Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, khả năng nhân giống in vitro hoa Lilium poilanei Gapnep và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen chi Lilium

ạnh đó ngành trồng và sản xuất hoa đang đặt mục tiêu không chỉ phục vụ nhu cầu trong nước mà còn hướng ra thị trường quốc tế. Theo Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, năm 2005 diện tích hoa và cây cảnh cả nước có 13189 ha, kim ngạch xuất khẩu đạt khoảng 13,5 triệu USD dự kiến đến năm 2010 diện tích hoa cây cảnh đạt 15000 ha, trong đó sản lượng hoa đạt 1,5 tỷ cành, kim ngạch xuất nhập khẩu đạt 60 triệu USD [1]. Chính vì vậy mà việc trồng và sản xuất một loại hoa cắt như hoa lily đang được chú ý đầu tư trong những năm gần đây. Tuy nhiên, thực tế cho thấy rằng hầu hết các giống hoa lily ở Việt Nam được nhập từ nước ngoài (phần lớn là từ Trung Quốc, Hà Lan...) với giá thành cao, chất lượng không đảm bảo và nhất là dễ bị thoái hoá do nấm, vi khuẩn, virus... vì thế năng suất thấp, chất lượng hoa lily giảm, việc sản xuất hoa lily là không chủ động. Đây là những hạn chế trong trồng và sản xuất hoa lily ở nước ta cần tìm ra biện pháp để khắc phục. Như chúng ta đã biết, nguồn gen cây hoa lily trên thế giới rất đa dạng và phong phú, ở nước ta các nhà khoa học đã tìm thấy một số loài hoa lily rất khác nhau, nhất là các loài hoang dại. Có thể kể đến ở đây là các loài như cây Bách Hợp (Lilium brownii F.E Brown) mọc hoang dại trên núi đá, các đồi cỏ ở Bắc Thái, Cao Lạng và loài Lilium poilanei Gapnep có ở đồi cỏ Sa Pa tỉnh Hoàng Liên Sơn (Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, 1978) [2]. Năm 2008, nhà khoa học Julian Shaw đã mô tả trên tạp chí The Plantsman loài hoa lily mới ở Sa Pa - Lào Cai có tên Lilium arboricola [49]. Đây là những nguồn gen rất có ý nghĩa trong chọn tạo giống. Bởi vì, có một nền di truyền đa dạng, phong phú là tiền đề tiên quyết để dẫn đến thành công cho bất kỳ một chương trình chọn giống nào. Các thông tin về nền di truyền của các giống là cơ sở quan trọng cho định hướng tiếp theo. Đối với loài hoa lily khi chúng ta xác định được mối quan hệ di truyền giữa các giống lily với nhau, từ đó chọn ra được những cặp bố mẹ phù hợp dẫn đến chọn tạo được những giống hoa lily có năng suất cao và phẩm chất tốt thích hợp với điều kiện khí hậu Việt Nam là vô cùng cần thiết. Xuất phát từ thực trạng nêu trên, nhằm góp phần vào việc nghiên cứu bảo tồn và phát triển hoa lily ở Việt Nam chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, khả năng nhân giống in vitro hoa Lilium poilanei Gapnep và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen chi Lilium” 1.2. Mục đích và yêu cầu 1.2.1. Mục đích Khảo sát sinh trưởng của hoa Lilium poilanei Gapnep và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen hoa lily nhằm cung cấp một số dẫn liệu cơ bản về đặc tính nông sinh học và phân tử phục vụ công tác chọn tạo giống hoa lily mới ở Việt Nam, bước đầu nghiên cứu nhân in vitro phục vụ bảo tồn, phát triển nguồn gen hoa lily bản địa. 1.2.2. Yêu cầu - Khảo sát sinh trưởng, phát triển của củ giống hoa Lilium poilanei Gapnep được trồng trong điều kiện nhà lưới tại Gia Lâm - Hà Nội. - Xác định một số khâu trong quy trình nhân giống in vitro (khử trùng, môi trường khởi động, nhân nhanh, tạo rễ). - Đánh giá đa dạng nguồn gen hoa lily ở mức phân tử (RAPD). 1.3. ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 1.3.1. ý nghĩa khoa học của đề tài Cung cấp các số liệu cơ bản về đặc tính hình thái, đa dạng di truyền nguồn gen hoa lily ở Việt Nam. Từ kết quả đó sẽ bổ sung tài liệu tham khảo giảng dạy và nghiên cứu về cây hoa lily. 1.3.2. ý nghĩa thực tiễn của đề tài Kết quả của đề tài góp phần cung cấp vật liệu khởi đầu và các thông tin quan trọng về về đặc tính hình thái, sinh trưởng và phát triển phục vụ cho chọn tạo giống hoa lily mới ở Việt Nam. 2. Tổng quan tài liệu 2.1. Giới thiệu chung về hoa lily 2.1.1. Nguồn gốc và sự phân bố Cây hoa lily thuộc chi Lilium đã được nghiên cứu và thuần hoá gần 100 năm nay từ các loài hoa dại phân bố hầu hết trên các châu lục từ 10-600 vĩ bắc, đặc biệt là các vùng ôn đới và hàn đới hoặc các vùng núi nhiệt đới có độ cao từ 1200m trở lên như: Trung Quốc, Nhật Bản, Nam Triều Tiên, California (Mỹ) và một số nơi khác. Ngày nay, hoa lily được trồng ở rộng rãi trên khắp thế giới (Trần Duy Quý,2004) [19]. 2.1.2. Vị trí phân loại thực vật Trong hệ thống phân loại thực vật, hoa lily được xếp vào nhóm một lá mầm (Monocotylendones), phân lớp hành (Lilidae), bộ hành (Liliales), họ hành (Liliaceae), chi Lilium (Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến, 1978) [2]. Nếu phân loại theo khả năng sử dụng thương mại thì chia thành 3 nhóm lớn là Asiatic lily, oriental lily và Lilium longiflorum (easter lily) (Rimando.T.J, 2001) [50]. Nhóm Asiatic lily bao gồm các giống hoa màu đỏ sẫm, cam, hồng, hồng đào, vàng tươi cho đến màu kem, màu trắng hay có sọc. Nhóm oriental lily thì bao gồm các màu trắng, đỏ thẫm, trắng có nhiều đốm đỏ hoặc hồng. Nhóm easter lily bao gồm các giống hoa có màu trắng. Hiện nay, việc lai giữa nhóm Asiatic lily và oriental lily với easter lily nhằm cải thiện các đặc tính của các giống lai có sẵn đang là xu hướng trong công tác lai tạo giống lily. Chi Lilium (Lilium spp.) bao gồm khoảng 100 loài, được phân loại thành 7 nhóm (Veli-Pekka Pelkonen, 2005) [58]. Lớp Loài 1. Nhóm Martagon L. distichum, hansonii, martagon, medeoloides, isingtauense 2. Nhóm American a) L.boladner, columbianum, kelloggii, umboldtii, rubescens, washingtonianum b) L.maritimum, nevadense, occidentale, parryi, parvum, roezlii c) L.canadense, grayi, iridollae, michauxii, michiganense, superbum d) L. catesbacei, philadelphicum 3. Nhóm Candidum L.bulbiferum candidum, carniolicum, chalcedomcum, monadelphun, polyphyllum, pomponium, pyrenaicum. 4. Nhóm Oriental L. auratum, brownii, japonicum, nobilissimum, rubellum, speciosum 5. Nhóm Asiatic a) L. davidii, duchartrei, henryi, lancifolium, lankogencse, leichtlini, papilliferum b) L. amabile, callosum, cernuum, concolor, pumilum c) L. bakerianum, mackliniae, neplense, ochraceum, sempervivoideum, taliense, wardii 6. Nhóm Trumpet a) L. leucanhum, regale, sargentiae, sulphureum b) L. lormosanum, longiflorum, nedgherrense, philimg/lense, wallichianum 7. Nhóm Dauricum L. danricum, maculatum Đến năm 2008 ở nước ta đã phát hiện được 3 loài hoa lily là: Lilium brownii F.E Brown (Bắc Thái, Cao Lạng), Lilium poilanei Gapnep và Lilium arboricola (Sa Pa - Lào Cai). Trong sản xuất hiện nay ở nước ta chủ yếu trồng hoa loa kèn Lilium longiflorum Thunb. Đây là giống được nhập nội vào Việt Nam từ rất lâu do người Pháp du nhập vào từ thế kỉ XIX, gần đây có một số giống hoa lily màu nhập nội đang được trồng thử nghiệm ở Sa Pa, Đà Lạt, Hà Nội, Hải Phòng và cho hiệu quả kinh tế cao. 2.1.3. Đặc điểm thực vật học cây hoa lily Cây hoa lily thuộc loại cây thân thảo một lá mầm và là cây lâu năm, gồm 2 phần: phần dưới mặt đất (thân vảy, rễ), phần trên mặt đất (lá, thân). 2.1.3.1. Thân vảy Thân vảy cây hoa lily là phần phình to của thân tạo thành. Trên đĩa thân vảy có vài chục vảy hợp lại, vảy có dạng hình cầu, hình dẹt, hình trứng dài, hình elíp. Thân vảy không có vỏ bao bọc, có màu sắc, số lượng vảy tuỳ giống. 2.1.3.2. Rễ Gồm 2 loại: rễ thân hay còn gọi rễ trên và rễ gốc còn gọi là rễ dưới. Rễ thân do phần thân mọc dưới đất sinh ra, có chức năng nâng đỡ thân, hút dinh dưỡng, nước. Rễ gốc được sinh ra từ gốc thân vảy, có nhiều nhánh, sinh trưởng khoẻ, chức năng chủ yếu hút nước, dinh dưỡng. 2.1.3.3. Lá Lá sắp xếp trên thân có thể xen kẽ, đối diện hoặc vòng xoắn. Lá có dạng hình kim, xoè hoặc thuôn, hình giải, đầu lá hơi nhọn, lá mềm có mầu xanh bóng. Kích thước lá tuỳ từng giống. Đối Vòng Xen kẽ Hình 2.2. Sự sắp xếp lá cây hoa lily 2.1.3.4. Hoa Mọc đơn lẻ hoặc xếp đặt trên trục hoa, bao hoa hình lá nhỏ. Hoa chúc xuống, vươn ngang hoặc hướng lên tuỳ giống, đây là đặc điểm cơ bản để phân loại giống, ví dụ: hoa các giống Lilium formolongo có hoa hướng lên, hoa các giống Lilium longiflorum có hoa vươn ngang. Hoa có nhiều màu sắc đa dạng và phong phú, có mùi thơm quyến rũ. Dạng buông thõng Dạng phẳng Dạng bát Dạng uốn ngược Hình 2.3. Hình dạng bông hoa lily 2.1.3.5. Quả, hạt Quả lily là quả nang hình trứng dài, có 3 góc và 3 nang, có tới vài trăm hạt. Hạt lily hình dẹt, xung quanh có cánh mỏng, hình bán cầu, hoặc 3 góc, hoặc vuông dài. Độ lớn, số lượng, trọng lượng hạt tuỳ giống. 2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển và yêu cầu điều kiện ngoại cảnh 2.1.4.1. Đặc điểm sinh trưởng, phát triển Đối với loại có hạt mọc nhanh như các giống thuộc nhóm Asiatic và Trumpet, trong điều kiện tốt có thể nẩy mầm sau khoảng 14 ngày hoặc sớm hơn, lá thật sẽ xuất hiện trong 4 tuần hoặc hơn. Đối với loại có hạt mọc chậm như các giống thuộc nhóm Oriental và Martagon có 2 giai đoạn nẩy mầm. Giai đoạn đầu thích hợp điều kiện ấm áp, kéo dài khoảng 3 tháng, củ nhỏ xuất hiện sau khoảng 2 tháng. Giai đoạn sau thích hợp với điều kiện lạnh kéo dài từ 2 đến 3 tháng, lá thật xuất hiện sau đó từ 1 đến 2 tuần. Củ hoa lily vùi trong đất khoảng 2 tuần thì nẩy mầm tuy nhiên trong trường hợp xử lý lạnh không đầy đủ hoặc trời lạnh, thời gian nẩy mầm có thể kéo dài đến 5 tuần. Các giống khác nhau có mức độ chênh lệch khá lớn về thời gian sinh trưởng. Sau khi mọc, sự sinh trưởng và phát dục có thể chia ra năm giai đoạn là phát triển trục thân, ra nụ, nở hoa, kết hạt, chết khô (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2004) [3]. Chiều cao cây được quyết định bởi số lá và chiều dài đốt, số lá chịu ảnh hưởng bởi chất lượng củ giống, điều kiện và thời gian xử lý lạnh củ giống, thường thì số mầm lá được quyết định trước khi trồng vì vậy chiều cao cây chủ yếu được quyết định bởi chiều dài đốt. Điều kiện ánh sáng yếu, ngày dài, nhiệt độ thấp và xử lý bảo quản lạnh lâu đều có tác dụng kéo dài đốt thân, ngược lại ánh sáng mạnh, ngày ngắn nhiệt độ cao, ức chế đốt kéo dài. 2.1.4.2. Yêu cầu điều kiện ngoại cảnh * Nhiệt độ: Nhìn chung cây hoa lily chịu lạnh khá, chịu nóng kém, nhiệt độ thích hợp ban ngày khoảng 20-250C, ban đêm khoảng 120C, thời gian đầu nhiệt độ thấp có lợi cho ra rễ và phân hoá hoa. * ánh sáng: Hoa lily ưa cường độ ánh sáng trung bình. Chiếu sáng ngày dài ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát dục của hoa. * Độ ẩm: Đất quá ẩm hoặc quá khô đều ảnh hưởng đến sự sinh trưởng, phát triển của hoa lily, độ ẩm thích hợp 70 - 80%. Độ ẩm không khí thích hợp là 80 - 85%, nếu quá lớn dễ gây thối củ và thối rễ. * Đất: Đất trồng lily có thành phần cơ giới nhẹ, đất xốp, nhiều mùn, độ ẩm vừa phải, thoát nước nhanh nhưng giữ ẩm tốt. Loại đất thích hợp nhất đó là đất phù sa và đất thịt nhẹ giàu chất hữu cơ, đất trung tính pH = 6.5 - 7. 