Nghiên cứu định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)

Cao Sơn TS Nguyễn Hải Nam Nơi thực hiện : Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế - VKN Thời gian thực hiện: 9/2006 đến 5/2007 Hà nội, 5/ 2007 LỜI CẢM ƠN Khóa luận này được thực hiện và hoàn thành tại khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế - Viện kiểm nghiệm Bộ Y tế và bộ môn Hóa Dược trường Đại học Dược Hà Nội. Trong quá trình thực hiện khóa luận tốt nghiệp tôi đã nhận được sự giúp đỡ tận tình của các thầy hướng dẫn, các giảng viên của bộ môn Hóa dược và các cán bộ khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế - viện kiểm nghiệm. Tôi xin được bày tỏ lời cảm ơn chân thành sâu sắc tới : Tiến sĩ Đoàn Cao Sơn –Trưởng Khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế Viện kiểm nghiệm – Bộ Y tế. Tiến sĩ Nguyễn Hải Nam – Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà nội. Thạc sĩ Nguyễn Thị Thanh Thảo – Cán bộ khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế - Viện kiểm nghiệm – Bộ Y tế Là những người thầy trực tiếp hướng dẫn, dìu dắt chỉ bảo tôi những ý kiến quý báu trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy cô các kĩ thuật viên bộ môn Hóa Dược, các cán bộ khoa kiểm nghiệm các dạng bào chế - viện kiểm nghiệm đã tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành khóa luận này. Tôi xin chân thành cảm ơn sự quan tâm của ban Giám hiệu, phòng đào tạo và các thầy cô đã truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt thời gian ngồi trên ghế nhà trường. Tôi vô cùng biết ơn gia đình, bạn bè, và những người luôn sát cánh bên tôi động viên và giúp đỡ tôi trong học tập cũng như trong cuộc sống. Nguyễn Thị Hạnh A1 K57 MỤC LỤC PHẦN 1. TỔNG QUAN 3 1.1. TỔNG QUAN VỀ CETIRIZIN 3 1.1.1. Công thức cấu tạo 3 1.1.2. Tính chất 3 1.1.3. Tác dụng dược lý 4 1.1.4. Tác dụng không mong muốn 4 1.1.5. Chỉ định 5 1.1.6. Một số chế phẩm 5 1.1.7. Các phương pháp định lượng 5 1.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 6 1.2.1. Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) 7 1.2.2. Nguyên tắc của quá trình sắc ký 7 1.2.3. Cơ sở lý thuyết sắc ký 8 1.2.4. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 9 1.2.5. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng 10 1.2.6. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký 15 1.2.7. Ứng dụng của HPLC 18 PHẦN 2. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU. 21 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU 21 2.2. PHƯƠNG TIỆN, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT 21 2.2.1. Hóa chất 21 2.2.2. Thiết bị, dụng cụ 22 2.3. NỘI DUNG 22 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.4.1. Các thông số thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu 23 2.4.2. Cách đánh giá kết quả 23 PHẦN 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 25 3.1. Xây dựng điều kiện sắc ký để định lượng cetirizin trong chế phẩm 25 3.1.1. Nghiên cứu lựa chọn sắc ký 25 3.1.2. Khảo sát tính thích hợp của hệ thống sắc ký 30 3.1.3. Khảo sát độ tuyến tính của phương pháp 31 3.1.4. Khảo sát độ lặp lại của phương pháp 33 3.1.5. Khảo sát độ đúng của phương pháp: 36 3.2. Ứng dụng định lượng cetirizin trong chế phẩm 40 3.3. Bàn luận về kết quả 42 KẾT LUẬN 44 PHỤ LỤC TÀI LIỆU THAM KHẢO ĐẶT VẤN ĐỀ Dị ứng là tình trạng tổn thương và rối loạn bệnh lý điển hình thể hiện phản ứng miễn dịch của cơ thể với các dị nguyên. Nhưng con người sống trong môi trường và luôn phải chịu tác động yếu tố ngoại cảnh vì vậy dị ứng rất dễ xảy ra, có thể xảy ra với mọi đối tượng khác nhau. Để điều trị các rối loạn trên một nhóm thuốc kháng histamin ra đời với tác dụng kháng histamin trên thụ thể H1. Nhưng các thuốc trước đây khi sử dụng luôn gây khó khăn cho con người trong công việc và sinh hoạt do tác dụng phụ gây buồn ngủ, cùng việc sử dụng liều nhiều lần trong ngày. Kháng histamin thế hệ 2 ra đời là một giải pháp hữu hiệu khắc phục nhược điểm trên nên kháng histamin thế hệ 2 nhanh chóng được sử dụng rộng rãi và phổ biến trong đó điển hình có cetirizin [1, 8]. Cetirizin là kháng histamin có tác dụng mạnh, kéo dài, chọn lọc trên thụ thể H1. Hiện nay trên thị trường dược phẩm trong nước và nước ngoài có hàng ngàn chế phẩm cetirizin được sản xuất. Chính vì vậy việc đảm bảo chất lượng cho rất nhiều chế phẩm của một thuốc như vậy là vấn đề đáng được quan tâm. Các dược điển European 4th, BP 2005 [9, 10] mới chỉ có chuyên luận kiểm tra cetirizin dạng nguyên liệu mà chưa có chuyên luận kiểm tra chất lượng cetirizin trong viên nén. Vì vậy xây dựng một phương pháp định lượng có thể dùng cho cả dạng nguyên liệu và viên nén một cách chính thống là hết sức cần thiết. Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, với sự phát triển vượt bậc của khoa học kĩ thuật, đã có nhiều thành tựu mới được đưa vào ứng dụng đem lại cho chúng ta những phương pháp kiểm nghiệm nhanh, đạt độ chính xác cao. Một trong những phương pháp đó là sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Phương pháp này đã được nghiên cứu và ứng dụng để định tính và định lượng có kết quả nhiều hoạt chất trong đa dạng các loại chế phẩm. Từ các cơ sở trên chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Nghiên cứu định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ” với các mục tiêu cụ thể sau: Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp định lượng cetirizin bằng kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu năng cao, đóng góp cho ngành Dược một phương pháp kiểm nghiệm cetirizin có tính đặc hiệu, độ chính xác cao, độ đúng cao. TỔNG QUAN TỔNG QUAN VỀ CETIRIZIN [ 8, 13, 14, 15] Công thức cấu tạo Công thức cấu tạo cetirizin. Mô phỏng cấu tạo của cetirizin Công thức phân tử : C18H25ClN2O3 Khối lượng phân tử: 461, 82 Tên khoa học: acid (RS)-2-[2[4[(4-Clorophenyl)phenylmethyl]piperazin-1-yl] ethoxy]acetic. Tính chất Cetirizin có dạng bột kết tinh màu trắng, không mùi, pKa1 = 2,9 tương ứng pKa cuả nhóm cacboxylic; pKa2 = 8,3 tương ứng pKa nhóm amin bậc 3; Tan tốt trong nước, đặc biệt là trong aceton và methylen clorid; Trong phân tử cetirizin có dây nối liên hợp nên có khả năng hấp thụ ánh sáng tử ngoại. Phổ hấp thụ của dung dịch 20µg/ml trong acid hydrochlorid R (10,3g/l) trong giới hạn quét phổ từ 210nm đến 350 nm có cực đại hấp thụ tại 231nm với độ hấp thụ riêng 359-381. Tác dụng dược lý Tác dụng dược lực học: Cetirizin là chất thuộc nhóm dẫn chất của piperazin, là chất chuyển hoá của hydroxyzin (oxy hoá nhóm chức –OH alcol thành –COOH) có tác dụng đối kháng histamin mạnh, kéo dài và đặc biệt chọn lọc trên thụ thể H1. Cetirzin có tác dụng an thần, gây ngủ và kháng cholinergic đều rất yếu, không kháng serotonin. Cetirizin ức chế giai đoạn sớm của phản ứng dị ứng qua trung gian histamin và cũng làm giảm sự di dời của các tế bào viêm. Giảm giải phóng các chất trung gian ở giai đoạn muộn của phản ứng dị ứng. Chất này có tác dụng bảo vệ dưỡng bào, giảm đáng kể đáp ứng hen suyễn với histamin. Tác dụng dược động học: Cetirizin sau khi uống phân bố rất nhanh, nồng độ thuốc trong huyết tương đạt được sau 30 phút đến 60 phút. Trên nghiên cứu những người tình nguyện với 10mg cetirizin mỗi ngày, uống trong 10ngày nồng độ đỉnh huyết tương đạt 311 ng /ml, nửa đời huyết tương xấp xỉ 11h, liên kết với protein mạnh 93%. Thời gian bán huỷ trung bình khoảng 8,3h. Thuốc chịu ảnh hưởng chuyển hoá của hệ enzym cytochrom 3A4P. Thuốc được đào thải chủ yếu qua thận khoảng 70%, qua gan khoảng 10%. Tác dụng không mong muốn Tác dụng không mong muốn xảy ra nhiều nhất là hiện tượng ngủ gà phụ thuộc vào liều sử dụng. Ngoài ra thuốc có thể gây mệt mỏi, khô