Nghiên cứu hóa học và nhận dạng một số nhóm chất có trong cây đỏ ngọn (CRATOXYLUM PRUNIFOLIUM KURTZ)

27 LUẬN VĂN THẠC SĨ HỐ HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS PHẠM VĂN THỈNH THÁI NGUYÊN - 2008 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DÙNG TRONG LUẬN VĂN SKLM : Sắc kí lớp mỏng UV : Ultraviolet spectrocopy MS : Mass Spectroscopy EI-MS : Electron Impact Mass Spectroscopy LC-MS : Liqud chromatography - Mass Spectroscopy FT-IR : Fourier Transform Infrared Spectroscopy NMR : Nuclear Magnetic Resonance 1 H-NMR : 1 H-Nuclear Magnetic Resonance 13 C-NMR : 13 C- Nuclear Magnetic Resonance DEPT : Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer COSY : Correlated Spectroscopy HSQC : Heteronuclear Spectroscopy- Quantum Coherence HMBC : Heteronuclear multiple - Bond Correlation HIV : Human Immunodeficiency Virus U : Unit Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới, giĩ mùa, mưa thuận giĩ hồ nên hệ thực vật rất phong phú, đa dạng. Đĩ là nguồn tài nguyên sinh học quý giá thuộc loại cĩ thể tái tạo được. Ngay từ xa xưa cha ơng ta đã biết khai thác nguồn tài nguyên quý báu này để làm đồ ăn, thực phẩm, thuốc chữa bệnh, vật liệu xây dựng và nhiên liệu phục vụ cuộc sống. Trong thế giới thực vật ấy cĩ những lồi cung cấp thức ăn cho chúng ta, cĩ những lồi cung cấp vật liệu, cĩ lồi cung cấp hương thơm, quả ngọt, cĩ nhiều lồi được dùng để làm thuốc chữa bệnh, thuốc trừ sâu, cung cấp nguyên liệu cho các ngành cơng nghiệp thực phẩm, mĩ phẩm và dược phẩm. Việt nam cĩ một vị trí thuận lợi về thiên nhiên như vậy nên nền Y học dân tộc cổ truyền phát triển từ lâu đời, chiếm vị trí đặc biệt trong việc bảo vệ sức khoẻ nhân dân trong suốt hàng ngàn năm đấu tranh dựng nước và giữ nước. Tiếp thu truyền thống quý báu của các thế hệ cha ơng, ngày nay Đảng và Nhà nước ta đã xây dựng nhiều chính sách, nhiều hình thức động viên nhằm kế thừa và phát huy tốt nguồn tài nguyên quý báu cĩ thể tái tạo được phục vụ con người cĩ hiệu quả nhất. Nhiều cây cỏ đã được trồng để dùng làm thuốc, nhiều lồi dùng làm nguyên liệu cung cấp tinh dầu cho cơng nghiệp dược phẩm và mỹ phẩm như bạc hà, thanh hao hoa vàng, hoa hồi…, cĩ loại được dùng làm thực phẩm chức năng đồ uống như các loại trà, các loại sâm v.v... Trong số đĩ cĩ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) thuộc loại cây mọc hoang dại và phổ biến khắp các vùng trên lãnh thổ nước ta. Đặc biệt cây đỏ ngọn cĩ nhiều ở các tỉnh miền núi phía Bắc, Tây Nguyên và Nam Bộ. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Cây đỏ ngọn đã và đang được dùng để làm thuốc và làm nước uống trong phạm vi dân gian một cách khá phổ biến ở các nước châu Á, ở Việt Nam đặc biệt vùng đồng bào dân tộc miền núi phía Bắc nước ta. Gần đây người ta phát hiện dịch chiết của lá cây đỏ ngọn cĩ tác dụng chữa bệnh gan, cĩ tác dụng tốt với hệ thần kinh và tác dụng của nĩ khơng thua kém gì các thuốc nhập ngoại. Cây đỏ ngọn được dùng trong dân gian đã cĩ từ lâu, nghiên cứu hố thực vật cây đỏ ngọn thì mới chỉ được các nhà khoa học chú ý đến trong một số năm gần đây, để gĩp phần làm rõ thêm thành phần hố thực vật của cây đỏ ngọn tạo thuận lợi cho việc dùng, sử dụng cây thuốc này làm dược liệu và nguyên liệu cho các mục đích khác, chúng tơi chọn đề tài: “Nghiên cứu hĩa học và nhận dạng một số nhĩm chất cĩ trong cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium). Đối tượng nghiên cứu là cây đỏ ngọn mọc hoang, thu hái vào tháng 11 năm 2007 tại xã Thịnh Đức thành phố Thái Nguyên . Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 Chương 1 TỔNG QUAN 1.1. Mơ tả thực vật Theo tài liệu về phân loại thực vật, cây đỏ ngọn cịn gọi là cây thành ngạnh, lành ngạnh tuỳ thuộc vào từng địa phương tên khoa học là “Cratoxylum prunifolium Kurtz” thuộc họ Ban “Hypericaceae” [1, 2, 5, 8, 11] Cây đỏ ngọn phân bố rộng rãi ở vùng Nhiệt đới, Cận Nhiệt đới, Ơn đới, chủ yếu ở vùng ơn đới bán cầu Bắc. Chi Cratoxylum ở Việt Nam cĩ 5 lồi: Cratoxylum maingayi Kurz cĩ tên là lành ngạnh nhỏ, phân bố ở Bắc Trung Bộ và Lâm Đồng; Cratoxylum prunifolium Kurz lành ngạnh lá hẹp phân bố ở vùng Đơng Nam Bộ trên lãnh thổ VIệt Nam; Cratoxylum prunifolium Kurtz cây đỏ ngọn, cịn gọi là thành ngạnh đẹp mọc phổ biến ở vùng Đơng Bắc nước ta; Cratoxylum polyanthum Korth hay Cratoxylum ligustrinum Blume lành ngạnh; Cratoxylum cochinchinense Blumer cịn gọi là lành ngạnh Nam Bộ. Hai lồi cuối chủ yếu mọc ở Nam Bộ song cũng khá phổ biến ở các tỉnh Đơng Bắc Bộ. Cây đỏ ngọn - Cratoxylum prunifolium Kurtz thường thấy mọc tự nhiên ở hầu hết các tỉnh miền núi và trung du phía Bắc Việt Nam cĩ nhiều ở Xuân Mai - Ba Vì, Hà Tây, Sapa, Phú Thọ, Thái Nguyên, Bắc Cạn, Lạng Sơn, Vĩnh Phú. Cây đỏ ngọn cũng phân bố phổ biến ở các nước Châu Á như: Trung Quốc, Malaysia, Philippin, Ấn Độ, Indonexia, Myanma, Thái Lan. Đặc điểm sinh trưởng và phát triển của cây đỏ ngọn: Cây đỏ ngọn là loại cây nhỏ, thân gỗ, cĩ gai ở gốc (trong rừng lâu năm cây cĩ thể cao và to) cành non cĩ lơng tơ, màu đỏ nên gọi là đỏ ngọn [11]. Lá hình mác dài 12 - 13 cm, rộng 3,5 - 4 cm, mọc đối xứng, cuống ngắn 3 - 5 mm. Mặt gân chính màu đỏ đến 1/3 lá non, gân lá và lá cĩ màu đỏ đến quá Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 nửa. Hoa mọc trên những cành ở kẽ lá màu trắng hoặc hồng cĩ lơng màu tía. Quả nang dài 15mm, rộng 7 - 8mm. Hạt hình trứng dài 6mm, rộng 3mm Hình 1.1. Ảnh cây đỏ ngọn (Cratoxylum Prunifolium Kurt, Hypericaceae) 1.2. Một số cơng dụng của chi Cratoxylum Hầu hết các lồi thực vật thuộc chi Cratoxylum đều được nhân dân sử dụng làm các bài thuốc dân gian để chữa bệnh, để chăm sĩc và bồi dưỡng sức khoẻ. Cây đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium mới thấy dùng trong phạm vi nhân dân, làm thuốc kích thích tiêu hố, ăn ngon hàng ngày hoặc sau khi đau yếu, sau khi sinh. Kinh nghiệm cho thấy ngày uống chừng 15 - 30 g lá khơ dưới hình thức sắc hoặc pha như trà. Cĩ khi phối hợp với lá vối nấu nước uống cho tiêu cơm đã đem lại hiệu quả cao cho sức khoẻ con người [11]. Nhân dân ta ở các vùng đã thu hái lá cây đỏ ngọn vào dịp tết Đoan Ngọ phơi khơ để nấu nước uống mỗi khi cảm thấy cơ thể mệt mỏi.. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Trong những năm gần đây một số tác giả đã nghiên cứu tác dụng chữa bệnh của dịch chiết tồn phần lá và thân cây đỏ ngọn. Nhĩm nghiên cứu của Học viện Quân Y - Hà Nội cho biết cây đỏ ngọn ít độc, dịnh chiết tồn phần của lá và thân cây đỏ ngọn cĩ tác dụng chống ơxi hố tốt, hoạt tính đạt 69% trong khi tanakan chỉ đạt 48% [9] và cĩ tác dụng hoạt huyết, làm lưu thơng máu, giảm đơng ở những trường hợp tăng đơng [12]. Bộ mơn Dược học quân sự - Học Viện Quân Y trên cơ sở nghiên cứu lâm sàng dịnh chiết của lá đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium trên chuột nhắt trắng và thỏ cĩ so sánh với thuốc tanakan do hãng Beaufour Ipsen của Pháp sản xuất đã đưa ra kết luận: Dịch chiết tồn phần lá đỏ ngọn và dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn đều cĩ ảnh hưởng lên hoạt động của hệ thần kinh ở các mức độ khác nhau: - Dịch chiết etylaxetat và dịch chiết tồn phần lá đỏ ngọn, Tanakan đều cĩ tác dụng hoạt hố hệ thần kinh thực vật, thể hiện ở sự tăng rõ hàm lượng Catecholamin trong máu động vật thí nghiệm sau khi uống các thuốc này. - Dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn cĩ tác dụng tương đương Tanakan gây hoạt hố đồng bộ các tế bào não ở thỏ thực nghiệm, thể hiện làm giảm thành phần sĩng chậm delta, tăng thành phần sĩng alpha trên điện não đồ, cịn dịch chiết tồn phần lá đỏ ngọn khơng thể hiện rõ tác dụng hoạt hố hệ thần kinh trung ương. - Dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn cĩ tác dụng làm tốt cả hai quá trình hưng phấn và ức chế cĩ điều kiện ở não bộ động vật thí nghiệm (thơng qua hoạt động phản xạ cĩ điều kiện), tương đương với Tanakan và tốt hơn tác dụng này của dịch chiết tồn phần lá đỏ ngọn. - Mức độ ảnh hưởng làm tăng cường chức năng hệ thần kinh trung ương của các chất theo thứ tự giảm dần: dịch chiết etylaxetat lá đỏ ngọn, Tanakan, dịch chiết tồn phần lá đỏ ngọn [4]. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 Đối với cao nước (cặn tổng) 30 - 80 mg/kg cĩ hoạt tính kháng khuẩn với các vi khuẩn staphylococcus auresu, Escherichia coli, Salmonella typhi. DÞch chiÕt tỉng sè tõ l¸ c©y Cratoxylum cochinchinense ë Th¸i Lan ®· được ng•êi ta thư nghiƯm vµ cho thÊy chĩng cã t¸ c dơng chèng nhiễm khuẩn, chống ơxi hố, những hoạt động của tế bào [22, 23, 24]. Ở Singapo dịch chiết cây Cratoxylum cochinchinense được sử dụng trong nhân dân cĩ tác dụng chống các gốc tự do để chữa các bệnh liên quan đến sự căng thẳng, mệt mỏi [25]. Tại Nhật Bản, từ rễ cây của một số lồi thuộc chi Cratoxylum người ta bào chế thành thuốc làm tăng trí nhớ, chống lão hố, mất ngủ ở người già. Ở Trung Quốc, lá của cây đỏ ngọn người ta chế biến thành trà pha nước uống hàng ngày và sử dụng một cách rộng rãi. Từ phần dịch chiết etylaxetat của lá cây đỏ ngọn đã tách được các xanthone cĩ tác dụng kháng ấu trùng của muỗi gây sốt da vàng hơn cả chất rotenon, khơng những thế các chất này cịn cĩ nhiều triển vọng làm thuốc chống mối [28]. Phần dịch chiết etylaxetat của Cratoxylum cochinchinense cĩ tác dụng kìm hẵm peroxit hố lipit màng tế bào gan, kìm hãm sự xuất hiện lipit ác tính gây viêm gan và cĩ tác dụng bảo vệ gan tốt [27]. Theo các lương y, cây đỏ ngọn cĩ vị ngọt, tính mát bộ phận dùng lá non, vỏ cây, vỏ rễ. Người bị đau bụng ăn khơng tiêu, uống nước nấu của lá lành ngạnh giúp tiêu hố tốt thường dùng 100g lá non nấu một lít nước, thay nước uống hàng ngày. Khi bị cảm nắng, sốt thì dùng lá non 50g nấu với 1 lít nước uống. Trong dân gian Việt Nam, cây đỏ ngọn mới thấy dùng trong phạm vi nhân dân làm thuốc kích thích tiêu hĩa, phục hồi sức khoẻ khi ốm đau, sinh đẻ, bảo vệ thành mạch, chống lão hố, tăng trí nhớ ở người cao tuổi. Người ta thu hái lá đỏ ngọn vào dịp Tết mồng 5 tháng 5 (Tết Đoan Ngọ) để làm thực vật nấu nước Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 uống hoặc cĩ thể ủ sau đĩ đem phơi khơ mới dùng. Gần đây cĩ một vài tác giả ở Việt Nam đã nghiên cứu và cho thấy lá đỏ ngọn cĩ tác dụng chữa bệnh, cĩ tác dụng chống gốc tự do, bảo vệ thành mạch, bảo vệ tế bào gan chống mù lồ, chống ơxi hố và miễn dịch invitro khá rõ [7]. Tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên, Bác sĩ Hồng Sầm đã sử dụng dịch chiết của lá đỏ ngọn để làm thực phẩm chức năng, thay chè làm nước uống, chữa các bệnh nan y như: ngứa, ghẻ lở, ronan thần kinh, mất ngủ, miệng đắng ăn khơng ngon, giảm trí nhớ… 1.3. Tình hình nghiên cứu hĩa học thực vật chi Cratoxylum 1.3.1. Các hợp chất cĩ khung triterpen Theo tài liệu [19] từ dịch chiết n-hexan của thực vật Cratoxylum cochinchinense đã tách được ngồi các triterpen cĩ 5 vịng ngưng tụ nhĩm lupeol và β-mangostin cịn phân lập được các triterpen cĩ hai vịng ngưng tụ. Sau khi tách bằng các phương pháp sắc kí và dựa vào kết quả phân tích các phổ của các chất được tách ra người ta đề nghị cơng thức cấu tạo của 7 hợp chất triterpen hai vịng là: R I.a: (13E,17E)-polypoda-8 (26),13,17,21-tetraen-3β-ol; (R= β-OH). I.b: -polypodatetraene; (R= H). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 30 27 28 29 26 R 25 II.a: (13E,17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3β-ol; (R= β - OH). II.b:  - polypodatetraene; (R = H). II.c: (13E,17E)-3β-axetoxypolypoda-7,13,17,21-tetraene; (R= β - OAc). II.d: (13E,17E)-polypoda-7,13,17,21-tetraen-3-one; (R= O). R III.a: Polypoda-13,17,21-trien-8-ol; (R=H). III.b: Polypoda-13,17,21-trien-3-one; (R =β - OH). III.c : Polypoda-13,17,21-trien-3β, 8-diol; (R= O). 1.3.2. Các chất axit hữu cơ Từ lá một loại rau thuộc lồi Cratoxylum formosum ở Thái Lan Pilchaon Maisuthisakul [23] đã phân lập được hai axit hữu cơ IV, V và cho biết các hợp chất ấy đều cĩ hoạt tính chống oxi hĩa. Sau khi tách, phân lập tác giả đã đề nghị cấu trúc của nĩ cĩ cơng thức là: Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 COOH HO OH HO O O OH OH IV: Acid chlorogenic HO HO O OH OH O HO O OHHO O O V: Acid dicaffeoylquinic 1.3.3. Các chất cĩ khung xanthone Các xanthone là nhĩm chất lớn nhất, phổ biến nhất cĩ ở hầu hết các lồi thuộc chi Cratoxylum [6, 14, 17, 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 29, 30]. Đã phát hiện ra là các xanthone và dẫn xuất dưới dạng C-glycoside của chúng. Từ lồi Cratoxylum cochinchinense [25] Soon Yew Tang cùng với các cộng sự đã phân lập được C-glicoside của xanthone và xác định được cơng thức cấu tạo của nĩ cĩ dạng VI. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 O OH OH HO OH O O HO HO OH VI: 1,3,6,7-tetrahydroxyxanthone- C2-β-D-glycoside. Từ lồi Cratoxylum formosum Nawong Boonnak cùng các cộng sự [22] cũng đã phân lập được các xanthone cĩ cấu trúc VII dưới đây: O OCH3HO O O OH OHO O OH MeO R1 VII.a: Dulxis-xanthone VII.b: Β-mangostin; (R1 = OMe) VII.c: -mangostin; (R1 = OH) O OH R1 OH OH VII.d: Formoxanthone A; (R1 = ). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 O O MeO HO O OHR1 VII.e: 3-isomangostin; (R1 = ). VII.e1: 3,4-dihidro- 5,9-dihidroxy-8-methoxy-7-(3-methoxy-3-methylbutyl)- 2,2- dimethyl-2H,6H-pyrano-[3,2-β] xanthen-6-one; (R1 = ). VII.e2: 3,4-dihidro-5,9-dihidroxy-7-(3- hidroxy-3-methybutyl)-8-methoxy- 2,2- dimethyl-2H,6H-pyrano-[3,2-β] xanthen-6-one; (R1 = ). O R2 R1 O OH OH HO VII.f: Isocudraniaxanthone B; (R1 = H; R2 = OMe). VII.f1: Gerontoxanthone I; (R1 = ; R2 = OH). O OR2 O OH OH R1 VII.g: 10-O-methylmaclur-xanthone; (R1 = ; R2 = OMe). VII.g1: Macluraxanthone; (R1 = ; R2 = OH). OMe OH Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 VII.g2: Xanthone V1. (R1 = ; R2 = OH). VII.g3: 6 - deoxyjacreubin; (R1 = H; R2 = H). O R1 O OH OH O VII.h: Formoxanthone B; (R1 = ). Từ lồi Cratoxylum cochinchinese của miền Nam nước ta Lê Thị Diệu Nguyên và Leslie J. Harrison [19] đã phân lập được ngồi các triterpen I, II và III. Hai nhà nghiên cứu xác định được các xanthone cĩ cấu trúc VIII.a,VIII.b. O R O OH HO OH VIII.a: 1,3,7-trihydroxy-2,4-di (3-methyl-but-2-enyl) xanthone; (R = prenyl). VIII.b: 2-geranyl-1,3,7- trihydroxy-4-3- methylbut-2-enyl) xanthone; (R=geranyl). Từ lồi Cratoxylum maingayi [14] người ta cũng phân lập được một số hợp chất xanthone (IX), các chất này cĩ cấu trúc đơn giản nhưng đều cĩ tác dụng như các chất cĩ hoạt tính chống oxi hố tốt. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 O O OH R HO IX.a: 1-7- dihidroxyxanthone; (R = H). IX.b: 1,7- dihidroxy - 4- methoxyxanthone; (R = OMe). O O OMe OH OH 8 7 6 5 8' 10 ' 4' 9' 1 3 2 4 IX.c: 2,8 - dihidroxy - 1- methoxyxanthone. O O OMe OMe OMe OMe RO 1 2 3 45 6 7 9' 4'10' 8'8 IX.d: 7-hidroxy-1,2,3,8 -tetramethoxyxanthone; (R = H). Từ lồi Cratoxylum formosanum người ta cũng phát hiện được các xanthone cĩ cấu trúc phân tử như sau [21, 22] . O OMe OMe R3 R1 R2 O X.a: 1,7-dihidroxy-5,6-dimethoxy xanthone; (R1 = R2 =R3 = OMe). X.a1: 1,2,3,8-tetramethoxy xanthone; ( R1 = R3 = OH; R2 = H). X.a2: 1,2,3,4,8-pentamethoxy xanthone; (R1=R3=OMe;R2=H). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 O OH R1 O HO R2 X.b: 1,7-dihidroxy-4-methoxy xanthone; (R1 = OMe; R2 = H). X.b1: 1,7-dihidroxymethoxy xanthone; (R1 = R2 = H). X.b2: 1,7-dihidroxy-8-methoxy xanthone; ( R1 = H; R2 = OMe). O O OH O OH HO O OMeO Me MeO OMe X.c: Maclurathone X.d: 1,5,6,7-tetramethoxy xanythone O O OHHO OMe OMe X.e: 2,7-dihidroxy-1,8-dimethoxy xanthone. O O HO OMe OH OH X.f: 1,4,7-trihidroxy-8-methoxy xanthone. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 O O HO OH OH O O OH HO OH OH X.g: 1,4,7-trihydroxy xanthone. X.h: 1,3,5,6-tetrahidroxy xanthone. O O O HO OCH3 R H3CO 2' 1'1 A 34'4'' 9'8 ' B X.i: Fruniflorone; (R= ) [22] 1.3.4. Một số đại diện của khung anthraquinon Từ lồi Cratoxylum formosum ngồi việc xác định các xanthone Nawong Boonnak, Chatchanok Karalai và các cộng sự [22] cịn phân lập được các anthraquinon cĩ các cấu trúc XI. Các tác giả cịn cho biết các chất này cĩ hoạt tính sinh học rất cao. Chúng cĩ tác dụng tốt trong việc điều trị bệnh tiểu đường, viêm nhiễm, hạ đường huyết [20]. OHOOH OR O XI.a: 3-geranyloxy-6-methyl-1,8-dihidroxy-anthraquinon; (R= ) XI.a1: madagascin; (R = ) 5'' 4''' OH 2'' 1'' 3'' Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 XI.a2: physcion; (R = Me) XI.a3: emodin; (R = H ) XI.b: 11-hidroxyl-5-methoxy-2,2,9-trimethyl-2H-anthra-[1,2-β] pyran-7, 12-dion. OMe OHO O OH O O OH O OH HO XI.c: Vismiaquinon XI.d: 3,4 - dihidrojacareubin 1.3.5. Một số đại diện của khung flavonoit Từ lồi Cratoxylum cochinchinense, Cratoxylum formosanum nhiều tác giả đã phân lập được 2 flavonoit XII.a và XII.b [18, 13, 15]. Chúng cĩ hoạt tính kìm hãm peroxit hố lipit màng tế bào gan, cĩ tác dụng tăng khả năng thải độc của gan, cĩ tác dụng kìm hãm sự xuất hiện lipit ác tính. OHO OH O OH OH OHO OH O OH OH OH XII.a: Đihiđrokampherol XII.b: Taxifolin OOOH OMe O Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 1.4. Những nghiên cứu hố thực vật lồi Cratoxylum prunifolium. Từ lá của lồi Cratoxylum prunifolium, Xue-Li-Cao, Yoichiro Ito đã dùng phương pháp sắc kí khí lỏng tốc độ cao phân lập được epigallocatechin gallat (XIII.a) và epicatechin gallat (XIII.b) [27]. O CO OH OH OH OH OH OH OH HO O XIII.a: Epigallocatechin-3-O- gallate O CO OH OH OH OH OH OH HO O XIII.b: Epicatechin-3-O-gallate Theo Nguyễn Liêm và các cộng sự [10], bằng các phản ứng định tính cho biết Cratoxylum prunifolium cĩ chứa các flavonoit, tanin pyrocatechic phitosterol saponin triterpen và các axit hữu cơ, đường khử. Tác giả cịn cho biết ở cây đỏ ngọn của Việt Nam khơng thấy cĩ ancaloit và anthraquinon Từ vỏ cây đỏ ngọn Cratoxylum prunifolium. Phạm Đình Hùng, Nguyễn Diệu Liên Hoa và các cộng sự tại Đại học Quốc gia thành phố Hồ Chí Minh đã phân lập được macluraxanthone, 1,7-đihidroxanthone và hai xanthone mới Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 [6] và cho biết chúng đều cĩ tác dụng diệt muỗi gây sốt rét và cĩ tác dụng tốt trong việc diệt mối. Từ vỏ và rễ cây Cratoxylum prunifolium trồng ở tỉnh Nơng Khai miền Nam Thái Lan, Nawong Boonnak và các cộng sự đã chiết bằng điclometan, phân lập các chất bằng sắc kí đã tách được 10 xanthone với sự khác nhau chỉ là ở các mạch nhánh (R1 và R2) [22] và tác giả đã gọi tên chúng là các prunifloron được đánh số từ 1 đến 10. Cơng thức của chúng cĩ cấu trúc XIV. O OR1 R2 OH OR RO HO Prunifloron XIV; R1 ≠ R2 và đều là gốc ankyl hoặc dẫn xuất của nĩ. R: là H hoặc CH3 Tên của chúng lần lượt là: XIV.1 Pruniflorone A; XIV.2 Pruniflorone B; XIV.3 Pruniflorone C; XIV.4 Pruniflorone D; XIV.5 Pruniflorone E; XIV.6 Pruniflorone F; XIV.7 Pruniflorone G; XIV.8 Pruniflorone H; XIV.9 Pruniflorone I; XIV.10 Pruniflorone J. Cũng từ rễ của thực vật Cratoxylum prunifolium các tác giả Thái Lan lại phát hiện được một anthraquinon mà cấu trúc của nĩ được tác giả mơ tả cĩ dạng XV. OOH OH O O OH XV: Anthraquinon Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Chương 2 PHẦN THỰC NGHIỆM 2.1. Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Thu mẫu cây, xác định tên khoa học và phương pháp xử lý mẫu Nguyên liệu để nghiên cứu gồm lá cây đỏ ngọn, thu hái vào tháng 11 năm 2007 tại xã Thịnh Đức - Thành phố Thái Nguyên. Cây đỏ ngọn, cịn gọi là cây thành ngạnh đẹp, lành ngạnh đẹp, cĩ tên khoa học là: “Cratoxylum prunifolium Kurtz ”, họ Hyperaceas hay họ Ban. Mẫu cây tươi thu hái gồm cả cành nhỏ và lá được đem sấy ở 80 0 C để diệt men, sau đĩ sấy khơ ở nhiệt độ 50 0 C cho tới khi khơ hồn tồn. Mẫu khơ được chia riêng thành các phần lá, và cành. Chọn mẫu lá làm đối tượng nghiên cứu. Nghiền nhỏ mẫu ngâm, chiết trong etanol 90 o ở nhiệt độ phịng nhiều lần. Sau khi cất loại dung mơi, cặn cơ được dưới dạng xiro, chiết lần lượt bằng các loại dung mơi cĩ độ phân cực tăng dần: clorofom, etylaxetat, n-butanol, metanol, các dịch chiết được bay hơi dung mơi bằng thiết bị cất quay ở nhiệt độ 50 0 C dưới áp suất thấp. Các cặn thơ được phân chia bằng sắc kí cột với các hệ dung mơi rửa giải cĩ độ phân cực tăng dần để phân lập các chất cĩ độ phân cực gần giống nhau, kết tinh phân đoạn và kết tinh lại trong hệ dung mơi thích hợp để thu được các chất sạch . 2.1.2. Phương pháp phân lập các hợp chất từ các dịch chiết Để phát hiện, phân lập được những hợp chất sạch từ các dịch thơ khác nhau của cây đỏ ngọn chúng tơi đã phối hợp sử dụng các phương pháp sắc kí và kết tinh lại trong dung mơi thích hợp, các phương pháp gồm: - Sắc kí lớp mỏng (SKLM). - Sắc kí cột silicagen thường dùng Merck 63- 200nm. - Kết tinh phân đoạn và kết tinh lại. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 2.1.3. Phương pháp khảo sát và xác định cấu trúc hố học các hợp chất Các chất kết tinh phân lập ra được xác định những tính chất vật lý đặc trưng: màu sắc, mùi vị, hệ số Rf, điểm nĩng chảy, ghi các loại phổ như: phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (FT-IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H- NMR, phổ 13 C- NMR, tuỳ theo từng loại chất. Các số liệu phổ thực nghiệm của các chất sạch được dùng để nhận dạng cấu trúc hố học của chúng. 2.2. Dụng cụ, hố chất và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Dụng cụ và hố chất Các loại dung mơi dùng để ngâm, chiết mẫu là các loại tinh khiết (pure), cịn các loại dung mơi dùng để sắc kí cột, sắc kí lớp mỏng hay dùng trong phân tích là loại tinh khiết phân tích (PA). Sắc kí lớp mỏng dùng tấm mỏng đế nhơm DC - Alufolien Kiesegel 60 F254 Art.5554 tráng sẵn, độ dày 0,2mm được sử dụng để xác định sơ bộ số thành phần cĩ trong các dich chiết, các phân đoạn chạy cột và kiểm tra sơ bộ độ sạch của sản phẩm thu được. Các hệ dung mơi khai triển SKLM: 1. n-Hexan - etylaxetat 90:10 Hệ A 2. n-Hexan - etylaxetat 95:10 Hệ B 3. Clorofom - metanol 90:10 Hệ C 4. Clorofom - metanol 50:10 Hệ D 5. Clorofom - metanol 20:10 Hệ E Các tấm SKLM sau khi sấy khơ được soi dưới đèn tử ngoại (UV- BIOBLOCK ) ở bước sĩng  = 254nm và 365nm. Thuốc thử để hiện màu là vanilin 1% trong dung dịch metanol-H2SO4 , sau đĩ sấy ở nhiệt độ trên 100 0 C Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Các giá trị Rf trong hệ dung mơi triển khai cĩ biểu thức: 2.2.2. Thiết bị nghiên cứu - Nhiệt độ nĩng chảy đo trên máy Boetus (Đức) hoặc trên máy Eletronthermal IA - 9200. - Phổ hồng ngoại ghi trên máy IMPACT - 410. - Phổ UV đo trên máy UV 1700 Phamaspec. - Phổ khối ghi trên máy MS- Engine - 5989- HP ion hố bằng va chạm eletron (LC- MS) 70ev và sử dụng ngân hàng dữ liệu DATABASE/ WILLEY 250L. - Phổ 1 H- NMR và 13 C- NMR ghi trên máy Bruker 500MHz nội chuẩn TMS, dung mơi CDCl3, MeOD. 2.3. Các dịch chiết từ cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) 2.3.1. Các dịch chiết Lá cây đỏ ngọn đã sấy khơ, nghiền nhỏ được ngâm chiết kiệt bằng etanol 90 0 ở nhiệt độ phịng cho đến khi thu được dịch khơng màu. Dịch chiết được cất loại hết dung mơi ở áp suất giảm cho đến dạng cao lỏng, xác định khối lượng cặn khơ, sau đĩ thêm nước vào cặn và lần lượt chiết với các loại dung mơi clorofom, etylaxetat, n-butanol, cuối cùng đuổi hết nước và hồ tan bằng metanol. Các dịch chiết trên được làm khơ bằng Na2SO4 lọc và cất dung mơi bằng thiết bị cất quay dưới áp suất giảm ở nhiệt độ 50 0 C. Cặn được sấy khơ và cân để xác định trọng lượng. chiều dài di chuyển của chất thử chiều dài di chuyển của dung mơi Rf = Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Như vậy từ lá cây đỏ ngọn đã thu nhận được 04 phân đoạn cặn là: cặn trong clorofom (ĐC), cặn trong etylaxetat (ĐE), cặn trong butanol (ĐB) và cặn trong metanol (ĐM). Sơ đồ 2.1 1. Etanol 2. Cặn trong nước CHCl3 EtOAc BuOH MeOH Sơ đồ 2.1. Quy trình ngâm chiết Bảng 2.1. Khối lượng chất tổng số được chiết từng phân đoạn lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium Kurtz) Khối lượng mẫu lá (gam) Cặn chiết Clorofom Etylaxetat n-Butanol Metanol 787,4 52,264 34,654 40,411 26,604 100% 6,63% 4,40% 5,13% 3,38% MẪU KHƠ Cặn CHCl3 (ĐC) Cặn BuOH (ĐB) Cặn EtOAc (ĐE) Cặn MeOH (ĐM) ĐC1 ĐE1 ĐC2 ĐC3 Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 2.3.2. Khảo sát định tính các dịch chiết Dùng các thuốc thử đặc hiệu để phát hiện các nhĩm hợp chất thiên nhiên cĩ trong hoạt tính sinh lí cao trong thực vật [3] chúng tơi thu được kết quả thử định tính với các nhĩm chất, kết quả được chỉ ra ở bảng 2.2. Bảng 2.2. Phát hiện các nhĩm chất trong cây đỏ ngọn Stt Nhĩm chất Thuốc thử đặc hiệu Hiện tượng Kết quả 1 Saponin Tạo bọt Bọt bền trong axit ++ 2 Glicozttim Kelle-Kiliani Vàng nâu - 3 Cumarin Axit và kiềm Kết tủa bơng ++ 4 Poliphenol (FeCl3+K3[Fe(CN)6]) 1% Xanh thẫm +++ 5 Flavonoit Xianidin Từ hồng đến đỏ ++ 6 Steroit Liberman-Bourchard Màu xanh vàng ++ 7 Ancaloit Dragendorf Màu vàng da cam - 8 Đường khử Felinh Cho kết tủa màu đỏ gạch ++ Ghi chú: Dấu (+) là cĩ phản ứng dương tính, (++) là cĩ phản ứng tính rất rõ, (-) là khơng cĩ phản ứng. 2.3.3. Thử hoạt tính sinh học Thử hoạt tính vi sinh vật kiểm định bằng định tính theo phương pháp khuyếch tán trên thạch, sử dụng khoang giấy lọc tẩm chất thử theo nồng độ tiêu chuẩn tại bộ mơn Vi Sinh trường Đại học Y Thái Nguyên. Các chủng vi sinh vật thử gồm đại diện các nhĩm:  Vi khuẩn Gr (-) Escherichia coli.  Vi khuẩn Gr (+) Staphylococcus auresu.  Vi khuẩn: Salmonella typhi. Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 Hình 2.1. Ảnh được gây ức chế xung quanh giếng thạch Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 Chúng tơi cịn tiến hành thử các ứng dụng làm thực phẩm chức năng tại cơ sở sản xuất kinh doanh thuốc thành phẩm, thực phẩm chức năng Y học cổ truyền Thái Nguyên. Kết quả thử hoạt tính các dịch chiết thơ được trình bày trong bảng 2.3. Bảng 2.3. Kết quả thử hoạt tính sinh học của dịch chiết thơ từ lá cây đỏ ngọn (Cratoxylum prunifolium) Dịch chiết Đường kính vùng ức chế xung quanh giếng thạch(mm) Staphylococcus auresu Escherichia coli Salmonella typhi Đường kính (mm) Hoạt tính Đường kính (mm) Hoạt tính Đường kính (mm) Hoạt tính Cặn tổng (H2O) 30 + 26 + 27 + Cặn EtOAc 29 + 17 + 18 + Chú ý: Dấu (+) là phản ứng cĩ hoạt tính. 2.4. Chiết suất, phân lập và tinh chế các chất từ cây đỏ ngọn Từ 787,4g lá Cratoxylum prunifolium khơ chiết nhiều lần bằng etanol 90 0 đến khi dịch chiết trong suốt khơng màu, loại bỏ bớt dung mơi rượu bằng máy cất quay ở nhiệt độ 50 0 C đến khi dịch chiết cịn lại ở dạng xiro đặc, thêm nước, lắc cặn tổng số này với c lorofom đến khi thu được tất cả các chất cĩ thể tan được trong CHCl3 đều được lấy ra hết, cơ cạn dung dịch CHCl3 ở nhiệt độ thấp thu đuợc 52,264g chất (kí hiệu các chất ĐC). Phần cặn khơng tan trong CHCl3 được lắc nhiều lần với EtOAc cho đến khi dịch chiết EtOAc hồn tồn khơng màu và trong suốt, cơ cạn dịch EtOAc trong máy cất quay thu được 34,654g chất tổng số (kí hiệu là các chất ĐE). Phần khơng tan được trong EtOAc, được lắc với n-butanol sau đĩ cũng cơ cạn trong điều kiện áp suất thấp được 40,410g chất (kí hiệu là các chất ĐB). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Các chất cặn cịn lại khơng tan trong các dung mơi trên cho tan trong MeOH thu đựoc 32,346g chất (kí hiệu là các chất ĐM). 2.4.1. Dịch chiết clorofom Từ 11g cặn từ dịch clorofom của lá đỏ ngọn kí hiệu (ĐC) được phân chia trên sắc kí cột silicagel với các hệ dung mơi n-hexan - c lorofom với các tỷ lệ tăng dần clorofom từ 0% đến 100% kiểm tra các phân đoạn trên sắc kí lớp mỏng, các phân đoạn giống nhau đem gộp lại và cất loại dung mơi thu được ba chất ĐC-1, ĐC-2, ĐC-3. 2.4.1.1. Taraxeron (Friendoolean - 14- en-3-on) (ĐC1) Rửa giải với các hệ dung mơi n- hexan-clorofom (50:1), sau khi cất loại dung mơi, cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung mơi B và phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong dung mơi trên thu được 21mg chất rắn, tinh thể hình kim, màu trắng cĩ nhiệt độ nĩng chảy 278-280 0 C và cho các đặc trưng của một tritecpen. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 1720 (C=O); 1500 (C=C); 3050 (CH3); 2940 (CH). Phổ LC- MS, m/z (%) 424 [M + ]; 408 [M-O] + . PHổ 1 H- NMR (500MHz, CDCl3):  (ppm) 0,762ppm (3H, s, CH3); 0,84ppm (3H, s, CH3); 0,885ppm (3H, s, CH3); 0,996ppm (3H, s, CH3); 1,011ppm (3H, s, CH3); 1,02ppm (3H, s, CH3); 1,07ppm (3H, s, CH3) 5,48ppm (1H, dd, 3,21 và 8,17Hz). Phổ 13 C - NMR (500MHz, CDCl3);  (ppm): 38,35 (Cl); 33,08 (C2); 217,3 (C3); 47,56 (C4); 55,77 (C5); 19,91 (C6); 33,57 (C7); 38,87 (C8); 48,80 (C9); 33,57 (C10); 17,44 (C11); 36,67 (C12); 37,74 (C13); 157,59 (C14); 117,19 (C15); 34,12 (C16); 35,57 (C17); 48,70 (C18); 40,64 (C19); 28,79 (C20); 35,11 (C21); 37,69 (C22); 29,56 (C23); 21,57 (C24); 14,79 (C25); 25,56 (C26); 29,92 (C27); 26,12 (C28); 33,39 (C29); 21,47 (C30). Số hĩa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 2.4.1.2. Stigmast- 5,22- đien-24R-3β-ol Rửa giải cột với hệ dung mơi n-hexan- clorofom (50:5), sau khi cất loại dung mơi cặn thu được kiểm tra trên SKLM trong hệ dung mơi A, phát hiện bằng vanilin 1% trong dung dịch CH3OH- H2SO4, kết tinh lại trong hệ dung mơi trên thu được 29mg tinh thể hình kim, khơng màu, khơng mùi, cĩ nhiệt độ nĩng chảy 152-155 0 C, Rf  100 =61. Phổ FT-IR (KBr); νmax (cm -1 ): 3429,2 (OH); 2864,7 (C-H); 1651 (C=C). Phổ EI- MS; m/z (%): 412 [M + ] (7); 300 (7); 255 (11);._.