2.1.5. Tổ chức gen của cây hoa lily Lily là một trong những loài có kích cỡ gen rất lớn. Ví dụ như: ADN của Lilium henryi chứa 32 tỷ cặp bazơ, một số loài có số cặp bazơ tăng lên 100 tỷ cặp (Bennet, M.D and Smith, J.B 1976) [31]. Như vậy có sự khác nhau trong kích cỡ bộ gen giữa các loài (Siljak- Yakovlev etal, 2003) [51]. Bộ gen của lily được xắp xếp trong các NST đơn và NST kép. Thể đơn bội số nhiễm sắc thể là 12 và không thay đổi giữa các giống. Lilium trong tự nhiên thì hầu hết là lưỡng bội (2n=24) nhưng có một vài loài có thể tam bội (3n=36) không có khả năng sinh sản. Tất nhiên thể tứ bội có tìm thấy và thường là sinh sản tốt [8]. Khi kỹ thuật nhân giống đã phát triển, sản xuất cây tứ bội đã được thực hiện một cách nhân tạo bằng xử lý hạt hoặc củ của cây lưỡng bội với colchicines. Dạng tứ bội đã được chứng minh là bền vững hơn trong tập tính sinh trưởng, có cấu trúc tế bào dày hơn và khả năng chống bệnh cao. Khi lai với thể lưỡng bội chúng sinh ra con lai thể tam bội (McRae Edward Austin, 1998) [46]. Nói chung, kích cỡ gen và cấu trúc của nó là rất ổn định trong giống, thông thường thể lưỡng bội số nhiễm sắc thể chiếm ưu thế trong các loài, cây lai hoặc cây trồng. 2.2. Tình hình sản xuất hoa lily trên thế giới và Việt Nam 2.2.1. Tình hình sản xuất hoa lily trên thế giới Với ưu thế là một loài hoa đẹp và được ưa chuộng ở nhiều nơi trên thế giới vì vậy hoa lily được trồng rộng rãi ở nhiều quốc gia trên thế giới với diện tích không ngừng được mở rộng. Bảng 2.1. Diện tích trồng hoa lily ở một số nước năm 2005-2006 STT Nước Diện tích (ha) 1 Hà Lan 3699 2 Nhật Bản 189 3 Pháp 420 4 Mỹ 170 5 New zealand 110 6 úc 25 7 Isael 100 8 Chilê 240 9 Achentina 200 10 Trung Quốc 200 11 Nam Phi 20 Tổng 5173 (Nguồn: Trung tâm củ giống hoa Quốc tế) Một trong những nước đứng đầu trong sản xuất hoa lily trên thế giới hiện nay là Hà Lan. Năm 1997, tổng diện tích trồng hoa lily của Hà Lan là 356 ha, đến năm 2006 thì diện tích này đã là 3699 ha diện tích này đứng thứ hai trong tổng diện tích hoa cắt trồng bằng củ sau hoa tuylip. Hoa lily được phát triển mạnh trong những năm gần đây là do người Hà Lan đã tạo ra được rất nhiều giống hoa mới có hoa đẹp, chống chịu sâu bệnh tốt và cho năng suất cao. Bên cạnh đó do kỹ thuật điều khiển ra hoa của người Hà Lan đã phát triển rất nhanh và có thể điều khiển cho hoa ra được quanh năm. Mỗi năm Hà Lan tạo ra từ 15-20 giống mới, sản xuất 1315 triệu củ giống lily, cung cấp cho nhiều nước trên thế giới (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2004) [3]. ở Italia tổng diện tích trồng hoa là trên 8000 ha (1996) thì hoa lily chiếm từ 280-300 ha, với tổng sản lượng thu được đạt giá trị 71 triệu USD. Toàn bộ củ giống, ước tính khoảng 152 triệu củ, dùng trong sản xuất hoa cắt được nhập khẩu chủ yếu từ Hà Lan, khoảng 70% là giống Lilium elegans, 20% là giống lai phương đông và 10% là giống Lilium longiflorum (Grassotti. A,1996) [38]. ở Châu á hiện nay thì Trung Quốc là nước phát triển mạnh mẽ việc sản xuất hoa lily với nhiều vùng trồng hoa rộng lớn như ở: Thượng Hải, Bắc Kinh, Cam Túc, Vân Nam, Tứ Xuyên. Trong đó Vân Nam được mệnh danh là vương quốc hoa của Trung Quốc đứng đầu về diện tích và sản lượng hoa cắt cành của cả nước. Hiện nay diện tích hoa lily cắt cành ở đây là 450 ha, sản lượng là 2201 triệu cành, diện tích sản xuất củ giống là 120 ha, sản lượng là 2600 triệu củ. Hoa lily ở đây thường được tiêu dùng trong nước và xuất khẩu sang một số nước thuộc khu vực Đông Nam á và Nhật Bản. Nhật Bản là nước sản xuất hoa lớn ở Châu á với diện tích là 4600 ha (1992), trong đó diện tích hoa lily chiếm 508 ha, đứng ở vị trí thứ tư sau hoa hồng, hoa cẩm chướng và hoa cúc. Hàn Quốc cũng là quốc gia có thế mạnh trong nghề trồng hoa, lượng hoa xuất khẩu của Hàn Quốc lớn nhất khu vực Đông Bắc á. Theo thống kê năm 2002, Hàn Quốc có 15000 ha trồng hoa với 1,2 vạn người tham gia, giá trị sản lượng đạt 700 triệu USD, gấp 8 lần năm 1989. Trong đó, hoa lily là loại hoa có hiệu quả kinh tế cao nhất trong các loại hoa ở đây. Ngoài ra còn phải kể đến một quốc gia có công nghệ sản xuất hoa lily cắt cành rất tiên tiến đó là Đài Loan. Năm 2001 nước này trồng 490 ha hoa lily, trong đó xuất khẩu hoa lily cắt cành đạt 7,4 triệu USD. Kênia là nước sản xuất hoa chủ yếu của Châu Phi và là nước xuất khẩu hoa tươi lớn nhất của châu lục này. Hiện nay, nước này có tới 3 vạn nông trường với hơn 2 triệu người trồng hoa, chủ yếu là hoa phăng, hoa lily, hoa hồng. Mỗi năm nước này xuất khẩu sang Châu Âu 65 triệu USD, trong đó chỉ riêng hoa lily đã chiếm 35% (Đặng Văn Đông, Đinh Thế Lộc, 2004) [3]. Ngoài các nước kể trên thì còn nhiều nước khác cũng có diện tích trồng hoa lily lớn là: Đức, Pháp, Mêhicô, Israel… Những năm qua, nhờ áp dụng các phương pháp chọn tạo giống truyền thống kết hợp với công nghệ sinh học hiện đại, trên thế giới đã tạo ra hàng nghìn giống hoa lily thương phẩm với đủ kích thước, màu sắc, kiểu dáng và hương thơm dịu mát, quyến rũ. Có thể nói, hiện nay hoa lily là một trong những loại hoa chiếm vị trí quan trọng trong các nhóm hoa cắt cành ở các nước tiên tiến. 2.2.2. Tình hình sản xuất hoa lily ở Việt Nam Việt Nam có điều kiện khí hậu, thổ nhưỡng thuận lợi để có thể trồng được nhiều loại hoa và cây cảnh. Sản phẩm hoa và cây cảnh có vai trò quan trọng trong cuộc sống khi thu nhập và nhu cầu thẩm mỹ của người dân ngày càng cao. Thị trường trong nước rộng lớn và phong phú, bên cạnh đó tiềm năng xuất khẩu cũng đầy hứa hẹn, hoa và cây cảnh Việt Nam nếu tổ chức tốt từ khâu sản xuất, quảng bá đến tiêu thụ sẽ tạo ra tiềm lực kinh tế lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp Việt Nam trong tiến trình chuyển đổi cơ cấu cây trồng. Hiện nay, ở nước ta hoa lily mới chỉ được trồng ở một số tỉnh thành phố có nghề trồng hoa phát triển: Đà Lạt, Thành Phố Hồ Chí Minh, Hà Nội, Hải Phòng... So với các chủng loại hoa khác thì hoa lily chiếm tỷ lệ về diện tích và số lượng còn nhỏ. Nước ta hình thành những vùng sản xuất hoa lily chính là: * Vùng đồng bằng sông Hồng: Với khí hậu bốn mùa, đây là vùng thích hợp cho trồng hoa. Hà Nội được đánh giá là có vùng trồng hoa lớn nhất tại huyện Từ Liêm với diện tích 500 ha trong đó xã Tây Tựu có 330 ha (chiếm 66% diện tích trồng hoa toàn huyện) chủ yếu là trồng hoa hồng, hoa cúc, hoa ly, hoa đồng tiền...Ngoài ra hoa lily được trồng rải rác ở cả 11 tỉnh khác như: Vĩnh Phúc, Thái Bình, Quảng Ninh, Hưng Yên... với diện tích khoảng trên 10 ha, chủ yếu mới chỉ cung cấp cho tiêu dùng trong vùng và một phần nhỏ để xuất khẩu. * Vùng các tỉnh phía Nam: Tập trung nhiều tại TPHCM với diện tích hoa cây cảnh hiện có 700 ha, tập trung ở 8 quận huyện như quận 12 (110 ha), Thủ Đức (87 ha), nhiều nhất là Củ Chi (131 ha) với khoảng 1400 hộ sản xuất hoa, cây cảnh. Các giống hoa cao cấp như lily, hồng môn, lay ơn giống mới, hoa đồng tiền giống mới, thiên điểu, tulip đang được ưa chuộng. * Vùng Đà Lạt: vùng này có diện tích trồng hoa không lớn nhưng lại là nơi sản xuất hoa nổi tiếng của cả nước. Đây là nơi có khí hậu ôn đới trong vùng nhiệt đới chung của cả nước. Lịch sử hình thành vùng Đà Lạt gắn liền với quá trình phát triển nông nghiệp. Đà Lạt được coi là một vùng nông nghiệp đặc sản chuyên sản xuất các loại hoa phù hợp với điều kiện thời tiết, khí hậu, đất đai. ở đây đã xuất hiện nhiều công ty liên doanh với nước ngoài sản xuất hoa tại Việt Nam. Điển hình là công ty Đà Lạt Hasfarm, công ty này bắt đầu công nghệ trồng hoa trong nhà kính từ năm 1994 và hiện nay vẫn đang tiếp tục mở rộng diện tích sản xuất. Đà Lạt Hasfarm là công ty đầu tiên ở Lâm Đồng áp dụng công nghệ này. Sản phẩm chính của Đà Lạt Hasfarm là hoa cắt cành, gồm hoa hồng, cúc, lily, cẩm chướng, đồng tiền...Trong số 20 ha trồng hoa của Hasfarm, hoa lily chiếm khoảng 4 ha, mỗi năm sản xuất 2 vụ, thu được khoảng 3 triệu bông phục vụ cho nội địa và xuất khẩu. Tuy nhiên, công ty Đà Lạt Hasfarm độc quyền và không chuyển giao bất cứ một kỹ thuật trồng trọt nào về hoa lily cho bất cứ một cơ sở nào trong nước vì họ muốn chiếm lĩnh thị trường tiêu thụ trong và ngoài nước. Đà Lạt hiện đang có diện tích trồng hoa lily nhiều nhất so với các địa phương khác trên cả nước (chiếm khoảng 8% trong tổng diện tích trồng hoa). Tình hình phát triển hoa lily ở Đà Lạt khá thuận lợi, một phần do thiên nhiên ưu đãi cho sự phát triển của các giống hoa nói chung và cho hoa lily nói riêng, một phần do kỹ thuật trồng hoa lily của Đà Lạt tương đối cao nên sinh trưởng phát triển khá tốt. Hiện nay, hoa lily là một trong những loại hoa đem lại hiệu quả kinh tế cao nhất cho một số công ty hoa ở Đà Lạt. Theo đề án phát triển rau quả và hoa cây cảnh đến năm 2010, tầm nhìn 2020 thì nước ta sản xuất rau hoa quả phải trên cơ sở áp dụng công nghệ cao, trước hết phải thực hiện quy trình sản xuất theo hướng thực hành nông nghiệp tốt (GAP) bảo đảm vệ sinh an toàn thực phẩm, cạnh tranh với hàng hóa nhập khẩu ngay tại thị trường trong nước và đẩy mạnh xuất khẩu. Trong thời kỳ 2010-2020, ngoài đáp ứng nhu cầu nội địa, kim ngạch xuất khẩu của rau hoa quả Việt Nam phấn đấu đạt 1,2 tỷ USD/năm [1]. 2.3. Tình hình nghiên cứu về xử lý nhiệt độ thấp đối với cây hoa lily 2.3.1. Cơ sở khoa học về ảnh hưởng của nhiệt độ đến quá trình ra hoa ở cây trồng Có rất nhiều thực vật mà yếu tố nhiệt độ ảnh hưởng rất sâu sắc đến sự khởi đầu và phát triển của cấu trúc sinh sản. Với những cây hàng năm thì ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự ra hoa thường là thứ yếu sau ảnh hưởng của quang chu kỳ. Nhưng với cây hai năm thì ngược lại: trong năm đầu chúng duy trì trạng thái dinh dưỡng, năm sau khi trải qua một thời gian lạnh dài thì chúng ra hoa. Nếu thực vật này không được tác động bởi nhiệt độ thấp thì phần lớn chúng được giữ lại ở trạng thái sinh trưởng sinh dưỡng không xác định. Người ta đã chứng minh rằng phần lớn những cây hai năm khi được xử lý lạnh nhân tạo và kèm theo quang chu kỳ thích hợp thì chúng có thể ra hoa ngay trong mùa sinh trưởng đầu tiên, tức là có thể biến cây hai năm thành cây một năm bằng biện pháp xử lý lạnh. Từ lâu người ta đã chứng minh rằng cơ quan tiếp nhận phản ứng nhiệt độ là đỉnh sinh trưởng của thân. Chỉ cần đỉnh sinh trưởng chịu tác động của nhiệt độ thấp cũng có thể gây nên sự phân hoá mầm hoa. Như vậy, đối với sự cảm nhận quá trình xuân hoá có các tế bào đang phân chia của đỉnh sinh trưởng. Giới hạn tác động của nhiệt độ thấp và thời gian tiếp xúc có hiệu quả thay đổi tuỳ theo từng loại thực vật, tức là tuỳ theo mức độ mẫn cảm của cây với nhiệt độ cảm ứng nói chung với đa số thực vật nhiệt độ từ 0-150C là có hiệu quả xuân hoá. Độ tuổi mẫn cảm với xuân hoá cũng thay đổi theo từng loài thực vật. Về bản chất của quá trình ra hoa ở thực vật đã có hai nghiên cứu riêng biệt về việc nở hoa của Sibum Sung, Richard M. Amasino và Caroline Deans. Những nghiên cứu này được tiến hành độc lập để tìm hiểu sự phát triển của hoa ở mức độ phân tử và nhằm phát hiện ra cơ chế ngăn cản cây cải thìa Arabidopsis thaliana không ra hoa cho tới tận mùa xuân. Caroline Dean và cộng sự (2004) [33] nghiên cứu gen VRN1 và VRN2 có trong gen nở hoa FLC (flowering locus C) - một sản phẩm protein ngăn chặn sự ra hoa bằng cách kiềm chế nhiều gen cần cho quá trình nở hoa. Trong khi đó Sung và Amasino (2004) [52] lại xác định gen khác là VIN3. Ba gen trên là do gen FLC kiểm soát và là các gen trong số nhiều gen cần thiết cho việc nở hoa của cây. Gen FLC cũng kiểm soát thời điểm thực vật nở hoa, đặc biệt là độ dài của ngày, tuổi của cây và các yêu cầu về quá trình xuân hoá. Trong mùa lạnh sự thể hiện của gen FLC ở mức thấp và thậm chí ở mức thấp này cho tới khi thời tiết ấm trở lại. Sung và Amasino đã xác định được gen có liên quan tới việc đo thời gian chịu lạnh và bắt đầu tình trạng xuân hoá. Họ kết luận rằng sự kích hoạt quá trình xuân hoá thay đổi trong các protein histone (các thành phần của chất nhiễm sắc) xung quanh gen FLC và VRN1, VRN2, VIN3 lặp lại những thay đổi này. 2.3.2. Một số kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến quá trình ra hoa cây hoa lily trên thế giới và Việt Nam * Trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ tới sự ra hoa của cây hoa lily. Trong đó xử lý lạnh củ giống đuợc xác định là điều kiện tiên quyết để điều tiết ra hoa. Củ giống lily có tập tính ngủ nghỉ, củ mới đào lên không thể nảy mầm, phải trải qua một thời gian rất dài mới có thể nảy mầm, nhưng nảy không đều. Xử lý lạnh phá vỡ ngủ nghỉ mới có thể nảy mầm được. Có thể kể đến một số kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự sinh trưởng phát triển của cây hoa lily như sau: Nghiên cứu của Lee.J và cộng sự (1996) [43] đã xác định điều kiện thuận lợi, thời gian xuân hoá cho các dòng mới của cây lai Asiatic (Lilium X elegans Thunb.) Kết quả cho thấy thời gian để cho hình thành chồi và hoa nở giảm khi khoảng thời gian của sự xuân hoá củ tăng. Xử lý lạnh hơn 4 tuần thì sớm xuất hiện chồi và hoa, 100% hoa nở và tăng số bông trên cành. Chiều cao cây, chiều dài và đường kính hoa không chỉ rõ mối quan hệ với sự xuân hoá, mặc dù có sự phản ứng khác nhau giữa các dòng. Liên tiếp xử lý lạnh (5+21+5 trong 2 tuần ở mỗi nhiệt độ) đã cho củ không ra hoa sớm, số hoa hình thành so với đối chứng (không xuân hoá) là như nhau. Kết quả nghiên cứu của Choi S.T và cộng sự (1998) [34] khi nghiên cứu ảnh hưởng của khoảng thời lượng xử lý lạnh và độ sâu trồng cây với sinh trưởng và nở hoa của Lilium spp. Ông đã kết luận rằng củ Lilium gelra và Lilium casablanca cho chất lượng hoa cắt cao, nếu được trồng sâu (vùi sâu 3 hoặc 6 cm) sau khi được xử lý lạnh 60 và 90 ngày. Củ Lilium joladan và Lilium dremadan nẩy mầm tốt nếu trồng nông (để lộ 1/2 củ) sau khi xử lý lạnh 75 ngày. Như vậy tuỳ thuộc từng giống mà có thời gian xử lý lạnh và độ sâu trồng phù hợp khác nhau. Erwin J.E và Engelen - Eigles G (1998)[37] nghiên cứu sự ngủ nghỉ và tính thuần thục trên củ Lilium longiflorum cv. Nellie While. Kết quả cho thấy sự ngủ nghỉ và tính thuần thục là 2 hiện tượng tách rời và ảnh hưởng bởi nhiệt độ khác nhau. Độ chín thuần thục của củ là khác nhau trong 2 năm trồng. Củ chín thuần thục là củ trải qua nhiệt độ lạnh dưới 160C trước 6 tuần, quá trình xuân hoá sẽ quyết định số lá cuối cùng và sự nở hoa nhưng chỉ khi củ còn non thì không dễ phản ứng với xuân hoá. Biểu hiện nhiệt độ xuân hoá và thời gian xuân hoá sẽ thay đổi trên cơ sở năm của củ chín thuần thục đạt được khi hình thái không thay đổi. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ và điều kiện chiếu sáng của Niimi Y và cộng sự (1999) [49] tới sự tái sinh và phát triển của vẩy củ đã được tiến hành trên 7 loài Lilium spp. Kết quả nghiên cứu cho thấy: để củ của 7 loài Lilium (Lilium rubellum Baker, Lilium speciosum Thunb.'Uchida', Lilium nobilissimum Makino, Lilium formosanum Wallace, Lilium longiflorum Thunb. 'Hinomoto', Lilium maculatum Thunb. và Lilium asiatic hybrid X 'Benisugata') trong 10 tuần ở nhiệt độ 150C hoặc 250C dưới điều kiện chiếu sáng liên tục (1000-1200 lux) hoặc tối. Hầu hết củ được hình thành ở 250C nhiều hơn ở 150C. Củ được hình thành hầu hết ở sáng tốt hơn ở tối và ánh sáng kích thích sự hình thành vẩy. Đối với Lilium nobilissimum củ hình thành từ vẩy lá dưới mọi điều kiện. Tất cả các loại củ hình thành sinh trưởng tốt ở 250C. Củ được hình thành sinh trưởng tốt nhất là Lilium formosanum, Lilium maculatum ở trong tối, Lilium rubellum và Lilium nobilissimum dưới ánh sáng, giống nhau là Lilium speciosum và Lilium asiatic hybrid X 'Benisugata' dưới ánh sáng hoặc trong tối. Củ hình thành ở 150C bị hỏng trong suốt thời lượng xử lý lạnh so với những củ hình thành ở 250C và mọc mầm thường muộn hơn sau khi trồng ở nhà kính. Bên cạnh việc xử lý củ lily thu được từ ruộng trồng thì củ lily in vitro cũng là một đối tượng được rất nhiều các nhà khoa học quan tâm và nghiên cứu. Trên đối tượng này Yae B.W (2001) [60] đã nghiên cứu ảnh hưởng của đường saccaroza trong nuôi cấy in vitro, kích thước củ trong ngủ nghỉ và sinh trưởng của củ sau in vitro. Củ in vitro của Lilium oriental hybrid “Casa Blanca” được đưa vào nhiệt độ thấp 50C và cây trồng trong nhà lưới trong thời gian 2 tuần. Hơn 95% lá được hình thành sau 6 tuần được theo dõi ở 50C ở củ trồng trong 3% saccaroza, 10 tuần trong 6% saccaroza và 12 tuần trong 9% saccaroza. Xử lý với GA3, GA4+7, và BA không có ảnh hưởng trong phá ngủ của củ. Tuy nhiên, xử lý lạnh cho kết quả phá vỡ sự ngủ nghỉ của củ. Tốc độ xuất hiện lá của củ tăng khi thời gian lạnh được kéo dài. 50% độ ẩm trong đất suốt giai đoạn lạnh là thích hợp cho sự tồn tại của củ và sự xuất hiện của lá. Rimando. T.J (2001) [50] cho biết điều kiện tốt nhất và thường sử dụng để xuân hoá củ giống là xử lý nhiệt độ thấp 50C trong 6-8 tuần. Củ không xuân hoá vẫn có thể nở hoa nhưng tốc độ sinh trưởng và sự nở hoa chậm. Sau khi xử lý lạnh củ Lilium longiflorum đem trồng ở nhiệt độ cố định 160C (đêm) và 210C (ngày) thì hoa nở sau trồng 110-120 ngày. Hoa xuất hiện đầu tiên 5-6 tuần sau trồng khi thân cao khoảng 10-15cm. Điều kiện tốt nhất cho Lilium longiflorum là khoảng 200C, thay đổi 13-230C cho các loài lily khác nhau. Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ cất giữ củ đối với sự hình thành nụ hoa và sự phá ngủ đã được Suzuki S, Kanahama K (2002) [53] tiến hành trên 3 giống lily lai:‘Morino-otome’, ‘Morino-sei’ và ‘Morino-roman’ là kết quả của phép lai Lilium X formolongi X Lilium rubellum. Khi củ của 3 giống được để ở nhiệt độ từ 50C đến 210C trong 8 tuần. Nhiệt độ thuận lợi cho hình thành nụ hoa của cây là khoảng 130C, nó thấp hơn của Lilium rubellum. * ở Việt Nam các nghiên cứu về phản ứng xuân hoá thực hiện trên nhiều đối tượng khác nhau. Một số nghiên cứu về ảnh hưởng của nhiệt độ thấp trên đối tượng hoa lily đã được tiến hành. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (1987) [4] đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của xử lý nhiệt độ thấp và Gibberellin đến sự sinh trưởng phát triển của cây hoa loa kèn trắng. Kết quả cho thấy việc xử lý nhiệt độ thấp 100C (liên tục trong 40 ngày) và Gibberellin đã làm cho cây sinh trưởng phát triển nhanh, rút ngắn thời gian ra hoa hàng tháng. Đây là nghiên cứu có ý nghĩa trong việc trồng và sản xuất hoa loa kèn trắng. Cụ thể hơn về ảnh hưởng của nhiệt độ thấp đến sinh truởng phát triển, Cao Ngọc Thuý và Hoàng Minh Tấn (1997) [5] đã nghiên cứu ảnh hưởng của việc xử lý nhiệt độ thấp đến sinh trưởng phát triển và hiệu quả kinh tế của hoa loa kèn trắng Lilium longiflorum hance. Kết quả nghiên cứu cho thấy việc xử lý nhiệt độ thấp 50C trong 20 ngày đã rút ngắn thời gian sinh trưởng từ 175 ngày (đối chứng) xuống 107 ngày và chất lượng hoa giảm sút không nhiều. Nguyễn Mạnh Khải, Nguyễn Quang Thạch (1999) [6] đã xử lý nhiệt độ thấp 50C củ giống hoa Lilium longiflorum thu thập từ Nam Định trong 3 tuần. Kết quả nghiên cứu cho thấy kích thước củ dùng để xử lý (đường kính 2,5 cm đến 4,5 cm) củ càng nhỏ mọc mầm càng sớm, ra nụ sớm, thu hoạch hoa sớm và tập trung hơn so với củ to. Tuy nhiên, củ càng nhỏ thì chất lượng hoa càng thấp (chiều cao, đường kính thân, số mỏ hoa trên một cành, kích thước mỏ, tuổi thọ bảo quản trung bình đều thấp hơn so với củ to). Hoàng Thị Thuý Nga, Nguyễn Quang Thạch (2006) [7] đã nghiên cứu phản ứng xuân hoá và phản ứng sáng của giống hoa Lilium fomolongo. Kết quả cho thấy việc xử lý nhiệt độ thấp (4-50C) có tác động làm rút ngắn thời gian ngủ nghỉ từ 55,36 - 43,80 ngày. Thời lượng xử lý nhiệt độ thấp thích hợp là 40 ngày có thể phá ngủ hoàn toàn được. Tiếp tục nghiên cứu trên giống hoa loa kèn trắng Lilium formolongo, Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2007) [8] đã nghiên cứu phản ứng xuân hoá của củ giống kết quả cho thấy xử lý củ giống trước khi trồng ở nhiệt độ 40C trong 45 ngày thì cây sẽ sinh trưởng tốt nhất, tổn._.g thời gian sinh trưởng là 161 ngày, chất lượng hoa đủ tiêu chuẩn xuất khẩu trong khi đó công thức không xử lý lạnh có tổng thời gian sinh trưởng là 295 ngày. Qua đây có thể thấy rằng các nghiên cứu về xử lý nhiệt độ đối với cây lily đã cho kết quả tích cực, những kết luận này có thể đem vào để áp dụng trong trồng và sản xuất loài hoa này. 2.4. ứng dụng nuôi cấy in vitro trên cây hoa lily trên thế giới và Việt Nam Trên thế giới có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy in vitro cho cây hoa lily nhằm tạo ra những cây con đồng nhất về kiểu gen với số lượng lớn mà các phương pháp nhân giống vô tính thông thường khác không thể có được. Có thể sử dụng nhiều bộ phận khác nhau của cây hoa lily để làm vật liệu khởi đầu trong nuôi cấy in vitro như meristem, vảy củ, đoạn