miệng viêm họng, chóng mặt, buồn nôn, nhức đầu. Chỉ định Cetirizin được chỉ định trong viêm mũi dị ứng dai dẳng, viêm mũi dị ứng theo mùa. Mày đay mạn tính vô căn ở người lớn và trẻ em trên 12 tuổi. Cetirizin chỉ định điều trị các dạng ngứa, ngứa kết hợp với tổn thương da Theo nghiên cứu mới nhất của trường đại học ở Mỹ cetirizin có tác dụng làm giảm các tổn thương da ở những người điều trị prednisolon Một số chế phẩm Hiện nay chế phẩm citirizine tương đối nhiều, có thể ở dạng đơn thành phần: ZYRTEC viên nén 10mg ZYRTEC dung dịch uống 1mg/1ml lọ 75ml ZYRTEC dung dịch uống 10mg/ml lọ 10ml Chế phẩm của hãng UCB PHARM CETINAX viên nén 10mg Chế phẩm của MEDOPHARM -TENAMYD CANADA HICET viên nén 10mg bao phim Chế phẩm của công ty Micro labs limited CEZILviên nén 10mg bao phim Chế phẩm của công ty Alkem labs. Ngoài ra cetirizin thường được kê đơn với pseudoephedrin nên có chế phẩm kết hợp với pseudoephedrin ZYRTEC-D, VILIX-D chế phẩm của UCB pharma. Các phương pháp định lượng [ 7, 9, 10, 11, 12] Qua các tài liệu tham khảo ta có một số phương pháp định lượng đã được đưa ra như sau: Phương pháp chuẩn độ acid –base [9, 10] Cân chính xác lượng bột tương ứng với khoảng 0,1g cetirizin hoà tan trong 100 ml dung dịch gồm 30 thể tích nước và 70 thể tích aceton. Chất chuẩn độ dùng là dung dịch NaOH 0,1M. 1ml NaOH 0,1M tương ứng với 15,39mg C21H27Cl3N2O3 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao [7, 11, 12] Phương pháp 1 [7] : Cột C18 (phenomenex) Pha động dung dịch đệm phosphat 0,01M (1,36g KH2PO4 trong 1000ml H2O): acetonitrile tỉ lệ 70:45 Detector UV 230nm Tốc độ dòng: 1,5ml/phút Thể tích tiêm 10µl, nồng độ định lượng 20µg/ml Phương pháp 2 [12]: Cột C18 (Nova – Pak, 300 x 4,6mm) Pha động dung dịch đệm phosphat 0,067M pH=3,4: acetonitrile (1:1;v/v) Detector UV 227 nm Phương pháp 3 [11]: Cột C18 (250 x 4,6mm; 5µm) Pha động Acid orthophosphoric, pH 3,0 : acetonitril (60 : 40 ) Tốc độ 1,0ml/phút Detector 232 nm. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC)[3, 4, 5, 6, 16, 17, 18, 19, 20] Khái niệm sắc ký và sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Khái niệm về sắc ký Sắc ký là một nhóm phương pháp hoá lý dùng để tách và phân tích các cấu tử của những hỗn hợp phức tạp dựa vào việc sử dụng các quá trình sắc kí khác nhau trong các điều kiện động. Sự tách các thành phần trong mẫu dựa vào sự phân chia khác nhau của các chất khác nhau vào hai pha là pha động và pha tĩnh. Pha tĩnh có thể là chất rắn hay chất lỏng phủ nền chất rắn. Chất rắn được nhồi vào trong cột hay tráng trên bản mỏng thành film. Pha động là khí hay chất lỏng. Sự tách là do hấp phụ, phân bố, trao đổi ion hay loại cỡ [3]. Khái niệm về sắc kí lỏng hiệu năng cao Phương pháp HPLC (High performance liquid chromatography) là một phương pháp phân tách sắc ký dựa trên sự phân chia khác nhau giữa hai pha luôn tiếp xúc không trộn lẫn vào nhau. Trong đó, pha động là chất lỏng được đẩy qua pha tĩnh trong cột dưới áp lực của một bơm cao áp. Pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn được phân chia dưới dang tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi băng liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Sắc ký lỏng phân tách dựa trên cơ chế hấp phụ, phân bố khối lượng, trao đổi ion, loại cỡ hay tương tác hoá học trên bề mặt [3]. Nguyên tắc của quá trình sắc ký Pha tĩnh được nhồi vào cột tách theo một kỹ thuật nhất định. Pha tĩnh là yếu tố quyết định bản chất của quá trình sắc ký: Nếu pha tĩnh là bản chất hấp phụ (silicagel, nhôm oxy hoặc polyme thuần tuý) thì ta có sắc ký hấp phụ. Nếu pha tĩnh bản chất là silicagel có bao một lớp mỏng chất hữu cơ hoặc đã được liên kết hoá học với các nhóm hữu cơ ta có sắc ký phân bố. Nếu pha tĩnh là chất trao đổi ion ta có sắc ký trao đổi ion. Nếu pha tĩnh là các gel, ta