Nghiên cứu đặc điểm hóa sinh vì phân lập gen CHAPERONIN liên quan đến tính chịu hạn của một số giống đậu tương địa phương trồng ở vùng Tây Nguyên

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thái Nguyên - 2008 ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM ĐINH THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU ĐẶC ĐIỂM HÓA SINH VÌ PHÂN LẬP GEN CHAPERONIN LIÊN QUAN ĐẾN TÍNH CHỊU HẠN CỦA MỘT SỐ GIỐNG ĐẬU TƯƠNG ĐỊA PHƯƠNGTRỒNG Ở VÙNG TÂY NGUYÊN CHUYÊN NGÀNH: DI TRUYỀN HỌC MÃ SỐ: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Người hướng dẫn khoa học: PGS. TS CHU HOÀNG MẬU Thái Nguyên- 2008 1MӢĈҪU 1. Lý do chӑn ÿӅ tài Ĉұu tѭѫng (Glycine max (L.) Merrill) là cây công nghiӋp ngҳn ngày, có giá trӏ kinh tӃ và hàm lѭӧng dinh dѭӥng cao. Hҥt ÿұu tѭѫng chӭa 30 % - 56% protein, chӭa nhiӅu loҥi axit amin không thay thӃ (lysin, tryptophan, metionin, cystein, leucin…), 12 %-25% lipit, và các vitamin (B1, B2, C,D, E, K…) cҫn thiӃt cho cѫ thӇ ngѭӡi và ÿӝng vұt. Mӝt ÿһc tính quan trӑng nӳa cӫa cây ÿұu tѭѫng là có nӕt sҫn ӣ rӉ tҥo khҧ năng cӕÿӏnh nitѫ không khí, vì vұy trӗng ÿұu tѭѫng góp phҫn cҧi tҥo ÿҩt và bҧo vӋ môi trѭӡng [20]. Sҧn xuҩt ÿұu tѭѫng phát triӇn mҥnh tҥi Mӻ, Brazil, Argentina, Trung Quӕc và nhiӅu nѭӟc khác. Sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng trên thӃ giӟi ÿҥt hàng trăm triӋu tҩn/ năm. Trong khi ÿó, ӣ ViӋt Nam sҧn lѭӧng mӟi chӍÿҥt trăm nghìn tҩn/ năm, ÿLӅu ÿó chӭng tӓ tình hình sҧn xuҩt ÿұu tѭѫng ӣ nѭӟc ta so vӟi khu vӵc vүn còn ӣ mӭc thҩp. ĈӇ thúc ÿҭy sҧn xuҩt ÿұu tѭѫng vҩn ÿӅ quan trӑng là chӑn tҥo ÿѭӧc nhӳng giӕng không chӍ cho năng suҩt cao, phҭm chҩt tӕt mà còn phҧi thích hӧp vӟi ÿLӅu kiӋn ÿӏa hình khí hұu. 1ѭӟc ta có hӋ sinh thái rҩt ÿa dҥng, khí hұu giӳa các vùng, miӅn lҥi không giӕng nhau. Ĉӏa hình có ÿӃn 3/4 là ÿӗi núi thѭӡng có mùa khô hanh ӣ miӅn Bҳc, mùa khô nóng ӣ Tây Nguyên…Nhӳng năm gҫn ÿây diӉn biӃn khí hұu ngày càng phӭc tҥp, Oѭӧng mѭa phân bӕ không ÿӅu giӳa các vùng và giӳa các thӡi kǤ trong năm nên hҥn hán và nҳng nóng kéo dài. Ĉұu tѭѫng là cây tѭѫng ÿӕi mүn cҧm vӟi ÿLӅu kiӋn ngoҥi cҧnh và thuӝc vào nhóm cây chӏu hҥn kém, công tác chӑn tҥo các giӕng ÿұu tѭѫng có kiӇu gen chӕng chӏu ngày càngÿѭӧc quan tâm nghiên cӭu [10], [18], [23]. Ӣ ViӋt Nam, nguӗn gen cӫa cây ÿұu tѭѫng rҩt ÿa dҥng và phong phú; ngoài nhӳng giӕng nhұp nӝi, giӕng lҥi tҥo và giӕng ÿӝt biӃn, còn có tұp ÿoàn các giӕng ÿӏa phѭѫng. Nhӳng giӕng ÿұu tѭѫng ÿӏa phѭѫng thѭӡng có năng suҩt thҩp, nhѭng lҥi có chҩt lѭӧng hҥt tӕt và khҧ năng chӕng chӏu cao vӟi các ÿLӅu kiӋn bҩt lӧi cӫa ngoҥi cҧnh. Ĉһc tính chӏu nóng, chӏu hҥn cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng này ÿã ÿѭӧc nhiӅu nhà khoa hӑc quan tâm nghiên cӭu [18], [24], [31], [36]. Tuy nhiên, các tác giҧ mӟi chӍ tұp trung nghiên cӭu các giӕng ÿұu tѭѫng trӗng ӣ các tӍnh trung du, 2ÿӗng bҵng và các tӍnh vùng núi phía Bҳc, trong khi nguӗn gen cӫa cây ÿұu tѭѫng ӣ các tӍnh khu vӵc Tây Nguyên nѭӟc ta cNJng rҩt ÿa dҥng, có nhiӅu ÿһc tính quý còn ít ÿѭӧc quan tâm. Tây Nguyên là vùng ÿҩt vӟi hai mùa rõ rӋt, mùa mѭa và mùa khô, mùa khô thѭӡng kéo dài gây thiӃu nѭӟc trҫm trӑng dүn ÿӃn năng suҩt, sҧn lѭӧng cây trӗng hàng năm giҧm mҥnh trong ÿó có cây ÿұu tѭѫng. Vì vұy, viӋc ÿánh giá, tuyӇn chӑn các giӕng ÿұu tѭѫng có năng suҩt và chҩt lѭӧng, có khҧ năng chӕng chӏu hҥn cao làm vұt liӋu chӑn giӕng là yêu cҫu thӵc tiӉn ÿһt ra cho ngành chӑn giӕng ÿұu tѭѫng ӣ vùng ÿҩt Cao Nguyên này. Tӯ nhӳng lý do trên chúng tôi ÿã tiӃn hành ÿӅ tài: “Nghiên cӭu ÿһc ÿLӇm hóa sinh và phân lұp gen chaperonin liên quan ÿӃn tính chӏu hҥn cӫa mӝt sӕ giӕng ÿұu tѭѫng ÿӏa phѭѫng trӗng ӣ vùng Tây Nguyên” nhҵm ÿánh giá chҩt lѭӧng hҥt và tìm hiӇu gen liên quan ÿӃn khҧ năng chӏu hҥn cӫa cây ÿұu tѭѫng trong ÿiӅu kiӋn sinh thái ӣ khu vӵc Tây Nguyên. 2. Mөc tiêu nghiên cӭu - So sánh chҩt lѭӧng hҥt cӫa mӝt sӕ giӕng ÿұu tѭѫng trӗng tҥi khu vӵc Tây Nguyên. - Nghiên cӭu khҧ năng chӏu hҥn, cѫ sӣ hóa sinh và phân lұp gen liên quan ÿӃn khҧ năng chӏu hҥn cӫa mӝt sӕ giӕng ÿұu tѭѫng trӗng tҥi khu vӵc Tây Nguyên. 3. Nӝi dung nghiên cӭu - Phân tích ÿһc ÿLӇm hình thái, khӕi lѭӧng và kích thѭӟc hҥt cӫa mӝt sӕ giӕng ÿұu tѭѫng trӗng tҥi Tây Nguyên. - Xác ÿӏnh hàm lѭӧng protein, lipit trong hҥt cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu. - Phân tích thành phҫn axit amin trong protein hҥt cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng - Xác ÿӏnh hàm lѭӧng protein tan, hoҥt ÿӝ cӫa proteaza ӣ giai ÿRҥn hҥt nҧy mҫm. -Ĉánh giá khҧ năng chӏu hҥn cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng ӣ giai ÿRҥn cây non trong ÿiӅu kiӋn hҥn nhân tҥo. - Xác ÿӏnh hàm lѭӧng prolin ӣ giai ÿoҥn cây non 3 lá ӣ thӡi ÿLӇm trѭӟc và sau khi xӱ lý bӣi hҥn. - Nhân, tách dòng và ÿӑc trình tӵ gen chaperonin liên quan ÿӃn tính chӏu hҥn cӫa mӝt sӕ giӕng ÿұu tѭѫng trӗng tҥi Tây Nguyên. 3Chѭѫng 1 7ӘNG QUAN TÀI LIӊU 1.1. CÂY ĈҰU TѬѪNG 1.1.1. Ĉһc ÿLӇm sinh hӑc cӫa cây ÿұu tѭѫng Ĉұu tѭѫng có tên khoa hӑc là Glycine max (L) Merrill, có bӝ nhiӉm sҳc thӇ 2n = 40, thuӝc thân thҧo, hӑÿұu (Fabaceae), hӑ phө cánh bѭӟm (Papilionoidea). Ĉұu tѭѫng có nguӗn gӕc tӯ các tӍnh phía Bҳc và Ĉông Bҳc Trung Quӕc, các vùng kӃ cұn cӫa Cӝng hòa liên bang Nga, TriӅu Tiên và Nhұt Bҧn.Các giӕng ÿұu tѭѫng ÿang trӗng tҥi nѭӟc ta ÿѭӧc du nhұp tӯ Trung Quӕc tӯ lâu ÿӡi [13]. VӅ hình thái, cây ÿұu tѭѫng các bӝ phұn chính là rӉ, thân, lá, hoa và quҧ RӉÿұu tѭѫng có rӉ cӑc gӗm rӉ cái và rӉ bên, trên bӝ rӉ cӫa cây ÿұu tѭѫng có nhiӅu nӕt sҫn chӭa vi khuҭn Rhizobium japonicum có khҧ năng cӕÿӏnh nitѫ tӯ khí trӡi cung cҩp ÿҥm cho cây, có vai trò cҧi tҥo ÿҩt [9]. Thân ÿұu tѭѫng có hình tròn, thân non có màu xanh hoһc tím, khi quҧ chín thì thân ngҧ sang màu vàng nâu. Lá ÿұu tѭѫng gӗm 3 loҥi lá: lá mҫm, lá ÿѫn và lá kép (có 3 lá chét ÿôi khi có 4-5 lá chét). Hoa mӑc thành chùm ӣ nách lá, mӛi chùm hoa có tӯ 10-15 hoa, có màu trҳng hoһc tím, hoa ÿұu tѭѫng tӵ thө phҩn hoàn toàn. Quҧ có thӇ thҷng hoһc cong có nhiӅu lông, mӛi quҧ chӭa tӯ 1-5 hҥt nhѭng thông thѭӡng là 2-3 hҥt. Hҥt ÿұu tѭѫng không có nӝi nhNJ mà chӍ có mӝt lӟp vӓ bao quanh phôi và 2 lá mҫm. Hҥt có hình tròn hoһc hình bҫu dөc, tròn dài, tròn dҽt, vӓ hҥt ÿұu tѭѫng có màu nâu, ÿen, vàng, xanh. Khӕi lѭӧng hҥt rҩt ÿa dҥng tӯ 20-400 mg/hҥt &ăn cӭ vào thӡi gian sinh trѭӣng cӫa cây ÿұu tѭѫng ngѭӡi ta chia làm 3 loҥi: Giӕng chín sӟm (75-85 ngày), giӕng chín trung bình (80-100 ngày), và giӕng chín muӝn (110-120 ngày). Thӡi gian sinh trѭӣng là mӝt yӃu tӕ quan trӑng ÿӇ lӵa chӑn cây trӗng luân canh tăng vө [28]. 41.1.2. Giá trӏ kinh tӃ cӫa cây ÿұu tѭѫng Ĉұu tѭѫng là cây trӗng có giá trӏ kinh tӃ cao, là cây công nghiӋp, cây thӵc phҭm, vӯa là cây cҧi cҧi tҥo ÿҩt. Vӟi ѭu thӃ ngҳn ngày, trӗng ÿѭӧc nhiӅu vө trong Qăm, có thӇ trӗng thuҫn, trӗng xen, luân canh gӕi vө, trӗng ÿѭӧc nhiӅu vùng sinh thái khác nhau, vì vұy sau lúa và ngô, cây ÿұu tѭѫng có mӝt vai trò ÿһc biӋt quan trӑng trong nӅn nông nghiӋp nhiӋt ÿӟi. VӅ mһt dinh dѭӥng, hҥt ÿұu tѭѫng có thành phҫn dinh dѭӥng cao chӭa 30- 56% protein, 12-25% lipit và 20% gluxit [20], là nguӗn axit amin, vitamin (B1, B2, C, D, E) rҩt quan trӑng ÿӕi vӟi ÿӡi sӕng cӫa con ngѭӡi. Protein ÿұu tѭѫng còn có tác dөng hӳu hiӋu giҧm cholesterol trong máu, giҧm thiӇu nguy cѫ các bӋnh liên quan ÿӃn tim mҥch, chúng cNJng ngăn cҧn sӵ phát triӇn các mҫm ung thѭ, ngăn ngӯa bӋnh thұn, bӋnh tiӇu ÿѭӡng, bӋnh xӕp xѭѫng..... Trong công nghiӋp, sҧn phҭm tӯ cây ÿұu tѭѫng ÿѭӧc sӱ dөng rҩt ÿa dҥng nhѭ dùng trӵc tiӃp hҥt khô hoһc chӃ biӃn thành ÿұu phө, ép thành dҫu ÿұu tѭѫng, làm bánh kҽo, sӳa ÿұu, nѭӟc giҧi khát, nѭӟc chҩm ... ÿáp ӭng nhu cҫu ÿҥm trong khҭu phҫn ăn hàng ngày cӫa ngѭӡi cNJng nhѭ gia súc. Ӣ nhӳng quӕc gia phát triӇn, ngѭӡi ta còn dùng ÿұu tѭѫng vào các kӻ nghӋ khác nhѭ biӃn chӃ cao su nhân tҥo, mӵc in, sѫn, xà phòng, chҩt tѫ nhân tҥo, chҩt nhiên liӋu lӓng, dҫu làm trѫn trong kӻ nghӋ hàng không. Trong trӗng trӑt, cây ÿұu tѭѫng còn có tác dөng cҧi tҥo ÿҩt, tăng năng suҩt các cây trӗng khác. ĈLӅu này có ÿѭӧc là do hoҥt ÿӝng cӕÿӏnh N2 cӫa loài vi khuҭn Rhizobium cӝng sinh trên rӉ cây. Nhӡ khҧ năng cӕÿӏnh ÿҥm nên sau mӛi vө thu hoҥch thành phҫn hóa tính cӫa ÿҩt trӗng ÿѭӧc cҧi thiӋn rõ rӋt, lѭӧng ÿҥm trong ÿҩt tăng và khu hӋ vi sinh vұt hiӃu khí trong ÿҩt FNJng tăng. Do ÿó, có lӧi ÿӕi vӟi cây trӗng khác và sau khi thu hoҥch toàn bӝ thân lá, rӉ, lá phӫ lҥi bӅ mһt ÿҩt vӯa có tác dөng che phӫ chӕng xói mòn, vӯa là nguӗn hӳu cѫ giàu ÿҥm cҧi tҥo ÿҩt. 1.1.3. Tình hình sҧn xuҩt ÿұu tѭѫng trên thӃ giӟi và ӣ ViӋt Nam Trên thӃ giӟi (tính ÿӃn tháng 4/ 2006), có 78 nѭӟc trӗng ÿұu tѭѫng vӟi diӋn tích là 91,3 triӋu ha; năng suҩt 22,9 tҥ/ ha, sҧn lѭӧng ÿҥt 236,1 triӋu tҩn. Các nѭӟc sҧn xuҩt ÿұu tѭѫng ÿӭng ÿҫu thӃ giӟi là: Mӻ, Brazil, Argentina và Trung Quӕc chiӃm khoҧng 90-95% tәng sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng trên toàn thӃ giӟi [45]. 5Nhѭ vұy, có thӇ thҩy ÿұu tѭѫng chiӃm mӝt vӏ trí quan trӑng trong nӅn kinh tӃ thӃ giӟi không chӍ do ÿѭӧc gieo trӗng trên diӋn tích lӟn ӣ 78 nѭӟc, mà hҥt ÿұu tѭѫng còn ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi ÿӇ làm thӵc phҭm và nguyên liӋu cho công nghiӋp. Bҧng 1.1. Sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng cӫa mӝt sӕ nѭӟc trên thӃ giӟi niên vө 2006 – 2007 (Theo Oil World); Ĉѫn vӏ tính: triӋu tҩn Ӣ ViӋt Nam, trong vòng hѫn 20 năm qua (tӯ 1985- 2006) diӋn tích, năng suҩt và sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng ÿã không ngӯng tăng, ÿһc biӋt trong nhӳng năm gҫn ÿây: Fө thӇ Qăm 2000 diӋn tích trӗng ÿұu tѭѫng là 124100 ha ÿӃn năm 2005 tăng lên 203600 ha, năng suҩt ÿҥt tӯ 12000 tҥ/ha năm 2000 lên 14,300 tҥ/ha năm 2005 và sҧn lѭӧng tӯ 147300 tҩn năm 2000 lên 290600 tҩn năm 2005 [21]. ThӃ giӟi 236,1 Mӻ 86,8 Brazil 59,0 Argentina 47,2 Paraguay 6,5 Trung Quӕc 16,2 Ҩn Ĉӝ 7,7 Canada 3,5 Ukraine 0,9 Liên bang Nga 0,7 Indonesia 0,8 ViӋt Nam 0,3 Thái Lan 0,2 Nigeria 0,4 Các nѭӟc khác 0,8 6Bҧng 1.2: DiӋn tích, năng suҩt, sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng cҧ nѭӟc qua các năm (Nguӗn: Tәng cөc Thӕng kê, 2006) 1ăm ChӍ tiêu 2000 2001 2002 2003 2004 2005 2006 DiӋn tích (1000 ha) 124,1 140,3 158,6 165,6 182,5 203,6 185,8 1ăng suҩt (tҥ/ha) 12,0 12,4 13,0 13,3 13,3 14,3 13,9 Sҧn lѭӧng (1000 tҩn) 149,3 173,7 205,6 219,6 242,1 290,6 186,9 HiӋn nay cây ÿұu tѭѫng ÿѭӧc trӗng ӣ cҧ 7 vùng nông nghiӋp trên cҧ nѭӟc, do ÿiӅu kiӋn sinh thái cӫa mӛi vùng khác nhau nên có sӵ khác biӋt khá rõ vӅ diӋn tích trӗng, năng suҩt và sҧn lѭӧng [21]. Bҧng 1.3. DiӋn tích, năng suҩt và sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng cӫa 7 vùng năm 2005 Ĉӏa ÿLӇm DiӋn tích (1000 ha) 1ăng suҩt (Kg/ha) Sҧn lѭӧng (1000 tҩn) Cҧ nѭӟc 203,6 1430 291,5 Ĉӗng bҵng Sông Hӗng 67,3 16000 107,5 Vùng Ĉông Bҳc 48,4 1040 50,2 Vùng Tây Bҳc 25,0 1150 28,7 Vùng Bҳc Trung Bӝ 6,5 1220 7,9 Tây Nguyên 27,1 1570 42,5 Ĉông Nam Bӝ 5,3 1060 5,6 Ĉӗng bҵng Sông Cӱu long 21,2 2100 44,5 %ҧng 3.1 cho thҩy Tây Nguyên là vùng có diӋn tích trӗng ÿұu tѭѫng lӟn thӭ 3 trong 7 vùng nông nghiӋp trên Fҧ Qѭӟc.Cùng vӟi sӵ Wăng trѭӣng Fӫa các loҥi cây trӗng chính nhѭ cao su, cà phê, hӗ tiêu, ca cao….thì cây ÿұu tѭѫng FNJng ÿang ÿѭӧc chú trӑng và phát triӇn trên vùng ÿҩt này. Mһc dù, sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng ӣ nѭӟc ta có tăng nhѭng so vӟi các nѭӟc trên thӃ giӟi và trong khu vӵc năng suҩt cӫa ta vүn còn thҩp, và ÿһc biӋt trong nhӳng Qăm gҫn ÿây diӋn tích, năng suҩt và sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng cӫa nѭӟc ta giҧm ÿi ÿáng 7kӇ. Năm 2005 diӋn tích tӯ 203600 ha giҧm xuӕng chӍ còn 185800 ha năm 2006 và sҧn lѭӧng giҧm tӯ 290600 tҩn năm 2005 xuӕng còn 186900 tҩn năm 2006. Nguyên nhân chính là do ÿҫu tѭ thҩp, chѭa có bӝ giӕng phù hӧp, chѭa áp dөng kӻ thұt tiên tiӃn. Vì vұy, nghiên cӭu cҧi tiӃn các ÿһc ÿLӇm nông sinh hӑc cӫa các giӕng ÿӏa phѭѫng và tҥo giӕng mӟi có năng suҩt cao, thích nghi vӟi ÿLӅu kiӋn sinh thái ӣ nhӳng vùng khác nhau bҵng phѭѫng pháp truyӅn thӕng kӃt hӧp vӟi hiӋn ÿҥi sӁÿáp ӭng ÿѭӧc yêu cҫu cӫa thӵc tiӉn ÿһt ra và ÿó cNJng là chiӃn lѭӧc quan trӑng vӅ sӵ phát triӇn cây ÿұu ÿӛӣ nѭӟc ta. 1.1.4. Thành phҫn hóa sinh hҥt ÿұu tѭѫng Trong hҥt ÿұu tѭѫng có các thành phҫn ÿã biӃt tính theo tӹ lӋ protein 30- 56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các muӕi khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S, các vitamin A, B1, B2, D, E, F, các men, sáp, nhӵa, cellulose. Ngoài ra, hҥt ÿұu tѭѫng còn có ÿӫ các axit amin cѫ bҧn isoleucin, leucin, lysin, metionin, phenylalanin, tryptophan, valin...[20]. Protein là thành phҫn chӫ yӃu trong hҥt ÿұu tѭѫng. Chúng chiӃm khoҧng 30%-55% khӕi lѭӧng khô cӫa hҥt. Dӵa vào hӋ sӕ lҳng, ngѭӡi ta chia protein cӫa hҥt ÿұu tѭѫng thành 3 loҥi: 11S - legumin, 7S - vixilin, 2S - albumin. Nhӳng loҥi protein chính trong hҥt ÿұu tѭѫng là: protein dӵ trӳ (chiӃm 70% tәng sӕ protein), các enzim, các chҩt ӭc chӃ proteaza và lectin. Thành phҫn cӫa protein gӗm có albumin (9,5%), globulin tan trong nѭӟc (75,8%), globulin chӍ tan trong NaCl là 3%, glutelin - protein tan trong NaOH 0,2M là 11,7% [18], [25]. Thành phҫn axit amin cӫa hҥt ÿұu tѭѫng: Protein cӫa các loҥi ÿұu ÿӛ, nhҩt là ÿұu tѭѫng, ÿѭӧc xem là protein có chҩt lѭӧng tӕt nhҩt trong các loҥi protein thӵc vұt. Chúng có chӭa tҩt cҧ các axit amin không thay thӃ. Hѫn nӳa protein cӫa cây hӑÿұu còn có hàm lѭӧng lysin rҩt cao so vӟi protein tӯ các loҥi ngNJ cӕc.Tuy vұy, hàm lѭӧng các axit amin có chӭa gӕc SH (metionin, cystein) còn thҩp [8], [40]. Hàm lѭӧng lipit trong ÿұu tѭѫng khá cao chiӃm khoҧng 12-25% khӕi Oѭӧng khô, trong ÿó hàm lѭӧng các axit béo no thҩp, khoҧng 13%, không có cholesterol, 30% là các axit béo chѭa no mӝt nӕi ÿôi. Lѭӧng axit béo không no cҫn 8thiӃt: axit linoleic 50%, và ÿһc biӋt có 7% axit anpha linolenic là nguӗn cung cҩp axit béo chuӛi mҥch dài omega 3 quan trӑng cho cѫ thӇ nhѭ DHA (Docosa Hexaenoic Acid) và EPA (Eicosa Pentaenoic Acid ) [44]. Chҩt lѭӧng lipit cӫa hҥt ÿұu tѭѫng rҩt tӕt, cho nên nó ÿѭӧc sӱ dөng rӝng rãi trong công nghiӋp chӃ biӃn thӵc phҭm. Hҥt ÿұu tѭѫng còn có các loҥi vitamin tan trong lipit, ÿһc biӋt là vitamin E = 200 mg/100g lipit [8], ngoài ra trong hҥt ÿұu Wѭѫng còn chӭa mӝt sӕ chҩt khác nhѭ hydrat cacbon, muӕi khoáng, axit nucleic, kích thích sinh trѭӣng . Tóm lҥi, hҥt ÿұu tѭѫng có giá trӏ dinh dѭӥng cao.Trong ÿó, hàm lѭӧng protein dӵ trӳ và chҩt lѭӧng cӫa chúng là yӃu tӕ quyӃt ÿӏnh làm cho ÿұu tѭѫng trӣ thành nguӗn thӵc phҭm quan trӑng cho ngѭӡi và thӭc ăn cho gia súc [18]. 1.2. NGHIÊN CӬU VӄĈҺC TÍNH CHӎU HҤN CӪA CÂY ĈҰU TѬѪNG 1.2.1. Khái niӋm vӅ hҥn và tác ÿӝng cӫa hҥn ÿӃn thӵc vұt Hҥn ÿӕi vӟi thӵc vұt là khái niӋm dùng ÿӇ chӍ sӵ thiӃu nѭӟc do môi trѭӡng gây nên trong suӕt quá trình hay tӯng giai ÿRҥn, làm ҧnh hѭӣng ÿӃn sinh trѭӣng và phát triӇn cӫa cây. ThiӃu nѭӟc trѭӟc tiên ҧnh hѭӣng ÿӃn sӵ cân bҵng nѭӟc cӫa cây, tӯÿó ҧnh Kѭӣng ÿӃn chӭc năng sinh lý nhѭ quang hӧp, hô hҩp dinh dѭӥng khoáng và cuӕi cùng ҧnh ÿӃn sӵ sinh trѭӣng phát triӇn cӫa thӵc vұt. Cây sӁ chӃt non hoһc giҧm sӭc sӕng, giҧm năng suҩt [19]. HiӋn tѭӧng mҩt nѭӟc có thӇ do tác ÿӝng sѫ cҩp, là kӃt quҧ cӫa sӵ thiӃu nѭӟc trong môi trѭӡng, hoһc là tác ÿӝng thӭ cҩp ÿѭӧc gây ra bӣi nhiӋt ÿӝ thҩp, sӵÿӕt nóng hay tác ÿӝng cӫa muӕi. Hҥn cNJng nhѭ yӃu tӕ ngoҥi cҧnh bҩt lӧi khác khi tác ÿӝng lên cѫ thӇ thӵc vұt sӁ gây ra phҧn ӭng cӫa cѫ thӇ. Tùy theo tӯng loài, giӕng mà mӭc ÿӝ phҧn ӭng cӫa cѫ thӇ cNJng nhѭ thiӋt hҥi do khô hҥn gây ra khác nhau: mӝt sӕ bӏ chӃt, mӝt sӕ bӏ tәn thѭѫng nhѭng cNJng có mӝt sӕ khác không bӏ ҧnh Kѭӣng. Khҧ năng thӵc vұt có thӇ giҧm thiӇu mӭc tәn thѭѫng do thiӃu hөt nѭӟc gây ra gӑi là tính chӏu hҥn [19]. 9 ViӋt Nam là mӝt nѭӟc có ÿӏa hình ÿa dҥng và diӉn biӃn khí hұu phӭc tҥp, lѭӧng Pѭa phân bӕ không ÿӅu giӳa các vùng, miӅn và giӳa các thӡi kǤ trong năm nên hҥn hán có thӇ xҧy ra ӣ bҩt kǤ mùa nào, vùng nào. DiӋn tích có tӟi 3/4 lãnh thә là ÿӗi núi, ÿҩt canh tác cӫa các khu vӵc này thѭӡng xuyên bӏ hҥn nên thành phҫn thә nhѭӥng cӫa các vùng khác nhau rҩt rõ rӋt. Tҩt cҧ các yӃu tӕ trên chi phӕi mҥnh mӁ mӵc nѭӟc ngҫm và khҧ năng giӳ nѭӟc cӫa ÿҩt. ĈӇ chӕng lҥi khô hҥn cây có thӇ giӳÿӇ không bӏ mҩt Qѭӟc, giҧm diӋn tích lá, rút ngҳn chu kǤ sӕng…Khҧ năng duy trì áp suҩt thҭm thҩu nӝi bào có tác dөng bҧo vӋ hoһc duy trì sӭc sӕng cӫa tӃ bào chҩt khi bӏ mҩt nѭӟc [2]. Có hai loҥi hҥn do môi tUѭӡng tác ÿӝng là hҥn ÿҩt và hҥn không khí [1], [5]. Tác ÿӝng Fӫa Kҥn lên cây chӫ yӃu theo hai hѭӟng chính là: làm tăng nhiӋt ÿӝ cây và gây mҩt nѭӟc trong cây. Nѭӟc là yӃu tӕ giӟi hҥn ÿӕi vӟi cây trӗng, vӯa là sҧn phҭm khӣi ÿҫu vӯa là sҧn phҭm trung gian và cuӕi cùng cӫa các quá trình chuyӇn hoá sinh hӑc. Nѭӟc là môi trѭӡng ÿӇ các phҧn ӭng trao ÿәi chҩt xҧy ra [2]. Sӵ tác ÿӝng cӫa hҥn, gây nên hiӋn tѭӧng co nguyên sinh và làm cho cây bӏ héo. Sӵ co nguyên sinh các tӃ bào diӉn ra khi nӗng ÿӝ nѭӟc trong môi trѭӡng quá cao hay do hҥn nѭӟc làm cho nѭӟc trong tӃ bào thҩt thoát ra ngoài nên khӕi. Hҥn hán làm giҧm mҥnh quang hӧp. Khi hàm lѭӧng nѭӟc trong lá còn khoҧng 40-50% quang hӧp cӫa lá sӁ bӏÿình trӋ cҧn trӣ sӵ sinh trѭӣng cӫa cây. Nhѭ vұy, ҧnh hѭӣng cӵc ÿoan cӫa hҥn ӣ bҩt cӭӣ giai ÿRҥn sinh trѭӣng nào cӫa cây trӗng cNJng ҧnh hѭӣng ÿӃn các yӃu tӕ cҩu thành năng suҩt và sҧn lѭӧng cây trӗng. 1.2.2. Cѫ sӣ sinh lý, sinh hóa và sinh hӑc phân tӱ cӫa tính chӏu hҥn 1.2.2.1. C˯ sͧ sinh lý, sinh hóa cͯa tính ch͓u h̩n Khi gһp hҥn thӵc vұt luôn có nhӳng biӃn ÿәi vӅ mһt sinh lý, sinh hóa nhҵm không ÿӇ mҩt nѭӟc. Có hai cѫ chӃ bҧo vӋ thӵc vұt tӗn tҥi trên môi trѭӡng thiӃu Qѭӟc ÿó là vai trò cӫa bӝ rӉ và khҧ năng ÿLӅu chӍnh áp suҩt thҭm thҩu [2]. Vai trò cͯa b͡ r͍: khҧ năng thu nhұn nѭӟc chӫ yӃu phө thuӝc vào bӝ rӉ. ĈӇ tránh mҩt nѭӟc nhӳng cây chӏu hҥn thѭӡng có bӝ rӉ khӓe, dài, mұp, có sӭc xuyên sâu sӁ hút ÿѭӧc nѭӟc ӣ nhӳng nѫi sâu trong ÿҩt hoһc rӉ lan rӝng vӟi sӕ lѭӧng lӟn [19]. Thӵc vұt nói chung, và cây ÿұu tѭѫng nói riêng, khi ӣ giai ÿRҥn cây non thѭӡng chӏu tác ÿӝng mҥnh cӫa hҥn vì bӝ rӉ chѭa phát triӇn ÿҫy ÿӫ còn yӃu. 10 Kh̫ năng ÿL͉u ch͑nh áp sṷt tẖm th̭u (ASTT): là mӝt ÿһc tính quan trӑng cӫa tӃ bào khi bӏ mҩt nѭӟc do nóng hҥn. Nhӳng thӵc vұt tӗn tҥi trên môi trѭӡng mҩt cân bҵng vӅ áp suҩt thҭm thҩu ÿòi hӓi phҧi có khҧ năng chӕng lҥi ÿLӅu kiӋn khҳc nghiӋt ÿó. Trong ÿLӅu kiӋn khô hҥn ASTT ÿѭӧc ÿLӅu chӍnh tăng lên giúp cho tӃ bào thu nhұn ÿѭӧc nhӳng phân tӱ nѭӟc tӯÿҩt. Bҵng cѫ chӃ nhѭ vұy, thӵc vұt có thӇ vѭӧt qua ÿѭӧc tình trҥng hҥn cөc bӝ. Thông thѭӡng, thiӃu nѭӟc gây rӕi loҥn toàn bӝ phѭѫng thӭc chuyӇn hóa ӣ thӵc vұt, làm tăng hoһc giҧm hàm lѭӧng các chҩt chuyӇn hóa nhѭ: Wăng lên vӅ hàm Oѭӧng prolin, nӗng ÿӝ ion K+, các loҥi ÿѭӡng, axit hӳu cѫ...[2], [4], [30]. Sӵ tәng hӧp và tích lNJy các chҩt trên diӉn ra rҩt nhanh khi tӃ bào mҩt nѭӟc, các chҩt hòa tan sӁÿѭӧc tích lNJy nhҵm chӕng lҥi viӋc giҧm mҩt nѭӟc, tăng khҧ năng giӳ nѭӟc cӫa chҩt nguyên sinh và chúng có thӇ tѭѫng tác vӟi lipit hoһc protein màng ngăn chһn sӵ phá hӫy màng và các phӭc protein [24]. Quá trình này liên quan ÿӃn sӵ biӇu hiӋn cӫa các gen, hàng loҥt các gen nghӍÿѭӧc hoҥt hóa tәng hӧp tҥo ra các chҩt cҫn thiӃt ÿӇ chӕng lҥi sӵ khô hҥn [1]. 1ѭӟc ta nҵm trong khu vӵc nhiӋt ÿӟi gió mùa hҥn là yӃu tӕ tKѭӡng xuyên tác ÿӝng gây ҧnh hѭӣng ÿӃn sinh trѭӣng, phát triӇn cӫa cây trӗng, ҧnh hѭӣng xҩu ÿӃn Qăng suҩt và phҭm chҩt cӫa chúng. Vì vұy, viӋc nghiên cӭu các cѫ chӃ chӏu hҥn sӁ là cѫ sӣ cho viӋc cҧi thiӋn giӕng cNJng nhѭ tҥo ra ÿѭӧc các giӕng có tính chӕng chӏu. Khi nghiên cӭu vӅ khҧ năng chӕng chӏu cӫa các cây trӗng lҩy hҥt ngѭӡi ta thӵc hiӋn theo nhiӅu hѭӟng khác nhau: phân tích hóa sinh trong hҥt nҭy mҫm ÿӇ nghiên cӭu ÿa dҥng enzym Į- amylaza và proteaza hàm lѭӧng protein tan, thành phҫn axit amim, prolin... Các proteazaÿóng vai trò quan trӑng trong cѫ thӇ sӕng và nhҩt là trong thӡi kǤ nҧy mҫm cӫa hҥt. Chúng rҩt ÿa dҥng. Thành phҫn phӭc tҥp cӫa các proteaza hҥt ÿѭӧc tҥo ra bӣi sӵÿa dҥng chӭc năng do chúng ÿҧm nhiӋm trong thӡi kǤ nҧy mҫm. Proteaza nói chung không chӍ tham gia vào phân giҧi protein dӵ trӳ trong hҥt, nhҵm cung cҩp các axit amin cho thӡi kǤ phát triӇn ÿҫu tiên cӫa cây mà chúng còn tham gia vào quá trình vi xӱ lý phân tӱ protein. Proteaza tham gia vào phân giҧi các protein lҥ 11 hoһc bӏ biӃn tính khi gһp ÿLӅu kiӋn cӵc ÿoan (lҥnh, mһn, hҥn, tác ÿӝng cѫ hӑc...) [18]. Trҫn Thӏ Phѭѫng Liên (1999) khi nghiên cӭu so sánh phәÿLӋn di hoҥt tính proteaza cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng chӏu nóng chӏu hҥn khác nhauÿã nhұn xét rҵng. Proteaza trong quá trình hҥt nҭy mҫm cӫa hҥt ӣ tҩt cҧ các giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu rҩt ÿa dҥng, có hoҥt tính cao, có khҧ năng phân giҧi hoàn toàn protein dӵ trӳ tҥo nguyên liӋu ÿӇ tәng hӧp protein cho cѫ thӇ mӟi. Xӱ lý nhiӋt ÿӝ cao chӍҧnh hѭӣng ÿӃn hoҥt tính proteaza ӣ mӝt sӕ giӕng chӏu hҥn, không ҧnh hѭӣng ÿӃn giӕng chӏu nóng [18]. NguyӉn Thӏ Kim Dung (2003) nghiên cӭu sӵ biӃn ÿӝng hoҥt ÿӝ proteaza ӣ giai ÿoҥn hҥt nҧy mҫm cӫa các giӕng lҥc ÿã rút ra kӃt luұn, hoҥt ÿӝ cӫa proteaza trong giai ÿoҥn hҥt nҧy mҫm có xu hѭӟng tăng tӯ 1 ÿӃn 5 ngày tuәi, sau ÿó giҧm tӯ 7 ÿӃn 9 ngày tuәi [6]. CNJng theo hѭӟng nghiên cӭu này NguyӉn Thӏ Thu Ngà (2007), cho rҵng ӣ các giai ÿRҥn hҥt nҧy mҫm làm biӃn ÿәi hoҥt ÿӝ cӫa proteaza và hàm lѭӧng protein tan. Sӵ biӃn ÿәi này tuân theo quy luұt chung : tăng ӣ các giai ÿRҥn tӯ 3 ÿӃn 7 ngày tuәi, bҳt ÿҫu giҧm ӣ giai ÿRҥn 9 ngày tuәi, hàm lѭӧng protein tan và hoҥt ÿӝ proteaza có mӕi tѭѫng quan thuұn chһt chӁ [29]. Nhӳng thay ÿәi hóa sinh khác do hҥn gây ra cNJng ÿѭӧc nhiӅu tác giҧ quan tâm nghiên cӭu: nhѭ sӵ thay ÿәi hàm lѭӧng prolin khi cây gһp hҥn. Prolin là mӝt axit amin có vai trò quan trӑng trong sӵÿLӅu hòa ASTT trong tӃ bào, ÿӗng thӡi là mӝt axit amin ѭa nѭӟc có khҧ năng giӳ và lҩy nѭӟc cho tӃ bào, ngăn chһn sӵ xâm nhұp cӫa ion Na+ tѭѫng tác vӟi protein màng, ngăn chһn sӵ phá hӫy cӫa màng và các phӭc protein khác. Các kӃt quҧ nghiên cӭu ÿӅu cho thҩy khi cây trӗng gһp hҥn thì cây giҧm tәng hӧp protein và tăng tәng hӧp prolin [26], [28]. Soulages và cs (2003) ÿã chӭng minh ngoài vai trò tăng cѭӡng khҧ năng chӏu hҥn thì chuӛi axit amin L – Prolin nhóm II còn có khҧ năng chӕng lҥi các tác ÿӝng bҩt lӧi cӫa nhiӋt ÿӝÿӕi vӟi cây ÿұu tѭѫng [ 38]. Theo Ĉinh Thӏ Phòng (2001), ӣ lúa khi gây hҥn sinh lý bҵng dung dӏch sorbitol 5% hàm lѭӧng prolin cӫa các dòng chӑn lӑc tăng lên vѭӧt xa so vӟi ÿӕi chӭng, sӵ tăng hàm lѭӧng prolin liên quan ÿӃn khҧ Qăng chӏu hҥn [30]. Khҧo sát chҩt lѭӧng hҥt và khҧ năng chӏu hҥn cӫa mӝt sӕ giӕng lúa cҥn ÿӏa phѭѫng ӣ vùng núi phía Bҳc, Chu Hoàng Mұu và cs ( 2005) ÿã nhұn xét, 12 khҧ năng chӏu hҥn cӫa các giӕng lúa cҥn có liên quan ÿӃn hàm lѭӧng protein và hàm Oѭӧng prolin. Khi gһp hҥn, cây lúa cҥn giҧm hàm lѭӧng protein và tăng hàm lѭӧng prolin [24]. NguyӉn Thӏ Thúy Hѭӡng ( 2006), khi nghiên cӭu vӅ khҧ năng chӏu hҥn cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng ÿӏa phѭѫng cӫa TӍnh Sѫn La cNJng ÿã nhұn xét rҵng: khi gһp hҥn các giӕng ÿұu tѭѫng có sӵ giҧm tәng hӧp protein và tăng cѭӡng tәng hӧp prolin [26 ]. 1.2.2. Cѫ sӣ phân tӱ cӫa tính chӏu hҥn Khҧ năng chӕng chӏu cӫa sinh vұt nói chung và cӫa thӵc vұt nói riêng liên quan ÿӃn cҩu trúc, chӭc năng cӫa các thành phҫn trong tӃ bào và các quá trình xҧy ra trong mӛi vùng liên quan ÿӃn khҧ năng chӏu nóng, chӏu hҥn, mһn, phèn cӫa thӵc vұt. Phҧn ӭng cӫa thӵc vұt trѭӟc nhӳng tác ÿӝng: nóng, hҥn rҩt ÿa dҥng nó phө thuӝc vào nhiӅu yӃu tӕ khác nhau, trong ÿó có kiӇu gen, ÿӝ dài và tính khӕc liӋt cӫa ÿiӅu kiӋn ngoҥi cҧnh. BiӇu hiӋn cӫa quá trình này là viӋc sinh tәng hӧp mӝt loҥt các chҩt trong tӃ bào, mӝt sӕ hormon hoһc chҩt kích thích ÿӇ giúp cho cây có khҧ năng thích ӭng. Khi ÿi sâu vào nghiên cӭu ӣ mӭc ÿӝ phân tӱ cӫa hiӋn tѭӧng nóng hҥn ӣ thӵc vұt ngѭӡi ta ÿã có nhӳng bѭӟc tiӃp cұn khác nhau trên nhiӅu loài cây trӗng ӣ các giai ÿoҥn phát triӇn khác nhau. Ĉѭӧc nghiên cӭu nhiӅu nhҩt là các protein sҧn phҭm biӇu hiӋn gen [19]. Nhóm các protein ÿѭӧc ÿһc biӋt quan tâm bao gӗm: protein sӕc nhiӋt, môi giӟi phân tӱ, LEA... Protein sӕc nhiӋt (heat shock protein- HSP): HSP có ӣ hҫu hӃt các loài thӵc vұt nhѭ: lúa mì, mҥch, lúa gҥo, ngô, ÿұu nành, hành, tӓi…. chúng chiӃm khoҧng 1% protein tәng sӕ trong lá cӫa các loài thӵc vұt này. HSP ÿѭӧc tәng hӧp khi tӃ bào gһp ÿiӅu kiӋn cӵc ÿoan nhѭ: hҥn, nhiӋt ÿӝ cao, ÿӝ muӕi cao. Sӵ xuҩt hiӋn cӫa HSP có chӭc năng ngăn cҧn hoһc sӱa chӳa sӵ phá Kӫy do stress nóng và mӣ rӝng giá trӏ ngѭӥng vӟi sӵ chӕng chӏu nhiӋt ÿӝ cao. Trong các tӃ bào thӵc vұt HSP tӃ bào chҩt tұp trung thành các hҥt sӕc nhiӋt (HSG-Heat Shock Granules). Ngѭӡi ta cho rҵng các HSP gҳn kӃt trên các ARN polymeraza ÿӇ ngăn cҧn sӵ phiên mã tәng hӧp mARN trong quá trình bӏ stress nóng. Sau sӕc nóng các hҥt này phân tán và liên kӃt dày ÿһc vӟi các ribôxôm hoҥt ÿӝng sinh tәng hӧp protein [19]. 13 HSP có thӇ chia làm 6 nhóm dӵa trên cѫ sӣ khӕi lѭӧng phân tӱ khác nhau: 110, 90, 70, 60, 20, 8,5 kDa. Trong ÿó có nhóm HSP70 và HSP 60 có nhiӅu ÿҥi diӋn cӫa chҩt môi giӟi phân tӱ (gӑi là chaperonin) HSP 8,5 kDa (Ubiquitin) có chӭc Qăng bҧo vӋ cho tӃ bào nhѭng không phҧi là môi giӟi phân tӱ. Ubiquitin có hoҥt tính proteaza vӟi chӭc năng phân giҧi các protein không có hoҥt tính enzym. Ubiquitin có MW rҩt thҩp, ít chӏu ҧnh hѭӣng cӫa nhiӋt ÿӝ nên có vai trò tӵ sӱa chӳa cӫa tӃ bào khi gһp yӃu tӕ cӵc ÿoan, ÿһc biӋt là nhiӋt ÿӝ cao [19]. Môi giӟi phân tӱ (MGPT): MGPT là mӝt nhóm gӗm nhóm gӗm nhiӅu loҥi protein khác nhau, nhѭng chúng ÿӅu có chӭc năng tham gia tҥo cҩu trúc không gian ÿúng cho protein trong tӃ bào. Phҫn lӟn các chҩt MGPT có hoҥt tính ATP-aza, có chӭc năng: (1) Giӳ әn ÿӏnh chuӛi polypeptit khi ÿang tәng hӧp và tҥo cҩu trúc không gian ÿúng cho chúng, (2) Tҥo lҥi cҩu trúc không gian cӫa protein sau khi vұn chuyӇn qua màng tӃ bào, (3) Lҳp ráp các chuӛi polipeptit vào phӭc ÿӇ tҥo cҩu trúc bұc 4, (4) MGPT ÿѭӧc tăng cѭӡng nhӡ quá trình tәng hӧp trong ÿLӅu kiӋn cӵc ÿoan do nhu cҫu cҩp thiӃt cӫa tӃ bào, nhҩt là sӕc nhiӋt. MGPT có thӇ chia thành mӝt sӕ nhóm nhѭ sau: HSP 70 là nhóm MGPT có hoҥt tính ATP-aza và có tính bҧo thӫ cao. Trong ÿiӅu kiӋn cӵc ÿoan HSP có thӇ ngăn chһn sӵ co cөm và kӃt tө protein. HSP 60 (chaperonin) là loҥi protein cҩu tҥo tӯ các tiӇu ÿѫn vӏ có khӕi lѭӧng 60 kDa và cNJng có hoҥt tính ATP-aza [24]. HӋ CCT: Chaperonin cӫa tӃ bào chҩt, còn gӑi là chaperonin chӭa polypeptit- l cӫa phӭc t (CCT), hay còn gӑi là phӭc vòng chӭa polypeptit-l cӫa phӭc t (TriC) là mӝt nhóm môi giӟi phân tӱ mӟi. Chúng giúp cho viӋc tҥo cҩu trúc không gian ÿúng cӫa protein trong khung tӃ bào actin và tubulin trong tӃ bào chҩt. Chúng ÿóng vai trò quan trӑng trong qua trình hình thành thoi vô sҳc cӫa giai ÿRҥn phân bào, ÿһc biӋt là thӡi kǤ phát triӇn mҫm tӯ hҥt. Chaperonin tӃ bào chҩt là mӝt phӭc có khӕi Oѭӧng phân tӱ khoҧng 90 kDa bao gӗm 8 tiӇu ÿѫn vӏ có tên là a, ȕ, Ȗ, į, İ, ȗ, Ș, ș (tѭѫng ÿѭѫng vӟi CCT1- CCT8) và hình thành nên cҩu trúc vòng bi kép [16]. Trong dӏch chiӃt tӃ bào các tiӇu ÿѫn vӏ trong cҩu trúc không gian cӫa vòng bi có vai trò rҩt 14 quan trӑng ÿӇ gҳn cѫ chҩt. Chӭc năng này gҳn liӅn vӟi sӵ có mһt cӫa 4 tiӇu ÿѫn vӏ: CCTaȕįİ. Vì quá trình tҥo cҩu trúc không gian trong CCT không có sӵ tham gia cӫa protein dҥng GroES, nên cѫ chҩt protein ÿѭӧc giӳ lҥi trong khӕi hình trө nhӡ cѫ chӃÿóng mӣÿһc biӋt theo kiӇu bұc thang cӫa các vùng CCT. Ngoài CCT còn có hai nhóm nhân tӕ cùng tác ÿӝng A và B tham gia vào cҩu trúc không gian ÿúng cӫa protein. Trong ÿó nhóm nhân tӕ A không ÿóng vai trò trong công viӋc ÿLӅu chӍnh hoҥt tính cӫa CCT. Nó không tham gia tѭѫng tác vӟi CCT nhѭng lҥi tham gia vào tҥo cҩu trúc không gian ÿúng cӫa protein khi giҧi phóng ra khӓi CCT [18]. Các nhóm HSP 100, HSP 90 ÿӅu có tính bҧo thӫ cao và có hoҥt tính ATP- aza. Mӝt sӕ tìm thҩy trong tӃ bào bình thѭӡng, nhѭng phҫn lӟn chúng sinh ra khi gһp các ÿLӅu kiӋn ngoҥi cҧnh bҩt lӧi nhѭ hҥn, nóng, lҥnh. Chӭc năng chính cӫa chúng là ngăn chһn sӵ co cөm cӫa protein và tái hoҥt hoá các protein biӃn tính [19]. 1.2.3. Nghiên cӭu vӅ tính chӏu hҥn ӣ cây ÿұu tѭѫng Trong các cây trӗng lҩy hҥt thì cây ÿұu tѭѫng có nhu cҫu vӅ nѭӟc cao hѫn các loҥi cây khác. Ĉó chính là do trong hҥt và cây ÿұu tѭѫng có hàm lѭӧng protein và lipit rҩt cao, ÿӇ tәng hӧp 1kg chҩt khô cҫn 500 - 530 kg nѭӟc. Trong quá trình nҧy mҫm thì nhu cҫu vӅ nѭӟc cӫa ÿұu tѭѫng cNJng khá cao 50%, trong khi ÿó ӣ ngô chӍ là 30%, lúa là 26% [20 ]. Nghiên cӭu vӅ các ÿһc tính chӏu hҥn cӫa cây ÿұu tѭѫng vӅ phѭѫng diӋn sinh lý và di truyӅn ÿã cho thҩy rҵng, các ÿһc tính này liên quan chһt chӁÿӃn ÿһc ÿLӇm hoá keo cӫa nguyên sinh chҩt, ÿһc ÿLӇm cӫa quá trình trao ÿәi chҩt. Tính chӏu hҥn cӫa cây ÿұu tѭѫng là tính trҥng ÿa gen. Chúng thӇ hiӋn ӣ nhiӅu khía cҥnh khác nhau nhѭ: vӅ sӵ phát triӇn cӫa bӝ rӉ, tính chín sӟm tѭѫng ÿӕi, cNJng nhѭ bҧn chҩt di truyӅn cӫa tӯng giӕng có khҧ năng sӱ dөng nѭӟc tiӃt kiӋm trong quá trình sinh trѭӣng và phát triӇn cӫa cây. &ăn cӭ vào ÿһc ÿLӇm này, ÿұu tѭѫng ÿѭӧc chia thành hai nhóm [18]. - Nhóm chӏu ÿѭӧc sӵ mҩt nѭӟc trong tӯng giai ÿRҥn phát triӇn cӫa cây. - Nhóm chӏu ÿѭӧc sӵ thiӃu nѭӟc trong tҩt cҧ giai ÿRҥn phát triӇn cӫa cây. 15 Ӣ giai ÿRҥn cây con khi gһp hҥn, ÿұu tѭѫng có thӇ dӉ vѭӧt qua hѫn, còn ӣ nhӳng giai ÿRҥn sau nhѭ giai ÿoҥn ra hoa, kӃt quҧ, hҥt chín sӳa mà gһp hҥn thì sӁ dүn ÿӃn năng suҩt giҧm ÿáng kӇ. Trong nhӳng năm gҫn ÿây các nhà khoa hӑc ÿã có nhiӅu thành công khi nghiên cӭu sâu hѫn vӅ tính chӏu hҥn cӫa cây ÿұu tѭѫng. Maitra và Cushman (1994) ÿã phân lұp ÿѭӧc cDNA cӫa dehydrin tӯ lá ÿұu Wѭѫng khi bӏ mҩt nѭӟc, ngoài ra các tác giҧ còn phân lұp ÿѭӧc cDNA cӫa LEA nhóm D - 95 tӯ lá và rӉ cây ÿұu tѭѫng khi bӏ hҥn [36]. Jinn và các tác giҧ khác (1997) nghiên cӭu vӅ sHSP nhóm 1 (15-18 kDa) ÿã nhұn thҩy, chúng tăng lên ӣ lѭӧng lӟn trong mҫm ÿұu tѭѫng dѭӟi tác ÿӝng cӫa nhiӋt ÿӝÿѭӧc tìm thҩy ӣ cҩu trúc dҥng hҥt trong nguyên sinh chҩt và trong nhân cùng vӟi protein bӏ biӃn tính.[35]. 1ăm 2004, nhóm nghiên cӭu gӗm Huang và cs cӫa Trѭӡng Ĉҥi hӑc Tӵ nhiên và Kӻ thuұt Pingtung, Ĉài Loan, ÿã phân lұp ÿѭӧc gen P5CS Ӣÿұu tѭѫng tӯ mARN vӟi kích thѭӟc 2148bp [45]. Gen P5CS là nhân tӕ giӟi hҥn cho nhӏp ÿӝ tәng hӧp proline ӣ thӵc vұt trong ÿLӅu kiӋn bҩt lӧi do hҥn và do mһn gây nên [39]. Nghiên cӭu cӫa Porcel và Cs (2005), ÿã chӍ ra rҵng, gen mã hoá protein dehydrin (LEA-DII) có vai trò vӟi khҧ năng chӕng chӏu cӫa ÿұu tѭѫng. Ӣ ViӋt Nam ÿã có mӝt sӕ công trình nghiên cӭu phân lұp các gen liên quan ÿӃn khҧ năng chӏu nóng, chӏu hҥn cӫa cây ÿұu tѭѫng. Nghiên cӭu phân lұp và ÿӑc trình tӵ gen chaperonin tӯ giӕng ÿұu tѭѫng chӏu Oҥnh Bonminori- Nhұt %ҧn vӟi kích thѭӟc phân tӱ 1,6 kb cӫa Nông Văn +ҧi và cs (1997) [12]. Nghiên cӭu cӫa Trҫn Thӏ Phѭѫng Liên (1999) ÿã phân lұp, xác ÿӏnh trình tӵ gen chaperonin tӃ bào chҩt CCTį tӯ giӕng ÿұu tѭѫng ÿӝt biӃn M103 vӟi kích thѭӟc 1602 bp mã hóa cho 533 axit amin. Trình tӵ gen này có sӵ thay ÿәi axit amin ӣ 3 vӏ trí 99 (Ser ĺ Thr), 280 (Ser ĺ Gly) và 308 ( Ser ĺ Ala), sӵ thay ÿәi này tuân theo quy luұt tăng khҧ năng chӏu nhiӋt. Tác giҧ khҷng ÿӏnh ._.sӵ thay ÿәi này là căn cӭ lý giҧi khҧ năng chӏu nóng cӫa giӕng ÿӝt biӃn M103 [18]. Trҫn Thӏ Phѭѫng Liên và cs (2003), ÿã phân lұp ÿѭӧc gen chaperonin CCTd tӯ giӕng ÿұu tѭѫng ÿӏa phѭѫng chӏu Kҥn Cúc Vàng, gen này gӗm 16 1602 nucleotit mã hóa cho 533 axit amin [17]. NguyӉn Thӏ Thu HiӅn (2005), phân lұp ÿѭӧc gen dehydrin vӟi kích thѭӟc 751bp liên quan ÿӃn khҧ năng chӏu hҥn tӯ hai giӕng ÿұu tѭѫng vàng Mѭӡng Khѭѫng và Cao Bҵng 4 [11]. 1.3. NHҰN XÉT CHUNG 1.3.1. Ĉұu tѭѫng là cây trӗng có giá trӏ kinh tӃ cao, là cây công nghiӋp, cây thӵc phҭm, vӯa là cây cҧi cҧi tҥo ÿҩt. Ĉѭӧc trӗng phә biӃn ӣ nhiӅu quӕc gia trên thӃ giӟi. Ӣ ViӋt Nam, cây ÿұu tѭѫng chiӃm mӝt vӏ trí quan trӑng trong nӅn nông nghiӋp. Trong nhӳng năm gҫn ÿây năng suҩt và sҧn lѭӧng ÿұu tѭѫng tuy có sӵ tăng ÿáng kӇ, nhѭng so vӟi các nѭӟc trên thӃ giӟi năng suҩt cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng ӣ Qѭӟc ta còn ӣ mӭc thҩp. 1.3.2.Trong hҥt ÿұu tѭѫng có các thành phҫn ÿã biӃt tính theo tӹ lӋ protein 30-56%, lipit 12-25%, gluxit 20%; có các muӕi khoáng Ca, Fe, Mg, P, K, Na, S; các vitamin A, B1, B2, D, E, F….Trong ÿó, hàm lѭӧng protein dӵ trӳ và chҩt lѭӧng cӫa chúng là yӃu tӕ quyӃt ÿӏnh làm cho ÿұu tѭѫng trӣ thành nguӗn thӵc phҭm quan trӑng cho ngѭӡi và thӭc ăn cho gia súc. 1.3.3. Ĉұu tѭѫng là loҥi cây có nhu cҫu vӅ nѭӟc cao hѫn các loҥi cây trӗng khác, thuӝc vào nhóm chӏu hҥn kém. Hҥn ÿã ҧnh hѭӣng lӟn ÿӃn quá trình sinh trѭӣng, phát triӇn cӫa cây ÿұu tѭѫng và làm giҧm năng suҩt, chҩt lѭӧng. Nghiên cӭu vӅ tính chӏu hҥn cӫa cây ÿұu tѭѫng ngѭӡi ta thӵc hiӋn theo nhiӅu hѭӟng khác nhau: phân tích hóa sinh trong hҥt nҭy mҫm ÿӇ nghiên cӭu ÿa dҥng enzym Į- amylaza và proteaza hàm Oѭӧng protein tan, thành phҫn axit amin... Ĉi sâu vào nghiên cӭu ӣ mӭc ÿӝ phân tӱ, ÿѭӧc nghiên cӭu nhiӅu nhҩt là các protein sҧn phҭm biӇu hiӋn gen. Nhóm các protein ÿѭӧc ÿһc biӋt quan tâm bao gӗm: protein sӕc nhiӋt, môi giӟi phân tӱ, LEA... 1.3.4. Trên thӃ giӟi ÿã thành công trong viӋc nghiên cӭu gen mã hóa protein ӣÿұu tѭѫng và các trình tӵ gen này ÿã ÿѭӧc công bӕ trên ngân hàng gen thӃ giӟi. Tҥi ViӋt Nam, ÿã có mӝt sӕ tác giҧ nghiên cӭu vӅ tính chӏu hҥn và ÿã phân lұp, giҧi trình tӵ gen liên quan ÿӃn tính chӏu hҥn cӫa cây ÿұu tѭѫng, trong ÿó có chaperonin trên các giӕng ÿұu tѭѫng khác nhau. Tuy nhiên, viӋc nghiên cӭu các giӕng ÿұu Wѭѫng ÿӏa phѭѫng cӫa các tӍnh ӣ khu vӵc Tây Nguyên còn ít ÿѭӧc quan tâm chú ý. 17 Chѭѫng 2 NGUYÊN LIӊU VÀ PHѬѪNG PHÁP NGHIÊN CӬU 2.1. NGUYÊN LIӊU 2.1.1. Nguyên liӋu thӵc vұt Các giӕng ÿұu tѭѫng ÿӏa phѭѫng: Azѭmpa- Gia Lai (AZP), Sa Thҫy - Kon Tum (ST), Chѭmnga-Ĉăk Lăk (CNg) do Trung tâm Tài nguyên Di truyӅn thӵc vұt - ViӋn Khoa hӑc Nông nghiӋp ViӋt Nam cung cҩp. Giӕng ÿӏa phѭѫng Duy Linh- Lâm Ĉӗng (DL) và giӕng ÿӕi chӭng HN9 do Trung tâm KhuyӃn Nông tӍnh Ĉҳk Lҳk cung cҩp. Bҧng 2.1. Nguӗn gӕc cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu TT Tên giӕng Ký hiӋu Nguӗn gӕc 1 Duy Linh DL Giӕng ÿӏa phѭѫng, Duy linh- Lâm Ĉӗng 2 Sa Thҫy ST Giӕng ÿӏa phѭѫng, Sa Thҫy- Kon Tum 3 &ѭmnga CNg Giӕng ÿӏa phѭѫng, Chѭmnga-Ĉҳk Lҳk 4 HN9 HN9 Giӕng ÿҥi trà ÿѭӧc trӗng phә biӃn ӣ huyӋn Buôn Ĉôn- Ĉҳk lҳk 5 Azѭmpa AZP Giӕng ÿӏa phѭѫng, Azѭmpa- Gia Lai 2.1.2. Hóa chҩt, thiӃt bӏ và ÿӏa ÿLӇm nghiên cӭu Hóa chҩt: dùng cho các thí nghiӋm phân tích hoá sinh và sinh hӑc hӑc phân tӱ: gӗm các loҥi hoá chҩt mua cӫa các hãng Anh, Ĉӭc, Mӻ, Trung Quӕc: EDTA, CTAB, TAE, Agarose… Các hóa chҩt thông dөng khác: axit citric, NaOH, NaCl, CH3COONa, ethanol (70%, 100%), tris HCl 1M, chloroform, isoamyl alcohol, isopropanol, nѭӟc khӱ ion, NaH2PO4, Fe2( SO4), K3Fe( CN)6, CuSO4, ninhydrin… ThiӃt bӏ: Các thiӃt bӏ chính ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ phân tích hoá sinh và sinh hӑc phân tӱ gӗm: - Máy quang phә UV-Vis Cintra 40 (Australia) - Máy ÿiӋn di + bӝ nguӗn PowerPac 300 (Bio-Rad, Mӻ) 18 - Máy phân tích axit amin tӵ ÿӝng - HP amino Quan SeriesII (Hewlett Parkard, Mӻ) - Máy phân tích trình tӵ gen ABI 3100 Genetic Analyzer (Mӻ) - BӇәn nhiӋt (Techne, OSI, Anh) - Pipetman các loҥi (Gilson, Pháp) - Tӫ sҩy (Anh) - Cân ÿiӋn tӱ (Thuӷ Sӻ) - Tӫ lҥnh sâu – 850C (Sanyo, Nhұt Bҧn) - Nӗi khӱ trùng (Tomy- Nhұt) - Máy PCR (ABI System, Mӻ) - Máy soi ADN (Bio-Rad, Mӻ) - Máy li tâm lҥnh (Ĉӭc) - Máy khuҩy trӝn Voltex (Ĉӭc) - Máy ÿo pH (Metter Toledo, Thөy Sӻ) Ĉӏa ÿLӇm nghiên cӭu: Các thí nghiӋm ÿѭӧc thӵc hiӋn tҥi Phòng thí nghiӋm Di truyӅn hӑc và Công nghӋ gen, Khoa Sinh- KTNN, Trѭӡng Ĉҥi hӑc Sѭ phҥm - Ĉҥi hӑc Thái Nguyên. Các phân tích axit amin tӵÿӝng và xác ÿӏnh trình tӵ gen ÿѭӧc thӵc hiӋn tҥi Phòng thí nghiӋm trӑng ÿLӇm Công nghӋ gen, ViӋn Công nghӋ sinh hӑc, ViӋn Khoa hӑc và Công nghӋ Viêt Nam. 2.2. PHѬѪNG PHÁP NGHIÊN CӬU 2.2.1..Phѭѫng pháp hoá sinh 2.2.1.1. Phân tích hóa sinh ͧ giai ÿR̩n h̩t ti͉m sinh (1) Xác ÿ͓nh hàm l˱ͫng lipit Dӵa vào tính chҩt hoà tan cӫa lipit trong dung môi hӳu cѫÿӇ chiӃt rút, dung môi hӳu cѫÿѭӧc sӱ dөng là petroleum ether [24]. Mүu ÿem sҩy khô, bóc vӓ, nghiӅn mӏn. Cân 0,05g mүu cho vào mӛi ӕng Eppendorf (3 ӕng Eppendorf / mүu). TiӃp theo, cho 1,5ml petroleum ether vào mӛi ӕng, lҳc ÿҧo ÿӅu, ÿӇ ngăn lҥnh 4oC trong 24 giӡ, ÿem ly tâm 12000 vòng/phút trong 20 phút, bӓ dӏch, lһp lҥi thí nghiӋm 3 lҫn. Sau ÿó, sҩy khô mүu còn lҥi trong epp ӣ 700C ÿӃn khi khӕi lѭӧng không ÿәi rӗi cân mүu. Hàm lѭӧng lipit ÿѭӧc tính theo công thӭc: 19 Hàm lѭӧng lipit = (%)A B A - Trong ÿó: A: Khӕi lѭӧng mүu ban ÿҫu B: Khӕi lѭӧng mүu sau khi loҥi lipit (2) Xác ÿ͓nh hàm l˱ͫng protein Protein tan tәng sӕ xác ÿӏnh theo phѭѫng pháp Lowry ÿѭӧc mô tҧ trong tài liӋu cӫa Phҥm Thӏ Trân Châu và cs (1998) [3]. Cân 0,05g mүu ÿã nghiӅn nhӓ, sҩy khô cho vào ӕng Eppendorf, mӛi mүu lһp lҥi 3 lҫn. Cho vào mӛi ӕng 1,5ml dung dӏch ÿӋm photphat citrat ( pH=10 ), ÿҧo ÿӅu bҵng máy voltex, ÿӇ trong tӫ lҥnh 4oC qua ÿêm, ÿem ly tâm thu dӏch ӣ 12000 vòng/phút trong 20 phút rӗi thu lҩy dӏch. Thí nghiӋm ÿѭӧc lһp lҥi 3 lҫn . Dӏch chiӃt ÿѭӧc ÿӏnh mӭc lên 5ml và ÿo hҩp thө quang phә trên máy quang phә UV ӣ bѭӟc sóng 750 nm vӟi thuӕc thӱ Folin. Hàm lѭӧng protein ÿѭӧc tính theo công thӭc : X % = m AxHSPL x 100% Trong ÿó : X : hàm lѭӧng protein (% khӕi lѭӧng khô) A : nӗng ÿӝ thu ÿѭӧc khi ÿo trên máy (mg /ml ) HSPL: hӋ sӕ pha loãng m: khӕi lѭӧng mүu (mg) (3) Xác ÿ͓nh hàm l˱ͫng và thành ph̯n axit amin trong h̩t Hàm lѭӧng axit amin ÿѭӧc xác ÿӏnh trên máy HP - Amino Quant sӱ dөng ortho-phtalADNehyt tҥo dүn xuҩt ÿӕi vӟi các axit amin bұc 1 và 9 - fluoreryl - metyl - cloroformat ÿӕi vӟi các axit amin bұc 2. Mүu ÿѭӧc xӱ lý theo phѭѫng pháp thuӹ phân pha lӓng theo hѭӟng dүn sӱ dөng máy phân tích axit amin tӵÿӝng. 2.2.1.2 Ĉánh giá khҧ năng chӏu hҥn thông qua phân tích mӝt sӕ chӍ tiêu hóa sinh ӣ giai ÿRҥn hҥt nҭy mҫm (1) Chu̱n b͓ m̳u Hҥt các giӕng ÿұu tѭѫng ÿѭӧc ngâm trong nѭӟc 1h, sau ÿó ÿѭӧc ӫ ҭm bҵng dung dӏch MS pha loãng 10 lҫn chӭa sorbitol 7%. Hҥt nҧy mҫm sau các 20 thӡi gian ӫ 1 ngày, 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày, 9 ngày ÿѭӧc lҩy ÿӇ xác ÿӏnh hoҥt ÿӝ cӫ proteaza và hàm lѭӧng protein tan. Ĉӕi chӭng là hҥt ÿұu tѭѫng ÿѭӧc ӫ bҵng Qѭӟc không chӭa sorbitol. (2) Xác ÿ͓nh ho̩t ÿ͡ cͯa proteaza Hoҥt ÿӝ enzym proteaza xác ÿӏnh theo phѭѫng pháp Anson cҧi tiӃn theo mô tҧ cӫa NguyӉn Văn Mùi ( 2001) [27]. Hҥt nҧy mҫm bóc vӓ lөa, cân khӕi lѭӧng, nghiӅn nhӓ, chiӃt bҵng ÿӋm phosphat pH= 6,5 li tâm 12000 vòng/phút ӣ 4oc, dӏch thu ÿѭӧc sӱ dөng làm thí nghiӋm. Thí nghiӋm ÿѭӧc tiӃn hành trên ӕng thí nghiӋm, ӕng kiӇm tra, ÿo trên máy quang phәӣ bѭӟc sóng 750 nm. Hoҥt ÿӝ enzym proteaza ÿѭӧc tính dӵa trên ÿӗ thӏ ÿѭӡng chuҭn xây dӵng bҵng tyrosin, và ÿѭӧc tính theo công thӭc: ĈVHĈ/mg = ( )n k D HSPL T m - ´ ´ ´ Trong ÿó: n: sӕÿo trên máy ӕng thí nghiӋm (mg/ml) HSPL: hӋ sӕ pha loãng k: sӕÿo trên máy ӕng kiӇm tra (mg/ml) m: khӕi lѭӧng mүu (mg) D: sӕ ml dӏch chiӃt T: thӡi gian ӫ enzym vӟi cѫ chҩt (3) Ĉ͓nh l˱ͫng hàm l˱ͫng protein tan Hàm lѭӧng protein tan ÿѭӧc xác ÿӏnh theo phѭѫng pháp Lowry ÿѭӧc mô tҧ trong tài liӋu cӫa Phҥm Thӏ Trân Châu và cs (1998) [3]. 2.2.2. Ĉánh gía khҧ năng chӏu hҥn ӣ giai ÿRҥn cây non bҵng phѭѫng pháp gây hҥn nhân tҥo Phѭѫng pháp ÿánh giá nhanh khҧ năng chӏu hҥn ӣ giai ÿRҥn cây non ÿѭӧc tiӃn hành theo Lê Trҫn Bình và cs (1998) [2]. 21 Hҥt ÿұu tѭѫng nҧy mҫm gieo vào chұu (kích thѭӟc 30cm x 30cm) chӭa cát vàng ÿã rӱa sҥch, mӛi chұu trӗng 30 cây, mӛi giӕng trӗng 4 chұu. Thí nghiӋm ÿѭӧc lһp lҥi 3 lҫn trong ÿiӅu kiӋn và chӃÿӝ chăm sóc nhѭ nhau. Thӡi gian ÿҫu tѭӟi nѭӟc cho ÿӫҭm, khi cây ÿұu tѭѫng ÿѭӧc 3 lá tiӃn hành gây hҥn nhân tҥo và ÿánh giá khҧ Qăng chӏu hҥn cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng bҵng cách xác ÿӏnh tӹ lӋ thiӋt hҥi và chӍ sӕ chӏu hҥn tѭѫng ÿӕi. (1) Xác ÿ͓nh tͽ l͏ cây s͙ng sót (%) Sӕ cây sӕng Tӹ lӋ cây sӕng sót = Tәng sӕ cây xӱ lý (%) (2) Xác ÿ͓nh kh̫ năng giͷ n˱ͣc qua các giai ÿR̩n x͵ lý bͧi h̩n theo công thͱc ( % )f t f c W W W = Trong ÿó: W(%): Khҧ năng giӳ nѭӟc cӫa cây sau khi xӱ lý bӣi hҥn Wft(g): Khӕi lѭӧng tѭѫi cӫa cây sau khi xӱ lý bӣi hҥn (g) Wfc(g): Khӕi lѭӧng tѭѫi cӫa cây không xӱ lý (g) (3) Xác ÿ͓nh tͽ l͏ thi͏t h̩i do h̩n gây ra ÿ˱ͫc tính theo công thͱc ( ) (%)o N b a NC = å Trong ÿó: a: Tӹ lӋ thiӋt hҥi do hҥn gây ra (%); b: Trӏ sӕ thiӋt hҥi cӫa mӛi cҩp; c: Trӏ sӕ thiӋt hҥi cӫa cҩp cao nhҩt; No: Sӕ cây cӫa mӛi cҩp thiӋt hҥi; N: Tәng sӕ cây xӱ lý Các trӏ sӕ: Sӕ cây chӃt: Trӏ sӕ 3 22 Sӕ cây héo: Trӏ sӕ 1 Sӕ cây không bӏҧnh hѭӣng: Trӏ sӕ 0. (4) Xác ÿ͓nh ch͑ s͙ ch͓u h̩n t˱˯ng ÿ͙i ÿ˱ͫc d͹a trên 15 ch͑ tiêu phân tích và ÿ˱ͫc tính theo công thͱc 1 sin ( ... ) 2 = + + + +S ab bc cd paa Trong ÿó: S: ChӍ sӕ chӏu hҥn tѭѫng ÿӕi a, b, c, … : Các chӍ tiêu theo dõi Į: Góc tҥo bӣi 2 trөc mang trӏ sӕ liӅn nhau Į = 3600/15 15: Sӕ chӍ tiêu theo dõi (5) Xác ÿ͓nh m͡t s͙ ch͑ tiêu khác ch͓u tác ÿ͡ng cͯa h̩n - Khӕi lѭӧng tѭѫi cӫa rӉ và thân lá: Cҳt riêng rӉ và thân lá, dùng giҩy thҩm khô, rӗi cân trӑng lѭӧng tѭѫi trên cân phân tích. - Xác ÿӏnh khӕi lѭӧng khô cӫa rӉ và thân lá: Các mүu ÿѭӧc sҩy trong tӫ sҩy ӣ nhiӋt ÿӝ 1000C rӗi xác ÿӏnh khӕi lѭӧng khô tuyӋt ÿӕi. - Xác ÿӏnh tӍ sӕ chӏu hҥn T = Wr/Wtl Trong ÿó : T: TӍ sӕ khӕi lѭӧng cӫa rӉ/ thân lá khô Wr: Khӕi lѭӧng khô cӫa rӉ (mg) Wtl: Khӕi lѭӧng khô cӫa thân lá (mg) (6) Xác ÿ͓nh hàm l˱ͫng prolin theo Bastes (1973) [33]. Tách chi͇t prolin: NghiӅn 0,5 gram thân lá cây ÿұu tѭѫng ÿã xӱ lý hҥn ӣ ngѭӥng trѭӟc hҥn, hҥn 3 ngày, 5 ngày, 7 ngày trong cӕi chày xӭ, thêm 10ml dung dӏch axit sunfosalisilic 3 %, li tâm 8000 vòng /phút trong 30 phút.Thu dӏch làm thí nghiӋm. Ĉo hҩp thө quang phәӣ bѭӟc sóng 520 nm. Hàm lѭӧng prolin ÿѭӧc tính theo công thӭc: X % = m AxHSPL x 100% 23 Trong ÿó: X : Hàm lѭӧng prolin (%) A : Nӗng ÿӝ thu ÿѭӧc khi ÿo trên máy (mg /ml) HSPL: HӋ sӕ pha loãng m: Khӕi lѭӧng mүu (mg) 2.2.3. Xӱ lý kӃt quҧ và tính toán sӕ liӋu Mӛi thí nghiӋm ÿѭӧc nhҳc lҥi 3 lҫn. Sӱ dөng toán thӕng kê ÿӇ xác ÿӏnh trӏ sӕ thӕng kê nhѭ trung bình mүu )(x , phѭѫng sai (s2), và sai sӕ trung bình mүu )( xS , hӋ sӕ tѭѫng quan R… theo tài liӋu cӫa Chu Văn Mүn và cs (2001) [22]. Các sӕ liӋu ÿѭӧc xӱ lý trên máy vi tính bҵng chѭѫng trình Excel vӟi mӭc ý nghƭa a = 0,05 [32]. Xác ÿӏnh khoҧng cách và thiӃt lұp mӕi quan hӋ giӳa các giӕng ÿұu tѭѫng bҵng chѭѫng trình NTSYS pc 2.02i. 2.2.4. Phѭѫng pháp sinh hӑc phân tӱ 2.2.4.1. Ph˱˯ng pháp tách chi͇t ADN t͝ng s͙ tͳ m̯m ÿ̵u t˱˯ng Quy trình tách chiӃt và làm sҥch ADN tәng sӕ tӯ mҫmÿұu tѭѫng ÿѭӧc thӵc hiӋn theo phѭѫng pháp cӫa Gawel và CS (1991) [34]. Mҫm ÿұu tѭѫng ÿѭӧc 3 ngày tuәi tách lҩy phҫn thân mҫm rӗi ÿem bao quҧn ӣ tӫ lҥnh sâu (-850C). Quy trình tách chiӃt ADN tәng sӕÿѭӧc thӵc hiӋn theo các bѭӟc sau: - Lҩy khoҧng 200g mҫm ÿұu tѭѫng ÿã ÿӇ lҥnh ӣ -850C ӣ nghiӅn nhanh trong cӕi và chày xӭ (cӕi chày ÿã ÿѭӧc vô trùng và ÿӇ trong tӫ -850C). - Bә sung 0,8ml ÿӋm rӱa, li tâm 15 phút, 12000 vòng/ phút, loҥi bӓ dӏch nәi. %ѭӟc này làm 2 lҫn. - Thêm 700µl ÿӋm tách, mix nhҽ, ӫ 650C trong 2h, sau ÿó lҩy ra ÿӇӣ nhiӋt ÿӝ phòng 5 phút. - Thêm 600µl cloroform:isoamyl alcohol ( 24:1 ), trӝn ÿӅu 20 phút - Li tâm 15 phút, 12000 vòng/phút. Hút cҭn thұn 500µl dӏch trong sang ӕng eppendorf 1,5 ml mӟi ( bӓ tӫa). 24 - Thêm 600µl isopropanol, lҳc nhҽ, ÿһt lên ÿá (ÿӇ tӫ lҥnh qua ÿêm), chӡ có dӏch tӫa trҳng. - Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, bӓ dӏch, úp xuӕng giҩy cho khô. - Bә sung 300µl cӗn 70%, búng nhҽ. Li tâm 5 phút, 13000 vòng/ phút, loҥi bӓ cӗn (thӵc hiӋn 2 lҫn). - Làm khô ADN trong box bұt quҥt. - Hòa tan ADN trong 50 µl nѭӟc khӱ ion. 2.2.4.2. Ph˱˯ng pháp ÿi͏n di ADN trên gel agarose Tҥo bҧn gel agarose vӟi nӗng ÿӝ thích hӧp. Dung dӏch ÿӋm dùng cho ÿiӋn di là TAE 1X. Tra mүu và chҥy ÿLӋn di vӟi hiӋu ÿLӋn thӃ là 80V -100V, sau ÿó ADN ÿѭӧc nhuӝm bҵng ethidium bromide, soi dѭӟi ÿèn UV và chөp ҧnh. 2.2.4.3. Ph˱˯ng pháp nhân b̫n ÿR̩n ADN thu͡c gen mã hóa cho chaperonin Ĉoҥn gen ADN ÿһc hiӋu thuӝc gen chaperonin cӫa ÿұu tѭѫng ÿѭӧc nhân bҧn bҵng kӻ thuұt PCR vӟi cһp mӗi MC1 và MC2 do hãng Invitrogen cung cҩp MC1: 5’- GCC ATA TGT CGG CAA TCG CGG CCC C MC2: 5’- CGG GAT CCC TAC CTC ACA GTT ACA GTT ACA ATATCA TC Bҧng 2.2. Thành phҫn phҧn ӭng cӫa PCR Thành phҫn phҧn ӭng Nӗng ÿӝ /ѭӧng (µl) 1ѭӟc khӱ ion vô trùng 17,1 Dung dӏch ÿӋm cho Tap- plymerase 10 lҫn 2,5 DNTP 10mM 2 MC1 10pmol/µl 1 MC2 10pmol/µl 1 Khuôn ADN 100ng/µl 1 Tap- polymerase 5U/µl 0,4 Tәng thӇ tích 25µl Chu kǤ nhiӋt cӫa phҧn ӭng PCR ÿѭӧc tiӃn hành theo chѭѫng trình 94oC: 3 phút: (94oC: 1 phút, 55oC: 50 giây, 72oC: 1phút 30 giây) lһp lҥi 30 chu kǤ: 72oC: 8 phút, 4oC: vô cùng. Sҧn phҭm PCR ÿѭӧc kiӇm tra bҵng ÿLӋn di trên gel agaroza (nhѭ mô tҧӣ trên). 25 2.2.4.4. Ph˱˯ng pháp tách dòng ÿo̩n gen chaperonin Tách dòng gen chaperonin ÿѭӧc tiӃn hành bҵng cách gҳn trӵc tiӃp Vҧn phҭm PCR vào vetѫ tách dòng Pjet 1.2 (Hãng Fermentas). Phҧn ӭng gҳn có thành phҫn nhѭ sau: H2O : 3,5ml Dung dich ÿӋm cho T4 ligaza : 1ml Sҧn phҭm PCR: 3ml Vetѫ Pjet 1.2 : 1,5ml T4 Ligaza : 1ml Tәng thӇ tích :10ml Quá trình gҳn ÿѭӧc tiӃn hành 12 tiӃng ӣ nhiӋt ÿӝ 140C. Sau khi gҳn Vҧn phҭm ÿѭӧc biӃn nҥp vào E. Coli DH5a. Các khuҭn Oҥc E.coli chӭa vectѫ tái tә hӧp mang Vҧn phҭm PCR ÿѭӧc chӑn lӑc trên môi trѭӡng LB chӭa ampixilin, IPTG và Xgal. 2.2.4.5. Ph˱˯ng pháp bi͇n n̩p ADN plasmit vào t͇ bào E. coli chͯng DH5a - Lҩy tӃ bào khҧ biӃn DH5a trong Wӫ lҥnh – 750 C ÿӇ trên ÿá 30 phút. - Trӝn 4ml dung Gӏch phҧn ӭng gҳn (ligate) vào ӕng tӃ bào khҧ biӃn, sau ÿó ÿӇ trên ÿá 30 phút. - Sӕc nhiӋt ӣ 420C, thӡi gian 1 phút 30 giây, sau ÿó ÿӇ trên ÿá 2 phút. - Bә sung 300 ml môi trѭӡng LB Oӓng, sau ÿó nuôi lҳc tӕc ÿӝ 200 v/p 370C trong 1 giӡ. - Cҩy trҧi toàn bӝ dӏch tӃ bào ÿã biӃn nҥp trên mӝt ÿƭa môi trѭӡng LB ÿһc chӭa ampixilin (100mg/ml), Xgal và IPTG. - Giӳ ÿƭa cҩy vi khuҭn trong Wӫҩm 370C qua ÿêm 2.2.4.6. Ph˱˯ng pháp tách chi͇t ADN plasmit tͳ vi khu̱n - Lҩy mӝt khuҭn Oҥc E. Coli chӭa plasmit cҩy vào 2ml môi trѭӡng LB Oӓng cӝng vӟi chҩt kháng sinh ampixilin (nӗng ÿӝ 100mg/ml). Lҳc qua ÿêm ӣ nhiӋt ÿӝ 370C, 200 vòng/ phút. - Lҩy 1,5 ml Gӏch nuôi cҩy vào ӕng eppendorf. Li tâm 5000 vòng/ phút trong 10 phútÿӇ thu cһn tӃ bào. - Bә sung 150 ml dung Gӏch I, trӝn ÿӅu bҵng máy voltex. 26 - Bә sung 150ml dung Gӏch II, ÿҧo nhҽ bҵng tay khoҧng 3 lҫn. - TiӃp Wөc bә sung 150ml dung Gӏch III, ÿҧo nhҽ bҵng tay khoҧng 3 lҫn. - Thêm 400ml chlorofom: isoamyl alcohol (24:1) ÿҧo nhҽ - Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 15 phút. - Dùng pipet hút 400ml Natri axetat 3M, pH 5.2 và 1ml cӗn 100%. ĈӇ ADN- plasmit tӫa – 200C ít nhҩt 2 giӡ. - Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút, loҥi Eӓ dӏch nәi thu cһn ADN- plasmit. - Rӱa cһn ADN- plasmit 1 lҫn bҵng 600ml cӗn 70%. - Ly tâm 13.000 vòng/ phút trong 10 phút, thu cһn Làm khô cһn ADN – plasmit trong box cҩy. - Hòa cһn ADN- plasmit trong 40 ml TE có ARNaza ( nӗng ÿӝ 100ml/ml). -Ӫӣ bӇәn nhiӋt 370C trong 1 giӡÿӇ loҥi ARN. -ĈiӋn di trên gel azaroza 1% ÿӇ kiӇm tra 2.2.4.7. Ph˱˯ng pháp xác ÿ͓nh trình t͹ gen b̹ng thi͇t b͓ t͹ÿ͡ng Xác ÿӏnh trình tӵ ADN theo phѭѫng pháp thông Gөng nhҩt ÿó là xác ÿӏnh trӵc tiӃp thông qua phҧn ӭng kӃt thúc ÿҫu cuӕi- phѭѫng pháp enzym Fӫa Sanger [41]. Vӟi cácÿRҥn mӗi có gҳn huǤnh quang và bӝ hóa chҩt chuҭn (kit) ÿӇ nhân trình tӵ gen bҵng PCR vӟi Tap ADN polymeraza. Chu trình nhiӋt: 950C 36 giây, 500C 36 giây, 720C 84 giây, kӃt thúc ӣ 40C. Sau ÿó sҧn phҭm nhân gen có gҳn huǤnh quang ÿѭӧc biӃn tính bҵng nhiӋt và phân tích trên máy xác ÿӏnh trình tӵ ADN tӵÿӝng ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analizer. Sӕ liӋu nhұn ÿѭӧc xӱ lý trên máy vi tính bҵng phҫn mӅm Clustalx. 27 Chѭѫng 3 .ӂT QUҦ VÀ THҦO LUҰN 3.1. ĈÁNH GIÁ CHҨT LѬӦNG HҤT CӪA 5 GIӔNG ĈҰU TѬѪNG NGHIÊN CӬU 3.1.1. Ĉһc ÿLӇm hình thái, kích thѭӟc và khӕi lѭӧng hҥt 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu KӃt quҧ phân tích ÿһc ÿLӇm hình thái, kích thѭӟc và khӕi lѭӧng 1000 hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng ÿӏa phѭѫng: Duy Linh- Lâm Ĉӗng (DL), Sa Thҫy - Kon Tum (ST), Chѭmnga-Ĉăk Lăk (CNg), Azѭmpa- Gia Lai (AZP), và giӕng ÿӕi chӭng HN9 ÿѭӧc trình bày trên bҧng 3.1. Bҧng 3.1 cho thҩy hҫu hӃt các giӕng ÿұu tѭѫng ÿӅu có hình tròn, màu hҥt có màu vàng và vàng nhҥt. Màu sҳc rӕn hҥt có màu nâu, nâu nhҥt và ÿen, ÿây là mӝt ÿһc tính quan trӑng trong viӋc giám ÿӏnh giӕng. Riêng giӕng Duy Linh -Lâm Ĉӗng có hình thái rҩt khác biӋt so vӟi các giӕng khác, ÿһc ÿLӇm chính cӫa giӕng này: hҥt dài dҽt lõm ӣ giӳa, màu hҥt trҳng xanh, rӕn màu nâu nhҥt. Bҧng 3.1. Màu sҳc, hình dҥng, kích thѭӟc và khӕi lѭӧng hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu Kích thѭӟc Giӕng Màu vӓ hҥt Màu rӕn hҥt Hình dҥng hҥt R͡ng (mn) Dài (mn) Khӕi lѭӧng 1000 hҥt (g) DL Vàng xanh Nâu Dài dҽt 0,49±0,025 0,70 ±0,03 65,26 ± 0,34 ST Vàng nhҥt Nâu nhҥt Tròn 0,65± 0,01 0,78 ±0,02 135,86 ± 1,45 CMG Vàng nhҥt Ĉen Tròn 0,70±0,032 0,76 ±0,01 119,95 ± 0,13 NH9 Vàng Nâu Tròn 0,76 ±0,03 0,79 ±0,01 145,34 ± 0,04 AZP Vàng nhҥt Nâu nhҥt Tròn 0,62 ±0,01 0,73 ±0,02 118,36 ± 1,55 28 Hình 3.1. Hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng DL : 2- ST : 3- CNg : 4 - NH9 : 5- AZP KӃt quҧ phân tích cho thҩy khӕi lѭӧng 1000 hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng dao ÿӝng tӯ 65,26 (g) ± 0,34 ÿӃn 145,34 (g) ± 0,04 , trong ÿó giӕng NH9 có khӕi lѭӧng 1000 hҥt cao nhҩt 145,34±0,04 (g). Có thӇ xӃp khӕi lѭӧng hҥt cӫa các giӕng ÿұu Wѭѫng theo thӭ tӵ tӯ cao ÿӃn thҩp nhѭ sau: HN9 >ST >CNg >AZP >DL. 3.1.2. Hàm lѭӧng protein và lipit trong hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu Hҥt ÿұu tѭѫng gӗm có lipit, protein, hydratcacbon và các chҩt khoáng. Trong ÿó protein và lipit là hai thành phҫn quan trӑng ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ ÿánh giá chҩt Oѭӧng hҥt trên phѭѫng diӋn hóa sinh. KӃt quҧ phân tích hàm lѭӧng lipit và protein cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng ÿѭӧc trình bày trong bҧng 3. 2. Trên phѭѫng diӋn hóa sinh, chҩt lѭӧng hҥt cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng ÿѭӧc xác ÿӏnh dӵa vào kӃt quҧ phân tích hàm lѭӧng protein, lipit và thành phҫn axit amin trong protein cӫa hҥt. Bҧng 3.2 cho thҩy hàm lѭӧng protein và lipit cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu khá chênh lӋch nhau, hàm lѭӧng protein dao ÿӝng trong khoҧng tӯ 33,12% ÿӃn 38,35%, kӃt quҧ này phù hӧp vӟi các tài liӋu ÿã công bӕ [18], [24], [31]. Trong ÿó DL và AZP là 2 giӕng có hàm lѭӧng protein cao nhҩt (38,35% và 37,87%), giӕng NH9 có hàm lѭӧng protein thҩp nhҩt (33,12%). Hàm lѭӧng protein cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng ÿѭӧc sҳp xӃp theo thӭ tӵ tăng dҫn là: NH9< ST< CNg< AZP< DL. 29 Lipit là mӝt trong nhӳng chӍ tiêu quan trӑng ÿӇÿánh giá chҩt lѭӧng hҥt. Tӯ kӃt quҧ phân tích ӣ bҧng 3.2 cho thҩy hàm lѭӧng lipit cӫa các giӕng nghiên cӭu dao ÿӝng trong khoҧng tӯ 12,26% ÿӃn 18,33%. NH9 là giӕng có hàm lѭӧng lipit cao nhҩt (18,33%), giӕng DL có hàm lѭӧng lipit thҩp nhҩt (12,26%), kӃt quҧ nghiên cӭu chúng tôi cho thҩy rҵng các giӕng ÿұu tѭѫng ÿӏa phѭѫng có hàm lѭӧng lipit không cao. Hàm lѭӧng lipit cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng ÿѭӧc sҳp xӃp theo thӭ tӵ tăng dҫn: DL< AZP< CNg< ST < NH9. Trong 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu, giӕng DL có hàm lѭӧng protein cao nhҩt (38,35%), nhѭng hàm lѭӧng lipit lҥi thҩp nhҩt (12,26 %). Giӕng NH9 có hàm Oѭӧng protein thҩp (33,12%) nhѭng hàm lѭӧng lipit lҥi cao (18,33%). Nhѭ vұy hàm Oѭӧng protein và lipit trong hҥt ÿұu tѭѫng có mӕi tѭѫng quan nghӏch [18], [25]. Bҧng 3.2. Hàm lѭӧng protein và lipit cӫa hҥt 5 giӕng ÿұu tѭѫng (%TL khô Giӕng Hàm lѭӧng protein Hàm lѭӧng lipit DL 38,35± 0,013 12,26± 0,013 ST 37,68± 0,018 16,37± 0,036 CNg 34,98± 0,032 14,67± 0,032 NH9 33,12± 0,020 18,33± 0,014 AZP 37,87± 0,013 12,53± 0,014 Trong các cây hӑ ÿұu, thì hҥt ÿұu tѭѫng có hàm lѭӧng protein cao nhҩt, protein tәng sӕ trong hҥt ÿұu tѭѫng chӫ yӃu là protein dӵ trӳ, tuy nhiên trong tӃ bào vүn có nhӳng ÿRҥn polypeptit mӟi ÿѭӧc tәng hӧp, nhӳng enzym nhѭ proteaza, amylaza….Các enzym này tham gia vào quá trình chuyӇn hóa các chҩt nhѭ : protein dӵ trӳ trong hҥt, tinh bӝt…cùng vӟi peptit là nhӳng yӃu tӕ tham gia vào quá trình thҭm thҩu cӫa hҥt trong giai ÿRҥn nҧy mҫm [18]. Vì vұy, phân tích hàm lѭӧng protein và lipit trong hҥt là mӝt trong nhӳng chӍ tiêu cho phép xác ÿӏnh mӭc ÿӝ chӕng chӏu cӫa giӕng trên phѭѫng diӋn hóa sinh. 30 3.1.3. Thành phҫn axit amin trong protein hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng Chҩt lѭӧng cӫa hҥt ÿұu tѭѫng không nhӳng phө thuӝc vào hàm lѭӧng protein mà còn phө thuӝc vào thành phҫn axit amin trong protein hҥt. Bҵng cách sӱ dөng phѭѫng pháp phân tích hàm lѭӧng axit amin trong hҥt trên hӋ máy HP- Amino Quant và dӵa vào sҳc ký ÿӗ, chúng tôi ÿã xác ÿӏnh ÿѭӧc hàm lѭӧng axit amin trong protein hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng. Hình 3.2. Sҳc ký ÿӗ axit amin cӫa bӝt giӕng ÿұu tѭѫng DL Hình 3.3. Sҳc ký ÿӗ axit amin cӫa bӝt giӕng ÿұu tѭѫng ST 31 KӃt quҧ phân tích thành phҫn và hàm lѭӧng axit amin trong protein hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng, chúng tôi thu ÿѭӧc 17 axit amin (3 axit amin còn lҥi, bình thѭӡng không phân tích ÿѭӧc trên máy tӵÿӝng), trong ÿó hàm lѭӧng cystein và cystin ÿѭӧc tính chung, kӃt quҧÿѭӧc trình bày ӣ bҧng 3.3. Quá trình thӫy phân các mүu nghiên cӭu trong HCl sӁ làm tryptophan bӏ phân hӫy hoàn toàn, còn glutamin và asparagin chuyӇn hóa thành axit glutamic và axit aspartic. Bҧng 3.3. Hàm lѭӧng axit amin trong hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng (g aa/100g protein) Axit amin DL ST CNg %Ĉ AZP A. Aspartic 10.31 10.43 10.66 10.90 11.03 A.Glutamic 16.76 14.74 16.83 15.10 14.54 Serin 4.85 5.06 4.67 4.98 4.88 Histidin 3.29 3.38 3.17 3.55 3.46 Glycin 4.87 5.06 4.84 4.95 5.04 Treonin 4.12 4.33 4.09 4.39 4.28 Alanin 4.39 4.56 4.37 4.67 4.57 Arginin 7.23 7.48 7.07 7.13 7.42 Tyrozin 3.21 3.40 3.17 3.42 3.43 Cystein +Cystin 0.62 0.60 0.64 0.78 0.58 Valin 4.93 4.84 4.87 4.95 4.91 Metionin 0.96 0.91 1.03 0.93 0.87 Phenylalanin 5.52 6.02 5.65 5.82 5.81 Isoleucin 4.50 4.56 4.42 4.70 4.57 Leucin 7.58 7.96 7.65 7.91 7.86 Lysin 11.86 11.26 11.30 11.43 11.69 Prolin 4.98 5.42 5.56 4.39 5.07 32 Hình 3.4. Sҳc ký ÿӗ axit amin cӫa bӝt giӕng ÿұu tѭѫng CNg Hình 3.5. Sҳc ký ÿӗ axit amin cӫa bӝt giӕng ÿұu tѭѫng HN9 Bҧng 3.3 cho thҩy hàm lѭӧng axit amin có chӭa nhóm SH ÿӅu thҩp: metionin tӯ (0,87g ÿӃn 1,03g/100g protein) còn cystein và cystin tӯ (0,58g ÿӃn 0,78g/100gprotein). Giӕng CNg có hàm lѭӧng metionin cao nhҩt (1,03g/100g protein), thҩp nhҩt là giӕng AZP (0,87g/ 100g protein). Trong 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu hàm lѭӧng axit amin tәng sӕ chênh lӋch nhau không ÿáng kӇ, nhѭng hàm lѭӧng mӛi loҥi axit amin ӣ tӯng giӕng lҥi có sӵ khác nhau. 33 Ĉұu tѭѫng ÿѭӧc coi là loҥi ÿұu chӭa proterin có phҭm chҩt tӕt nhҩt trong sӕ các loҥi protein thӵc vұt. Các axit amin không thay thӃ (treonin, valin, metionin, phenylalanin, isoleuxin, leucin, lysin) ÿӅu có trong thành phҫn axit amin ÿѭӧc nghiên cӭu. Hàm lѭӧng prolin cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng trong khoҧng (4,39g ÿӃn 5,42g/100g, trong ÿó CNg có hàm lѭӧng này cao nhҩt (5.56g/100gprotein), thҩp nhҩt là giӕng NH9 (4,39g/100g protein). Hàm lѭӧng lysin trong khoҧng tӯ (11.30g ÿӃn 11,86 g/100g protein), cao hѫn so vӟi các loҥi ngNJ cӕc, trong ÿó giӕng DL và AZP là 2 giӕng có khҧ năng chӏu hҥn có hàm lѭӧng lysin cao nhҩt (11,86g- 11,69g/1000g protein). ĈiӅu này làm tăng giá trӏ cӫa ÿұu tѭѫng vӅ mһt dinh dѭӥng vì lysin vӕn là axit amin giӟi hҥn trong gҥo và các loҥi ngNJ cӕc khác [18]. Hình 3.6.Sҳc ký ÿӗ axit amin cӫa bӝt giӕng ÿұu tѭѫng AZP 3.1.4. Nhұn xét vӅ ÿһc ÿLӇm hình thái, hóa sinh hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu (1) Các giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu có kích thѭӟc, khӕi lѭӧng và hình dҥng hҥt khác nhau. Khӕi lѭӧng 1000 hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng dao ÿӝng tӯ 65,26± 0,34(g) ÿӃn 145,34± 0,04(g), trong ÿó giӕng NH9 có khӕi lѭӧng lӟn nhҩt 145,34± 0,04(g), nhӓ nhҩt là 2 giӕng ÿӏa phѭѫng DL (65,24± 0,34g), và AZP (118,36± 1,55g). 34 (2) Hàm lѭӧng protein trong hҥt cӫa các giӕng ÿұu tѭѫng ÿӏa phѭѫng: Azѭmpa- Gia Lai (AZP), Sa Thҫy - Kon Tum (ST), Chѭmnga-Ĉăk Lăk (CNg), Duy Linh- Lâm Ĉӗng (DL) và giӕng ÿӕi chӭng HN9 dao ÿӝng tӯ 33,12% ÿӃn 38,35%, trong ÿó DL và AZP là 2 giӕng có hàm lѭӧng protein cao nhҩt (38,35% và 37,87%), giӕng NH9 có hàm lѭӧng protein thҩp (33,12%). (3) Lipit dao ÿӝng trong khoҧng tӯ 12,53% ÿӃn 18,33 %. NH9 là giӕng có hàm lѭӧng lipit cao nhҩt (18,33%), hai giӕng AZP và DL có hàm lѭӧng lipit thҩp nhҩt (12,26% và 12,53%). (4) Ĉã xác ÿӏnh ÿѭӧc 17 loҥi axit amin có trong hҥt cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng trên, trong ÿó có 7 loҥi axit amin không thay thӃ. Giӕng DL và AZP có hàm lѭӧng lizin cao nhҩt (11,86g và 11,69g). 3.2. ĈÁNH GIÁ KHҦ NĂNG CHӎU HҤN CӪA 5 GIӔNG ĈҰU TѬѪNG 3.2.1. Khҧ năng chӏu hҥn cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu ӣ giai ÿRҥn hҥt nҧy mҫm 3.2.1.1. Ho̩t ÿ͡ Fͯa proteaza và hàm l˱ͫng protein tan trong h̩t ṉy m̯m khi x͵ lý bͧi sorbitol 7% Các proteaza ÿóng vai trò quan trӑng trong cѫ thӇ sӕng, nhҩt là trong thӡi kǤ nҭy mҫm cӫa hҥt. Khi hҥt nҧy mҫm, mӝt sӕ proteaza ÿѭӧc tәng hӧp và hoҥt ÿӝng mҥnh, giúp cho quá trình phân giҧi protein dӵ trӳ diӉn ra mҥnh mӁ nhҵm cung cҩp các axit amin ÿӇ tәng hӧp protein mӟi cho mҫm non phát triӇn, ÿҧm bҧo cho cây non có thӇ sinh trѭӣng phát triӇn bình thѭӡng trong ÿLӅu kiӋn thiӃu nѭӟc. Do vұy, viӋc tìm hiӇu vӅ sӵ biӃn ÿӝng hoҥt ÿӝ proteaza và sӵ phân giҧi protein dӵ trӳ trong giai ÿoҥn hҥt nҧy mҫm là mӝt trong nhӳng cѫ sӣÿánh giá tính chӏu hҥn cӫa cây hӑ ÿұu nói chung và cây ÿұu tѭѫng nói riêng. Trong nghiên cӭu này chúng tôi tiӃn hành ÿánh giá khҧ năng chӏu hҥn cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng thông qua sӵ biӃn ÿӝng vӅ hoҥt ÿӝ proteaza và hàm lѭӧng protein ӣ giai ÿoҥn hҥt nҧy mҫm dѭӟi tác ÿӝng cӫa sorbitol nӗng ÿӝ 7%. Dung dӏch sorbitol tҥo áp suҩt thҭm thҩu cao, cҥnh tranh nѭӟc vӟi tӃ bào hҥt làm cho hҥt không hút ÿѭӧc nѭӟc, gây ra sӵ thiӃu nѭӟc trong tӃ bào. KӃt quҧ nghiên cӭu ÿѭӧc trình bày trên bҧng 3.4. 35 Bҧng 3.4 cho thҩy hoҥt ÿӝ proteaza và hàm lѭӧng protein cӫa 5 giӕng ÿұu Wѭѫng ÿӅu tăng dҫn và ÿҥt cӵc ÿҥi vào ngày nҧy mҫm thӭ 7, sau ÿó giҧm xuӕng vào ngày thӭ 9. Sӵ có mһt cӫa proteaza trong các hҥt dӵ trӳ protein cӫa hҥt ÿang nҧy mҫm là bҵng chӭng vӅ sӵ tham gia cӫa chúng vào quá trình phân giҧi các protein, các sҧn phҭm peptit trong các bào quan ÿó [18]. Tӯ kӃt quҧ nghiên cӭu chúng tôi nhұn thҩy rҵng, hoҥt ÿӝ proteaza và hàm Oѭӧng protein cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng biӇu hiӋn rҩt khác nhau, giӕng có hoҥt ÿӝ proteaza cao thì hàm lѭӧng protein ÿѭӧc phân giҧi cNJng tăng cao và ngѭӧc lҥi. Cө thӇ, trong 5 giӕng ÿұu tѭѫng nghiên cӭu giӕng DL có hoҥt ÿӝ proteaza và hàm Oѭӧng protein cao nhҩt so vӟi các giӕng còn lҥi ӣ tҩt cҧ các ngày tuәi ÿѭӧc nghiên cӭu và thҩp nhҩt là giӕng NH9. Sӵ khác nhau vӅ hoҥt ÿӝ proteaza giӳa 5 giӕng ÿұu tѭѫng chӍ có thӇ giҧi thích bҵng sӵ khác nhau vӅ ÿһc ÿLӇm phҧn ӭng kiӇu gen cӫa các giӕng ÿұu Wѭѫng, hoһc do sӵ khác nhau vӅ cҩu trúc gen mã hóa loҥi enzym này dүn ÿӃn sӵ phân giҧi protein dӵ trӳ giӳa các giӕng cNJng khác nhau. Protein dӵ trӳ là nguӗn cung cҩp axit amin và nitѫ cho mҫm phát triӇn. Khi protein dӵ trӳ trong hҥt bӏ phân giҧi hӃt, nhӳng không bào lӟn ÿѭӧc hình thành trong các tӃ bào dӵ trӳ, các axit amin ÿѭӧc tҥo ra trong quá trình này ÿѭӧc sӱ dөng ÿӇ sinh tәng hӧp các protein mӟi cho sӵ sinh trѭӣng cӫa mҫm [18]. Hoҥt ÿӝ proteaza càng cao thì hàm Oѭӧng protein ÿѭӧc hình thành do quá trình phân giҧi protein dӵ trӳ càng lӟn và cung cҩp cho quá trình nҭy mҫm cӫa hҥt và ÿӗng thӡi có vai trò trong quá trình phөc hӗi cӫa mҫm khi gһp hҥn. KӃt quҧ nghiên cӭu vӅ hoҥt ÿӝ cӫa proteaza và hàm lѭӧng protein cho thҩy khҧ năng chӏu hҥn cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng ӣ giai ÿRҥn hҥt nҧy mҫm là khác nhau. Giӕng DL có khҧ năng chӏu hҥn tӕt nhҩt sau ÿó là giӕng AZP, CNg, ST và cuӕi cùng là giӕng NH9. Quá trình phân giҧi protein dӵ trӳ cӫa các cây hӑÿұu ÿӅu giӕng nhau [18]. Khi nghiên cӭu vӅ sӵ biӃn ÿӝng hoҥt ÿӝ proteaza và hàm lѭӧng protein tan trong giai ÿoҥn hҥt nҧy mҫm cӫa 5 giӕng ÿұu tѭѫng có xӱ lý sorbitol, chúng tôi nhұn 36 ÿѭӧc quy luұt phân giҧi proteaza tѭѫng tӵ vӟi kӃt quҧ cӫa các tác giҧ. NguyӉn Thӏ Kim Dung (2003) [6], NguyӉn Thӏ Thu Ngà (2007), khi nghiên cӭu sӵ biӃn ÿӝng hoҥt ÿӝ proteaza ӣ giai ÿRҥn hҥt nҧy mҫm cӫa mӝt sӕ giӕng lҥc [29]. Bҧng 3.4. Hoҥt ÿӝ cӫa proteaza và hàm lѭӧng protein tan ӣ giai ÿRҥn hҥt nҧy mҫm khi xӱ lý bӣi sorbritol nӗng ÿӝ 7 % GiӕngTuәi mҫm (ngày) DL ST CNg NH9 AZP 1 0,61± 0,10 0,45± 0,02 0,53± 0,10 0,50± 0,02 0,59± 0,10 3 0,65± 0,10 0,63± 0,10 0,59± 0,02 0,57± 0,10 0,61± 0,04 5 0,78± 0,04 0,66± 0,10 0,61± 0,10 0,60± 0,02 0,75± 0,02 7 0,81± 0,20 0,69± 0,30 0,69± 0,03 0,67± 0,02 0,78± 0,03 Hoҥt ÿӝ cӫa proteaza ĈVHĈ/mg) 9 0,72± 0,10 0,62± 0,10 0,65± 0,10 0,64± 0,06 0,68± 0,02 1 30,12± 0,29 21,12± 0,10 26,25± 0,27 20,79± 0,06 25,44± 0,12 3 30,16± 0,63 23,46± 0,20 29,07± 0,34 23,01± 0,34 30,80± 0,31 5 34,48± 0,22 27,49± 0,21 30,90± 0,11 24,31± 0,06 31,15± 0,26 7 35,16± 0,01 31,00± 0,08 33,20± 0,53 27,93± 0,21 33,16± 0,01 Hàm lѭӧng protein tan (%) 9 31,24± 0,13 26,70± 0,32 29,99± 0,09 23,58± 0,02 27,99± 0,09 +Ӌ sӕ tѭѫng quan (R) giӳa hoҥt ÿӝ cӫa proteaza và protein Y=27,20X+3,9 R= 0,95 Y=34,61X4,84 (R= 0,85 ) Y=36,68X+6,89 (R= 0,87) Y=35,01X+3,2 (R= 0,89) Y=27,03X+9,48 (R= 0,75) Phân tích mӕi tѭѫng quan giӳa sӵ biӃn ÿӝng hoҥt ÿӝ cӫa proteaza và hàm Oѭӧng protein cho thҩy hàm lѭӧng protein phө thuӝc chһt chӁ vào hoҥt ÿӝ proteaza vӟi hӋ sӕ tѭѫng quan dao ÿӝng tӯ 0,75 ÿӃn 0,95. Trong phҥm vi nghi._.