Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa đồng tiền ( Gerbera Jamesonii ) trong điều kiện INVITRO

“Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro” 2. Nhiệm vụ (yêu cầu về nội dung và số liệu ban đầu): ™ Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel. ™ Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy phát hoa Đồng tiền. ™ Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy phát hoa Đồng tiền. ™ Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp NAA lên khả năng tái sinh chồi 3. Ngày giao Đồ án tốt nghiệp: 01/04/2009 4. Ngày hồn thành nhiệm vụ: 24/06/2009 5. Họ tên người hướng dẫn Phần hướng dẫn CN. Bùi Văn Thế Vinh Tồn bộ Nội dung và yêu cầu LVTN đã được thơng qua Bộ mơn. Ngày tháng năm 2009 CHỦ NHIỆM BỘ MƠN NGƯỜI HƯỚNG DẪN CHÍNH (Ký và ghi rõ họ tên) (Ký và ghi rõ họ tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO ĐẠI HỌC KTCN TPHCM CỘNG HỒ Xà HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM ĐỘC LẬP - TỰ DO – HẠNH PHÚC ------------------------ KHOA : MƠI TRƯỜNG & CNSH BỘ MƠN : CNSH NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP HỌ VÀ TÊN : ĐẶNG LÂM TRÚC MSSV : 105111070 NGÀNH : CƠNG NGHỆ SINH HỌC LỚP : 05DSH PHẦN DÀNH CHO KHOA, BỘ MƠN Người duyệt (chấm sơ bộ): ……………………… Đơn vị:…………………………………………… Ngày bảo vệ:…………………………………….. Điểm tổng kết:…………………………………… Nơi lưu trữ Đồ án tốt nghiệp: Lời cảm ơn Cuối cùng tơi cũng được đặt chân vào trường Đại học, đĩ khơng chỉ là mong ước của chính bản thân mà cịn là điều kỳ vọng của những người thân của tơi. Và mục tiêu kế tiếp là được như các đàn anh được làm luận văn tốt nghiệp. Ngay lúc này đây, tơi vẫn cịn đang “sợ” vì khơng biết mình cĩ được bảo vệ đề tài hay khơng? Đơn giản, chỉ vì khả năng làm luận văn cịn quá tệ để mà … Câu viết xin được bỏ ngõ, thay vào đĩ tơi sẽ cố gắng – cố gắng hơn nữa. Đề tài của mình sẽ là gì ??? Tơi vẫn chưa biết chính xác trong khi luơn ao ước là được làm luận văn. Nhưng thật may mắn, Đại học năm thứ 3 tơi cũng đã chọn được cho mình hướng đi khi được học mơn Cơng nghệ thực vật. Biết được Thầy, người truyền đạt kiến thức và khơi dậy niềm yêu thích từ lâu trong bản thân mình. Khơng biết nĩi gì hơn, người học trị này xin chân thành cảm ơn thầy –Tiến sĩ Dương Tấn Nhựt, tuy chưa lần nào được gọi trực tiếp là thầy, nhưng tơi vẫn luơn mong mỏi điều đĩ. Vì thầy đã là người khơi dậy niềm đam mê nghiên cứu khoa học từ một người học trị mà lẽ ra chỉ yêu thích Cơng nghệ thơng tin… Chính nhờ thầy mà giờ đây, em đã may mắn được học hỏi từ người học trị ấy. Em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc đến Thầy – Bùi Văn Thế Vinh, người hiện đang dẫn dắt và hướng dẫn tận tình khơng những cho em mà cịn 3 người học trị khác nữa. Để cĩ thể viết ra cuốn luận văn này, em xin cảm ơn Ban lãnh đạo trường Đại học Kỹ Tthuật Cơng Nghệ và thầy cơ phịng thí nghiệm đã tạo mọi điều kiện để em cĩ thể hồn thành đề tài này. Tơi cũng cám ơn các bạn, những người đã gắn bĩ cùng tơi trong những tháng vừa qua tại phịng thí nghiệm, đĩ sẽ luơn là kỷ niệm hạnh phúc trong tơi : Hiền, Xuân, Quyên cám ơn các bạn nhé. Ngồi ra, người đã luơn ủng hộ tơi trong những lúc chán nản sau khi gặp nhiều thất bại khi làm luận văn, đĩ là Phúc, người bạn thân nhất của tơi. Vẫn cịn nhiều lời cảm ơn mà tơi thực sự muốn gủi đến như bạn Trinh, Cẩm, Khánh Linh và thầy Thành nữa, nhờ thầy mà khơng khí ở phịng thí nghiệm thực vật “bùn tẻ” này đã trở nên vui nhộn và ấm áp. Cuối cùng, con xin cảm ơn ba mẹ nhiều lắm, điều mà cĩ lẽ con chưa bao giờ nĩi ra : con yêu ba mẹ và nhĩc con “lớn xác”- nhỏ em cũng như người bạn của tơi. Đồng Nai, tp. Biên Hịa ngày 29 tháng 6 năm 2009 Đặng Lâm Trúc MỤC LỤC Lời cảm ơn Mục lục Danh mục chữ viết tắt .............................................................................................. i Danh mục bảng ........................................................................................................ii Danh mục hình........................................................................................................iii Phần 1: MỞ ĐẦU 1.1. Đặt vấn đề ...................................................................................................1 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu ......................................................................1 1.2.1. Mục đích ........................................................................................................1 1.2.2. .Nội dung ........................................................................................................1 Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống..............................................................2 2.1.1. Khái niệm.......................................................................................................2 2.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuơi cấy mơ ...............................................................2 2.1.3. Các bước nhân giống in vitro..........................................................................2 2.1.4. Quá trình tái sinh cơ quan trong vi nhân giống in vitro ...................................6 2.1.4.1. Sự hình thành chồi bất định ..........................................................................7 2.1.4.2. Sự hình thành rễ bất định..............................................................................9 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro ..............................11 2.1.5.1. Ảnh hưởng của mẫu cấy.............................................................................11 2.1.5.2. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng và phát triển của thực vật ..........14 2.1.6. Các chất khử trùng hĩa học được dùng trong nuơi cấy mơ............................15 2.2. Kỹ thuật nuơi cấy lớp mỏng tế bào ..............................................................17 2.2.1. Giới thiệu .....................................................................................................17 2.2.2. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào ...........................................................17 2.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào...........19 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa Đồng tiền ........................................................21 2.3.1. Các đặc điểm quan trọng của cây hoa Đồng tiền ..........................................22 2.3.1.1. Vị trí phân loại ...........................................................................................22 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái .....................................................................................22 2.3.1.3. Điều kiện trồng trọt ....................................................................................23 2.3.2. Một số phương pháp vi nhân giống đối với cây hoa Đồng tiền .....................25 Phần 3: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 3.1. Vật liệu ......................................................................................................... 