Nghiên cứu giải trình tự gen kháng nguyên GP5 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS, tai xanh) Việt Nam và so sánh với một số chủng của thế giới

H SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRS, TAI XANH) VIỆT NAM VÀ SO SÁNH VỚI MỘT SỐ CHỦNG CỦA THẾ GIỚI LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. LÊ THANH HÒA HÀ NỘI - 2009 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan toàn bộ kết quả trong luận văn là do chính tôi trực tiếp thực hiện. Các số liệu và kết quả được công bố trong luận văn là hoàn toàn trung thực, chính xác và chưa được công bố ở bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Tác giả Lại Thị Tuyết LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến PGS.TS. Lê Thanh Hoà - Trưởng phòng Miễn dịch học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là người Thầy trực tiếp hướng dẫn, đã tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Bá Hiên - Trưởng Bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm, Khoa Thú y, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn sự tài trợ kinh phí nghiên cứu khoa học của Phòng Miễn dịch học do PGS.TS. Lê Thanh Hoà làm chủ nhiệm. Tôi xin gửi lời cảm ơn đến: - ThS(NCS). Lê Thị Kim Xuyến, ThS(NCS) Nguyễn Thị Bích Nga, cùng các anh chị trong Phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học, đã nhiệt tình giúp đỡ, tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực hiện đề tài. - Các Thầy, Cô trong Khoa Thú y, Viện Đào tạo sau Đại học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong quá trình học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn vô hạn đến những người thân trong gia đình cùng bạn bè đã luôn hỗ trợ, động viên, khuyến khích tôi trong suốt thời gian qua. Hà Nội, ngày tháng năm 2009 Lại Thị Tuyết MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii ĐẶT VẤN ĐỀ……………………………………………………………… 1 PHẦN I. TỔNG QUAN TÀI LIỆU………………………………………. 4 1.1. GIỚI THIỆU VỀ HỘI CHỨNG RỐI LOẠN SINH SẢN VÀ HÔ HẤP Ở LỢN (PRRSV)……………………………………………….. 4 1.1.1. Khái niệm PRRS…………………………………………………... 4 1.1.2. Nguyên nhân gây bệnh và phân loại………………………………. 5 1.1.3. Dịch tễ học PRRS…………………………………………………. 7 1.1.3.1. Trên thế giới…………………………………………………. 7 1.1.3.2. PRRS tại Việt Nam…………………………………………... 8 1.1.4. Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích………………………………... 11 1.1.4.1. Triệu chứng………………………………………………….. 11 1.1.4.2. Bệnh tích……………………………………………………... 13 1.2. ĐẶC TÍNH SINH HỌC VIRUS PRRS................................................. 14 1.2.1. Hình thái và cấu trúc của virus PRRS.............................................. 14 1.2.2. Cấu trúc phân tử hệ gen của virus PRRS.......................................... 15 1.2.3. Khả năng gây bệnh và sức đề kháng................................................ 19 1.2.3.1. Khả năng gây bệnh................................................................... 19 1.2.3.2. Sức đề kháng............................................................................ 20 1.2.4. Đáp ứng miễn dịch của vật chủ với PSSRV.................. 20 1.2.4.1. Đặc trưng đáp ứng miễn dịch dịch thể với PRRS…………… 20 1.2.4.2. Đặc trưng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào của PRRS………………………………………………………… 21 1.2.5. Vật chủ và phương thức truyền lây……………………………….. 23 1.2.6. Cơ chế sinh bệnh.............................................................................. 24 1.2.7. Chẩn đoán…………………………………………………………. 26 1.2.7.1. Chẩn đoán lâm sàng………………………………………….. 26 1.2.7.2. Chẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh………………. 26 1.2.7.3. Phát hiện virus……………………………………………….. 26 1.2.7.4. Chẩn đoán huyết thanh học………………………………….. 27 1.2.8. Điều trị và phòng chống………………………………………... 27 1.2.8.1. Điều trị.............................................................................. 27 1.2.8.2. Phòng chống ………………………………………………. 28 1.3. CÁC KỸ THUẬT SINH HỌC PHÂN TỬ SỬ DỤNG TRONG NGHIÊN CỨU PHÂN TÍCH GEN VÀ HỆ GEN…………………….. 29 1.3.1. Kỹ thuật PCR……………………………………………………… 29 1.3.2. Kỹ thuật RT-PCR………………………………………………..... 30 1.3.3. Kỹ thuật tách dòng………………………………………………… 31 1.3.4. Kỹ thuật giải trình trình tự........................................................ 31 1.4. XỬ LÝ SỐ LIỆU SỬ DỤNG CÁC PHẦN MỀM TIN – SINH HỌC.. 32 1.4.1. Nguyên tắc chung............................................................................. 32 1.4.2. Xử lý số liệu trong nghiên cứu......................................................... 34 1.4.3. Các chương trình tin – sinh học ứng dụng trong nghiên cứu xử lý, phân tích và so sánh chuỗi gen thu nhận.......................................... 34 1.5. TẦM QUAN TRỌNG CỦA VIỆC NGHIÊN CỨU TÌM HIỂU GEN GP5 36 PHẦN II. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……... 39 2.1. NGUYÊN LIỆU ……………………………………………………… 39 2.2. DỤNG CỤ, TRANG THIẾT BỊ VÀ HÓA CHẤT NGHIÊN CỨU….. 39 2.2.1. Dụng cụ, trang thiết bị…………………………………………….. 39 2.2.2. Hóa chất…………………………………………………………… 39 2.2.3. Dung dịch sử dụng trong tách dòng…………………………… 40 2.2.4. Các dung dịch dùng để điện di trên thạch agarose………………... 41 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......................................................... 42 2.3.1. Tách chiết RNA tổng số................................................................... 42 2.3.2. Kỹ thuật điện di để kiểm tra RNA tổng số....................................... 43 2.3.3. Phản ứng RT-PCR............................................................................ 43 2.3.3.1. Thiết kế mồi.............................................................................. 43 2.3.3.2. Thực hiện phản ứng RT-PCR một bước................................... 44 2.3.4. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR................................................. 45 2.3.5. Phương pháp tách dòng và lưu giữ nguồn gen................................. 45 2.3.6. Giải trình tự và xử lý chuỗi gen........................................................ 49 2.3.6.1. Giải trình tự DNA..................................................................... 49 2.3.6.2. Tinh sạch sản phẩm của phản ứng giải trình tự ....................... 50 2.3.6.3. Thu nhận, xử lý và phân tích dữ liệu chuỗi gen GP5................ 50 2.3.6.4. Các gen GP5 của các chủng thế giới được lựa chọn so sánh.... 51 PHẦN III. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN.................................................... 52 3.1. Kết quả tách chiết ARN tổng số............................................................. 52 3.2. Kết quả thực hiện phản ứng RT-PCR.................................................... 52 3.3. Kết quả dòng hóa sản phẩm gen GP5 trong vector tách dòng.............. 53 3.4. Kết quả giải trình tự gen GP5 của TX196 và TXMT1........................... 55 3.5. Kết quả truy cập Ngân hàng gen................................................. 58 3.6. Kết quả so sánh thành phần nucleotide và acid amin của gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 với một số chủng trên thế giới..................... 59 3.6.1. Kết quả so sánh thành phần nucleotide.......................................... 59 3.6.2. Kết quả so sánh thành phần amino acid......................................... 64 3.7. Kết quả so sánh mức độ đồng nhất về thành phần nucleotide (%) và tương đồng về amino acid (%) của gen GP5 giữa TX196 và TXMT1 với các chủng thế giới.............................................................................. 66 3.8. Kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ của hai chủng TX196 và TXMT1 với các chủng thế giới dựa trên gen GP5................................................ 68 3.9. Bàn luận chung....................................................................................... 72 KẾT LUẬN..................................................................................................... 74 KIẾN NGHỊ................................................................................................... 75 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt aa Amino acid Axit amin BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp Base pair Cặp bazơ Da Dalton DNA Deoxyribonucleic acid Axit deoxyribonucleic EAV Equine arteritis virus Virus gây viêm động mạch ngựa EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid Axit ethylene diamine tetraacetic ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay Phản ứng hấp phụ miễn dịch liên kết với enzyme EtBr Ethidium bromide GP Glycoprotein LB Luria-Bertani LDHV Lactate dehydrogenase-elevating virus Virus gây tăng hoạt enzyme Lactate dehydrogenase SHFV Simian hemorrhagic fever virus Virus gây bệnh sốt xuất huyết khỉ MEGA Molecular Evolutionnary Genetics Analysis N Nucleocapsid protein Protein vỏ nhân OIE Organisation of International Epidemiology Tổ chức Dịch tễ học Thế giới ORF Open reading frame Khung đọc mở PCR Polymerase chain reaction Phản ứng trùng hợp chuỗi gen PRRS Porcine reproductive and respiratory syndrome Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn RNA Ribonucleic acid Axit ribonucleic RNP Ribonucleprotein Phức hợp protein và RNA RT-PCR Reverse transcription polymerase chain reaction Phản ứng PCR ngược WHO Wold Health Organization Tổ chức Y tế Thế giới X-gal 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-galactopyranoside DANH MỤC BẢNG Trang Bảng 1.1. Arterivirus gây bệnh trên động vật………………………….. 7 Bảng 1.2. Thống kê đặc điểm hệ gen của các chủng đại diện các dòng PRRS trên thế giới..................................................................... 16 Bảng 2.1. Thành phần nucleotide các mồi dùng trong phản ứng RT-PCR 45 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng RT-PCR/1 ống Eppendorf cho PCR....... 46 Bảng 2.3. Thành phần phản ứng cắt DNA plasmid bằng EcoRI................ 50 Bảng 2.4. Danh sách các chủng PRRSV của Việt Nam và thế giới cung cấp chuỗi gen GP5 để phân tích so sánh thành phần gen và mối quan hệ nguồn gốc phả hệ............................................................ 52 Bảng 3.1. Kết quả truy cập Ngân hàng gen quốc tế, sử dụng chuỗi nucleotide của gen GP5 của chủng TXMT1 làm chuỗi truy cập....................................................................................... 60 Bảng 3.2. Tỷ lệ đồng nhất (%) nucleotide (trên đường chéo) và tương đồng amino acid (dưới đường chéo) của gen GP5 giữa các chủng PRRSV phân lập tại Việt Nam với các chủng thế giới....................................................................................... 68 DANH MỤC HÌNH Trang Hình 1.1. Cây phả hệ thể hiện sự liên quan của virus PRRS với các virus khác trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae dựa trên dữ liệu chuỗi gen RNA-dependent RNA polymerase (RdRp)……………………………………...... 6 Hình 1.2. Bản đồ lịch sử xuất hiện bệnh PRRS trên thế giới.............. 8 Hình 1.3. Tình hình dịch bệnh PRRS ở Việt Nam (năm 2007)........... 9 Hình 1.4. Hình ảnh triệu chứng lâm sàng ở lợn nhiễm PRRSV…….. 12 Hình 1.5. Hình ảnh bệnh tích trên phổi lợn mắc PRRS……………... 14 Hình 1.6. Hình thái virion của virus PRRS......................................... 15 Hình 1.7. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS.......................................... 17 Hình 1.8. Sơ đồ hệ gen của virus PRRS.............................................. 18 Hình 1.9. Mô phỏng vị trí các protein của PRRSV trong virion......... 19 Hình 1.10. Hình ảnh xâm nhiễm và phá huỷ đại thực bào của PRRSV 25 Hình 2.1. Sơ đồ quy trình nghiên cứu.................................................. 42 Hình 2.2. Sơ đồ vị trí ORF5 vùng mã hoá protein chức năng của virus PRRS........................................................................... 44 Hình 2.3. Sơ đồ cấu tạo vector pCR®2.1-TOPO® (Invitrogen)........... 47 Hình 3.1. Kết quả điện di kiểm tra RNA tổng số của TX196 và TXMT1................................................................................ 53 Hình 3.2. Kết quả diện di sản phẩm RT -PCR gen GP5...................... 54 Hình 3.3. Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh................................................................................ 55 Hình 3.4. Kết quả cắt kiểm tra DNA của gen GP5 từ plasmid tái tổ hợp................................................................................... 55 Hình 3.5. Giản đồ giải trình tự tự động (chromatogram) thành phần nucleotide của đoạn gen GP5 chủng TX196 và TXMT1.... 57 Hình 3.6. Trình bày chuỗi nucleotide và amino acid của gen GP5 chủng TX196 và TXMT1 thu nhận sau giải trình tự…….. 58 Hình 3.7. So sánh thành phần nucleotide 603 bp chuỗi gen GP5 của virus gây Hội chứng sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở lợn phân lập tại Việt Nam với các chủng của thế giới............... 62 Hình 3.8. So sánh thành phần amino acid chuỗi gen GP5 của virus gây Hội chứng sinh sản và hô hấp (PRRSV) ở lợn phân lập tại Việt Nam với các chủng của thế giới........................ 65 Hình 3.9. Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng virus PRRS của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần nucleotide của gen GP5..................................... 70 Hình 3.10. Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng virus PRRS của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần amino acid của chuỗi polypeptide GP5............. 72 ĐẶT VẤN ĐỀ Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS - Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome), còn gọi là bệnh “tai xanh” (Blue Ear), là bệnh truyền nhiễm cấp tính nguy hiểm, do virus PRRS (PRRSV), thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales gây ra. Bệnh lây lan nhanh và làm chết nhiều lợn nhiễm bệnh. Hiện nay, PRRS đã và đang trở thành dịch ở nhiều nước trên thế giới, gây tổn thất nặng nề cho nền kinh tế. PRRS lần đầu tiên được phát hiện ở Mỹ vào năm 1987, ở châu Âu (tại Đức năm 1990, tại Hà Lan năm 1991) và tại châu Á vào đầu những năm 1990. Tại Việt Nam, PRRSV được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ năm 1997 bằng phản ứng huyết thanh học. Gần đây, từ tháng 3 năm 2007 đến nay, liên tiếp xảy ra các đợt dịch bệnh ở nhiều địa phương trong cả nước, gây thiệt hại hàng trăm tỷ đồng cho ngành chăn nuôi do phải tiêu huỷ lợn bệnh nhằm ngăn chặn nguồn virus lây nhiễm. Virus PRRS có tính thích ứng rất cao đối với các đại thực bào ở phổi. Hệ gen của PRRSV là phân tử RNA sợi đơn dương, cấu trúc tương tự các khung đọc mở (open reading frame, ORF) của Coronavirus, gồm 7 khung đọc mở gối lên nhau, mã hóa cho 7 protein của virus gồm: GP1, GP2, GP3, GP4, GP5, M và N. Trong số đó, protein GP5 (glycoprotein 5) được mã hoá bởi ORF5, là một protein được glycosyl hoá, gắn với màng bọc ngoài của PRRSV, có tính kháng nguyên mạnh và chịu trách nhiệm gây bệnh của virus. Protein GP5 cùng với protein N là đích chủ yếu của các kháng thể trung hoà, tham gia vào cơ chế “lẩn tránh” đáp ứng miễn dịch cơ thể vật chủ của PRRSV, do ngăn cản hiện tượng trình diện kháng nguyên virus của các đại thực bào với các tế bào có thẩm quyền miễn dịch trong cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và qua trung gian tế bào (CMI-cell mediated immunity). Ngoài ra, GP5 còn tham gia hiện tượng “chết theo chương trình” (apoptosis) của các tế bào trong cơ thể bị nhiễm PRRSV. Sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng lây nhiễm và gây bệnh của PRRSV, làm cho bệnh dịch PRRS ngày càng phức tạp, do làm giảm hiệu quả phòng bệnh của các vaccine phòng bệnh đang lưu hành. Chính vì vậy, nghiên cứu giải mã gen kháng nguyên GP5 (ORF5) của PRRSV đương nhiễm hiện nay là thực sự cần thiết, giúp cho chẩn đoán xác định bệnh nhằm sớm áp dụng các biện pháp khống chế và khoanh vùng dịch tễ, giảm thiệt hại do bệnh dịch gây ra. Ngoài ra, dữ liệu gen học và hiểu biết di truyền học của gen ORF5 giúp cho việc nghiên cứu sản xuất các vaccine thế hệ mới phù hợp với PRRSV đang lưu hành và còn cho phép xác định mức độ tiến hóa của virus đương nhiễm với các chủng trước đó tại Việt Nam và trên thế giới. Bên cạnh các phương pháp chẩn đoán huyết thanh học hay miễn dịch học, hiện nay kỹ thuật sinh học phân tử cho phép phát hiện và chẩn đoán nhanh virus gây bệnh, có độ chính xác và tin cậy cao, được ứng dụng trong nghiên cứu phân tích hệ gen của các loài sinh vật. Hiện nay, ở Việt Nam còn ít công trình nghiên cứu cơ bản về gen/hệ gen của PRRSV phân lập tại Việt Nam được công bố. Xuất phát từ yêu cầu trên, trong khuôn khổ luận văn cao học, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu giải trình tự gen kháng nguyên GP5 của virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS, tai xanh) Việt Nam và so sánh với một số chủng của thế giới” Mục tiêu đề tài: Có được chuỗi gen và kết quả phân tích gen GP5 của một số chủng PRRSV gây bệnh phân lập tại Việt Nam, so sánh với một số chủng của thế giới. Đề tài được thực hiện tại phòng Miễn dịch học - Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu về hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) 1.1.1 Khái niệm PRRS Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndome, viết tắt là PRRS), là bệnh truyền nhiễm nguy hiểm của loài lợn (kể cả lợn rừng), biểu hiện đặc trưng là các rối loạn sinh sản ở lợn nái như sảy thai, thai chết lưu, lợn sơ sinh chết yểu [15], cũng như ở lợn con theo mẹ và lợn nái hậu bị còn thể hiện viêm đường hô hấp rất nặng như sốt, ho, khó thở, chết với tỷ lệ cao. Bệnh còn được gọi bằng nhiều tên khác nhau như: + “Bệnh bí hiểm ở lợn” (Mystery Disease Syndrome). + Hội chứng vô sinh và hô hấp ở lợn (Swine Infertility and Respiratory Syndromde, được viết tắt là SIRS). + Hội chứng hô hấp và sảy thai ở lợn (Porcine Endemic and Respiratory Syndrome, được viết tắt là PEARS). + Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome). + Căn cứ vào triệu chứng và bệnh tích, bệnh này còn được gọi là “Bệnh lợn tai xanh” (Blue-ear disease), ở Việt Nam tên bệnh “Tai xanh” trở nên phổ biến hiện nay. Năm 1992, Hội nghị Quốc tế về bệnh này được tổ chức tại St. Paul, Minnesota (Mỹ) đã nhất trí dùng tên Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRS) và được Tổ chức Thú y thế giới công nhận. Bệnh được gây ra bởi virus PRRS, tồn tại dưới dạng các hạt virion gây nhiễm. Virus PRRS (PRRSV) là một loại virus thuộc nhóm Arterivirus, có cấu trúc vỏ bọc, hình khối đa diện, là virus nhóm RNA, thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Hệ gen của PRRSV chứa RNA sợi đơn dương (+ssRNA) gồm 7 khung đọc mở khác nhau mã hoá cho các protein của virus [44]. PRRS được ghi nhận lần đầu tiên ở Mỹ tại vùng bắc của bang California, bang Iowa và Minnesota (1987), bệnh lây lan nhanh, đến nay gặp ở hầu hết các quốc gia, châu lục trên thế giới [12]. Tại Việt Nam, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam năm 1997. Hiện nay, dịch PRRS vẫn đang tiếp tục xảy ra và diễn biến phức tạp, có nguy cơ bùng phát ở tất cả các địa phương trong cả nước. 1.1.2 Nguyên nhân gây bệnh và phân loại Virus PRRS lần đầu tiên được phân lập từ một ổ dịch ở Hà Lan, được xác định là nguyên nhân chính gây ra hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Virus thuộc nhóm Arterivirus, thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, có cấu trúc hệ gen là RNA sợi đơn dương, gồm 7 khung đọc mở khác nhau mã hoá cho các protein của virus. Bộ Nidovirales gồm có 4 họ, bao gồm: Coronaviridae, Arteriviridae, Toroviridae, Roniviridae (Hình 1.1). Tên gọi của nhóm Arterivirus được bắt nguồn từ một loại virus trong họ đó, đó là virus gây viêm động mạch ở ngựa (Equine arteritis virus). Các thành viên trong họ Arteriviridae có cấu trúc và sự nhân lên giống với các virus trong họ Coronaviridae. Sự khác biệt giữa hai họ này chính là kích thước hệ gen, trong đó hệ gen của Arteriviridae chỉ bằng một nửa hệ gen của Coronaviridae và nét đặc trưng của chúng là bản sao mã giống nhau chung cho các loại virus của bộ Nidovirales. Họ Arteriviridae chỉ có một giống duy nhất là Arterivirus chứa tất cả bốn thành viên là virus gây viêm động mạch ở ngựa (EAV), virus gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (PRRSV), virus gây tăng hoạt enzyme lactase dehydrogenase (LDV) và virus sốt xuất huyết ở khỉ (SHFV) [20] (Bảng 1.1). Hình 1.1. Cây phả hệ thể hiện sự liên quan của virus PRRS với các virus khác trong bộ Nidovirales và họ Picornaviridae dựa trên dữ liệu chuỗi gen RNA-dependent RNA polymerase (RdRp) (theo Gorbalenya và cs, 2006) PRRSV được phân chia thành 2 kiểu gen di truyền (genotype): kiểu gen châu Âu (type I), đại diện tương ứng là chủng Lelystad (LV) và kiểu gen châu Mỹ (type II), đại diện tương ứng là chủng VR-2332. Hai kiểu gen khác nhau tới 60% về nucleotide, cả về mặt di truyền và kháng nguyên. Bốn dưới chủng (subtype) đã được xác nhận trong các genotype châu Âu và có tính đa dạng cao trong mỗi một kiểu gen và dưới chủng. Hơn nữa, PRRSV cũng có sự khác nhau về hệ gen gần loài [54]. Các chủng virus này gây bệnh trên động vật cảm thụ với bệnh cảnh giống nhau, nhưng chúng lại đại diện cho 2 kiểu gen khác biệt. Những nghiên cứu gần đây còn cho thấy có sự khác biệt về tính di truyền trong các virus phân lập được từ các vùng địa lý khác nhau. Bản thân các virus trong cùng một nhóm cũng có sự thay đổi về chuỗi nucleotide khá cao, đến 20%, đặc biệt là các chủng virus thuộc dòng Bắc Mỹ. Chính sự khác biệt và sự đa dạng về tính kháng nguyên, khả năng biến đổi cấu trúc kháng nguyên của virus đã làm tăng thêm những khó khăn trong việc sản xuất vaccine phòng chống bệnh này. Điều cần lưu ý nữa là sự đa nhiễm PRRSV ở một số quốc gia, đó là sự trộn lẫn nhiều genotype, tức là căn bệnh do PRRSV lưu hành trên đàn lợn gồm cả 2 dòng virus: Bắc Mỹ và châu Âu [20]. Bảng 1.1. Arterivirus gây bệnh trên động vật Virus Vật chủ Bệnh Equine arteritis virus (EAV) Ngựa Bệnh toàn thân, viêm động mạch, sảy thai, thai chết, viêm phổi ở ngựa con Porcine reproductive And respiratory syndrome virus (PRRVS) Lợn Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn, bệnh toàn thân; đặc trưng bởi hiện tượng sảy thai, thai chết yểu và bệnh đường hô hấp Lactate dehydrogenase – elevating virus (LDHV) Chuột Bệnh tăng hoạt enzyme Lactate dehydrogenase do virus; Simian hemorrhagic fever virus (SHFV) Khỉ (Linh trưởng) Bệnh sốt xuất huyết khỉ, có bệnh lý toàn thân thường giết chết con vật 1.1.3 Dịch tễ học PRRS 1.1.3.1 Trên thế giới Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn được phát hiện lần đầu tiên năm 1987 ở tại vùng Bắc Mỹ gồm các bang California, bang Iowa và Minnesota. Dịch lây lan nhanh chóng tới nhiều nước trên thế giới bao gồm Canada (1988); Đức (1990); Hà Lan, Tây Ban Nha, Bỉ, Anh (1991) và ở Pháp (1992) [52]. Năm 1998, bệnh được phát hiện ở châu Á như Hàn Quốc, Nhật Bản. Từ năm 2005 trở lại đây, 25 nước và vùng lãnh thổ thuộc tất cả các châu lục trên thế giới đều có dịch bệnh PRRS lưu hành (trừ châu Úc và Newzeland) Những năm gần đây ở Trung Quốc, dịch bệnh PRRS đã liên tục xảy ra và hiện vẫn đang còn tồn tại. Trong vòng hơn 3 tháng của năm 2006, chủng virus PRRS thể độc lực cao đã gây ra đại dịch lây lan ở hơn 10 tỉnh phía Nam và làm hơn hai triệu con lợn ốm, trong số đó, có khoảng hơn 400.000 con đã chết do bị bệnh. Đến tháng 7 năm 2007, dịch bệnh đã xảy ra trên 25 tỉnh với hơn 180.000 lợn mắc bệnh và 45.000 con đã bị chết ( [34]. Tại Thái Lan, PRRS xuất hiện vào năm 1989 và có mặt các chủng thuộc dòng châu Âu và dòng Bắc Mỹ. Có thể khẳng định rằng PRRS là nguyên nhân gây tổn thất kinh tế cho ngành chăn nuôi lợn ở nhiều quốc gia trên thế giới. 1.1.3.2 PRRS tại Việt Nam Tại Việt Nam, PRRS được phát hiện trên đàn lợn nhập từ Mỹ vào các tỉnh phía Nam năm 1997, kết quả kiểm tra huyết thanh học cho thấy 10/51 lợn giống nhập khẩu đó có huyết thanh dương tính với PRRS. Từ những công bố đó, có thể thấy rằng, virus PRRS đã xuất hiện và lưu hành tại nước ta từ năm 1997 ( Hình 1.3. Tình hình dịch bệnh PRRS ở Việt Nam (năm 2007) Nguồn: Theo báo cáo của Cục Thú y (2007), trong nhiều năm qua có một tỷ lệ nhất định lợn giống có huyết thanh dương tính với PRRS. Tuy nhiên, sự bùng phát thành dịch và gây tổn thất lớn đáng báo động cho ngành chăn nuôi lợn Việt Nam thực sự mới bắt đầu từ tháng 3/2007 (Hình 1.3) + Ngày 12/3/2007, dịch bệnh trên đàn lợn đầu tiên xuất hiện tại tỉnh Hải Dương. Sau đó, do không quản lý được việc buôn bán, vận chuyển lợn ốm, dịch PRRS đã lây lan nhanh và phát triển mạnh tại 7 tỉnh thuộc vùng đồng bằng sông Hồng bao gồm: Hưng Yên, Quảng Ninh, Thái Bình, Bắc Ninh, Bắc Giang và Hải Phòng với 31.750 lợn mắc bệnh và số lợn chết lên tới 7.296 con. Sau hơn 1 tháng tích cực khống chế, dịch PRRS ở vùng này đã tạm thời được dập tắt. + Ngày 25/6/2007 dịch xuất hiện tại Quảng Nam, dịch bệnh đã lây sang Thừa Thiên Huế và Đà Nẵng với 33.433 con lợn mắc bệnh và 7.127 con chết. + Ngày 13/7/2007, tại tỉnh Long An, đã xác định có dịch bệnh PRRS với 91 lợn mắc bệnh và 8 con chết, địa phương đã tiêu huỷ 34 con. Điều này cho thấy bệnh đã xuất hiện ở đồng bằng sông Cửu Long (Hình 1.3). Dịch Tai xanh xảy ra trong năm 2008 chia thành 2 đợt chính tại 956 xã, phường thuộc 103 huyện của 26 tỉnh, thành phố làm 309.586 lợn mắc bệnh, 300.906 lợn phải tiêu huỷ ( Từ cuối tháng 3 đến đầu tháng 7/2008 dịch xảy ra tại 17 tỉnh, thành phố. + Ngày 28/03/2008 dịch xuất hiện tại Thanh Hoá và Hà Tĩnh. Tỉnh Thanh Hoá có 193.003 lợn bị ốm, tiêu huỷ 192.946 con, Hà Tĩnh với 30.020 con bị ốm, tiêu huỷ 30.015 con. Riêng tỉnh Thanh Hoá chiếm 73% tổng số lợn ốm và tiêu huỷ trong cả đợt dịch trên toàn quốc. + Ngày 01/04/2008, tại Nghệ An đã xuất hiện dịch PRRS với 8.455 con mắc bệnh và tiêu huỷ 8.455 con. + Ngày 11/04/2008 dịch tái xuất hiện tại Thừa Thiên - Huế làm 16.389 lợn ốm, tiêu huỷ 16.389 con. + Ngày 14/04/2008 tại Thái Bình đã xác định có dịch và có 9.447 lợn mắc bệnh, tiêu huỷ 9.447 con. + Ngày 18/04/2008 dịch xuất hiện tại Nam Định với số lợn mắc bệnh là 4.784 con và có 4.768 con bị tiêu huỷ. + Trong tháng 4/2008 dịch xảy ở Thái Nguyên (17/04), Ninh Bình (19/04), Vĩnh Long (21/04). + Tháng 5 đến tháng 7/2008 dịch xảy ra ở các tỉnh: Bình Phước, Bạc Liêu, Sóc Trăng, Lào Cai, Bà Rịa – Vũng Tàu, Quảng Ninh. Sau đợt dịch này, tổng số lợn ốm là 271.215 con, số tiêu huỷ là 261.854 con [3]. Năm 2009, từ đầu năm đến ngày 24/06 đã có 6 tỉnh phát dịch là: Quảng Ninh, Quảng Nam, Hưng Yên, Gia Lai, Bạc Liêu, Bắc Giang ( + Ngày 16/02/2009 dịch xuất hiện tại Quảng Ninh với 303 lợn mắc bệnh, 8 con chết, tiêu huỷ 380 con. + Ngày 19/02/2009 dịch xảy ra tại Quảng Nam làm cho 3140 lợn ốm và tiêu huỷ 3026 con. + Ngày 25/02/2009 tại Bạc Liêu dịch PRRS xuất hiện với 13 lợn ốm và tiêu huỷ 13 con. + Ngày 03/04/2009 dịch xuất hiện tại Gia Lai với 40 con lợn bị mắc, số tiêu huỷ là 13 con. + Ngày 24/04/2009 dịch xảy ra tại Hưng Yên với 212 lợn mắc bệnh, tiêu huỷ 212 con. + Ngày 11/05/2009 tại Bắc Giang xuất hiện dịch với 605 con mắc bệnh, có 91 con chết. Dịch vẫn đang tiếp tục phát triển mạnh và có thể sẽ có những diễn biến phức tạp và có nguy cơ bùng phát ở tất cả các địa phương trong cả nước. Dịch bệnh PRRS ở lợn không chỉ gây tổn thất cho nền kinh tế xã hội ở nhiều địa phương trong cả nước, mà còn gây tâm lý hoang mang trong nhân dân và ngành chăn nuôi truyền thống có tính chất nhỏ lẻ không tập trung của nước ta. 1.1.4 Triệu chứng lâm sàng và bệnh tích 1.1.4.1 Triệu chứng Lợn mắc hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp thường có những đặc trưng như: lợn nái có chửa thường bị sảy thai hoặc thai chết lưu; lợn ốm thường sốt cao đến 40 - 420C, các phần da mỏng thường bị đỏ lên, lợn bị nhiễm bệnh có lúc bị táo bón có lúc bị tiêu chảy, lợn ốm viêm phổi nặng đặc biệt là lợn con cai sữa, do đó những biểu hiện ở đường hô hấp thường rất rõ nét. ( Triệu chứng lâm sàng trên lợn ở các giai đoạn và lứa tuổi (Hình 1.4): + Lợn nái giai đoạn cai sữa: Trong tháng đầu tiên khi bị nhiễm virus, lợn biếng ăn 7 - 14 ngày (10 - 15% đàn), sốt 39 - 400C, sảy thai thường giai đoạn cuối (1 - 6%), tai chuyển màu xanh trong khoảng thời gian ngắn (2%), đẻ non (10 - 15%), động đực giả (3 - 5 tuần sau khi thụ tinh), đình dục hoặc chậm động dục trở lại sau khi đẻ, ho có dấu hiệu viêm phổi. + Lợn nái giai đoạn đẻ và nuôi con: Biếng ăn uống, mất sữa và viêm vú, đẻ non 2 – 3 ngày, da biến màu, lờ đờ hoặc hôn mê, thai chết lưu (10 - 15% thai chết trong 3 - 4 tuần cuối của thai kỳ), lợn con yếu, chết ngay sau khi sinh (30%), tai có màu xanh và tồn tại trong vài giờ. + Lợn đực giống: Bỏ ăn, sốt, đờ đẫn hoặc hôn mê, giảm hưng phấn hoặc mất tính dục, lượng tinh dịch ít, chất lượng tinh kém và cho lợn con sinh ra nhỏ. + Lợn con theo mẹ: Thể trạng gầy yếu, nhanh chóng rơi vào trạng thái tụt đường huyết do không bú được, mắt có dử màu nâu, trên da có vết phồng rộp, tiêu chảy nhiều, giảm số lợn con sống sót, tăng nguy cơ mắc các bệnh về hô hấp, chân choãi ra, đi run rẩy… + Lợn con cai sữa và lợn choai: Biếng ăn, ho nhẹ, lông xơ xác,... Ngoài ra, trong trường hợp ghép với bệnh khác có thể thấy viêm phổi lan toả cấp tính, thể trạng gầy yếu, da xanh, tiêu chảy, ho nhẹ, hắt hơi, chảy nước mắt, thở nhanh, tỷ lệ chết có thể tới 15%. 1.1.4.2 Bệnh tích Viêm phổi hoại tử và thâm nhiễm đặc trưng bởi những đám chắc, đặc (hiện tượng nhục hoá) trên các thuỳ phổi. Thuỳ bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ và đặc chắc. Trên mặt cắt ngang của thuỳ bệnh lồi ra, khô. Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hoá mủ ở mặt dưới thuỳ đỉnh (Hình 1.5). Về mô bệnh học, thường thấy dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm, trong phế nang chứa đầy dịch viêm và đại thực bào, một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân. Một bệnh tích đặc trưng nữa là sự thâm nhiễm của tế bào phế nang loại II (pneumocyte) làm cho phế nang nhăn lại, thường bắt gặp đại thực bào bị phân huỷ trong phế nang. * Một số bệnh tích khác: + Thận: xuất huyết lấm tấm như đầu đinh ghim. + Não: xung huyết. + Hạch hầu họng, hạch amidan: sưng, xung huyết. + Lách: sưng, nhồi huyết. + Hạch màng treo ruột: xuất huyết. + Van hồi manh tràng: loét nặng. 1.2 Đặc tính sinh học virus PRRS 1.2.1 Hình thái và cấu trúc của virus PRRS Vi._.rus gây nên Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales chứa duy nhất hệ gen RNA có cấu trúc sợi dương [20]. Phân loại PRRS trong Ngân hàng gen theo trật tự như sau: Viruses; ssRNA viruses; ssRNA positive-strDNA viruses, no DNA stage; Nidovirales; Arteriviridae; Arterivirus; Porcine respiratory And reproductive syndrome virus ( Hạt virus hình khối đa diện có cấu trúc đối xứng 20 mặt, đường kính 45-55 nm, chứa nhân nucleocapsid có đường kính khoảng 30 – 35 nm và được bao bọc ngoài cùng bởi một lớp vỏ bọc dính chặt với các cấu trúc bề mặt của virus giống như tổ ong (Hình 1.6). 1.2.2 Cấu trúc phân tử hệ gen của virus PRRS Hệ gen của virus PRRS có độ dài trên 15 kb [45], là phân tử RNA sợi đơn dương liên tục, được bắt đầu bằng vùng không mã hóa (đầu 5’) và kết thúc bằng vùng không mã hoá (đầu 3’) trong đó có chuỗi poly A, mã hoá cho 7 khung đọc mở (ORFs) lồng vào nhau, cấu trúc tương tự các ORFs của Coronavirus [20]. Khi phân tích hệ gen PRRS người ta thấy rằng các khung đọc mở (ORFs) lồng vào nhau từ 1-253 bp. Ví dụ: khung đọc mở 4 (ORF4) và 5 (ORF5) lồng vào nhau bởi 1 bp, ORF3 và ORF4 lồng vào nhau bởi 253 bp. Như vậy, virus sử dụng một phần gen chung để mã hóa cho các protein khác nhau [44] (Hình 1.7). Bảng thống kê một số đặc điểm hệ gen và gen của một số chủng virus PRRS đại diện trên thế giới. Tổng độ dài của hệ gen của chủng virus Lelystad phân lập tại Hà Lan (số đăng ký: M96262) thuộc genotype 1, đại diện dòng châu Âu là 15111 bp, trong đó phần mã hoá sử dụng cho 7 khung đọc mở là 14763 bp [44], [45]. Bảng 1.2. Thống kê đặc điểm hệ gen của các chủng đại diện các dòng PRRS trên thế giới Hệ gen 5’ UTR Phần mã hoá ORF 1a ORF 1b ORF 2 ORF 3 ORF 4 ORF 5 ORF 6 ORF 7 3’ UTR Lelystad (M96262) (Hà Lan) 15111 221 14763 7191 4392 750 798 552 606 522 387 127 VR2332 (AY150564) (Mỹ) 15451 190 15071 7512 4374 771 765 537 603 525 372 190 GD* (EU109503) (Trung Quốc) 15353 189 14981 7422 4383 771 765 537 603 525 372 183 Ghi chú: độ dài gen và hệ gen tính bằng bp; 5’UTR và 3’UTR: phần không mã hóa đầu và cuối hệ gen; Lelystad: chủng đại diện dòng châu Âu (genotype I); VR-2332: chủng đại diện dòng Bắc Mỹ (genotype II); GD*: chủng thuộc dòng Bắc Mỹ (genotype II) đại diện cho PRRV độc lực rất cao phát hiện gần đây ở Trung Quốc. Tổng độ dài của hệ gen của chủng virus VR2332 phân lập tại Mỹ (số đăng ký: AY150564) thuộc genotype II, đại diện dòng Bắc Mỹ là 15451 bp, trong đó phần mã hoá sử dụng cho 7 khung đọc mở là 15071 bp [49]. Hệ gen của virus PRRS chủng GD (Quảng Đông) (số đăng ký: EU109503) đại diện cho một nhóm PRRS mới phân lập gần đây có độc lực rất cao ở Trung Quốc, cũng thuộc genotype II, dòng Bắc Mỹ, có độ dài là 15353 bp, trong đó phần mã hoá sử dụng cho 7 khung đọc mở là 14981 bp [62]. Độ dài các gen hoàn toàn khác nhau giữa PRRS dòng châu Âu và Bắc Mỹ phản ánh chênh lệch di truyền và mức độ tương đồng kháng nguyên giữa các chủng thuộc 2 dòng này. Trong cùng một dòng Bắc Mỹ, các gen mã hoá cho các protein chức năng (ORF2-7) có độ dài gần như nhau, nhưng có độ khác nhau về kích thước và thành phần gen mã hoá cho RNA-polymerase (ORF1a và ORF1b) (Bảng 1.2). Đặc điểm gen và hệ gen này là yếu tố ảnh hưởng đến độc lực của virus PRRS mới xuất hiện gần đây ở Trung Quốc từ cuối năm 2006 [62]; [64] và có lẽ xâm nhập vào Việt Nam đầu năm 2007 với đặc tính hoàn toàn đồng nhất về di truyền và gây bệnh [6]. Sự xuất hiện và lan toả của PRRS độc lực cao ở Trung Quốc, Việt Nam và Nam Á, và đa nhiễm trộn lẫn các dòng PRRS trên thế giới sẽ làm phức tạp hoá dịch tễ học và vaccine phòng chống [64]. Hình 1.7. Cấu trúc hệ gen của virus PRRS Nguồn: Cấu trúc hệ gen của PRRSV bao gồm 7 khung đọc mở (ORFs) đó là ORF1, ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6 và ORF7. Trong đó, ORF1 được chia làm hai phần bao gồm ORF1a và ORF1b, chiếm tới khoảng 80% tổng số độ dài hệ gen của virus, chịu trách nhiệm mã hoá RNA thông tin tổng hợp các enzyme RNA polymerase của virus [44]. Đầu 3’ của ORF1a được lồng vào đầu 5’ của ORF1b bởi 16 nucleotide. Tại đầu cuối ORF1a có chuỗi gen gồm 7 nucleotide (UUUAAAC) tạo thành một vòm (loop), và cấu trúc này được coi là rất cần thiết cho quá trình sao chép và biểu hiện gen của ORF1b theo cơ chế chuyển đổi khung ribosome [44]. Hình 1.8. Sơ đồ hệ gen của virus PRRS Như vậy, chuỗi gen của ORF1a ngoài nhiệm vụ tổng hợp nên protein còn chịu trách nhiệm là chuỗi gen điều hoà quá trình tổng hợp của ORF1b. ORF2, ORF3, ORF4, ORF5, ORF6, ORF7 là các phần gen tạo nên khung đọc mở mã hoá các protein tương ứng, đó là GP2 (glycoprotein 2), GP3, GP4, GP5 (hay còn gọi là glycoprotein vỏ (E, envelope)), protein màng M (membrane protein), và protein cấu trúc capsid N (nucleocapsid protein) [44]. Các protein được glycosyl hóa là: GP2, GP3, GP4, GP5, và các protein không được glycosyl hóa là M và N (Hình 1.9). Glycosyl hoá (glycosylation) là hiện tượng gắn thêm hydratcarbon vào một vị trí amino acid xác định là Asparagine (N) theo quy luật N-(X)-S/T, trong đó N: Asparagine, X: bất kỳ (trừ Proline), S/T: hoặc Serine hoặc Threonine [16]. Chức năng của các ORFs là: - ORF1a và 1b mã hoá protein enzyme RNA polymerase có chức năng xúc tác sao chép và tổng hợp như các RNA polymerase của các virus RNA khác. - ORF2 đến 6 mã hoá cho các protein kết hợp với màng của virus, trong đó đã xác định: + Envelope glycoprotein (E, ORF5) có trọng lượng phân tử từ 24-25 kDa là protein liên kết vỏ bọc kết hợp glycogen. Các kháng thể trung hoà chủ yếu liên kết trực tiếp với các epitope có trên bề mặt của protein GP5, do vậy virus có thể bị trung hoà [47]. Những epitope trung hoà này nằm sát ngay cạnh các vị trí glycosyl hoá. Người ta cũng thấy rằng phân tử GP4 và protein M cũng chứa các epitope trung hoà [44] và phân tử GP3 cũng chứa một epitope trung hoà. Mặc dù vậy, những protein này có tác dụng kích thích miễn dịch và sinh học nhỏ hơn đáng kể so với protein GP5 [19]. + Membrane protein: (M, ORF6) có khối lượng phân tử khoảng 18-19 kDa, không được glycosyl hoá, là protein liên kết vỏ bọc, mang tính kháng nguyên và có tính bảo tồn cao nhất. Protein M có cấu trúc tương tự như cấu trúc protein M của các virus thuộc nhóm Coronavirus. Protein M hình thành cầu nối disunfit với glycoprotein 5 (GP5) cấu thành một phần virus và được tìm thấy trong tế bào nhiễm nhưng cầu nối sunfit này không cấu thành nên hạt virus [44]. + Nucleocapsid protein (N, ORF7) có khối lượng phân tử khoảng 14-15 kDa, đây là protein vỏ bọc nhân, có tính kháng nguyên cao. Protein N chiếm khoảng 20-40% protein của hạt virus. Hình 1.9. Mô phỏng vị trí các protein của PRRSV trong virion Nguồn: Trong các tế bào bị nhiễm virus PRRS, có tất cả 6 RNA thông tin (RNAtt) (mRNA) được tổng hợp, tất cả 6 RNAtt đều chứa trình tự sắp xếp chung nhận được từ đầu 5' của hệ gen RNA trong gen và tất cả chúng đều có gắn thêm đuôi 3' polyA. 1.2.3 Khả năng gây bệnh và sức đề kháng 1.2.3.1 Khả năng gây bệnh PRRSV tồn tại dưới 2 dạng: + Dạng cổ điển: có độc lực thấp, lợn mắc bệnh ở dạng này có tỷ lệ chết thấp, chỉ từ 1 – 5% trong tổng đàn. + Dạng biến thể độc lực cao: gây nhiễm và chết nhiều lợn. Người và các động vật khác không mắc bệnh khi nhiễm PRRS, do PRRS có tính đặc hiệu gây bệnh theo loài rất cao. Tuy nhiên, trong các loài thuỷ cầm chân màng và vịt trời (mallard duck) lại mẫn cảm với virus. PRRSV có thể nhân lên ở các loài động vật này, và đây là nguồn reo rắc mầm bệnh trên diện rộng và rất khó khống chế. Cơ chế chính xác của sự sao chép và dịch mã của PRRSV chưa được biết rõ, mặc dù vậy nó được cho rằng có thể tương tự như quá trình phiên mã và dịch mã của Coronavirus. 1.2.3.2 Sức đề kháng PRRSV có thể tồn tại 1 năm trong nhiệt độ lạnh từ -200C đến -700C; trong điều kiện 40C, virus có thể sống 1 tháng; với nhiệt độ cao, cũng như các virus khác, PRRSV đề kháng kém: ở 370C chịu được 48 giờ, 560C bị giết sau 1 giờ. Với các hoá chất sát trùng thông thường và môi trường có pH acid, virus dễ dàng bị tiêu diệt. Ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại vô hoạt virus nhanh chóng [8]. 1.2.4 Đáp ứng miễn dịch của vật chủ với PSSRV 1.2.4.1 Đặc trưng đáp ứng miễn dịch dịch thể với PRRS Thông thường khi nhiễm virus, cơ thể động vật chống lại bằng cách tiết interferon (INF), các cytokine gây nhiễm để cản trở sự nhân lên và hạn chế sự lan tràn của virus. Khi con lợn nhiễm virus PRRS, hệ thống miễn dịch không chống virus tại chỗ nhiễm, không tiết ra INFα và các cytokine gây nhiễm. Đáp ứng miễn dịch tự nhiên yếu đối với virus PRRS dẫn đến kích thích không hoàn chỉnh đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Bên cạnh đó giảm hoặc triệt tiêu đáp ứng miễn dịch tự nhiên chống virus có thể tăng nguy cơ nhiễm trùng kế phát. PRRSV không kích thích cơ thể sản sinh các cytokine gây nhiễm, các cytokine này có vai trò rất quan trọng trong đáp ứng miễn dịch khởi phát đối với các virus gây bệnh đường hô hấp. Kháng thể dịch thể, đặc biệt là kháng thể trung hoà (KTTH) có vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch chống lại PRRS. Các kháng thể lưu hành chống lại PRRSV được phát hiện vào các ngày 5-7 ở lợn sau nhiễm và có sự biến đổi trong huyết thanh vào ngày 14 sau nhiễm, sau đó giảm xuống tới mức không phát hiện được vào ngày 42 sau nhiễm. Nồng độ IgG đạt giá trị tối đa vào khoảng các ngày 21-49 sau nhiễm với các kháng thể trung hoà. Những kháng thể xuất hiện sớm nhất là kháng thể trực tiếp kháng lại protein nhân (N), tiếp theo là protein M, sau đến glycoprotein 5 (GP5) [47]. Một protein không cấu trúc 2 (NSp2) chứa một cụm epitope B không trung hoà và chúng là những protein miễn dịch quan trọng nhất của PRRSV [50]. Hầu hết các test chẩn đoán chủ yếu phát hiện kháng thể kháng protein N. Những kháng thể này xuất hiện trong tuần đầu tiên sau nhiễm trùng và tồn tại trong vài tháng, nhưng không có khả năng bảo vệ cơ thể bị nhiễm virus. Kháng thể trung hoà được phát hiện ổn định vào ngày thứ 28 sau nhiễm hoặc muộn hơn [63], đóng vai trò quan trọng trong đáp ứng miễn dịch với PRRSV, và có sự khác nhau trong nhiễm trùng tự nhiên so với tiêm phòng vaccine [26]. Sự xuất hiện sớm của các kháng thể không trung hoà có thể tác động đáng kể đến sự tiến triển bệnh của PRRSV. Ngoài ra kháng thể không trung hoà làm tăng sự lây nhiễm của virus trong các túi thực bào của các đại thực bào, do tăng quá trình đáp ứng phụ thuộc kháng thể. Đáp ứng miễn dịch dịch thể của các kháng thể không trung hoà có thể tác động mạnh mẽ tới PRRSV thông qua việc thoát vỏ (“cởi áo”) của virus và làm tăng sự bắt giữ các tiểu phần virus trong các tế bào đại thực bào. 1.2.4.2 Đặc trưng đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào của PRRS Đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào (CMI, cell mediated immunity) cũng vô cùng quan trọng trong miễn dịch chống lại PRRSV. Virus PRRS ngăn cản sự trình diện kháng nguyên và hoạt hoá tế bào lympho T. PRRSV làm giảm đáp ứng miễn dịch tự nhiên bằng cách thay đổi hình dạng của tế bào thực bào và giảm sự xuất hiện phân tử trình diện kháng nguyên đi kèm trên bề mặt tế bào đại thực bào trong việc trình diện kháng nguyên. Những cá thể lợn đang bình phục có sự đáp ứng tăng sinh mạnh mẽ các tế bào lympho, hiện tượng này không được phát hiện trong 4 tuần sau nhiễm trùng và cùng với đáp ứng với kháng thể trung hoà [18]. Các đáp ứng có vai trò cytokine, chủ yếu là interferon (IFN-c) và IL-2 nhưng vai trò interferon kéo dài ít hơn so với interleukin [40]. Sự điều biến và lẩn tránh đáp ứng miễn dịch của PRRSV Những đặc điểm bất thường của phản ứng thích ứng miễn dịch đối với PRRSV cho thấy virus có khả năng điều biến mạnh mẽ chống lại đáp ứng miễn dịch của vật chủ. + Vai trò interferon: PRRSV tăng nhạy cảm với tác động của IFN type I, chúng có thể đã kháng lại với những phản ứng của IFN-a, [55]; [37]. Các chủng PRRSV khác nhau có khả năng tác động khác nhau không chỉ với IFN-a mà còn cả với TNF-a; IL-10 và IL-2, trong túi thực bào của các đại thực bào và tế bào tua (dendritic cells). Sự giảm tiết IFN-a được gây ra do tác động tăng trưởng của một hiệu ứng đáp ứng miễn dịch của tế bào T hỗ trợ type 1. + Vai trò Interleukin: IL-10 có vai trò quan trọng trong điều hoà đáp ứng miễn dịch với PRRSV. Sau nhiễm trùng với PRRSV, hiệu giá của RNAtt của IL-10 đã tăng lên ở các tế bào phế nang phổi của lợn [57] và trong dịch rửa phế quản [60]; [26]. + Vai trò “tự nguyện chết” (apoptosis): Trong sự nhiễm trùng của lợn với PRRSV, các tế bào chết do cơ chế apoptosis đã được tìm thấy rải rác khắp nơi trong các mô bị nhiễm trùng (bao gồm: phổi, tinh hoàn và các hạch lympho) [24]. Tuy nhiên, PRRSV gây ra hiện tượng apoptosis trực tiếp (trong tế bào nhiễm) hay gián tiếp (thông qua các tế bào bên cạnh) vẫn chưa được hiểu rõ. Phần lớn các tế bào apoptosis đã không bị nhiễm với PRRSV, như vậy rất có thể tế bào chết do apoptosis thông qua tín hiệu chuyển tải [46]. PRRSV có khả năng trực tiếp gây ra apoptosis các tế bào đã tự nguyện chết một cách chủ động ở các con lợn bị nhiễm trùng, hoặc gián tiếp thông qua TNF-α được giải phóng từ các đại thực bào sau nhiễm PRRSV, tác động gây ra apoptosis trong các tế bào không bị nhiễm trùng bên cạnh [46]. Các tế bào “tự nguyện chết” có thể gián tiếp thông qua con đường phụ thuộc AIF (apoptosis inducing factor), xảy ra thứ phát bởi các yếu tố kích ứng apoptosis do nhiễm trùng hoặc bởi các tế bào bên cạnh, chứ không phải là kết quả “đặc trưng” trực tiếp của apoptosis ở tế bào bị nhiễm [46]. 1.2.5 Vật chủ và phương thức truyền lây - Vật chủ: PRRSV chỉ gây bệnh cho lợn, lợn ở tất cả các lứa tuổi đều cảm nhiễm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả. Ngoài ra, lợn rừng cũng mắc bệnh và đây có thể được coi là nguồn dịch thiên nhiên và phát tán bệnh. Theo Tổ chức Nông lương Thế giới (FAO), PRRS được xác định không lây truyền và gây bệnh sang gia súc khác và con người [52]. - Đường truyền lây: Virus PRRS có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng và phát tán ra môi trường; tinh dịch của lợn đực giống nhiễm virus cũng là nguồn lây lan bệnh. Ở lợn nái mang thai, virus có thể từ mẹ xâm nhiễm sang bào thai và gây bệnh. Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng có thể đào thải virus ra môi trường trong vòng 6 tháng [8]. Bệnh truyền chủ yếu theo đường không khí, có thể lây trực tiếp thông qua sự tiếp xúc giữa lợn ốm, lợn mang trùng với lợn khoẻ và cũng có thể lây gián tiếp qua các nhân tố trung gian (không khí, đất, nước, thức ăn,…) bị nhiễm virus, virus có khả năng phát tán rộng và dễ gây nhiễm qua đường hô hấp [23]. 