Nghiên cứu chuyển nạp GEN vào cây hoa cẩm chướng bằng phương pháp AGROBACTERIUM TUMEFACIENS kết hợp sóng siêu âm

chuyển gen gián tiếp nhờ vector mang gen chuyển. Phương pháp chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm Gần đây, sóng âm được ứng dụng rộng rãi trong nhiểu lĩnh vực liên quan nhờ khả năng thúc đẩy hiện tượng cavitation xảy ra. Sự tạo và vỡ bọt (cavitation) đóng vai trò như một trung gian để nhận năng lượng và tập trung năng lượng của sóng âm, chuyển năng lượng này sang dạng có ích cho hóa học. Hiện tượng cavitation có thể gây tổn thương tế bào, làm chết tế bào hoặc tạo lỗ (kênh) trên màng tế bào tạm thời. Sự tạo lỗ tạm thời trên màng bởi sóng âm được gọi là sonoporation. Khả năng tạo nên các lỗ màng này giúp gen cần chuyển (các đoạn DNA) dễ dàng vào trong tế bào, có thể tạo được các thể tái tổ hợp với bộ gen của tế bào chủ. Cơ chế tạo các lỗ màng Siêu âm trong môi trường lỏng sản sinh ra một năng lượng lớn do nó gây nên một hiện tượng vật lý đó là cavitation (sự tạo và vỡ bọt), quá trình này phụ thuộc vào môi trường phản ứng (môi trường đồng thể lỏng rất khác so với cavitation ở bề mặt tiếp xúc rắn-lỏng). Siêu âm được chiếu xạ qua môi trường lỏng tạo ra một chu trình dãn nở, nó gây ra áp suất chân không trong môi trường lỏng. Hiện tượng cavitation xảy ra khi áp suất chân không vượt quá so với độ bền kéo của chất lỏng, độ bền này thay đổi tùy theo loại và độ tinh khiết của chất lỏng (độ bền kéo là ứng suất tối đa mà chất lỏng có thể chịu được khi kéo). Thông thường sự tạo-vỡ bọt bắt nguồn từ những chỗ yếu trong chất lỏng như một lỗ hổng chứa khí phân tán lơ lửng trong hệ hoặc là những vi bọt (microbubble) tồn tại thời gian ngắn trước khi sự tạo-vỡ bọt xảy ra. Những vi bọt này qua sự chiếu xạ của siêu âm thì sẽ hấp thu dần năng lượng từ sóng và sẽ phát triển. Sự phát triển của bọt phụ thuộc vào cường độ của sóng. Ở cường độ sóng cao, những bọt này sẽ phát triển nhanh thông qua tương tác quán tính. Nếu chu kỳ giãn nở của sóng đủ nhanh, bọt khí được giãn ra ở nửa chu kỳ đầu và nửa chu kỳ còn lại là nén bọt, nhưng bọt chưa kịp nén thì lại được giãn tiếp, cứ thế bọt lớn dần lên và vỡ. Ở cường độ âm thấp hơn bọt khí cũng hình thành theo quá trình chậm hơn. Hình 1.1: Sóng siêu âm và hiện tượng cavitation (Nguồn: Sonication of Biosolids) Khi bọt phát triển tới kích thước không thể phát triển tiếp được (ở cả 2 trường hợp cường độ sóng cao và thấp), bọt không hấp thu năng lượng được nữa, không tiếp tục giữ được hình dạng của nó. Và dưới áp lực từ chất lỏng bên ngoài đẩy vào trong, kết quả là bọt sẽ vỡ vào trong. Đặc biệt trong môi trường lỏng-rắn, khi hiện tượng cavitation xảy ra gần bề mặt phân cách lỏng - rắn thì nó khác so với trong hệ đồng thể. Ở hệ đồng thể, trong quá trình vỡ bọt, bọt vẫn ở dạng hình cầu đối xứng. Tuy nhiên, ở ranh giới phân cách rắn lỏng thì sự vỡ bọt ở dạng rất bất đối xứng và tạo ra một sự phun chất lỏng với tốc độ rất cao. Sự có mặt của bề mặt rắn là