thân... Asjes và cộng sự (1974) [14] đã ứng dụng thành công kỹ thuật nuôi cấy meristem để tạo ra các giống hoa lily hoàn toàn sạch virus ở Hà Lan. Tiếp theo đó Van aartrijk và Blom-Barnhoorn (1979) cũng đã thành công trong việc sử dụng đỉnh sinh trưởng để nuôi cấy. Ngoài ra nhiều bộ phận khác cũng được sử dụng để nuôi cấy như đoạn thân (Sheridan,1968); nhị và cánh hoa (Takayama và Miawa, 1979) [14]. Sử dụng vẩy củ làm vật liệu khởi đầu trong nuôi cấy đã được nghiên cứu bởi nhiều tác giả Robb (1957), Hackett (1969), Allen (1974), Simmondds và Cumming (1976), Stimart và Ascher (1978), Van aartrijk và Blom-Barnhoorn (1977)... Cho đến nay thì vẩy củ là một nguồn nguyên liệu chủ yếu trong việc nuôi cấy mô khi sản xuất cây giống hoa lily do việc sử dụng vây củ rất tiện lợi, dễ thành công và có hiệu quả cao hơn nhiều so với việc sử dụng các bộ phận khác của cây hoa lily để nuôi cấy [14]. Cùng với việc nghiên cứu khả năng cảm ứng từ vẩy củ của hoa lily thì nhiều tác giả trên thế giới đã tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện và yếu tố môi trường trong việc nhân nhanh in vitro như mức độ gây tổn thương cho mô (Van aartrijk và Blom-Barnhoorn, 1984), điều kiện nhiệt độ ánh sáng (Niimi và Onozawa, 1979), thành phần môi trường dinh dưỡng (Slimart và Ascher,1978) [14]. Gautheret (1969) [14] quan sát thấy hàm lượng dinh dưỡng muối khoáng đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phân chia của mô hoa lily nuôi cấy. Các tác giả Van aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984)[57] đã tìm ra môi trường thích hợp cho nuôi cấy hoa lily là môi trường MS có hàm lượng muối khoáng giảm đi một nửa. Các ông cũng chứng minh rằng việc bổ sung nicotinic acid, pyridoxin HCl và glicin là không cần thiết đối với việc nhân giống mô hoa lily, trong khi thiamin HCl và meso inositol lại đóng vai trò quan trọng trong nuôi cấy (Barz và Nicolas, 1978 [32]; Murashige, 1974 [45]). Đường saccaroze đóng một vai trò rất quan trọng trong nuôi cấy in vitro, điều này đã được chứng minh bởi nhiều tác giả. Takayama và Misawa (1979) [5] đã chứng minh được môi trường có bổ sung 15% đường Saccaroze đã làm giảm sự hình thành chồi và sinh trưởng của nụ hoa lily trong nuôi cấy vẩy củ in vitro. Van aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984) [57] cũng đã tìm thấy hàm lượng đường từ 3-4% làm tăng cả về hệ số nhân chồi cũng như trọng lượng của củ hoa lily trong nuôi cấy. Giảm hàm lượng đường xuống dưới 3% đã hạn chế các chỉ tiêu trên. Torres - K (1985) [56] cho rằng nồng độ đường saccaroze hoặc glucoze từ 40 - 60g/l là thích hợp nhất cho sự hình thành chồi đối với 2 giống Saintpaulia và Agrostis. Nhìn chung các loại đường khác nhau và hàm lượng của chúng trong môi trường là những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phát sinh cơ quan và sự nhân nhanh. Các nghiên cứu của Zaghmout-O, Lorres-K [63] trên giống Lilium longiflorum Harson chỉ ra rằng Glucoze, xylose, maltoze, lactoze có tác dụng làm tăng trọng lượng tươi của củ cũng như kích thích sự sinh trưởng phát triển của mô sẹo. ảnh hưởng của lactose, galactoze và fructoze tuy có kém hơn song vẫn cho kết quả tốt hơn nhiều so với đối chứng không có đường. Một yếu tố không thể thiếu và mang tính quyết định trong nhân nhanh in vitro phải kể đến sự có mặt của các chất điều tiết sinh trưởng. Theo Murashige (1962) [47] thì quá trình phát sinh chồi phụ thuộc vào tỷ lệ Auxin/Cytokinin trong môi trường nuôi cấy. Việc sử dụng các chất điều tiết sinh trưởng trong nuôi cấy mô, tế bào ngày càng được sử dụng bởi nhiều tác giả khác nhau và cho các kết quả tương tự như trên. Van aartrijk và Blom-Barnhoorn (1984) [57] đã xác định được vai trò của α-NAA và BA trong nuôi cấy vẩy củ. Theo 2 ông thì α-NAA đóng vai trò quyết định đến sự tái sinh chồi, số chồi/vẩy và sự tăng trưởng của củ về trọng lượng khi dùng ở nồng độ thấp. ở nồng độ cao, tác dụng của α-NAA hoàn toàn ngược lại. Trong nuôi cấy, BA hoàn toàn không ảnh hưởng đến sự tái sinh chồi song lại thúc đẩy quá trình sinh trưởng của các chồi tái sinh. Nghiên cứu quá trình nhân củ hoa lily bằng phương pháp nuôi cấy in vitro trên môi trường được bổ sung axit abscisic của Kyowa và Hakko (1986) [42] kết quả cho thấy rằng axitabcisic có thể ức chế quá trình tạo mô sẹo song lại kích thích quá trình hình thành củ con và làm mập chồi. Maesato - K, Sarma - K, Fukui - H, Hara - T (1991) [48] khẳng định hàm lượng thấp của α - NAA và 2,4-D thích hợp cho tạo rễ trong khi hàm lượng cao của α - NAA không chỉ kích thích tạo rễ nhiều mà còn thúc đẩy sự hình thành lá tốt hơn. Các củ có rễ và lá sinh trưởng tốt hơn khi trồng ra đất. ở Việt Nam nghiên cứu về nhân giống in vitro hoa lily cũng được tiến hành và đã đạt được một số thành tựu sau: Mai Xuân Lương và cộng sự (1993) [12] đã thăm dò quy trình nhân giống hoa loa kèn trắng (hoa huệ tây - Lilium longiflorum Hance) trên các môi trường đa lượng với các mức dinh dưỡng khác nhau như: MS, White, B5, Knutson C, thậm chí cả môi trường Knop nhưng tốt nhất là môi trường MS. Tất cả các môi trường đa lượng trên đều cần bổ sung các nguyên tố vi lượng, vitamin. Điều kiện thích hợp cho tái sinh và sinh trưởng là nhiệt độ 18-20oC, chế độ chiếu sáng 2500-3000 lux, 16 giờ chiếu sáng mỗi ngày. Dương Tấn Nhựt (1994)[13] đã công bố kết quả nghiên cứu giống hoa huệ tây bằng phương pháp nuôi cấy vẩy củ, nhằm đưa ra một giải pháp hữu hiệu khắc phục hiện tượng thoái hoá giống trầm trọng tại Đà Lạt hiện nay. Vẩy củ được khử trùng bằng HgCl2 2% trong 5 phút, sau đó cấy trên môi trường MS có bổ sung các thành phần Vitamin, chất hữu cơ và saccaroze. Sau khi tạo được cây con trong ống nghiệm, có thể tiếp tục nhân bằng tách các chồi được tạo thành đem cấy trên môi trường nhân. Dương Tấn Nhựt (1998) đã công bố kết quả nghiên cứu cho thấy ảnh hưởng của than hoạt tính tới sự phát triển bộ rễ của cây hoa loa kèn (Lilium longiflorum) ở nồng độ 1g/l trong nhân giống in vitro. Năm 2001 Dương Tấn Nhựt và cộng sự đã công bố kết quả nghiên cứu cho thấy than hoạt tính có ảnh hưởng tốt đến tỉ lệ sống và sự phát sinh chồi của lát mỏng đoạn thân Lilium longiflorum ở nồng độ 1g/l [27]. Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (1999) [15] cho biết có thể sử dụng hỗn hợp 0,2 mg/l α-NAA + 1 mg/l BA trong môi trường tái sinh mầm chồi từ vẩy củ hoa loa kèn trắng. Cũng trên môi trường này cho hệ số nhân là 4,4 lần (sau 4 tuần nuôi cấy) khi tiếp tục nhân nhanh các mầm chồi tạo được. Hàm lượng saccaroze thích hợp cho quá trình tạo củ trong ống nghiệm là 4,5 % và đặt trong điều kiện bóng tối hoàn toàn. Một số nghiên cứu tạo củ in vitro của giống hoa lily cũng đã được nghiên cứu: Nguyễn Thị Nhẫn và cộng sự (1999) [16] cho biết nồng độ đường saccaroze 5%là môi trường cho chất lượng củ giống cao và tạo điều kiện cho cây sinh trưởng phát triển tốt hơn. Nguyễn Quang Thạch và Nguyễn Thị Nhẫn (2001) [17] đã đưa ra kỹ thuật tạo củ in vitro trong công tác nhân giống hoa loa kèn. Nghiên cứu khác của Nguyễn Thái Hà và cộng sự (2003) [30] công bố kết quả nghiên cứu sự phát sinh củ in vitro các giống hoa Lilium và kết luận đường saccaroze là thành phần quan trọng quyết định sự hình thành củ in vitro, hàm lượng đường từ 9-12% cho hệ số nhân củ từ 1,8-4,1 lần tuỳ thuộc vào từng giống, môi trường bán lỏng 12% đường có bổ sung 0,1 BA và 0,01 α-NAA trong điều kiện tối là tốt nhất cho quá trình tạo củ từ vẩy và tăng cường kích thước củ. Theo Nguyễn Thị Lý Anh và cộng sự (2005) [25] thì tuổi chồi trong ống nghiệm cũng ảnh hưởng tới sự hình thành củ in vitro, các chồi 10 tuần tuổi có khối lượng củ trung bình tốt nhất, chồi 8 tuần tuổi cho hệ số nhân thấp hơn. Nguyễn Quang Thạch và cộng sự (2006) [29] cho biết môi trường tốt nhất cho sự tái sinh chồi của callus có nguồn gốc từ mô vẩycủ của giống hoa loa kèn trắng Lilium formolongo là môi trường MS + 1 BA + 0,25 α-NAA + 30 saccaroze + 6,5 g/ agar (pH = 5,7). Nghiên cứu của Cao Huyền Trang (2006) [21] cho biết khả năng tạo củ nhỏ từ lát cắt vẩy củ phụ thuộc vào kích thước và vị trí lát cắt vẩy củ in vitro. Chiều dày lắt cắt 1,0-1,5 mm từ củ in vitro có đường kính 4-5 mm cho hiệu quả tạo củ cao nhất. Lát cắt càng sát phần gốc củ thì càng cho tỷ lệ phát sinh củ cao. Nghiên cứu của Dương Tấn Nhựt và cộng sự (2006) [26] cho thấy kiểu gen ảnh hưởng rất nhiều lên khả năng tái sinh của các mẫu cấy, khả năng nhân chồi cũng như sụ phát triển của chồi. Hai giống lai Lily ‘Tiber’ và Lily ‘Sorbone’ có khả năng tái sinh từ thân non và vẩy củ rất cao. 2.5. Nghiên cứu Đa dạng di truyền trên cây hoa lily 2.5.1. Khái niệm về đa dạng di truyền Đa dạng di truyền là sự thể hiện phong phú ở mức độ gen. Gen tạo nên từ ADN là thành phần quyết định sự phát triển của cấu trúc sinh vật cũng như các đặc điểm và khả năng mà sinh vật sẽ có. Cấp độ đa dạng này có thể tạo ra các biến thể khác nhau của cùng một gen (Nguyễn Thị Ngọc ẩn, 2004) [9]. 2.5.2. Nguyên nhân phát sinh đa dạng di truyền Gen có khả năng tái tạo trên cơ sở tự sao chép một cách chính xác để đảm bảo sự tồn tại của vật chất di truyền qua các thế hệ sinh vật. Tuy nhiên, gen cũng có thể bị biến đổi dưới tác dụng của các yếu tố môi trường trong và ngoài cơ thể, đặc biệt là những tác động mạnh của các yếu tố lí hoá. Sự biến đổi trong phân tử ADN có thể là nhỏ như sự thay đổi xảy ra ở các cặp bazơ nitơ hoặc ở mức lớn hơn như các hiện tượng thêm bớt một đoạn gen nào đó nhưng lượng ADN trong một tế bào là lớn nên sự biến đổi ấy trong từng cơ thể và cả quần thể là rất lớn. Vì thế không có hai cơ thể nào đó có sự giống nhau hoàn toàn về trật tự phân bố các nucleotit trong chuỗi ADN. Sự biến đổi của một gen hay một nhóm gen như vậy gọi là sự đột biến và làm xuất hiện thể đột biến, đến lượt mình các đột biến mới được hình thành sẽ được di truyền lại cho thế hệ sau và đó chính là nguyên nhân phát sinh đa dạng di truyền. 2.5.3. ý nghĩa của việc nghiên cứu đa dạng di truyền Đa dạng di truyền rất cần thiết cho sự tồn tại của các loài, các quần xã tự nhiên. Sự đa dạng di truyền là nhân tố giúp cho sinh vật duy trì được nòi giống, kháng với các loài dịch bệnh và thích nghi với những thay đổi của môi trường. Sự đa dạng di truyền của cây trồng, vật nuôi có giá trị đặc biệt trong chọn tạo giống cây trồng, vật nuôi mới phục vụ cho lợi ích của con người. 2.5.4. Các phương pháp xác định đa dạng di truyền 2.5.4.1. Chỉ thị hình thái Việc sử dụng các đặc điểm hình thái trong phân loại sinh vật được sử dụng từ rất sớm. Những tính trạng hình thái được sử dụng như là một chỉ thị di truyền là những tính trạng do một locus gen quy định và sự thể hiện của chúng không bị ảnh hưởng của nhân tố môi trường. Tuy nhiên, việc sử dụng các chỉ tiêu hình thái trong phân tích đa dạng di truyền cũng có những hạn chế nhất định: số lượng các chỉ tiêu hình thái là có hạn, chúng bị ảnh hưởng bởi quá trình tương tác gen và các nhân tố môi trường, các chỉ tiêu hình thái chỉ thể hiện ở những giai đoạn nhất định của quá trình phát triển cá thể. 2.5.4.2. Chỉ thị hoá sinh * Chỉ thị Protein: Mỗi gen trong đoạn ADN cần tìm mã hoá cho một protein đặc hiệu, hoạt động của gen trong dòng tế bào đó sẽ sinh ra một protein đặc trưng. Người ta sẽ sử dụng các mẫu dò là các protein kháng thể đã đánh dấu phóng xạ để phát hiện ra protein cần tìm. Từ đó suy ra dòng tế bào nào đã sản sinh ra protein có phản ứng với mẫu dò. Bởi vì, trình tự của nucleotid của gen đã được dịch sang ngôn ngữ hoàn toàn chính xác đó là protein. * Chỉ thị Isozym: là các enzym cùng xúc tác một phản ứng trong tế bào nhưng do các locus khác nhau quy định. Enzym có bản chất là protein và là chất đa điện di nên trong dung dịch nó ở trạng thái phân cực. Dưới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử protein khác nhau về kích thước, trọng lượng phân tử, lực tĩnh điện... sẽ chuyển động với tốc độ khác nhau và sẽ phân bố ở vị trí khác nhau trên gen sau khi điện di. 2.5.4.3. Chỉ thị phân tử ADN Từ khi ra đời kỹ thuật PCR, người ta đã áp dụng thành công kỹ thuật PCR trong việc đánh giá đa hình ADN của sinh vật. Đáng chú ý là các kỹ thuật RAPD, AFLP, SSR, STS, RFLP. Trong các phương pháp thì hiện nay ứng dụng nhiều hơn cả trên đối tượng lily là RAPD. Các phương pháp này đều sử dụng kỹ thuật PCR làm nền nhưng khác nhau ở chỗ là sử dụng các mồi được thiết kế khác nhau. * Kỹ thuật RAPD (Randomly Amplified Polymorphic ADN) - Đa hình các đoạn ADN nhân bản ngẫu nhiên. Nguyên lý của phương pháp: Sử dụng một số mồi ngẫu nhiên nhất định (thường từ 10-40 mồi) để thực hiện phản ứng PCR, nhằm nhân các đoạn ADN đặc trưng của các mẫu nghiên cứu. Nếu các mẫu nghiên cứu có bộ gen giống nhau hoàn toàn, sản phẩm PCR thu được gồm các đoạn ADN hoàn toàn giống nhau về kích thước và cấu trúc. Khi bộ gen của các mẫu nghiên cứu có sự khác biệt nhau, kết quả PCR nhân được các đoạn khác biệt nhau. Mồi ngẫu nhiên là các đoạn oligo nucleotid gồm khoảng 8-20 nucleotid, đặc trưng cho mỗi loài sinh vật. Ngày nay, kỹ thuật RAPD được ứng dụng rất rộng rãi trong nghiên cứu, phân tích di truyền ở mức phân tử trên các loài cây trồng khác nói chung và ở Lilium nói riêng. * Kỹ thuật RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphims) - Đa hình chiều dài các đoạn ADN cắt bởi enzym giới hạn. Kỹ thuật RFLP dựa trên đặc điểm của các loại enzym giới hạn khác nhau, tạo nên các đoạn cắt ADN khác nhau, tạo nên các đoạn cắt ADN khác nhau phân biệt bằng điện di đồ. Bản đồ di truyền các kết quả RELP, có tính chính xác cao sử dụng trong nghiên cứu sự khác biệt trong cấu trúc bộ gen của các cá thể, các loài sinh vật, nhằm so sánh sự khác biệt giữa các mẫu nghiên cứu, xác định nguồn gốc hoặc kiểm tra mức độ tiến hoá của các loài sinh vật. * Kỹ thuật AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism) - Sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN được khuyếch đại chọn lọc. Kỹ thuật AFLP dựa trên cơ sở sử dụng PCR với các mồi đặc hiệu để khuyếch đại một đoạn ADN đặc trưng của các mẫu nghiên cứu. Sau đó thực hiện PCR lần thứ 2 với các mồi nối thêm 1 hoặc 2 nucleotid ở đầu 3’(hoặc 5’) của mồi, để nhân các đoạn ADN có tính đặc hiệu cao. Kết quả PCR cho phép phân biệt mức độ giống và khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu ngay cả các mẫu so sánh có quan hệ di truyền gần nhau. Sự đa hình thể hiện qua mỗi phản ứng khi sử dụng AFLP cao hơn nhiều so với RFLP và RAPD vì vậy AFLP có thể cho phép xem xét sự đa hình ở một số lượng lớn locus trong một thời gian ngắn và có thể sử dụng lượng nhỏ ADN. AFLP đang trở thành hệ thống chỉ thị lý tưởng cho hàng loạt các nghiên cứu di truyền và được sử dụng trong việc lập bản đồ liên kết phân tử. * Kỹ thuật STS (Sequence Tagged Site) - Điểm trình tự được đánh dấu Nguyên lý: dựa vào những locus đã biết (gen, cADN,..) nhân trực tiếp bởi mồi PCR được thiết kế từ trình tự đầu cuối của những locus đặc trưng này. Kỹ thuật STS cho phép xác định những vị trí cần biết bằng các trình tự ADN biết trước. * Kỹ thuật SSR (Simple Sequence Repeats) - Đa hình trình tự lặp lại đơn giản. Hệ gen sinh vật Eukaryote có mặt các trình tự nucleotid lặp lại, có kích thước khác nhau đặc trưng cho loài. SSR gồm 2-5 nucleotid lặp lại nhiều lần: (TG)n hoặc (AAT)n. Các đoạn ADN nhắc lại này có trình tự 2 đầu rất đặc trưng nên được sử dụng để thiết kế mồi cho PCR. Do có sự sai khác về kích thước của các đoạn lặp lại nên kỹ thuật SSR rất thích hợp cho nghiên cứu đa hình, lập bản đồ và phân lập gen. Kỹ thuật SSR đơn giản, không tốn kém, là chỉ thị đồng trội nên được sử dụng để phát hiện cá thể dị hợp tử. 2.5.5. Một số kết quả nghiên cứu đa dạng di truyền của cây hoa lily trên thế giới và Việt Nam Rapd là kỹ thuật được sử dụng khá phổ biến trong nghiên cứu đa dạng di truyền của các loài sinh vật đặc biệt khi mà hệ gen của chúng còn ít được nghiên cứu về trình tự. Hiện nay, trên thế giới đã sử dụng chỉ thị phân tử trong nghiên cứu đa dạng di truyền. Trong đó, có rất nhiều nghiên cứu về đa dạng di truyền trên cây Lilium bằng phương pháp chỉ thị phân tử. Sau đây là tóm tắt một số kết quả nghiên cứu. Lee. J, Lee. P, Lim.Y, E.Shin, Mark S.Roh (1994) [44] đã đi tiên phong trong việc phát triển hệ thống phân loại Lilium bằng phân tích đa hình các đoạn ADN được nhân bản ngẫu nhiên (RAPD). Ba mồi đã thu được đa hình giữa 15 giống lai châu á Lilium x elegans, 5 giống lai phương đông Lilium speciosum, Lilium x formolongi, Lilium concolor và Lilium lancifolium. 51 mồi RAPD được phân tích theo từng cặp. Kết quả chỉ ra rằng phân tích băng đa hình bằng chỉ thị RAPD có thể chứng minh nguồn gốc phát sinh của hoa lily trồng. Yamagishi. M (1995) [59] đã sử dụng mồi RAPD để phân biệt sự khác nhau giữa các loài thuộc chi Lilium và giữa các loài lai. Ông đã xác định được nhiệt độ tối ưu cho phản ứng PCR của mồi RAPD là 540C, và đã sử dụng 76 mồi để phát hiện sự khác nhau giữa các giống hoa lily được tạo ra bởi lai trong loài trong đó có 18 mồi (24%) có xuất hiện các vạch đa hình. Trình tự Sinomartagon, Leucolirion b, Leucolirion a và Archelirion có thể được phát hiện bởi 6 trình tự ADN đặc thù với 5 mồi. Có 7 cặp lai cùng loài thấy được các băng của cả bố mẹ, rõ ràng những chỉ thị này có thể sử dụng để phát hiện ra các cặp bố mẹ của các giống lily được tạo ra bởi lai trong loài. Bằng việc sử dụng kỹ thuật RFLP, Haruki K và cộng sự năm 1997 [40] đã phân loại các giống lily: Lilium japonicum, Lilium rubellum, Lilium nobilissimum, Lilium speciosum, Lilium auratum, Lilium auratum var. platyphyllum, Lilium henryi, Lilium concolor var. pulchellum và Lilium leichtlinii var. maximowiczii, và một giống lai đặc biệt Lilium x fomolongi bằng kỹ thuật RFLP. Dựa trên kết quả sản phẩm PCR- RFLP đã chia các giống lily trên thành 6 nhóm khác nhau. Haruki K và cộng sự (1998) [39] đã nghiên cứu mối quan hệ di truyền mỗi cá thể của Lilium japonicum, loài bản địa của Shimane và nơi khác bằng phân tích RAPD, ông đã sử dụng 10 mồi ngẫu nhiên. Kết quả cho thấy các loài biểu hiện sự biến đổi rộng phụ thuộc vào nơi nó sống. Khi tạo nên cây trồng mới của Lilium japonicum từ Shizuoka hoặc Wakayama đến có thể tạo nên ưu thế lai trong cây lai. Mối quan hệ di truyền Lilium japonicum các cá thể như đã được xác định rõ bằng phân tích RAPD. Nhờ kỹ thuật RAPD, Choi HaeSun và cộng sự (1999) đã phân tích được gen của phần lớn cây trồng Lilium và cây lai. Kết quả nghiên cứu của ông cho thấy mồi ngẫu nhiên OPAO2, OPAO3, OPAO4, OPA14, OPA16 và OPA17 có thể sử dụng trong phân loại cây Lilium và cây lai [36]. Chia-Szu Wen và Ju-Ying Hsiao (1999) [35] đã sử dụng mồi RAPD để đánh giá sự khác nhau về nguồn gen giữa các quần thể Lilium longiflorum Thunb. var. scabrum Masam tại phía Bắc, phía Tây và Nam của Đài Loan. Tác giả đã sử dụng 140 mồi ngẫu nhiên trong số đó có 9 mồi đã xác định được sự khác nhau của tất cả các quần thể ở các khu vực địa lí khác nhau đó. Kết quả cho thấy 14,08% là khác nhau trong một quần thể; 85,92% cá thể khác nhau trong ba quần thể khi tất cả 3 quần thể được trồng chung ở cùng một vùng. Khi hai quần thể phía Bắc được nghiên cứu ở một vùng và quần thể khác nghiên cứu ở vùng khác, kết quả phân tích AMOVA cho thấy tỷ lệ khác nhau giữa các vùng với nhau, giữa các quần thể trong cùng vùng, giữa các cá thể trong cùng một quần thể lần lượt là 5,94% (p<0,0001), 10,18% (p <0,001), và 83,33% (p<0,0001). Với việc sử dụng 7 đặc trưng hình thái học và 64 mồi RAPD Wen CS, J Y Hsiao (1999) [61] đã nghiên cứu đa dạng di truyền của Lilium longiflorum var. formosanum phân bố từ vùng đất thấp đến vùng núi cao ở Đài Loan... Dữ liệu hình thái được vạch rõ thành hai nhóm thấp, trung bình cao so với mặt nước biển. Phân tích 9 mồi RAPD cũng đã phát hiện ra quần thể là khác nhau theo sự khác nhau về độ cao so với mặt nước biển. Kết quả phân tích AMOVA cho thấy giữa các nhóm, giữa các quần thể trong nhóm, giữa các cá thể trong quần thể với giá trị tương đồng lần lượt là: 5,09%, 2,82%, và 92,09 %. Hai vùng bằng phẳng phân tích với 3 vùng thấp so với mặt nước biển đã phát hiện ra giữa các quần thể, giữa các cá thể trong cùng quần thể có giá trị tương đồng đếm được là 4,19% và 95,8%. Cùng sự phân tích cho thấy trên 3 quần thể đất cao so với mặt biển cho biết rằng 2,32% trong đó biến đổi di truyền cho là khác nhau của quần thể, 97,68% cho bởi các cá thể khác nhau trong cùng quần thể. Các cá thể trong cùng quần thể của vùng cao so với mặt nước biển có sự sai khác thấp hơn vùng thấp so với mặt nước biển. Chỉ số kết quả quần thể của vùng cao so với mặt nước biển là càng biến đổi giữa các cá thể trong cùng quần thể hơn quần thể của vùng thấp so với mặt nước biển. Cũng bằng chỉ thị phân tử Wiejacha và cộng sự (2002)[62] đã phát hiện khoảng cách giữa các con lai trong loài Lilium. Các ông đã dùng chỉ thị RAPD để phát hiện sự đa dạng giữa các con lai được tạo ra bằng việc dùng noãn của các cây lily thuộc nhóm "oriental hybrids” hạt phấn của Lilium henryi, Lilium pumilum và Lilium x formolongi. Kết quả là 8 mồi đã tạo được băng đa hình giữa cặp “Marco Polo” và Lilium henryi, 6 mồi tạo được băng đa hình giữa cặp “Alma Ata” và “Lilium pumilum”, “Muscadet” và Lilium x formolongi. ở Việt Nam việc sử dụng chỉ thị RAPD trong đánh giá đa dạng di truyền đã được thực hiện trên nhiều đối tượng cây trồng và vật nuôi khác nhau và đã thu được một số kết quả nhất định. Ví dụ như: Nghiên cứu tính đa dạng di truyền của một số giống khoai tây bằng kỹ thuật RADP-PCR (Trịnh Thị Loan và cộng sự) [10]; Nghiên cứu tính đa hình của giống vừng đen bằng phương pháp RADP - PCR (Nguyễn Thị Thuý Mai, Nguyễn Văn Mùi) [10]; Phân tích đa dạng di truyền nguồn gen cây dứa bằng phương pháp RADP Marker (Trần Thị Mỹ Hạnh và cộng sự) [11]... Tuy nhiên trên đối tượng cây hoa lily nghiên cứu về đa dạng di truyền vẫn còn rất hạn chế. Trong nghiên cứu của Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Quang Thạch (2007)[28] đã dùng chỉ thị AFLP để đánh giá đa dạng di truyền của 18 giống/loài lily thu thập kết quả cho thấy các giống này có hệ số tương đồng dao động từ 0,75 đến 0,96. Hiện nay, các nghiên cứu về đa dạng di truyền trên cây hoa lily trong nước vẫn đang tiếp tục được nghiên cứu để phục vụ cho công tác chọn tạo giống. 