1.2.6 Cơ chế sinh bệnh Sau khi xâm nhập vào cơ thể, đích tấn công của virus là đại thực bào, đặc biệt đại thực bào ở phế nang và phế quản. Đại thực bào là loại tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus, vì thế virus hấp thụ và thực hiện quá trình nhân lên chỉ trong tế bào này và phá huỷ nó. Có một tỷ lệ lớn tế bào đại thực bào trong nang phổi bị virus xâm nhiễm rất sớm [52]. Lúc đầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào này cung cấp nguyên liệu cho quá trình sao chép của virus, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày virus sẽ giết chết chúng, các virion được giải phóng và ồ ạt xâm nhiễm sang các tế bào khác. Ở giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệu giá kháng thể chống lại các loại virus và vi khuẩn không liên quan khác trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch. Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn [52]. Trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, đại thực bào là tế bào có thẩm quyền miễn dịch, đóng vai trò vô cùng quan trọng trong đáp ứng miễn dịch cả không đặc hiệu và đặc hiệu, đây là loại tế bào trình diện kháng nguyên thiết yếu, mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu. Khi tế bào đại thực bào bị virus phá huỷ, các phản ứng miễn dịch không xảy ra được, lợn nhiễm bệnh rơi vào trạng thái suy giảm miễn dịch và dễ dàng mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát [27]. Hậu quả suy giảm miễn dịch còn thể hiện ở góc độ không hoặc giảm hiệu lực của các vaccine khác ở lợn như vaccine dịch tả, tụ huyết trùng,... Điều này có thể thấy rõ ở những đàn lợn vỗ béo chuẩn bị giết thịt, khi bị nhiễm PRRSV sẽ có sự tăng đột biến về tỷ lệ viêm phổi thứ (kế) phát do những vi khuẩn vốn sẵn có trong đường hô hấp [52] (Hình 1.9). Viêm phổi làm thiếu oxy nên gây rối loạn chuyển hóa của thai, thai bị suy dinh dưỡng và gây chết thai, sảy thai. Lợn chửa kỳ cuối thì nhu cầu oxy tăng cao vì phải nuôi thai, ở thời kỳ cuối thai tăng trưởng rất nhanh nên nhu cầu về oxy tăng gấp bội, vì vậy lượng thiếu hụt oxy càng nghiêm trọng, nên thai hay sảy vào kỳ cuối. Sau sảy thai tế bào nội mạc tử cung bị thoái hóa, hoại tử nên làm chậm các quá trình sinh lý khác. Tuỳ theo đối tượng lợn nhiễm bệnh mà hậu quả gây ra có sự khác nhau. Hầu hết lợn con và lợn nái đang trong thời kỳ mang thai đều bị chết do nhiễm khuẩn kế phát nặng sau nhiễm PRRSV. Tuy nhiên, để ngăn chặn nguồn bệnh và cắt đường lây truyền của dịch, người ta thường tiêu huỷ 100% lợn bệnh, nếu dịch bệnh xảy ra trên diện rộng sẽ gây thiệt hại nặng nề về kinh tế cho người chăn nuôi, môi trường và xã hội. 1.2.7 Chẩn đoán 1.2.7.1 Chẩn đoán lâm sàng Chẩn đoán dựa vào 2 nhóm triệu chứng: + Triệu chứng đường sinh sản: chủ yếu đối với lợn nái. Vào giai đoạn đầu của dịch PRRS, có thể thấy hiện tượng sảy thai ở giai đoạn cuối thời kỳ mang thai và đẻ non, có các thai yếu, thai chết lưu, đồng thời có thai gỗ, lợn con yếu, chết trước khi cai sữa. + Triệu chứng đường hô hấp: Chủ yếu dựa vào biểu hiện viêm phổi ở lợn con và lợn vỗ béo [10]. 1.2.7.2 Chẩn đoán bằng phương pháp giải phẫu bệnh + Đối với lợn con, lợn vỗ béo, lợn xuất chuồng: Bệnh tích khi mổ khám thấy phổi rắn, chắc và có vùng xám và hồng. + Trên tiêu bản vi thể: Viêm phổi kẽ tăng sinh đa điểm hoặc lan tràn làm vách phế nang dày lên, viêm não giữa và giảm số lượng tế bào lympho trong các tổ chức lympho. + Đối với thai sảy và thai chết lưu: Không có bệnh tích đại thể hoặc vi thể [10]. 1.2.7.3 Phát hiện virus Lấy bệnh phẩm là huyết thanh, huyết tương, bạch cầu, phổi, hạch Amidan, tổ chức Lympho, dịch báng của thai chết lưu hoặc lợn chết ngay sau khi sinh để phát hiện virus. Có thể áp dụng một số kỹ thuật sau đây để phát hiện virus: - Phân lập virus trên một số loại tế bào: Tế bào phế nang của lợn, tế bào MA-104, tế bào MARC-145, CL-2621 và CL-11171. - Phương pháp bệnh lý miễn dịch. - Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên. - Phương pháp sinh học phân tử. + Phương pháp nhân gen (RT-PCR). + Phương pháp lai phân tử tại chỗ (in situ hybridization) [10]. Phản ứng RT-PCR có độ chính xác cao đáp ứng được yêu cầu phát hiện sớm và chính xác virus PRRS trên đàn lợn. Trong quá trình chẩn đoán, việc ứng dụng và hoàn thiện quy trình kỹ thuật RT-PCR góp phần xây dựng chiến lược kiểm soát bệnh trong ngành chăn nuôi lợn Việt Nam [2]. Phương pháp sinh học phân tử có độ nhạy và độ chính xác cao đang được ứng dụng rộng rãi trong chẩn đoán xác định bệnh dịch, và cung cấp các dữ liệu di truyền học của virus PRRS giúp cho việc nghiên cứu và điều chế vaccine phòng bệnh thế hệ mới. 1.2.7.4 Chẩn đoán huyết thanh học Có thể phát hiện kháng thể kháng virus PRRS trong huyết thanh, dịch của cơ thể hoặc từ thai chết lưu bằng một số phương pháp huyết thanh học bao gồm phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp, phương pháp miễn dịch enzyme, ELISA và phản ứng trung hòa huyết thanh. Trong đó, ELISA là phương pháp tiện lợi hơn cả. Thuận lợi của phương pháp này là có thể chẩn đoán một số lượng lớn các mẫu huyết thanh và các kết quả thu được của các phòng thí nghiệm (khi chẩn đoán huyết thanh cùng lúc) là tương đối đồng nhất [10]. Tuy nhiên, việc chọn lọc kháng nguyên chẩn đoán là hết sức quan trọng do PRRS là nhóm virus đa dòng, đa chủng. 1.2.8 Điều trị và phòng chống 1.2.8.1 Điều trị Không có thuốc điều trị đặc hiệu với PRRSV, chủ yếu chỉ điều trị triệu chứng. Hầu hết các phương pháp điều trị chủ yếu nhằm ngăn chặn và điều trị các nhiễm khuẩn thứ phát. Chống nhiễm bệnh kế phát có thể dùng kháng sinh có tác dụng với đường hô hấp như: Flofenicol, Lincomix S, Tylansulfa – G, Amoxicilin LA, Linco – spectin, Cephalosporin. Ngoài ra có thể sử dụng một số thuốc chống sảy thai dành cho nái mang thai như: Acid acetyl salicylique, Salicylate sodium,… 1.2.8.2 Phòng chống Thông thường biện pháp ngăn chặn quyết liệt và hữu hiệu nhất là tiêu huỷ đàn gia súc bị bệnh, vệ sinh và khử trùng chuồng trại,… nhằm tiêu huỷ mầm bệnh và ngăn chặn nguyên nhân phát tán bệnh ra diện rộng. Hiệu quả của vaccine bảo vệ trước nhiễm trùng đem lại có thể phòng ngừa bệnh lý lâm sàng và là công cụ chính trong việc tiêu diệt PRRSV. Việc tiêm phòng bằng vaccine được coi là phương pháp hữu hiệu nhất để kiểm soát bệnh dịch hiện nay. Tuy nhiên, do PRRS đa dòng đa chủng, có độ đồng nhất kháng nguyên không cao, nên vaccine nào phù hợp là vấn đề và giá cả vaccine quá cao đối với người chăn nuôi Việt Nam (thấp nhất là 100.000 VNĐ/liều, đối với vaccine nhập từ Trung Quốc). Thời gian tạo ra miễn dịch bảo hộ phụ thuộc vào các chủng virus vaccine. Đặc biệt ở Việt Nam hiện nay, do chưa xác định được chính xác chủng virus gây bệnh nên việc tiêm phòng đạt kết quả không cao. Hiện tại, vaccine phòng PRRSV đã được Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn cho phép nhập vào Việt Nam để phòng bệnh cho lợn ( Có 2 loại vaccine đang được sử dụng ở các địa phương: 1. Vaccine phòng PRRS BSL – PS100 : Là loại vaccine virus PRRS sống nhược độc dạng đông khô có nguồn gốc từ chủng JKL-100 thuộc dòng Bắc Mỹ. 2. Vaccine phòng PRRS BSK-PS100: Là loại vaccine vô hoạt chứa chủng virus PRRS dòng châu Âu. Vaccine an toàn và gây miễn dịch tốt. Công nghệ sinh học hiện nay cho phép tách chiết các hợp phần kháng nguyên từ tế bào nuôi cấy có một vài bước đặc biệt so với quy trình sản xuất vaccine thông thường để gần như loại bỏ hết các tế bào nuôi cấy trong sản phẩm cuối cùng nhằm có một thành phẩm vaccine đạt độ tinh khiết kháng nguyên rất cao - đó là vaccine phòng PRRS trong tương lai. 1.3 Các kỹ thuật sinh học phân tử sử dụng trong nghiên cứu phân tích gen và hệ gen 1.3.1 Kỹ thuật PCR Phản ứng PCR được phát hiện vào giữa những năm 1980, là phương pháp hoàn toàn mới trong việc nghiên cứu, giúp chúng ta tạo ra một số lượng lớn các bản sao của đoạn DNA mong muốn. PCR là một phản ứng sinh hóa phụ thuộc nhiệt độ, sử dụng đặc điểm của quá trình sao chép DNA với sự tham gia của một loại enzyme DNA-polymerase chịu nhiệt, có hai đoạn ngắn làm mồi và dùng các đoạn DNA mạch đơn làm khuôn để tổng hợp nên sợi mới bổ sung với nó [5]. Trong kỹ thuật PCR, các đoạn mồi được chọn ở hai đầu đoạn DNA cần nhân lên, sao cho các sợi DNA tổng hợp mới được bắt đầu tại mỗi đoạn mồi và kéo dài về phía đoạn mồi nằm trên sợi kia, cho sản phẩm có độ dài nằm giữa hai đoạn mồi này. Như vậy, sau mỗi chu kỳ, các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên mỗi sợi DNA mới được tổng hợp. Hỗn hợp phản ứng được nâng nhiệt độ lên thích hợp cho các sợi ban đầu tách khỏi sợi mới tổng hợp, rồi các sợi này được dùng làm khuôn cho chu kỳ tiếp theo. Phản ứng PCR được tiến hành qua ba bước điều chỉnh nhiệt độ cho 1 chu kỳ (còn gọi là chu trình nhiệt của phản ứng) [5]. Bao gồm các giai đoạn: - Bung liên kết của DNA (denaturation). Thực hiện ở nhiệt độ 90oC đến 98oC (thường là 94oC) trong vài giây đến vài phút, làm gẫy các liên kết hydro của chuỗi xoắn kép DNA tạo ra các sợi DNA mạch đơn. - Mồi bám (annealing) hay còn gọi là ủ với mồi. Ngay sau giai đoạn bung liên kết nhiệt độ được hạ xuống 37 - 68oC, các đoạn mồi (oligopeptide - có độ dài từ 6-30 nucleotide) bám vào với các trình tự bổ sung tương ứng trên đoạn DNA sợi đơn làm khuôn được tạo ra ở trên tại điểm khởi đầu sao chép. - Tổng hợp hay còn gọi là kéo dài (extension). Nhiệt độ được nâng lên đến 68-720C (thường là 720C) trong vài chục giây đến vài chục phút, để tổng hợp các sợi DNA bổ sung - sản phẩm PCR dưới xúc tác của enzyme DNA-polymerase. Sau mỗi chu kỳ các điểm bám cho các đoạn mồi lại xuất hiện trên các sợi DNA mới, các sợi này được dùng làm khuôn cho các chu kỳ tiếp theo, đến chu kỳ cuối nhiệt độ được duy trì ở 720C/5-10 phút, để cho tất cả các đoạn DNA mới được tổng hợp xoắn lại hoàn toàn tạo nên sản phẩm PCR. Cuối cùng, duy trì nhiệt độ ở 40C để bảo quản sản phẩm. Kết quả, sau n chu kỳ của phản ứng, đoạn DNA ban đầu được “nhân lên” với số lượng rất lớn, theo lý thuyết sẽ có 2n bản sao các phân tử DNA mạch kép nằm ở giữa hai đoạn mồi. Ví dụ: sau 30 chu kỳ số lượng sản phẩm PCR sẽ là: 230=1.073.741.824 bản sao của một đoạn DNA ban đầu [5]. 1.3.2 Kỹ thuật RT-PCR Phản ứng RT-PCR thực chất là phản ứng nhân một đoạn giới hạn của khuôn RNA, theo nguyên lý của phản ứng PCR, bao gồm hai giai đoạn: giai đoạn thứ nhất là chuyển đổi RNA một sợi làm khuôn thành DNA 2 sợi; sau đó qua giai đoạn thứ hai, dùng DNA hai sợi này tiếp tục làm khuôn để thực hiện phản ứng PCR. Phản ứng biến đổi RNA hệ gen thành cDNA phải nhờ đến vai trò của enzyme phiên mã ngược. Do vậy giai đoạn này gọi là giai đoạn chuyển ngược (RT – reverse transcription). Khi đã có cDNA hai sợi làm khuôn, phản ứng tiếp theo là PCR và được thực hiện ba bước thay đổi nhiệt độ cho phù hợp mỗi chu kỳ. Tùy theo từng mục đích của việc thực hiện các phản ứng RT-PCR, có thể sử dụng RT-PCR một bước hoặc RT-PCR hai bước. Trong chẩn đoán virus PRRS hiện nay phương pháp RT-PCR một bước được đánh giá là phương pháp có độ nhạy cao, cho kết quả nhanh [4]. 1.3.3 Kỹ thuật tách dòng Phương pháp tách dòng là đưa đoạn DNA sản phẩm của PCR/RT-PCR vào trong hệ gen của một vòng DNA đã được thiết kế trước gọi là plasmid hay là vector dẫn truyền. Sau đó plasmid chứa DNA ngoại lai này sẽ chuyển nạp vào tế bào chủ thích ứng (thường là vi khuẩn E. coli rồi nuôi cấy với số lượng lớn). Sau khi chuyển nạp, tiến hành chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp theo cơ chế X-gal và cơ chế kháng sinh nhằm loại trừ những vi khuẩn không tái tổ hợp. Sau đó tách DNA plasmid chứa đoạn DNA của phản ứng PCR/RT-PCR nói trên. Thành phần thực hiện dòng hoá gồm: DNA ngoại lai (DNA của PCR/RT-PCR), vector dẫn truyền (plasmid mang), dòng tế bào chủ thích ứng. Cuối cùng kiểm tra xem đoạn DNA ngoại lai có được nối vào vector hay không bằng phản ứng cắt với enzyme giới hạn và tiến hành giải trình tự [4]. 