nguyên nhân của sự vỡ bất đối xứng, hình thành một vòi chất lỏng bắn vào bề mặt rắn với tốc độ rất cao. Thế năng của sự giãn nở bọt được chuyển thành động năng của vòi phun chất lỏng, nó hình thành và di chuyển vào phía trong, đâm xuyên qua bóng khí. Những vòi này bắn vào bề mặt rắn với một lực rất lớn, quá trình này tạo ra một lỗ thủng tại vị trí bị tác kích. Nhờ vậy mà sóng âm có thể tạo lỗ trên màng tế bào tạo điều kiện cho các gen chuyển hay các vector mang gen chuyển xâm nhập vào tế bào. Sau quá trình chuyển gen, dựa vào các gen chỉ thị, thực hiện quá trình sàng lọc để lựa chọn các thể chuyển gen (GMO – Genetically Modified Organism). Nuôi cấy hoặc chăm sóc các thể chuyển gen và kiểm tra sự biểu hiện gen mới trong thể chuyển gen, tiếp tục chọn lọc để tạo được các thể chuyển gen theo ý muốn có tính ổn định di truyền. Ngoài kỹ thuật chuyển gen trực tiếp bằng sóng siêu âm kể trên, còn nhiều kỹ thuật chuyển gen trực tiếp khác được sử dụng như kỹ thuật chuyển gen qua ống phấn, chuyển gen bằng phương pháp sốc nhiệt, chuyển gen bằng phương pháp điện xung, chuyển gen bằng kỹ thuật PEG (Polyethylen glycol), và hiện đại nhất là chuyển gen bằng súng bắn gen …[3, 4, 5, 12, 28] Phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ vi khuẩn Agrobacterium Đây là hệ thống chuyển gen vào thực vật thành công lần đầu tiên vào năm 1983 bằng cách định vị và thao tác trên plasmid của loài vi khuẩn gây bệnh Agrobacterium tumefaciens và Agrobacterium rhizogenes. Hệ thống chuyển gen này đem lại việc chuyển gen một cách tự nhiên, sự biểu hiện gen trên đối tượng đích và còn bao gồm hệ thống chọn lọc. Hiện nay, A. tumefaciens đã được xử lý để trở thành công cụ chuyển gen tự nhiên đem lại hiệu quả bậc nhất. Nguyên lý của phương pháp là Ti plasmid của vi khuẩn được cải biến cấu trúc di truyền bằng cách cắt bỏ một đoạn dài chứa T-DNA, đồng thời gắn thêm vào một đoạn của plasmid khác tạo nên các vector chuyển gen có kích thước phù hợp, mang các gen giúp khả năng xâm nhiễm tự nhiên của vi khuẩn vào thực vật đồng thời mang các gen chuyển mong muốn. Agrobacterium tumefaciens (hình 1.2) thuộc nhóm vi khuẩn gram âm, hình que, di động, không sinh bào tử, sống tự do trong đất. A. tumefaciens gây bệnh khối u trên thân và rễ thực vật (hình 1.3). Hình 1.2: Hình vi khuẩn Agrobacterium dưới kính hiển vi (nguồn: www.bio.davidson.edu/.../method/dsmeth/ds.htm) Hình 1.3: Nốt sần gây ra bởi vi khuẩn Agrobacterium trên thực vật. (nguồn: Khả năng gây bệnh của vi khuẩn này dựa trên Ti plasmid. Khi cây bị nhiễm A. tumefaciens qua các vết thương, các khối u được hình thành ngay trên chỗ lây nhiễm. Sự hình thành khối u được tiếp diễn mà không nhất thiết cần sự có mặt của vi khuẩn, do vi khuẩn đã chuyển một đoạn DNA của Ti plasmid (T-DNA) nhập vào bộ gen của cây bị bệnh. Phân tích các khối u của cây cho thấy sự hình thành các chất mới như nopaline, octopine và agropine gọi chung là opine (không tồn tại ở cây bình thường). Ti plasmide của vi