Nghiên cứu khả năng phân giải Cacbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ

ạnh - Người đã trực tiếp định hướng và hướng dẫn giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Dương Thị Bạch Tuyết, TS. Trần Thị Thanh cùng toàn thể các thầy cô tổ Vi sinh- Sinh hoá, khoa Sinh Trường ĐHSP TP. Hồ Chí Minh hết lòng giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu. Tôi cũng bày tỏ lòng biết ơn đến Sở Giáo dục và Đào tạo Bình Dương, trường THPT Phước Vĩnh đã động viên tôi trong suốt thời gian học tập. Cuối cùng, tôi xin gởi đến gia đình, các bạn cùng khoá - Những người luôn bên tôi khi thực hiện luận văn này. TP. Hồ Chí Minh, tháng 12 năm 2007 DANH MỤC CÁC THUẬT NGỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN Từ viết tắt - BTT Bào tử trần - BT Bào tử - C Cacbon - CFU Đơn vị hình thành khuẩn lạc. - DO Dầu Diesel - Đ/C Đối chứng - MT Môi trường - N Nitơ - P Photpho - PTN Phòng thí nghiệm - RNM Rừng ngập mặn - VSV Vi sinh vật MỞ ĐẦU 1. Lí do chọn đề tài Khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ được đánh giá là nơi có giá trị kinh tế và độ đa dạng sinh học cao trong khu vực đông nam Á. Bao gồm hệ sinh thái đất liền và vùng ven biển. Áp lực từ những hoạt động kinh tế, do phải đáp ứng nhu cầu phát triển của đất nước trong những năm gần đây, dẫn đến tình trạng ô nhiễm môi trường trầm trọng. Đặc biệt là môi trường ven bờ [45]. Hệ sinh thái RNM là nơi lưu trữ nguồn gen quý hiếm. Do đặc trưng của vùng đất không ổn định, độ ẩm cao, sự dao động của thủy triều ra vào thường xuyên, nên vi sinh vật ở đây có nguồn gen dễ biến đổi để thích nghi với môi trường. Nhiều tài liệu đã nghiên cứu về hệ động-thực vật ở hệ sinh thái này. Nhưng ít tài liệu nghiên cứu về VSV phân hủy-một mắt xích quan trọng trong chu trình sinh thái, trong đó có nấm sợi phân giải cacbuahydro. Ngày nay cùng với sự gia nhập vào WTO, sự phát triển và hội nhập của nền kinh tế đất nước với thế giới. Các ngành đặc biệt là ngành khai thác, chế biến dầu khí, vận tải biển làm nguy cơ ô nhiễm MT do sự cố tràn dầu gây ra càng lớn. Ngành công nghiệp dầu mỏ đã và đang đem lại nguồn lợi lớn cho các quốc gia có tài nguyên này. Tuy nhiên, nó cũng đưa vào môi trường một lượng cacbuahydro khó phân hủy. Đặc biệt là môi trường biển và khu vực gần bờ ở mức độ khác nhau. Do rửa tàu chở dầu, khai thác, vận chuyển gây sự cố tràn dầu... làm nguy hại đến thực vật, động vật và cả con người. Thành phần dầu chủ yếu làm ô nhiễm môi trường là cacbuahydro no, cacbuahydro thơm đơn nhân, đa nhân. Nhiều công trình nghiên cứu nhằm xử lí ô nhiễm nguồn nước do dầu với các biện pháp như: gạn vớt cơ học, lí học, hoá học.. nhìn chung không mang lại hiệu quả cao và an toàn cho môi trường. Ngay cả thiết bị tách dầu tốt nhất cũng còn khoảng một vài mg/lit. Vì vậy, sau khi xử lí bằng phương pháp trên vẫn còn 1 lượng dầu nhỏ trên mặt biển. Hơn nữa, khi lượng dầu tràn bị sóng đánh vào bờ, nhanh chóng thấm vào đất liền dẫn đến suy thoái vùng sinh thái nơi này [42], [47]. Sử dụng VSV phân giải dầu là biện pháp hiện nay đang được thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng quan tâm để loại bỏ phần dầu còn sót lại ảnh hưởng đến vùng ven bờ [43]. Biện pháp này với tính ưu việt của nó là xử lí triệt để lượng dầu mà không gây ô nhiễm môi trường, ngay ở cả môi trường nước, cát, đá. Đồng thời, trong quá trình phân giải dầu các VSV này tạo sinh khối, cung cấp dinh dưỡng cho chu trình trong hệ sinh thái. Nhiều công trình nghiên cứu về VSV phân giải dầu ở các khu vực có nhiễm dầu khác nhau [1],[17],[20],[21],[23],[24],[26], nhưng về VSV có khả năng phân giải dầu của hệ VSV ở RNM còn ít đề tài quan tâm, đặc biệt là nấm sợi. Vì vậy, việc tìm kiếm các chủng nấm sợi thích hợp trong khu hệ VSV đa dạng tự nhiên RNM, tiềm năng ứng dụng của chúng trong công nghệ sinh học làm sạch môi trường là cần thiết. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu khả năng phân huỷ các hợp chất cacbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ”. 2. Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu khả năng phân giải cacbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ. 3. Đối tượng nghiên cứu Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM Cần Giờ có khả năng phân giải hợp chất cacbuahydro. 4. Phạm vi nghiên cứu Đất, lá cây, thân cây là nguôn phân lập nấm sợi ở RNM thuộc bảy xã: An Thới Đông, Bình khánh, Cần Thạnh, Lý Nhơn, Long Hoà, Tam Thôn Hiệp, Thạnh An của huyện Cần Giờ. 5. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập nấm sợi từ đất, lá cây, thân cây ở một số khu vực RNM Cần Giờ. - Tuyển chọn một số chủng nấm sợi có khả năng phân giải cacbuahydro cao. - Nghiên cứu đặc điểm sinh học, phân loại các chủng được tuyển chọn. Định danh đến loài. - Nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và khả năng phân giải dầu của chủng nấm sợi tuyển chọn. - Đề xuất hướng ứng dụng 6. Phương pháp nghiên cứu - Phương pháp VSV. - Phương pháp Sinh học. - Phương pháp toán học. 7. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Vi sinh Trường ĐHSP TP. Hồ Chí Minh và PTN viện Sinh học Nhiệt đới TP. Hồ Chí Minh. 8. Thời gian nghiên cứu Từ tháng 04 năm 2006 đến tháng 08 năm 2007. Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Đặc điểm khu bảo tồn sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ Rừng ngập mặn (Mangrove) là thuật ngữ dùng để chỉ các loài thực vật hoặc một khu rừng có nhiều loài sống ở vùng giao thoa giữa đất liền và biển. Chúng có thể mọc tốt ở những vùng khí hậu nóng-ẩm. Theo đánh giá của GS. Phan Nguyên Hồng (1995), diện tích RNM trên thế giới khoảng 16.670.000 ha. Trong đó, khu vực châu Á có diện tích lớn nhất. Theo thống kê ban đầu của FAO, diện tích RNM ở Việt Nam khoảng 320.000 ha chiếm một phần khá lớn so với các nước trong khu vực [3]. Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển RNM thế giới đầu tiên ở Việt Nam được UNESCO công nhận vào 21/01/2000. Nằm ở phía đông nam Thành phố Hồ Chí Minh ở vĩ tuyến 10o22’14” đến 10o40’09”, kinh tuyến 106o46’12” đến 107o00’59”. Diện tích khoảng 75.750 ha với diện tích rừng là 38.664 ha trên nền đất phù sa chủ yếu do sông bồi đắp[3],[42]. RNM Cần Giờ phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sông Sài Gòn và Đồng Nai mang đến, lắng đọng thành nền đất. Theo thuyết khô hạn sinh lý học của Schimper thì đây là yếu tố chính hình thành RNM. Đất RNM được tạo bởi quá trình trầm tích sét, phèn hoá và nhiễm mặn: Lớp đất sâu chưa ổn định, đất chứa nhiều muối. Bốn loại đất chính: Đất mặn, đất mặn- phèn ít, đất mặn-phèn nhiều, đất cát mịn có pha một ít bùn ven biển; nhưng diện tích đất mặn chiếm ưu thế. Đất RNM có nồng độ muối cao, vào mùa nắng 4‰ - 18‰, còn mùa mưa độ mặn cao hơn từ 24‰- 30‰, độ pH trung bình khoảng 6.8- 7.2, nhiệt độ trung bình 26oC – 29oC, độ ẩm 74% - 83%. Cũng giống như các RNM khác, đất RNM Cần Giờ có độ ẩm cao. Nhờ sự vào ra của thuỷ triều và được che phủ bởi các tán lá cây ngập mặn nên đất ở đây hiếm khi trải qua thời kì khô hạn kéo dài. Khí hậu RNM Cần Giờ mang đặc tính nóng ẩm, chịu chi phối của qui luật gió mùa cận xích đạo với 2 mùa mưa nắng rõ rệt. Có chế độ bán nhật triều không đều, hai lần nước lớn và hai lần nước ròng trong ngày [3], [44], [45]. Hệ sinh thái ở RNM cũng mang các nét đặc trưng của các hệ sinh thái khác: Dòng năng lượng, chuỗi thức ăn, đặc trưng phân hoá theo không gian và thời gian, vòng tuần hoàn vật chất. Trong hệ sinh thái này, thực vật chủ yếu là các loại như: Mắm, Sú, Bần, Đước, Trang, Dừa nước, Đưng, Dà … có 157 loài thực vật thuộc 76 họ. Sinh vật tiêu thụ gồm: 63 loài phiêu sinh vật, 130 loài tảo thuộc 3 ngành: Tảo Khuê, Tảo Giáp, Tảo Lam. 100 loài động vật đáy như: Tôm, cua, sò, ốc. Ngoài ra, còn có 120 loài cá trong đó có các loài có giá trị kinh tế cao như cá Ngát, cá Dứa, cá Chếm. 31 loài bò sát như: Cá Sấu Hoa cà, trăn, rắn, kì đà nước. 19 loài hữu nhũ như: khỉ, heo rừng, rái cá, mèo rừng và 145 loài chim như: Ác là, Bồ Nông chân xám [44]. Vi sinh vật đặc biệt là vi khuẩn, nấm và xạ khuẩn là các tác nhân quan trọng trong quá trình phân giải các chất hữu cơ, cung cấp thức ăn cho các loài sinh vật khác trong hệ sinh thái RNM. Các VSV này có thể sống hoại sinh trong đất, lá mục, thân mục, một số sống kí sinh hoặc cộng sinh trong cây hay côn trùng. Phức hợp quần xã VSV phân giải protein, xenlulose, cacbuahydro, kitin… cung cấp mạnh vật chất và năng lượng cho chu trình tuần hoàn trong suốt cả hai pha của chu kì thủy triều. Hệ sinh thái RNM nằm ở lưu vực ven bờ có nhiều thành phần cacbon phức tạp do thuỷ triều đưa vào. VSV đóng vai trò quan trọng trong việc phân hủy các hợp chất độc có tính bền vững cao, trong đó có dầu. Với dầu, VSV không chỉ có khả năng phân hủy cacbuahydro mạch thẳng, cacbuahydro thơm đơn nhân hay đa nhân mà còn có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ có chứa lưu huỳnh. Vì vậy, hệ VSV ở đây góp phần rất lớn trong quá trình làm sạch các hợp chất này. Đặc biệt là nấm sợi phân giải các chất hữu cơ trong thảm thực vật, động vật ở RNM. Góp phần làm giảm sự ô nhiễm MT trong đó có ô nhiễm dầu. Khu hệ VSV ở RNM có khả năng phân giải các chất hữu cơ cho điều kiện không có oxi, trong suốt mùa lũ lụt và điều kiện có oxi trong suốt kì phơi ải [37]. Đây là hệ sinh thái có năng suất sinh học cao nhất trong các hệ sinh thái, nơi hội tụ sự đa dạng của cả sinh vật biển và đất liền. Vì vậy, nó chính là phòng thí nghiệm sống, để nghiên cứu về khả năng chịu đựng và phục hồi của các tổ hợp gen, khả năng phát tán và định cư của các dạng sống. Đặc biệt là năng suất sinh sản của các quần thể nấm sợi phân giải cacbuahydro sau khi môi trường bị đảo lộn bởi con người do nhiễm dầu [44],[47]. 1.2. Tổng quan về nấm sợi 1.2.1. Đặc điểm sinh học 1.2.1.1 . Điểm hình thái, cấu trúc Nấm sợi thuộc nhóm vi nấm (filamentous fungi), có kích thước hiển vi. Chúng là một hệ sợi phức tạp, đa bào có màu sắc phong phú (hình 1.1a). Nấm sợi có cấu tạo cơ quan sinh sản với nhiều hình thức sinh sản khác nhau. Đây là một trong những tiêu chuẩn chủ yếu để phân loại chúng [7],[8]. Cơ thể nấm là một tản (thallus). Tản nấm được cấu tạo từ hệ sợi nấm hay thể khuẩn ty (mycelium) do các sợi nấm hay khuẩn ty (hypha) phân nhánh tập hợp lại. Những sợi này sinh trưởng ở đỉnh [7],[11],[12]. Khuẩn lạc của nấm sợi thường tròn, cũng có nhiều màu sắc như khuẩn lạc của xạ khuẩn, nhưng khác với xạ khuẩn ở chỗ nó phát triển nhanh hơn (hình 1.1b). Bề mặt len xốp hoặc mịn. Thường thì mỗi khuẩn lạc sau 3 ngày phát triển có kích thước 5- 10 μm, trong khi đó khuẩn lạc của xạ khuẩn chỉ 0.5- 2 μm. vách sợi có vách ngăn Sợi không vách ngăn a) b) Hình 1.1: a) Các loại sợi nấm b) Hình thái khuẩn lạc [Nguồn: sinhhocviet.com.vn]  Khuẩn ty: Là những sợi nấm phân nhánh, phát sinh từ bào tử mà ra. Sợi nấm có thể có hoặc không có vách ngăn ngang (septum), các sợi nấm không có vách ngăn ngang gọi là sợi cộng bào (coenocystic). Một số sợi nấm có thể tiết sắc tố vào môi trường hoặc tiết chất hữu cơ kết tinh trên bề mặt sợi nấm. Đa số sợi nấm phân nhánh nhiều lần nhưng cũng có sợi nấm không phân nhánh. Nấm sợi không có diệp lục do đó không có khả năng tiến hành quang hợp, chúng sống nhờ khả năng hấp thụ các chất hữu cơ có sẵn qua bề mặt của khuẩn ty. Có 2 loại khuẩn ty: - Khuẩn ty khí sinh phát triển trên bề mặt cơ chất, từ đây sẽ có một số sợi phát triển thành các cơ quan sinh sản đặc biệt mang bào tử. - Khuẩn ty cơ chất phát triển sâu vào cơ chất, giúp nấm sợi bám chặt vào cơ chất và hấp thụ các loại thức ăn chứa trong đó.  