Nghiên cứu đa hình Protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D-Loop ty thể của ba giống Gà: Ri, Mông và đa cựa

VÀ TRÌNH TỰ VÙNG ĐIỀU KHIỂN D-LOOP TY THỂ CỦA BA GIỐNG GÀ: RI, MÔNG VÀ ĐA CỰA Chuyên ngành: Di truyền học Mã số: 60.42.70 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học:PGS.TS NGUYỄN TRỌNG LẠNG THÁI NGUYÊN - 2009 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Trọng Lạng - Bộ môn Di truyền học, khoa Sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên đã hƣớng dẫn tôi tận tình, chu đáo trong quá trình tôi học tập và nghiên cứu. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Công nghệ DNA ứng dụng Viện Công nghệ Sinh học đặc biệt là PGS.TS Nông Văn Hải đã tận tình giúp đỡ, hƣớng dẫn và tạo điều kiện tốt nhất để tôi hoàn thành bản khóa luận này. Trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu tôi đã đƣợc các anh chị NCS Nguyễn Đăng Tôn, CN Địch Thị Kim Hƣơng, CN Vũ Hải Chi - cán bộ nghiên cứu trong phòng quan tâm, hƣớng dẫn và cho tôi những lời khuyên quý báu. Tôi luôn trân trọng và biết ơn sự giúp đỡ hết mình đó. Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy cô và các cán bộ của cơ sở Đào Tạo thuộc Khoa Sinh - KTNN, Trƣờng Đại học Sƣ phạm, Đại học Thái Nguyên. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tác giả luận văn Hứa Thị Nga Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của chúng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chƣa từng đƣợc công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận văn Hứa Thị Nga Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên CÁC CHỮ VIẾT TẮT A bp cs C ddNTP dNTP DNA D-Loop EDTA EtBr EtOH Epp G Kb kDa mtDNA NXB NADH PBS PCR RNA RNase SDS T TAE Tm Adenin Base pair (cặp bazơ) Cộng sự Cytozin Dideoxynucleside triphosphate Deoxynucleside triphosphate Deoxyribonucleic acid Displacement loop - đoạn điều khiển ty thể Ethylene Diamine Tetraacetic Acid Ethidium brommide Ethanol Eppendorf Guamin kilo base kilo Dalton DNA ty thể (mitochondrial DNA) Nhà xuất bản Nicotinamide adenine dinucleotide Phosphate - buffer saline Polymerase Chain Reaction Ribonucleic Acid Ribonuclease Sodium Doecyl Sulphate Timin Tris - Acetate - EDTA Melting Temperature (Nhiệt độ nóng chảy) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen ........................................... 28 Bảng 2.2. Chu trình nhiệt ............................................................................. 29 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 .......................................................................................... 30 Bảng 3.1. Thống kê các điểm đa hình ở hai mẫu nghiên cứu so với trình tự chuẩn ..................................................................................................... 41 Bảng 3.2. So sánh mức độ sai khác về trình tự nucleotide ............................ 42 Bảng 3.3. Thống kê sự xuất hiện các băng điện di protein huyết thanh gà thí nghiệm ................................................................................................... 45 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà...................................................16 Hình 3.1. Ảnh điện di DNA tổng số ............................................................. 33 Hình 3.2. Ảnh chụp kết quả điện di sản phẩm PCR ...................................... 36 Hình 3.3. So sánh trình tự D-Loop của hai mẫu gà nghiên cứu Ri (RI) và Đa cựa (Da) với trình tự tham khảo mã số AB114078 ................................. 40 Hình 3.4. Quan hệ di truyền của một số giống gà ......................................... 42 Hình 3.5: Phổ điện di SDS – PAGE protein huyết thanh. ............................. 43 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên MỤC LỤC MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................................ 1 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài ................................................................................. 2 3. Nội dung nghiên cứu ................................................................................................. 3 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .......................................................... 4 1.1. SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU .................................................................. 4 1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà ............................. 4 1.1.2. Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu ....................................... 5 1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ ............................................................... 7 1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI ......................................................................... 8 1.3.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máu của gia cầm .............................................................................................. 8 1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết thanh máu .............................................................................................. 10 1.3.3. Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật ......... 11 1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ ................................................................ 12 1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể ........................................................ 12 1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể ......................................................... 13 1.4.3. Chủng loại phát sinh của ty thể ........................................................... 14 1.4.4. MtDNA của động vật có xƣơng sống và mtDNA gà ........................... 14 1.4.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới .............................. 17 1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam ............................... 20 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 22 2.1. VẬT LIỆU............................................................................................................... 22 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ .................................................................................... 22 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2.2.1. Hóa chất ............................................................................................. 22 2.2.2. Thiết bị ............................................................................................... 23 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................................................................... 23 2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật ................. 23 2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose ................................................ 24 2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE ....................................................... 25 2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR .............................. 27 2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA ................................................................... 29 2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự ............................................................ 