khuẩn A. Tumefaciens Ti plasmid là nhân tố gây biến nạp tự nhiên ở thực vật, có kích thước khoảng 200kp và gồm có 3 vùng chủ yếu: Vùng T-DNA (transfer-DNA) mang hai hệ gen: (1) hệ gen gây khối u onc (oncogenic), chứa ít nhất 3 gen chịu trách nhiệm tổng hợp các phytohormon auxin và cytokinin nên liên quan đến việc sản sinh và duy trì sự phân chia tế bào liên tục. (2) hệ gen mã hóa cho một số enzym điều khiển quá trình tổng hợp các dẫn xuất của các acid amin hay đường, gọi là opine. Vùng T-DNA được giới hạn tại hai đầu bởi một đoạn nucleotide dài 25bp được gọi là các T-DNA borders (bờ T-DNA). Bờ trái thì không cần thiết nhưng bờ phải tuyệt đối quan trọng cho việc chuyển đoạn T-DNA vào tế bào thực vật. Nhờ khả năng sinh tổng hợp auxin và cytokinin mà các tế bào khối u của thực vật bị nhiễm có khả năng tăng trưởng. Những chủng khác của A. tumefaciens chứa các loại Ti plasmid khác nhau sẽ mã hóa cho sự sản xuất các opine khác nhau. Opine là các amino acid bất thường (không có trong mô bình thường) được vi khuẩn sử dụng như đài chất dinh dưỡng để sinh sản nhanh chóng. Vùng dị hóa opine (opine catabolism), sự dị hóa opine được kiểm soát bởi các loci (noc đối với nopaline, occ đối với octapine) trên nhánh phải của Ti plasmid. Vùng Vir (Virulence region) vùng độc, chứa các gen vir, giữ vai trò quan trọng trong việc chuyển T-DNA vào hệ gen của tế bào thực vật. Gen tạo khối u Sinh tổng hợp auxin Khởi đầu sao chép Vùng vir Vùng dị hóa opine Vùng tiếp hợp Sinh tổng hợp cytokinin Sinh tổng hợp opine Bờ trái Bờ phải Hình 1.4: Sơ đồ vector Ti plasmid (nguồn: Hoạt động của Ti plasmid và cơ chế xâm nhiễm, chuyển gen vào tế bào thực vật Hình 1.5. Quá trình chuyển gen vào tế bào thực vật (nguồn: Việc phân tích di truyền A. tumefaciens đã được áp dụng để phân lập các thể “determinant” đặc biệt của vi khuẩn. Gen định vị trên vùng vir của Ti plasmid cũng như trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn đều quan trọng như nhau. Tiến trình gắn vào của vi khuẩn và tiến trình di chuyển DNA có liên quan đến hiện tượng tiếp hợp của vi khuẩn. Phân tử DNA di chuyển từ một tế bào vi khuẩn đến tế bào thực vật nhiều hơn di chuyển từ vi khuẩn đến vi khuẩn. Cơ chế chuyển Ti-plasmid từ vi khuẩn A. tumefaciens vào tế bào thực vật còn chưa sáng tỏ. Bản thân vi khuẩn không bị tế bào nuốt chửng, mà khi tiếp xúc với tế bào thực vật, T-DNA vòng từ Ti plasmid tiết ra rồi chuyển vào cây để gắn bền vững với bộ gen (genome) của cây. Ở giai đoạn đầu tiên, sự kết gắn giữa Agrobacterium và tế bào cây bị tổn thương được kiểm soát bởi hai loci “virulence” của vi khuẩn (chvA và chvB) định vị trên nhiễm sắc thể của vi khuẩn, không có trên Ti plasmid. Hiện nay người ta nhận ra rằng các vi khuẩn này đáp ứng với các hợp chất phenol có tính chất tín hiệu nhất định của thực vật như acetosyringon (AS) và α-hydroxyaxetosyringon (OH-AS) trong trường hợp cụ thể đã được ghi nhận (Stachel và cs.1985) được tiết ra bởi các cây bị thương mẫn cảm. Các phân tử nhỏ này gây cảm ứng gen độc (vir) được mã hóa trên plasmid Ti. Phân tích vùng vir (regulon) của Ti plasmid thấy rằng có 6 vùng (operon) cần cho sự dịch chuyển T-DNA đến tế bào thực vật, các loci được đặt tên là virA, B, C, D, E, và G. Sự điều tiết của vùng vir được thực hiện thông qua sự thể hiện gen có tính cấu trúc của virA và virG. Protein virA cần di chuyển tín hiệu AS từ vị trí kế bên mô cây bị thương xuyên qua màng tế bào vào tế bào của A. tumefaciens. AS hỗ trợ với protein virG kích thích sự thể hiện virB, C, D, E. Sự thể hiện các gen này cần phải cắt T-DNA ra khỏi Ti plasmid và đưa nó vào tế bào cây. Vai trò của các gen trong vùng vir như sau VirA mã hóa cho protein có chức năng như hóa thụ quan thực hiện vận chuyển qua màng. VirG mã hóa cho protein điều hòa dương đóng vai trò thông tin đến loci của những gen vir khác. VirC và virD giữ chức năng là những endonuclease tại vị trí đặc biệt trên những trình tự lặp lại của T-DNA, tạo những sợi T-DNA mạch đơn (T-strand). VirE bám bên ngoài, bảo vệ sợi T-DNA mạch đơn trong suốt quá trình vận chuyển qua tế bào thực vật . VirB mã hóa cho protein chuyên chở trên bề mặt tế bào vi khuẩn, giúp T-DNA được vận chuyển vào trong tế bào thực vật. Sự tích hợp vào bộ gen thực vật với cơ chế chưa xác định rõ và được xem là xảy ra qua sự tái tổ hợp không đúng luật (illegitimate recombination) (Gheysen và cs, 1991; Lehman và cs, 1994; Puchta, 1998). Sau khi tích hợp vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA sẽ được biểu hiện. Sự sản xuất các cytokinin, các indoleacetic acid làm rối loạn sinh trưởng bình thường của tế bào, gây ra sự tạo thành các khối u là một môi trường giàu dinh dưỡng cho vi khuẩn. Bên cạnh đó, sự tổng hợp và giải phóng các hợp chất chuyển hóa mới – các opine (dẫn xuất acid amine đặc biệt) và agrocinopine (dẫn xuất đường được phosphoryl hóa) cung cấp cho Agrobacterium nguồn dinh dưỡng mà không một vi khuẩn nào khác có thể sử dụng được.[3, 4, 9, 10, 13, 14, 15] Một tiến bộ trong phương pháp chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium là hoạt chất acetosyringone hỗ trợ cho quá trình chuyển gen. Acetosyringone (tên hóa học: 1-(4-Hydroxy-3,5-dimethoxyphenyl) ethanol), công thức phân tử là C10H1204, có tác dụng kích thích quá trình biến nạp gen của A. tumefaciens vào tế bào mô vì acetosyringone là hợp chất được sản sinh khi tế bào bị tổn thương. Đây là tín hiệu quan trọng trong quá trình xâm nhiễm của vi khuẩn vào tế bào thực vật. Ở nồng độ cao, acetosyringone sẽ được nhận diện bởi protein virA- receptor trên màng vi khuẩn. Đây là một protein cần thiết để chuyển phân tử tín hiệu acetosyringone từ vị trí kế bên mô cây bị tổn thương, xuyên qua màng tế bào, vào tế bào của Agrobacterium. Sau khi vào tế bào của Agrobacterium, acetosyringone hoạt động như một nhân tố có tính chất hoạt hóa virA hỗ trợ với virG-protein để kích thích sự thể hiện virB, virC, virD, virE. Sự thể hiện các gen này cần thiết cho việc cắt T-DNA ra khỏi Ti plasmid và đưa nó vào tế bào thực vật. [14, 19, 29] Hình 1.6: Acetosyringone giúp hoạt hóa vùng vir trong quá trình chuyển gen (nguồn: Nhờ hoạt chất acetosyringone mà hiệu suất chuyển gen cao gấp nhiều lần. Trong bài báo cáo của Sheikholeslam SN, Weeks DP năm 1987 với đề tài ‘Acetosyringone promotes high frequency transformation of Arabidopsis thaliana explants by Agrobacterium tumefaciens’ đã ghi nhận với việc bổ sung acetorycinone, hiệu suất chuyển gen là 55 đến 63% thay vì bình thường là 2-3%. Ngoài dùng vi khuẩn là vector chuyển gen thì virus cũng có thể là một dạng vector. Nhiều virus như CaMV (Cauliflower mosacic virus), Geminivirus, virus đốm thuốc lá… được dùng làm vector chuyển gen thực vật. Chuyển gen nhờ virus có một số thuận lợi như virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể thực vật và có thể mang đoạn DNA lớn hơn so với khả năng của plasmid. Tuy nhiên, khi sử dụng virus cần một số lưu ý: hệ gen của virus phải là DNA, virus có thể chuyển từ tế bào này sang tế bào khác qua các lỗ ở vách tế bào thực vật, virus có khả năng mang được đoạn DNA mới, có khả năng xâm nhiễm vào nhiều loại cây, không có tác hại đáng kể cho thực vật. Hiện nay, sử dụng virus chuyển gen thực vật còn ít vì DNA virus khó biến nạp vào hệ gen thực vật. [ 3, 4, 13] 1.1.1.3 Phương pháp chuyển gen dùng Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm. Ứng dụng tạo lỗ tạm thời trên màng tế bào - sonoporation của sóng siêu âm trong chuyển gen vào tế bào và mô phát triển nhanh chóng trong những năm gần đây đặc biệt là một số các dòng tế bào đã được chuyển gen thành công. Trong tế bào, hiện tượng cavitation khởi động và điều khiển rất khó, tuy nhiên có thể điều chỉnh nhờ sóng âm tác động đến các bọt khí. Tùy vào đối tượng chuyển gen mà thời gian tạo sóng âm và tần số sóng âm được điều chỉnh. Để tăng hiệu suất chuyển gen thì các nghiên cứu hiện nay đang tập trung vào phương pháp chuyển gen dùng Agrobacterium tumefaciens kết hợp sóng siêu âm trong chuyển gen vào mô, tế bào thực vật (sonication-assisted Agrobacterium-mediated transformation) được viết tắt là SAAT. Các bọt khí cực nhỏ (bubbles) được ứng dụng để chuyển gen vào trong mô và tế bào thực vật. Hình 1.7: Hiện tượng cavitation (sự tạo và vỡ bọt) Hình 1.8: Ảnh hưởng của sóng âm trên tế bào. A, B, C, D : những tế bào được xử lý sóng âm E, F: tế bào không được xử lý sóng âm. Hình 1.9: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào nhờ sóng âm. Sóng âm làm tăng hiện tượng cavitation, tạo lỗ (kênh) trên màng, các T-DNA của A. tumefaciens plasmid sẽ qua lỗ màng vào trong tế bào thực vật dễ dàng và nhanh chóng. Hình 1.10: Cơ chế chuyển DNA vào trong tế bào nhờ Agrobacterium tumefaciens kết hợp với sóng âm. Sau khi T-DNA của A. tumefaciens vào được bên trong tế bào nó nhanh chóng tích hợp vào bộ gen thực vật, các gen trên T-DNA sẽ được biểu hiện, sự tổng hợp và giải phóng các hợp chất chuyển hóa mới – các hợp chất mà ta mong muốn sