Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5 và đặc điểm phân loại chủng vi khuẩn phân lập từ các Bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/Dioxin

c Long NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG PHÂN HỦY 2,4,5-T VÀ ĐẶC ĐIỂM PHÂN LOẠI CỦA CHỦNG VI KHUẨN PHÂN LẬP TỪ CÁC BIOREACTOR XỬ LÝ ĐẤT NHIỄM CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN Chuyên ngành : Sinh học thực nghiệm Mã số : 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Nghiêm Ngọc Minh Thái Nguyên - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Lời cảm ơn Trước hết, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới TS Nghiêm Ngọc Minh. Trưởng Phòng Công nghệ sinh học Môi trường – Viện Công Nghệ sinh Học đã tận tình hướng dẫn và dìu dắt tôi trong quá trình nghiên cứu và hoàn thành luận án. Trong quá trình nghiên cứu vửa qua, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và chỉ bảo tận tình của PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà và các anh chị Phòng Công nghệ sinh học Môi trường, đặc biệt là Ths. Nguyên Bá Hữu, CN. Nguyễn Văn Bắc, KS. Cung Thị Ngọc Mai, những người đã giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện luận án của mình. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Khoa sau đại học, khoa Sinh-Kỹ thuật nông nghiệp – Trường đại học Sư phạm – Đại Học Thái Nguyên và lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện cho tôi hoàn thành khóa luận này. Bên cạnh đó, tôi xin cảm ơn những người thân trong gia đình và bạn bè đã tạo điều kiện động viên giúp đỡ tôi cả về vật chất và tinh thần để tôi có thể hoàn thành bản luận văn này. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 1 tháng 10 năm 2009 Phạm Ngọc Long BẢNG CHỮ VIẾT TẮT 1,2,3,7,8-PeCDD 1,2,3,7,8-Pentaclorodibenzo-p-dioxin 2,3,7,8-TCDD 2,3,7,8-Tetraclorodibenzo-p-dioxin 2,4,5-T 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-D 2,4,- dichlorophenoxyacetic acid bp Base pair DNA Deoxyribonucleic acid LB Luria - Bertani PAH Polycyclic aromatic hydrocarbon PCDDs Polychlorinated dibenzo-p-dioxins PCDFs Polychlorinated dibenzofurans PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ribonucleic acid rRNA Ribosomal ribonucleic acid X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indodyl- β galactosidase Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 PHẦN 1 TỔNG QUAN 3 1. Sự ô nhiễm của 2,4,5-T và 2,4-D 3 2. Đặc điểm và tính chất của 2,4,5-T và 2,4-D 5 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 5 2.2 Chất diệt cỏ 2,4-D 7 3. Ảnh hƣởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trƣờng và con ngƣời 8 3.1 Ảnh hưởng của 2,4,5-T và 2,4-D tới môi trường 8 3.2 Ảnh hưởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến con người 9 4. Một số phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học trong đó có 2,4,5-T và 2,4-D 9 4.1 Phương pháp xử lý chất độc hóa học bằng hóa học, lý học, cơ học 9 4.2 Phương pháp phân hủy sinh học 10 5. Khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của một số vi sinh vật 15 6. Phân loại vi sinh vật 21 6.1. Phân loại theo phương pháp cổ điển 21 6.2 Phương pháp phân loại bằng sinh học phân tử 22 PHẦN 2 VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 25 1. Vật liệu, hóa chất, các thiết bị sử dụng trong nghiên cứu 25 1.1 Vật liệu 25 1.2 Hóa chất 25 1.3 Thiết bị, máy móc 25 2. Phƣơng pháp nghiên cứu 26 2.1 Môi trường nuôi cấy 26 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 2.1.1 Môi trường SH1 dịch (g/l) 26 2.1.2 Môi trường SH1 thạch 26 2.1.3 Môi trường muối khoáng 26 2.1.4 Môi trường LB dịch 27 2.1.5 Môi trường LB thạch 27 2.1.6 Nước muối sinh lý 27 2.2 Phương pháp nuôi cấy và phân lập vi khuẩn từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiếu khí 27 2.2.1 Nuôi cấy làm giàu vi sinh vật 27 2.2.2 Phương pháp phân lập vi khuẩn 27 2.3 Nghiên cứu hình thái tế bào của chủng vi khuẩn 28 2.3.1 Nhuộm Gram 28 2.3.2 Quan sát hình thái tế bào dưới kính hiển vi điện tử quét 28 2.4 Phương pháp phân tích khả năng phân hủy 2,4,5-T 29 2.5 Phân loại vi khuẩn dựa trên so sánh trình tự gen mã hóa 16S rRNA 29 2.5.1 Phương pháp tách DNA tổng số từ vi sinh vật 29 2.5.