30 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................. 31 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ .................... 31 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà ................................. 31 3.1.2. Nhân vùng điều khiển D-Loop của DNA ty thể .................................. 33 3.1.3. Xác định trình tự vùng điều khiển của DNA ty thể ............................. 37 3.2. THÀNH PHẦN ĐIỆN DI PROTEIN HUYẾT THANH GÀ THÍ NGHIỆM ............. 43 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ........................................................................ 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 47 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Gần một thế kỉ qua ngành chăn nuôi gia cầm đƣợc cả thế giới quan tâm và phát triển mạnh cả về số lƣợng và chất lƣợng. Chăn nuôi gia cầm chiếm một vị trí quan trọng trong chƣơng trình cung cấp protein động vật cho con ngƣời. Gia cầm chiếm 20-25% trong tổng sản phẩm thịt, ở các nƣớc phát triển thịt gà chiếm tới 30% hoặc hơn thế nữa. Ở nƣớc ta ngành chăn nuôi gia cầm là một nghề sản xuất truyền thống, giữ vị trí quan trọng thứ hai trong tổng giá trị sản xuất. Đàn gia cầm ở nƣớc ta phân bố không đều, đàn gà tập trung chủ yếu ở các tỉnh phía Bắc (66%), ở các tỉnh phía Nam chiếm 34%. Đàn vịt thì ngƣợc lại phân bố chủ yếu ở các tỉnh phía Nam (60%) và ở miền Bắc đàn vịt chỉ chiếm khoảng 40%. Theo số liệu của Tổng cục thống kê, số lƣợng đàn gia cầm của nƣớc ta đến ngày 1/8/2004 là 218,15 triệu con, tƣơng đƣơng với số đầu con năm 2001 (218,1 triệu con) thấp hơn năm 2002 ( 233,3 triệu con) và năm 2003 (254,06 triệu). Sản lƣợng thịt là 316,41 ngàn tấn, thấp hơn năm 2001 (322,6 ngàn tấn), năm 2002 (338,4 ngàn tấn) và 2003 (372,72 ngàn tấn). Sản lƣợng trứng là 3,94 tỷ quả, thấp hơn năm 2001 (4,16 tỷ quả), 2002 (4,85 tỷ quả) và 2003 (4,85 tỷ). Nguyên nhân là do ảnh hƣởng của dịch cúm gia cầm [10].Năm 2005, Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn đã hoàn thành việc xây dựng đề án đổi mới hệ thống chăn nuôi gia cầm ở nƣớc ta. Theo đề án, ngành chăn nuôi gia cầm phải chuyển đổi mạnh từ chăn nuôi phân tán, quy mô nhỏ sang sản xuất hàng hóa lớn theo hƣớng công nghiệp hóa và bán công nghiệp trên cơ sở có quy hoạch vùng chăn nuôi hàng hóa tập trung tại từng địa phƣơng; mục tiêu là đến năm 2015, tổng đàn gia cầm đạt 560-580 triệu con, khối lƣợng thịt 1000 nghìn tấn , sản lƣợng trứng 11,0 tỷ quả và tổng giá trị sản xuất chăn nuôi gia cầm đạt xấp xỉ 20000 tỷ đồng [10]. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 2 Hiện nay 75-80% chăn nuôi gà ở nƣớc ta là sử dụng các giống địa phƣơng, nuôi gà chăn thả với các giống truyền thống địa phƣơng cũng không ngừng phát triển và hiệu quả ngày càng tăng bởi các giống địa phƣơng đã đƣợc đầu tƣ để bảo tồn quỹ gen nhằm chọn lọc nâng cao năng suất. Các giống gà nội của ta mặc dù có hạn chế về năng suất, nhƣng khả năng thích ứng với điều kiện chăn nuôi Việt Nam cao, phẩm chất trứng thịt tốt đặc biệt là một số giống gà còn có giá trị dƣợc liệu cao, tốt cho việc bồi bổ sức khỏe của con ngƣời. Gà Ri của ta, gà của ngƣời H'Mông là một trong những giống gà có phẩm chất quý đó.Và một giống gà hiện đƣợc rất nhiều ngƣời quan tâm về phẩm chất, tác dụng của nó đó là gà Đa cựa. Bên cạnh việc đánh giá chọn giống vật nuôi dựa vào những đặc điểm hình thái còn dựa vào đặc tính di truyền, sinh lí, sinh hóa. Các đặc tính này chịu sự kiểm soát bởi các gen, thuộc hệ gen của cơ thể sinh vật và sự tƣơng tác giữa các gen với môi trƣờng. phân tích đa hình protein huyết thanh của các giống gà để thấy đƣợc chất lƣợng của các giống gà thí nghiệm, so sánh trình tự đoạn D-loop của các giống gà Ri, gà Mông, gà Đa cựa nhằm xác định mối quan hệ di truyền giữa các giống gà, đó là một việc làm cần thiết nhằm cung cấp thêm thông tin khoa học cho nghành chọn giống, tạo cơ sở cho việc lai tạo các giống mới đáp ứng đƣợc các nhu cầu thị trƣờng hiện nay. Vì vậy chúng tôi lựa chọn đề tài: "Nghiên cứu đa hình protein huyết thanh và trình tự vùng điều khiển D-loop ty thể của ba giống gà: Ri, Mông và Đa cựa" . 2. Mục tiêu nghiên cứu của đề tài - So sánh trình tự đoạn điều khiển trong DNA ty thể giữa các giống gà. - Xác định mối quan hệ di truyền của ba đại diện của ba giống gà. - Phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 3 3. Nội dung nghiên cứu - Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ mô máu của gà Ri, gà Mông, và gà Đa cựa. - Phân lập vùng D-Loop của hệ gen ty thể bằng kỹ thuật PCR. - Xác định trình tự vùng D-Loop và so sánh với trình tự tham khảo đã đƣợc công bố trên Ngân hàng trình tự gen quốc tế. Trên cơ sở đó, đánh giá sơ bộ về sự khác biệt di truyền giữa ba đại diện của ba giống gà nói trên. Từ đó cung cấp dữ liệu ban đầu cho các nghiên cứu về đa dạng di truyền và cải tạo giống gà bằng Công nghệ gen và Công nghệ tế bào. - Dùng phƣơng pháp điện di để điện di huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà từ đó phân tích đa hình protein huyết thanh của ba đại diện của ba giống gà nói trên. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 4 Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SƠ LƢỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI GÀ VÀ MỘT SỐ ĐẶC ĐIỂM CỦA CÁC GIỐNG GÀ NGHIÊN CỨU 1.1.1. Sơ lƣợc về nguồn gốc và vị trí phân loại của gà nhà Các giống gà hiện nay đƣợc hình thành từ quá trình lai tạo, tiến hóa lâu dài và phức tạp của 4 loại hình sau của gà rừng. - Gallus Bankiva: Phân bố ở Miến Điện, Đông Dƣơng và Philippin. - Gallus Soneratii: Phân bố ở Tây và Nam Ấn Độ. - Gallus Lafazetti: Phân bố ở Sri Lanca. - Gallus Varius: Phân bố ở Inđônêxia. Ở các vùng thung lũng sông Ấn, sự thuần hóa đầu tiên của gà nhà diễn ra ở thời kỳ đồ đồng, khoảng 3000 năm trƣớc Công nguyên (CN). Vào khoảng 2000 năm trƣớc CN gà đƣợc đƣa sang Trung Quốc. Sau đó gà phân bố ở Hy Lạp, ở đây gà vừa là con vật để làm cảnh, tế lễ, và giải trí (chọi gà). Thông qua ngƣời Hy Lạp có mối quan hệ buôn bán rộng rãi mà gà đƣợc đƣa sang các nƣớc thuộc miền Địa Trung Hải và giữa Châu Âu. Đến thế kỉ I gà nuôi đã đƣợc phân bố rộng rãi ở Trung Âu và Đông Âu. Dẫn theo Nguyễn Đình Ân và nhiều tác giả, trong hệ thống phân loại sinh giới, gà nhà có vị trí phân loại nhƣ sau: Giới Động vật (Animalia) Nghành Động vật có xƣơng sống (Chordata) Lớp Chim (Aves) Bộ Gà (Galliformes) Họ Trĩ (Phasianidae) Giống Gallus Loài Gallus gallus Phân loài Gallus gallus domesticus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 5 Theo tác giả Nguyễn Thị Mai [10] gà nhà của ta bắt nguồn từ gà rừng Gallus bankiva hay còn có tên là Gallus gallus. Cách đây khoảng 3000 năm từ giống gà hoang ban đầu, trải qua thời gian dài nhân dân ta đã tạo ra đƣợc nhiều giống gà khác nhau: Gà chọi, gà Đông Cảo, gà Hồ, gà Mía, và gà Ri đƣợc phân bố rất rộng rãi. Theo tác giả Nguyễn Văn Tiêu, Nguyễn Duy Ti [12] việc nuôi gà ở nƣớc ta đã có từ giai đoạn Phùng Nguyên cách đây 3500 năm. Cơ sở của kết luận này là tƣợng gà bằng đất nung tìm thấy ở xóm Rền, Đồng Đậu, Vĩnh Phúc. Theo Nguyễn Đức Tâm [9] nghề nuôi gà ở nƣớc ta muộn hơn cách đây khoảng 3328 ± 100 năm, đến giai đoạn Đông Sơn (2800 ± 100 năm) đã có tƣợng gà bằng đồng khá phổ biến. Theo tác giả Đào Văn Tiến (1971) [11] thì