có sắc ký loại cỡ (sắc ký rây phân tử). Khi đặt chất phân tích lên đầu cột ta cho pha động chạy liên tục cột ta đã thực hiện quá trình sắc ký Ví dụ, nếu ta nạp một hỗn hợp ba chất A, B, C vào cột tách thì khi bơm pha đông qua cột tách các quá trình sắc ký xảy ra. Khi đó A, B, C tách ra khỏi nhau sau khi đi qua cột tách. Yếu tố quyết định hiệu quả sự tách sắc ký ở đây là tổng hợp của các tương tác: Tương tác giữa chất cần phân tích và pha tĩnh F1 là lực giữ chất phân tích trên cột. Tương tác giữa chất phân tích và pha động F2 là lực kéo chất phân tích ra khỏi cột. Tương tác giữa pha tĩnh và pha động F3. Theo sơ đồ sau: Trong đó F1, F2 đóng vai trò quyết định, F3 là yếu tố ảnh hưởng không lớn [6]. Cơ sở lý thuyết sắc ký Quá trình phân tách trong phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao là do quá trình vận chuyển và phân bố chất tan giữa hai pha là khác nhau. Khi pha động di chuyển với một tốc độ nhất định sẽ đẩy các chất tan bị pha tĩnh lưu giữ trong cột ra khỏi cột. Tuỳ theo bản chất pha động, pha tĩnh, chất tan mà quá trình rửa giải tách đuợc các chất ra khỏi cột. Khi ra khỏi cột mỗi chất sẽ được phát hiện và ghi lại dưới dạng pic. Tín hiệu của quá trình sắc ký cho chúng ta sắc ký đồ. Một sắc ký đồ có một hay nhiều pic phụ thuộc vào mẫu có một hay nhiều thành phần. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC Hệ thống bơm Bơm được xem là một trong các thành phần quan trọng nhất của hệ thống sắc ký. Bơm có tác dụng đẩy dung dịch pha động qua cột với một tốc độ hằng định. Có hai loại bơm Một loại bơm đẳng dòng (Isocratic pump) Hai là loại bơm chương trình dung môi và tốc độ dòng (Gradient pump) Bình chứa dung môi và hệ thống xử lý dung môi Bình chứa dung môi thường được làm bằng thuỷ tinh, đôi khi là thép không gỉ. Cần lọc các hạt trong dung môi (thường dùng các màng lọc cỡ lỗ 0,45µm) và đuổi khí hoà tan trong dung môi (thường dùng máy siêu âm đuổi khí). Trong phương pháp thông thường chỉ cần một bình dung môi. Trong phương pháp gradient có thể cần đến 2, 3, 4 bình chứa dung môi. Hệ tiêm mẫu Để đưa mẫu vào cột có thể dùng bơm tiêm để tiêm vào đầu cột. Phương pháp phổ biến là dùng van tiêm có vòng chứa mẫu (sample loop) có dung tích xác định và chính xác, có thể thay đổi vòng chứa mẫu với các dung tích khác nhau. Một số máy HPLC có hệ thống tiêm mẫu tự động có thể lập trình điều khiển thể tích tiêm (microsyringe), số lần tiêm và chu kì rửa vòng chứa mẫu. Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao Cột sắc ký lỏng hiệu năng cao có thể coi là bộ phận quan trọng nhất của hệ thống sắc ký vì ở đây xảy ra quá trình phân tách các chất. Cột có ảnh hưởng lớn tới khả năng tách các chất cần phân tách. Cột được chế tạo bằng thép đặc biệt trơ với hóa chất, chịu được áp suất cao đến vài trăm bar. Trong cột nhồi pha tĩnh của hệ sắc ký. Cột có nhiều kích cỡ khác nhau, tuỳ mức độ và mục đích của quá trình sắc ký. Một cột phân tích thông thường dài 10-30cm có đường kính 4-10mm, hạt nhồi cột cỡ 5-10µm, số đĩa lý thuyết 40.000 – 60.000 Với chất nhồi cột cỡ 3-5µm có thể dùng các cột ngắn (3 - 7,5 cm) và nhỏ (đường kính trong 1 - 4, 6mm), số đĩa lý thuyết có thể lên đến 100.000 và cột này có hiệu lực rất cao. Detector trong HPLC Là bộ phận phát hiện các chất trong pha động khi nó ra khỏi cột sắc ký liên tục. Đó là bộ phận thu nhận, phát hiện các hợp chất của chúng dựa theo một tính chất nào đó của chất cần phân tích. Các loại detector phổ biến Detector UV-VIS (Utraviolet/Visible Spectrophotometric Detertor) Detector huỳnh quang (Fluorescence Detector) Detector khối phổ (Mass Spectrophometric Detector) Detector điện hoá (Electrochemical Detector) Detector tán xạ bay hơi (Evaprative Light Scattering Detector) Detector đo độ dẫn điện (Electrical Conductivity Detector) Detector đo chỉ số khúc xạ (Refractive Index Detector) Detector chuỗi Diod (Diod Array Detector) Bộ phận ghi tín hiệu: Recorder Bộ điều khiển: Computer Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký và các yếu tố ảnh hưởng Thời gian lưu tR và thể tích lưu VR Thời gian lưu tR (phút) là thời gian cần để một chất di chuyển từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ (tính từ lúc tiêm đến lúc xuất hiện pic). Nếu tR là thời gian lưu giữ của một chất thì Trong đó: tR’ là thời gian lưu hiệu chỉnh (thời gian lưu thực) t0 là thời gian chết (thời gian chất không bị lưu giữ nghĩa là tốc độ di chuyển của chất bằng tốc độ di chuyển của dung môi). Khi pha động chảy qua cột sắc ký với một tốc độ không đổi thì thời gian lưu có thể thay thế bằng thể tích lưu, VR là thể tích dung môi đi qua cột cần để di chuyển chất từ nơi tiêm mẫu qua cột sắc ký, tới detector và cho pic trên sắc đồ. Trong đó: VR phụ thuộc vào: tính chất pha tĩnh, bản chất của pha động, tốc Fc là thể tích pha động trong một đơn vị thời gian; tR và VR là các đại lượng phản ánh sự phân bố của chất tan vì vậy hai đại độ dòng, tính chất chất tan, nhiệt độ… Hệ số phân bố K Trong quá trình sắc ký luôn có sự phân bố của các chất tan giữa pha động và pha tĩnh. Sự phân bố này được đặc trưng bởi cân bằng phân bố với hệ số phân bố tính theo công thức: Trong đó, Cs và Cm là nồng độ chất tan phân bố ở pha tĩnh và pha động tương ứng, k là hệ số phân bố ở trạng thái cân bằng xác định tốc độ trung bình của mỗi vùng chất tan do pha động vận chuyển nó qua cột. K chỉ phụ thuộc vào: bản chất của chất tan, bản chất pha động, bản chất pha tĩnh, nhiệt độ. Nếu K lớn thì tR lớn (pic ra muộn) Nếu K nhỏ thì tR nhỏ (pic ra sớm) Thừa số dung lượng K’ K’ là đại lượng biểu thị khả năng phân bố của chất tan trong hai pha cộng với sức chứa của cột, tức là tỉ số giữa lượng chất tan trong pha tĩnh và lượng chất tan trong pha động ở thời điểm cân bằng Trong đó tR là thời gian lưu, to là thời gian chết. K’ phụ thuộc bản chất hai pha, bản chất chất tan, nhiệt độ, đặc điểm cột, thể tích pha động và pha tĩnh. K’ càng lớn tốc độ di chuyển càng thấp. Trong phân tích thường chọn cột, pha động và các điều kiện phân tích sao cho: 1≤K’≤8 Nếu K’ <1 thời gian phân tích ngắn pic ra sớm dễ lẫn với tạp Nếu K’ >8 thì thì gian phân tích sẽ quá dài, tốn dung môi Tốc độ di chuyển tỷ đối của hai chất Được đánh giá qua thừa số chọn lọc (selectivity-factor) Để tách riêng hai chất thường chọn α = 1, 05 - 2,0. Nếu α càng lớn thì hai chất tách nhau càng tốt, α nhỏ hai chất khó tách nhau, nhưng α qua lớn thì thời gian phân tích sẽ quá dài. Độ phân giải Là đại lượng đo mức độ tách hai chất trên một cột sắc ký (ví dụ A và B) Như vậy Rs phụ thuộc vào: Hiệu lực cột Thừa số chọn lọc α Thừa số dung lượng K’B Rs tối ưu ≥ 1, 5 Có thể làm tăng Rs bằng cách: Tăng N: Tăng chiều dài cột giảm tốc độ dòng. Tăng K’B: Thay đổi pha động làm Rs thay đổi lớn Tăng α: Thay đổi pha động hay pha tĩnh làm Rs thay đổi lớn f. Hệ số bất đối AF Trong đó: W là độ rộng đáy píc đo ở 1/20 chiều cao của pic d là khoảng cách từ đường vuông góc hạ từ đỉnh pic đến mép đường cong phía trước ở 1/20 chiều cao pic. Yêu cầu AF = 0,9 - 2,0. Vai trò: AF càng gần 1 thì pic càng có dạng phân phối chuẩn Gauss nên kết quả tính theo diện tích pic sẽ càng chính xác hơn. Các yếu tố ảnh hưởng: pH quyết định dạng tồn tại của chất tan nên từ đó ảnh hưởng đến AF Cột tốt thì AF sẽ tốt Thể tích tiêm Cải thiện AF Chọn cột phù hợp Điều chỉnh pH để chất tan tồn tại ở dạng thích hợp. Thể tích tiêm thích hợp. Số đĩa lý thuyết N Số đĩa lý thuyết cho biết hiệu lực cột. Từ công thức ta thấy N phụ thuộc vào tR và W (độ rộng pic) Nếu tR càng lớn thì N có thể sẽ tăng, tuy nhiên thời gian phân tích kéo dài. W (độ rộng pic ở đáy) hay W1/2 (độ rộng pic đo ở 1/2 chiều cao) càng nhỏ thì N càng lớn