30 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu.................................................................................. 30 3.1.2. Mẫu cấy....................................................................................................... 30 3.1.3. Các loại mơi trường..................................................................................... 30 3.1.4. Điều kiện nuơi cấy....................................................................................... 30 3.2. Phương pháp thí nghiệm............................................................................. 31 3.2.1. Khử trùng mẫu ............................................................................................ 31 3.2.2. Bố trí thí nghiệm ......................................................................................... 32 3.2.2.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel ... 3.2.2.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền.......................................................................... 32 3.2.2.3. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền.......................................................................... 33 3.2.2.4. Thí nghiệm 4: : Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng tái sinh chồi............................................................................................................ 34 3.2.3. Phân tích thống kê ....................................................................................... 34 Phần 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Thí nghiệm 1: Khảo sát thời gian khử trùng mẫu cấy bằng dung dịch Javel 4.2. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền .......................................................................38 4.3. Thí nghiệm 3: Mơi trường khảo sát ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền ................................................41 4.4. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hưởng của BA kết hợp với NAA lên khả năng tái sinh chồi............................................................................................................44 Phần 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận.........................................................................................................48 5.2. Đề Nghị..........................................................................................................48 Phần 6 : TÀI LIỆU THAM KHẢO 6.1. Tài liệu tham khảo trong nước.......................................................................a 6.2. Tài liệu tham khảo nước ngồi.......................................................................a e Danh mục chữ viết tắt f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e i f # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Danh mục chữ viết tắt ¾ MS : MS medium (Murashige và Skoog, 1962) ¾ TCL : Thin cell layer ¾ tTCL : Transverse thin cell layer ¾ lTCL : Long thin cell layer ¾ ELS : Embro-like structure ¾ NAA : Naphthalene acetic acid ¾ BA : 6-benzylladenine acid ¾ TDZ : N-phenyl-N’-1,2,3-thidiazol-5-ylurea e Danh mục bảng f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e ii f #Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Danh mục bảng Bảng 3.1. Nồng độ Javel và thời gian khử trùng mẫu cấy Bảng3. 2. Mơi trường khảo sát nồng độ BA ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 3.3. Mơi trường khảo sát nồng độ NAA ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 3.4. Khảo sát nồng độ BA kết hợp với NAA đến sự ti sinh chồi của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.1. Kết quả ảnh hưởng của thời gian và nồng độ Javel lên mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.2. Kết quả ảnh hưởng của BA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. Bảng 4.3. Kết quả ảnh hưởng của NAA lên sự phát sinh hình thái của mẫu cấy tTCL phát hoa Đồng tiền. e Danh mục hình f Danh mục hình Hình 2.1. Mười hai lồi thuộc họ Cúc (Asteraceae), từ các phân họ Asteroideae, Cichoriodeae và Carduoideae. Hình 2.2. Cây hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) Hình 2.3. Một số lồi hoa Đồng tiền trên thế giới. Hình 2.4. Cụm hoa đầu (B - C) và hoa Đồng tiền. Hình 4.1. Ảnh hưởng chất điều hịa tăng trưởng lên sự phát sinh hình thái tTCL phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh e iii f # Đặng Lâm Trúc Khoa MT & CNSH 05DSH e Phần 1 – Mở đầu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Phần 1: MỞ ĐẦU e Phần 1 – Mở đầu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 1 - 1.1. Đặt vấn đề Hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) là cây cảnh thuộc họ cúc (Asteraceae). Cây rất phổ biến được dùng làm cây trang trí trong sân vườn hay dùng làm cây cắt cành. Nên cĩ tầm quan trọng về mặt thương mại, hoa Đồng tiền đứng hàng thứ năm trong số các loại hoa được cắt để bán trên thế giới (chỉ sau hoa hồng, cẩm chướng, cúc đại đĩa và tulip). Ngồi ra cây cịn chứa các dẫn xuất của comarin nguồn gốc tự nhiên – cĩ tính chất chống đơng máu. Nhân giống in vitro là một cơng cụ kỹ thuật quan trọng nhằm tạo một số lượng cây lớn mà vẫn giữ được đặc tính di truyền như cây mẹ. Trên thế giới cũng như Việt Nam đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về cây hoa Đồng tiền trong lĩnh vực nuơi cấy in vitro, và đã thiết kế được nhiều quy trình nhân giống số lượng lớn và đồng nhất từ mẫu ban đầu là chồi đỉnh, cuống lá, mặt lá, rễ, đế hoa, và cánh hoa. Đề tài “Nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vtro” nhằm bổ sung thêm nguồn mẫu ban đầu để xây dựng một quy trình nhân giống mới từ tế bào phát hoa. Trong nghiên cứu này, mẫu cấy sử dụng là các lát mỏng tTCL được cắt từ phát hoa cây Đồng tiền. Các kết quả cho thấy được kỹ thuật nuơi cấy lát mỏng tế bào phát hoa tương lai cĩ thể dùng để nhân giống cây hoa Đồng tiền cùng với các kỹ thuật khác đã nghiên cứu thành cơng 1.2. Mục đích, nội dung nghiên cứu 1.2.1. Mục đích Bước đầu thực hiện nghiên cứu khả năng đáp ứng phát sinh hình thái của lát mỏng tế bào phát hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) trong điều kiện in vitro . 1.2.2. Nội dung Nghiên cứu khử trùng mẫu cấy để xác định nồng độ hĩa chất, thời gian khử trùng tối ưu. Nghiên cứu các nồng độ của chất điều hịa sinh trưởng ảnh hưởng lên mẫu cấy. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH Phần 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 2 - 2.1. Khái quát về kỹ thuật vi nhân giống 2.1.1. Khái niệm Nhân giống in vitro hay nuơi cấy mơ đều là thuật ngữ mơ tả các phương thức nuơi cấy các bộ phận thực vật trong ống nghiệm cĩ chứa mơi trường xác định ở điều kiện vơ trùng. Mơi trường cĩ chứa các chất dinh dưỡng thích hợp như muối khống, vitamin, các hormone tăng trưởng và đường (Dương Cơng Kiên, 2002). 2.1.2. Ứng dụng của kỹ thuật nuơi cấy mơ Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật cĩ ý nghĩa vơ cùng to lớn đối với nghiên cứu lý luận sinh học cơ bản, đồng thời nĩ cĩ giá trị đĩng gĩp trực tiếp cho thực tiễn sản xuất và đời sống. Phương pháp nuơi cấy mơ và tế bào thực vật được ứng dụng trong một số lĩnh vực như: 9 Lai tạo giữa những lồi xa nhau về di truyền bằng phương pháp dung hợp (nuơi cấy tế bào trần). 