1.3.4 Kỹ thuật giải trình tự Giải trình tự là quá trình xác lập và thu nhận thành phần nucleotide của một phân đoạn DNA cần nghiên cứu. Sử dụng mồi đơn và các dideoxynucleotide (ddNTP), kết hợp ba bước của một phản ứng, bao gồm ba giai đoạn: bung liên kết, bám mồi và tổng hợp sợi đơn nucleotide. Đối với DNA plasmid tái tổ hợp, giải trình tự được tiến hành với mồi xuôi hoặc mồi ngược bám vào thành phần vector ở hai đầu DNA ngoại lai. Giải trình tự sản phẩm tách dòng được tiến hành trên máy tự động, trong đó có loại mới như ABI 3100 Avant Gentic Analyzer (Mỹ). Trình tự chuỗi nucleotide được xử lý bằng các phần mềm của máy tính [4]. So sánh đối chiếu và xử lý số liệu các chuỗi thu nhận được với các chuỗi có trong Ngân hàng gen quốc tế (GenBank) bằng chương trình GENEDOC2.5. Sau khi thu nhận trình tự các chủng của virus PRRS được chọn, chúng ta sử dụng chương trình MEGA4.0 để so sánh và lập sơ đồ quan hệ phả hệ giữa các chủng. 1.4 Xử lý số liệu sử dụng các phần mềm tin – sinh học 1.4.1 Nguyên tắc chung Trong quá trình tái tạo, các chuỗi DNA luôn luôn có thành phần nucleotide giống với chuỗi khuôn ban đầu. Nếu có sai khác, thì sai khác đó có thể là do lỗi ngẫu nhiên của sao chép tổng hợp hoặc do áp lực di truyền của tự nhiên mà hình thành [32]. Những nucleotide sinh ra thế hệ sau khác với thế hệ ban đầu thường được gọi là các đột biến, đó chính là nguồn gốc của sự đa dạng và sự đổi mới trong tiến hóa [7]. Trình tự DNA bị ảnh hưởng do đột biến có thể là ở trong một gen, hay trong một vùng DNA hoặc toàn bộ hệ gen; có thể ở vùng DNA mã hóa cho protein hoặc ở vùng không mã hóa. Ví dụ, các đột biến có thể tác động lên một nucleotide (các đột biến điểm), hoặc một số nucleotide cạnh nhau (các đột biến đoạn). Các loại hình đột biến có thể phân loại như sau: - Đột biến thay thế (substitution mutation), thay thế một nucleotide này bằng một nucleotide khác hay còn gọi là đột biến điểm (point-mutation). - Đột biến tái tổ hợp (recombination) là sự trao đổi các nucleotide của một trình tự này với một trình tự khác. - Đột biến loại bỏ (deletion) là đột biến làm mất đi một hoặc một số nucleotide, thậm chí một gen hay nhiều gen. - Đột biến thêm vào (insertion) là thêm một hoặc một số nucleotide vào phân tử DNA, thậm chí một gen hay nhiều gen. - Đột biến đảo đoạn (inversion) là đột biến làm quay 1800 một đoạn sợi kép DNA gồm hai hay nhiều nucleotide [7]; [32]. Theo Grauer và Li (2000), phân tích chuỗi gen (sequence analysis) là xác định các cấu trúc và so sánh thành phần của chuỗi gen bao gồm trình tự nucleotide, amino acid, cấu trúc gen/hệ gen, khung đọc mở (ORF) và nhiều đặc tính phân tử khác. So sánh đối chiếu chuỗi gen (comparative analysis of sequences) là thao tác thực hiện với hai hay nhiều chuỗi gen khác. Trong nghiên cứu thuộc lĩnh vực sinh học phân tử, phân tích chuỗi gen được thực hiện nhờ sự trợ giúp của các chương trình tin-sinh học thông qua máy tính để kiểm tra và xác định: - So sánh thành phần nucleotide (amino acid) giữa hai hay nhiều chuỗi với mục đích tìm kiếm sự giống/khác nhau, đó là mức độ đồng nhất (identity) về nucleotide và tương đồng (homology) về amino acid. - Xác định cấu trúc gen (gene structure), khung đọc mở (open reading frame), phân bố intron/exon, các thành phần điều hòa gen (regulatory element), và các mô hình cấu trúc (motif). - Tìm kiếm và so sánh các sai khác (đột biến) nucleotide và qua đó là amino acid suy diễn (nếu có) có thể giữa 2 hay nhiều chuỗi của cùng hay khác loài. - Phát hiện xác định tiến hóa và đa dạng di truyền của sinh vật. - Phân tích chức năng của gen hoạt động, suy diễn chức năng của sản phẩm do gen tổng hợp. Nhiều phương pháp xây dựng cây phả hệ (hay còn gọi là cây phát sinh loài), được sử dụng trong nghiên cứu phân tử mà chủ yếu dựa trên số liệu về trình tự DNA, nhưng cũng có thể áp dụng với các số liệu về trì._.a gen GP5 giữa các chủng PRRSV phân lập tại Việt Nam với một số chủng thế giới Nhóm Độc lực cao Độc lực thấp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Độc lực cao 1 99 98 99 99 100 100 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 2 100 98 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 3 99 99 99 98 98 98 99 99 99 98 99 99 98 88 88 88 94 88 86 88 88 89 89 4 100 100 99 99 99 99 100 100 100 99 100 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 5 100 100 99 100 99 99 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 6 100 100 99 100 100 100 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 7 100 100 99 100 100 100 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 8 100 100 99 100 100 100 100 100 100 99 100 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 9 100 100 99 100 100 100 100 100 100 99 100 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 10 100 100 99 100 100 100 100 100 100 99 100 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 11 99 99 98 99 99 99 99 99 99 99 99 99 98 88 88 88 95 88 87 88 88 90 89 12 100 100 99 100 100 100 100 100 100 100 99 99 99 88 88 88 95 89 87 89 89 90 89 13 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 99 88 88 88 95 88 87 89 89 90 89 14 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 98 99 88 88 88 94 88 87 89 89 89 89 Độc lực thấp 15 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 88 88 100 99 91 88 91 99 99 90 99 16 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 88 88 100 99 91 88 91 99 99 90 99 17 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 86 87 87 88 99 99 91 88 91 99 99 90 99 18 93 93 92 93 93 93 93 93 93 93 93 93 93 92 90 90 90 90 89 91 91 92 92 19 87 87 86 87 87 87 87 87 87 87 86 87 86 86 87 87 87 90 87 88 88 90 89 20 86 86 85 86 86 86 86 86 86 86 85 86 85 85 88 88 89 88 84 91 91 88 91 21 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 88 88 99 99 99 90 87 88 100 90 99 22 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 87 88 88 99 99 99 90 87 88 100 90 99 23 92 92 91 92 92 92 92 92 92 92 91 92 91 91 91 91 91 94 91 89 92 92 91 24 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 88 89 89 98 98 98 91 88 88 99 99 93 Chú thích: 1. TX196-VN; 2. TXMT1-VN; 3. 07QN-VN; 4. 07NM-CN; 5. GD-CN; 6. HUB1-CN; 7. HUB1-CN ; 8. HEN13-CN; 9. HUN4-CN; 10. Jsyx-CN; 11. JXA1-CN; 12. NX06-CN; 13. BO-CN; 14. YN02-CN; 15. PRRSV01-CN; 16. S1-CN; 17. Fuzhou-CN; 18. CH1a-CN; 19. 07NP4-TL; 20. LMY-KR; 21. MLV-USA; 22. MLVvac-USA; 23. PrimePac(a) USA; 24. VR2332-ATCC. VN: Việt Nam; CN: Trung Quốc; TL: Thái Lan; KR: Hàn Quốc; USA: Mỹ. Bảng 3.2 cho thấy, qua so sánh 603 nucleotide (tương ứng với 200 amino acid) của hai chủng TX196 và TXMT1 có tỷ lệ đồng nhất về nucleotide và tương đồng về amino acid rất cao (99%, nucleotide; 100%, amino acid). Giữa các chủng phân lập ở Trung Quốc và một chủng Việt Nam (07QN-VN) tỷ lệ này đạt khoảng 98-100%. Với các chủng Bắc Mỹ thì mức độ tương đồng thấp hơn (88-90% về nucleotide và 87-92% về amino acid). Không có sự sai khác nhiều về nucleotide và amino acid giữa các chủng TX196 và TXMT1 với các chủng phân lập ở Trung Quốc năm 2006-2007. Tuy nhiên, sự sai khác này cũng đủ để tạo nên sự đa dạng về chủng loại trong quần thể virus PRRS và làm phức tạp hơn về mặt dịch tễ học của PRRS. Điều đó cũng cho thấy rằng tác nhân gây PRRS có tại Việt Nam rất có thể là có từ các chủng PRRSV của Trung Quốc. Như vậy, qua phân tích, rõ ràng gen GP5 của chủng TX196 và TXMT1 của Việt Nam và các chủng Trung Quốc đã có sự tiến hoá xa hơn rất nhiều so với với chủng gốc VR2332 của Bắc Mỹ như một số nhận định của nhiều tác giả khác [62]; [29]; [64]; [38]. 3.8 Kết quả phân tích nguồn gốc phả hệ của hai chủng TX196 và TXMT1 với một số chủng thế giới dựa trên gen GP5 Từ kết quả so sánh thành phần nucleotide và amino acid giữa các chủng virus PRRS chúng tôi tiến hành lập sơ đồ phả hệ dựa trên sự phân tích so sánh về thành phần nucleotide và amino acid của chuỗi gen GP5 nghiên cứu, sử dụng chương trình MEGA3.1. Kết quả được trình bày ở Hình 3.9 và Hình 3.10. Hình 3.9. Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng virus PRRS của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần nucleotide của gen GP5 Kết quả phân tích phả hệ trình bày ở Hình 3.9 và Hình 3.10 cho thấy, 24 chủng PRRSV lựa chọn so sánh, cả về nucleotide và amino acid, được phân chia thành 2 nhóm: - Nhóm I: gồm các chủng của Việt Nam và Trung Quốc, một chủng của Thái Lan và một chủng của Mỹ. Các chủng trong nhóm I chia thành 2 phân nhóm: Ia và Ib. + Phân nhóm Ia: bao gồm các chủng TX196 và TXMT1 trong nghiên cứu của chúng tôi, cùng nhóm với một số chủng PRRSV phân lập tại Trung Quốc và một chủng khác của Việt Nam (07QN-VN) [29]. Các chủng của Trung Quốc có tính gây bệnh rất cao, đại diện cho PRRSV thể độc lực cao mới xuất hiện tại các tỉnh phía Nam Trung Quốc từ năm 2006 [62]; [59]; [29]; [64]. Điều này chứng tỏ, các chủng TX196, TXMT1 và 07QN của Việt Nam đều thuộc nhóm các chủng có độc lực cao mới xuất hiện gần đây trên địa bàn các quốc gia Nam Á và Đông Nam châu Á [38]. + Phân nhóm Ib: Gồm chủng 07NP4-TL của Thái Lan, chủng PrimePac-USA của Mỹ. Chủng 07NP4 của Thái Lan có mức độ tương đồng cao với chủng PrimePac-USA của Mỹ, mà theo nhận xét của nhiều nhà nghiên cứu, hiện nay Thái Lan có nhiều genotype tồn tại, dòng Bắc-Mỹ (type II), dòng Châu Âu (type I), có lẽ 07NP4 là một chủng mang đặc tính như vậy [61]. - Nhóm II: bao gồm các chủng thuộc dòng Bắc Mỹ (nhóm cũ) có độc lực thấp, tiêu biểu trong nhóm này là chủng VR2332 (Bắc Mỹ). Các chủng khác nằm trong nhóm này cũng là các chủng được phân lập tại Mỹ (MLV-USA; MLVvac-USA) và một số chủng của Trung Quốc (Fuzhou-CN; S1-CN; PRRSV01-CN). Ngoài ra, trong nhóm này còn có một chủng của Hàn Quốc (LMY-KR). Chủng LMY của Hàn Quốc có mức độ biến đổi khác với các chủng trong vùng và Châu Á [22]. Kết quả phân tích phả hệ sử dụng trình tự amino acid của 24 chủng cũng cho thấy sự phân chia nhóm và phân nhóm hoàn toàn giống như kết quả khi phân tích phả hệ sử dụng dữ liệu là chuỗi nucleotide của GP5 (Hình 3.10). Như vậy, phân tích phả hệ nguồn gốc các chủng PRRSV của Việt Nam, Trung Quốc và một số chủng của thế giới dựa trên chuỗi gen GP5 đều cho kết quả tương tự nhau, giúp chúng ta đánh giá chính xác genotype và mối quan hệ giữa các chủng thuộc dòng Bắc Mỹ. Hình 3.10. Phân tích phả hệ và nguồn gốc của các chủng virus PRRS của Việt Nam và một số chủng khác trên thế giới sử dụng thành phần amino acid của chuỗi polypeptide GP5 Từ những kết quả phân tích phả hệ trên đây, chúng tôi có một số nhận xét như sau: Mặc dù, có một số sai khác nhất định, nhưng các chủng PRRSV phân lập ở Việt Nam mà chúng tôi nghiên cứu (TX196, TXMT1) và các chủng PRRS của Trung Quốc phân lập những năm 2006-2007, cùng với chủng VR2332 của Bắc Mỹ có chung nguồn gốc tiến hoá. Kết quả này phù hợp với sự phân loại về nguồn gốc phát sinh chủng loại PRRSV của thế giới trong các nghiên cứu trước đây của nhiều tác giả trên thế giới [54]; [62]; [59]; [64]; [29]; [38]. Kết quả phân tích phả hệ một lần nữa cho thấy, các chủng của Việt Nam (phân lập năm 2007) cùng nguồn gốc với các chủng mới xuất hiện tại các tỉnh phía Nam Trung Quốc. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả phân tích trình tự nucleotide của gen GP5 ở hai chủng TX196, TXMT1 (Việt Nam) và thành phần amino acid của chuỗi polypeptide do gen này quy định mã hoá đã trình bày ở các phần trước. 3.9 Bàn luận chung - Gen GP5 là một gen có tính kháng nguyên và chịu trách nhiệm gây bệnh (biểu hiện độc lực) của virus PRRS, sự biến đổi của GP5 là một trong những nguyên nhân làm gia tăng khả năng gây bệnh của virus [41]; [38]. - Cả ba chủng phân lập tại Việt Nam là: TX196-VN, TXMT1-VN và 07QN-VN có độ tương đồng rất cao so với các chủng độc lực cao phân lập gần đây của Trung Quốc (98-100%). Đặc biệt, chủng TX196 có độ tương đồng 100% cả về nucleotide và amino acid với hai chủng HUB1-CN và HUB2-CN. Điều đó cho thấy, có khả năng PRRSV từ Trung Quốc đã lây truyền vào Việt Nam. Mầm bệnh có thể vào nước ta qua rất nhiều con đường. Do Việt Nam và Trung Quốc có biên giới giáp nhau nên việc nhập lậu gia súc thường xuyên diễn ra mặc dù sự vẫn có sự kiểm tra, giám sát hay kiểm dịch. Ngoài ra, sự lây lan mầm bệnh từ nước ngoài vào qua con đường nhập khẩu là một nguy cơ lớn, do động vật và thực phẩm nhập khẩu không được kiểm dịch chặt chẽ. Do đó, virus PRRS dễ dàng xâm nhập và việc khống chế bệnh dịch là một điều vô cùng khó khăn do tính chất lây lan nhanh và gây chết nhiều của bệnh. - So sánh về nucleotide và amino acid cho thấy, chủng vaccine của Mỹ (MLVvac-USA) có độ tương đồng cao (99%) so với chủng VR2332 (Bắc Mỹ) thuộc nhóm độc lực thấp, nhưng MLVvac-USA lại có sự sai khác lớn so với các chủng mới xuất hiện tại Trung Quốc và Việt Nam (87-88%). Vaccine này nếu được sử dụng đối với vùng dịch do các chủng độc lực cao gây ra, rất có thể chỉ có tác dụng bảo hộ tốt cho các chủng cũ độc lực thấp mà có thể không có tác dụng bảo hộ miễn dịch đối với các chủng độc lực cao này. - Gen GP5 của những chủng virus PRRS có độc lực cao, tuy có khả năng biến đổi mạnh mẽ dẫn đến sự sai khác lớn so với các chủng cũ có độc lực thấp nhưng nó không phải type mới và sự biến đổi trong cùng nhóm độc lực cao là không lớn (≤ 2%). Điều này có lợi cho việc sử dụng vaccine sản xuất từ các chủng mới xuất hiện gần đây, đối với việc phòng chống các chủng độc lực cao. Như vậy, vaccine lưu hành hiện nay đang sử dụng tại Việt Nam (xuất xứ từ Trung Quốc) vẫn có khả năng bảo hộ miễn dịch cao đối với các chủng của Trung Quốc và Việt Nam. Tuy nhiên, hiệu quả thực tế như thế nào thì cần phải có những nghiên cứu cụ thể để đánh giá chính xác về sự bảo hộ miễn dịch của các loại vaccine này. - Kết quả nghiên cứu sinh học phân tử gen GP5 của các chủng độc lực cao phân lập tại Việt Nam cho thấy, cho đến nay, tại nước ta, chưa có sự trộn lẫn nhiều dòng PRRSV, sự biến đổi nucleotide và amino acid giữa các chủng so sánh là hoàn toàn theo quy luật tự nhiên, tuy nhiên, những biến đổi đó có ảnh hưởng đến tính kháng nguyên và độc lực là vấn đề cần nghiên cứu để có những đánh giá xác định mối quan hệ genotype và phenotype, giữa các chủng đương nhiễm và các loại vaccine nhập từ Trung Quốc, Mỹ và Châu Âu. KẾT LUẬN Từ những kết quả nghiên cứu trên đây, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1. Thực hiện phản ứng RT-PCR với cặp mồi TX3F – TXGPR, dòng hoá và giải trình tự thành công đoạn gen GP5 (ORF5) của PRRSV từ mẫu bệnh phẩm phân lập ở lợn có nguồn gốc từ Hải Dương (ký hiệu mẫu: TX196) (2007) và ở một tỉnh miền Trung Việt Nam (2007) (ký hiệu: TXMT1). Giải mã thành công gen GP5 có độ dài 603 bp, cung cấp một số thông tin về gen học của PRRSV gây bệnh tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam. 2. Gen GP5 của hai chủng TX196 và chủng TXMT1 có sự tương đồng cao với các chủng PRRSV được lựa chọn so sánh ở Trung Quốc cả về thành phần nucleotide và thành phần amino acid (98-100%). 3. TX196 và TXMT1 cùng với các chủng mới xuất hiện và được phân lập tại Trung Quốc, với sự thay đổi các nucleotide và amino acid của chuỗi polypeptide do gen GP5 mã hoá đã tạo một nhóm mới so với các chủng cũ phân lập tại Mỹ và một số nước khác được lựa chọn so sánh 4. Hai chủng TX196 và TXMT1 có chung nguồn gốc phát sinh với các chủng PRRSV của Trung Quốc được phân lập gần đây và thuộc nguồn gốc dòng Bắc Mỹ. KIẾN NGHỊ Tiếp tục nghiên cứu giải trình tự, nếu có điều kiện, toàn bộ hệ gen của hai chủng TX196 và TXMT1 và một số chủng PRRSV khác gây bệnh tại Việt Nam. Từ đó, phân tích đánh giá mức độ tiến hoá, cũng như mối quan hệ về kháng nguyên - miễn dịch với các chủng trên thế giới, đặc biệt là các chủng đang được sử dụng làm vaccine, nhằm cung cấp cơ sở dữ liệu cho việc nghiên cứu, ứng dụng, chẩn đoán sớm và sản xuất vaccine phòng bệnh PRRS ở Việt Nam. TÀI LIỆU THAM KHẢO A. TIẾNG VIỆT Bùi Quang Anh và Nguyễn Văn Long, (2007), Một số đặc điểm dịch tễ của Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp lợn (bệnh tai xanh) và tình hình dịch tại Việt Nam. Diễn đàn khuyến nông và công nghệ - Bộ Nông Nghiệp và phát triển Nông thôn, tháng 8/2007. Nguyễn Ngọc Hải, Trần Thị Bích Liên, Trần Thị Dân và Nguyễn Ngọc Tuân, (2007), Chẩn đoán virut gây hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp trên heo (PRRS) bằng kỹ thuật RT-PCR. Khoa học Kỹ thuật Thú y tập XIV, số 5/2007, tr. 5 – 12. Đậu Ngọc Hào, Văn Đăng Kỳ, Nguyễn Văn Long và Tiêu Quang An, (2008), Một số đặc điểm dịch tễ hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp (PRRS) ở lợn từ cuối tháng 3 đến đầu tháng 7/2008 tại một số tỉnh trong cả nước. Khoa học Kỹ thuật Thú y tập XV, số 5/2008, tr. 14 – 20. Lê Thanh Hoà, (2002), Bài giảng Sinh học phân tử: nguyên lý và ứng dụng. Viện Công nghệ sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Lê Thanh Hoà (chủ biên), (2006), Y - sinh học phân tử. Nhà xuất bản Y học, Hà Nội, 240 trang. Lê Thanh Hoà, Lê Thị Kim Xuyến, Đoàn Thị Thanh Hương, Trần Quang Vui, Phạm Công Hoạt và Nguyễn Bá Hiên, (2008), Phân tích gen M mã hoá protein màng của virus gây bệnh“Tai xanh” tại Việt Nam và so sánh với các chủng của Trung Quốc và thế giới. Tạp chí Khoa học và Phát triển tập 7, số 3/2009, tr. 282 – 290. Lê Quang Huấn, (2007), Tiến hoá phân tử. Nhà xuất bản Khoa học tự nhiên và Công nghệ (280 trang). Jenny G. Cho và Scott A. Dee (bản dịch - Trần Đức Minh), (2007), Virus gây Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Khoa học Kỹ thuật Thú y tập XIV, số 5/2007, tr. 74 – 80. Phạm Sỹ Lăng và Văn Đăng Kỳ, (2007), Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn. Diễn đàn khuyến nông và công nghệ - Bộ Nông nghiệp và phát triển Nông thôn, tháng 8/2007. Tô Long Thành, Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp của lợn. Khoa học và Kỹ thuật Thú y tập XIV, số 3/2007, tr. 81 – 88. Phạm Văn Ty (2005), Virus học. Nhà xuất bản Giáo dục, 334 trang. B. TIẾNG ANH Albina E., Madec F., Cariolet R. and Torrison J., (1994), Immune response and persistenceof the porcine reproductive and respiratory syndrome virus in infected pigs and farm inits. Vet. Rec. 134, pp. 567 – 573. Albina E., Leforban Y., Banro T., Plana Duran J. and Vannier P., (1992), An enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) for the detection of antibodies to the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus. Ann. Rech. Vet. 23, pp. 167 – 176. Allende R., Kutish G.F., Laegreid W., Lu Z., Lewis T.L., Rock D.L., Friesen J., Galeota J.A., Doster A.R. and Osorio F.A., (2000), Mutations in the genome of porcine reproductive and respiratory syndrome virus responsible for the attenuation phenotype. Arch. Virol. 145 (6), pp. 1149-1161. Anonymous, (1992). Porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS or blue-eared pig disease). Vet. Ret. 130, pp. 87 – 89. Ansari I.H., Kwon B., Osorio F.A. and Pattnaik A.K., (2006), Influence of N-linked glycosylation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 on virus infectivity, antigenicity, and ability to induce neutralizing antibobies. J. Virol. 80 (8), pp. 3994 – 4004. Bautista E.M., Goyal S.M., Yoon I.J., Joo H.S. and Collins J.E., (1993), Comparison of porcine alveolar macrophages and CL2621 for the detection of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus and anti-PRRS antibody. J. Vet. Diagh. Invest 5, pp. 163 – 165. Bautista E.M. and Molitor T.W., (1997), Cell-mediated immunity to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine. Viral Immunol. 10, pp. 83 – 94. Cancel–Tirado S.M., Evans R.B. and Yoon K.J., (2004), Monoclonal antibody analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus epitopes associated with antibody-dependent enhancement and neutralization of virus infection. Vet. Immunol. Immunopathol 102, pp. 249 – 262 . Cavanagh D., (1997), Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and Arteriviridae. Arch. Virol. 142, pp. 629 – 633. Cavanagh D., (2005), Coronaviruses in poultry and other birds. Avian Pathol. 34, 439 – 448. Cha S.H., Choi E.J., Park J.H., Yoon S.R., Song J.Y., Kwon J.H., Song H.J. and Yoon K.J., (2006), Molecular characterization of recent Korean porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) viruses and comparison to other Asian PRRS viruses. Vet. Microbiol. 117 (2-4), pp. 248-257. Cho J.G. and Dee S.A., (2006), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Theriogenology. Review, pp. 655-662. Costers S., Lefebvre D.J., Delputte P.L. and Nauwynck H.J., (2008), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus modulates apoptosis during replication in alveolar macrophages. Arch. Virol. 153(8), pp. 1453 – 1465. Den Boon J.A., Faaberg K.S., Meulenberg J.J., Wassenaar A.L., Plagemann P.G., Gorbalenya A.E. and Snijder E.J., (1995), Processing and evolution of the N-terminal region of the Arterivirus replicase ORF1a protein: indentification of two papainlike cysteine proteases. J. Virol. 69, pp. 4500 – 4505. Diaz I., Darwich L., Pappaterra G., Pujols J. and Mateu E., (2006), Different European-type vaccines against porcine reproductive and respiratory syndrome virus have different immunological properties and confer different protection to pigs. Virilogy. 351 (2), pp. 249 – 259. Drew T.W., (2000), A review of evidence for immunosuppression due to porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet. Res. 2000 Jan-Feb; 31 (1), pp. 27 – 39. Faaberg K.S., Hocker J.D., Erdman M.M., Harris D.L., Nelson E.A., Torremorell M. and Plagemann P.G., (2006), Neutralizing antibody responses of pigs infected with natural GP5 N-glycan mutants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Viral. Immunology 19, pp. 294–304. Feng Y., Zhao T., Nguyen T., Inui K., Ma Y., Nguyen T.H., Nguyen V.C., Liu D., Bui Q.A., To L.T., Wang C., Tian K. and Gao G.F., (2008), Porcine respiratory and reproductive syndrome virus variants, Vietnam and China. Emerg. Infect. Dis. 14(11), pp. 1774 – 1776. Frederick A., Murphy E., Paul J., Gibbs, Mairian C., Horzinek and Michael J., Studdert Arteriviridae. Veterinary virology, (3rd Ed), Chapter 34, pp. 509 – 515. Gorbalenya A.E., Enjuanes L., Ziebuhr J., Snijder E.J., (2006), Nidovirales: Evoling the largest DNA virus genome. Virus Res. 177, pp. 17 – 37. Grauer D. and Li W.H., (2000), Fundamentals of molecular evolution (second edition). Sinauer Associates, Inc. Sunderland, MA, USA, pp. 481. Hagemann T.L. and Kwan S.P., (2008), SeqEd: Manipulation of Sequence Data and Chromatograms from the ABI DNA Sequencer Analysis Files, pp. 55-63. In Sequence Data Analysis Guidebook (Methods in Molecular Biology) Eds: Swindell SR. Humana Press Inc, Totowa, NJ. Han J., Wang Y. and Faaberg K.S., (2006), Complete genome analysis of RFLP 184 isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Virus Res. J. 122(1-2), pp. 175-82. Kumar S., Dudley J., Nei M. and Tamura K., (2008), MEGA: A biologist-centric software for evolutionary analysis of DNA and protein sequences. Briefings in Bioinformatics 9, pp. 299-306. Kwon B., Ansari I.H., Osorio F.A. and Pattnaik A.K., (2006), Infectious clone-derived viruses from virulent and vaccine strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus mimic biological properties of their parental viruses in a pregnant sow model. Vaccine 24 (49-50), pp. 7071-7080. Lee S.M., Schommer S.K. and Kleiboeker S.B., (2002), Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates differ in in vitro interferon phenotypes. Vet. Immunol. Immunopathol 102, pp. 217 – 231. Li Y., Wang X., Jiang P., Wang X., Chen W., Wang X. and Wang K., (2009), Genetic variation analysis of porcine reproductive and respiratory syndrome virus isolated in China from 2002 to 2007 based on ORF5. Vet. Microbiol. 138 (1-2), pp. 150-155. Li G., Huang J., Jiang P., Li Y., Jiang W. and Wang X., (2007), Suppression of porcine reproductive and respiratory syndrome virus replication in MARC-145 cells by shRNA targeting ORF1 region. Virus Genes 35 (3), pp. 673-679. Lopez O.J., Oliveira M.F., Garcia E.A., Kwon B.J., Doster A. and Osorio F.A., (2007), Protection against porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) infection through passive transfer of PRRSV – neutralizing antibidies is dose dependent. Clin Vaccine Immunol. 14 (3), pp. 260 – 275. Mateu E., Diaz I., Drwich L., Casal J., Martín M. and Pujols J., (2006), Evolution of OFR5 of Spanish porcine reproductive and respiratory syndrome virus strains from 1991 to 2005. Virus Res. 115 (2), pp. 198 – 206. Mateu E. and Diaz I., (2007), The challenge of PRRS immunology. Vet. J. 2007 Jul 17; [Epub ahead of print]. Meng X.J., Paul P.S. and Halbur P.G., (1994), Molecular cloning and nucleotide sequencing of the 3’ terminal genomic DNA of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen. Virol. 75, pp. 1795 – 1801. Meulenberg J.J., Petersen den Besten A., de Kluyver E., van Nieuwstadt A., Wensvoort G. and Moormann RJ., (1997), Molecular characterization of Lelystad virus. Vet. Microbiol. 55, pp. 197 – 202. Meulenberg J.J., Hulst M.M., de Meijer E.J., Moonen P.L., de Besten A., de Kluyver E., Wensvoort G. and Moormann R.J., (1993), Lelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV. Virology 192 (1), pp. 62 – 72. Miller L.C. and Fox J.M., (2004), Apoptosis and porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Vet. Immunol. Immunopathol 102 (3), pp. 131 – 142. Nelson E.A., Christopher-Hennings J. and Benfield D.A., (1994), Serum immune responses to the proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus. J. Vet. Diagn. Invest 6, pp. 410 – 415. Nicholas K.B. and Nicholas H.B., (1997), Genedoc: a tool for editing and annotating multiple sequence alignments. Distributed by the author. Nielsen H.S., Liu G., Nielsen J., Oleksiewicz M.B., Botner A., Storgaard T. and Faaberg K.S., (2003), Generation of an Infectious Clone of VR-2332, a Highly Virulent North American – Type Isolate of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Virol. 77 (6), pp. 3702 – 3711. Oleksiewicz M.B., Botner A., Toft P., Normann P. and Storggard T., (2001), Epitope mapping porcine reproductive and respiratory syndrome virus by phage display: the nsp 2 fragment of the replicase polyprotein contains a cluster of B-cell epitopes. J. Virol. 75, pp. 3277 – 3290. Ostrowski M., Galeota J.A., Jar A.M., Platt K.B., Osorio F.A. and Lopez O.J., (2002), Identification of neutralizing and nonneutralizing epitopes in the porcine reproductive and respiratory syndrome virus GP5 ectodomain. J. Virol. 76, pp. 4241 – 4250. Rossow K.D., (1998), Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome. J. Vet. Pathol. 35, pp. 1 – 20. Rossow K.D., Bautista E.M., Goyal S.M., Molitor T.W., Murtaugh M.P., Morrison R.B., Benfield D.A. and Collins J.E., (1994), Experimental porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection in one-four-, and 10-week-old pigs. J. Vet. Diagn. Invest 6, pp. 3 – 12. Rowland R.R., Steffen M., Ackerman T. and Benfield D.A., (1999), The evolution of porcine reproductive and respiratory syndrome virus: quasispecies and emergencence of a virus subpopulation during infection of infection of pigs with VR-2332. Virology 259, pp. 262 – 266. Royaee A.R., Husmann R.J., Dawson H.D., Calazada-Nova G., Schnitzlein W.M., Zuckermann F.A. and Lunney J.K., (2004), Deciphering the involvement of innate immune factors in the development of the host response to PRRSV vaccination. Vet. Immunol. Immunopathol 102, pp. 199 – 216. Suarez P., Diaz Guerra M., Prieto C., Esteban M., Castro J.M., Nieto A. and Ortin J., (1996), Open reading frame 5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a cause of virus-induced apoptosis. J. Virol. 70, pp. 2876-2882. Suradhat S., Thanawongnuwech R. and Poovorawan Y., (2003), Upregulation of IL-10 gene expression in porcine peripheral blood mononuclear cells by porcine reproductive and respiratory syndrome virus. J. Gen Virol. 84, pp. 453 – 459. Tamura K.J., Dudley M., Nei and Kumar S., (2007), MEGA4: Molecular Evolutionary Genetics Analysis (MEGA) software version 4.0. Mol. Biol. Evol. 24, pp. 1596-1599. Tong G.Z., Zhou,Y.J., Hao X.F., Tian Z.J., Qiu H.J., Peng J.M. and An T.Q., (2007), Identification and molecular epidemiology of the very virulent porcine reproductive and respiratory syndrome viruses emerged in China. Chin. J. Prev. Vet. Med. 29, pp. 323-326. Thanawongnuwech R., Thacker B., Halbur P. and Thacker E.L., (2004a), Increased production of proinflammatory cytokines following infection with porcine reproductive and respiratory syndrome virus and Mycoplasma hyopneumoniae. Clin.Diagn. Lab. Immunol. 11, pp. 901 – 908. Thanawongnuwech R., Amonsin A., Tatsanakit A. and Damrongwatanapokin S., (2004b), Genetics and geographical variation of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in Thailand. Vet. Microbiol. 101(1), pp. 9-21. Tian K., Yu X., Zhao T., Feng Y., Cao Z., Wang C., Hu Y., Chen X., Hu D., Tian X., Liu D., Zhang S., Deng X., Ding Y., Yang Y., Zhang Y., Xiao H., Qiao M., Wang B., Hou L., Wang X., Yang X., Kang L., Sun M., Jin P., Wang S., Kitamura Y., Yan J. and Gao GF., (2007), Emergence of fatal PRRSV variants: unparalleled outbreaks of atypical PRRS in China and molecular dissection of the unique hallmark. PloS. ONE 2 (6), pp. 526. Yoon I.J., Joo H.S., Goyal S.M. and Molitor T.W., (1994), A modified serum neutralization test for the detection of antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome virus in swine sera. J. Vet. Diagn. Invest 6, pp. 289 – 292. Zhou Y.J., Hao X.F., Tian Z.J., Tong G.Z., Yoo D., An T.Q., Zhou T., Li G.X., Qiu H.J., Wei T.C. and Yuan X.F., (2008), Highly virulent porcine reproductive and respiratory syndrome virus emerged in China. Transbound Emerg. Dis. 55 (3-4), pp. 152 – 164. C. INTERNET PHỤ LỤC 1. Phụ lục 1. Các bước thực hiện điện di kiểm tra RNA tổng số - Chuẩn bị gel agarose 1%: lấy 0,4 g bột thạch agarose nguyên chất cho vào cốc đong thuỷ tinh chịu nhiệt, đổ vào đó 40 ml đệm TAE 1X. Cho vào lò vi sóng đặt nóng chảy trong 3 phút sao cho agarose tan chảy hết. Đổ thạch đã tan chảy vào hệ thống điện di, gài lược có nhiều răng vào và đổ ngập răng lược khoảng 0,5 cm rồi để nguội ở nhiệt độ phòng. Khi nguội, các răng lược sẽ tạo thành các giếng để chúng ta cho mẫu vật vào điện di kiểm tra. - Dìm ngập khay có thạch trong hộp điện di chứa đệm TAE 1X (đệm cung cấp ion cho điện trường hoạt động). - Tra mẫu: lấy 5 ml sản phẩm, trộn chỉ thị màu (thường là dùng hỗn hợp xanh Bromophenol và glycerol) với mẫu và tra riêng biệt vào từng giếng trong thạch. - Tra chỉ thị phân tử: trong 1 giếng riêng biệt khác cho 10 ml (0,5 mg) chỉ thị phân tử (DNA marker) (thường dùng là DNA của thực khuẩn thể Lamda cắt bằng enzyme giới hạn HindIII). - Chạy điện di ở 100-120V trong 25-30 phút. - Nhuộm bằng ethidium bomide cho bản gel vào khay đặt trên máy lắc 100 vòng/phút trong 10 phút. - Rửa thạch bằng nước cất, sau đó soi qua tia cực tím và chụp ảnh. 2. Phụ lục 2. Điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR Thành phần các giếng điện di kiểm tra sản phẩm RT-PCR Thành phần các giếng điện di Tên hóa chất Thể tích các giếng điện di (µl) Chỉ thị (M) Các giếng mẫu sản phẩm HindIII (0,5µg/µl) 7 Sản phẩm RT-PCR 10 Loading Dye 1 1 Tổng thể tích 8 11 Chế độ điện di: Môi trường : TAE 1X Cường độ dòng điện (I): 400 mA (miliAmpe) Hiệu điện thế (U) : 100 volt Thời gian (t) : 30 phút 3. Phụ lục 3. Thực hiện phản ứng nối DNA ngoại lai - sản phẩm của RT-PCR Thành phần phản ứng nối được trình bày trong bảng sau Thành phần phản ứng nối Tên hóa chất Thể tích (µl) Buffer 10X 1 Vector pCR®2.1-TOPO® 1 Enzyme T4-ligase 1 Nước tinh khiết (khử ion) 4 cDNA sản phẩm RT-PCR 3 Tổng thể tích 10 4. Phụ lục 4. Điện di kiểm tra sản phẩm cắt DNA tái tổ hợp Thành phần các giếng điện di kiểm tra sản phẩm cắt DNA tái tổ hợp Tên hóa chất Thể tích các giếng điện di (µl) Chỉ thị (M) Các giếng mẫu sản phẩm (S) HindIII 7 Sản phẩm DNA cắt bằng EcoRI 10 Loading Dye 1 2 Tổng thể tích 8 12 Chế độ điện di: Môi trường : TAE 1X Cường độ dòng điện (I) : 400 mA (miliAmpe) Hiệu điện thế (U) : 100 volt Thời gian (t) : 30 phút 5. Phụ lục 5. Giải trình trình tự Thành phần phản ứng giải trình trình tự được trình bày ở bảng sau: Thành phần phản ứng giải trình trình tự Tên hóa chất Thể tích (µl) Big Dye3.1 1 DNA plasmid tái tổ hợp (~50ng/µl) 3 Mồi (1pMol/µl) 3,2 Nước tinh khiết 3,8 Enhance (hóa chất kích hoạt) 2X 10 Tổng thể tích 20 Chu trình nhiệt phản ứng giải trình trình tự: Thu nhận sản phẩm. 6. Phụ lục 6. Tinh sạch sản phẩm của phản ứng giải trình tự bằng bộ hoá chất Dye-Ex 2.0 Spin Kit (QIAGEN) Bước 1: Lắc đều cột tinh sạch (Dye-Ex), xoay nhẹ nắp (1/2 vòng), bẻ đuôi và lắp vào ống Eppendorf 2,0 ml. Bước 2: Ly tâm 2.800 vòng/phút trong 5 phút. Bỏ dịch dưới rồi chuyển cột Dye-Ex vào ống Eppendorf 1,5 ml vô khuẩn. Bước 3: Chuyển mẫu sản phẩm giải trình tự (~20 µl) vào chính giữa cột theo chiều vát của cột Dye-Ex. Bước 4: Ly tâm 2.800 vòng/phút trong 5 phút, thu được sản phẩm giải trình tự ở dưới. Chuyển sang ống Eppendorf 0,5 ml vô khuẩn và ly tâm đông khô trong 35 phút. 7. Phụ lục 7. Bảng tra cứu acid amin theo bộ mã vi khuẩn (Bacterial code) 8. Phụ lục 8. Bảng mã di truyền Glycin G Gly Asparagin N Asn Alanin A Ala Glutamin Q Glu Valin V Val Phenylalanin F Phe Leucin L Leu Tyrosin Y Tyr Isoleucin I Ile Tryptophan W Trp Prolin P Pro Aspartat D Asp Serin S Ser Glutamat E Glu Threonin T Thr Lysin K Lys Cystein C Cys Arginin R Arg Methionin M Met Histidin H His ._.