nhưng W và W1/2 sẽ nhỏ hơn khi tR nhỏ. Khi tR cố định thì bản chất của cột, pha động, pH là các yếu tố quyết định trong đó cột đóng vai trò quan trọng. Để đánh giá hiệu lực cột thường tính số đĩa lý thuyết trên một đơn vị độ dài cột : Khi các điều kiện khác cố định thì cột nào có số đĩa lý thuyết cao hơn cột đó sẽ có hiệu lực cao hơn. Xác định tỷ số giữa tín hiệu và nhiễu Trong đó H là chiều cao pic thành phần cần quan tâm trong sắc ký đồ từ dung dịch đối chiếu quy định (pic C). hn là giá trị tuyệt đối của chiều cao nhiễu lớn nhất lệch khỏi đường nền trong khoảng sắc đồ thu được sau khi tiêm dung dịch mẫu trắng. Khoảng sắc đồ cần quan sát có độ dài bằng 20 lần độ rộng đáy ở chiều cao của pic C và ở điểm giữa của nó là vị trí tương đương với vị trí của pic C (vị trí của pic thành phần cần quan tâm). Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký Lựa chọn cột (pha tĩnh) Pha tĩnh trong HPLC chính là chất nhồi cột để làm nhiệm vụ tách một hỗn hợp chất phân tích. Đó là các chất rắn, xốp kích thước hạt rất nhỏ đường kính hạt từ 3-10µm, diện tích bề mặt thường từ 50-500m2/g. Trong phương pháp định lượng cetirizin sử dụng sắc ký phân bố nên dưới đây chỉ tập trung vào lựa chọn pha tĩnh cho sắc ký phân bố. Theo tài liệu mới sắc ký phân bố được chia làm ba loại sau [16, 21]: Sắc ký phân bố pha thuận (Normal phase –HPLC) Sắc lý phân bố pha đảo (Reserse phase –HPLC) Sắc ký pha thuận có sử dụng nước (Aqueous Normal phase) Bản chất chính của sự tách sắc ký loại này là dựa trên tính chất hấp phụ lên bề mặt của pha tĩnh . Cơ chế tách là cơ chế hấp phụ. Trong sắc ký pha thuận thì pha tĩnh sẽ phân cực hơn (ví dụ silicagel) còn pha động không phân cực hexan, heptan, tetrafuran có thể trộn lẫn một lượng nhỏ các dung môi hữu cơ phân cực như isopropanol, ethylacetat, hoặc chloroform. Thời gian lưu của chất phân tích tăng khi độ không phân cực của pha động tăng, chất phân tích là các chất phân cực. Trong sắc ký pha đảo thì pha tĩnh ít phân cực (hydrophobic) còn pha động phân cực như H2O hoặc là sự pha trộn của H2O, methanol hoặc acetonitrile Trong sắc ký pha thuận có sử dụng nước đó có thể nói đó là phương pháp có sự kết hợp của cả pha thuận và pha đảo. Cột sử dụng trong loại sắc ký này là cột pha thuận trên bề mặt Si –H, pha động thường sử dụng là acetonitrol hoặc methanol và một lượng nhỏ H2O, pha động này có sự hiện diện cả H2O và yếu tố “normal” ít phân cực hơn pha tĩnh. Thời gian lưu sẽ giảm khi hàm lượng H2O trong pha động tăng. Loại sắc ký này thường áp dụng cho các chất có nhóm cacboxylic, dạng racemic, các chất khá phân cực mà sắc ký pha đảo không đảm nhận được [16, 21]. Yêu cầu của pha tĩnh trong HPLC: Phải trơ và bền vững với môi trường sắc ký Có khả năng tách một hỗn hợp chất tan nhất định trong điều kiện sắc ký Tính chất bề mặt ổn định (đặc biệt là đặc trưng xốp của nó) Cân bằng động học của sự tách phải xảy ra nhanh và lặp lại tốt Cỡ hạt phải tương đối đồng nhất. Lựa chọn pha động Pha động là dung môi dung để rửa giải chất tan (chất cần phân tích ) ra khỏi cột tách để thực hiện một quá trình sắc ký. Pha động là yếu tố thứ hai quyết định hiệu suất tách sắc ký của một hỗn hợp, thời gian lưu tR và hiệu quả tách Pha động trong HPLC có thể là dung môi hữu cơ hay hỗn hợp của 2, 3 dung môi theo tỷ lệ nhất định, cũng có thể là các dung dịch các muối có chứa chất đệm, chất tạo phức. Mỗi loại sắc ký sẽ có hệ dung môi rửa giải tách tốt nhất. Pha động có thể ảnh hưởng tới: Độ chọn lọc của pha động Thời gian lưu giữ của chất tan Hiệu lực tách của cột Độ phân giải của chất tan Độ rộng của pic sắc ký Hình dáng píc sắc ký Vì những lý do trên nên khi các điều kiện khác đã cố định thì việc lựa chọn pha động phù hợp là điều rất quan trọng. Những yếu tố chính cần chú ý trong khi lựa chọn pha động: Bản chất dung môi được lựa chọn