9 Nuơi cấy tế bào thực vật trong mơi trường lỏng (nuơi cầy huyền phù tế bào) trên quy mơ lớn để sản xuất các hợp chất thứ cấp như alkaloid, glycoside, các steroid (dùng trong y học), chất dính dùng trong cơng nghiệp thực phẩm, những chất kìm hãm sự sinh trưởng của vi khuẩn dùng trong nơng nghiệp. 9 Chọn lọc tế bào cĩ những đặc tính mong muốn, cho phát triển thành cây con thay vì chọn lọc cây ngồi đồng ruộng (nuơi cấy tế bào đơn). 9 Sản xuất dịng cây đồng hợp tử (nuơi cấy bao phấn và túi phấn). 9 Vi nhân giống những giống cây cĩ giá trị khoa học và thương mại. 9 Bảo quản phơi và cơ quan trong điều kiện nhiệt độ thấp. 9 Nuơi cấy phơi sinh dưỡng, phơi hợp tử. 9 Nuơi cấy quang tự dưỡng. 2.1.3. Các bước nhân giống in vitro Quá trình nhân giống in vitro được chia thành các giai đoạn sau: ¾ Chọn lựa và khử trùng mẫu cấy Khi chọn cây mẹ phải chú ý xác định đúng cây cần nhân giống. Cây mẹ phải sạch bệnh và tốt nhất là chọn cây trồng trong nhà kính hoặc trong phịng tăng trưởng. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 3 - Kết quả nhân giống tốt nhất cĩ thể đạt được khi mẫu cấy được lấy vào thời điểm tăng trưởng mạnh nhất của cây mẹ. Mục tiêu của việc khử trùng mẫu cấy là thu được một lượng lớn các mẫu cấy vơ trùng và vẫn cịn khả năng tăng trưởng. Khử trùng bề mặt mẫu cấy bao gồm rửa mẫu và khử trùng mẫu cấy. Mẫu thu được phải rửa dưới vịi nước chảy từ 30 phút – 2 giờ, sau đĩ rửa mẫu bằng xà phịng sẽ làm giảm đáng kể nguồn lây nhiễm trên mẫu cấy. Mẫu sau khi rửa sạch sẽ được ngâm chìm trong dung dịch khử trùng để khử các nguồn lây nhiễm trên bề mặt mẫu cấy. Dung dịch thường được sử dụng để khử trùng mẫu là hypochlorite sodium 0,5 – 5,25%, cồn, hypochlorite calcium, oxy già, nitrate bạc, dung dịch bromine, chlorur thủy ngân. Khi thêm Tween 20 (polyoxyethylene sorbitan monolaurate) vào dung dịch khử trùng thì sẽ làm tăng hiệu quả khử trùng vì làm giảm sức căng bề mặt giữa nước và mơ thực vật như vậy bề mặt mẫu tiếp xúc với chất khử trùng tốt hơn. Sau khi khử trùng mẫu cấy phải được rửa lại vài lần bằng nước cất vơ trùng trong tủ cấy để rửa sạch các chất khử trùng cịn bám trên bề mặt mẫu, những phần bị tổn thương phải được cắt bỏ, đồng thời mẫu cấy phải được cắt theo kích thước thích hợp. Mẫu thực vật thường bị nhiễm bên trong và cĩ thể được khử trùng bằng cách bổ sung benomyl hoặc benlate 10mg/l trong mơi trường nuơi cấy hoặc xử lý mẫu bằng các chất này trước khi khử trùng. Mẫu cấy của vài lồi thực vật cĩ thể hĩa nâu hoặc đen sau vài ngày kể từ khi bắt đầu nuơi cấy. Khi bị hĩa nâu thì sự tăng sinh của mẫu sẽ bị ức chế và lâu ngày mẫu sẽ chết. Hiện tượng hĩa nâu này xảy ra khi trong mẫu cấy cĩ chứa một lượng lớn tannin hoặc các hợp chất hydroxyphenol. Các mơ non thường ít bị hĩa nâu hơn mơ trưởng thành hay mơ già. Hiện tượng hoại tử hoặc hĩa nâu là do hoạt động của enzyme oxidase cĩ nhân Cu (ví dụ như polyphenoloxidase và tryosinase), nĩ được tổng hợp và phĩng thích tùy thuộc vào vết thương trong suốt quá trình cắt và khử trùng mẫu. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 4 - Phương pháp thường được sử dụng nhiều nhất để ngăn cản hiện tượng hĩa nâu là dùng than hoạt tính để hấp thụ bớt các hợp chất phenol được tiết ra. Lượng thường dùng 0,5 – 5 g/l. Ngồi ra cịn cĩ một số chất khác như: polyvinyl pyrolidone (PVP), acid ascorbic, acid citric, L–cystein, hydrochlorite, 1,4 – ditheithreitol, glutathione và mercaptoethanol. Khi nghiên cứu enzyme phenolase người ta thấy rằng enzyme này hoạt động mạnh ở pH 6,5 và hoạt động yếu ở pH thấp. Vì vậy, nếu giảm pH thì sẽ giảm được hiện tượng hĩa nâu. Tĩm lại, từ kinh nghiệm thực tiễn người ta rút ra rằng để làm giảm hiện tượng hĩa nâu của mẫu cấy nên: Sử dụng mẫu cấy nhỏ ở mơ non. Gây vết thương trên mẫu với kích thước nhỏ nhất. Ngâm mẫu vào dung dịch acid ascorbic trong vài giờ trước khi cấy vào mơi trường. Nuơi cấy mẫu trong mơi trường lỏng cĩ lượng O2 thấp, khơng cĩ ánh sáng trong 1 – 2 tuần đầu. Chuyển mẫu từ mơi trường cĩ chất kích thích sinh trưởng nồng độ thấp sang mơi trường cĩ chất kích thích sinh trưởng nồng độ cao. Chuyển mẫu liên tục trong khoảng thời gian 2 – 4 tuần kể từ khi bắt đầu nuơi cấy thì một lượng lớn các hợp chất phenol sẽ khơng tích tụ. Tạo thể nhân giống in vitro Mẫu nuơi cấy được cấy trên mơi trường chọn lọc đặc biệt nhằm mục đích tạo thể nhân giống in vitro. Cĩ hai thể nhân giống in vitro: thể chồi, thể cắt đốt. Tạo thể nhân giống in vitro dựa vào đặc điểm nhân giống ngồi tự nhiên của cây trồng. Tuy nhiên, cĩ những lồi cây trồng khơng cĩ khả năng nhân giống, người ta thường nhân giống bằng cách tạo cụm chồi từ mơ sẹo. Để nhân giống, trong mơi trường nuơi cấy thường bổ sung cytokinin, GA3 và các chất hữu cơ khác. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 5 - ¾ Nhân giống in vitro Đây là giai đoạn quan trọng trong việc nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuơi cấy mơ tế bào thực vật nhằm mục đích tăng sinh khối thể nhân giống. Vật liệu nuơi cấy là những thể chồi, mơi trường nuơi cấy thơng thường giống với mơi trường tạo thể chồi, đơi khi nồng độ chất sinh trưởng giảm thấp cho phù hợp với quá trình nhân giống kéo dài. Điều kiện nuơi cấy thích hợp giúp cho quá trình tăng sinh được nhanh. Cây nhân giống in vitro cĩ trạng thái sinh lý trẻ và được duy trì trong thời gian vơ hạn. ¾ Tái sinh cây hồn chỉnh in vitro Đây là giai đoạn tạo cây con hồn chỉnh cĩ đầy đủ thân, lá và rễ chuẩn bị chuyển ra vườn ươm cây. Cây con phải khỏe mạnh nhằm nâng cao sức sống khi ra mơi trường bình thường. Các chất cĩ tác dụng tạo chồi được loại bỏ, thay vào đĩ là các chất kích thích quá trình tạo rễ. Điều kiện nuơi cấy tương tự với điều kiện tự nhiên bên ngồi, một bước thuần hĩa trước khi được tách ra khỏi điều kiện in vitro. Sự ra rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố: hàm lượng auxin nội sinh, tỷ lệ C/N, ánh sáng, sự trẻ hịa của mẫu, kiểu di truyền. Người ta thường bổ sung auxin để kích thích quá trình ra rễ in vitro. ¾ Chuyển cây con in vitro ra vườn ươm Đây là giai đoạn khĩ khăn nhất trong quá trình nhân giống vơ tính. Cây in vitro được nuơi cấy trong điều kiện ổn định về dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ, độ ẩm… Nên khi chuyển ra đất, với điều kiện tự nhiên hồn tồn khác hẳn như dinh dưỡng thấp, ánh sáng cĩ cường độ mạnh, nhiệt độ cao, ẩm độ thấp, cây con dễ dàng bị stress, dễ mất nước và mau héo. Để tránh tình trạng này, vườn ươm cây cấy mơ phải mát, cường độ chiếu sáng thấp, nhiệt độ khơng khí mát, ẩm độ cao…cây con thường được cấy trong luống ươm cây cĩ cơ chất dễ thốt nước, tơi xốp, giữ được ẩm, trong những ngày đầu cần phải được phủ nylon để giảm quá trình thốt nước ở lá (thường 7-10 ngày kể từ ngày cấy). Rễ được tạo ra trong quá trình cấy mơ sẽ dần dần bị lụi đi và rễ mới xuất hiện, cây con thường được xử lý với chất kích thích ra rễ bằng cách ngâm hay phun lên để rút ngắn thời gian ra rễ. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 6 - 2.1.4. Quá trình tái sinh cơ quan trong vi nhân giống in vitro Sự tái sinh cơ quan trong nuơi cấy mơ khơng xảy ra ngay khi vừa cơ lập mẫu cấy mà phải trải qua một quá trình rất phức tạp vì: ¾ Quá trình tái sinh chỉ xảy ra khi mối tương quan cũ được phá vỡ và những mối tương quan mới được hình thành. ¾ Quá trình này bao gồm nhiều giai đoạn khác nhau: 9 Loại bỏ sự phản biệt hĩa của các tế bào phản biệt hĩa (dẫn đến sự trẻ hĩa tế bào). 9 Sự phân chia tế bào (đơi khi dẫn đến sự hình thành mơ sẹo): sự hình thành cơ quan bắt đầu xảy ra khi sự phân chia tế bào diễn ra. 9 Sự hình thành cơ quan 9 Sự phát triển cơ quan 9 Sự tái sinh bị giới hạn về số lượng và chất lượng do nhiều nhân tố: 9 Các yếu tố nội sinh trong mẫu cấy 9 Điều kiện tăng trưởng của cây mẹ trong nhà kính hoặc ngồi thiên nhiên 9 Vị trí của mẫu cấy trên cây 9 Thời gian thu mẫu trong năm 9 Hàm lượng chất điều hịa sinh trưởng thực vật nội sinh 9 Kích thước của mẫu cấy, phương pháp cấy, nuơi, thành phần dưỡng chất trong mơi trường nuơi cấy, các chất điều hịa sinh trưởng, các yếu tố vật lý trong quá trình nuơi cấy như nhiệt độ, ánh sáng…, sự bổ sung một số cơ chất khác vào trong mơi trường… Những nguyên nhân trên cho thấy quá trình tái sinh cơ quan trong nuơi cấy mơ rất phức tạp, chúng ta khơng thể đề cập hết những khía cạnh liên quan nhưng cần lưu ý đến một số vấn đề sau: 9 Quá trình tái sinh phức tạp do chịu sự tương tác của nhiều nhân tố khác nhau (mơi trường dinh dưỡng, ánh sáng, nhiệt độ và các chất điều hịa sinh trưởng,…). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 7 - 9 Khơng thể khái quát chung quá trình tái sinh cho tất cả các lồi vì mỗi lồi khác nhau cần điều kiện tái sinh khác nhau. 9 Khĩ cĩ thể điều hịa quá trình tái sinh vì khả năng tái sinh của mỗi lồi khác nhau: trong những trường hợp này các nhân tố nội sinh đĩng vai trị quyết định do đĩ các yếu tố ngoại sinh như chất điều hịa ảnh hưởng khơng nhiều. 9 Sự hình thành rễ bất định thường đối lập với sự hình thành chồi bất định. Nếu cả hai quá trình này được thúc đẩy đồng thời, cây con tạo ra sẽ mang nhiều thiếu sĩt. Để thu nhận một cây hồn chỉnh tốt nhất chúng ta nên tạo chồi bất định trước sau đĩ cảm ứng tạo rễ. 2.1.4.1. Sự hình thành chồi bất định Người ta sử dụng phương pháp tạo chồi bất định như một phương pháp nhân giống vơ tính nhằm làm tăng số lượng cây mong muốn. Các loại cây thường được áp dụng phương pháp này để nhân giống ví dụ như: Saintpaulia, Begonia, Achimenes, Streptocarpus, Lily, lan dạ hương, Nerin… Cĩ nhiều điểm giống nhau giữa tạo chồi bất định và tạo rễ bất định: 9 Sự hình thành chồi bất định ở cây hạt trần chỉ thành cơng khi sử dụng các bộ phận của cây con (Anonymous, 1984). 9 Đường luơn luơn đĩng vai trị quan trọng trong sự tạo cơ quan (chồi và rễ). 9 Sự hình thành chồi và rễ đều bị ức chế bởi gibberellin và acid abscisic. 9 Các yếu tố ảnh hưởng đến sự tạo chồi bất định ¾ Ánh sáng Ánh sáng kích thích sự tạo chồi nhưng cũng cĩ một số trường hợp ngoại lệ là cĩ một số cây trồng lại cĩ thể tạo chồi dễ dàng hơn khi ở trong tối: chồi hoa của Freesia (Pierik và Steegmans, 1975), cuống hoa Eucharis grandiflora và Nerine bowdenii (Pierik, 1985; Pierik và Steegmans, 1986). Economou và Read (1986) cho biết rằng các mẫu cấy lá của Petunia hyrbida tăng trưởng trên mơi trường khơng cĩ cytokinin và được xử lý với ánh sáng đỏ thì tạo ra nhiều chồi cĩ trọng lượng tươi lớn hơn là được nuơi cấy dưới ánh sáng đỏ xa. Tuy nhiên, trên mơi trường cĩ BA thì khi xử lý với ánh sáng đỏ và ánh sáng đỏ xa thì sẽ tạo ra số lượng chồi và trọng e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 8 - lượng tươi của chúng tương tự nhau và nhiều hơn trên mơi trường khơng cĩ cytokinin. ¾ Nhiệt độ Nhiệt độ cao cần thiết cho sự tạo chồ nhưng cũng cĩ một số trường hợp ngoại lệ như Begonia (Heide, 1965) và Streptocarpus ( Appelgren và Heide, 1972). ¾ Chất điều hịa sinh trưởng thực vật Nhu cầu về auxin và cytokinin trong sự tạo chồi bất định cĩ phần phức tạp: Cĩ những lồi thực vật về mặt cơ bản khơng cần cả auxin lẫn cytokinin để tạo chồi bất định như: rau diếp xoăn (Pierik, 1966), Streptocarpus (Appelgren và Heide, 1972; Rossini và Nitsch, 1966). Hầu hết các lồi thực vật đều cần đến cytokinin để cảm ứng sự tạo chồi, trong khi auxin lại cĩ vai trị ngược lại (Miller và Skoog, 1953; Paulet, 1965; Nitsch, 1968). Cĩ một số thực vật cần đến auxin ngoại sinh để tạo chồi, đĩ là trường hợp Lili (van Aartrijk, 1984), lan dạ hương (Pierik và Steegmans, 1975). Một nồng độ cytokinin cao phối hợp với auxin nồng độ thấp rất quan trọng trong việc tạo chồi ở nhiều lồi thực vật khác nhau như Begonia (Ringe và Nitsch, 1968; Heide, 1965) và cây bơng cải (Margara, 1969). Chúng ta cĩ thể kết luận rằng ở những lồi cần cytokinin và auxin cho sự tái sinh chồi, nồng độ cytokinin bao giờ cũng cao hơn nồng độ auxin. Tỉ lệ của hai chất điều hịa sinh trưởng này sẽ quyết định sự hình thành cơ quan (Skoog và Tsui, 1948; Miller và Skoog, 1953). Cytokinin BA rất hiệu quả trong việc thúc đẩy tạo chồi ở nhiều lồi thực vật nhưng nếu sử dụng BA ở nồng độ cao sẽ xuất hiện nhiều biến dị (chồi biến dạng). Trong một số trường hợp, sự kết hợp giữa cytokinin và adenine (sulphate) sẽ tăng hiệu quả tạo chồi (Skoog và Miller, 1957; Nitsh và cộng sự, 1969). Một số trường hợp, việc sử dụng một mình adenine cũng cĩ thể cảm ứng tạo chồi: Begonia (Ringle và Nitsch, 1968), cây thuốc lá (Skoog và Tsui, 1948). Sự gia tăng nồng độ gibberellin ức chế quá trình tạo chồi: ở lồi Begonia rex (Schrandolf và Reinert, 1959), Plumbago indica (Nitsch, 1968)… Acid abscisic ức e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 9 - chế sự hình thành chồi bất định mặc dù vẫn cĩ trường hợp cảm ứng sự hình thành chồi như ở cây Ipomoea batatas. 2.1.4.2. Sự hình thành rễ bất định Rễ bất định được hình thành trên các cơ quan khác nhau của cây, nơi mơ của chúng cịn giữ khả năng phân sinh. Quá trình hình thành rễ rất quan trọng vì nĩ ảnh hưởng đến khả năng sống sĩt của mẫu cấy khi cây in vitro được chuyển ra vườn ươm. Cĩ nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự hình thành rễ bất định: đặc điểm di truyền của lồi, tuổi của mẫu, vị trí của mẫu cấy trên thân, kích thước mẫu cấy, vết thương, số lần cấy chuyển, nguồn oxy, ánh sáng, nhiệt độ, chất điều hịa sinh trưởng, than hoạt tính, đường, agar, pH. 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát sinh hình thái in vitro 2.1.5.1. Anh hưởng của mẫu cấy Vật liệu nuơi cấy là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển in vitro: ¾ Kiểu di truyền Khả năng tái sinh của thực vật rất đa dạng. Những cây hai lá mầm thơng thường cĩ khả năng tái sinh mạnh hơn cây một số lá mầm và cây hạt trần rất khĩ tái sinh (trừ khi chúng cịn non). Trong số các cây hai lá mầm, Solanaceae, Begoniaceae, Crassulaceae, Gesneriaceae, Cruciferae là những họ thực vật dễ tái sinh nhất. Nếu một lồi dễ tái sinh cơ quan trong tự nhiên (các giống lai Saintpaulia ionantha, Begonia rex, Streptocarpus) thì chúng hầu như dễ tái sinh in vitro. Cũng cĩ những trường hợp ngoại lệ như những đoạn cắt từ lá của Kalanchoe farinacea hầu như khơng cĩ khả năng hình thành chồi bất định in vivo nhưng cĩ thể thực hiện trong điều kiện in vitro, điều này cĩ thể do sự hấp thu các chất điều hịa sinh trưởng cĩ trong mơi trường nuơi cấy. ¾ Tuổi của cây Các mơ phơi thường cĩ khả năng tái sinh cao do đĩ ở ngũ cốc người ta thường dùng phơi và hạt làm vật liệu nuơi cấy mơ. Khi cây già đi, khả năng tái sinh của e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 10 - chúng cũng giảm theo và các bộ phận của cây non dễ tái sinh hơn như trong trường hợp cây bụi. Khi mơ phân sinh và chồi đỉnh được tách khỏi cây mẹ thì chúng vẫn giữ những đặc tính già hay non trong điều kiện in vitro tùy vào điều kiện ban đầu. Đơi khi._. qua nhiều lần cấy chuyển, mơ phân sinh già từng bước được trẻ hĩa do tăng khả năng tái sinh và phân chia tế bào. Điều này được chứng minh trên những đối tượng như Pinus vinifera, Malus sylvestris, Cryptomeria japonica. ¾ Tuổi của mơ và cơ quan Những mơ cịn non và mềm thường dễ nuơi cấy hơn những mơ cứng nhưng cũng cĩ nhiều trường hợp ngoại lệ. Các mẫu cấy từ cuống lá cịn non tái sinh tốt hơn những mẫu cấy từ cuống lá già do cơ quan của chúng già hơn nên khả năng tái sinh và phân chia tế bào giảm. Khả năng tái sinh của những lồi khác nhau tăng lên trong suốt giai đoạn ra hoa: các bộ phận của phát hoa cịn non đơi khi tái sinh rất mạnh, ví dụ như Freesia (Bajaj và Pierik, 1974), Lunaria annua (Pierik và cộng sự, 1974), Primula obconica ( Coumans và cộng sự, 1979). ¾ Tình trạng sinh lý Tình trạng sinh lý ảnh hưởng mạnh đến khả năng tái sinh và phân chia tế bào in vitro. Thơng thường các bộ phận của cây trong giai đoạn sinh dưỡng dễ tái sinh hơn trong giai đoạn sinh sản. Các mẫu cấy từ vảy của cây huệ tây ở giai đoạn sinh dưỡng tái sinh tốt hơn những mẫu cấy ở giai đoạn sinh sản (Robb, 1957). Các chồi của cây trong giai đoạn ngủ đơng (cuối thu đầu đơng) khĩ nuơi cấy in vitro hơn chồi của những cây đã vượt qua được giai đoạn này (vào mùa xuân trước khi chúng bắt đầu phát triển). ¾ Vị trí của mẫu cấy trên cây Ever (1984) đã khảo sát sự ảnh hưởng của vị trí mẫu cấy lên sự sinh trưởng và phát triền in vitro sau khi tách mẫu ở cây Pseudotsuga menziesii, ơng nhận thấy những chồi ban đầu được tách từ những vị trí thấp trên cây phát triển trong mơi trường in vitro tốt hơn, và chồi gốc tăng trưởng nhanh hơn chồi nách. Sự hình thành các giả hành bất định của mẫu cấy lan dạ hương được tách ra từ phần gốc của vảy hành tốt hơn từ phần đỉnh. Điều này cũng xảy ra tương tự đối với Lily (Robb, 1957). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 11 - Điều đáng lưu ý là những mơ sẹo phát sinh từ những mẫu cấy cĩ nguồn gốc từ các phần khác nhau của cây như rễ, chồi, cuống lá đều cĩ phản ứng in vitro giống nhau. ¾ Kích thước mẫu cấy Các cấu trúc nhỏ như tế bào, cụm tế bào và mơ phân sinh khĩ cảm ứng để tăng trưởng hơn những cấu trúc lớn như thân, lá, củ. Các phần được tách rời khỏi cây tự nĩ cung cấp chất dinh dưỡng và hormone, do đĩ mẫu cấy cĩ kích thước càng lớn càng dễ tái sinh và phát triển. Các bộ phận của cây cĩ chứa nhiều chất dinh dưỡng dự trữ như củ, thân hành thường dễ tái sinh trên mơi trường in vitro hơn những cơ quan ít chất dự trữ. Đối với những mẫu bị cắt, phần trăm bề mặt bị tổn thương cũng ảnh hưởng đến khả năng tái sinh. Ảnh hưởng của vết thương lên sự tái sinh của các mẫu cấy từ vảy hành Lily đã được Aartrijk (1984) chứng minh. ¾ Vết thương Sự tổn thương trên bề mặt mẫu cấy đĩng vai trị quan trọng trong sự tái sinh mẫu cấy. Bề mặt tổn thương tăng lên làm gia tăng sự hấp thu chất dinh dưỡng và các chất điều hịa đồng thời ethylene được tạo ra nhiều hơn. Ngồi ra, cĩ thể tăng cường sự hình thành rễ bất định bằng vết thương. ¾ Phương pháp cấy Các mẫu cấy cĩ thể được đặt trên mơi trường theo nhiều cách khác nhau: cĩ cực (thẳng đứng với phần gốc cắm xuống mơi trường) hoặc khơng cực (cắm phần ngọn xuống mơi trường). Chồi và rễ thường tái sinh dễ và nhanh khi mẫu được cấy khơng cực (Pierik và Steegmans, 1975). Mẫu tái sinh tốt khi được cung cấp đầy đủ oxy nhưng những nhân tố khác cũng đĩng vai trị quan trọng. Phần gốc của mẫu cấy khơng cực cĩ các chất dự trữ khơng cĩ khả năng khuếch tán vào trong agar do nĩ khơng tiếp xúc với mơi trường. Như ở trường hợp tất cả các cây thuộc họ Amaryllidaceae (Pierik và cộng sự, 1974), sự tái sinh chỉ xảy ra ở phần gốc của vảy hành, do đĩ phương pháp cấy khơng cực dẫn đến sự hình thành thân hành bất định tốt hơn phương pháp cấy cĩ cực. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 12 - 2.1.5.2. Ảnh hưởng của chất điều hịa sinh trưởng và phát triển của thực vật Chất điều hịa sinh trưởng hoạt động với liều lượng rất thấp,ở liều lượng cao chúng trở nên độc, điều này cho phép một vài chất kích thích tố được sử dụng như các chất diệt cỏ dại. Các chất điều hịa nội sinh cĩ thể được kiểm sốt do cơ chế chuyển hĩa của tế bào nên chúng được kiểm sốt hoặc đào thải khá nhanh. Trái lại các chất điều hịa tổng hợp tồn tại lâu hơn nhiều nên thường được sử dụng cho các ứng dụng trong thực tế. Cĩ 5 nhĩm chất điều hịa quan trọng trong nuơi cấy mơ thực vật: auxin, cytokinin, gibberellin, abscisic acid và etylen. ¾ Auxin Auxin là hợp chất cĩ nhân indole, cĩ cơng thức nguyên là C10H9O2N. Auxin gồm cĩ hai loại là auxin cĩ nguồn gốc nội sinh do thực vật tạo ra (IAA), và auxin tổng hợp do con người tạo ra (IBA, NAA, 2,4-D,...). Auxin can thiệp vào nhiều hiện tượng sinh lý, hoạt động của nĩ tùy thuộc vào nồng độ và tác động bổ trợ của chúng với các chất điều hịa tăng trưởng khác. Auxin tác động lên sự kéo dài tế bào. Hiệu quả này là sự nối tiếp cho sự gia tăng tính đàn hồi của thành tế bào và cho sự xâm nhập của nước vào bên trong tế bào, sức căng của thành tế bào giảm đi và tế bào tự kéo dài ra. Auxin thay đổi tính thẩm thầu của màng tế bào, sự thay đổi này thể hiện bằng một sự phĩng thích ion H+. Ion này gây ra một hoạt tính acid chịu trách nhiệm làm giảm tính đề kháng của thành tế bào bởi sự hấp thu ion K+. Auxin tác động lên các quá trình chuyển hĩa, đặc biệt nhất là trên sự tổng hợp ARN ribosome. Auxin kích thích sự phân chia tế bào một cách đặc biệt trong quá trình hình thành mơ sẹo và sự hình thành rễ bất định. Auxin cũng ức chế sự phát triển của chồi nách và sự hình thành phơi sinh dưỡng trong mơi trường nuơi cấy mơ sẹo. Tất cả cây trồng đều tổng hợp auxin tùy theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxin được tổng hợp ở lá non, trong các chồi đang hoạt động, ở phát hoa, ở các quả cịn non và lưu thơng từ đỉnh xuống phía dưới với một sự phân cực rõ ràng được nhìn e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 13 - thấy rõ trên các cơ quan thực vật cịn non. Nhưng trong quá trình vận chuyển này, chúng bị oxy hĩa do hoạt động của các enzyme auxin – oxidase, điều này cho thấy nồng độ auxin luơn cao hơn ở những vùng tổng hợp ra chúng. Đối với một số lồi, auxin cần cho sự hình thành rễ của các cành giâm (Võ Thị Bạch Mai, 2004). ¾ Cytokinin Cytokinin (gồm kinetin, BA, zeatin và 2-iP) được phát hiện sau auxin và gibberellin. Người ta biết rằng trong mơi trường nuơi cấy, việc bổ sung cytokinin sẽ tạo điều kiện thuận lợi cho sự phân chia tế bào và hình thành chồi. Cytokinin là các hợp chất adenin được thay thế, cĩ 2 nhĩm cytokinin nội sinh được biết đến là zeatin và IPA, ngồi ra cịn cĩ 2 nhĩm cytokinin tổng hợp được sử dụng nhiều nhất trong nuơi cấy mơ thực vật là Kinetin và BAP. Cytokinin tác động hiệu quả lên sự phân chia tế bào khi cĩ sự hiện diện của auxin: auxin tạo điều kiện thuận lợi cho sự nhân đơi DNA và cytokinin cho phép tách rời nhiễm sắc thể. Cytokinin cĩ vai trị trong sự tạo cơ quan thực vật, chúng kích thích mạnh mẽ sự thành lập chồi non, trái lại chúng là chất đối kháng với sự tạo rễ. Cytokinin kích thích quá trình chuyển hĩa, bảo vệ các chất chuyển hĩa chống lại tác động của enzyme phân giải, làm chậm quá trình lão hĩa. Các chồi nách được xử lý bằng cytokinin sẽ tăng trưởng và cạnh tranh với chồi ngọn. Tĩm lại, cytokinin giúp duy trì sự sống của mơ, kích thích sự phân chia tế bào và định hướng tế bào trong con đường phân hĩa, tạo điều kiện thuận lợi cho nuơi cấy in vitro. ¾ Gibberellin Gibberellin cũng như chất auxin, đã nổi bật rất lâu trước khi được nhận dạng. Chất gibberellin đầu tiên được nhận dạng GA3. Đây là các chất cĩ cấu trúc nội sinh. Tất cả các gibberellin thể hiện một nhân giống nhau, chúng cĩ sự khác nhau bởi chất lượng và vị trí của các chất thế trên nhân. Tính chất chính của gibberellin là sự kéo dài của các đốt cây. Tác động này cũng cĩ thể áp dụng trên các cuống hoa và điều này cho phép cĩ một sự chín tốt hơn e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 14 - hoặc những phát hoa phát triển hơn (trên các lồi nho cĩ chùm nhiều trái, chất gibberellin cho phép làm các chùm nho thưa trái, thống hơn). Trong nuơi cấy in vitro, gibberellin cĩ tác dụng đối với nhiều đỉnh sinh trưởng, nếu thiếu gibberellin đỉnh sinh trưởng thể hiện một dạng hình cầu, tạo nên các mắt cây. Các gibberellin cũng cĩ tác động trên sự đậu trái của các trái khơng hạt, chẳng hạn trái lê, quýt, mận và một vài loại cây khác. Một hoạt động cũng phức tạp trong hiện tượng làm thức giấc các chồi, mầm ngủ trên các hạt giống. Hiệu quả này sẽ làm thuận lợi cho sự nảy mầm hoặc là để thay thế sự lạnh và để thu được một sự tăng trưởng tốt. ¾ Etylen Gia tăng quá trình rụng lá và trái được sử dụng cho phép thu hoạch cơ giới trái (thí dụ trái olive, cerise…). Tính cảm ứng hoa trên cây trồng thuộc họ dứa. Tác động làm thuận lợi cho sự tạo củ. Tất cả các bộ phận của cây đều cĩ khả năng tổng hợp etylen, nơi sản xuất quan trọng nhất là trái cây, kế đến ở mức độ kém hơn là hoa, cũng nhu chúng cĩ ở các cơ quan thực vật bị chấn thương. ¾ Abscisic acid Acid abscisic (ABA), một loại hormone thực vật gây nên sự rụng lá và quả cũng như sự miên trạng thường được sử dụng trong nuơi cấy phơi. Hoạt động trên sự thẩm thấu của tế bào đối với ion potassium (K+), do tác động này nĩ đã ảnh hưởng trên sự đĩng các lỗ hổng của tế bào. Khi áp dụng trên các cây ngắn ngày được nuơi cấy bằng chu kỳ sáng thích hợp, nĩ cĩ thể hồn tồn (như cây volubilis) hoặc từng phần bị ức chế (như cây chenopodium rubrum) thậm chí kích thích sự ra hoa (như cây plumbago). Áp dụng trên các cây dài ngày, nĩ cĩ thể ức chế sự ra hoa trong chu kỳ sáng thuận lợi chẳng hạn như cây epinard, lolium temulentum). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 15 - Trong nuơi cấy mơ, acid abscisic ít được sử dụng, một phần tùy theo loại cây và phần khác tùy các điều kiện nuơi cấy, chất này sẽ gây nên các phản ứng rất khác nhau và giải thích một cách khĩ khăn. Tĩm lại, trong nuơi cấy in vitro, sự chế ngự của kỹ thuật sẽ vượt qua các sự cân bằng giữa chất điều hịa với nhau và trong số đĩ cĩ hai chất chính mà vai trị tạo cơ quan là cơ bản: auxin và cytokinin. Theo Skoog: 9 Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin cao, người ta thu được chức năng sinh tạo rễ.Nếu tỷ lệ auxin/cytokinin thấp, mơ sẽ phát triển về phía chức năng sinh tạo thân. 9 Nếu tỉ lệ này gần một đơn vị người ta sẽ thu được sinh tạo mơ sẹo. Các chất hữu cơ khác 2.1.6. Các chất khử trùng hĩa học được dùng trong nuơi cấy mơ Khi tiến hành nuơi cấy mơ khĩ khăn lớn nhất là phải tạo được thể nhân giống in vitro vơ trùng. Cĩ rất nhiều nguyên nhân gây ra sự nhiêm trùng, trong quá trình nuơi cấy cĩ thể bị nhiễm vi sinh vật từ: mẫu cấy, người cấy, hệ thống lọc khí trong tủ cấy, cơn trùng, dụng cụ hay bản thân mơi trường nuơi cấy. Mẫu cấy thường là nguồn nhiễm chính vì cĩ rất nhiều vi sinh vật bám trên bề mặt, trong các rãnh nhỏ hoặc giữa các lớp vảy chồi, mầm chồi. Đối với một số lồi thực vật được bao phủ bên ngồi bởi một lớp sáp dày hoặc cĩ lơng tơ thì càng khĩ khử trùng vì đây là nơi cư ngụ của rất nhiều vi sinh vật. Ngồi ra, những cây đã bị nhiễm ngay trong hệ thống mơ mạch thì xem như khơng thể dùng phương pháp khử trùng thơng thường để loại bỏ vi sinh vật được. Để giải quyết vấn đề này, đầu tiên người ta sử dụng các chất khử trùng. Nhằm tăng cường hiệu quả khử trùng, người ta thường rửa sơ mơ cấy với xà phịng để loại bỏ bụi đất và gia tăng sự tiếp xúc với các chất khử trùng hoặc sử dụng dung dịch Tween-20 như là chất hoạt động bề mặt. Sau khi khử trùng phải rửa sạch mẫu cấy bằng nước cất vơ trùng 3 - 5 lần. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 16 - Một số chất khử trùng thường sử dụng như: 9 Chlorur thủy ngân (HgCl2): Là chất khử trùng rất hiệu quả, thường dùng với lượng rất thấp từ 0,01% - 0,05%, chất này rất khĩ đào thải, vì vậy cần cẩn thận khi tiếp xúc. 9 Sodium hypochlorite NaOCl: Cĩ trong các dung dịch tẩy trắng 5 - 20% (v/v). Thời gian khử trùng từ 5 – 30 phút, sau đĩ rửa sạch bằng nước cất vơ trùng 3 – 5 lần. Chất này ngấm vào trong mơ thực vật, làm cản trở sự tăng cường của mơ về sau. 9 Calcium hypochlorite Ca(OCl)2: Nồng độ khoảng 5 – 10% (v/v), xử lý mơ cấy từ 5 – 30 phút. 9 Ethyl hay isopropyl alcohol 70% (v/v): Thường sử dụng để lau sạch các vật liệu nuơi cấy trước khi khử trùng hoặc dùng để ngâm nguyên liệu trước hoặc sau khi xử lý với NaOCl hoặc Ca(OCl)2 trong khoảng 1 -5 phút. 9 Nước oxy già (H2O2): Là một chất oxy hĩa cực mạnh, cĩ thể sử dụng ở nồng độ 3 – 10% trong 1 – 30 phút trước khi rửa bằng nước cất vơ trùng khi sử dụng. Sự kết hợp giữa NaOCl và H2O2 là rất độc với mơ thực vật, do đĩ phải rửa thật sạch. 9 Khí Clo (Cl2): Thường được sử dụng nhiều trong khử trùng hạt khơ. 9 Sodium dichloroisocyanurate (NADCC): Chất này ít độc đối với mơ thực vật, khơng cần rửa lại mẫu cấy bằng nước cất vơ trùng sau khi xử lý bằng chất này. 2.2. Kỹ thuật nuơi cấy lớp mỏng tế bào 2.2.1. Giới thiệu Những biểu hiện về cơ chế kiểm sốt quá trình sinh trưởng và phát triển của thực vật là những kiến thức cơ bản được áp dụng rỗng rãi. Để phân tích những cơ chế này, chúng ta cần thiết lập một chương trình biệt hĩa cho một mẫu thí nghiện cĩ sẵn trong nuơi cấy in vitro trước khi cố gắng giải thích câu hỏi: làm thế nào để một chương trình biệt hĩa được thực hiện, ví dụ như trong cơ thể thực vật. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 17 - Từ giai đoạn phơi đến giai đoạn trưởng thành, sự biệt hĩa tế bào thực vật trải qua nhiều sự kiện liên kết với nhau, và cuối cùng tạo thành những hình dạng, chức năng, cấu trúc phức tạp. Tất cả các sự kiện này xảy ra trong một mối liên quan hệ thống rất nhạy cảm với các nhân tố mơi trường. Những tác động này thống nhất trên tồn bộ cơ thể sinh vật. Tuy nhiên, trong đĩ những hiểu biết hết về sự kích thích, tiến trình, vận chuyển của chúng đến các tế bào đích khơng thể dùng để nghiên cứu, mặc dù hiện nay những kỹ thuật về sinh học phân tử rất mạnh. Các khái niệm về mạng lưới ức chế, trong đĩ sự tăng trưởng, phát triển và lão hĩa bắt nguồn từ mối tương quan cĩ thể điều chỉnh giữa: i) cơ quan, mơ, tế bào, ii) các cụm tế bào khác nhau, iii) các bào quan trong tế bào đâ đưa GS. K. Trần Thanh Vân đến với khái niệm hệ thống lớp mỏng tế bào (TCL) vào đầu những năm 70 thế kỷ XX. Với hệ thống này SG. K. Trần Thanh Vân cố gắng tách một hoặc một vài lới trong tế bào; và cố gắng chương trình hĩa lại chúng trong nuơi cấy in vitro, trong đĩ “biệt hĩa” là một tiêu chí quan trọng. Tất cả các quá trình biệt hĩa đĩ được kiểm sốt một cách riêng biệt hoặc tái chương trình hĩa theo trình tự thời gian hoặc khơng gian tùy theo người nghiên cứu và khơng bị áp đặt bởi quá trình phát triển cá thể. 2.2.2. Định nghĩa hệ thống lớp mỏng tế bào Hệ thống lớp mỏng tế bào – thin cell layer – TCL bao gồm các mẫu cấy cĩ kích thước nhỏ được cắt ra từ những bộ phận khác nhau của thực vật (thân, lá, rễ, phát hoa, các bộ phận của hoa, lá mầm, phơi). Nếu mẫu cấy được cắt theo chiều dọc được gọi là lTCL, nếu được cắt theo chiều ngang gọi là tTCL. Các lTCL (1 mm x 0,5 hay 10 mm) chỉ chứa một loại mơ như lớp đơn của tế bào biểu bì hoặc một vài lớp (3 – 6 lớp) của tế bào vỏ, ngược lại các tTCL (dày khoảng 0,2/0,5 mm đến vài mm) bao gồm một số tế bào thuộc các mơ khác nhau (mơ biểu bì, mơ vỏ, thượng tầng, mơ ruột hay tế bào nhu mơ) (Tran Thanh Van và Gendy, 1996). tTCL và lTCL cĩ đặc điểm chung là mỏng. Đặc điểm mỏng đĩng vai trị quan trọng vì các phân tử đánh dấu sự biệt hĩa cĩ thể định vị in situ ở những tế bào đích hay những tế bào đáp ứng. Quá trình định vị này cho phép giới hạn các tế bào cảm ứng khơng mong muốn (Tran Thanh Van, 2002). e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 18 - Khi cắt mẫu, mơ thực vật bị tổn thương, nhiều enzyme hoặc các polysacharide sinh ra rất cần cho quá trình cảm ứng sự sinh trưởng và phát triển của thực vật (Tran Thanh Van và Mutaftschiew, 1990). Lý do cơ bản của việc ứng dụng một vài tế bào trong hệ thống TCL là chúng cĩ mối liên hệ mật thiết với các tế bào bị thương (nơi xảy ra tổng hợp cấu tạo vách tế bào mới và nơi phĩng thích của oligosacharide) và chất dinh dưỡng cùng các yếu tố khác bên tong mơi trường để “kiểm sốt” sự phát sinh hình thái. Tuy nhiên, cũng bởi vì lý do đĩ cĩ thể nĩi chúng khá phụ thuộc vào mơi trường, lát mỏng cĩ ưu điễm là đồng nhất, nên dễ phản ứng một các đồng nhất với mơi trường. Ngược lại các mẫu cấy lớn hơn (như thân hoặc các mảnh lá) cho thấy sự phân cực mạnh trong phản ứng với mơi trường và cĩ thể chứa các hợp chất nội sinh cao hơn, bao gồm các chất sinh trưởng thực vật nên chúng khơng phụ thuộc nhiều vào mơi trường. Một hệ thống đa bào như hệ thống TCL được định nghĩa như tre6nmang những tổ chức khơng gian và thời gian cố hữu. Khác với khi sử dụng một tế bào tách ra hay tế bào trần, sau khi tách chúng tạo nên vách tế bào và hình thành nên cụm tế bào mới với tổ chức khơng gian và thời gian khác biệt với sự tổ chức trước khi tiến hành quá trình tách ra từ mơ hay cơ quan cho. Hơn nữa hầu hết các trường hợp trong quá trình phát triển của tế bào đơn hay tế bào trần cĩ sự hình thành mơ sẹo, phơi sinh dưỡng trộn lẫn tế bào khơng phải là phơi như các tế bào ống và rễ. Ngược lại, hệ thống TCL cĩ sự hình thành phần đĩ với số lượng lớn hơn. Khơng nhữ chúng được tiếp xúc trực tiếp với mơi trường mà cịn được chương trình hĩa một cách riêng biệt hoặc kết hợp tương ứng với khơng gian và thời gian (Tran Thanh Van, 1973). Việc giản số lượng tế bào trong phương pháp lớp mỏng tế bào cĩ ý nghĩa quan trọng vì ảnh hưởng đến quá trình phát triển hoặc các chương trình biệt hĩa mơ, cơ quan. Bên cạnh đĩ, khoảng thời gian để quá trình phát sinh hình thái xuất hiện tương đối ngắn (trung bình khoảng sau 14 ngày sau khi cấy). Tần suất cũng khá cao, gần 100% mẫu cĩ phản ứng. Như trên mẫu lTCL của cây thuốc lá (Nicotiana tabacum) cĩ kích cỡ 1 x 10 mm bao gồm 3 – 6 lớp tế bào biểu bì và được thu nhận từ cánh hoa, các cơ quan sau đây đươc biệt hĩa trực tiếp trên bề mặt TCL (mà khơng e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 19 - trài qua quá trình mơ sẹo trng gian): i) 50 hoa trong chương trình hoa, ii) 500 -700 chồi trong chương trình chồi, iii) 15-20 rễ trong chương trình rễ. Các tính chất mong muốn khác cĩ được trong phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào là sự đồng nhất về sinh lý, di truyền, và cĩ thể ứng dụng phương pháp này cho mọi thực vật. Tuy nhiên điều kiện mơi trường lý tưởng phù hợp cho sự tồn tại của mẫu TCL cịn phụ thuộc vào lồi và phải thử nghiệm lại tất cá các điều kiện in vitro gồm chất dinh dưỡng, chất điều hịa sinh trưởng, ánh sáng, nhiệt độ (Tran Thanh Van, 1980). 2.2.3. Một số nghiên cứu ứng dụng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào Trên thế giới đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu để ứng dụng phương pháp nuơi cấy lớp mỏng tế bào trên các đối tượng như cây lương thực, ngũ cốc và dược liệu. Amaranthus edulis Là cây hai lá mầm C4 rất quý, thuơc họ Amaranthaceae. Hạt của cây được quan tâm rất nhiều do cĩ chừa hàm lượng protein (16 – 18%) và lysin cao. Các nghiên cứu liên quan đến tái sinh chồi in vitro đối với nhiều lồi đã được báo cáp trên mơ sẹo xuất phát từ mặt lá, trụ dưới lá mầm, cuống lá, thân,phát hoa và cả thân cây Amaranthus. Tuy nhiên, thời gian trung bình cần để tái sinh chồi khoảng 4 – 6 tuần và tần số tái sinh rất thấp đối với các kiểu di truyền được thí nghiệm (Bagga và cộng sự, 1987). Trong một nỗ lực để thu được tần số tái sinh cây cao hơn trong một thời gian ngắn đối với cây A. edulis, Bui và cộng sự (1998) đã sử dụng hệ thống nuơi cấy TCL để cảm ứng biệt hĩa chồi in vitro. Chỉ sau một tuần nuơi cấy, 100% mẫu cấy tTCL từ rễ, lá mầm và trụ dưới đều hình thành mơ sẹo dạng bở và xốp. 100% mẫu cấy tTCL được cắt từ ngọn và vùng cĩ sự tái sinh chồi trực tiếp khơng thơng qua mơ sẹo. Beta vulgaris L. Cĩ nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhân giống in vitro đối với cây củ cải đường. Sự hình thành chồi nách từ đỉnh chồi của cây con (Hussey và Hepher, 1978) và sự phát triển của chồi nách từ các phân đoạn thể phát hoa e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 20 - (Saunden, 1982) là hai phương pháp thường được sử dụng để tạo ra một số lượng lớn chồi. Kỹ thuật TCL đối với cây củ cải đường là một phương pháp tỏ ra rất hiệu quả trong việc nghiên cứu phát sinh hình thái và vi nhân giống (Dectrez và cộng sự, 1988). Brassica napus Brassica napus (cây cải dầu) khá phổ biến trong việc nghiện cứu nuơi cấy mơ mở rộng. Klimaszewska và keller (1985) đã tiến hành thí nghiệm với các lát mỏng TCL bao gồm biểu bì và lớp tế bào cận biểu bì được cắt dọc theo lĩng thân cây. Chồi cĩ thể được phá hiện ở một đầu cuối cảu mẫu cấy sau 12 – 15 ngày. Hệ thống nuơi cấy này cĩ khả năng tạo ra tần số tái sinh chồi và số lượng chồi trên mỗi mẫu cấy cao. Hơn nữa, nguy cơ nhiễm vi sinh vật của mẫu cấy cũng khơng cịn là một vấn đề nghiêm trọng. Lupinus mutabilis và lipinus albus Đậu lupin là cây trồng quan trọng giúp khắc phục vấn đề thiếu hụt protein trong nguồn dinh dưỡng động vật. Nhưng khả năng thành cơng bị giới hạn trong quá trình nhân giống đối với nhiều lồi đậu lupin đã được báo cáo (Sator, 1985). Mulin và Bellio-Spataru (2000) đã nghiên cứu thành cơng khả năng tái sinh của mẫu cấy TCL được cắt từ vùng nốt trụ dưới lá mầm của cây Lupinus spp. Phaseolus vulgaris L. Là cây đậu xanh, loại đậu chủ yếu tự thụ phấn, cung cấp nguồn protein lớn trong khẩu phần ăn của người dân các nước Mỹ La Tinh và Đơng Phi. Tuy nhiên, cây trồng này rất nhạy cảm với hạn hán và nhiều tác nhân gây bệnh. Việc tạo ra cây đậu chuyển gen cĩ khả năng kháng hạn hoặc mang gen phịng vệ thơng qua di truyền sẽ rất cĩ ích, nhưng quá trình chuyển gen chỉ cĩ thể thành cơng nếu thiết lập được một hệ thống tái sinh cĩ hiệu quả. Cruz de Carvalho và cộng sự (2002) đã phát triển thành cơng một hệ thống tái sinh chồi trực tiếp bằng tTCL, nhờ đĩ tăng khả năng áp dụng phương pháp này cho quá trình chuyển gen. e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 21 - Oryza sativa L. Cây lúa đã được trồng như một loại cây lương thực chính yếu cách đêy hơn 7.000 năm và hiện đang nuơi sống hơn 50% dân số thế giới. Trong những năm gần đây, nuơi cấy mơ đĩng một vai trị rất quan trọng trong việc cải tiến chất lượng cây lúa. Tuy nhiên, cũng như các lồi đơn tử diệp khác, khơng phải tất cả các lồi lúa đều đáp ứng như nhau với các điều kiện tái sinh khi nuơi cấy trong ống nghiệm và cần cĩ một quy trình gồm nhiều bước địi hỏi một khoảng thời gian dài để phát triển thành cây hồn chỉnh. Nhut và cộng sự (2000) đã nỗ lực tìm kiếm một phương pháp tái sinh trực tiếp đối với cây lúa bằng cách sử dụng hệ thống nuơi cấy TCL. tTCL được nuơi cấy trong tối 2 tuần và sau đĩ đưa ra sáng . Vào ngày thứ 7, hơn 93% tTCL hình thành các cấu trúc giống phơi (Embryo-like Structure – ELS) trong mơi trường bổ sung 1µM BAP. Các cấu trúc này biệt hĩa trực tiếp thành chồi mà khơng qua trung gian mơ sẹo. Tĩm lại, cây lương thực, thực phẩm và dược liệu tạo nên một phần khơng thể thiếu trong đời sống con người. Cho đến nay, cĩ rất nhiều lồi thực vật chưa đươc nhân giống in vitro thành cơng, quá trình cải thiện và nhân giống với số lượng lớn thơng qua các phương pháp truyền thống hay phân tử vẫn cịn giới hạn. Kỹ thuật TCL cho phép tái sinh thành cơng các cơ quan in vitro và nhờ sự phát sinh hình thái được kiểm sốt đã mở đường cho những thành cơng trong chuyển gen nhờ vào các đặc tính vốn cĩ của hệ thống. 2.3. Giới thiệu chung về cây hoa Đồng tiền Thuộc họ Cúc (Asteraeae). Tên gọi Gerbera được đặt theo tên nhà tự nhiên học người Đức Traugott Gerbera. Cĩ khoảng 30 – 100 lồi sống hoang dã, phân bố Nam Mỹ, châu Phi, Madagascar và cùng nhiệt đới châu Á (Nepal, Trung Quốc). Các lồi G.jamesonii được đặt tên khi Robert Jameson cùng một số người đến khu mỏ vàng gần Barberton (phí đơng của núi Drakensberg) thuộc khu Transvaal vào năm 1884. Sau đĩ Bolus, một nhà thực vật học đã gủi mẫu cây gerbera vào vườn thực vật ở Kew (gần London). Cây được hính thức miêu tả bởi Joseph Dalton Hooker, khi thực hiện tạp chí thực vật Curtis năm 1889. Ơng miêu tả Gerbera jamesonii – theo đúng danh pháp e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 22 - khoa học cho lồi này – ở Nam Phi được biết dưới tên gọi là cúc Transvall hay cúc Barberton. Gerbera rất phổ biến và được trồng làm cây trang trí trong các mảnh vườn hay để cắt cành. Các giống trồng tại vườn chủ yếu là lai ghép chéo giữa Gerbera jamesonii và một lồi khác ờ Nam Phi là Gerbera Vindifolia. Giống lai ghép chéo này cĩ tên gọi là Gerbera Hybrida. Cây đa dạng về hình dạng và kích thước hoa, cĩ nhiều màu sắc. Phần trung tâm củ hoa đơi khi cĩ màu đen, thơng thường trên một bơng các cánh hoa cĩ thể cĩ một vài màu khác nhau. Những cây hoa Đồng tiền là một trong những loại hoa trồng chủ yếu là cắt cành. Được nhập khẩu vào Châu Au từ thế kỷ 19, ngày nay cĩ giá trị thương mại kinh tế cao. Phổ biến ở Hà Lan, Columbia, xung quanh các nước Nam Mỹ và Israel. Tại Việt Nam, hoa Đồng tiền khá phổ biến, cĩ giá trị kinh tế và cĩ thể ra hoa ở miền Bắc vì đây là thời gian hiếm hoa trong năm (Nguyễn Quang Thạch, 2002). Với diện tích 2.000m2 trồng hoa Đồng tiền cĩ thể cho thu nhập khoảng 15 triệu đồng/tháng (Nguyễn Hà và Hồng Nhung, 2007). 2.3.1. Các đặc điểm quan trọng của cây hoa Đồng tiền 2.3.1.1. Vị trí phân loại ¾ Giới: Plantae ¾ Ngành: Magnoliophyta ¾ Lớp: Magnoliosida ¾ Bộ: Asterales ¾ Họ: Asteraceae ¾ Chi: Gerbera ¾ Lồi: Gerbera jamesonii Hình 2.2. Cây hoa Đồng tiền (Gerbera jamesonii) e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 23 - 2.3.1.2. Đặc điểm hình thái 9 Thân, lá: thân ngầm, khơng phân cành, chỉ đẻ nhánh, cĩ chiều cao từ 45 – 63cm, cĩ khoảng 10 lá trên một cây. Lá và hoa phát triển từ thân cây, lá mọc chếch một gĩc so với mặt đất một gĩc 15 – 450, hình dáng lá thay đổi theo sinh trưởng của cây (từ hình trứng thuơn đến thuơn dài); lá dài 15 – 25cm, rộng 5 – 8cm, cĩ hình lơng chim, xẻ thùy nơng hoặc sâu (tùy thuộc vào từng loại giống), mặt thân của lá cĩ lớp lơng nhung. 9 Rễ: thuộc dạng rễ chùm, hình ống, phát triển khỏe, ăn ngang và nối với một phần trên mặt đất, vươn dài tương ứng với diện tích lá tỏa ra. 9 Hoa: hoa là dạng hoa tự đơn hình đầu và bơng hoa được tạo bởi hai loại cánh hoa hình lưỡi và hình ống. Cánh hình lưỡi lớn hơn, xếp thành một vịng hoặc một vài vịng phía ngồi; cánh hình ống nhỏ hơn, do sự thay đổi hình thái và màu sắc nên được gọi là mắt hoa hoặc tâm hoa. Trong quá trình hoa nở, cánh hoa hình lưỡi nở trước, cánh hoa hình ống nở sau theo thứ tự từ ngồi vào trong theo từng vịng một. Cụm hoa đầu cĩ bề ngồi dường như là một bơng hoa, trên thực tế là một tập hợp của hàng trăm hoa nhỏ riệng biệt. Tùy theo từng giống mà phân cấp theo chiều dài cành và kích thước đường kính hoa. 9 Đồng tiền là cây hoa của vụ Đơng xuân nên chịu rét khỏe, chịu nĩng kém hơn. Vào mùa hè cây cho hoa cĩ màu sắc và hình dáng kém chất lượng. Nhưng giống hoa kép và màu nhạt chịu nĩng tốt nhất, cĩ tuổi thọ cao hơn. Hình 2.4. Cụm đầu hoa (B - C) và hoa Đồng tiền (A) e Phần 2 – Tổng quan tài liệu f GVHD: CN. Bùi Văn Thế Vinh # Đặng Lâm Trúc Khoa Mơi trường & CNSH - 24 - 2.3.1.3. Điều kiện trồng trọt ¾ Nhiệt độ: Nhiệt độ là một trong những yếu tố quan trọng quyết định sự sinh trưởng, phát triển, nở hoa và chất lượng hoa. Đa số các giống Đồng tiền được trồng hiện nay đều thích hợp ở khoảng nhiệt độ từ 15 – 250C. Nếu nhiệt độ nhỏ hơn 120C hoặc lớn hơn 350C, cây sẽ kém phát triển. ¾ Ẩm độ: Đồng tiền là cây trồng trên cạn, khơng chịu được úng nhưng lại cĩ sinh khối lớn, bộ lá to, tiêu hao nước nhiều, do vậy khả năng chịu hạn kém. Độ ẩm đất từ 60 – 70%, độ ẩm khơng khí từ 55 – 65% thuận lợi cho cây Đồng tiền sinh trưởng, phát triển; đặc biệt vào thời gian thu hoạch cần độ ẩm vừa phải để tránh nước đọng trên các vết cắt, gây thối hoa và sâu bệnh phát triển. ¾ Đất đai: Đất cần tơi xốp, nhiều mùn, thống khí, tốt nhất là đất thịt pha cát. Cĩ độ pH 6 – 6,5. Đất phải cĩ khả năng giữi nước và thốt nước tốt, khơng bị ứ đọng trong mùa mưa. ¾ Các yếu tố dinh dưỡng: Các loại phân hữu cơ, phân vơ cơ, phân vi lượng cĩ ý nghĩa quan trọng đối với sinh trưởng, phát triển, phẩm chất và năng suất hoa Đồng tiền. ¾ Phân hữu cơ chứa hầu hết các nguyên tố đa lượng và vi lượng mà cây hoa đồng tiền cần, vì tạo nên sự cân đối về dinh dưỡng cho cây, đồng thời cải tạo đất (tăng độ mùn và độ tơi xốp). Phân hữu cơ thường được bĩn lĩt (phân phải được hoại mục). ¾ Các nguyên tố vi lượng rất cần thiết cho cây Đồng tiền. Nếu thiếu các nguyên tố vi lượng này sẽ làm cây ít lá, sự hình thành hoa bị ức chế, hoa nhỏ. ¾ Việc bĩn phân cho cây cần được quan tâm nhiều. Lượng phân bĩn tính cho 1000m2/năm : 70kg vơi (bĩn trước khi cày đất), 120kg Super lân, 40kg Ure, 25kg KCl, 70kg NPK (20 – 15 – 15). ¾ Chăm sĩc: e._.