Bào tử: Là cơ quan sinh sản chủ yếu của nấm sợi. Khi nấm sợi trưởng thành sẽ xuất hiện khuẩn ty khí sinh, từ khuẩn ty khí sinh sẽ sinh sản ra bào tử. Nấm là VSV có nhân chuẩn thành tế bào nấm cấu tạo chủ yếu là kitin- glucan, kitozan, rất ít nấm có thành tế bào là xenluloza [7],[12],[16]. 1.2.1.2 . Đặc điểm sinh lí, sinh hoá Phương thức dinh dưỡng của nấm là hấp thụ qua màng nên không có cơ quan tiêu hoá. Nấm sợi không có diệp lục nên không có khả năng quang hợp. Chúng thuộc loại dinh dưỡng hoá năng hữu cơ, sử dụng được nhiều nguồn cacbon khác nhau. Phần lớn nấm sợi là các cơ thể hoại sinh, một số kí sinh gây bệnh cho người và động vật. Các loại nấm sợi thường có nhu cầu khác nhau về nguồn nitơ, photpho. Chúng có thể sử dụng nguồn nitơ hữu cơ lẫn vô cơ. Ngoài ra, sự sinh trưởng của nấm sợi ở RNM liên quan đến các nguyên tố vi lượng, các vitamin, độ mặn trong môi trường nuôi cấy. Tuỳ thuộc vào chủng nấm ưa mặn cực đoan hay ưa mặn tuỳ ý, mà nồng độ muối thích hợp dao động từ 0%- 3%. Ảnh hưởng đến sinh trưởng của nấm sợi còn có yếu tố độ ẩm, nhiệt độ môi trường. Nấm sợi tăng trưởng tối ưu ở nhiệt độ 25-30o. Đa số nấm sợi sinh trưởng tốt ở pH=7. Riêng loài Trichoderma thích hợp ở môi trường axit. 1.2.1.3 . Đặc điểm sinh sản Nấm sợi là một trong những VSV có nhiều kiểu sinh sản khác nhau, nhưng chủ yếu bằng bào tử, bào tử có thể hình thành theo kiểu vô tính hoặc hữu tính.  Sinh sản sinh dưỡng:  Phát triển bằng khuẩn ty: Những đoạn nấm riêng rẽ có thể phát triển thành khuẩn ty. Trong lòng khuẩn ty này có thể thấy xuất hiện một hay nhiều tế bào hình cầu, có màng dày bao bọc, bên trong có nhiều chất dự trữ. Khi gặp điều kiện thuận lợi, các tế bào này lại tiếp tục phát triển thành một sợi nấm mới.  Sinh sản bằng hạch nấm: Một số nấm lại có khả năng tạo thành hạch nấm. Đây là một khối có hình tròn không đều, màu tối. Bên trong là một tổ chức sợi xốp và thường có màu trắng. Hạch nấm có thể giúp cho cơ thể nấm vượt qua những điều kiện khó khăn. Khi gặp điều kiện thuận lợi, chúng lại phát triển bình thường.  Sinh sản vô tính bằng bào tử: Các bào tử vô tính khác nhau về hình dạng và cách phát sinh, căn cứ vào đặc điểm phát sinh chia làm 3 loại bào tử vô tính:  Bào tử động (zoospores): Gặp ở các lớp ngành phụ Mastigo- mycotina, bào tử vô tính có roi, phát sinh trong nang bào tử động. Nang có thể do toàn bộ sợi nấm đơn giản biến đổi thành. Nang khi chín sẽ mở nắp cho các BT chui ra. Hình 1.2a  Bào tử kín (gymnospores): Gặp ở ngành phụ Zygomycotyna. Các BT kín không có roi, tạo ra trong nang kín. Khi nang chín sẽ nứt ra và phóng thích BT ra ngoài. Hình 1.2b  Bào tử trần (conidi, angiospores): Là loại BT phát sinh bằng con đường ngoại sinh hay nội sinh, nhưng đều được giải phóng ra phía ngoài của tế bào sinh bào tử. Bào tử trần (BTT) có nhiều loại: Loại không có vách ngăn ngang (Aspergillus spp, Penicillium spp…), loại có một vách ngăn ngang (Trichothecium spp, Arthrobotrytis spp…), có từ hai vách ngăn ngang trở lên (Fusarium spp, Helmilthosporium spp…), có cả vách ngăn ngang lẫn vách ngăn dọc xen kẽ hoặc nối tiếp nhau (Alternaria spp…). Hình 1.2c a b c Hình 1.2: Các dạng BT vô tính [Nguồn:sinhhocviet.com.vn] (a: BT động; b: BT kín; c: BT trần)  Sinh sản hữu tính Nấm sợi cũng có hình thức sinh sản hữu tính giống các sinh vật bậc cao, đó là quá trình chất giao (plasmogamy) nhân giao (caryogamy) và quá trình giảm phân (meiosis). * Lớp nấm roi thực hiện bằng cách đẳng giao, dị giao và noãn giao.  Đẳng giao: Sợi khuẩn ty sinh ra các túi giao tử trong có chứa giao tử. Các giao tử sau khi ra khỏi túi kết hợp với nhau tạo thành hợp tử. Hợp tử phân chia giảm nhiễm thành các BT. Mỗi BT khi được giải phóng ra từ hợp tử có thể phát sinh thành sợi nấm. Các giao tử và túi giao tử hoàn toàn giống nhau giữa cơ thể “đực” và cơ thể “cái”.  Dị giao: Là trường hợp các giao tử và túi giao tử ở cơ thể “đực” và cơ thể “cái” khác nhau. * Lớp nấm tiếp hợp: Sinh sản bằng bào tử tiếp hợp (zygospore), hình 1.3c. Từ hai khuẩn ty khác nhau gọi là sợi âm và sợi dương mọc ra hai mấu lồi gọi là nguyên phối nang. Các nguyên phối nang mọc hướng vào nhau, mỗi nguyên phối nang sẽ xuất hiện một vách ngăn phân tách hai phần đầu của hai nguyên phối nang thành hai tế bào đa nhân (đơn bội). Hai tế bào đa nhân tiếp hợp với nhau tạo thành hợp tử đa nhân lưỡng bội, có màng dày bao bọc gọi là bào tử tiếp hợp. Ngoài ra, nấm tiếp hợp còn có dạng sinh sản chỉ phối sinh chất không phối nhân, do đó tạo thành hợp tử có nhiều nhân nhưng đơn bội. * Nấm đảm: Sinh sản bằng bào tử đảm (basidiospore)- hình 1.3b, là BT thực hữu tính được tạo thành bên ngoài tế bào sinh bào BT đặc biệt gọi là đảm (basidium). Khi chín phát tán bằng cách rụng khỏi đảm. * Nấm túi: Sinh sản bằng bào tử túi (ascospore)- hình 1.3a, các bào tử này được hình thành trong túi bào tử. Bào tử chỉ phát tán khi túi già và mở ở đỉnh hoặc khi vỏ túi bị phân huỷ. a) b) c) Hình 1.3: Các dạng BT sinh sản hữu tính [Nguồn: sinhhocviet.com] a) BT túi b) BT đảm c) BT tiếp hợp Nấm không có chu trình phát triển chung, có các chu trình phát triển tổng quát sau: + Chu trình lưỡng bội: Giai đoạn đơn bội tương đương với giao tử thể. Giai đoạn bào tử thể chiếm ưu thế rõ rệt so với giai đoạn giao tử thể. + Chu trình hai thế hệ: Giai đoạn giao tử thể xen kẽ với giai đoạn bào tử thể, hai giai đoạn này tương đương nhau. + Chu Trình đơn bội: Sự giảm phân nối tiếp ngay sau khi phối nhân để tạo thành giao tử thể đơn bội. Giai đoạn lưỡng bội chỉ tồn tại trong một trạng thái và thời gian ngắn. + Chu trình đơn bội song nhân: Đây có thể là biến dạng của chu trình đơn bội, giai đoạn đơn bội chiếm ưu thế hơn so với giai đoạn song nhân. + Chu trình vô tính: Đây là đặc trưng của nhóm nấm bất toàn, hoàn toàn không có giai đoạn sinh sản hữu tính [10],[11],[12],[13] 1.2.2. Phân loại nấm Nhiều tác giả đã đưa ra những hệ thống phân loại khác nhau. Mỗi hệ thống đều có ưu, nhược điểm nhất định. Nhưng đều theo hai hệ thống phân loại chung. Hệ thống phân loại hình thái: dựa vào đặc điểm hình thái, nuôi cấy, một số đặc điểm sinh lý sinh hoá và phương thức sinh sản. Hệ thống phân loại dựa trên các phương pháp sinh hoá và sinh học phân tử. Nhưng hệ thống phân loại này được sử dụng rất ít. Các khoá phân loại phổ biến hiện nay thường dùng là: Khoá phân loại hình thái của Saccardo (1880, 1886), Barnett (1960), Ainsworth (1973), Bùi Xuân Đồng (2004), Đặng Vũ Hồng Miên, Robert A.Samson, Ellen S.Hoekstra and Jens C. Frisvad (2004). Trong luận văn này, chúng tôi dựa vào đặc điểm mô tả trong các khoá phân loại: Bùi Xuân Đồng , Đặng Vũ Hồng Miên, đây là khoá phân loại được rất nhiều nhà nấm học Việt Nam thường dùng. VSV không phải là một nhóm phân loại trong sinh giới. Chúng bao gồm tất cả các sinh vật có kích thước nhỏ. Vì vậy, khi quan sát phải dùng kính hiển vi. Ngoài ra, muốn nghiên cứu phải sử dụng phương pháp nuôi cấy vô khuẩn [26],[36],[37],[38]. Nấm sợi là loại nấm hiển vi thuộc ngành nấm (Fungi). Chúng thuộc các nhóm phân loại như ghi trong bảng 1.1. Đa số thuộc các ngành phụ Zygomy- cotina, Deuteromycotina và Ascomycotina. Ở đây, chúng tôi chỉ khái quát những nhóm phân loại chính của nấm sợi. Nấm sợi có nhân tế bào hoàn chỉnh, không có diệp lục, thành tế bào có kitin, có chất dự trữ là glycogen, dinh dưỡng kiểu hấp thu, dạng cộng bào đặc biệt, sinh sản bằng bào tử vô tính hoặc hữu tính. Gồm ngành nấm nhày (Myxomycota) và ngành nấm thực (Mycota). Bảng 1.1: Khái quát một số nhóm phân loại chính [8] Nhóm phân loại Đặc điểm chung Ngành nấm nhày (Myxomycota) Giai đoạn dinh dưỡng là thể nguyên hình hoặc thể nguyên hình giả, dinh dưỡng bằng hấp thụ hoặc thực bào. Ngành nấm thực (Eumycota) Giai đoạn dinh dưỡng là dạng sợi điển hình, dinh dưỡng bằng cách hấp thụ qua màng. Nhóm phân loại Đặc điểm chung Ngành phụ nấm roi (Mastigomycotina) Lớp: Chytridiomyces Lớp: Hyphochytridiomyces Lớp: Oomycetes Giai đoạn dinh dưỡng là dạng sợi hoặc đơn bào, dinh dưỡng hấp thụ. Sợi nấm không ngăn vách, sinh sản bằng động bào tử 1-2 roi. Sinh sản hữu tính là đẳng giao, dị giao, noãn giao. Hầu hết ở nước. Ngành phụ nấm tiếp hợp (Zygomy- cetina) Lớp: Zygomycetes Lớp: Tricomycetes Sợi nấm không ngăn vách. Sinh sản vô tính bằng bào tử kín (một ít loài có BTT). Sinh sản hữu tính bằng bào tử tiếp hợp. Ngành phụ nấm túi (Ascomycetina) Lớp: Hemiascomycetes Lớp: Loculoascomycetes Lớp: Plectomyces Lớp: Laboulbeniomyces Lớp: Pyrenomyces Lớp: Discomycetes Sợi nấm ngăn vách. Sinh sản vô tính bằng bào tử trần, sinh sản hữu tính bằng bào tử túi. Ngành phụ nấm đảm (Basidiomy- cotina) Lớp: Teluomycetes Lớp: Hymenomycetes Lớp: Gasteromycetes Sợi nấm ngăn vách. Sinh sản vô tính bằng bào tử trần, sinh sản hữu tính bằng bào tử đảm. Ngành phụ nấm bất toàn (Deuteromy-cotina) Lớp: Blastomyces Lớp: Hyphomycetes Lớp: Coelomycetes Sợi nấm ngăn vách. Sinh sản vô tính bằng bào tử trần, không có hoặc chưa tìm thấy hình thức sinh sản hữu tính. 1.2.3 . Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học 1. 2.3.1. Khả năng sinh enzym Nấm sợi là một trong nhóm VSV có khả năng sinh nhiều loại enzym có hoạt tính sinh học cao. Vì vậy, giúp chúng có thể sống được trong môi trường nghèo chất dinh dưỡng, cũng như có thành phần hidrocacbon khó hấp thu. Enzym là những phân tử protein, được sản xuất tự nhiên từ sinh vật, hết sức cần thiết cho sự sống. Chúng là những chất xúc tác thúc đẩy phản ứng sinh hoá học ở cả trong và ngoài cơ thể sống, nhưng không làm thay đổi tính chất của chúng. Vì vậy việc nghiên cứu hoạt tính enzym có thể tiến hành trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các loại enzym trên thị trường hiện nay được trích từ vi khuẩn hoặc nấm như: Bacillus, Aspergillus, Tricoderma. Ngày nay, người ta đã biết được khoảng 3500 loại enzym. Trong đó, phần lớn là ở thực vật và VSV. Những enzym tham gia quá trình dị hoá ngoài tế bào được gọi là enzym ngoại bào (exoenzym). Những enzym tham gia quá trình dị hoá trong tế bào được gọi là enzym nội bào (endoenzym). Enzym nội bào còn bao gồm các loại enzym tham gia tổng hợp, enzym tham gia quá trình oxi hoá và các enzym tham gia quá trình chuyển hoá vật chất có trong tế bào. Phần lớn, các enzym ngoại bào thuộc enzym cảm ứng. Đó là các enzym thường được tạo thành do trong môi trường có chất cảm ứng (cơ chất đặc hiệu) tác dụng đặc hiệu lên tế bào. Enzym này thường tham gia phân hủy cơ chất. Nấm sợi là nhóm VSV có tiềm năng lớn nhất sinh các loại enzym thủy phân ngoại bào như: Ligno-xenlulaza, proteaza, amilaza, kitinaza, pectinaza, oxigenaza…Trong tự nhiên nhờ hệ enzym ngoại bào mạnh, chúng có mặt ở khắp mọi nơi. Đồng thời, chúng có khả năng thích nghi với mọi hoàn cảnh môi trường. Chính nhờ khả năng tuyệt vời này mà VSV có thể tồn tại trong những môi trường khắc nghiệt nhất (chẳng hạn khi môi trường bị nhiễm dầu). Trong quá trình đấu tranh sinh tồn đó, VSV đã tiến hoá dần và trong các loài có những cá thể VSV có thể tổng hợp được những enzym có hoạt tính cao. - Xenlulaza: Xúc tác phân giải hợp chất ligno-xenluloza thành glucoza. Ligno-xenluloza là thành phần chủ yếu của tế bào thực vật, bao gồm: Xenluloza chiếm (30-40%), hemi-xenluloza và lignin (15-30%). Trong RNM, nguồn dinh dưỡng và năng lượng chủ yếu từ sự phân giải xác thực vật. Nên vai trò của enzym xenlulaza rất lớn. Nhiều loại nấm sợi có hoạt tính ligno- xenlulaza như: Penicillium, Aspergillus, Trichoderma.` - Amilaza: Xúc tác quá trình thuỷ phân tinh bột, glucogen và các polyxacarit tương tự thành đường. Nấm sợi là nhóm có nhiều chủng có khả năng sinh enzym này. Do đó, chúng không thể thiếu trong những hệ sinh thái RNM-nơi chiếm ưu thế là quần thể thực vật. Các loài nấm sợi có hoạt tính phân giải cơ chất này là: Aspergillus, Penicillum.. - Proteaza:Xúc tác quá trình thủy phân protein thành các chuỗi polypep-tit ngắn, peptit hay axit amin. Nấm sợi là một trong những loại VSV có khả năng phân giải proetin mạnh, điển hình như các loài thuộc chi Aspergillus, Trichoderma, Penicillium… - Kitinaza: Xúc tác phân giải các biopolyme tạo ra các N-acetyl- glucozamin. Nấm sợi có hệ kitinaza mạnh giúp chúng tiêu diệt các loài nấm gây bệnh và côn trùng có thành kitin - Oxygenaza: Oxi hoá các cacbuahydro trong dầu tạo ra các axit cacboxylic. Hệ enzym này đã giúp nấm sợi có thể tồn tại và phát triển ngay trên cả môi trường nhiễm cacbuahydro khó phân huỷ như dầu mỏ. Thêm vào đó sản phẩm phân giải của enzym này là cacbon dioxit, nước và sinh khối tế bào - nguồn thức ăn dễ đồng hoá cho sinh vật ở những vùng dễ nhiễm dầu như vùng RNM [41],[44],[50]. 1.2.3.2. Khả năng sinh kháng sinh Nấm sợi là một trong những VSV có khả năng sinh kháng sinh được phát hiện đầu tiên nên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Nhiều CKS đã được phát hiện như penicillin, cephalosporin, grisoefulvin, glytoxin. Từ các chủng nấm sợi Penicillium notatum, Penicillium chrysogesrum, Cephalosporium sp, Trichoderma viride…đã có hàng ngàn kháng sinh được tìm thấy sử dụng trong y học, nông nghiệp. Thực tế trong sản xuất, nhiều nước đưa vào đất các loài VSV có khả năng đối kháng với VSV gây bệnh mà không hại cây trồng. Đặc biệt chúng có khả năng ức chế các VSV gây bệnh đã nhờn thuốc. Trong những năm gần đây, người ta phát hiện thấy nấm ở RNM có tiềm năng sinh các kháng sinh mới. Trong môi trường sống đặc biệt này các VSV tạo CKS mới chống hiện tượng lờn thuốc. 1.3 . Cacbuahydro và khả năng phân giải dầu của nấm sợi 1.3.1. Sơ lược về cacbuahydro Cacbuahydro là hợp chất của các nguyên tố hydrogen và cacbon. Các cacbuahydro ở dạng khí (methan, ethylen và acethylen) trong điều kiện nhiệt độ và áp suất bình thường. Đa số các cacbuahydro còn lại ở dạng lỏng hoặc rắn. Chúng ít tan trong nước, tan nhiều trong dầu và các dung môi hữu cơ (Walker et al., 1996). Chúng là một trong những nguồn gây ô nhiễm MT của nền văn minh hiện đại. Dầu mỏ là hỗn hợp lỏng sánh của các chất hữu cơ tích tụ thành mỏ trong vỏ trái đất, giữa các lớp đá. Thường có mùi đặc trưng, màu sẫm đen và không tan trong nước. Dầu thô là dầu mỏ được khai thác lên và đã qua xử lí sơ bộ. Hợp phần chính của dầu mỏ là các cacbuahydro lỏng tan vào nhau ở dạng dung dịch. Phần định tính và định lượng của dầu mỏ khác nhau tuỳ từng mỏ, tầng. Thành phần cơ bản của dầu mỏ gồm:  Cacbuahydro thẳng 30%-35%  Cacbuahydro mạch vòng 25%-75%  Cacbuahydro thơm 10%-20% Ngoài ra, còn có hợp chất chứa oxi (acid, xeton, rượu…). Hợp chất nitơ (furol, indol, carbazol). Hợp chất chứa lưu huỳnh (hắc ín, nhựa đường, bit- um). Lưu huỳnh thuộc hợp chất: mecaptan, sunphua và sunphua vòng. Thành phần hoá học của dầu mỏ được chia tách bằng phương pháp chưng cất phân đoạn. Các sản phẩm thu được từ việc lọc dầu có thể kể đến xăng, dầu hoả, dầu diesel, paraphin, dầu bôi trơn nhựa đường… Các chuỗi cacbuahydro từ C5-C7 là các sản phẩm dầu mỏ nhẹ, dễ bay hơi. Chúng được sử dụng làm dung môi, chất làm sạch bề mặt và các sản phẩm làm khô nhanh khác. Nhưng chúng lại rất độc đối với VSV. Các chuỗi cacbuahydro từ C6-C12 bị trộn lẫn vào nhau được sử dụng trong đời sống với tên gọi là xăng. Dầu hoả được tạo thành từ chuỗi cacbuahydro từ C10-C15. Dầu Diesel (DO) gồm các cacbuahydro từ C15–C20. DO nặng có thể có được tạo từ cả những C20+ thậm chí đến C30. Các sản phẩm này ở nhiệt độ phòng đều là chất lỏng. Dầu thô của Việt Nam thuộc dầu trung bình nặng, nhiều parafin (20%- 30%) và ít lưu huỳnh. Khoảng nhiệt độ sôi của các sản phẩm dầu mỏ trong chưng cất phân đoạn ở điều kiện áp suất khí quyển tính theo độ C là:  Xăng, ête: 40-70oC.  Xăng nhẹ: 60-100oC.  Dầu hoả: 120-300oC.  Dầu Diesel: 250-350oC.  Dầu bôi trơn: Trên 300oC. Tóm lại, người ta coi dầu mỏ là hỗn hợp 3 loại chất của cacbuahydro: Hợp chất mạch thẳng-alphatic, hợp chất mạch vòng thơm-aromatic và hợp chất nhựa đường-asphatic là những hợp chất độc đối với sinh vật (Atlas, 1995) [5]. 1.3.2. Tình hình ô nhiễm dầu Dầu là tài nguyên thiên nhiên có giới hạn và không có khả năng phục hồi, là năng lượng cho sản xuất lớn nhất trên thế giới hiện nay. Số lượng mỏ dầu được phát hiện và đưa vào khai thác hàm lượng dầu trên thế giới ngày càng tăng. Kéo theo sự rạn nứt, rò rỉ ở các dàn khoan đổ ra bên ngoài tới 1% số lượng dầu khai thác (hình 1.4). Thêm vào đó, sự thấm tự nhiên ở các kho chứa hàng, vận chuyển, rửa tàu bừa bãi. Đặc biệt, các tai nạn tràn dầu gây ô nhiễm dầu nguy hại đến con người và hệ sinh thái biển. Trong đó, ảnh hưởng nặng nề nhất là các hệ sinh thái vùng ngập mặn nằm dọc bờ. Sự ô nhiễm bởi dầu chủ yếu là do vận chuyển ở biển và chất thải bị nhiễm xăng dầu. Theo điều tra của các nhà khoa học khoảng 1 tỉ tấn dầu được chở bằng đường biển mỗi năm. Một phần khối lượng này (khoảng 0,1 – 0,3%) được ném ra biển một cách hợp pháp: Đó là sự rửa dầu bằng nước biển. Các tai nạn đắm tàu chở dầu tương đối thường xuyên.  Trên thế giới Theo thống kê đã có 129 tai nạn tàu dầu từ 1973 - 1975, làm ô nhiễm biển bởi 340.000 tấn dầu (Ramade, 1989). Ước tính có khoảng 3.6 triệu tấn dầu thô thải ra biển hàng năm (Baker, 1983). Một tấn dầu loang rộng 12 km2 trên mặt biển, do đó biển luôn luôn có một lớp mỏng dầu trên mặt (Furon, 1962) [4]. Hình 1.4: Tai nạn tràn dầu ở dàn khoan [51] Một trong những sự cố tràn dầu nghiêm trọng nhất là vụ đắm tàu chở dầu Exxon Valdez ngày 24/03/1989 làm tràn 11 triệu gallon dầu ra bờ biển bang Alaska. Khoảng 300.000 con chim, 3.500 con rái cá và 200 con hải cẩu đã bị chết [4], [42]. Tai nạn tràn dầu gần đây nhất ở phía nam bờ biển Trung Quốc vào đầu năm 2007, dầu tràn trên diện tích rộng khoảng 656 feet, dài 9 hải lí. Gần đây nhất vào 11/11/07 vụ đắm tàu của Nga tại cảng ở Biển đen làm tràn 4.000 tấndầu ra biển [50].  Tại Việt Nam Theo báo cáo thống kê của cục môi trường, Bộ khoa học-Công nghệ và môi trường cho biết: ừ năm 1987 đến nay đã xảy ra hơn 90 vụ tràn dầu, làm nhiều vùng biển và cửa biển bị ô nhiễm dầu. Khoảng 200 tấn dầu được vận chuyển hàng năm ở vùng biển Việt Nam từ Trung đông đến Nhật Bản và Triều Tiên. Các vụ tràn dầu ở Việt Nam đều có đặc điểm chung : Có nơi lặp lại nhiều lần. Khối lượng dầu tràn lớn, diễn ra trên diện rộng. Dầu ô nhiễm từ nhiều nguồn gốc khác nhau. Từ năm 199._.4 đến nay (2007) đã có 37 sự cố tràn dầu. Riêng thành phố Hồ Chí Minh có 8 vụ, với lượng dầu tràn ước tính khoảng 2.520 tấn [48]. Ở Cần Giờ 2 vụ vào năm 1994, 1998 làm tràn tổng số 170 tấn. Tại Cát Lái-TP. Hồ Chí Minh 4 vụ (1994, 1996, 2001, 2005). Đến tháng 6-2003 tàu Hồng Anh đụng vào cầu cảng chìm, làm tràn hàng chục tấn dầu tại vùng ven biển Cần Giờ (hình 1.5). Ngày 21/1/2007 tàu chở dầu mang tên Kasco chở khoảng 30.000 tấn dầu DO. Do va chạm vào cầu cảng tại xí nghiệp lọc dầu SaiGon Petro (Phường Thạnh Mỹ Lợi, Q.12- tp. HCM) khiến tàu bị thủng, dầu tràn ra trên đoạn đường 1km sông Đồng Nai về phía cầu phà Cát Lái. Gần đây nhất tai nạn nổ kho chứa xăng- dầu ở Đà Nẵng vào tháng 4/2007.Theo các nhà khoa học, mỗi năm nước ta có khoảng 5-6 vụ tràn dầu. Hằng ngày có khoảng 110.000 thùng dầu khai thác ở mỏ Bạch Hổ có 1% bị rò rỉ. Thêm vào đó 70% nước thải từ các vùng công nghiệp khai thác dầu khí không hề được xử lí đổ ra biển. Ở một số bãi biển và cảng lớn tại Hải Phòng, Vũng Tàu, Quy Nhơn…nồng độ dầu đã vượt quá mức cho phép (trên 0,05% mg dầu/l) [42], [45], [47], [49], [51]. Hình 1.5 :Tàu Hồng Anh chìm vào tháng 6-2003 gây tràn dầu tại vùng ven biển Cần Giờ-TPHCM. (Nguồn: Báo SGGP, 2003) Dầu và các sản phẩm của dầu khi tràn ra nước tạo ra lớp bao phủ trên mặt nước, ngăn cản sự trao đổi nhiệt, oxy giữa pha nước và pha khí gây ảnh hưởng đến sinh vật. Ô nhiễm dầu sẽ làm giảm hiệu quả trạng thái của đất về vi sinh vật, về động thực vật đặc biệt ảnh hưởng đến sức khoẻ con người. 1.3.3. Cơ chế phân giải dầu của vi sinh vật Con đường trao đổi chất từ cơ chất là cacbuahydro của dầu mỏ khá phức tạp. Mức độ phân giải sinh học của từng loại dầu tuỳ thuộc vào bản chất và kích thước phân tử của từng cacbuahydro tạo nên chúng. Khả năng phân giải các cacbuahydro trong dầu tuỳ theo sự khác biệt về chiều dài mạch cacbon của ankan. Các ankan có số C10 – C14 thường phân giải mạnh nhất. Các ankan chuỗi ngắn hơn hầu hết có độc tính với vi sinh vật, nhưng lại dễ mất do quá trình bay hơi. Các vi sinh vật không có khả năng phân giải các mạch cacbon có khối lượng hơn 500 đvC [27], [28]. Sự phân giải cacbuahydro hai hướng sau: - Oxi hoá hợp chất cacbuahydro phức tạp có khối lượng lớn thành những chất đơn giản có khối lượng nhỏ hơn để làm giảm hoặc mất độc tính tạo khí thoát ra. - Sử dụng cacbuahydro để sinh tổng hợp tạo sinh khối VSV sử dụng vào các mục đích khác nhau. Hiện nay các nhà khoa học đã làm sáng tỏ cơ chế phân giải cacbuahydro mạch hở. Sự phân giải cacbuahydro có thể diễn ra trong điều kiện hiếu khí hoặc kị khí. Trong điều kiện hiếu khí sự phân giải ankan no mạch thẳng thường theo con đường oxy hoá hoàn toàn đầu tận cùng, diễn ra như sau: - Đầu tiên dưới tác dụng của enzym hydroxylase (monooxygenase) n- ankan sẽ bị oxy hoá thành rượu bậc một: CH3-R-CH3 + O2 + NAD(P)H + H+ → CH3-R-CH2-OH + NAD(P) + H2O. Một số trường hợp giai đoạn đầu này được tác động bởi enzym dioxygenase. Khi đó quá trình oxy hoá diễn ra theo cách sau: CH3-R-CH3 + O2 → CH3-R-CH2- COOH + NAD(P)H + H+ → CH3- R-CH2-OH + NAD(P) + H2O. - Tiếp đến rượu bậc một tiếp tục được oxy hoá thành andehyt rồi thành axit cacboxylic: CH3-R-CH2-OH → CH3-R-CHO → CH3-R-CH2-COOH. - Axit cacbonxylic được sinh ra có thể theo quá trình ω-oxidation rồi đến quá trình β-oxidation hoặc trực tiếp quá trình β-oxidation. - Sản phẩm quá trình β-oxidation là Acetyl CoA sẽ đi vào chu trình TCA và giải phóng CO2 và H2O. Ngoài ra, sự phân giải cũng có thể đi theo con đường phụ (subterminalo- xidation), oxi hoá cacbon giữa mạch: Từ cacbuahydro sẽ tạo ra rượu bậc 2, rồi tạo xêton tạo axit béo và cuối cùng giải phóng CO2 và H2O. Các vi sinh vật có khả năng phát triển trên hexan