gà đƣợc nuôi cách đây 3000 năm. Theo các tài liệu nghiên cứu về khảo cổ và di chỉ tìm đƣợc cho thấy vùng nuôi gà sớm nhất ở nƣớc ta nằm giữa hai dãy núi Ba Vì và Tam Đảo. Gà nuôi lúc bấy giờ tầm vóc còn bé, khả năng sinh sản thấp và đó chính là tổ tiên giống gà hiện nay. Trải qua thời kì dài làm nông nghiệp, chăn nuôi tùy theo sở thích và điều kiện khí hậu, đất đai, trình độ canh tác, tập quán.. tổ tiên ta đã tạo nên các giống gà khác nhau mà cho đến ngày nay vẫn tồn tại và phát triển nhƣ gà Ri, gà Đông Tảo, gà Hồ, gà Tre... 1.1.2. Một số đặc điểm của ba giống gà nghiên cứu 1.1.2.1. Gà Ri Có nguồn gốc thuộc nhóm gà rừng Gallus banguira thƣờng gặp ở các nƣớc Đông Nam Á nhƣ Ấn Độ, Mianma, Malaysia... Ở nƣớc ta gà Ri đƣợc nuôi phổ biến ở mọi miền trong cả nƣớc. Mầu sắc lông có nhiều loại: Vàng , nâu, đen, trắng, xám...thể hiện tính pha tạp nặng. Tầm vóc nhỏ, dáng thanh gọn, chân có hai hàng vẩy xếp nhƣ hình mái ngói. Đến tuổi thành thục, con trống nặng từ 1,6- 2,2 kg; con mái nặng từ 1,1 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 6 - 1,6 kg. Sản lƣợng trứng 80 - 100 quả/năm. Khối lƣợng trứng nhỏ: 40 - 50 gam. Gà Ri đƣợc chọn lọc, sản lƣợng trứng có thể đạt 120 - 130 quả/năm. Gà Ri có sức chống chịu bệnh tật cao, thịt có hƣơng vị thơm ngon, phẩm chất tốt [7]. Gà Ri có đặc tính cần cù, chịu khó kiếm ăn, khả năng chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật, nuôi con khéo, đẻ trứng sớm với khẩu phần ăn nghèo chất dinh dƣỡng 13-15% đạm thì vẫn nuôi đƣợc gà đẻ trứng bình thƣờng. 1.1.2.2. Gà Mông Ở nƣớc ta gà Mông đƣợc nuôi chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía bắc trong các gia đình dân tộc thiểu số, đặc biệt là ngƣời H'Mông, đƣợc nuôi với phƣơng thức chăn thả quảng canh không có đầu tƣ. Đặc điểm gần giống với kiểu Bakira, Gà Mông có tầm vóc tƣơng đối lớn từ 3 - 4kg, có chân cao, tốc độ sinh trƣởng khá, nhiều lông, ức nở, mào và dái tai lớn, mỏ hơi cong và nhọn, màu sắc lông đa dạng. Gà Mông thích nghi tốt với điều kiện thời tiết khí hậu, dịch bệnh, phẩm chất thịt ngon, ít mỡ, giàu dinh dƣỡng. Tuy nhiên gà Mông thƣờng nuôi con và chăm sóc con kém hơn gà Ri [7]. Gà Mông không những là món ăn ngon, bổ mà còn có giá trị dƣợc liệu cao, rất tốt cho những ngƣời bị bệnh tim mạch. Đồng bào ngƣời Mông dùng xƣơng, thịt của gà Mông nhƣ một loại thuốc bồi dƣỡng sức khỏe cho những ngƣời ốm yếu. Gà mái đẻ ít và thƣa số trứng/mái/lứa là 13,65 quả, khoảng cách giữa 2 lứa đẻ là 19,88 ngày. Trứng gà Mông có khối lƣợng ở mức trung bình với 44,04g. Tỷ lệ vật chất khô ở lòng đỏ trứng là 50,56%, ở lòng trắng 12,41. Tỷ lệ protein lòng đỏ 16,66%, lòng trắng 11,01% lòng đỏ trứng có tỷ lệ lipit khá cao 26,94% [20]. Đặc tính riêng biệt: Da, thịt, xƣơng và phủ tạng có màu đen chiếm 90%, ngoại trừ màu lông do quá trình nuôi bị lai tạp, chƣa đƣợc chọn lọc nên màu sắc Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 7 lông gà Mông thƣờng rất đa dạng: Vàng rơm, nâu, đen, xám, hoa mơ, trắng...... Về tập tính, trƣớc đây, gà Mông đƣợc nuôi thả tự do nên tập tính có phần hoang dại. Ban ngày gà đƣợc thả rông tự kiếm ăn, tối về chuồng hoặc đậu trên cây ngủ. Thức ăn có thể là giun, dế, ngô, thóc....., ngƣời nuôi ít cho ăn thêm. 1.1.2.3. Gà Đa cựa Là giống gà địa phƣơng đƣợc nuôi ở chủ yếu ở các tỉnh miền núi phía bắc trong các gia đình dân tộc thiểu số. Tầm vóc tƣơng đối lớn, màu sắc lông đa dạng: Xám, vàng, đỏ nâu.....Phẩm chất thịt ngon, ít mỡ. Gà có khả năng chống chịu tốt với thời tiết, bệnh tật. Đặc điểm đặc biệt dễ nhận thấy là chân có nhiều cựa nên đƣợc gọi là gà Đa cựa. 1.2. ĐẠI CƢƠNG VỀ SINH HỌC PHÂN TỬ Sinh học phân tử nghiên cứu ở mức độ phân tử các phản ứng sinh học xảy ra trong tế bào. Hoạt động của từng gen cũng nhƣ sự phối hợp giữa các gen; Kiểm soát sự phiên mã, dịch mã cũng nhƣ sự phân bố của các protein trong tế bào; các phản ứng sinh học đảm bảo hoạt động sống của tế bào cũng nhƣ điều hòa hoạt động giữa các tế bào trong một mô, giữa các mô với nhau.... Sự phát hiện cấu trúc chuỗi xoắn kép của DNA bởi James D.Watson và Francis H.C. Crick (1953) chính thức khởi đầu cho thời kì hiện đại của sinh học phân tử. Trải qua hơn nửa thế kỉ sinh học phân tử đã đạt đƣợc những thành tựu vĩ đại mà đỉnh cao của sự phát triển này là những khám phá bản chất sinh học của sự sống ở cấp độ phân tử và xây dựng các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng vào thực tiễn. Geneomics và Proteomics là vấn đề đang đƣợc quan tâm đặc biệt hiện nay mà cơ sở của các lĩnh vực này là những phát hiện về cấu trúc và chức năng của axit nucleic, về đặc điểm của genome nhân, genome ty thể, genome lạp thể. Những đặc điểm khác nhau về cấu trúc và chức năng của Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 8 các hệ gene cho phép ứng dụng vào thực tế chọn giống và nghiên cứu ở ngƣời. Cùng với cấu trúc DNA và RNA còn có đặc điểm của quá trình tái bản DNA và phiên mã cũng đƣợc quan tâm, vì nó là cơ sở của những kĩ thuật sinh học phân tử - các thao tác ở DNA và RNA. Phân loại học phân tử (Molecular systematics ) là sự phát hiện, mô tả và giải thích tính đa dạng sinh học ở mức độ phân tử giữa các loài trong phạm vi loài [16]. Các phƣơng pháp dùng trong phân loại phân tử: Hiện nay có hàng loạt các phƣơng pháp đang đƣợc sử dụng trong phân loại học phân tử nhƣ: Điện di isozym, phản ứng chuỗi polymerase (PCR); Kĩ thuật phân tích hiện tƣợng đa hình của độ dài các phân đoạn ADN (RFLP technology); Phân tích đa hình của ADN đƣợc nhân bản ngẫu nhiên (Random Amplified Polimorphic DNA - RAPD) ;Phân tích tính đa hình chiều dài các phân đoạn ADN đƣợc nhân bản có chọn lọc (Amplified Fragment Length Polimorphism-AFLP)....... 1.3. CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI 1.3.1. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu chỉ tiêu sinh lý, hóa sinh máu của gia cầm Máu là một loại dịch thể lỏng, có màu đỏ, vị hơi mặn và đƣợc lƣu thông liên tục trong hệ tuần hoàn của cơ thể. Máu cũng là một mô lỏng (mô máu) bao gồm các tế bào máu nhƣ: Hồng cầu, bạch cầu, tiểu cầu. Ngoài ra còn có huyết tƣơng (dịch ngoại bào). Máu cùng với các dịch thể khác của cơ thể nhƣ: Dịch bạch cầu, dịch gian bào, dịch tiêu hóa...là những môi trƣờng sống của tất cả các loại tế bào trong cơ thể và đƣợc gọi là nội bào. Máu là thành phần rất quan trọng của nội môi. Nội môi luôn đƣợc ổn định và cân bằng đã đảm bảo cho các quá trình sống của cơ thể đƣợc diễn ra một cách bình thƣờng và do đó cơ thể mới đƣợc tồn tại, sinh trƣởng và phát triển tốt...Các tế bào máu luôn đƣợc đổi mới trong cơ thể nhƣng vẫn luôn duy trì một tỷ lệ tƣơng đối ổn định. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 9 Việc nghiên cứu các thành phần của máu cũng nhƣ các chỉ số sinh lý, hóa sinh máu có ý nghĩa quan trọng trong công tác giống, chỉ số sinh lý, hóa sinh đã trở thành hằng số đặc trƣng cho phẩm chất giống, quy định đặc tính di truyền bên trong cơ thể, từ đó cho phép khảo sát và điều tra các chỉ tiêu cho công tác chọn giống và lai tạo giống gia súc, gia cầm. Thành phần của máu: Lấy máu và chống đông rồi cho vào một ống nghiệm, sau đó ly tâm, ta sẽ thấy máu đƣợc chia làm hai phần rõ rệt: - Phần trên có màu vàng nhạt vì có các sắc tố màu vàng và chiếm khoảng 55-60% thể tích của máu. - Phần dƣới đặc hơn có màu đỏ thẫm, chiếm khoảng từ 40-45% thể tích của máu, đó là các tế bào máu gồm có : Các hồng cầu, bạch cầu và tiểu cầu. Lƣợng máu trong cơ thể là tỉ lệ % của khối lƣợng máu so với trọng lƣợng cơ thể. Tỉ lệ này thay đổi tùy loài: Ở mèo 6,6%, ở thỏ 5,5% và ở gà 8,5% - 9% (gà 180 - 315ml; vịt 360ml). Tỉ trọng của máu thay đổi thuộc vào tùy loài, thành phần nhóm tuổi nhƣng mức độ thay đổi không lớn. Số lƣợng hồng cầu, bạch cầu của gia cầm không giống nhau, phụ thuộc vào giống, tuổi và giới tính. pH của máu và hệ đệm: Phản ứng của máu phụ thuộc vào tỉ lệ ion H+ và OH - trong máu, phản ứng máu nói chung ổn định ít có sự dao động giữa các loài: Máu Ngựa pH=7,4; Dê=7,49; Gà=7,42; Lợn=7,49. pH máu đƣợc duy trì ở trạng thái ổn định nhờ sự hoạt động của cơ quan bài tiết và các hệ đệm của máu: Hồng cầu có 5 đôi hệ đệm, huyết tƣơng có 4 đôi hệ đệm. Nghiên cứu về hệ đệm của máu là cơ sở để sử dụng các dung dịch đệm trong điện di huyết thanh và hemoglobin cho phù hợp với pH của nó. Trong điện di ngƣời ta sử dụng các dung dịch đệm khác nhau phù hợp với từng đối tƣợng. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 10 1.3.2. Cơ sở khoa học của việc nghiên cứu tính đa hình protein huyết thanh máu Trong những năm gần đây, nhờ các phƣơng pháp và kỹ thuật phân tích sinh hóa hiện đại phát triển mạnh mẽ, đặc biệt là phƣơng pháp điện di và các phƣơng pháp nhuộm hóa tế bào đã góp phần quan trọng để nghiên cứu, phát hiện cấu trúc enzym của protein huyết thanh, sữa, các kiểu hemoglobin…trên cơ sở đó nghiên cứu cơ chế phân tử của trao đổi chất, hoạt động của gen trong tế bào. Nhiều dẫn liệu trong lĩnh vực phân tích tính đa hình di truyền của các tính trạng hóa sinh đã đƣợc ứng dụng trong công tác chọn giống vật nuôi một cách có hiệu quả. Các tính trạng hoá sinh là những tính trạng muốn xác định nó, ngƣời ta phải dùng các phƣơng pháp phân tích hoá học, hoá sinh học. Hƣớng nghiên cứu di truyền học hoá sinh ngày càng phát triển mạnh mẽ trên tất cả các đối tƣợng vi sinh vật, thực vật, động vật và ngƣời. Nhờ cải tiến các kĩ thuật phân tích hoá sinh ngày càng hiện đại, chính xác, có sự kết hợp giữa các máy phân tích tự động với máy vi tính đã rút ngắn khá nhiều thời gian phân tích các tính trạng tới hàng trăm, hàng nghìn lần. Nghiên cứu tính đa hình di truyền của hemoglobin, protein, huyết thanh máu, protein trong sữa hoặc các enzym trong máu và các cơ quan…..đã đƣợc tiến hành từ lâu. Năm 1955, Smithies O. đã chứng minh tính đa dạng di truyền các protein huyết thanh máu động vật. Ông đã dùng hai phƣơng pháp chính là: Phƣơng pháp miễn dịch học phát hiện nhóm globin, lipoprotein…và phƣơng pháp miễn dịch học phát hiện hemoglobin, haptoglobin, transferin. Nhiều nhà nghiên cứu về sau đã sử dụng các phƣơng pháp điện di trên giấy, trên gel tinh bột, gel agarose, gel polyacrylamide…để xác định tính đa hình của hemoglobin, các protein trong máu, mô cơ quan, sữa, trứng và các enzym trong máu, trong các dịch của cơ thể. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 11 Protein huyết thanh máu là hỗn hợp các chất khác nhau. Ngƣời ta đã đi sâu chứng minh vai trò quan trọng của các tiểu phần huyết thanh với các quá trình trao đổi chất và liên quan của chúng với các chỉ tiêu kinh tế khác. 1.3.3. Thành phần protein huyết thanh của gia súc và một số động vật Tùy theo phƣơng pháp xác định thành phần protein huyết thanh mà ta đƣợc số tiểu phần (cấu tử) khác nhau. Phƣơng pháp điện di trên giấy tách protein huyết thanh bò, lợn đƣợc bốn tiểu phần chính; Anbumin là tiểu phần chạy nhanh nhất về phía cực dƣơng, tiếp theo là các tiểu phần αglobulin, βglobulin, γglobulin. Về thành phần protein huyết thanh của lợn, gà, cá và một số động vật nuôi khác khi điện di trên giấy cũng đƣợc 4 tiểu phần chính là anbumin, αglobulin, βglobulin, γglobulin. Khi phân tích protein huyết thanh trên gel tinh bột thủy phân, gel polyacrylamide…số cấu tử sẽ lớn hơn do mỗi tiểu phần ở trên giấy sẽ đƣợc tách ra nhiều phần nhỏ nhƣ tiền anbumin, anbumin, hậu anbumin, α1globulin, α2globulin βglobulin, γ1globulin, γ2globulin… Anbumin là nguyên liệu xây dựng các tế bào, anbumin huyết thanh đóng vai trò giữ áp lực thẩm thấu keo, vận chuyển và liên kết axít béo, vitamin… Anbumin liên quan đến một số tính trạng kinh tế nhƣ lợn sinh trƣởng nhanh, tỷ lệ nạc cao thì chúng có hàm lƣợng anbumin cao. αglobulin tuy hàm lƣợng thấp so với tổng lƣợng protein huyết thanh nhƣng chúng có vai trò quan trọng trong liên kết với gluxit, lipit để tạo ra lipoprotein, glucoprotein. Đồng thời, chúng tham gia vận chuyển cholestron. Khi dùng thạch, tinh bột tách đƣợc 2 phần α1globulin, α2globulin. α2globulin đƣợc quan tâm nhiều hơn vì nó chứa haptoglobin, nó liên quan đến hàm lƣợng mỡ sữa và sự tích lũy mỡ sữa ở động vật. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 12 βglobulin có nhiệm vụ liên kết và chuyển hóa sắt, tạo máu, vận chuyển các ion kim loại, chuyển hóa mỡ… Khi tách βglobulin bằng gel tinh bột đƣợc phần transferin có vai trò quan trọng trong việc tạo máu. Liên quan đến sản lƣợng sữa ở bò, sức kháng bệnh tự nhiên ở gia súc. γ globulin là tiểu phần rất quan trọng. Nó là protein miễn dịch, ở động vật γ- globulin đƣợc chia ra làm 5 nhóm: IgA, IgG, IgH, IgD và IgE (do các lympho B sản xuất). Các globulin miễn dịch có tác dụng chống lại các kháng nguyên lạ xâm nhập vào cơ thể. Thông qua hệ thống miễn dịch, các globulin miễn dịch đã bảo vệ cho cơ thể, và có vai trò trong bảo tồn nòi giống [2]. 1.4. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ TY THỂ GÀ 1.4.1. Cấu trúc và chức năng của ty thể Ty thể là bào quan có mặt trong tất cả tế bào hô hấp hiếu khí, có chức năng vô cùng quan trọng là trạm chuyển hóa năng lƣợng từ các phân tử dinh dƣỡng thành dạng năng lƣợng tích trữ trong phân tử ATP là dạng năng lƣợng cần thiết cho tất cả các hoạt động sống của tế bào. Ty thể đƣợc Altman phát hiện vào năm 1894 và đến năm 1897 đƣợc Benđa đặt tên là Mitochondria (theo tiếng Hy Lạp- Mistos là sợi và chondira- là hạt) vì chúng có dạng sợi hoặc dạng hạt khi xem dƣới kính hiển vi thƣờng. Ty thể là những thể nhỏ có màng bao bọc, số lƣợng ty thể trong các tế bào rất khác nhau, có thể hàng trăm hoặc hàng nghìn. Ty thể có nhiều hình dạng khác nhau nhƣ hình cầu, hình que, hình sợi... Ty thể có khả năng chuyển động, thay đổi kích thƣớc, hình dạng và liên kết lại với nhau thành các cấu trúc dài hơn hoặc phân ra thành các cấu trúc ngắn hơn. Trong tế bào, ty thể thƣờng tập trung ở các nơi đang diễn ra sự trao đổi chất mạnh nhất. Cấu trúc của ty thể đƣợc bao bọc bằng một màng kép lớp ngoài nhẵn, lớp trong có nhiều nếp gấp chạy song song và ăn sâu vào trung tâm của ty thể. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 13 Giữa hai lớp màng trong và màng ngoài có chứa dịch kẽ màng. Mặt ngoài của lớp ngoài và mặt trong của lớp trong có chứa nhiều hạt với kích thƣớc từ 80- 90 A o chứa các enzyme và cofacto. Ty thể nhƣ một nhà máy để sản sinh ra năng lƣợng của tế bào. Hệ thống sản sinh ra năng lƣợng trong ty thể bao gồm hai quá trình oxy hóa và photphoril hóa. Quá trình oxy hóa giải phóng ra các điện tử, các điện tử tác dụng nhƣ tác nhân tích lũy và biến đổi năng lƣợng. Trong điều kiện nếu thiếu oxy sẽ diễn ra quá trình tổng hợp ATP là chất tích lũy năng lƣợng dƣới dạng các cầu nối photphát giầu năng lƣợng. Tại ty thể sẽ tiếp nhận các sản phẩm đƣợc phân giải từ các chất nhƣ protein, lipit._. và gluxit diễn ra trong bào tƣơng đến dạng pyruvat và chuyển sang dạng Axetyl coenzimA. Trong ty thể, axetyl coenzimA đã qua quá trình oxy hóa trong chu trình Krebs. Với chu trình này, đã có bốn lần giải phóng 2H+ nghĩa là giải phóng hai điện tử. Các ion H+ giải phóng ra đƣợc các chất vận chuyển H+ tiếp nhận chuyển vào chuỗi hô hấp và cuối cùng chuyển hydro cho oxy. Trong chuỗi hô hấp, năng lƣợng giải phóng đƣợc tích lại dƣới dạng ATP. Ty thể còn có đặc điểm là trong dịch nền của nó có những hạt DNA và ARN. Ty thể đã sử dụng DNA làm khuôn mẫu để sản sinh ra ty thể mới. 1.4.2. Sự tổng hợp protein trong ty thể Nhờ có đủ các nhân tố riêng của mình (mtDNA, mARN, tARN và riboxom) nên ty thể có thể tự tổng hợp các protein cho mình. Sự tổng hợp protein cũng diễn ra trên riboxom theo cơ chế chung, nhƣng axit amin khởi động, giống nhƣ ở Bacteria là N-fomyl- methionin, chứ không phải methionin nhƣ ở tế bào Eukaryota. Ty thể không thể tự tổng hợp tất cả protein của ty thể bởi vì mtDNA chỉ chứa lƣợng nucleotit mã hóa cho khoảng 500 axit amin. Rất nhiều protein của ty thể đƣợc tổng hợp từ mạng lƣới nội chất có hạt trong tế bào chất theo mã của các gen trong nhiễm sắc thể của nhân, sau đó đƣợc vận chuyển vào ty thể. Ty thể tự tổng hợp một số protein không hòa tan cần Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 14 cho màng trong và một số protein có chức năng điều chỉnh quá trình hoạt hóa các gen ty thể của nhân tế bào. 1.4.3. Chủng loại phát sinh của ty thể Trƣớc đây có giả thuyết cho rằng trong quá trình tiến hóa của tế bào thì ty thể có nguồn gốc từ sự phân hóa của màng sinh chất ăn sâu vào tế bào chất, về sau tách ra và phức tạp hóa hệ thống mào trở thành một bào quan độc lập, với dẫn chứng là nhiều bọn vi khuẩn có cấu trúc mezoxom - là một phần của màng sinh chất gấp nếp ăn sâu vào tế bào chất, có chứa các enzym và nhân tố của sự hô hấp hiếu khí - đó là hình ảnh của ty thể ở dạng nguyên thủy. Nhƣng hiện nay ngƣời ta công nhận giả thuyết cộng sinh về nguồn gốc chủng loại của ty thể. Sự xuất hiện ty thể trong tế bào Eukaryota là kết quả cộng sinh của một dạng vi khuẩn hiếu khí với tế bào. Dẫn chứng thuyết phục nhất là trong ty thể có chứa DNA giống DNA của vi khuẩn, riboxom của ty thể về kích thƣớc và rARN giống với riboxm vi khuẩn, và đặc biệt là cơ chế và hoạt động tổng hợp protein trong ty thể có nhiều đặc điểm giống với vi khuẩn. 1.4.4. MtDNA của động vật có xƣơng sống và mtDNA gà MtDNA là sợi xoắn kép có cấu trúc vòng, có chiều dài chừng 5µm. Trong tế bào mtDNA chiếm từ 1 - 5% DNA của tế bào. MtDNA tự tái bản theo kiểu bán bảo thủ nhờ hệ DNA polimerase có trong chất nền ty thể và xảy ra ở gian kỳ của chu kì tế bào. MtDNA có dạng vòng và không liên kết với histon, điều này làm cho mtDNA khác với DNA của nhân tế bào và mtDNA tƣơng tự với DNA của vi khuẩn. MtDNA là một trong các nhân tố qui định tính di truyền tế bào chất. Sự di truyền của các gen ty thể phụ thuộc vào hai yếu tố: Kiểu di truyền của bản thân bào quan và số bản sao nhiễm sắc thể trong tế bào. Ở phần lớn các loài, mỗi cá thể nhận đƣợc các bào quan từ mẹ cùng với tế bào chất của trứng. Kiểu di truyền này đƣợc gọi là di truyền theo dòng mẹ. Kiểu di truyền Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 15 này có đặc điểm: Thứ nhất, kiểu gen của con hoàn toàn do mẹ quyết định. Nếu mẹ mang đột biến ở gen bào quan thì con sẽ có kiểu hình đột biến cho dù bố bình thƣờng. Thứ hai, ảnh hƣởng đến kiểu di truyền này là số lƣợng bản sao nhiễm sắc thể trong bào quan. Phân tử mtADN có các đặc điểm chú ý sau: - Tốc độ đột biến lớn gấp 5 lần so với gen nhân. - Số lƣợng bản sao lớn. - Đơn bội, không có sự tái tổ hợp. - Chỉ di truyền theo dòng mẹ. Mt DNA của động vật có xƣơng sống nói chung có dạng vòng kép, gồm một chuỗi nặng (chuỗi H) giàu Guamin, và một chuỗi nhẹ (chuỗi L) giàu cytozin, có chiều dài khoảng 5µm. Phân tử mtDNA không liên kết với protein histone, có khả năng tái bản theo cơ chế bán bảo toàn nhờ sử dụng các enzyme DNA polymerase trong chất nền ty thể. Ở đa số các động vật, phân tử mtDNA chứa khoảng 16-17kb, mã hóa cho các loại protein/enzyme tham gia vào các quá trình tổng hợp năng lƣợng, trao đổi chất...của tế bào, trong đó gồm 22 loại tRNA, 2 loại rRNA 16S và 12S, 13 chuỗi polypeptide [15, 25]. Tất cả các động vật có xƣơng sống đã đƣợc phân tích đều có 37 gen trên phân tử DNA ty thể và thƣờng không có khoảng trống giữa các gen (không có intron). Tuy nhiên, trật tự sắp xếp các gen trong phân tử DNA dạng vòng có thể không giống nhau giữa các loài, điều này đƣợc thể hiện rõ khi so sánh trình tự genome ty thể các bậc taxon bậc bộ trở lên. Vì thế, các đặc điểm về trật tự các gen trên ty thể có triển vọng đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu phân loại với các taxon bậc cao [30]. Phân tử mtDNA có tốc độ tiến hóa nhanh hơn 5 lần so với các gen nhân do thiếu cơ chế sửa chữa DNA do đó dẫn đến nhiều biến dị trong ty thể, không chỉ giữa các loài mà còn cả trong cùng một loài. Bên cạnh đó, các biến Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 16 dị này không giống nhau giữa các ty thể trong cùng một tế bào và giữa các tế bào khác nhau. MtDNA còn có đặc điểm đơn bội, không tái tổ hợp, di truyền theo dòng mẹ, có nhiều bản sao trong tế bào và bền vững hơn DNA nhân trong khi tách chiết do có cấu trúc dạng vòng [18], vì vậy có thể đƣợc sử dụng nhƣ một dấu hiệu để nhận biết các sai khác di truyền. Năm 1990, trình tự genome mtDNA lần đầu tiên đƣợc công bố trên đối tƣợng gà Leghorn trắng bởi các tác giả Desjardins và Moais [16]. MtDNA có chiều dài khoảng 16,8 kb và ngoài các gen cấu trúc còn có một vùng điều khiển không mang mã di truyền gọi là vùng D-Loop. Tuy có nhiều đặc điểm tƣơng đồng với hệ genome mtDNA của các động vật có xƣơng sống, hệ genome mtDNA của gà vẫn mang những điểm khác biệt: - Trên chuỗi nhẹ, trật tự gen theo chiều 5'-3' là NADH dehydrogenase (ND5), Cytochrome b (Cyt b), tRNA thr , tRNA pro , ND6, tRNA Glu và vùng điều khiển trong khi ở các động vật khác, gen Cyt b lại nằm gần vùng điều khiển hơn [16]. - Ở gà thiếu 1 điểm khởi đầu sao chép nằm giữa 2 gen tRNACys và tRNA Asn nhƣ ở các động vật có xƣơng sống khác [16]. - Gen Cytochrome oxydase I (COI) có bộ 3 mở đầu là GTG thay vì ATG. Toàn bộ genome ty thể gà (Galuss galuss) đƣợc tổ chức nhƣ sơ đồ trong hình 1.1. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 17 Hình 1.1. Sơ đồ tổ chức của DNA ty thể Gà ND: NADH dehydrogenase; CO: Cytochrome oxydase Đoạn D-loop trên mtDNA là một vùng không mang mã di truyền, có chiều dài 1227bp ở gà nhà [16], chứa điểm khởi đầu sao chép và các promoter cho quá trình phiên mã của cả chuỗi nặng và chuỗi nhẹ. Về cấu trúc vùng trình tự D-Loop có thể chia thành ba domain I, II và III [14]. Trong đó domain II bảo thủ nhất, chứa một số đơn vị cấu trúc không thay đổi ngay cả ở bậc phân loại họ. Ngƣợc lại domain III đƣợc coi là biến đổi nhiều nhất [25]. Đoạn trình tự D-Loop là vùng tiến hóa nhanh nhất trong phân tử mtDNA. Trung bình, nó tích lũy các đột biến nhanh hơn 5-10 lần so với bất kì gen nào trong hệ gen ty thể vì vậy có thể xem trình tự nucleotide của vùng D- Loop là một công cụ quan trọng để đánh giá đa dạng di truyền, sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể cùng loài. 1.4.5. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà trên thế giới Năm 1994-1995, Fuhimito và cộng sự [33] đã tiến hành nghiên cứu Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 18 mối quan hệ chủng loại giữa các loài gà rừng, Công , Trĩ, chim Cun cút...dựa trên các phân tích đoạn điều khiển ty thể. Kết quả phân tích đa hình chiều dài các đoạn giới hạn (RFLP) trên vùng điều khiển mtDNA cho phép các tác giả này đƣa ra một sơ đồ phân loại giữa các loài trên. Đồng thời họ đã xác định đƣợc trình tự của 400bp đầu tiên trên vùng điều khiển mtDNA. Kết quả nhận đƣợc đã chỉ ra sự lặp lại của một đoạn khoảng 60bp trên vùng điều khiển mtDNA là điểm đặc trƣng của giống Gallus. Randi và cộng sự (1997) [19]; Scott(1997) [24] phân tích trình tự của một phân đoạn điều khiển ty thể (đoạn D-Loop)của 2 loài gà lôi đặc hữu ở Việt Nam đã chỉ ra sự khác biệt rất ít ở mức độ phân tử giữa 2 giống gà này. Năm 1999, Kimball và cộng sự [21] cũng dựa trên sự phân tích đầy đủ của gen cytochrom b (1143 bp) và đoạn siêu biến 1 (350 bp) của vùng điều khiển mtDNA để xác định mối quan hệ chủng loại của một số loài Trĩ và gà Gô. Hai cây phân loại đƣợc xây dựng từ hai hệ thống số liệu nhận đƣợc trên một đoạn trình tự ngắn trên mtDNA cũng cho kết quả khá phù hợp với kết quả phân tích trên toàn bộ gen cytochrom b, điều này cho thấy trình tự vùng điều khiển có đủ cơ sở để phân tích quan hệ chủng loại. Năm 2001, D.Niu và cộng sự đã tiến hành nghiên cứu nguồn gốc và đánh giá đa dạng di truyền 6 giống gà bản địa của trung Quốc. Họ giải trình tự 539 nucleotide vùng trình tự D-Loop của 6 giống gà, so sánh với trình tự nucleotide của các giống gà G. gallus, G.sonneratii, G.varius, G. lafayettei lƣu giữ trong GenBank và thiết lập cây chủng loại phát sinh giữa các giống. Đồng thời, dựa trên đoạn trình tự phân tích đƣợc họ cũng nhân thấy sự khác biệt đáng kể về mặt di truyền giữa các giống gà chuyên trứng và các giống nuôi với mục đích khác, chủ yếu là do sự khác biệt về dòng mẹ giữa các giống [31]. Năm 2002 Zang và đồng tác giả đã giải trình tự 539 nucleotide đầu tiên trong vùng D-Loop của 6 chủng gà nhà (Gallus gallus domesticus) Trung Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 19 Quốc và so sánh dữ liệu này với trình tự DNA của 4 loài khác: Gallus gallus, Gallus sonneratii, Gallus varius, Gallus lafayettei đã đƣợc công bố trong ngân hàng gen quốc tế. Ông đã thiết lập đƣợc mối quan hệ nguồn gốc của chúng dựa trên trình tự vùng D-Loop. Kết quả cho thấy 4 loài thuộc giống Gallus có rất nhiều điểm khác nhau. G. g. domesticus có mối quan hệ thân thuộc nhất với G. gallus của Thái Lan và các vùng lân cận. Nhóm nghiên cứu đã giả thuyết rằng, gà nhà Trung Quốc có thể có nguồn gốc từ loài G.gallus ở các nơi này và hai loài phụ G. g. Gallus, G. g. spadiceus có thể thuộc một loài phụ do tính tƣơng đồng cao giữa chúng [36]. Năm 2003, S. Moulin và cộng sự đã sử dụng 800 bp của đoạn D-Loop và 400 bp của gen cyt b để nghiên cứu sự phát sinh chủng loại của 2 loài gà Lôi Lophura nycthemera và L. leucomelanos. Các kết quả thu đƣợc đã góp phần phân biệt 2 loài trên và đồng thời làm sáng tỏ nguồn gốc của một số loài thuộc 2 loài này [29]. Năm 2003, T. Komiyama và cộng sự cũng dựa trên trình tự đầy đủ của vùng D-Loop để nghiên cứu nguồn gốc tiến hóa và quá trình thuần hóa của 3 giống gà Naganakidori của Nhật Bản. Trên cơ sở cây chủng loại phát sinh xây dựng đƣợc các nhà nghiên cứu cho rằng tuy có nhiều điểm khác biệt đáng chú ý, 3 giống gà trên đều có nguồn gốc từ giống gà chọi Shamo. Kết quả này còn dẫn đến kết luận 3 giống gà đƣợc đƣa từ các vùng lân cận miền Nam trung Quốc hoặc Đông Dƣơng qua Okinawa vào Nhật Bản [22, 23]. Pereira và cộng sự (2004) đã tìm đƣợc ít nhất 13 gen giả (pseudogene hay Numt) trong genome của G.gallus với kích thƣớc dao động từ 131 đến 1733 nucleotide. Đây là các đoạn DNA ty thể đƣợc tìm thấy trong hệ gen nhân của sinh vật nhân thật. Một số trong chúng có nhiều điểm tƣơng đồng với các đoạn trong ty thể. Do đó, chúng có thể đƣợc dùng trong các nghiên cứu mối quan hệ chủng loại và di truyền quần thể sử dụng DNA ty thể làm Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 20 đối tƣợng nghiên cứu. Tuy nhiên, ngƣời ta vẫn chƣa xác định đƣợc tần số bắt gặp của Numt cũng nhƣ đóng góp của nó đối với genome trong nhân [33]. Komiya T và đồng tác giả (2004) [23] đã tiến hành phân tích trình tự vùng D-Loop trong ty thể từ mẫu của 9 con gà cảnh đuôi dài và 74 con thuộc gà địa phƣơng của Nhật Bản đồng thời chọn trình tự DNA của 2 loài gà nhà lông đỏ (Jungle Fowl) đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen Quốc Tế EMBL/Genbank/DDBJ, làm nhóm ngoại (outgroup). Trên cơ sở đó họ đã thiết lập cây phát sinh và kết quả cho thấy cả 3 chủng Naganakidori có nguồn gốc từ gà chọi Shamo. Các kết quả này đã gợi ý rằng 3 mẫu gà cảnh đuôi dài đều có chung nguồn gốc mặc dù đặc điểm hình thái bên ngoài rất khác nhau. Hơn thế 3 chủng gà đuôi dài đầu tiên đã phân ly từ các con gà chọi Okinawa vốn có nguồn gốc địa lý gần với Nam Trung Quốc và Đông Nam Á hơn so với Honshu/Kyushu Nhật Bản. Điều này dẫn đến giả thiết rằng gà đuôi dài Nhật Bản đầu tiên đƣợc đƣa đến Nhật Bản là gà chọi các vùng lân cận của vùng Nam Trung Quốc và Đông Nam Á. Nhƣ vậy có thể thấy trình tự nucleotide của vùng D-Loop là một công cụ hữu hiệu để đánh giá tính đa dạng di truyền và sự phân hóa bên trong loài và giữa các quần thể địa lý. 1.4.6. Tình hình nghiên cứu DNA ty thể gà ở Việt Nam Năm 1999, Kim Thị Phƣơng Oanh và cộng sự đã sử dụng phƣơng pháp đa hình các đoạn cắt giới hạn (RFLP) nghiên cứu vùng D-Loop của 3 loài gà lôi Việt Nam gồm: gà lôi đuôi trắng, trĩ bạc và gà lôi hông tía. Các kết quả thu đƣợc cho thấy sự sai khác về trình tự nhận biết các enzyme trong vùng trình tự nói trên [13]. Năm 2000 Nguyễn Hải Hà và cộng sự [3] đã tạo dòng phân tử đoạn gen điều khiển DNA ty thể của 2 loài gà lôi đặc hữu Việt Nam trong vector pBluescript KS (-) để chuẩn bị cho việc đọc và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 21 Năm 2006 Địch Thị Kim Hƣơng và cộng sự [6] đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1277 nucleotide của 2 mẫu giống gà Ác Tiềm, Lƣơng Phƣợng, đã phát hiện đƣợc 22 vị trí khác biệt về nuclotide giữa hai đại diện. Năm 2007 Lê Đức long và cộng sự đã giải trình tự và so sánh trình tự nucleotide vùng D-Loop của 3 đại diện gà Mông có nguồn gốc từ Điện Biên, Hà Giang và Yên Bái đƣợc nuôi tại trại gà Nông Lâm Thái Nguyên theo dự án gà sạch. Kết quả nghiên cứu đã xác định đƣợc trình tự vùng D-Loop gồm 1227 nucleotide của 3 mẫu gà nghiên cứu và đã xác định đƣợc 10 vị trí khác biệt về nucleotide giữa các đại diện của 3 mẫu gà này. Năm 2008 Nguyễn Trƣờng Huy và cộng sự [5] đã xác định đƣợc trình tự 300 nucleotide đầu tiên trong đoạn D-Loop của 4 mẫu thuộc 4 giống gà: Gà Ác, gà Mía, gà Hồ và gà Mông và so sánh với trình tự tƣơng ứng trên đoạn D-Loop 2 giống gà Leghorn và gà bản địa Lào. Dựa trên cây chủng loại phát sinh xây dựng đƣợc, có thể đƣa ra kết luận sơ bộ về mối quan hệ di truyền giữa các mẫu thuộc 4 giống gà nghiên cứu so với 2 giống gà đƣợc chọn để so sánh. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 22 Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Vật liệu nghiên cứu là mẫu máu của các giống gà: - Gà Ri Bắc Kạn (RI): Lông vàng, da vàng, chân vàng. - Gà Mông Bắc Kạn (Mo): Lông đỏ thẫm điểm đốm trắng nhỏ, da vàng, chân chì. - Gà Đa Cựa Bắc Kạn (Da): Lông màu đỏ thẫm, da vàng, chân vàng và có nhiều cựa. Các giống gà trên đƣợc lấy từ Bản Hậu - Xã Mỹ Phƣơng - Huyện Ba Bể - Tỉnh Bắc Kạn. 2.2. HÓA CHẤT VÀ THIẾT BỊ 2.2.1. Hóa chất Protease K (20mg/l); phenol:chloroform:Isoamyl alcohol (25:24:1); Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1); Agarose 0.8%; Tris-HCl (0.1M; pH7.5); NaOH 1M; H2O khử ion vô trùng; Ethidium bromide. Bộ hóa chất dùng để tách DNA tổng số của hãng Biosciences, Sigma. Dung dịch đệm PBS (phosphate Buffer Saline) 10x, NaCl 8g; KCl 0.2g; Na2HPO4 1.44g; KH2PO4 0.24g. Dẫn nƣớc đến 100ml. Dung dịch đệm tách tế bào (Lysis buffer): Tris - HCl (10mM, pH8); EDTA (10mM, pH8); NaCl 0.1M; SDS 2.1%. Dung dịch đệm TAE dùng trong kĩ thuật điện di: Tris base; CH3COOH; EDTA (0.5mM, pH8). Bộ hóa chất dùng cho PCR (dNTPs, MgCl2, enzym chịu nhiệt...) Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45l 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 23 Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8 Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 2.2.2. Thiết bị Các thiết bị và hóa chất đƣợc sử dụng thuộc sở hữu của phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen và Phòng Công nghệ ADN ứng dụng - Viện Công Nghệ Sinh Học. Các thiết bị sử dụng trong đề tài - Bể ổn nhiệt hãng Tempette Junior Tech - Cân phân tích hãng metter Toledo, Thụy Sỹ - Máy li tâm hãng Sorvall - Máy điện di hãng PowerPac 300, Mỹ - Máy khuấy trộn hãng OSI, Rotolab - Máy làm khô chân không hãng Speed Vac Sc 110A- Savan, Mỹ - Máy PCR-PTC 100 hãng MJ Research, Mỹ - Máy chụp ảnh hãng Bio-Rad, Mỹ - Lò vi sóng hãng Samsung, Hàn Quốc - Pipetman các loại hãng Gilson, Pháp - Tủ lạnh sâu -20oC, -84oC do hãng Sanyo, Nhật Bản sản xuất. - Máy gene AmpPCR System 9700 do hãng Applied Biosystems, Mỹ sản xuất. - Máy xác định trình tự tự động ABI PRISMTM3100 Genetic Analyser do hãng Applied Biosystems, Mỹ sản xuất. 2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu của động vật • Nguyên tắc chung Màng tế bào đƣợc phá vỡ bằng các chất tẩy mạnh, DNA trong và ngoài nhân đƣợc giải phóng cùng với các protein. Sau đó DNA đƣợc tinh sạch nhờ Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 24 proteinase K và phenol trong hỗn hợp phenol: chloroform:isoamylalcohol. Cuối cùng, DNA đƣợc tủa bằng cồn 100% và thu lại bằng phƣơng pháp ly tâm. • Quy trình kĩ thuật Làm tan máu đông lạnh ở 37-39oC trong bể ổn nhiệt khoảng 1 giờ, chia máu vào các ống eppendof 1,5 ml với thể tích 500µl/ống, tách chiết DNA tổng số theo phƣơng pháp của Sambrook và Russell [35] các bƣớc nhƣ sau: Bƣớc 1: Hòa tan 500 µl PBS vortex và ly tâm ở 6000 v/p, 15 phút, 4oC, đổ dịch, thu cặn. Bƣớc 2: Thêm 1ml dung dịch đệm tách (buffer lysis) và 10 µl proteinase K. Mẫu thu đƣợc ủ ở 65oC trong 1h, sau đó để ở nhiệt độ phòng, chia vào mỗi ống Epp 500 µl dịch. Bƣớc 3: Bổ sung một lƣợng tƣơng đƣơng Phenol: Chlroform: Isoamyl alcohol (tỷ lệ 25:24:1), vortex kỹ, sau đó ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4oC. Hút pha trên vào ống mới. Bƣớc 4: Thêm một thể tích tƣơng đƣơng Chloroform: Isoamyl alcohol (24:1), vortex và ly tâm ở 12000 v/p, 15 phút, 4oC. Thu pha trên. Bƣớc 5: Thêm CH3COONa một lƣợng bằng 1/10 thể tích dung dịch trong ống. Thêm 3 thể tích cồn 100%, để ở tủ lạnh -20oC trong 15h (qua đêm). Bƣớc 6: Ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC để thu DNA. Tiếp đó, bổ sung 500µl cồn 70% để rửa, ly tâm ở 12000v/p, 15 phút, 4oC, bỏ dịch và thu cặn. Bƣớc 7: Làm khô cặn trong máy sấy, hòa tan cặn trong 50 µl H2O, búng nhẹ. 2.3.2. Kĩ thuật điện di DNA trên gel agarose • Nguyên tắc chung Điện di là kĩ thuật dùng để tách và định lƣợng axit nucleic với các kích thƣớc và hàm lƣợng khác nhau. Kĩ thuật này dựa trên một đặc tính cơ bản của axit nucleic là các đại phân tử tích điện âm do sự có mặt của gốc PO4 3- trên bề Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 25 mặt. Do đó, khi đặt axit nucleic trong điện trƣờng với cƣờng độ dòng điện và hiệu điện thế thích hợp, chúng sẽ di chuyển dần về phía cực dƣơng. Gel đƣợc sử dụng trong kĩ thuật điện di có thể là gel agarose hoặc polyacrylamid. Trong thí nghiệm này chúng tôi đã dùng gel agarose 0,8 bởi nồng độ này phù hợp kích thƣớc trung bình của các đoạn DNA cần phân tích (1-20kb). • Quy trình kĩ thuật Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,8g agrose vào 100ml dung dịch đệm TAE. Đun trong lò vi sóng cho đến khi thu đƣợc dung dịch trong suốt. Để nguội đến khoảng 50-60oC, đổ dung dịch agarose vào khay đã cài sẵn răng lƣợc. Sau 30 phút gel đông lại thì rút răng lƣợc ra và đặt bản gel vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE. Tra mẫu DNA: Trộn một lƣợng mẫu thích hợp (3 µl) với đệm tra mẫu (2,5 µl), tra vào các giếng trên bản gel. Điện di với dòng điện một chiều có hiệu điện thế 100V, dòng 60-80mA trong khoảng 30 phút. Sau khi kết thúc điện di, lấy bản gel ra khỏi khuôn và ngâm vào dung dịch EtBr nồng độ 0,5 µl/ml. Lấy bản gel ra sau 10-15 phút và rửa trong nƣớc sạch. Quan sát và chụp ảnh bằng máy Bio-Rab. 2.3.3. Phƣơng pháp điện di SDS-PAGE • Nguyên tắc SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi [26].Trong phƣơng pháp này, các phân tử protein đƣợc phân tách theo trọng lƣợng dƣới tác dụng của điện trƣờng không đổi. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các protein có kích thƣớc khác nhau sẽ di chuyển về điện cực trái dấu. Các phân tử protein gắn với SDS nên chúng sẽ tích điện âm, do đó sự khác biệt về điện tích đƣợc loại trừ. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 26 Khi protein đƣợc chạy trong điện trƣờng không đổi, phức hệ protein- SDS sẽ di chuyển xuyên qua các lỗ gel polyacrylamid với vận tốc phục thuộc vào hình dáng, kích thƣớc phân tử. Khi đó protein sẽ đƣợc phân tách thành các băng, vạch khác nhau. Gel thƣờng đƣợc sử dụng với nồng độ từ 5%-15% và có thể đƣợc chạy theo chiều nằm ngang hoặc chiều thẳng đứng. • Phƣơng pháp Máu ngoại vi đƣợc lấy khoảng 3ml -5ml từ ba đại diện của ba giống gà . Để mẫu máu tại nhiệt độ phòng trong 3h. Sau đó ly tâm 3000 vòng/phút trong 15 phút. Hút chuyển phần huyết thanh sang eppendorf mới. Mẫu huyết thanh sau đó đƣợc giữ tại điều kiện -25oC hoặc -75oC. Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di biến tính (SDS-PAGE) Kỹ thuật SDS-PAGE đƣợc thực hiện theo LaemLi, 1970 .Các thiết bị, hóa chất đƣợc sử dụng trong kỹ thuật SDS-PAGE do hãng Bio-Rad cung cấp. Protein đƣợc phân tách trong gel polyacrylamide với các nồng độ khác nhau. Đối với các protein có trọng lƣợng phân tử từ 6 kDa-160 kDa, gel 10%, 12.6% và 15% (w/v) thƣờng đƣợc sử dụng. Trong nghiên cứu này, SDS- PAGE đƣợc tiến hành trên gel 12.6% với các thành phần cơ bản nhƣ sau cho 3 mẫu huyết thanh của 3 dòng gà thí nghiệm đã pha loãng 30 lần. Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE Gel cô 5% : 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-Cl pH 6.8, 10 l 10% (w/v) SDS, 0,35 ml acrylamid 30 % (w/v), 1,3 ml H2O, 20 l 10% (w/v) APS, 2 l TEMED Gel tách 12,6%: 4,5 ml: 1,125 ml 1,5 M Tris-Cl pH 8.8, 45l 10% (w/v) SDS, 0,9 ml 50% glycerol, 1,89 ml acrylamid 30% (w/v), 0,55 ml H2O, 30 l 10% (w/v) APS, 3 l TEMED Đệm hòa mẫu 5x: 25% (v/v) glycerol, 14,4 mM 2-mercapto ethanol, 2% (w/v) SDS, 0,1 (w/v) bromophenol blue, 60 mM 1M Tris-Cl pH 6.8 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 27 Đệm điện di: 25 mM TrisCl, 192 mM glycine, 0,1% (w/v) SDS, pH 8.3 Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 2 vùng điện thế: (i) 75V trong 30 phút và (ii) 150V cho đến khi thuốc nhuộm trong mẫu bắt đầu đi ra khỏi bản gel. Kết thúc quá trình điện di, bản gel đƣợc nhuộm bằng Coomassie Brilliant Blue R-250. Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0.1% (w/v) Coomassie Brilliant Blue, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phút, bản gel đƣợc tẩy màu bằng dung dịch tẩy (30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi có thể quan sát thấy . 2.3.4. Nhân vùng điều khiển D-Loop bằng kĩ thuật PCR Kĩ thuật phản ứng chuỗi dùng enzyme polimerase (polimerase chain reaction = PCR hay PCR Technology) lần đầu tiên đƣợc Mullis và cộng sự mô tả năm 1986. • Nguyên tắc: Phản ứng chuỗi polimerase là một kĩ thuật đơn giản, cho phép khuếch đại invitro một trình tự DNA lên hàng triệu lần trong vài giờ. Điều này rất thuận lợi cho việc phát hiện những trình tự hiếm trong các bộ gene từ những đoạn DNA ngắn đƣợc phân lập hoặc từ một lƣợng rất nhỏ lấy ra đƣợc khuếch đại cho các thử nghiệm sinh học, y học và nông nghiệp. Đồng thời nó giúp cho các nhà sinh học phân tử nghiên cứu cấu trúc trình tự DNA trong bộ gene của các cơ thể sinh vật khác nhau. Phản ứng chuỗi polimerase đƣợc thực hiện khi có DNA mẫu, 2 đoạn mồi, Taq polimerase, bốn loại deoxyronucleotit triphotphat( dATP, dTTP, dGTP, dCTP), dung dịch đệm và ion Mg2+. Phản ứng chuỗi PCR đƣợc thực hiện trên thiết bị nhân DNA. Một chu kì PCR gồm 3 giai đoạn cơ bản có nhiệt độ khác nhau: - Giai đoạn tách chuỗi DNA: DNA bị biến tính từ dạng kép sang sợi đơn ở nhiệt độ 94o- 95oC trong khoảng thời gian rất ngắn (khoảng 1- 1.5 phút) Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 28 - Giai đoạn gắn mồi: Nhiệt độ phản ứng đƣợc hạ thấp xuống 40- 65oC cho phép hai đoạn mồi gắn DNA mẫu ở vị trí tƣơng đồng theo nguyên tắc bổ sung ( A - T, G - X) ở hai đầu DNA cần nhân. - Giai đoạn kéo dài: Ở nhiệt độ 72oC DNA Taq polimerase hoạt động kéo dài DNA từ đoạn mồi và hai đoạn DNA mới đƣợc tổng hợp theo nguyên tắc bổ sung từ hai đầu đoạn DNA khuôn ban đầu. Sau một chu kì gồm 3 giai đoạn nhƣ trên, một đoạn DNA khuôn đƣợc nhân lên thành hai, các đoạn DNA đƣợc nhân bản trong mỗi chu kì lại đƣợc coi là DNA khuôn cho chu kì nhân bản tiếp theo. Chính vì vậy sau k chu kì nhân bản sẽ tạo ra 2k DNA giống đoạn DNA khuôn ban đầu. • Nguyên liệu - DNA khuôn (Teplate) - Cặp mồi H1255- L16725 chuyên biệt. Ở đây, H(Heavy) và L( Light) là kí hiệu chuỗi nặng và chuỗi nhẹ, còn chữ số là vị trí nuclotide đầu 3' của primer trong trình tự đầy đủ của mtDNA ở gà [15]. - Bộ hóa chất: Dung dịch đệm có chứa NH4 + , dNTPs 10mM, MgCl2 10mM, Taq DNA polymerase của hãng Fermentas. - Nƣớc khử ion vô trùng. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen cho một mẫu với tổng thể tích 25 µl nhƣ trong bảng 2.1. Bảng 2.1 Thành phần phản ứng khuếch đại gen Nƣớc 10,85 µl Buffer 2,5 µl MgCl2 4 µl dNTPs 2,5 µl Mồi H1255-F 0,5 µl Mồi L16725-R 0,5 µl Taq DNA polymerase 0,15 µl DNA temp 4 µl Tổng thể tích 25 µl Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 29 Bảng 2.2. Chu trình nhiệt Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Ổn định Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 94oC 50oC 72oC 72oC 4oC Thời gian 4' 1' 1' 1'20" 10' ∞ Số chu kì 1 30 1 Sau khi kết thúc phản ứng, điện di kiểm tra sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%. 2.3.5. Tinh sạch sản phẩm DNA - Cân ống eppendoff (1,5ml) - Điện di toàn bộ sản phẩm PCR trên gel agarose 0,8%, sau đó tiến hành cắt gel trên máy soi DNA, thu lấy các vạch DNA đặc hiệu rồi cho vào ống eff đã cân. - Cân lại ống eff có chứa gel để biết đƣợc trọng lƣợng của băng gel ta vừa cắt. - Bổ sung dung dịch MBS (Membrane Binding Solution) với tỉ lệ 1mg gel: 1 µl dung dịch MBS và ủ hỗn hợp ở nhiệt độ 50-60oC để gel tan hoàn toàn. - Hút dịch gel hòa tan vào các vi cột, giữ ở nhiệt độ phòng trong khoảng 1 phút, sau đó ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC và đổ dịch thừa. - Bổ sung 700 µl dung dịch MBW (Membrane Wash Solution) và ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC, sau khi ly tâm cũng loại bỏ dịch. - Lặp lại bƣớc trên với 500 µl dung dịch MBW và ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC. Đổ dịch thừa và ly tâm lại trong 1 phút. - Chuyển vi cột sang 1 ống eff 1,5 ml mới, sau đó cho vào máy sấy khoảng 5 phút. - Bổ sung thêm khoảng 30-35 µl H2O 2x để ở nhiệt độ phòng 1 phút rồi ly tâm 12000 vòng trong 1 phút ở 4oC, cuối cùng bảo quản mẫu sau khi tinh sạch ở -20oC. Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 30 2.3.6. Phƣơng pháp xác định trình tự • Nguyên tắc chung Trình tự vùng D-Loop đƣợc xác định dựa trên nguyên tắc chung của phƣơng pháp Sanger: Tạo ra các đoạn Oligonuclotide hơn kém nhau 1 nucleotide, kết thúc bởi các ddNTP đã đƣợc đánh dấu huỳnh quang. Để tạo ra các đoạn kết thúc bằng các loại ddNTP khác nhau, chúng tôi tiến hành PCR sử dụng BigDya Terminator v3.1 Cycle Squencing Kit đã có chứa sẵn các hóa chất cần thiết của phản ứng nhân gen để đọc trình tự nhƣ dNTPs,ddNTPs, DNA polymerase... Do đó, chỉ cần bổ sung thêm DNA khuôn và mồi phù hợp. Phản ứng đƣợc thực hiện trong 1 ống vì 4 loại ddNTP đx đƣợc đánh dấu bằng các màu khác nhau. Thành phần của phản ứng khuếch đại gen để đọc trình tự bao gồm: Mồi 3,2pM, 200ng DNA khuôn, BigDye và nƣớc với tổng thể tích là 15 µl. Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cho PCR trong máy luân nhiệt GenAmp PCR System 9700 Các bƣớc Khởi động nóng Biến tính Gắn mồi Kéo dài Giữ mẫu Nhiệt độ 94oC 96oC 50oC 60oC 4oC Thời gian 1' 10'' 5'' 4' ∞ Số chu kì 1 25 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 31 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. ĐÁNH GIÁ ĐA DẠNG DI TRUYỀN CỦA BA MẪU GIỐNG GÀ Để tìm hiểu sự khác biệt ở mức độ phân tử giữa các cá thể thuộc ba giống gà Ri, Mông, Đa cựa chúng tôi tiến hành tách chiết DNA tổng số của chúng, dùng kỹ thuật PCR để nhân đoạn điều khiển trong ty thể, xác định trình tự của vùng D-Loop. Từ đó, so sánh các trình tự này để tìm ra sự khác biệt giữa chúng. 3.1.1. Tách chiết và tinh sạch DNA tổng số từ máu gà Để tiến hành đánh giá đa dạng di truyền các giống gà, vấn đề quan trọng đầu tiên là phải thu nhận đƣợc DNA tổng số ở dạng tinh sạch và không bị phân hủy bởi các tác nhân cơ học hay hóa học. Có nhiều phƣơng pháp tách chiết DNA từ máu động vật nhƣng việc lựa chọn một phƣơng pháp tách chiết có nhiều ƣu điểm và phù hợp với đối tƣợng nghiên cứu là rất quan trọng. Vì mẫu sử dụng trong thí nghiệm này là mẫu máu cho nên chúng tôi đã lựa chọn phƣơng pháp có sử dụng protease K và SDS của Sambrook và Russel để tách chiết DNA. Trƣớc tiên, máu đông đƣợc làm tan trong bể ổn nhiệt ở 39oC trong 2 giờ. Trong điều kiện về nhiệt độ và thời gian nhƣ vậy, plasminogen trong huyết tƣơng sẽ đƣợc chuyển sang dạng hoạt động là plasmin, chất này phân hủy các protein nhƣ fibrin, fibrinopeptit, prothrombin, nhờ đó mà các tế bào đƣợc giải phóng. Sau khi rã đông đem ly tâm dung dịch máu đã đƣợc hòa tan trong dung dịch đệm PBS. Dung dịch muối n._.