dịng BALB/c 6 tuần tuổi, khoẻ mạnh được nuơi với mật độ 5 con/lồng tại chuồng nuơi động vật của Viện Cơng nghệ sinh học. Chuột được cung cấp thức ăn tiêu chuẩn, nước uống tự do. 3.1.2. Vật liệu thí nghiệm và thiết bị thí nghiệm  Vật liệu thí nghiệm Hoạt chất paeonol (Tên khoa học: 2'-Hydroxy-4'-methoxyacetophenone với cơng thức phân tử: C9H10O3, Khối lượng phân tử: 166 và chế phẩm PAN từ hợp chất này với hàm lượng paenol đạt 95%.  Hố chất và thiết bị thí nghiệm - Dung mơi PBS pha PAN - Thiết bị làm sinh hố máu - Xi lanh, kim tiêm, dao mổ, kéo - Tủ nuơi tế bào (Sanyo, Nhật) cĩ điều hồ nhiệt độ và CO2 tự động - Tủ cấy vơ trùng sử dụng đèn cực tím và màng lọc 0,25µm - Chai lọ nuơi cấy, pipet các loại của Costar và Corning Incorparated - Kính hiển vi soi ngược (Olympus, Nhật) với độ phĩng đại 5-20×20 - Buồng đếm tế bào (Newbauer, ðức). - Mơi trường nuơi cấy - Trypsin EDTA (Ethylene diamine tetraacetic acid) - Huyết thanh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 27 - Kháng sinh - Nước cất 3.1.2. Thời gian nghiên cứu Từ 01/10/2009 – 30/06/2010 3.1.3. ðịa điểm nghiên cứu Tổ Thử nghiệm sinh học, Viện Cơng nghệ sinh học, Viện Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam 3.2. Nội dung nghiên cứu - Gây u thực nghiệm trên chuột nhắt trắng dịng BALB/c bằng tế bào ung thư cĩ khả năng di căn mạnh Lewis Lung Carcinoma (LLC). - Xác định liều độc cấp tính LD50 gây chết 50% động vật thí nghiệm của paenol. - Nghiên cứu tìm hiểu hoạt tính của Paenol khi sử dụng làm chất bảo vệ để phịng và ngăn chặn sự phát triển khối u ung thư trên chuột đã được gây u thực nghiệm. 3.3. Phương pháp nghiên cứu 3.3.1. Bố trí thí nghiệm 3.3.1.1 Thí nghiệm nghiên cứu khả năng gây u thực nghiệm trên chuột thí nghiệm bằng dịng tế bào LLC Chuột được chia ra thành các lơ, mỗi lơ gồm 10 chuột BALB/c 6 tuần tuổi, khoẻ mạnh. • Lơ 1: Tiêm 1×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào bắp đùi • Lơ 2: Tiêm 1×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào dưới da lưng • Lơ 3: Tiêm 2×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào bắp đùi Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 28 • Lơ 4: Tiêm 2×106 tế bào LLC (trong 0,1ml dung dịch sinh lý)/con vào dưới da lưng • Lơ 5: Lơ đối chứng, chuột được tiêm 0,1ml dung dịch sinh lý/con 3.3.1.2. Xác định liều độc cấp tính LD50 gây chết 50% động vật thí nghiệm của hoạt chất Paeonol bằng đường uống. 50 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuơi tại khu nuơi động vật của Viện Cơng nghệ sinh học, được chia làm 5 lơ (10 chuột/lơ), chuột bị bỏ đĩi hồn tồn 16 giờ trước khi cho uống chế phẩm PAN. • Lơ 6: Chế phẩm PAN được cho uống một lần duy nhất ở nồng độ 2000 mg/kg thể trọng (kgP) • Lơ 7: Chế phẩm PAN được cho uống một lần duy nhất ở nồng độ 2500 mg/kgP • Lơ 8: Chế phẩm PAN được cho uống một lần duy nhất ở nồng độ 3000 mg/kgP • Lơ 9: Chế phẩm PAN được cho uống một lần duy nhất ở nồng độ 3500 mg/kgP • Lơ 10: Chế phẩm PAN được cho uống một lần duy nhất ở nồng độ 4000 mg/kgP Sau khi cho uống chế phẩm 1-2 giờ, chuột được nuơi dưỡng bình thường trở lại (cho ăn, uống tự do) và theo dõi liên tục trong 72 giờ để xác định số chuột chết trong từng lơ sau khi cho uống PAN và tính giá trị LD50 . 3.3.1.3. Nghiên cứu độc bán trường diễn của hoạt chất paeonol khi cho chuột thí nghiệm uống liều thấp trong thời gian dài. Nghiên cứu độc tính bán trường diễn được tiến hành theo phương pháp của Abraham (1978): 50 chuột BALB/c khoẻ mạnh, nuơi tại khu nuơi động vật của Viện Cơng nghệ sinh học, được chia làm 3 lơ (10 chuột/lơ), hàng ngày cho uống chế phẩm PAN liều thấp và theo dõi trong 4 tuần. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 29 • Lơ 11: Chuột thí nghiệm được cho uống PAN với liều 1000 mg/kgP/ngày • Lơ 12: Chuột thí nghiệm được cho uống PAN với liều 500 mg/kgP/ngày • Lơ 13: Chuột thí nghiệm chỉ cho uống nước sinh lý 3.3.1.4. Nghiên cứu tìm hiểu hoạt tính của Paeonol khi sử dụng làm chất bảo vệ để phịng và ngăn chặn sự phát triển khối u ung thư trên chuột đã được gây u thực nghiệm. • Lơ 14: uống PAN liều 100mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau đĩ tiêm tế bào LLC để gây u và vẫn tiếp tục cho uống PAN thêm 6 tuần nữa. • Lơ 15: uống PAN liều 200mg/kgP/ngày trước 4 tuần sau đĩ tiêm tế bào LLC để gây u và vẫn tiếp tục cho uống PAN thêm 6 tuần nữa. • Lơ 16: tiêm tế bào LLC để gây u, đồng thời uống chế phẩm PAN liều 100 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa. • Lơ 17: tiêm tế bào LLC để gây u, đồng thời uống chế phẩm PAN 200 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa. • Lơ 18: tiêm tế bào LLC để gây u, sau khi cĩ u sơ cấp thì cho uống PAN liều 250 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa. • Lơ 19: tiêm tế bào LLC để gây u đồng thời cho uống PAN liều 500 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa. • Lơ 20: tiêm tế bào LLC để gây u đồng thời cho uống PAN liều 1000 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa. • Lơ 21: tiêm tế bào LLC để gây u đồng thời cho uống PAN liều 1500 mg/kgP/ngày liên tục trong 6 tuần nữa. • Lơ 22 (đối chứng): chỉ tiêm tế bào LLC và cho uống PBS là dung mơi được sử dụng để pha PAN trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm. • Lơ 23 (đối chứng âm): khơng tiêm tế bào LLC và chỉ cho uống nước Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp ........... 30 muối sinh lý trong suốt thời gian thực hiện thí nghiệm Với bố trí thí nghiệm như trên, chúng tơi sẽ kiểm tra được khả năng bảo vệ cơ thể của PAN trước khi gây u bằng tế bào ung thư LLC ở các liều lượng khác nhau (lơ 14, 15, 16, 17). ðồng thời, sau khi chuột đã xuất hiện u do bị tiêm tế bào ung thư LLC, chuột được sử dụng PAN như chất chữa trị ở các liều lượng khác nhau (lơ 18, 19, 20, 21). Lơ số 22 được sử dụng như là đối chứng của thí nghiệm. Theo dõi chuột hàng ngày, cân khối lượng và đo kích thước khối u sơ cấp hàng tuần trên chuột thí nghiệm theo phương pháp của Abrham (1978) và của Iigo et al (1991) để xác định khả năng ức chế khối u của PAN. Thể tích khối u được tính theo cơng thức của Iigo (1991). V = chiều dài (khối u) × chiều rộng2(khối u)/2 Trong đĩ: V: thể tích khối u. 3.3.2. Phương pháp nuơi cấy tế bào ung thư invitro Phương pháp nuơi cấy tế bào ung thư được tiến hành theo phương pháp đang lưu hành tại Viện ung thư Quốc Gia Mỹ NCI (National Cancer Institute) và được WHO cơng nhận Dịng tế bào ung thư LLC (Lewis lung carcinoma) do trường ðại học Universit degli Studi di Milano Italia cung cấp ở dạng được bảo quản trong Nitơ lỏng (-196oC) vì vậy tế bào này sẽ phải đánh thức trước khi nhân nuơi ở các mơi trường khác nhau * Phương pháp đánh thức tế bào (Thawing) Lấy tế bào ra khỏi Nitơ lỏng, đưa vào cốc nước 37oC cho đến khi dung dịch trong ống tan đá hồn tồn, lau phía ngồi ống cất bằng cồn 70o để khử trùng. Chuyển tế bào sang một ống li tâm quay với tốc độ 300._.