vòng phải thực hiện tất cả các phản ứng phân huỷ trên. Nhưng trong thực tế, thường gặp các vi sinh vật có khả năng chuyển vòng hexan thành vòng cyclo hexanol (hình 1.6) nhưng không có khả năng lacton hoá và mở mạch vòng. Sau đó, các hợp chất hữu cơ vòng thơm bị hydroxyl hoá nhờ cắt ở vị trí octo tạo ra axit muconic và bị oxi hoá tiếp thành xetoadipic. Oxi hoá tiếp theo thành axit succinic và axetyl CoA. Sau cùng vào con đường β–oxi hoá thành axit formic, piruvic và axetaldehyd [5]. Một số loại nấm sợi thường gặp có khả năng oxi hoá các hợp chất có chứa nhân thơm như Aspergillus niger, có khả năng phân huỷ hợp chất là dẫn suất của phenol. chủng Fusarium lini, Fusarium solani oxi hoá được một số dẫn suất của steroids, terpenoids, alkaloid [28], [43], [49]. Hình 1.6: Phân giải hiếu khí benzen (ảnh nguồn của Brauner, 1998) 1.3.4. Các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu Các yếu tố môi trường như nhiệt độ, độ pH, độ mặn…có ảnh hưởng trực tiếp đến trạng thái lý học của dầu. Thêm vào đó, thành phần chất dinh dưỡng như cacbon, nitơ, photpho trong MT cũng ảnh hưởng đến mức độ phân giải dầu. 1.3.4.1. Ảnh hưởng của yếu tố nhiệt độ Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình phân giải dầu của VSV vì nó ảnh hưởng đến tính chất vật lý, hoá học của dầu cũng như khả năng sinh trưởng của VSV. Mỗi loài nấm sợi đều có khoảng nhiệt độ sinh trưởng và phát triển nhất định, phần lớn nấm sợi có khoảng nhiệt độ 15- 30oC. Nhiệt độ này còn phụ thuộc vào độ ẩm và tuỳ vào nhóm nấm ưa nhiệt hay ưa lạnh. Kết quả nghiên cứu trước đây cho thấy quá trình phân giải dầu diễn ra mạnh nhất ở khoảng 30- 40oC. Đối với VSV ưa nhiệt, nhiệt độ tối ưu cho quá trình phân giải có thể cao hơn khoảng 45- 75oC (Klug và Markovet, 1992). 1.3.4.2. Ảnh hưởng của độ pH Mỗi nhóm VSV có độ pH thích hợp riêng để sinh trưởng. Điều kiện pH thích hợp của môi trường sẽ kích thích quá trình phân giải dầu của VSV. Đối với nấm sợi pH có thể chịu được 3,5-8 và pH tối ưu từ 5,5-6,5. Trong môi trường có nồng độ axit hay kiềm mạnh đều ức chế sự sinh trưởng của nấm sợi. Tuỳ thuộc vào điều kiện môi trường, độ pH thay đổi liên quan đến sự có mặt của gốc H+, OH- của các chất hoà tan [8] . 1.3.4.3. Ảnh hưởng của nồng độ muối Môi trường ô nhiễm dầu nặng chủ yếu là vùng nước lợ ven biển. Nồng độ muối khác nhau ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của VSV. vì vậy, tác động đến quá trình phân giải dầu của chúng. Tùy vào từng khu vực, thời điểm mà có sự thay đổi về nồng độ muối khác nhau. Đối với vùng ven biển và vùng RNM thì nồng độ muối dao động từ 0.1-5% [15], [16]. Vào mùa mưa thì độ mặn ở RNM Cần Giờ tăng lên do hiện tượng xả lũ của các hồ chứa nước. Theo nghiên cứu của Ward và Brock (1990) khi độ mặn tăng từ 3.3-28.4% quá trình phân giải cacbuahydro giảm đi [31]. 1.3.4.4. Các chất dinh dưỡng Thành phần dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến hoạt tính phân giải dầu của VSV. Trong môi trường tự nhiên, thành phần này không ổn định. Nấm sợi thường có khả năng sử dụng cả các nguồn nitơ hữu cơ lẫn nguồn nitơ vô cơ. Nhiều loài nấm sợi có khả năng đồng hoá cả muối amôn lẫn nitrat. Đôi khi ta thấy có những loài nấm sợi không phát triển trên môi trường chứa nguồn nitơ là muối amôn nhưng nguyên nhân không phải là do gốc NH4+ mà ở độ chua sinh lí do các muối amôn tạo ra. Trong quá trình phân giải dầu tỉ lệ C/N; C/P là một yếu tố quan trọng quyết định hoạt tính phân giải dầu của VSV. Khi có dầu tràn, lượng cacbuahydro lớn làm tăng tỉ lệ C/N; C/P dẫn đến hạn chế khả năng phân giải dầu. Vì vậy, điều chỉnh tỉ lệ C/N/P nhằm kích thích khả năng phân giải dầu của VSV là hết sức cần thiết. Để giải quyết vấn đề ô nhiễm dầu do sự cố đắm tàu Exxon Valdez ở Alaska (1989) người ta đã bổ sung 50.000 kg N và 5.000 kg P để tăng sự phân giải dầu của VSV ở đây [36], [43]. 1.3.5. Vai trò và lược sử nghiên cứu nấm sợi phân giải dầu 1.3.5.1. Vai trò của nấm sợi trong hệ sinh thái RNM - Nấm sợi RNM góp phần quan trọng trong việc khép kín vòng tuần hoàn vật chất trong tự nhiên. Chúng có khả năng phân giải mạnh mẽ các hợp chất hữu cơ phức tạp. - Chúng được sử dụng để sản xuất nước tương, đậu phụ, các loại enzym như: amilaza, proteinaza, xenlulaza,... - Nhiều loại nấm sợi có khả năng tích luỹ vitamin, các chất sinh trưởng và nhiều ancaloit có giá trị chữa bệnh. - Nấm sợi có khả năng tiết chất kháng sinh có giá trị: Pennixilin, xephalosporum, fuzidin, fumagilin, tripaxidin. - Nấm sợi được sử dụng trong sản xuất thu sinh khối giàu protein làm thức ăn cho gia súc. - Việc phát hiện ra VSV có khả năng phân giải các hợp chất cacbu- ahydro khó phân huỷ có ý nghĩa rất lớn trong ngành công nghệ sinh học. Rất nhiều nhà khoa học trong các phòng thí nghiệm đi sâu nghiên cứu sử dụng VSV trong thăm dò và khai thác dầu khí. VSV phân giải dầu còn được sử dụng để sản xuất sinh khối giàu protein cho gia súc, trên cơ chất dầu mỏ. Để giải quyết vấn đề ô nhiễm dầu hiện nay trên biển và các vùng ngập mặn. Biện pháp sử dụng chủ yếu là cơ học và hoá học. Nhưng biện pháp này để lại một lượng dầu không xử lí hết sau khi thu dọn. Ngày nay, các nhà khoa học sau khi dùng phương pháp lí-hoá để dọn bớt lượng dầu trên bề mặt đã phối hợp thêm biện pháp phân hủy sinh học để xử lí lượng dầu còn lại [27], [32]. 1.3.5.2. Lược sử nghiên cứu nấm sợi phân giải dầu Các vi sinh vật phân giải dầu chủ yếu là nhóm vi khuẩn, nấm men, nấm mốc. Các công trình nghiên cứu về nấm sợi ở RNM của các tác giả trên thế giới như: Từ năm 1895 Miyoshi đã công bố công trình nghiên cứu về khả năng phân huỷ parafin trong dầu mỏ của vi sinh vật. 1906-Rahn nghiên cứu khả năng phân giải parafin bởi nấm mốc. Năm 1925, Tauson đã phát hiện thấy khả năng phân giải cacbuahydro của vi khuẩn. Đến năm 1940, rất nhiều nhà khoa học trong các phòng thí nghiệm trên thế giới đi sâu nghiên cứu sử dụng vi sinh vật trong thăm dò và khai thác dầu khí. Năm 1961, Fush thống kê có 26 giống trong đó có 75 chủng phân giải cacbuahydro mạch thẳng, 25 chủng phân giải cacbuahydro mạch vòng. Sau đó, các nhà khoa học Kom- agata, Nakase, Kasuio đã phân lập được 498 chủng nấm men có khả năng phân giải cacbuahydro. Số lượng các loài VSV có khả năng phân giải dầu mỏ được công bố ngày càng nhiều. Chúng thuộc các nhóm vi khuẩn, nấm men, nấm sợi và cả xạ khuẩn.  Vi khuẩn: Bacillus, Bacterium, Flavobacterium, Micrococcus, Pseudomonas, Vibrio, Mycobacterium.  Nấm men: Candida(chủ yếu), Endomyces.  Nấm sợi: Penicilium, Aspergillus.  Xạ khuẩn: Actinomyces, Streptomyces. Trong số các nhóm vi sinh vật thì vi khuẩn và nấm sợi là hai nhóm đã tìm thấy nhiều loài có khả năng phân giải dầu mạnh. Nấm sợi phát triển mạnh trên môi trường có n-ankan mạch thẳng nhưng yếu hơn ở mạch nhánh. Vi sinh vật trong môi trường có dầu mỏ, với điều kiện thích nghi chúng có thể sử dụng các thành phần cacbuahydro của dầu mỏ làm cơ chất dinh dưỡng nguồn cacbon [28]. Sự phân huỷ sinh học không phải là một khái niệm mới. Các nhà khoa học đã nghiên cứu từ năm 1940. Tuy nhiên, nó chỉ được biết đến rộng rãi như là một công nghệ cho việc làm sạch các vùng ven bờ bị ô nhiễm do sự cố tràn dầu tiêu biểu như trường hợp xử lí tai nạn tràn dầu ở Prince William Sound vào năm 1989 (Hoff, 1993). Nấm trên thế giới đã được nghiên cứu và hệ thống hoá từ lâu. Nhưng mô tả đầu tiên về nấm biển xuất hiện trong RNM là nhà nghiên cứu nấm Cribb và Cribb (1955, 1956, 1960) ở Australia, về nhóm Philophorophoma littoralis Linder. Tiếp đến là Kohlmeyer (1966, 1968, 1969). Năm 1979 Kohlmeyer và cộng sự đẫ đưa ra danh sách 42 loài vi nấm RNM (23 loài thuộc Ascomyco-tina, 17 loài thuộc Deuterromycotyna, 2 loài thuộc basidiomycotina). Năm 1987, Hyde và Jones 89 loài nấm từ cây Rhizophora mucronata lanak (Ấn Độ). Gần 300 chủng nấm từ lá cây, chủ yếu là nấm kí sinh [33]. Bên cạnh đó, cũng có những công trình nghiên cứu hệ vi nấm khác trên lá của cây Heliconia marina ở Costa Rica và ở nam Mexico. Qua tổng hợp, so sánh người ta đã ghi nhận được một số loài vi nấm đặc trưng của vùng Caribê như: Clordium phacosporum var cubense, Cylinsympodiella sp. Lauriomyces pulchra và Solheimia costaspora. (JD Polishook et al, 1996). Chủ yếu là các loài nấm sợi có khả năng phân giải xenluloza, protein, kitin. Riêng về nấm sợi phân giải dầu ở RNM còn tản mạn. Tại Việt Nam, có công trình nghiên cứu nấm sợi có khả năng phân giải dầu thô ở các giếng khoan dầu khí thuộc tỉnh Thái Bình, Vũng Tàu của tác giả Lại Thuý Hiền. Nghiên cứu tính đa dạng và vai trò của nấm sợi phân lập từ RNM ở tỉnh Thái Bình và Nam Định của Mai Thị Hằng, 2003. Cũng theo các nhà nghiên cứu, vi sinh vật RNM ven biển đồng bằng sông Hồng và Cần Giờ tìm thấy có khoảng 83/199 chủng nấm có khả năng phân giải dầu mỏ ở mức độ khác nhau, một số chủng nấm sợi thuộc các chi Penicillium, Aspergillus, Cladosporium, Paeci-lomyces có khả năng phân giải mạnh dầu DO. Ngoài ra các nhà nghiên cứu còn thấy các chủng nấm sợi hiện diện ở RNM cũng có mặt ngay trên dầu thô ở Bạch Hổ [42], [44], [45], [47]. Chương 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. Vật liệu 2.1.1. Khu vực lấy mẫu Ghi chú: Vị trí lấy mẫu Hình 2.1: Bản đồ vị trí lấy mẫu huyện Cần Giờ [Nguồn từ ] Các mẫu đất, lá, thân cây ở các vùng của RNM Cần Giờ như: - Đất ở bề mặt từ 0-5cm và lớp đất bề sâu khoảng 10-15cm ở xã An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp; Bình Khánh; đảo khỉ; ruộng muối cách đảo khỉ 3km; rừng Đước thuộc rừng trồng lâu năm. - Thân: Thân mục, thân tươi ; quả chủ yếu ở các cây như : Dừa nước, Sú, Đước, Bần, Mắm.. - Lá gồm lá mục, lá vàng, lá tươi. Đa số đất ở RNM Cần Giờ là đất sét pha cát, rừng thứ sinh cây trồng từ 5-20 năm, độ ẩm cao. Mẫu được lấy làm 3 đợt, mỗi đợt cách nhau một tháng vào tháng 6, 7, 8 năm 2006. Đợt 1 tháng 6 ít mưa, đợt 2 tháng 7 mưa vừa và đợt cuối tháng 8 mưa nhiều. - Các VSV kiểm định: Bacillus subtilis ATCC 6633 từ PTN vi sinh Đại học Khoa học Tự Nhiên TP. HCM và Escherichia coli ATCC 15224 từ phòng xét nghiệm vi sinh Bệnh viện Bình Dân. 2.1.2. Hoá chất - Các loại đường chuẩn như: glucozơ, saccarozơ, lactozơ, mantozơ, galactozơ (Trung Quốc). - Các loại muối: KNO3, (NH4)2SO4, NaNO3, NaCl, KCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, FeSO4, (NH4)2C2O4, Na2HPO4 (Trung Quốc). - Các hợp chất khác: Yeast extract (Mỹ), CMC (Nhật), mealt extract (Đức), pepton, n-hexan (Luân Đôn), kitin, casein, tween-80, toluen (Trung Quốc), dầu Diesel, dầu hoả (Petrolimex- Việt Nam), Cloramphenicol, Agar (Việt Nam). 2.1.3. Máy móc thiết bị - Máy dập mẫu (Anh). - Nồi hấp vô trùng Hyrayama (Nhật). - Tủ sấy Memmer (Đức). - Tủ cấy (Việt Nam). - Tủ giữ mẫu Sanyo (Nhật Bản) - Tủ ấm Memmert (Đức) - Máy lắc Gerhardt (Đức) - Máy đo pH pometer KL-009 (II) (Trung Quốc) - Kính hiển vi quang học, máy ảnh kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật) - Cân điện tử 2 số Sartorius (Đức). - Cân phân tích điện tử (4 số) Sartorius (Đức). - Tủ lạnh National (Nhật) 2.1.4. Các môi trường phân lập, nuôi cấy, giữ giống nấm sợi - MT1: Môi trường D : Dùng để phân lập nấm sợi Glucose 10g Agar 20g Nước biển 1000ml - MT2: Glucose Yeast Agar (YEA): Dùng để phân lập, nuôi cấy, giữ giống nấm sợi gồm: Cao nấm men 4,0g Glucose 20,0g Agar 20,0g Nước biển 1000ml pH= 5,5-6,0. - MT3: MT muối khoáng: Dùng để thử hoạt tính phân giải dầu gồm: KH2PO4 0,3g MgSO4 0,4g KNO3 3g Na2HPO4 0,7g Nước biển 1000ml Dầu DO (dầu hoả) 2,5ml pH = 5,5-6,0. Để xác định ảnh hưởng của pH, độ mặn, nồng độ nitơ đến khả năng phân giải dầu. Ta điều chỉnh bằng các chất NaOH, HCl, NaCl và các muối nitrat với tỉ lệ khác nhau. - MT4: MT Czapek- Dox: Nuôi cấy và thử hoạt tính enzim ngoại bào (xenlulaza; kitinaza; amilaza; proteaza). Glucose 20,0g KH2PO4 1,5g NaNO3 3,5g KCl 0,5g MgSO4.7H2O 0,5g FeSO4.7H20 0,1g (vết) Agar 20,0 g Nước biển 1000ml pH = 6,5- 7,2. Để thử hoạt tính enzym amilaza, kitinaza, proteaza, xenlulaza ta dùng các cơ chất tương ứng là tinh bột, bột vỏ tôm, casein, CMC thay đường glucose với hàm lượng tương đương. * Cách thu kitin từ vỏ tôm: Vỏ tôm rửa sạch bằng nước, đem đun sôi thay nước 3 lần. Xử lí tiếp với dung dịch NaOH 10% để loại bỏ hết protein. Sau đó xử lí tiếp bằng dung dịch HCl 10% để hoà tan CaCO3, cuối cùng rửa sạch, sấy khô, nghiền nhỏ để xử dụng trong các thí nghiệm [19]. - Các MT phân loại nấm sợi: - MT5: Malt Extract Agar (môi trường MEA): Malt Extract 20,0g Pepton 1,0g Glucose 20,0g Agar 20,0g Nước biển 1000ml pH=5,6. - MT6: Czapek Glucose 20g MgSO4 0,5g FeSO4 0,1g K2HPO4 1,0g KCl 0,5g CaCO3 3g Agar 20g Nước biển 1000ml 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp VSV 2.2.1.1. Phương pháp lấy mẫu - Nguyên tắc: Mẫu lấy dựa trên mục đích phân lập loại VSV nào, thì chọn cơ chất, số lượng mẫu cho phù hợp. Không lấy ngẫu nhiên mất nhiều thời gian. Phân lập nấm sau khi lấy mẫu càng sớm càng tốt. - Thu mẫu: - Ngẫu nhiên: Khi thuỷ triều vừa rút tại các rừng già cách biển 2km. Mẫu đất trên bề mặt dưới lớp lá cây mục và lớp đất sâu 5- 10cm. Mẫu lá cây già tươi, lá vàng, lá khô ở các cây khác nhau. Mẫu thân cây tươi, khô, mục. - Chọn lọc: Mục đích phân lập chọn những chủng nấm có khả năng phân giải dầu. Vì vậy, trước khi tiến hành thu mẫu 1 tháng tôi đã đưa dầu DO- chất cảm ứng vào môi trường đất. Sau đó, tiến hành thu mẫu. - Cách tiến hành: Mẫu đất: Dùng thìa vô trùng lấy phần đất cần cho vào túi nilon. Đồng thời ghi các thông số cần thiết về nơi lấy mẫu: địa chỉ, ngày lấy mẫu, tình trạng mẫu, người lấy mẫu. Mẫu lá, thân: dùng dao, kéo, vô trùng cắt khoảng 50g mẫu cho vào túi nilon. Tất cả các mẫu sau khi lấy đều được bảo quản trong thùng đá, vận chuyển về PTN và giữ ở nhiệt độ 4oC 2.2.1.2. Phương pháp phân lập - Nguyên tắc: Để phân lập nấm sợi là VSV đơn bào, thường phải pha loãng để các tế bào tách rời nhau ra. Sau đó trải đều trên mặt đĩa petri để các khuẩn lạc mọc riêng rẽ. Mỗi khuẩn lạc sinh ra từ một tế bào ban đầu, do đó khi tách nuôi sang môi trường mới một hoặc vài lần có thể thuần khiết được giống nấm sợi. - Tiến hành: Cân 10g đất (đã nghiền nhỏ và trộn đều), lá hoặc thân cho vào túi lọc. Trong đó có chứa 90ml nước cất vô trùng, đưa vào máy nghiền mẫu, dập trong 2 phút, vận tốc 230 vòng. Sau đó, dùng pipet vô trùng hút 1 ml dung dịch trên sang ống nghiệm chứa 9ml nước cất vô trùng, ta được dung dịch pha loãng 10-2. Tiếp tục như vậy pha loãng đến nồng độ 10-4, 10-5, 10-6. Lấy 0,1ml (2 giọt) dung dịch pha loãng nồng độ 10-6 sang hộp petri có chứa môi trường phân lập, dùng que trang, trang đều cho đến khi khô. Giữ nguyên que trang tiếp tục sang hộp 2 và hộp 3 [33]. Sau đó, để ở nhiệt độ phòng trong 2 hoặc 3 ngày. Tách các khuẩn lạc riêng rẽ và cấy chuyền cho đến khi thu được giống thuần khiết. Cuối cùng, đưa vào ống nghiệm có chứa thạch nghiêng môi trường giữ giống (MT2). - Yêu cầu: Các chủng phân lập ngẫu nhiên từ MT và chủng phân chọn lọc kí hiệu riêng để so sánh 2.2.1.3. Phương pháp xác định số lượng VSV [9] - Nguyên tắc: Sự hiện diện của VSV có thể được định lượng bằng nhiều phương pháp khác nhau: Đếm số lượng tế bào trực tiếp trên kính hiển vi, gián tiếp thông qua mức độ cản ánh sáng (độ đục), định lượng 1 cách thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn (phương pháp MPN)… Định lượng thống kê bằng phương pháp pha loãng tới hạn: - Cách tiến hành: Đưa 10ml nước cất vô trùng có 3 giọt Tween 80 vào ống giống thạch nghiêng nuôi cấy được 3 ngày. Lắc đều, lấy 1ml mẫu có chứa VSV. Pha loãng theo phương pháp pha loãng giới hạn. Dùng micropipet lấy 0,1ml dịch huyền phù trải đều trên mặt môi trường trong hộp petri. Nuôi ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày, đếm số lượng khuẩn lạc VSV phát triển trong hộp petri, từ đó tính được số lượng tế bào trong 1ml mẫu lúc đầu theo công thức: N = a x 10 x n Với N: Tổng số CFU trong 1ml mẫu đem phân lập. n: Độ pha loãng mẫu. a: Số CFU trung bình đếm được trong một hộp petri. - Yêu cầu: + Không đếm hộp có khuẩn lạc mọc bung, mọc lan. + Chỉ đếm hộp có ít nhất 10 khuẩn lạc trở lên. Những hộp có số khuẩn lạc nhỏ hơn 10 không có giá trị thống kê. + Khi đếm khuẩn lạc cần hạn chế việc mở đĩa tránh sự phát tán của bào tử vào không khí, gây nhiễm mẫu hoặc môi trường khác. 2.2.1.4. Phương pháp định danh nấm sợi [6] - Nguyên tắc: Các chủng VSV cần được xác định chủng loại, trước khi tiếp tục nghiên cứu hoặc sử dụng. Việc phân loại định danh cần tiến hành tỉ mỉ thông qua quá trình quan sát, mô tả hoặc các trắc nghiệm sinh hoá dựa trên một khoá phân loại nào đó. - Cách tiến hành phương pháp cấy chấm điểm: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp (YEA; MEA; Czapek) MT sau khi đổ vào hộp petri, để qua ngày khi bề mặt môi trường tương đối khô ráo rồi mới cấy. Cấy chấm điểm các chủng nấm tuyển chọn, tuỳ theo tốc độ phát triển của từng loài nấm mà cấy 1 hoặc 3 điểm. Đánh dấu vào vị trí cần cấy lên mặt đáy của đĩa MT bằng bút lông Khi cấy, úp ngược hộp MT và cấy bào tử vào các điểm đánh dấu trước, tránh sự rơi vãi bào tử trên bề mặt môi trường tại những vị trí không mong muốn. Sau khi cấy, đĩa được ủ ở nhiệt độ phòng, trong tối và thường xuyên theo dõi 3 đến 7 ngày.  Quan sát đại thể: Ghi nhận các thông tin về khuẩn lạc của nấm (kích thước, hình dạng, màu sắc, sắc tố tiết ra môi trường, giọt tiết,..). mô tả mặt trên và mặt dưới môi trường thạch. Quy trình quan sát đại thể đặc điểm khuẩn lạc định loại: - Hình dáng - Kích thước (đường kính, chiều dày). Tốc độ phát triển của khuẩn lạc sau những thời gian nhất định (trên những môi trường xác định và ở những nhiệt độ xác định) - Dạng mặt (nhung mịn, mượt, len xốp, dạng hạt, lồi lõm, có khía hay không…) - Màu sắc của khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới. Sự thay đổi màu sắc khuẩn lạc. - Dạng mép khuẩn lạc: Dày, mỏng, nhăn nheo, phẳng… - Giọt tiết nếu có (ít, nhiều, màu sắc..) - Mùi khuẩn lạc (có, không mùi) - Sắc tố hoà tan (màu sắc môi trường xung quanh khuẩn lạc) nếu có. Các cấu trúc khác: Bó sợi, bó giá, các cấu trúc mang bào tử trần như đĩa giá hoặc túi giá, đệm nấm, hạch nấm vv ..  Quan sát đặc điểm vi học: Phương pháp cấy khối thạch: Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp ( MEA, YEA, Czapek) trong các hộp petri. + Chuẩn bị các hộp petri, phiến kính, lá kính, bông thấm nước và nước cất vô trùng. + Đặt một hoặc hai khối thạch hình vuông có cạnh trên mỗi phiến kính (mỗi phiến kính chỉ cấy một chủng để nghiên cứu). + Cấy một ít bào tử lên bề xung quanh khối thạch. Đặt lá kính vô trùng lên trên bề mặt khối thạch. + Nuôi cấy trong 3- 4 ngày quan sát dưới kính hiển vi với vật kính x 100. + Quan sát trên kính hiển vi và mô tả các đặc điểm hình dạng, kích thước sợi nấm ,bào tử, nhánh, cuống sinh bào tử…  Màu sắc hệ sợi khí sinh và cơ chất còn non và khi già. Sợi có vách ngăn, không có vách ngăn, các hình thái đặc biệt nếu có.  Sinh sản vô tính hay hữu tính.  Đặc điểm của các cơ quan sinh sản vô tính,  Hình thái, kích thước của các loại bào tử (dạng bào tử trần, bào tử kín…) + Đặc điểm cuống sinh bào tử (giá bào tử): Hình dạng và cách sắp xếp cuống sinh bào tử (đơn hoặc thành bó, song không liên kết chặt chẽ, bó có liên kết chặt chẽ, liên kết thành mô giả). + Kiểu phân nhánh của cuống sinh bào tử: Không phân nhánh, phân nhánh đơn, phân nhánh nối tiếp hay phân nhánh đối xứng. + Màu sắc của cuống sinh bào tử: Không màu hoặc màu sáng, sặc sỡ hay màu tối. + Sự khác nhau về cấu tạo và vị trí của cuống sinh bào tử:  Vị trí: Đâm lên hay trúc xuống, bò ngang, thẳng.  Kích thước: Cao, thấp, mỏng hay dầy.  Hình dạng phần ngọn của cuống (tròn, vuông, lồi…).  Bề mặt của cuống: Phẳng, lồi, xù xì hay gai.  Nơi xuất phát: Từ sợi khí sinh hay cơ chất. + Đặc điểm của bào tử: Đơn bào hoặc đa bào, có hay không có vách ngăn, có hay không có các sợi phụ, không màu, màu sáng, màu rực rỡ hay tối, toàn bộ đám bào tử màu gì? Được sinh ra trực tiếp từ sợi nấm hay từ sợi nấm do đứt gẫy hoặc được tạo ra trên cuống sinh bào tử. Xếp đơn độc , thành chuỗi hay tụ tập thành cụm. Hình dạng bào tử (hình cầu, ôvan, elíp,..). Bề mặt nhăn hay gai, sần sùi hay có các sợi tơ hoặc đuôi. 2.2.2. Phương pháp sinh học 2.2.2.1. Xác định khả năng phân giải cacbuahydro của nấm sợi - Nguyên tắc: Khả năng phân giải cacbuahydro được đánh giá bằng sự sinh trưởng của VSV (lượng sinh khối khô) trên MT có thành phần cacbuahydro. - Tiến hành: + Chuẩn bị các bình tam giác dung tích 250 ml có chứa 47,5 ml môi trường khoáng nước biển và 2,5 ml dầu D.O (dầu hoả, toluen) có khối lượng tương đương 2,1g ( 4%). + Vô trùng môi trường ở 121oC trong 30 phút. + Cấy chủng nấm sợi nghiên cứu lấy từ bề mặt thạch nghiêng đưa vào bình tam giác khoảng 6,3.106 CFU/ml. Bình đối chứng không cấy nấm sợi. Nuôi cấy tĩnh trong 15 ngày ở nhiệt độ phòng. - Yêu cầu: Đánh giá mức độ phát triển của nấm sợi qua sinh khối khô, mức độ mất các giọt dầu và mùi dầu trong MT. 2.2.2.2. Xác định hàm lượng dầu bị phân giải - Đưa 15ml n-Hexan vào bình tam giác chứa 50ml dịch nuôi cấy sau 15 ngày. - Lắc trên máy 200 vòng/ phút trong 40 phút. - Dùng pipet lấy lớp dịch dầu đã hoà tan trong n-Hexan sang lọ nhựa đã biết trước khối lượng (ký hiệu mo). - Cho tiếp 10ml n-Hexan vào dịch còn lại rồi làm tương tự như trên. - Sấy lọ nhựa chứa hỗn hợp dầu hoà tan trong n-Hexan ở 60oC đến khối lượng không đổi. * Bình đối chứng không cấy nấm sợi cũng được tiến hành như trên. Lượng dầu bị phân huỷ được tính theo công thức: ∆m= m- (m1-mo) Trong đó: - m là khối lượng dầu còn lại trong bình đối chứng. - m1 là khối lượng bình nhựa chứa dầu sau khi sấy khô đến khối lượng không đổi. - mo là khối lượng bình nhựa. Tỉ lệ (%) dầu bị phân giải tính theo công thức: Tỉ lệ (%)= ∆m.100/m. 2.2.2.3. Phương pháp nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu  Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần MT đến khả năng phân giải dầu của các chủng tuyển chọn.[20] - Nguyên tắc: Thành phần MT ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phân giải dầu của nấm sợi. Đánh giá sự ảnh hưởng này thông qua việc nuôi cấy ở MT giàu chất dinh dưỡng (MT phân lập) và nghèo chất dinh dưỡng (MT khoáng). - Tiến hành: 2 ml bào tử nấm sợi (6,3.106 CFU/ml) + 47,5 ml môi trường Czapek- Dox hoặc MT muối khoáng và 2,5 ml dầu D.O trong bình tam giác dung tích 250ml. - Yêu cầu: So sánh khả năng phân giải dầu của nấm sợi ở hai điều kiện trên trong cùng thời gian và nhiệt độ, để chọn môi trường phân giải dầu tốt nhất cho việc nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng tiếp theo. * Nghiên cứu khả năng phát triển của các chủng tuyển chọn trên môi trường tự nhiên. Để xác định xem các chủng tuyển chọn trong môi trường tự nhiên có khả năng phân giải dầu hay không? Chúng tôi dùng môi trường nước biển tự nhiên không bổ sung thêm muối khoáng: Cấy 2ml bào tử nấm sợi (6,3.106CFU/ml) vào bình tam giác 250ml chứa 47,5ml nước biển và 2,5ml dầu DO và nuôi cấy tĩnh trong 15 ngày. Đánh giá bằng cách xác định lượng dầu bị phân giải.  Ảnh hưởng thời gian - Nguyên tắc: Các chủng nấm sợi có tốc độ sinh trưởng khác nhau. Để xác định ảnh hưởng của thời gian đến sự sinh trưởng của nấm sợi RNM chủng tôi tiến hành thí nghiệm sau: - Cách tiến hành: Sử dụng môi trường (MT2) cấy chấm điểm các chủng nấm sợi tuyển chọn. Để ở nhiệt độ phòng. Đo đường kính khuẩn lạc, mỗi lần cách nhau 24giờ nhằm xác định tốc độ sinh trưởng của nấm sợi. Sử dụng môi trường (MT3) nuôi cấy và xác định lượng dầu phân giải bằng phương pháp 2.2.2.2 vào các ngày thứ 7,15, 23, 30. - Yêu cầu: Đánh giá tốc độ sinh trưởng và khả năng phân giải dầu bằng cách so sánh đường kính khuẩn lạc và lượng dầu phân giải của các chủng nấm sợi trong cùng thời điểm.  Ảnh hưởng nguồn nitơ - Nguyên tắc: Thành phần môi trường ảnh hưởng rất lớn đến khả năng phân giải dầu của nấm sợi, trong đó có N. Để xác định được ảnh hưởng của nguồn N đến khả năng phân giải dầu của các chủng nấm sợi chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau: - Cách tiến hành: Chúng tôi dùng môi trường khoáng làm môi trường cơ sở, trong đó nguồn nitơ được lần lượt được thay thế bằng KNO3; NaNO3; (NH4)2NO3; (NH4)2C2O4; NH4Cl; (NH4)2SO4 ở các nồng độ khác nhau. Tính theo lượng nitơ của các chất lần lượt là 0,01%, 0,04%, 0,07%, 0,1% và 0,13%. Hàm lượng nitơ bổ sung vào môi trường được tính theo công thức sau: C1% = 14.n.m/m1.M Trong đó: - n: Số nguyên tử nitơ có trong muối chứa nitơ. - m: Khối lượng muối chứa nitơ trong 1lít môi trường. - m1: Khối lượng phân tử của muối chứa nitơ - M: Khối lượng của dung dịch.  Ảnh hưởng của nguồn cacbon. - Nguyên tắc: Các chủng nấm sợi có khả năng sử dụng các nguồn cacbon khác nhau để sinh trưởng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau, để xác định ảnh hưởng của nguồn cacbon đến sự sinh trưởng của nấm sợi. - Cách tiến hành:Chúng tôi sử dụng môi trường nuôi cấy (MT4) trong nước biển, sacaroza lần lượt được thay bằng các nguồn cacbon sau: lactoza, galact-oza, CMC, maltoza. Trọng lượng các chất thay thế được lấy sao cho hàm lượng cacbon trong các nguồn đó đúng bằng hàm lượng cacbon đó trong MT nuôi cấy. Cấy chấm điểm nấm sợi nghiên cứu trên bề mặt các MT tương ứng. Sau đó để ở nhiệt độ phòng khoảng 3-4 ngày. - Yêu cầu: Đánh giá khả năng sử dụng các nguồn cacbon bằng mức độ phát triển của các khuẩn lạc qua độ lớn đường kính khuẩn lạc.  Ảnh hưởng độ mặn - Nguyên tắc: Áp suất thẩm thấu của môi trường có ảnh hưởng đến sự tăng trưởng của VSV. Phần lớn VSV có khả năng tăng trưởng trong môi trường nhược trương. Khi thêm một chất tan như muối, đường vào dung dịch, chúng làm gia tăng áp suất thẩm thấu của dung dịch. Một số VSV có khả năng chịu được nồng độ muối lên đến 10%, được gọi là ưa muối tuỳ ý, một số khác cần nồng độ muối cao từ 15% đến 20% để tăng trưởng, được gọi là VSV ưa muối cực đoan. Để thử khả năng chịu mặn ta tiến hành phương pháp sau: - Cách tiến hành: + Đo khả năng sinh trưởng:  Chuẩn bị môi trường nuôi cấy thích hợp (môi trường MT2), có bổ sung c._. mong muốn. Nhiệt độ cao có thể làm biến tính enzym, mất nước và oxi hoá các thành phần của tế bào. Nhiệt độ thấp có thể ức chế sự tăng trưởng của chúng. Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự tăng trưởng của các chủng nấm sợi phân giải dầu tuyển chọn. 3.2.4. Ảnh hưởng của nhiệt độ Chúng tôi xác định nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trưởng của nấm sợi RNM phân giải dầu trong điều kiện in vitro. Nhằm xác định môi trường tối ưu nuôi cấy nấm sợi, chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy các chủng nấm sợi trên MT2 với nhiệt độ: Lô đối chứng ở nhiệt độ phòng, lô thí nghiệm ở các nhiệt độ 20oC, 25oC, 30oC, 35oC, 40oC. Xác định mức độ sinh trưởng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc ở các nhiệt độ khác nhau. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13. Bảng 3.13: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sự sinh trưởng của chủng C15.1 và Đ41 mức độ phát triển của nấm sợi (mm) Ký hiệu chủng Đ/C 20oC 25oC 30oC 35oC 40oC C15.1 1,4 0,2 0,8 1,5 1,2 0,0 Đ41 4,8 0,8 3,8 4,8 4,2 1,5 0 1 2 3 4 5 6 20 25 30 35 40 Nhiệt độ (độ C) Đư ờn g kí nh k hu ẩn lạ c (m m ) C15.1 Đ41 Biểu đồ 3.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên sinh trưởng của C15.1 và Đ41 Kết quả ở bảng 3.13 và biểu đồ 3.6 cho thấy: - Chủng nấm sợi tuyển chọn (Đ41) có khả năng sinh trưởng trên biên độ nhiệt rộng từ 20- 40oC và sinh trưởng tốt nhất ở 30oC. Đối với chủng nấm (C15.1) thì không sinh trưởng được ở 40oC. - Theo nghiên cứu của tác giả Bùi Xuân Đồng (2004): Khả năng hấp thu hay thoát hơi nước của nấm sợi đều liên quan đến nhiệt độ môi trường, khoảng từ 15- 30oC. Nấm sợi có nhiệt độ tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25- 30oC. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ, được trình bày ở bảng 3.12 của chúng tôi cho thấy: Chủng nấm (C15. và Đ41) cũng có đặc tính như vậy, chúng sinh trưởng tối ưu ở nhiệt độ 30oC. Sau khi nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố MT lên khả năng phân giải dầu, chúng tôi thấy nấm sợi RNM Cần Giờ có khả năng sinh trưởng và phân giải dầu tốt ở độ mặn 3%, pH=6, nhiệt độ 30oC và phân giải mạnh nguồn cacbuahydro ở dầu DO. Các kết quả trên cho thấy các chủng nấm sợi (C15.1 và Đ41) có tiềm năng ứng dụng để giải quyết ô nhiễm dầu. Vì vậy, để làm cơ sở cho việc sử dụng chúng trong thực tiễn. Chúng tôi tiến hành định loại đến loài hai chủng nấm sợi trên. 3.3. Xác định lượng dầu DO bị phân giải ở điều kiện môi trường tối ưu Trong tất cả các thí nghiệm trên có thể thấy trong điều kiện phòng thí nghiệm các chủng nấm sợi phân lập được có khả năng phân giải dầu DO. Vậy trong tự nhiên (đất và nước biển) chúng có khả năng này không? Ở môi trường nuôi cấy và môi trường có điều kiện tối ưu khả năng phân giải dầu có chênh lệch nhiều không? Vì vậy chúng tôi tiến hành thí nghiệm sau đây: Nuôi cấy nấm sợi C15.1, Đ41 trong bình tam giác 250 ml với 3 lô thí nghiệm, mỗi lô gồm 3 bình: - Lô 1: Bình tam giác có chứa 47,5 ml nước biển + 2,5 ml dầu DO. - Lô 2 (Đ/C): bình tam giác có chứa 47,5ml MT3 + 2,5ml dầu DO. - Lô 3: Bình tam giác có chứa 47,5ml MT3 với lượng NH4NO3 thích hợp, pH, độ mặn tối ưu. Sau 15 ngày nuôi cấy tĩnh, xác định khả năng phân giải dầu của nấm sợi trong các bình nuôi cấy theo phương pháp 2.2.2.2. Kết quả trình bày ở bảng 3.14. Bảng 3.14: Khả năng phân giải dầu của chủng nấm sợi trên môi trường tối ưu. Tỉ lệ dầu bị phân giải(%) STT Ký hiệu chủng MT tự nhiên MT tối ưu MT Đ/C 1 C15.1 8.49 82.6 65.7 2 Đ41 8.18 84.4 66.1 Qua kết quả bảng 3.14 chúng tôi thấy: - Trong môi trường tự nhiên các chủng nấm mốc được tuyển chọn cũng có khả năng phân giải dầu khi không được bổ sung thêm nguồn khoáng N, P. - Trong điều kiện tối ưu các yếu tố môi trường cho quá trình phân giải dầu của nấm sợi, tỉ lệ dầu phân giải cao (82,6-84,4%). - Lượng dầu phân giải của môi trường tối ưu so với đối chiếu tăng (15,9-18,3%). - Điều này cho thấy sự thích ứng của nguồn gen VSV trong RNM. Chúng có ý nghĩa rất cao khi ứng dụng việc sử dụng các chủng VSV trong phương pháp phân huỷ sinh học để làm sạch môi trường ô nhiễm dầu. Hình 3.8: Khả năng phân giải dầu chủng nấm Đ41 trên các môi trường khác nhau 3.4. Định danh chủng nấm sợi tuyển chọn đến loài Nhằm xác định vị trí của hai chủng nấm sợi tuyển chọn (C15.1 và Đ41) trong hệ thống phân loại. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm: - Nuôi cấy chấm điểm chủng nấm sợi tuyển chọn trên các môi trường thạch khác nhau (MT1, MT4, MT5) theo phương pháp 2.2.1.3. Mô tả đặc điểm khuẩn lạc: Đường kính, hình dạng khuẩn lạc, giọt tiết, sắc tố hoà tan. - Nuôi cấy phòng ẩm chủng nấm trên môi trường phân loại Czapek. Quan sát dưới kính hiển vi điện tử, mô tả: Cuống sinh bào tử, bào tử, cuống thể bình , thể bình. Dựa vào tài liệu của Nguyễn Lân Dũng (2000), Đặng Hồng Miên (1999), Bùi Xuân Đồng (2004). - Chúng tôi gửi chủng nghiên cứu sang công ty cổ phần Giám định và khử trùng FCC, để định danh đến loài, theo phương pháp quan sát hình thái. Dựa vào các khoá phân loại: The Genus Aspergillus- Kenneth B-Raper; Manual of the Penicillia by Kenneth B-Raper and Charles Thom (1968). 3.4.1. Định danh chủng Đ41 Sau khi nuôi cấy chủng nấm sợi trên MT YEA, MEA, Czapek. Chúng tôi quan sát tốc độ phát triển và đặc điểm của khuẩn lạc mô tả ở bảng 3.15. Dựa trên cơ sở mô tả của công ty khử trùng FCC và đặc điểm vi thể nấm sợi của khoá phân loại của các tác giả trên . Chúng tôi định danh chủng Đ41 theo bảng 3.15 Bảng 3.15: Đặc điểm chủng nấm sợi kí hiệu Đ41 Các đặc điểm Chủng Đ41 Chủng Aspergillus Oryzae (Ahlb) cohn var effesuss MEA - Khuẩn lạc phát triển nhanh, sau 1 ngày có d=0.4cm. - MTKL: Mép bằng phẳng, có màu trắng ngà. Xung quanh có tia toả tròn. - MSKL: Không màu - Khuẩn lạc phát triển khá nhanh. - MTKL: Dạng bông, lúc đầu trắng, sau vàng nhạt. - MSKL: Không tiết sắc tố YEA - Khuẩn lạc mọc nhanh, sau 1 ngày có d=0.8cm. - MTKL: Mép bông, chia vòng. Vòng ngoài màu trắng đục,vòng giữa màu xanh vàng, vòng trong trắng. Xung quanh có tia toả tròn. - MSKL: màu hồng nhạt. - Khuẩn lạc phát triển khá nhanh. - MTKL: Dạng bông, lúc đầu trắng, sau vàng nhạt, có tia toả tròn. - MSKL: Tiết sắc tố màu hồng nhạt Đặ c điể m n uô i c ấy tr ên c ác m ôi tr ườ ng d in h dư ỡn g Czapek - Khuẩn lạc phát triển nhanh, sau 1 ngày có d=0.4cm. - MTKL: Mép bắng, bông xốp có màu trắng kem.Sau chuyển sang xanh lục, cuối cùng là màu xanh vàng. Xung quanh có tia toả tròn. - MSKL: Không màu - Khuẩn lạc phát triển nhanh. - MTKL: Lúc đầu trắng, sau xanh lục, cuối cùng xanh vàng - MSKL: Không màu Các đặc điểm Chủng Đ41 Chủng Aspergillus Oryzae (Ahlb) cohn var effesuss Đầu - Mọc từ môi trường. Hình dạng toả tròn từ phía trên,chuỗi phân kỳ giống dạng trụ ngắn. - Kích thước: (30-120) x (50x70)μm. - Mọc từ môi trường. Dạng toả tròn phía trên có chuỗi. - Kích thước: (150- 300) x (30- 80)μm. Cuống - Có màu nâu vàng, nhám. - Kích thước: (250-600) x (2.5- 8)μm - Có màu vàng hoặc nâu vàng - Kích thước: (200- 600) x (1.5- 10)μm. Bọng - Hình chuỳ khi non và hình cầu khi già. - Kích thước: (20-30)μm - Hình chuỳ hay hình cầu - Kích thước: (15- 40)μm Thể bình - Một tầng, hình chai. - Kích thước (7-15) x (2.5- 3)μm - Xếp thành tầng hay cụm. - Kích thước (12-15) x (3- 5)μm Đặ c điể m c ơ q ua n sin h sản v ô tín h BTT - Hình cầu, vách nhẵn. - Kích thước: (4-5)μm. - Xếp thành chuỗi dài hay hình tia toả tròn. - Kích thước: (4.5-7)μm. Qua các đặc điểm trên ta có thể kết luận vị