Thành phần các chất trong pha động Tốc độ dòng của pha động pH của pha động (đặc biệt với sắc ký trao đổi ion và sắc ký cặp ion) Những yêu cầu của một pha động: Phải hoàn toàn trơ với pha tĩnh Phải hòa tan được chất mẫu Phải bền vững theo thời gian Các thành phần phải hoàn toàn tinh khiết Nhanh đạt được trạng thái cân bằng trong quá trình sắc ký Phù hợp với detector được sử dụng Phải có tính kinh tế và đảm bảo môi trường Trong sắc ký pha thuận pha động thường là các dung môi ít phân cực như n- hexan hoặc n-heptan và thường trộn lẫn một lượng nhỏ các chất phân cực như isopropanol, ethylacetat,cloroform,… Trong sắc ký pha đảo thường hệ dung môi là sự pha trộn của nước và các chất phân cực như methanol, acetonitrile, THF…Các hệ dung môi nay có thể hòa tan một lượng nhỏ acid hay base hữu cơ. Trong sắc ký pha thuận có sử dụng H2O pha động thường dùng là acetonitril, methanol và một lượng nhỏ H2O, có thể sử thêm một lượng nhỏ acid để tạo pH thấp. Chọn pH Cơ sở của việc chọn pH phù hợp được trình bày như dưới đây. Trong dung dịch ta có cân bằng sau: [AB] = [A+] + [B-] Theo cân bằng trên khoảng 50% phân tử sẽ bị ion hóa. Quá trình sắc ký có sự phân tách không giống nhau giữa ion và các phân tử trung tính. Các ion sẽ phân tách nhanh hơn khi đó trong dung dịch cân bằng mất đi và các phân tử trung tính sẽ tiếp tục phân chia kết quả pic thu được sẽ bị doãng. Chính vì vậy trong nhiều trường hợp của sắc ký hấp phụ pha đảo thường phải cho thêm đệm vào pha động để ổn định pH cho quá trình sắc ký. pH thường phải ổn định trong trường hợp sắc ký tạo cặp ion, sắc ký trao đổi ion,sắc ký hấp phụ mà chất tan có tính acid hay base. Do pH ảnh hưởng đến quá trình phân ly như vậy nên pH sẽ góp phần làm hiệu quả tách được tốt hơn. Thông thường các chất tan là acid hữu cơ thì phải dùng đệm pH acid, tuy nhiên cũng có trường hợp ngoại lệ. Và pH trong sắc ký tạo cặp ion thì pH tùy từng trường hợp. Tốc độ dòng Sau khi chọn được pha tĩnh, pha động, pH, ta tiến hành chạy và lựa chọn tốc độ dòng. Tốc độ dòng ảnh hưởng tới thời gian lưu, thừa số dung lượng, số đĩa lý thuyết của cột. Ứng dụng của HPLC Sắc ký nói chung và HPLC nói riêng có 3 ứng dụng chính: Định tính Thời gian lưu của chất thử trên sắc ký đồ tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn trên đối chiếu trên sắc ký đồ. Tuy nhiên việc định tính đơn thuần bằng HPLC không đảm bảo tính chắc chắn. Sắc ký điều chế Trong quá trình sắc ký các chất được tách ra và hứng lấy dung dịch rửa giải cho bốc hơi dung môi thu lấy chất. Định lượng và xác định giới hạn tạp chất Sắc ký lỏng hiệu năng cao có ứng dụng rất lớn trong định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất. Trong sắc ký, chất muốn phân tích được tách riêng ra khỏi hỗn hợp và được định lượng dựa vào chiều cao hay diện tích của đáp ứng pic so với chất chuẩn. Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong kĩ thuật HPLC: Phương pháp chuẩn ngoại: Cả hai mẫu thử và mẫu chuẩn đều được tiến hành trong cùng một điều kiện. Sau đó diện tích pic thu được từ mẫu thử được so sánh với mẫu chuẩn. Kết quả có thể tính theo cách chuẩn hóa một điểm hoặc chuẩn hóa từ một điểm trên dường tuyến tính. Phương pháp chuẩn nội : Là phương pháp cho thêm những lượng giống nhau của chất chuẩn thứ hai đáp ứng gần giống chất phân tích vào cả hai mẫu chuẩn và thử rồi tiến hành sắc ký. Chất chuẩn thứ hai được gọi là chất chuẩn nội.Yêu cầu của pic của chất chuẩn nội phải tách hoàn toàn ra khỏi pic của chất cần phân tích. Kết quả được tính dựa vào tỷ số diện tích hoặc chiều cao pic đáp ứng của chất phân tích và chất chuẩn nội. Phương pháp thêm chuẩn: Phương pháp này dùng trong HPLC khi có ảnh hưởng của chất phụ hay quá trình xử lý mẫu phức tạp. Mẫu thử được thêm một lượng chính xác chất chuẩn. Nồng độ chưa biết của mẫu thử được tính