3. Vật liệu, nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng, vật liệu, địa điểm và thời gian nghiên cứu 3.1.1. Đối tượng nghiên cứu - Củ hoa Lilium poilanei Gapnep có nguồn gốc từ Sa Pa - Lào Cai. - Các củ giống/loài lily trong nước và nhập nội. Bảng 3.1. Danh sách tên và ký hiệu các loài/ giống lily sử dụng phân tích RAPD Tên giống/loài Nguồn gốc Ký hiệu Lilium oriental “Nostalgia” Hà Lan 1 Lilium longiflorum 1 Quảng Bá-Việt Nam 2 Lilium formolongo Trung Quốc 3 Lilium poilanei Gapnep Sa Pa - Việt Nam 4 Lilium longiflorum 2 Nhật Bản 5 Lilium longiflorum 3 Nam Định- Việt Nam 6 Lilium oriental hybrid “Cassandra” Nhật Bản 7 Lilium oriental “Sorbonne” Hà Lan 8 Lilium oriental - trumpet “Gradisca” Hà Lan 9 Lilium oriental “Acapulco” Hà Lan 10 Lilium hybrid “Leslie” Hà Lan 11 Lilium oriental “Tiber” Hà Lan 12 Lilium oriental hybrid “Siberia” Hà Lan 13 Lilium oriental “Stargazer” Hà Lan 14 Lilium longiflorum “Deliana” Nhật Bản 15 Lilium oriental “Crystal Star” Hà Lan 16 Lilium asiatic hybrid “Royal Show” Hà Lan 17 Lilium longiflorum 4 Trung Quốc 18 Lilium oriental “Giacondo” Hà Lan 19 Lilium oriental “Mondriann” Hà Lan 20 Lilium oriental “Valadores” Hà Lan 21 Lilium oriental hybrid “Salinas” Hà Lan 22 Lilium oriental hybrid “Shalloon” Hà Lan 23 L2.1 Nhật Bản 24 Lilium brownii Hà Giang-Việt nam 25 Lilium asiatic hybrid “Freya” Hà Lan 26 Lilium asiatic hybrid “Quinta” Hà Lan 27 Lilium longiflorum 5 Đại học Nông Nghiệp 28 Lilium longiflorum “Georgia” Hà Lan 29 Lilium longiflorum “Snow Queen” Nhật Bản 30 Lilium formosanum Nhật Bản 31 Lilium speciosum (Tiger lily) Nhật Bản 32 Ghi chú: L2.1 chưa xác định tên 3.1.2. Vật liệu nghiên cứu - Các mồi sử dụng trong phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD Bảng 3.2. Các mồi sử dụng trong phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD Tên mồi Trình tự nucleotitde 5’-3’ Nhiệt độ gắn mồi (0C) OPA-10 GTGATCGCAG 32 OPG-12 CAGCTCACGA 34 OPA-01 CAGGCCCTTC 32 OPG-10 AGGGCCGTCT 34 OPA-04 AATCGGGCTG 32 P615 GCCGTGGACTGCAGA 50 P617 CCCGACACCAGGTGA 50 P618 TCAGGTTATCCGCCCC 48 P623 ACGGGGTTTACCGCT 48 P650 GACACGGCCCGATAG 50 OPC6 CAGGCCCTTC 33 A8 GTGACGTAGG 32 A9 GGGTAACGCC 30 C5 GATAACCGCC 34 C11 AAAGCTGCGG 34 D3 GTCGCCGTCA 32 D5 TGAGCGGACA 30 Q5 CCGCGTCTTG 32 Q6 GAGCGCCTTG 32 V10 GGACCTGCTG 36 - Củ hoa Lilium poilanei Gapnep có chất lượng và kích thước củ tương đối đồng đều, đường kính củ 4,34 cm sử dụng trong nội dung 1 và nội dung 2. - Vật liệu dùng trong nghiên cứu nội dung 3 là các củ giống, vẩy củ và lá từ các giống lily trong nước và nhập nội. 3.1.3. Địa điểm và điều kiện thí nghiệm Toàn bộ thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm JICA Bộ môn công nghệ sinh học - Khoa nông học và khu ruộng thí nghiệm Viện sinh học Nông nghiệp, Trường Đại Học Nông nghiệp - Hà Nội. 3.2. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 3.2.1. Nội dung nghiên cứu * Nội dung 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của thời lượng xử lý nhiệt độ thấp cho củ giống đến sự sinh trưởng của cây hoa Lilium poilanei Gapnep. CT1: Củ giống không xử lý lạnh CT2: Củ giống xử lý lạnh 6 tuần CT3: Củ giống xử lý lạnh 8 tuần Mỗi công thức nhắc lại 3 lần mỗi lần 60 củ Ngày trồng 24 tháng 1 năm 2008 Thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh Tất cả củ ngay sau khi thu thập về được xử lý lạnh ở điều kiện 40C với thời lượng khác nhau tính đến ngày trồng 24/1/2008. * Nội dung 2: Nghiên cứu khả năng nhân in vitro hoa Lilium poilanei Gapnep Thí nghiệm 1. Nghiên cứu thời gian khử trùng thích hợp tạo mẫu sạch đưa vào nuôi cấy CT1 (Đ/C): Không khử trùng. CT2 : Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 5 phút. CT3 : Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 10 phút. CT4 : Khử trùng bằng HgCl2 0,1% trong 15 phút. Thí nghiệm 2. Nghiên cứu ảnh hưởng của α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái của vẩy củ CT1 (Đ/C): MS CT2 : MS + 0,1 α-NAA CT3 : MS + 0,5mg/l α-NAA CT4 : MS + 1mg/l α-NAA Thí nghiệm 3. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA đến khả năng phát sinh hình thái của vẩy củ CT1 (Đ/C): MS CT2 : MS + 0,1mg/l BA CT3 : MS + 0,5mg/l BA CT4 : MS + 1 mg/l BA Thí nghiệm 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng phát sinh hình thái của vẩy củ CT1 : MS + 0,1mgBA/l + 0,1mg/l α-NAA CT2 : MS + 0,1mgBA/l + 0,5mg/l α-NAA CT3 : MS + 0,1mgBA/l + 1mg/l α-NAA CT4 : MS + 0,5mgBA/l + 0,1mg/l α-NAA CT5 : MS + 0,5mgBA/l + 0,5mg/l α-NAA CT6 : MS + 0,5mgBA/l + 1mg/l α-NAA Thí nghiệm 5. Nghiên cứu ảnh hưởng của BA và α-NAA đến khả năng nhân nhanh của chồi CT1 : MS + 0,25mg/l α-NAA CT2 : MS + 0,25mg/l α-NAA + 0,5mg BA/l CT3 : MS + 0,25mg/l α-NAA + 1mg BA/l CT4 : MS + 0,25mg/l α-NAA + 1,5mg BA/l Thí nghiệm 6. Nghiên cứu ảnh hưởng của than hoạt tính tới khả năng ra rễ của chồi phát sinh. CT1(Đ/C) : MS CT2 : MS + 0,25g/l THT CT3 : MS + 0,5g/l THT CT4 : MS + 0,75g/l THT CT5 : MS + 1g/l THT * Nội dung 3: Nghiên cứu đa dạng dạng di truyền của một số giống/loài lily bằng kỹ thuật RAPD. 3.2.2. Phương pháp nghiên cứu 3.2.2.1. Phương pháp nghiên cứu thí nghiệm trên đồng ruộng * Bố trí thí nghiệm - Các thí nghiệm được bố trí theo kiểu khối ngẫu nhiên hoàn chỉnh (RCB) với 3 lần nhắc lại. - Quan sát và đo đếm các chỉ tiêu theo dõi, mỗi công thức 60 cây với 3 lần nhắc lại, mỗi lần nhắc lại 20 cây. - Các chỉ tiêu về động thái được ghi nhận là 7 ngày một lần. * Điều kiện thí nghiệm Thí nghiệm về củ được tiến hành ngoài ruộng, đất trồng là đất thịt nhẹ. * Điều kiện trồng và chăm sóc - Củ giống được xử lý lạnh trước khi trồng (trừ đối chứng) với thời gian phù hợp với yêu cầu của thí nghiệm. - Chuẩn bị đất trồng: làm đất kỹ, tơi xốp, lên luống cao 20 cm, bón lót phân chuồng hoai mục. Phân chuồng hoai mục 15-20 tấn/ha, phân lân 20kg/ha. - Mật độ trồng 15cm x 20 cm. - Bón thúc 3 lần trong suốt giai đoạn sinh trưởng. - Tưới nước giữ ẩm và làm cỏ thường xuyên. * Các chỉ tiêu theo dõi 1.Thời gian bắt đầu mọc (ngày): Số ngày từ khi trồng đến khi 10% số củ nẩy mầm. 2.Thời gian mọc (ngày): Số ngày từ khi trồng đến khi 50% số củ nẩy mầm. 3.Tỷ lệ mọc (%): Tỷ lệ mọc (%) = x 100 4. Động thái ra lá (lá/cây): Số lá ra mỗi tuần từ sau khi mọc, lá mới nhất là lá trên cùng đã mở. Số lá cuối cùng (lá/cây): Số lá cuối cùng là tổng số lá của cây trong suốt thời kỳ sinh trưởng. Động thái tăng trưởng chiều cao cây (cm/tuần): Chiều cao cây được đo hàng tuần, tính từ gốc sát mặt luống đến đỉnh lá cao nhất. Chiều cao cây cuối cùng (cm): Chiều cao cây cuối cùng lá chiều cao cây được đo sau khi cây có nụ từ sát mặt luống đến đỉnh của lá cuối cùng. * Phương pháp xử lý Số liệu xử lý theo chương trình IRRISTART 4.0, Excel. 3.2.2.1. Phương pháp nghiên cứu thí nghiệm in vitro * Điều kiện thí nghiệm Quá trình nuôi cấy in vitro được tiến hành trong điều kiện nhân tạo, các điều kiện ánh sáng, nhiệt độ, ẩm độ luôn được giữ ổn định. + ánh sáng: Các mẫu đều được nuôi cấy dưới ánh đèn neon với cường độ chiếu sáng 2000 lux, thời gian chiếu 16 giờ sáng/8 giờ tối. + Nhiệt độ: Được duy trì ở nhiệt độ 20-220C (đêm) và 25-270C (ngày). + ẩm độ phòng: luôn được duy trì ở 70% độ ẩm tối đa. * Các chỉ tiêu theo dõi + Tỷ lệ mẫu sạch (%) = x 100 + Tỷ lệ mẫu nhiễm (%) = x 100 + Tỷ lệ mẫu chết (%) = x 100 + Hệ số nhân (lần) = x 100 + Tỷ lệ mẫu tạo callus (%) = ._.tách chiết được. Đồng thời có thể bổ sung RNase để tinh sạch hơn DNA. 4. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Bước Nhiệt độ Thời gian Tác dụng Số chu kỳ I 94 4 phút Biến tính 1 II 94 30 giây Biến tính 34 X 30 Gắn mồi 72 45 Tổng hợp III 72 7 Kéo dài tổng hợp 1 IV 4 ∞ Bảo quản X là nhiệt độ gắn mồi, tuỳ thuộc vào từng mồi khác nhau. Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR như sau: Phản ứng được bắt đầu ở 940C trong thời gian 4 phút, sau đó chuyển sang giai đoạn 940C trong 30 giây để biến tính các phân tử DNA (giai đoạn biến tính), đến nhiệt độ gắn mồi (nhiệt độ này phụ thuộc vào Tm của mồi) thường kéo dài từ 30 giây - 1 phút sau đó là giai đoạn 720C trong 45 giây để DNA polymerase hoạt động tổng hợp DNA từ khuôn là các phân tử DNA tách chiết được bị biến tính và các dNTP trong phản ứng, tiếp đến là 720C trong 7phút và từ bước 940C trong 30 giây sẽ được lặp lại cho đến 720C trong 45 giây (chu kì) khoảng 34 lần. Sau đó nhiệt độ sẽ giảm xuống 40C để bảo quản DNA vừa tổng hợp được. 5. Phương pháp chạy điện di phát hiện sản phẩm PCR (RAPD) + Tiến hành chạy điện di trên gel agarose 2%. . Chuẩn bị gel: Cân 2g agar cho vào 100ml dung dịch TAE 1X đun đến khi tạo agarose trong suốt. . Lấy dung dịch đổ vào khay để tạo gel điện di. . Chạy điện di: Lấy 10ml DNA sản phẩm PCR trộn lẫn với 2ml Loading Buffer 10X rồi đổ vào giếng điện di. . Gel được đặt trong máy điện di với dung dịch điện di là TAE 1X, dưới hiệu điện thế 75V, trong thời gian là 30 phút. + Chụp ảnh điện di: Bản gel sau khi được chạy điện di đem nhuộm trong Ethium Bromide trong 10 phút. Sau đó bản gel được đưa vào thiết bị chiếu tia UV và chụp ảnh điện di. Quan sát hình ảnh chạy điện di để phát hiện gen mong muốn. 6. Thành phần dinh dưỡng MS (Musahige and Skoog, 1962) Lượng pha cho một lít dung dịch mẹ - Khoáng đa lượng NH4No3………………………… 33 g Kno3…………………………….38 g Mgso4…………………………...10 g Kh2po4......................................3,4 g *CaCl2……………………………6,6 g (pha riêng) - Vi lượng H3PO3……………………………620mg MnSO4.4H2O…………………….2230mg ZnSO4.4H2O……………………..860mg KI…………………………………..83mg MoO4Na2.2H2O…………………..25mg CoCl2.6H2O……………………….2,5mg CuSO4.5H2O………………………2,5mg - Sắt FeSO4.7H2O………………………5,56mg Na2EDTA………………………….7,46mg - Vitamin Glycine……………………………..400mg Axit Nicotinic (B5)…………………100mg Pyridoxin (B6)………………………100mg Thiamin HCl2 (B2)………………….20mg *Inositol……………………………..100mg/l môi trường (cân riêng) *Agar…………………………………6,2g/l môi trường (cân riêng) *Kết quả xử lý thống kê SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE CHIEUCAO 10/ 9/ 8 18: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua xu ly lanh den tang truong chieu cao cay ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB CHIEUCAO 566.46 2 19.000 6 29.81 0.001 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CHIEUCAO 10/ 9/ 8 18: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua xu ly lanh den tang truong chieu cao cay MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CHIEUCAO CT1 3 34.2000 CT2 3 61.2000 CT3 3 52.1400 SE(N= 3) 2.51661 5%LSD 6DF 8.70536 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CHIEUCAO 10/ 9/ 8 18: 1 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua xu ly lanh den tang truong chieu cao cay F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHIEUCAO 9 49.180 12.485 4.3589 8.9 0.0011 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CAOMAX FILE CAOMAX 9/ 9/ 8 23:58 ---------------------------------------------------------------:PAGE 1 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den chieu cao cay toi da VARIATE V003 CAOMAX LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 1588.33 794.164 58.11 0.000 2 * RESIDUAL 6 82.0004 13.6667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1670.33 208.791 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE CAOMAX 9/ 9/ 8 23:58 ----------------------------------------------------------------:PAGE 2 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den chieu cao cay toi da MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CAOMAX CT1 3 50.4500 CT2 3 82.7500 CT3 3 63.1800 SE(N= 3) 2.13438 5%LSD 6DF 7.38316 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE CAOMAX 9/ 9/ 8 23:58 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den chieu cao cay toi da F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CAOMAX 9 65.460 14.450 3.6969 12.6 0.0003 SINGLE EFFECT ANOVA FOR UNBALANCED DATA FILE SOLA 10/ 9/ 8 18: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua xu ly lanh den tang truong so la ANOVA FOR SINGLE EFFECT - CT$ -------------------------------------------------------------- VARIATE TREATMENT MS - DF RESIDUAL MS - DF F-RATIO F-PROB SOLA 941.67 2 10.818 6 87.05 0.000 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE SOLA 10/ 9/ 8 18: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua xu ly lanh den tang truong so la MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS SOLA CT1 3 31.1233 CT2 3 63.6100 CT3 3 56.1700 SE(N= 3) 1.89893 5%LSD 6DF 6.56869 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE SOLA 10/ 9/ 8 18: 6 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua xu ly lanh den tang truong so la F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SOLA 9 51.141 15.605 3.2890 6.4 0.0001 BALANCED ANOVA FOR VARIATE LAMAX FILE LAMAX 10/ 9/ 8 0:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den so la toi da VARIATE V003 LAMAX LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 1200.36 600.178 36.01 0.001 2 * RESIDUAL 6 100.000 16.6667 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1300.36 162.544 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE LAMAX 10/ 9/ 8 0:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den so la toi da MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS LAMAX CT1 3 45.1800 CT2 3 73.4500 CT3 3 60.2000 SE(N= 3) 2.35702 5%LSD 6DF 8.15332 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE LAMAX 10/ 9/ 8 0:18 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den so la toi da F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | LAMAX 9 59.610 12.749 4.0825 9.8 0.0007 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NOHOA FILE NOHOA 9/ 9/ 8 23:34 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den thoi gian ra hoa 10% VARIATE V003 NOHOA LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 6858.42 3429.21 77.58 0.000 2 * RESIDUAL 6 265.220 44.2034 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 7123.64 890.455 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE NOHOA 9/ 9/ 8 23:34 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den thoi gian ra hoa 10% MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NOHOA CT1 3 192.300 CT2 3 141.400 CT3 3 128.300 SE(N= 3) 3.83855 5%LSD 6DF 11.2782 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE NOHOA 9/ 9/ 8 23:34 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua thoi luong xu ly lanh den thoi gian ra hoa F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NOHOA 9 154.00 29.840 6.6486 8.3 0.0001 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN2 9/ 9/ 8 23:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 2.26140 .753800 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .180041E-02 .225051E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 2.26320 .205745 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN2 9/ 9/ 8 23:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CT1 3 0.000000 CT2 3 1.13000 CT3 3 0.870000 CT4 3 0.400000 SE(N= 3) 0.866123E-02 5%LSD 8DF 0.182434E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN2 9/ 9/ 8 23:19 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 12 0.60000 0.45359 0.15002E-01 2.5 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN1 9/ 9/ 8 23:12 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua BA toi kha nang tai sinh cua mo vay cu VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 8.32140 2.77380 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 .180123E-02 .225153E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 8.32320 .756655 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN1 9/ 9/ 8 23:12 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua BA toi kha nang tai sinh cua mo vay cu MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CT1 3 0.000000 CT2 3 0.600000 CT3 3 1.77000 CT4 3 2.03000 SE(N= 3) 0.866321E-02 5%LSD 8DF 0.222498E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN1 9/ 9/ 8 23:12 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua BA toi kha nang tai sinh cua mo vay cu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 12 1.1000 0.86986 0.15005E-01 1.4 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSN 9/ 9/ 8 23: 0 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua BA va NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 5 11.1124 2.22248 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 12 .760014E-02 .633345E-03 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 17 11.1200 .654118 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSN 9/ 9/ 8 23: 0 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua BA va NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CT1 3 1.10000 CT2 3 0.800000 CT3 3 0.630000 CT4 3 1.90000 CT5 3 2.67000 CT6 3 2.40000 SE(N= 3) 0.145298E-01 5%LSD 12DF 0.247712E-01 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSN 9/ 9/ 8 23: 0 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua BA va NAA den kha nang phat sinh hinh thai cua mo vay cu F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 18) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 18 1.5833 0.80878 0.25166E-01 1.6 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE HSN FILE HSNC 9/ 9/ 8 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 anh huong cua BA va NAA den kha nang nhan nhanh cua choi tai sinh VARIATE V003 HSN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 11.0546 3.68488 192.67 0.000 2 * RESIDUAL 8 .153000 .191250E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 11.2076 1.01888 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HSNC 9/ 9/ 8 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 anh huong cua BA va NAA den kha nang nhan nhanh cua choi tai sinh MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS HSN CT1 3 1.62000 CT2 3 3.04000 CT3 3 4.13000 CT4 3 3.76000 SE(N= 3) 0.798436E-01 5%LSD 8DF 0.260362 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HSNC 9/ 9/ 8 22:40 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 anh huong cua BA va NAA den kha nang nhan nhanh cua choi tai sinh F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | HSN 12 3.1375 1.0094 0.13829 4.4 0.0000 Số liệu khí tượng Số liệu khí tượng tháng 1 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt độ trung bỡnh (oC) Nhiệt độ thấp nhất (oC) Nhiệt độ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) Độ ẩm (%) 1 15.9 13.2 20.0 - 8.4 46.0 2 14.6 11.1 19.3 - 9.0 47.0 3 14.7 10.8 20.2 - 8.5 59.0 4 16.0 11.3 22.2 - 0.0 67.0 5 16.6 14.5 19.5 - 3.7 80.0 6 18.4 14.6 23.8 - 4.7 79.0 7 19.1 17.2 21.3 - 0.0 84.0 8 19.6 17.5 23.2 - 0.0 86.0 9 21.5 19.1 25.7 - 2.5 79.0 10 21.9 19.6 26.9 - 5.9 85.0 Trung bỡnh 17.82125 14.89 22.21 0 34.3 74 11 23.8 20.5 29.7 - 7.3 84.0 12 23.2 20.6 29.1 - 6.9 82.0 13 22.7 21.7 26.3 - 1.9 82.0 14 14.9 12.7 21.0 0.0 0.0 74.0 15 11.6 10.5 12.5 0.0 0.0 88.0 16 12.9 11.5 15.9 0.0 0.3 71.0 17 14.5 13.5 15.9 - 0.0 57.0 18 15.0 13.5 17.2 - 0.0 73.0 19 14.5 13.3 15.5 0.7 0.0 93.0 20 16.3 14.6 18.8 0.0 0.0 94.0 Trung bỡnh 16.94625 15.24 20.1900001 0.7 9.1 79 21 15.0 11.8 18.3 2.6 0.0 98.0 22 11.4 10.8 12.3 0.7 0.0 91.0 23 12.3 10.0 15.8 0.0 0.0 82.0 24 12.7 11.2 15.4 0.0 0.0 73.0 25 11.4 10.2 13.3 13.0 0.0 95.0 26 12.5 11.2 15.1 0.0 0.0 88.0 27 11.7 10.7 13.7 0.0 0.0 80.0 28 9.7 8.8 10.7 0.9 0.0 96.0 29 10.7 9.3 12.7 1.5 0.0 87.0 30 10.3 9.5 11.7 1.3 0.0 93.0 31 9.1 7.9 9.4 6.2 0.0 87.0 Trung bỡnh 18.8 17.6 20.5 4.5 5.6 77 Số liệu khí tượng tháng 2 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt độ trung bỡnh (oC) Nhiệt độ thấp nhất (oC) Nhiệt độ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) Độ ẩm (%) 1 7.5 6.8 7.8 0.2 0.0 87.0 2 9.3 6.7 13.2 5.7 0.0 81.0 3 11.8 10.4 13.9 - 0.0 71.0 4 12.4 10.6 14.8 0.0 0.0 66.0 5 12.8 11.0 14.8 0.0 0.0 80.0 6 13.2 12.1 14.7 - 0.0 69.0 7 12.9 12.0 14.1 - 0.0 70.0 8 13.1 11.9 15.0 - 0.0 68.0 9 13.2 11.3 15.5 - 0.0 50.0 10 12.2 11.3 13.2 - 0.0 57.0 Trung bỡnh 11.84 10.41 13.7 5.9 0 68 11 11.4 11.0 11.9 - 0.0 70.0 12 12.1 10.9 14.8 - 0.0 61.0 13 12.3 11.0 14.1 - 0.0 47.0 14 12.2 10.0 14.9 0.0 0.0 57.0 15 13.7 11.7 16.6 0.0 0.6 56.0 16 14.5 13.3 16.3 - 0.0 61.0 17 11.8 11.2 12.9 1.8 0.0 92.0 18 12.1 11.2 13.2 2.1 0.0 90.0 19 12.4 11.5 13.3 0.0 0.0 90.0 20 14.1 12.8 16.8 - 0.0 84.0 Trung bỡnh 12.6675 11.46 14.48 3.9 0.6 70.8889 21 16.8 11.6 23.0 - 7.2 78.0 22 18.4 13.0 24.9 - 7.8 76.0 23 20.2 15.5 26.2 - 5.9 74.0 24 19.6 18.2 22.0 0.0 0.0 87.0 25 18.7 17.9 20.2 1.1 0.0 93.0 26 17.7 15.6 19.2 0.8 0.0 86.0 27 15.0 13.6 17.5 0.0 0.0 54.0 28 15.1 14.0 16.2 0.0 0.0 61.0 29 15.1 11.8 20.0 2.3 4.8 72.0 Số liệu khí tượng tháng 3 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt độ trung bỡnh (oC) Nhiệt độ thấp nhất (oC) Nhiệt độ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) Độ ẩm (%) 1 16.7 11.9 23.2 - 8.5 69.0 2 18.1 12.7 25.2 - 8.5 66.0 3 19.9 14.4 26.2 - 8.0 64.0 4 20.4 15.0 26.1 - 8.1 60.0 5 19.5 16.0 23.6 - 2.4 73.0 6 20.0 17.7 23.8 - 0.8 84.0 7 20.1 18.7 23.0 0.0 0.1 83.0 8 20.8 17.7 25.2 - 1.3 81.0 9 20.2 19.1 22.2 0.0 0.3 82.0 10 19.9 18.8 22.1 0.0 0.0 86.0 Trung bỡnh 19.6 16.2 24.1 0.0 29.5 75.4 11 21.4 19.0 25.3 - 0.0 82.0 12 20.9 18.5 26.1 0.0 5.5 85.0 13 20.0 19.0 21.6 0.0 0.0 94.0 14 20.8 19.8 22.4 0.4 0.0 95.0 15 21.2 19.2 24.7 0.2 0.0 89.0 16 22.1 21.0 24.3 0.7 0.3 91.0 17 23.1 21.3 27.7 0.5 1.6 90.0 18 23.5 22.1 26.2 3.7 0.2 92.0 19 22.7 21.5 24.4 0.0 0.0 89.0 20 23.4 21.0 28.2 0.0 3.0 87.0 Trung bỡnh 21.9 20.2 25.1 5.5 10.6 90.2 21 24.6 23.4 26.8 0.0 0.0 88.0 22 23.0 22.2 24.5 6.9 0.0 94.0 23 22.4 19.2 26.8 0.1 6.9 66.0 24 22.2 18.9 26.2 - 7.4 67.0 25 22.0 20.1 24.7 0.0 0.0 70.0 26 22.3 20.9 25.6 0.0 1.9 73.0 27 20.5 18.8 23.5 0.0 0.2 86.0 28 22.0 19.5 26.0 0.6 0.4 88.0 29 24.9 22.3 29.5 0.1 1.4 85.0 30 25.2 23.8 29.0 0.4 0.8 88.0 31 22.2 20.8 23.0 6.6 0.0 94.0 Trung bỡnh 18.8 17.6 20.5 4.5 5.6 77 Số liệu khí tượng tháng 4 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt độ trung bỡnh (oC) Nhiệt độ thấp nhất (oC) Nhiệt độ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) Độ ẩm (%) 1 20.1 18.2 22.1 2.6 0.0 89 2 18.6 17.6 20.3 1.4 0.0 88 3 18.4 17.0 20.9 0.3 0.0 92 4 20.7 18.8 24.2 1.0 0.0 93 5 22.9 21.2 26.3 0.8 0.0 94 6 25.7 23.0 29.6 - 3.4 87 7 26.5 24.2 30.3 - 4.7 86 8 26.9 24.0 32.1 - 5.3 83 9 27.8 24.2 33.7 - 8.2 81 10 26.1 25.1 28.2 0.0 0.0 89 Trung bỡnh 23.4 21.3 26.8 6.1 21.6 88 11 25.9 25.2 27.7 0.0 0.0 90 12 26.1 25.4 27.8 0.0 0.0 90 13 25.2 24.8 28.5 6.1 0.1 94 14 26.0 22.7 31.2 1.6 6.9 81 15 25.5 21.3 30.2 13.2 5.9 84 16 26.0 24.5 29.2 0.0 4.0 86 17 26.4 23.1 31.0 - 4.6 83 18 26.9 23.3 31.7 - 6.0 89 19 27.7 25.2 32.1 - 5.8 76 20 27.7 25.6 32.0 - 4.0 83 Trung bỡnh 26.3 24.1 30.1 20.9 37.3 86 21 28.3 26.3 31.7 0.1 4.0 84 22 26.6 23.6 28.7 93.4 0.0 88 23 22.4 20.7 24.3 0.3 0.0 81 24 21.5 20.2 24.2 0.1 0.7 68 25 22.8 21.2 26.5 0.0 2.4 72 26 23.4 20.8 26.9 - 2.3 79 27 23.8 22.1 28.5 0.0 1.0 84 28 24.5 22.6 28.5 0.1 1.3 79 29 25.7 22.5 29.7 - 2.1 77 30 25.9 23.5 28.5 0.6 0.3 83 Trung bỡnh 24.5 22.3 27.7 94.5 14.1 80 Số liệu khí tượng tháng 5 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt độ trung bỡnh (oC) Nhiệt độ thấp nhất (oC) Nhiệt độ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) Độ ẩm (%) 1 26.6 24.5 30.4 15.8 1.1 89 2 28.1 25.8 32.6 - 3.8 86 3 28.3 25.8 32.0 0.7 2.8 84 4 29.0 26.5 33.4 - 7.8 83 5 24.0 23.0 24.4 17.1 0.0 92 6 24.6 22.3 28.1 4.1 0.4 88 7 28.1 24.5 33.0 - 6.5 83 8 28.9 26.2 33.9 0.0 6.7 84 9 28.3 25.7 32.8 3.1 3.3 86 10 24.2 22.6 27.7 9.0 0.4 78 Trung bỡnh 27.0 24.7 30.8 49.8 31.7 85 11 24.4 21.7 27.7 0.0 0.0 72 12 26.3 23.0 31.0 - 7.5 70 13 27.1 24.2 31.0 - 5.3 71 14 27.8 23.3 31.9 - 10.3 66 15 27.1 23.5 31.6 - 3.3 72 16 27.6 24.3 32.9 - 8.0 76 17 27.8 25.1 31.5 - 2.2 75 18 27.9 25.3 33.0 12.6 4.1 84 19 22.9 21.6 23.7 102.9 0.0 93 20 25.3 22.5 30.5 0.2 4.8 81 Trung bỡnh 26.4 23.4 30.5 115.7 45.5 76 21 26.9 24.0 31.4 - 5.8 78 22 27.0 25.0 30.6 - 1.0 85 23 28.4 25.8 33.5 - 4.0 83 24 29.2 26.9 33.0 0.0 4.9 83 25 29.6 27.3 33.8 0.2 5.0 83 26 30.5 27.5 35.9 0.2 7.4 80 27 32.0 27.9 37.8 - 9.2 73 28 32.2 28.7 36.5 - 6.5 67 29 32.1 28.4 37.1 - 9.7 74 30 29.1 25.4 33.7 3.8 1.5 78 31 26.2 24.2 29.8 14.3 4.1 80 Trung bỡnh 29.4 26.5 33.9 18.5 59.1 78 Số liệu khí tượng tháng 6 năm 2008 trạm Láng Ngày Nhiệt độ trung bỡnh (oC) Nhiệt độ thấp nhất (oC) Nhiệt độ cao nhất (oC) Lượng mưa (mm) Số giờ nắng (h) Độ ẩm (%) 1 27.5 26.0 30.9 0.0 0.3 83 2 27.1 24.3 31.6 6.4 0.2 85 3 27.5 24.5 33.0 0.1 4.2 72 4 28.0 26.1 31.7 0.0 1.0 85 5 28.0 25.5 31.9 1.4 2.1 86 6 27.3 25.1 32.0 0.0 2.9 84 7 28.6 26.0 34.0 7.8 3.7 81 8 29.2 26.1 34.4 0.3 3.3 78 9 29.3 26.6 33.5 1.1 5.6 74 10 27.6 24.9 30.8 0.1 2.0 82 Trung bỡnh 28.0 25.5 32.4 17.2 25.0 81 11 28.9 26.1 34.1 - 5.5 80 12 29.0 26.6 33.8 0.4 1.7 78 13 28.7 27.0 31.9 0.7 2.1 81 14 28.3 25.6 33.0 19.5 3.0 86 15 29.2 26.2 34.4 21.6 4.5 84 16 28.1 26.5 30.2 1.8 0.0 86 17 28.0 26.5 30.9 0.0 1.0 87 18 27.2 24.6 31.6 67.3 0.6 91 19 26.4 25.0 28.5 19.6 0.1 90 20 29.0 24.9 34.7 22.3 7.2 83 Trung bỡnh 28.3 25.9 32.3 153.2 25.7 85 21 29.5 25.0 36.1 0.0 8.9 74 22 31.3 28.0 36.1 - 9.5 73 23 32.2 28.5 37.5 - 10.8 76 24 29.3 25.5 34.0 21.0 4.9 79 25 30.9 28.2 35.6 - 5.0 73 26 32.1 29.1 36.8 0.0 7.6 71 27 27.7 25.2 32.5 20.7 1.0 85 28 25.8 24.4 28.3 22.2 0.6 88 29 28.5 24.4 34.4 - 8.5 76 30 30.8 28.2 35.9 0.0 7.4 76 Trung bỡnh 29.8 26.7 34.7 63.9 64.2 77 Bộ giáo dục và đào tạo trường đại học nông nghiệp hà nội ------------------ vũ quang khánh “Nghiên cứu đặc điểm nông sinh học, khả năng nhân giống in vitro hoa Lilium poilanei Gapnep và đánh giá đa dạng di truyền nguồn gen chi Lilium” Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành: trồng trọt Mã số: 60.62.01 Người hướng dẫn khoa học: ts. Nguyễn thị phương thảo Hà Nội - 2008 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan, số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Tôi xin cam đoan, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Vũ Quang Khánh Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: TS. Nguyễn Thị Phương Thảo, người hướng dẫn khoa học đã tận tình giúp đỡ với tinh thần trách nhiệm cao và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tập thể Thầy, Cô giáo khoa Nông Học, khoa Sau đại học, đặc biệt các Thầy, Cô giáo trong Bộ môn công nghệ sinh học trường Đại Học Nông nghiệp Hà Nội đã trực tiếp hướng dẫn và đóng góp nhiều ý kiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn này. Tập thể cán bộ, công nhân viên viện sinh học nông nghiệp, các bạn học sinh K49 trường Đại học nông nghiệp Hà Nội đã giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình làm đề tài. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các bạn bè, đồng nghiệp, gia đình và người thân đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình tiến hành đề tài. Hà Nội, ngày tháng năm 2008 Tác giả luận văn Vũ Quang Khánh Mục lục Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh mục chữ viết tắt CT: Công thức TB: Trung bình THT: Than hoạt tính a -NAA: axit a - naphtyl axetic BA: benzyl adenin MS: Murashige & Skoog, 1962 Đ/C: Đối Chứng NST: Nhiễm sắc thể Danh mục các bảng STT Tên bảng Trang 2.1. Diện tích trồng hoa lily ở một số nước năm 2005-2006 10 3.1. Danh sách tên và ký hiệu các loài/ giống lily sử dụng phân tích RAPD 32 3.2. Các mồi sử dụng trong phân tích đa hình ADN bằng kỹ thuật RAPD 33 4.1. Phân loại theo hình thái củ Lilium poilanei Gapnep 41 4.2. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến tỷ lệ mọc mầm của củ Lilium poilanei Gapnep 43 4.3. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến động thái tăng trưởng chiều cao cây hoa Lilium poilanei Gapnep 46 4.4. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến thời gian đạt chiều cao tối đa cây hoa Lilium poilanei Gapnep 48 4.5. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến động thái ra lá cây hoa Lilium poilanei Gapnep 50 4.6. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến thời gian đạt số lá tối đa cây hoa Lilium poilanei Gapnep 52 4.7. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến các thời kỳ sinh trưởng cây hoa Lilium poilanei Gapnep 54 4.8. Một số đặc điểm hình thái cây hoa Lilium poilanei Gapnep 56 4.9. ảnh hưởng của thời gian khử trùng tới khả năng tạo mẫu sạch của mô vẩy củ Lilium poilanei Gapnep (sau 2 tuần nuôi cấy) 59 4.10. ảnh hưởng của a-NAA đến khả năng phát sinh hình thái của mô vẩy củ Lilium poilanei Gapnep (sau 8 tuần nuôi cấy) 60 4.11. ảnh hưởng của BA đến khả năng tái sinh của mô vẩy củ Lilium poilanei Gapnep 61 4.12. ảnh hưởng của BA và a-NAA đến khả năng phát sinh hình thái của mô vẩy củ Lilium poilanei Gapnep 63 4.13. ảnh hưởng của BA và a-NAA đến khả năng nhân nhanh của chồi hoa Lilium poilanei Gapnep tái sinh (sau 6 tuần nuôi cấy) 65 4.14. ảnh hưởng của than hoạt tính đến khả năng ra rễ của chồi loài hoa Lilium poilanei Gapnep 67 4.15. Số băng ADN thu được của 32 giống/loài lily với 3 mồi RAPD 71 4.16. Hệ số tương đồng di truyền của 27 giống/loài lily nghiên cứu 73 Danh mục hình STT Tên hình Trang 2.1. Lilium poilanei Gapnep 4 2.2. Sự sắp xếp lá cây hoa lily 6 2.3. Hình dạng bông hoa lily 7 4.1. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến tỷ lệ mọc mầm của củ Lilium poilanei Gapnep 44 4.2. Sự nảy mầm của củ hoa Lilium poilanei Gapnep (CT3) 45 4.3. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến động thái tăng trưởng chiều cao cây hoa Lilium poilanei Gapnep 47 4.4. ảnh hưởng của thời lượng xử lý lạnh đến động thái ra lá cây hoa Lilium poilanei Gapnep 51 4.5. Sinh trưởng của cây hoa Lilium poilanei Gapnep ở các thời lượng xử lý lạnh khác nhau (sau trồng 14 tuần) 55 4.6. Một số ảnh về hoa Lilium poilanei Gapnep 57 4.7. Sự phát sinh thái của mô vẩy củ hoa Lilium poilanei Gapnep 64 4.8. ảnh hưởng của BA và a -NAA đến khả năng nhân nhanh của của chồi Lilium poilanei Gapnep tái sinh 65 4.9. ảnh hưởng của BA và a-NAA đến khả năng nhân nhanh của của chồi Lilium poilanei Gapnep tái sinh 66 4.10. Kết quả điện di ADN tổng số tách chiết từ 32 giống/loài lily 68 4.11. ảnh điện di sản phẩm PCR với mồi OPA-10 70 4.12. ảnh điện di sản phẩm PCR với mồi P615 70 4.13. ảnh điện di sản phẩm PCR với mồi P650 70 4.14. Sơ đồ cây biểu diễn mối quan hệ di truyền của 27 giống/loài nghiên cứu 74 ._.