trí phân loại của Đ41: Lớp (Class): Deuteromyces Bộ (Order): Moniliales Họ (Family): Moniliaceae Chi (Genus): Aspergillus Loài: Aspergillus oryzae (Ahlb). Cohn var. effusus Hình 3.9: Khuẩn lạc chủng Aspergillus oryzae (Ahlb).Cohn var. effusus trên MT khác nhau Hình 3.10a: Hình thái khuẩn lạc Hình3.10b: Hình thái BT và giá BTT chủng Đ41 chủng Đ41 3.4.2. Định danh chủng C15.1 Để định danh chủng C15.1, chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy chấm điểm chủng C15.1 trên các MT (YEA, MEA, Czapek) và mô tả đặc điểm sinh trưởng, hình thái khuẩn lạc của chúng. ở bảng 3.16 Bảng 3.16: Đặc điểm chủng nấm sợi ký hiệu C15.1 Các đặc điểm Chủng C15.1 Chủng penicillium citrinum Thom MEA - Khuẩn lạc phát triển chậm, sau 2 ngày có d= 0.4cm - MTKL: Mép viền trắng mịn, kế tiếp xanh nhạt, trong cùng có điểm lồi ở giữa. - MSKL: Không màu - Khuẩn lạc phát triển chậm - MTKL: Có màu xanh lục, mặt nhung, viền trắng, đôi khi ở giữa bông xốp nhẹ - MSKL: Không màu YEA - Khuẩn lạc phát triển chậm, sau 2 ngày có d= 0.8cm - MTKL: Mép viền trắng đục mịn, kế tiếp xanh nhạt, trong cùng xanh đậm, chia thuỳ, lồi ở giữa. - MSKL: Sắc tố màu vàng tươi - Khuẩn lạc phát triển chậm - MTKL: Có màu xanh lục, mặt nhung, viền trắng, có vòng đồng tâm. - MSKL: Màu vàng cam Đặ c điể m n uô i c ấy tr ên c ác m ôi tr ườ ng d in h dư ỡn g Czapek - Khuẩn lạc mọc rất chậm, sau 2 ngày có d=0.2cm. - MTKL: Mép ngoài trắng,→ xanh xám nhạt→tâm xanh xám đậm - MTKL: Màu vàng nâu. Có nhiều giọt tiết vàng nâu to - Khuẩn lạc phát triển rất chậm - MTKL: Viền trắng mịn, giữa xanh, tâm hơi lồi. - MSKL: Có màu vàng đậm. Đôi khi có giọt tiết vào môi trường Các đặc điểm Chủng C15.1 Chủng penicillium citrinum Thom Cuống sinh BT - Chổi 2 tầng không cân đối, hình dạng cột. - Kích thước chổi: (12-20)μm - Mọc từ môi trường, có 1, 2 tầng, dạng trụ - Kích thước: (8- 25)μm Thể bình - Có 4-5 thể bình/1 cuống nhỏ. Dạng hình chai - Kích thước: (7.5-9) x (2-2.5)μm -Có từ 2-5 thể bình/1 nhánh -Kích thước: (5-15) x (2-3)μm. Đặ c điể m c ơ q ua n si nh s ản v ô tín h BTT - Hình cầu, tạo thành chuỗi có gai. - Kích thước: (2.5-3)μm - Hình cầu, gần cầu hay elip. Có gai hoặc nhẵn, xếp thành dạng chuỗi dài. -Kích thước: (2.2-3.2)μm Qua bảng 3.16, có thể kết luận vị trí phân loại của chủng Đ41: Lớp (Class): Deuteromyces Bộ (Order): Moniliales Họ (Family): Moniliaceae Chi (Genus): penicillium Loài: Penicillium citrinum Thom. Hình 3.11: Khuẩn lạc trên môi trường khác nhau của chủng Penicillum citrinum Thom Hình 3.12a: Khuẩn lạc chủng C15.1 Hình 3.12b: Sợi nấm chủng C15.1 Để có cái nhìn cụ thể hơn về chủng nấm sợi tuyển chọn. Chúng tôi tiến hành khảo sát các đặc tính sinh học khác của chủng nấm sợi này. 3.5. Khảo sát các đặc tính sinh học khác 3.5.1. Nghiên cứu khả năng đồng hoá nguồn cacbon khác nhau. RNM là khu vực có nguồn cacbon rất đa dạng, chúng tồn tại trong xác thực vật lẫn động vật. Do vậy, nhằm khảo sát khả năng sử dụng các loại cacbon này của chủng nấm sợi RNM. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chấm điểm các chủng tuyển chọn trên các môi trường nước biển (MT4), có nguồn cacbon khác nhau theo phương pháp 2.2.2.3. Để ở nhiệt độ phòng. Đánh giá mức độ phát triển bằng cách đo đường kính khuẩn lạc. Kết quả thu được ghi ở bảng 3.17 Bảng 3.17: Khả năng đồng hoá nguồn cácbon khác nhau của các chủng nấm sợi tuyển chọn Đường kính khuẩn lạc (cm) STT Ký hiệu chủng Glucoza Lactoza Maltoza Galactoza Sucroza 1 C15.1 18 17 15 6 12 2 Đ41 51 49 43 18 34 Kết quả thí nghiệm ở bảng 3.17 cho thấy: Các chủng nấm sợi sử dụng được hầu hết các nguồn cacbon nhưng ở mức độ khác nhau. Các chủng nấm sợi tuyển chọn sử dụng rất tốt nguồn cacbon trong glucoza, lactoza, maltoza, sucroza còn galactoza thì không thích hợp lắm cho sự phát triển của nhìn chung các chủng. Số liệu bảng 3.17 chứng tỏ nấm sợi ở RNM có các enzym phân giải tốt các polisacarit. Đây là nguồn cacbon tự nhiên rất phổ biến ở khu RNM. Đặc tính sử dụngtốt nguồn cacbon tự nhiên giúp nấm sợi tồn tại và thích nghi trong khu hệ sinh thái RNM. 3.5.2. Khảo sát hoạt tính enzym ngoại bào Nấm sợi và VSV khác tồn tại và phát triển trong RNM có khả năng sử dụng nhiều nguồn dinh dưỡng khác nhau nhờ hệ enzym ngoại bào phong phú: amylaza, proteaza, xenlulaza, kitinaza,…. . Để xác định khả năng sinh các enzym ngoại bào của 2 chủng nấm tuyển chọn. Chúng tôi tiến hành thử hoạt tính enzym phân giải sau: 3.5.2.1. Hoạt tính enzym amilaza Để xác định khả năng sinh enzym ngoại bào amilaza của 2 chủng nấm sợi tuyển chọn. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chấm điểm trong MT4 (glucose thay bằng tinh bột). Sau 3 ngày, xác định khả năng sinh enzym bằng cách đo đường kính vòng phân giải theo phương pháp 2.2.2.4. Kết quả ở bảng 3.18. Bảng 3.18: Hoạt tính enzym amilaza của chủng nấm sợi tuyển chọn. STT Ký hiệu chủng Hoạt tính enzym (D-d) cm 1 C15.1 0.3 2 Đ41 1 Qua bảng 3.18 ta thấy: Khả năng sinh enzym ngoại bào amilaza của chủng nấm sợi tuyển chọn không cao. Tuy nhiên, chúng vẫn sinh trưởng được trên môi trường có nguồn cacbon là tinh bột. Chủng C15.1 khả năng sinh enzym amilaza (0.3cm) yếu hơn so với chủng Đ41 (1cm) .Vậy, chủng Đ41 ngoài hoạt tính phân giải dầu mạnh còn có khả năng sinh enzym amilaza với mức độ trung bình. 3.5.2.2. Hoạt tính enzym xenlulaza RNM là nơi có nguồn cacbon dồi dào từ lá, thân cây mục, đa số các vi sinh vật dinh dưỡng bằng cách phân huỷ chất hữu cơ chủ yếu từ nguồn này. Vì vậy, để xác định chủng nấm sợi phân giải dầu ở RNM có khả năng đồng hoá nguồn cacbon từ xenlulose hay không, chúng tôi cũng tiến hành nuôi cấy các chủng nấm trên trong MT4 ( glucose thay bằng CMC) ở điều kiện nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày, xác định khả năng sinh enzym bằng cách đo vòng phân giải theo phương pháp 2.2.2.4. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.19. Bảng 3.19: Hoạt tính xenlulaza của chủng nấm sợi tuyển chọn Hoạt tính enzym (D- d) cm STT Ký hiệu chủng Môi trường thích ứng xenlulose Môi trường thích ứng dầu DO 1 C15.1 0,3 0,3 2 Đ41 0,6 0,4 Ghi chú: Kết quả hoạt độ enzym với môi trường thích ứng xenlulose từ nguồn luận văn của tác giả Khưu Phương Yến Anh, 2007 Qua kết bảng 3.19 ta thấy: Các chủng nấm sợi tuyển chọn khi được thích ứng trong 2 môi trường khác nhau khả năng sinh enzym xenlulaza cũng khác nhau. Các chủng nấm sợi tuyển chọn khi được thích ứng nguồn cacbon từ dầu DO, sinh enzym xenlulaza có hoạt tính yếu hơn được thích ứng xenlulose. Điều này có thể suy đoán: Chủng nấm sợi khi thử ở thời điểm, điều kiện thích ứng khác nhau, thì kết quả không trùng khớp nhau. So với kết quả thử hoạt tính xenlulaza của tác giả Khưu phương Yến Anh thì yếu hơn. Có thể, sau thời gian giữ giống hoạt tính enzym đã giảm xuống. Hình 3.13: Hoạt tính enzym amilaza và xenlulaza của chủng C15.1 và Đ41 3.5.2.3. Hoạt tính proteaza Ngoài 2 enzym, nấm sợi RNM còn sinh enzym proteaza. Để xác định hoạt tính enzym này chúng tôi tiến hành thí nghiệm nuôi cấy chấm điểm trong môi trường MT4(thay glucose bằng casein). Nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sau 3 ngày, xác định khả năng sinh hoạt tính enzym proteaza bằng cách đo vòng phân giải theo phương pháp 2.2.2.4. Kết quả ghi nhận ở bảng 3.20. Bảng 3.20: Hoạt tính enzym proteaza của chủng nấm sợi tuyển chọn. STT Chủng nấm Hoạt tính enzym (D- d) cm 1 C15.1 0,8 2 Đ41 0,7 Qua bảng 3.20 ta thấy, các chủng nấm sợi tuyển chọn sinh hoạt tính enzym ngoại bào proteaza rất yếu. Dù vậy, chủng vẫn phát triển được trên môi trường này. Hình 3.14 : Hoạt tính enzym proteaza của chủng C15.1 và Đ41 3.5.2.4. Hoạt tính kitinaza RNM là nơi tập trung nhiều nguồn cacbon đa dạng, phong phú. Một lượng cacbon không nhỏ từ xác côn trùng, vỏ các loài giáp xác trôi dạt do thuỷ triều. Vì vậy, một số các VSV sống hoại sinh có khả năng sinh enzym đồng hoá được nguồn cacbon này, trong đó có nấm sợi. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm thử hoạt tính enzym kitinaza của chủng nấm sợi tuyển chọn bằng phương pháp cấy chấm điểm trên MT4 (glucose thay bằng kitin). Sau 3 ngày, xác định bằng cách đo vòng phân giải theo phương pháp 2.2.2.4. Kết quả ghi nhận được ở bảng 3.21. Bảng 3.21: Hoạt tính kitinaza của chủng nấm sợi tuyển chọn STT Chủng nấm Hoạt tính enzym (D- d) cm 1 C15.1 0,6 2 Đ41 0,8 Qua bảng 3.21 ta thấy: Các chủng nấm sợi tuyển chọn cũng có khả năng sinh enzym kitinaza phân hủy kitin. Khả năng sinh enzym kitinaza của các chủng tuyển chọn thấp hơn so với các chủng nấm sợi RNM Nam Định, Thái Bình do tác giả Nguyễn Vĩnh Hà nghiên cứu (2002). Tuy nhiên, các chủng này vẫn sinh trưởng được trên môi trường có nguồn cacbon là kitin. Đ41 Hình 3.15: Hoạt tính kitinaza chủng Đ41 3.4.2.5. Khả năng sinh kháng sinh của chủng nấm tuyển chọn Đối kháng là một trong những đặc tính sinh học của VSV trong đó có nấm sợi của nấm sợi. Ngày nay, các nhà khoa học muốn tìm kháng sinh mới chống nhờn thuốc. Vì vậy, để khảo sát xem 2 chủng nấm sợi phân giải dầu tuyển chọn có tính đối kháng không, chúng tôi tiến hành thí nghiệm với chủng VSV kiểm định là B. subtilis và E. coli theo phương pháp 2.2.2.4. Đánh giá hoạt tính đối kháng bằng cách đo đường kính vòng vô khuẩn. Kết quả thu được như sau: Chủng Đ41 không kháng được B.subtilis, còn chủng C15.1 kháng được B. subtilis. Nhưng cả hai không kháng được E.coli. Song song với công trình nghiên cứu của chúng tôi. Một tác giả cũng khảo sát về đặc tính này của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ. Từ kết quả nghiên cứu của tác giả Phan Thanh Phương cũng có kết quả tương tự: Chủng C15.1 và Đ41 có phổ kháng khuẩn hẹp chỉ ức chế 1 trong 2 loại VKGram dương hoặc Gram âm Để tổng quan hơn về đặc tính sinh học của chủng Đ41 và C15. Chúng tôi thiết lập biểu đồ 3.7 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 amilaza xenlulaza proteaza kitinaza B.subtilis E.coli Các đặc tính sinh học nấm sợi C15.1 Đ41 Biểu đồ 3.7: Khảo sát các đặc tính sinh học nấm sợi Qua kết quả khảo sát biểu đồ 3.7 về các đặc tính sinh enzym ngoại bào và khả năng sinh kháng sinh của chủng nấm sợi phân giải dầu tuyển chọn. Chúng tôi thấy, ngoài khả năng sinh enzym có hoạt tính phân giải dầu chủng nấm sợi tuyển chọn cũng sinh các enzym có khả năng phân giải các nguồn cacbon khác nhau, với hệ enzym phong phú này giúp các chủng nấm sợi dễ tồn tại trong môi trường tự nhiên nhiều biến động như RNM. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ  Kết luận. 1. Đã phân lập các chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. Sau khi thu mẫu, chúng tôi đã phân lập được 312 chủng nấm sợi từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. Trong đó: + Từ đất có 114 chủng (93 chủng bề mặt, 21 chủng sâu 5- 10cm) + Từ lá có 96 chủng (lá vàng 34, lá phân huỷ 62). + Từ thân có 102 chủng (Thân tươi 35, thân khô- mục: 67) 2. Đã tuyển chọn các chủng phân giải dầu DO mạnh + Từ 312 chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, chúng tôi đã chọn lọc được 83/312 chủng (26,6% tổng số chủng nấm sợi) có khả năng phân giải dầu DO in vitro ở mức độ khác nhau. Trong đó, 14 chủng nấm sợi (chiếm 16,86%) có khả năng phân giải mạnh, 12 chủng phân giải mức trung bình (chiếm 14,45%), còn lại là yếu. + Tuyển chọn 4 chủng có tỉ lệ phân giải dầu cao 63-67%. + Đã chọn nguồn hydrocacbon phù hợp trong dầu DO để tiến hành thí nghiệm. + Đã chọn thời gian nuôi cấy thích hợp để xác định lượng dầu bị phân giải là 15ngày. + Đã chọn 2 chủng C15.1 và Đ41 phân giải dầu mạnh nhất để khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến khă năng phân giải của chúng. 3. Đã xác định được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng phân giải dầu của2 chủng nấm sợi .  Ảnh hưởng nguồn N: Nguồn N từ NH4NO3 với nồng độ 0,1% là tốt nhất cho sự phân giải dầu của 2 chủng C15.1 (68.28%) và Đ41 (67,57%).  Ảnh hưởng độ mặn: Nồng độ muối tốt nhất cho phân giải dầu của cả 2 chủng C15.1 và Đ41 là 3%.  Ảnh hưởng pH: Độ pH= 5.5-6 là tối ưu cho nấm sợi phân giải dầu. Trong đó, pH tối ưu của chủng C15.1 pH= 5,5-6,5 và chủng Đ41 pH= 5,6-6.  Ảnh hưởng của nhiệt độ: Nấm sợi phân giải dầu sinh trưởng tốt nhất ở nhiệt độ 30- 35oC. Nhưng chủng C15.1 có phổ hẹp hơn 20- 35oC so với Đ41 từ 20- 40oC. 4 .Xác định lượng dầu phân giải trên môi trường tối ưu Ở môi trường tối ưu về nồng độ N, nguồn N thích hợp là NH4NO3, độ mặn phù hợp và pHopt=6. Chủng nấm C15.1 và Đ41 phân giải lượng dầu DO đạt 82-84,4%. 5. Đã xác định 2 chủng nấm sợi tuyển chọn đến loài Để xác định đến loài, chúng tôi nhờ công ty cổ phần Giám định và khử trùng FCC định danh đến loài, 2 chủng có khả năng phân giải dầu mạnh C15.1 và Đ41 theo phương pháp hình thái. Kết quả: + Chủng 1 ký hiệu C15.1 là Penicillium citrinum Thom. + Chủng 2 ký hiệu Đ41 là Aspergillus oryzae (Ahlb).Cohn var. effusus. 6. Đã xác định một số đặc điểm sinh học của chủng nấm C15.1 và Đ41. - Cả hai chủng đều sử dụng rất tốt nguồn cacbon là: Glucose, lactose, maltoseínucrose và chúng sử dụng yếu galactose. - Cả hai chủng C15.1 và Đ41 đều có khả năng sinh enzym thuỷ phân amilaza nhưng Chủng C15.1 ở mức yếu hơn (0,3cm) Chủng Đ41 (1cm). Đối với enzym proteaza 2 chủng nấm tuyển chọn đều có hoạt tính yếu (0,8cm, 0,7cm). Đồng thời khả năng sinh enzym kitinaza và xenlulaza của 2 chủng này cũng ở mức yếu (kitinaza=0,6-0,8cm, xenlulaza=0,3-0,4cm). Chủng C15.1 có khả năng đối kháng với B.subtilis,còn chủng Đ41 không kháng được VSV này, nhưng cả hai đều không kháng được E.coli  Đề nghị Để có đầy đủ cơ sở cho việc sử dụng 2 chủng nấm sợi tuyển chọn trong thực tiễn, chúng tôi đề nghị: + Chủng C15.1 và Đ41 là hai chủng nấm sợi được xác định có khả năng phân giải cacbuahydro trong dầu DO mạnh. Chúng tôi hy vọng các nghiên cứu sau sẽ tiếp tục nghiên cứu sâu hơn về, khả năng phân giải các nguồn cacbuahydro trong môi trường tự nhiên chứa các sản phẩm khác của dầu mỏ như dầu FO, dầu thô và các nguồn độc tố khác… + Nghiên cứu sâu hơn về ảnh hưởng của nguồn P, O, các nguồn N khác đối với các chủng phân giải dầu tuyển chọn trong đề tài. + Thử khả năng đối kháng của 2 chủng Penicillium citrinum Thom và Aspergillus oryzae (Ahlb).Cohn var. effusus.trên các đối tượng VSV gây bệnh khác. Vấn đề ô nhiễm môi trường do tai nạn tràn dầu, rửa tàu.. là vấn đề thời sự mà nhiều nhà nghiên cứu môi trường đang quan tâm. Việc tìm ra các chủng nấm sợi phân giải dầu góp phần làm phong phú thêm nhóm VSV phân giải dầu trong phương pháp phân huỷ sinh học xử lí môi trường ô nhiễm dầu ngày nay. TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Tô Kim Anh, Trần Thị Linh (2003), Khả năng phân giải hiếu khí phenol của tập hợp VSV làm giàu từ bùn thải nhiễm xăng dầu, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Hà Nội. tr 167- 171. 2. Kiều Hữu Ảnh (1987), Vi sinh Vật công nghiệp, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội 3. Nguyễn Ngọc Ân, Nguyễn Đình Cương, Nguyễn Đình Quý (1998), Hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ và biện pháp quản lí, phát triển, Nxb Nông nghiệp, tp. HCM. 4. Lê Huy Bá (2000), Sinh thái môi trường đất, Nxb Đại học Quốc gia, tp. HCM. 5. Phan Tử Bằng (2002), Công nghệ chế biến dầu và khí, Nxb Xây dựng, Hà Nội. 6. Nguyễn Lân Dũng (1972), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, Nxb Khoa học-Kĩ thuật, Hà Nội. 7. Nguyễn Lân Dũng và cộng sự (1993), Vi sinh vật tập 1, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 8. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, 1998, Vi sinh vật học, Nxb Giáo Dục. Tr 3-40,407 9. Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vật học, Nxb Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội. 10. 10-Nguyễn Lân Dũng, Bùi Xuân Đồng, Lê Đình Lương (1982), Vi nấm, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 11. Nguyễn Thành Đạt (2004) Cơ sở sinh học vi sinh vật, Nxb Đại học Sư phạm, Hà Nội. 12. Bùi Xuân Đồng và Hà Huy Kế (1999), Nấm mốc và phương pháp phòng chống, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 13. Bùi Xuân Đồng (1978), Nấm mốc bạn và thù, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 14. Bùi Xuân Đồng (1986) Nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam tập 1,2, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 15. Bùi Xuân Đồng, Nguyễn Huy Văn (2000), Vi nấm dùng trong công nghệ sinh học, Nxb Khoa học – Kĩ thuật, Hà Nội. 16. Bùi Xuân Đồng (2003), Nguyên lí phòng chống mốc và mycotoxin, Nxb Khoa học- Kĩ thuật, Hà Nội. 17. Đặng Thị Cẩm Hà, Đinh Thuý Hằng, Lưu Bích Thảo(1997), Nghiên cứu nấm sợi sử dụng dầu thô và các sản phẩm của dầu phân lập từ những vùng ô nhiễm dầu Cát Lái và Cần Giờ, Tạp chí Khoa học Công nghệ 18. Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, La Thị Thanh Phương, Hoàng Mĩ Hạnh, Nguyễn Thị Đệ (2003), Nghiên cứu xử lí làm sạch cặn dầu thô bằng phương pháp phân huỷ sinh học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Hà Nội. tr 70-73. 19. Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM khu vực Giao Thuỷ, Nam Định và Thái Thụy, thái Bình, luận vănTthạc sĩ khoa học Sinh học, trường ĐHSP Hà Nội. 20. Vũ Ngọc Hạnh (2004), Nghiên cứu khả năng phân giải dầu diesel (DO) của các chủng vi khuẩn phân lập từ một số mẫu đất thân, lá cây rừng RNM huyện Cần Giờ- TP. HCM, luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Sư phạm Hà Nội. 21. Mai Thị Hằng (2001), Kết quả nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của nhóm nấm sợi phân lập từ một số RNM ở hai tỉnh Nam Định và Thái Bình, tổ CNSH- vi sinh, Đại học Sư phạm Hà Nội. Tr 135- 153. 22. Mai Thị Hằng, Nguyễn văn Diễn (2005), Bước đầu tìm hiểu thành phần loài nấm túi (Ascomycetes) hoại sinh trên các phần chết của cây dừa nước (Nypa fruiticán Wurmb) ở RNM Cần Giờ, Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 27 (2), tr 49-56. 23. Mai Thị Hằng, Phan Thị Trang (1999), Khả năng phân giải hidrocacbon của một số chủng nấm trong RNM, báo cáo khoa học tổ CNSH- Vi sinh, Đại học Sư phạm, Hà Nội. 24. Lại Thuý Hiền, Đặng Thị Cẩm Hà, Lý Kim Bảng (1990), Khu hệ VSV trong các giếng khoan dầu khí Thái Bình, tạp chí sinh học, 12 (3), tr 1-6. 25. Phan Thị Phương Hoa, Mai Thị Hằng, Trần Thị Thuý, Phạm Thị Trang, (2001). Nghiên cứu một số hoạt tính enzym thuỷ phân ngoại bào của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Giao Thuỷ, Nam Định, Việt Nam. Báo cáo tại hội thảo khoa học đề án EP- DRC/MERD TP Nam Định tháng 12- 2001,Tr 82-88. 26. Nguyễn Bá Hữu, Vũ Thị Hồng Nga, Đặng Thị Cẩm Hà (2003), khả năng sử dụng hydrocacbon dầu mỏ của 3 chủng vi khuẩn phân lập từ cặn thải xăng dầu ở Việt Nam, Tạp chí Sinh học, 25(4), 62-68. 27. Nguyễn Đức Lượng (2003), Thí nghiệm vi sinh vật, Nxb Đại học Bách khoa, tp. HCM. 28. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh vật tập 1, Nxb Đại học Quốc gia, tp. HCM. 29. Đặng Vũ Hồng Miên (1998 ) Bảng phân loại một số nấm mốc thường gặp, Nxb Khoa học và Kĩ thuật, Hà nội. 30. Lương Đức Phẩm (2004), công nghệ vi sinh vật, Nxb Nông nghiệp, Hà Nội. tr159- 161 31. Trần Thị Thanh (2000), Công nghệ vi sinh, Nxb Giáo dục, tp.HCM. 32. Nguyễn Xuân Thành và cộng sự (2005), Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, Nxb Giáo dục, tp. HCM. 33. Trần Thanh Thuỷ (1999), Thực hành vi sinh vật, Nxb Giáo dục, tp. HCM. 34. Trần Linh Thước (1999-2000), Thực hành vi sinh vật năm IV, Nxb Đại học Khoa học Tự Nhiên, tp. HCM. 35. Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật học môi trường đất, Nxb Đại học Quốc gia, Hà Nội. Tiếng Anh 36. Atlas M Ronald, 1981, “Microbial degradation of petroleum hydrocacbons: An enviroment perspective”, Microbiology review, tr 108- 209. 37. A.D. Agate C.V. Subramania M. Vannucci (1988). Mangrove microbiology, UNDP/UNESCO Regional Projec RAS/86/1988. 38. Booth C. (1971), “the genus Fusarium” CMI kew, survey, England. 39. Collin Ratledge, 1989, Biochemistry of Microbiology. P1-25 40. Robert A.Samson, Ellen S. Hoekstra, Jens C. Frisvad (2004), Introduction to food and airborne fungi, centraalbureau voor Schimmelcultures, P.O.Box 85167, 3508 AD UTRECHT, the Netherland. 41. Miguel Ulloa and Richard T. Hanlin (2000), Illustrate Dictionary of MYCOLOGY, APS PRESS the American Phytopathological Society St. Paul, Minnesota. 42. NTC publishing Group (2000), enzyme technology, McGraw- Hill companies, USA. Trang web 43. gov.vn/hn/database/an pham dientu. 44. 45. 46. http:// www.hochiminhcity.gov.vn/home/left/tintuc/thoisu/2003. 47. http:// www.vietciences. Free. 48. http:// www.nea.gov.vn/htm/o nhiem/kiem soat html. 49. http:// www.geocities.com/Capnavaral/lab/2094/table.html Bioremediation methods for oil. 50. http:// www.geocities.com/Rainforest/Vines/4301. 51. http:// www.va21. org/uutien/14bien/14_ onhiembien. Htm 52. PHỤ LỤC Phụ lục 1: Khuẩn lạc của một số chủng nấm sợi phân lập từ đất RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh Đ41 Đ7a Đ’8b Đ4a Đ1 Đ5a Đ18 Đ’8 Đ1a Đ30 Đ6 Đ33 1 Phụ lục 2: Khuẩn lạc của một số chủng nấm sợi phân lập từ lá, thân RNM Cần Giờ Phụ lục 3: Mẫu một số chủng phân giải dầu sau 15 ngày nuôi cấy L3.2a Đ5a Đ16b Đ33.1 Đ7a Đ’9b Đ2b L15.5 C’18.1C4.1 Đ’8.1 Đ41 Đ/C Đ4a Đ3O L35 Phụ lục 4: Mẫu một số chủng phân giải dầu sau 15 ngày nuôi cấy L6.3 L24 L19 C18 Đ18a T8 TC2 C15.1 L1.8 L21.1 L3.2b Đ9.4 Phụ lục 5: Các lô thí nghiệm phân giải dầu của 14 chủng nấm sợi tuyển chọn Khối lượng dầu bị phân giải trong lô thí nghiệm (g) STT Tên chủng TN1 TN2 TN3 TN4 Khối lượng dầu bị phân giải (∆m)g Tỷ lệ (%) 1 C15.1 1,2856 1,2738 1,2928 1,2801 1,2831  0,007 67,09 2 Đ41 1,2804 1,2852 1,2863 1,2750 1,2817 0,005 67,02 3 L6.3 1,2635 1,2521 1,2438 1,2594 1,2547  0,007 65,60 4 Đ’9b 1,2235 1,2220 1,2252 1,2197 1,2226  0,002 63,93 5 Đ4a 1,2098 1,2041 1,2146 1,2252 1,2129  0,007 63,42 6 L3.2a 1,1856 1,1960 1,940 1,1847 1,191  0,006 62,27 7 Đ5a 1,1894 1,1783 1,1802 1,1866 1,1838  0,007 61,90 8 L35 1,1802 1,1806 1,1843 1,1859 1,1818  0,003 61,79 9 C’18.1 1,1894 1,1758 1,1856 1,1753 1,1815  0,006 61,78 10 L19 1,1653 1,1468 1,1547 1,1649 1,1579  0,008 60,54 11 C18 1,1596 1,1538 1,1503 1,1517 1,1538  0,004 60,33 12 Đ1a 1,1301 1,1338 1,1220 1,1367 1,1306  0,005 59,11 13 Đ7a 1,1038 1,0912 1,1138 1,0955 1,1011  0,008 57,57 14 Đ30 1,0847 1,0749 1,0893 1,0831 1,0830  0,005 56,63 15 Đ/C 1,9062 1,9181 1,9157 1,9094 1,9124 0,005 0 ._.