dựa trên sự chênh lệch nồng độ (lượng chất chuẩn thêm vào) và độ tăng của diện tích. Với phương pháp thêm nhiều lần ta có phương pháp thêm đường chuẩn. Phương pháp chuẩn hóa diện tích pic: Nguyên tắc: Hàm lượng phần trăm của một chất trong hỗn hợp nhiều cấu tử được tính bằng tỷ lệ phần trăm diện tích pic của nó so với tổng diện tích của tất cả các pic thành phần. Yêu cầu: Tất cả các thành phần phải được phát hiện và rửa giải hoàn toàn Tất cả các chất có đáp ứng như nhau với detector. Khi đó hàm lượng các chất thành phần được tính theo công thức sau: Tuy vậy sắc ký lỏng thì điều kiện tất cả các thành phần đều có đáp ứng như nhau với detector là rất khó. Khắc phục nhược điểm này của sắc ký lỏng người ta xây dựng hệ số đáp ứng cho từng thành phần. Để xây dựng hệ số đáp ứng người ta chọn một thành phần làm chuẩn có hệ số đáp ứng bằng 1. Các hệ số đáp ứng của các chất tính theo công thức sau: Trong đó : Sc và Sx là diện tích pic của thành phần chọn làm chất chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng. Cc và Cx là nồng độ của thành phần chuẩn gốc và thành phần cần tính hệ số đáp ứng. fc là hệ số hiệu chỉnh. Khi đó hàm lượng thành phần X tính theo công thức: Đây là phương pháp hay áp dụng để định lượng và thử giới hạn tạp chất trong thuốc. ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP, NỘI DUNG, VÀ PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU Chế phẩm thứ nhất (M1): Tên biệt dược: HICET –viên nén bao film 10mg Công ty sản xuất Micro labs limited Số đăng ký: VN -5908-01 Số kiểm soát: 37L49 Số lô : HICH 0007 Hạn dùng: 7/2009 Chế phẩm thứ 2 (M2) Tên biệt dược: CEZIL –viên nén bao phim 10mg Công ty sản xuất Alkem labs Số đăng ký VN-7451-03 Số kiểm soát 37L51 Số lô 6004 EN Hạn dùng 3/2009 PHƯƠNG TIỆN, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT Hóa chất Sử dụng chất chuẩn của phòng kiểm nghiệm các dạng bào chế –viện kiểm nghiệm Chuẩn cetirizin Hàm lượng trên chế phẩm khô: 99, 22% nguyên trạng Acid H2SO4 1M Acid phosphoric 12,5% Acetonitrile dùng cho HPLC Nước cất dùng cho HPLC Thiết bị, dụng cụ Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao: MERCH –HITACHI D7000 Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao HEWLETT PACKARD 1100 Detector UV: Diod array Detector Máy lắc siêu âm Bransom 5210 Bộ lọc chân không Milipore, màng 0,45µm Whatman Cân phân tích Mettler Toledo AB 204 độ chính xác 0,1mg Cân phân tích Mettler Toledo AB 245 độ chính xác 0,01mg Bình định mức dung tích 10ml, 20ml, 25ml, 50ml, 100ml Cốc đong 50ml, 100ml, 500ml Pipet chính xác, pipet thường, đũa thủy tinh, phễu lọc Bơm tiêm, lọ đựng mẫu bình pha động, bình cầu các loại, giấy lọc… NỘI DUNG Khảo sát các điều kiện sắc ký Xây dựng chương trình sắc ký cho cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều, bao gồm: Chọn cột sắc ký Chọn pha động Chọn dung môi pha mẫu Detector UV, bước sóng đo Tốc độ dòng Thể tích tiêm Cách xử lý mẫu Đánh giá phương pháp Tiến hành xác định tính thích hợp của hệ thống sắc ký Xác định độ tuyến tính giữa nồng độ và diện tích pic Xác định độ lặp lại của phương pháp Xác định độ đúng của phương pháp Ứng dụng định lượng cetirizin trong chế phẩm rắn phân liều. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Phương pháp thực nghiệm để tìm điều kiện sắc ký cho phép phát hiện được cetirizin trong chế phẩm và tách tốt cetirizin với các pic của dung môi và tá dược, thu thập số liệu và xử lý thống kê để đánh giá kết quả. Phương pháp cụ thể: sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Các thông số thống kê đặc trưng để xử lý kết quả nghiên cứu Giá trị trung bình : Độ lệch chuẩn : Sai số chuẩn : Sai số tương đối : Sai số tương đối : Cách đánh giá kết quả Khi độ pha loãng của mẫu thử và mẫu chuẩn giống nhau, hàm lượng của cetirizin trong chế phẩm được tính theo c._.