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA bằng phương pháp PCR 30 2.5.3 Điện di kiểm tra trên gel agarose 31 2.5.4 Tách dòng đoạn gen mã hóa 16S rRNA 31 2.5.5 Biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli 31 2.5.6 PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (colony–PCR) 32 2.5.7 Tách DNA plasmid theo Kit của hãng Fermentas 33 2.5.8 Xác định trình tự đoạn gen mã hóa 16S rRNA 34 2.5.9 Xây dựng cây phát sinh chủng loại 34 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 PHẦN 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 1. Nuôi cấy, phân lập chủng vi sinh vật từ mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin trong bioreactor hiểu khí 35 1.1 Nuôi cấy, làm giàu tập đoàn vi sinh vật 35 1.2 Phân lập chủng vi khuẩn 37 2. Đặc điểm phân loại của chủng HR5.1 38 2.1 Hình thái tế bào 38 2.2 Phân loại dựa trên trình tự gen mã hóa 16S rRNA 39 2.2.1 Tách chiết DNA tổng số 39 2.2.2 Nhân đoạn gen 16S rRNA của chủng HR5.1 bằng kỹ thuật PCR 40 2.2.3 Tách dòng gen 16S rRNA trong vector pBT 41 2.2.4 Xác định trình tự gen 16S rRNA của chủng HR5.1 43 3 Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng HR5.1 47 3.1 Khả năng phát triển của chủng HR5.1 trên PAH 47 3.2 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng HR5.1 49 3.2.1 Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy có chứa 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 49 3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ 2,4,5-T lên sự phát triển của chủng HR5.1 50 3.2.3 Khả năng phân hủy 2,4,5-T của chủng vi khuẩn HR5.1 54 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 56 TÀI LIỆU THAM KHẢO 57 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 MỞ ĐẦU Trong cuộc chiến tranh xâm lược của Mỹ tiến hành ở Việt Nam, hơn 100 triệu lít chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và 2,3,7,8 TCDD đã được rải xuống hơn 20% diện tích của miền Nam. Theo công bố của Stellman và cộng sự trên tạp chí Nature năm 2003 thì 20 chất diệt cỏ khác nhau đã được sử dụng. Chu kỳ bán hủy của dioxin và các chất tương tự dioxin rất dài, có khi đến vài chục năm hoặc hàng trăm năm [15],[42]. Qua các điều tra nghiên cứu của nhiều cơ quan khoa học và công nghệ ở Việt Nam và quốc tế cho thấy, đất của sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa độ tồn lưu của PCDD, PCDF, 2,4,5-T và 2,4-D vẫn còn cao. 2,4,5-T, 2,4-D có hàm lượng lên tới hàng vài trăm nghìn đến vài triệu µg/kg đất. Ngoài ra một lượng không nhỏ các chất DCP, TCP và PAH cũng đã được xác định trong các mẫu đất tại khu vực bị nhiễm độc. Nghiên cứu áp dụng phương pháp sinh học để khử độc tại “điểm nóng” ở Đà Nẵng thu được kết quả rất khả quan. Tuy nhiên để xử lý các điểm ô nhiễm cục bộ chất diệt cỏ/dioxin với thời gian ngắn cần có các công nghệ phân hủy sinh học phù hợp. Hiện nay, phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học đang tiến hành xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin bằng công nghệ tăng cường sinh học trong các bioreactor hiếu khí và kỵ khí. Trong quá trình xử lý, ngoài sự điều khiển về điều kiện môi trường như độ ẩm, nhiệt độ thì vai trò của các vi sinh vật có trong bioreactor là rất quan trọng. Để tăng hiệu quả và hoàn thiện công nghệ cần tăng thêm hiểu biết về đặc điểm vi sinh vật có trong bioreactor, cũng như vai trò của các vi sinh vật phân hủy chất độc được bổ sung vào bioreactor. Nhằm đáp ứng yêu cầu của thực tiễn đó, đề tài “Nghiên cứu khả năng phân hủy 2,4,5-T và đặc điểm phân loại của chủng vi khuẩn phân lập từ các bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin“ đã được thực hiện. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Luận án đã thực hiện đƣợc các nội dung nghiên cứu sau đây  Làm giầu vi sinh vật từ các mẫu đất trong bioreactor xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.  Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng phát triển trên 2,4,5-T và 2,4-D.  Nghiên cứu một số đặc điểm của chủng vi khuẩn phân lập được.  Phân loại định tên chủng vi khuẩn được chọn lựa.  Xác định khả năng sử dụng 2,4,5-T của chủng vi khuẩn nghiên cứu. Luận án này được thực hiện tại phòng Công nghệ sinh học môi trường, Viện Công nghệ sinh học và là một phần đề cấp Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam: “Nghiên cứu xử lý tẩy độc một số hợp chất hữu cơ chứa clo bằng các phương pháp hóa học và sinh học tiên tiến“ do PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà chủ trì. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 PHẦN 1 TỔNG QUAN 1. Sự ô nhiễm của 2,4,5-T và 2,4-D Từ năm 1961 đến năm 1971 quân đội Mỹ đã rải hơn 100 triệu lít chất diệt cỏ xuống nhiều vùng ở miền Trung và Nam Việt Nam [42]. Các chất diệt cỏ đã được sử dụng bao gồm: chất da cam, chất trắng, chất xanh lục, chất xanh lam, chất tím, chất hồng, các chất này được gọi tên theo mầu đánh dấu trên các thùng phuy chứa chúng, mỗi thùng khoảng 250l [42]. Các chất diệt cỏ thường là hỗn hợp của hai chất 2,4,5-T (2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid) và 2,4-D (2,4-dichlorophenoxyacetic acid) với tỷ lệ 50:50 (Bảng 1). Dioxin là tạp chất được sinh ra trong quá trình sản xuất 2,4,5-T. Hàm lượng dioxin trong các chất diệt cỏ rất khác nhau, ước tính số lượng dioxin chứa trong chất diệt cỏ mà Mỹ đã dùng trong chiến tranh Việt Nam từ 170 - 1000 kg [42], [15]. Bảng 1.1. Thành phần hóa học của các chất diệt cỏ quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh Việt Nam [42]. Tên chất Thành phần hoá chất Độ đậm đặc tƣơng đƣơng Sử dụng trong trong năm Số lƣợng ƣớc tính đã rải (lít) Chất hồng 60% - 40% n-Butyl: isobutylester của 2,4,5-T 961-1081 g/l acid tương đương 1961-1965 503.121; 413,852 Chất xanh lá cây n-Butylester của 2,4,5-T Giống như chất hồng Chưa rõ, rải cùng thời gian với chất hồng 31.026 Chất tím 50%n-Butylester 2,4,D 30% Butylester 1033 g/l acid tương đương 1962-1965 1.892.773 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 2,4,5-T 20% isobutyl ester 2,4,5-T Chất da cam (1) 50% n-Butyl ester 2,4-D 50% n-Butyl ester 2,4,5-T 1033 g/l acid tương đương 1965-1970 45.677.937 (có thể bao gồm cả chất da cam) Chất da cam (2) 50% n-Butyl ester 2,4-D 50% n-Butyl ester 2,4,5-T 910 g/l acid tương đương Sau 1968 (?) Chưa rõ nhưng đã gửi sang Việt Nam ít nhất là: 3.591.000 Chất trắng Khối lượng acid cơ bản: 21,1% tri- isopropanolamine muối của 2,4-D và 5,7% picloram Khối lượng acid: 240,2 g/l 2,4-D và 64,9 g/l picloram 1966-1971 20.556.525 Chất xanh (dạng bột) Acid dimethylarsinic và Natri cacodylat Acid: 65% tương đương Muối: 70% tương đương 1962-1964 25.650 Chất xanh (dạng dịch) 21% Natri cacodylat+ acid cacodylic ít nhất chiếm 26% tổng lượng acid tương đương Khối lượng acid: 360,3 g/l 1964-1971 4.715.731 Tại các căn cứ quân sự cũ của Mỹ trước đây là nơi tàng trữ và nạp chất diệt cỏ lên máy bay như sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng, Phù Cát có độ tồn lưu các chất độc ở mức cao và rất cao, lên tới hàng trăm nghìn ppt [15]. Đặc biệt là các sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng hàm lượng 2,3,7,8-TCDD chiếm 90% tổng độ độc, nhiều mẫu đất 2,3,7,8-TCDD > 99% tất cả độ độc của PCDD và Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 PCDF. Các kết quả phân tích còn phát hiện một lượng lớn 2,4,5-T, 2,4-D, dichlorphenol, trichlorophenol và một số lượng nhỏ hydrocarbon thơm đa nhân trong các mẫu đất tại khu vực nhiễm độc [15]. Ngoài ra, ô nhiễm 2,4,5-T và 2,4-D ở Việt Nam còn từ các nguồn khác. Tuy nhiên, trong khuôn khổ luận văn này chúng tôi chỉ nghiên cứu về vi sinh vật có nguồn gốc từ nguồn ô nhiễm chất diệt cỏ do chiến tranh. 2. Đặc điểm và tính chất của 2,4,5-T và 2,4-D 2.1 Chất diệt cỏ 2,4,5-T 2,4,5-T là tên gọi tắt của acid 2,4,5-trichlorophenoxyaxetic. Công thức hóa học là C8H5O3Cl3, khối lượng phân tử 255,49 g/mol. Công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 1.1. Hình 1.1 Công thức cấu tạo 2,4,5-T 2,4,5-T tinh khiết có dạng tinh thể rắn, không mùi, từ không màu đến vàng nâu nhạt, tan ít trong nước, độ hòa tan trong nước ở 30oC là 238 mg/kg, tan tốt trong dung môi hữu cơ. Tỷ trọng là 1,8 g/cm3 ở 20oC. Nhiệt độ nóng chảy trong khoảng 154oC -158oC [43]. 2,4,5-T được sử dụng như một chất diệt cỏ có tác dụng làm rụng lá cây, được phát triển vào cuối thập niên 40 của thế kỷ XX và sử dụng trong nông nghiệp. 2,4,5-T là chất có độc tính mạnh, gây ung thư, dị thai, rối loạn nội Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 tiết, nhiễm độc tuyến sinh dục và nhiều bệnh nghiêm trọng khác. Sơ đồ tổng quát quá trình tổng hợp 2,4,5-T được trình bày ở hình 1.2. i ii Hình 1.2 Sơ đồ tổng hợp 2,4,5-T i : Nhiệt độ với NaOH trong CH3OH dưới áp suất hơi nước ii: ClCH2COOH trong NaOH ở 140 o C Trong quá trình tổng hợp 2,4,5-T đi từ nguyên liệu ban đầu là 1,2,4,5- tetrachlorobenzene, cần phải có nhiệt độ từ 225 đến 3000C và áp suất dao động trong khoảng từ 400 đến 1500 psi. Tuy nhiên, ở điều kiện như vậy sản phẩm phụ là 2,3,7,8-TCDD đã được tạo ra và theo các tác giả, hàm lượng 2,3,7,8-TCDD có trong 2,4,5-T vào khoảng từ 0,07 tới 6,2 ppm (hình 1.3) [40]. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 Hình 1.3 Cơ chế tạo ra sản phẩm phụ 2,3,7,8-TCDD trong quá trình tổng hợp chất diệt cỏ 2,4,5-T 2.2 Chất diệt cỏ 2,4-D Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) có công thức hóa học là C8H6Cl2O3 công thức cấu tạo được thể hiện ở hình 1.4. Hình 1.4 Cấu trúc của 2,4-D. 2,4-D có khối lượng phân tử 221,04g/mol, ở dạng tinh khiết 2,4-D ở dạng bột, có mầu trắng đến mầu vàng. Nhiệt dộ nóng chảy là 140,5oC và nhiệt Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 độ bay hơi là 160oC. Ở nhiệt độ 25oC, 2,4-D có thể được hòa tan cới hàm lượng 900mg/l. 2,4-D là thuốc diệt cỏ được tổng hợp từ các auxin, là thuốc diệt cỏ tán rộng Hiện nay chủ yếu 2,4-D được sử dụng trong những hỗn hợp pha trộn với các loại thuốc diệt cỏ khác, có vai trò như một chất tăng cường tác dụng. Nó đang được sử dụng rộng rãi trên khắp thế giới. 3. Ảnh hƣởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến môi trƣờng và con ngƣời 3.1 Ảnh hƣởng của 2,4,5-T và 2,4-D tới môi trƣờng Quân đội Mỹ đã rải chất diệt cỏ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và tạp chất dioxin lên khoảng 27% tổng diện tích Việt Nam. Khoảng hơn 2 triệu ha rừng đã bị tác động của chất diệt cỏ [17]. Tác dụng tức thời của chất diệt cỏ là làm cho các loài cây rừng bị trụi hết lá, rất nhiều loài cây bị chết, môi trường và sinh cảnh bị thay đổi nhanh chóng [17]. Tại các vùng rừng bị rải lặp đi lặp lại nhiều lần, hệ sinh thái rừng bị phá hủy hoàn toàn và cho đến nay tại những nơi này chưa có cây mọc tự nhiên như khu rừng Mã Đà (Đồng Nai), thung lũng A Lưới (Thừa Thiên Huế) v.v.[17] Chất diệt cỏ sau khi được phun xuống có thể tích tụ không những trong đất mà còn phân tán trong lớp nước mặt, nước ngầm, không khí, tích tụ trong thực vật, gây nhiều sự cố và hiểm họa cho môi trường và từ đó tác động dây chuyền đến con người, động thực vật và các vi sinh vật. Hậu quả là làm suy thoái hệ sinh thái tự nhiên. Các chất này giết chết các động vật, thực vật, vi sinh vật và nhiều loại sinh vật khác làm cho chúng không thể phục hồi lại được, làm thay đổi hoàn toàn cấu trúc quần xã và chủng loại động vật, thực vật [4], [22]. Chất độc hóa học ngấm vào trong đất, tích tụ lại trong cơ thể thực vật nên ít bị phân hủy bởi một số yếu tố như ánh sáng mặt trời, tia cực tím, nhiệt độ. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 Các chất này tồn tại dưới dạng hỗn hợp và các yếu tố môi trường nhiều khi chưa thuận lợi cho các quá trình phân hủy sinh học tự nhiên. Chiến tranh kết thúc đã hơn 30 năm, lượng chất độc hóa học còn lại trong đất rất lớn, đặc biệt là 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin tại các điểm nóng. Tại các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở sân bay Đà Nẵng, Biên hòa và Phù Cát bị ô nhiễm 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin .v.v. ở mức độ cao. Nghiên cứu chọn lựa và áp dụng các phương pháp thích hợp để tấy độc ngay các “Điểm nóng” là nhiệm vụ rất cần thiết đặt ra cho các nhà khoa học và công nghệ cần quan tâm giải quyết. 3.2 Ảnh hƣởng của 2,4,5-T, 2,4-D đến con ngƣời Ước tính có 3181 ngôi làng Việt Nam bị rải trực tiếp, với khoảng 4,8 triệu người đã tiếp xúc với chất độc hóa học do Mỹ rải xuống [42]. Theo báo cáo mới nhất của Viện Y khoa Hoa Kỳ năm 2002, có 37 bệnh ở người liên quan đến dioxin ở các cấp độ khác nhau như ban clo, ung thư mô mềm, ung thư dạng Hodkin, ung thư dạng không Hodkin, một số bệnh thần kinh cấp tính, gai đốt cột sống, sẩy thai, dị tật bẩm sinh v.v. [32]. Trong số những người đã tiếp xúc với các chất độc hóa học này. Nhiều người bị phơi nhiễm đã mắc phải những căn bệnh nguy hiểm và một số bệnh di truyền cả sang các thế hệ sau [16]. 4. Một số phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học trong đó có 2,4,5- T và 2,4-D 4.1 Phƣơng pháp xử lý chất độc hóa học bằng hóa học, lý học, cơ học Phương pháp chôn lấp hay được áp dụng cho chất thải nguy hại, rác thải, kể cả các chất độc hóa học. Ưu điểm của phương pháp là giá thành rẻ nhưng chất Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 độc vẫn nằm trong các hố chôn lấp không được phân hủy nên các chất độc hóa học này có thể là nguồn ô nhiễm tiềm tàng cho môi trường và con người. Các phương pháp vật lý như quang hóa, sử dụng các tia cực tím, hay dùng áp suất cao cũng có hiệu quả. Theo các kết quả công bố cho thấy rằng sử dụng phương pháp quang hóa, 80% chất độc bị phân hủy dưới tác động của chùm tia cực tím cường độ 20W/cm3 ở nhiệt độ 20oC trong 3 ngày. Tuy nhiên phương pháp này chỉ áp dụng cho những lớp đất mỏng bề mặt dầy dưới vài milimet [14], [41]. Phương pháp thiêu đốt cũng được nhiều nước lựa chọn để xử lý dioxin. Nguyên lý của phương pháp là dùng nhiệt độ cao để phân hủy dioxin đạt hiệu quả đến 99,99%, nhưng phương pháp này có nhược điểm là giá thành xử lý cao, đó là chưa kể đến kinh phí đào, vận chuyển đất đến lò đốt và có thể tạo ra các sản phẩm phụ gây ô nhiễm thứ cấp [18]. Phương pháp declo hóa và oxy hóa cũng được nghiên cứu áp dụng với các chất chứa clo và cả 2,3,7,8-TCDD. Phương pháp này cũng cho kết quả khá tốt, thường tạo ra những hợp chất ít clo và ít độc hơn [19], [24],[14]. Nhược điểm của phương pháp hóa học là không kiểm soát được sản phẩm tạo thành, các sản phẩm này thường gây ô nhiễm thứ cấp. Các phương pháp xử lý cơ học, vật lý, hóa học nói chung đều có nhược điểm là tốn kém và không triệt để, dễ gây ô nhiễm thứ cấp cho môi trường. Phương pháp xử lý ô nhiễm bằng công nghệ sinh học đang được đặc biệt chú ý do tính an toàn và kinh tế của nó. Phương pháp này đang được nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới nghiên cứu, phát triển. 4.2 Phƣơng pháp phân hủy sinh học Phương pháp xử lý bằng công nghệ sinh học tuy mới mẻ nhưng đã được đặc biệt chú ý bởi giá thành hạ và thân thiện với môi trường. Phương pháp Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 phân hủy sinh học không đòi hỏi các điều kiện phức tạp như nhiệt độ cao, áp suất, quá trình xúc tác v.v. Phương pháp này tuân theo qui luật chuyển hóa thuộc chu trình cacbon, nitơ, photpho v.v. không gây ra ô nhiễm thứ cấp, an toàn, thân thiện với môi trường và hệ sinh thái, chi phí thấp do đó rất phù hợp với điều hiện kinh tế ở nước ta. Mặt khác, diện tích đất bị nhiễm độc ở Việt Nam rất lớn nên việc ứng dụng các phương pháp tẩy độc khác như hóa học và lý học khó có khả năng thực hiện [2]. Tuy nhiên nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi thời gian dài. Quá trình làm sạch sinh học có thể thực hiện ở quy mô lớn nhỏ khác nhau và ở điều kiện hiếu khí hoặc kị khí. Việc tẩy độc bằng phân hủy sinh học có thể được tiến hành riêng rẽ hoặc kết hợp với các phương pháp khác. Sau vài tháng hoặc vài năm các chất ô nhiễm có thể được hoàn toàn loại bỏ bằng phương pháp phân hủy sinh học [9]. Xử lý chất ô nhiễm theo phương pháp phân hủy sinh học có thể đi theo hai hướng chính là làm giàu sinh học và kích thích sinh học [9]. Làm giàu sinh học (Bioaugmentation) là phương pháp sử dụng tập đoàn vi sinh vật bản địa đã được làm giàu hoặc vi sinh vật sử dụng các chất độc từ nơi khác, thậm chí vi sinh vật đã được cải biến về mặt di truyền bổ sung vào các địa điểm ô nhiễm. Kích thích sinh học (Biostimulation) là quá trình thúc đẩy sự phát triển và hoạt động trao đổi chất của tập đoàn vi sinh vật bản địa có khả năng sử dụng các chất độc hại thông qua việc thay đổi các yếu tố môi trường như pH, độ ẩm, nồng độ O2, chất dinh dưỡng, các cơ chất, các chất xúc tác v.v. Việc bổ sung vi sinh vật vào các địa điểm ô nhiễm đòi hỏi chi phí cao và nhiều khi không mang lại hiệu quả cao do nhiều nguyên nhân như sự cạnh tranh của vi sinh vật, độ độc của môi trường, sự thiếu hụt nguồn dinh dưỡng, các chất đa lượng và vi lượng cần cho hoạt động phân hủy của vi sinh vật [15]. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 Ở Việt Nam, biện pháp chôn lấp tích cực để phân hủy chất diệt cỏ/dioxin đã được nghiên cứu và áp dụng thành công trên quy mô pilot hiện trường. Chôn lấp tích cực là sự kết hợp của phân hủy sinh học, cô lập, hấp phụ và chôn lấp. Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu thử nghiệm phân hủy sinh học đối với các lô xử lý 0,5m3; 1,5m3; 10m3 và 100m3 đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại Đà Nẵng [2], năm 2009 nhóm nghiên cứu đã xử lý hơn 3000 m2 đất nhiêm chất độc hóa học tại sân bay Biên Hòa bằng công nghệ phân hủy sinh học. Các công thức xử lý phân hủy sinh học được bổ sung các dạng chế phẩm khác nhau cung cấp chất dinh dưỡng, các chất cần thiết cho quá trình oxy hóa, khử loại bỏ clo các chất vi lượng và các chất thêm cho tập đoàn vi sinh vật tham gia vào quá trình tẩy độc ở điều kiện kị khí và hiếu khí. Số lượng các nhóm vi sinh vật trước, trong suốt quá trình xử lý đã được theo dõi. Các chủng nấm, vi khuẩn hiếu khí, kị khí, xạ khuẩn đã được sử dụng để nghiên cứu khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD. Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật truyền thống và kỹ thuật sinh học phân tử điểm chỉ như DGGE và các kỹ thuật sinh học phân tử khác đã được tiến hành để nghiên cứu tập đoàn vi sinh vật đồng thời phân lập các chủng vi sinh vật, định tên loài vi sinh vật sử dụng dioxin, dibenzofuran, hydrocabon thơm đa nhân phân lập từ nguồn ô nhiễm kể trên. Độ tồn lưu của dioxin và các ô nhiễm khác được xác định bằng phương pháp miễn dịch và sắc ký khối phổ. Phương pháp miễn dịch phân tích dioxin của EPA Hoa Kỳ được tiến hành theo EnviroGrardTM kít [2]. Sau tám năm nghiên cứu, các nhà khoa học ở Việt Nam đã thu được những kết quả rất khả quan. Số lượng vi sinh vật dị dưỡng ở đất nhiễm độc trước khi xử lý không cao, dao động từ 102 - 105 MPN/g hay CFU/g [2]. Những nhóm vi sinh vật khác cũng tồn tại trong loại đất này với số lượng và đa dạng thấp. Trong quá trình xử lý ở qui mô khác nhau, số lượng vi sinh vật đã tăng đáng Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 kể từ 1.000-10.000 lần [2]. Sau hơn hai năm xử lý bằng cách bổ sung chế phẩm Slow-D, DHS1, DHS2 và các hợp chất, vi lượng, thành phần xúc tác, các chất hoạt động bề mặt sinh học, phối hợp với sự thay đổi hàm lượng oxy và thay đổi độ ẩm, hiệu quả của quá trình xử lý “chôn lấp tích cực” (kết hợp cô lập, hấp phụ, chôn lấp và phân hủy sinh học) rất rõ rệt. Trong tất cả các lô xử lý, sau 8 đến 24 tháng, từ 50 đến 70% tổng độ độc đã bị giảm [2]. Trong quá trình xử lý ở các quy mô, hình thức khác nhau, trong những năm qua, các cán bộ nghiên cứu thuộc phòng Công nghệ sinh học môi trường Viện Công nghệ sinh học đã phân lập được một số chủng vi sinh có khả năng vật sử dụng dibenzofuran, dioxin, chất diệt cỏ 2,4,5-T, 2,4-D và PAH từ đất nhiễm chất độc hóa học tại sân bay Đà Nẵng. Các vi khuẩn đã được phân lập gồm Bacillus sp. BU3, Pseudomonas sp. BDN15, Pseudomonas sp. SETDN1, Terrabacter sp. DMA, Rhodoccocus sp. HDN3 v.v. Một số chủng nấm sợi chủ yếu thuộc chi Aspergillus như Aspergillus sp. FDN30, Aspergillus sp. FDN22, Aspergillus sp. FDN20. Xạ khuẩn cũng đã được phân lập tuy không nhiều nhưng cũng đã, phân lập được một số chủng thuộc chi Streptomyces như các chủng Streptomyces sp. XKDN11, Streptomyces sp. XKDN12 [1], [2], [5], [8], [10], [11]. Việc định tên và xác định khả năng phân hủy chất ô nhiễm của các chủng vi sinh vật này góp phần làm sáng tỏ cơ chế và hiệu quả của sự phân hủy sinh học diễn ra trong quá trình xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học đã được triển khai để xử lý khử độc ở qui mô 3.000 m3 tại “điểm nóng” Biên Hòa, Đồng Nai. Kết quả phân tích vi sinh vật và hóa học cho thấy các chế phẩm sử dụng tại hiện trường đã thành công trong việc kích thích quá trình phân hủy sinh học tại chỗ. Tất cả các chế phẩm, các hợp chất trên đều có thể tìm được và sản xuất tại Việt Nam vì vậy chủ động và giảm giá thành xử lý đất nhiễm dioxin trong các căn cứ quân sự cũ. Hơn nữa, phương pháp chôn lấp tích cực có tính Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 an toàn cao và khả thi đối với khối lượng bị ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin đến vài ha và ở độ sâu trung bình từ một đến hai mét. Để đẩy nhanh tốc độ phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin, các nghiên cứu xử lý khử độc trong các bioreactor đã được nhóm nghiên cứu công nghệ xử lý POP, Viện Công nghệ sinh học tiến hành. Đây là phương pháp xử lý kiểu tăng cường sinh học (bioaugmentation) trong hệ thống có khả năng điều khiển các thông số quan trọng liên quan đến quá trình chuyển hóa sinh học như nồng độ oxy, độ ẩm, độ pH, nhiệt độ, nồng độ các chất bổ sung và thành phần các nhóm vi sinh vật liên quan đến từng giai đoạn chuyển hóa sinh học chất ô nhiễm. Đây là kiểu xử lý ex situ và tốc độ chuyển hóa được cải thiện so với biện pháp xử lý chôn lấp tích cực do các điều kiện đều được kiểm soát. Đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng đã được xử lý trong các bioreactor với quy mô 50 kg [3]. Các chủng vi sinh vật có hoạt tính phân hủy tốt các chất ô nhiễm chính được phân lập tại đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại chính sân bay Đà Nẵng và tập đoàn vi sinh vật nuôi cấy làm giàu trên môi trường dinh dưỡng chứa các thành phần chất ô nhiễm trong phòng thí nghiệm được bổ sung trong quá trình xử lý. Các chất bổ sung trong quá trình xử lý được tính toán và bổ sung theo từng giai đoạn trong quá trình kết hợp với kiểm soát chặt chẽ các yếu tố về độ ẩm và độ thông khí. Ngoài ra, còn kết hợp xử lý theo kiểu kết hợp hiếu khí – kỵ khí để có thể chuyển hóa hiệu quả trong cả hai điều kiện khử loại chlo và oxi hóa cắt vòng 2,3,7,8-TCDD. Thành phần vi sinh vật trong thời gian xử lý đã tăng đáng kể, từ 106 lên đến 1012 MPN/g, trong đó trong các bioreactor hiếu khí, vai trò của nấm sợi đã được khẳng định là rất quan trọng với hệ sợi phát triển mạnh trên đất xử lý và khả năng sinh các loại enzyme ngoại bào như laccase, và các peroxidase với hoạt tính cao. Sau thời gian 17 tuần, tổng độ độc đã giảm 44,1%[3]. Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 5. Khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của một số vi sinh vật 2,4-D và 2,4,5-T là hai thành phần chủ yếu của các chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh Việt Nam [42]. Hiện tại đất tại các khu nhiễm chất độc hóa học ở các căn cứ quân sự cũ của Mỹ ở miền Trung và Nam Việt Nam hai hợp chất trên vẫn ở nồng độ cao. Trên thế giới do 2,4-D và 2,4,5-T đã được sử dụng từ rất lâu nên có nhiều công bố về khả năng phân hủy sinh học hai hợp chất này bởi vi sinh vật phân lập từ nguồn khác nhau như đất nông nghiệp, đất công nghiệp và trầm tích. Khác với 2,4-D, 2,4,5-T khó phân hủy hơn, hiện không có nhiều công bố về phân hủy sinh học hợp chất này. Tuy nhiên cũng đã có một số nghiên cứu trên thế giới và Việt Nam công bố về vi khuẩn có khả năng phân hủy 2,4,5-T như Burkholderia cepacia AC1100, Phanerochaete chrysosporium, Pleurotus cornucopiae, Stenotrophomonas maltophilia PM, .v.v. Một vài chủng nấm Aspergillus terreus FDN41, Penicillium, Phanerochaete, Pleurotus.v.v. [12],[21],[36] Chủng Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18087 và Pseudomonas pseudoalcaligenes NRRL B-18086 do Roy phân lập được có khả năng phát triển trên cả hai cơ chất 2,4,5-T, 2,4-D. Hai chủng này đều có khả năng sử dụng 2,4-D và 2,4,5-T là nguồn năng lượng và carbon duy nhất cho chúng [23]. Theo Haugland và cộng sự, chủng Pseudomonas cepacia AC1100 có khả năng phân hủy rất mạnh 2,4,5-T, chủng này phân hủy được 960μg/ml trong 24h ở 29oC [26]. Một chủng mới có nguồn gốc từ chủng Pseudomonas cepacia AC1100 được nhận thêm plasmid pJP4 quy định khả năng phân hủy 2,4-D từ chủng Alcalugenes eutrophus JMP134, chủng này được đặt tên là RHJ1. Chủng này có khả năng phân hủy 1000 μg/ml 2,4-D và 2,4,5-T μg/ml trong 24h ở 29oC trên môi trường có chứa hai cơ chất này. Trong khi đó khả năng phân hủy 2,4,5-T và 2,4-D của chủng Pseudomonas cepacia AC1100 Luận văn thạc sỹ sinh học Phạm Ngọc Long Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 giảm hẳn khi nuôi trên môi chứa cùng một lúc hai cơ chất, chủng này phân hủy được 26 μg/ml 2,4,5-T và 24 μg/ml 2,4-D cung trong 24h [26]. Ở chủng RHJ1 2,4,5-T được chuyển hóa thông qua con đường chlorohydroquinon, còn 2,4-D được phân hủy thông qua con đường chloroatechol [26]. Vi khuẩn sử dụng 2,4,5-T như nguồn cacbon và năng lượng duy nhất được nghiên cứu đầy đủ nhất hiện nay là Burkholderia phenoliruptrix AC110 (tên ._.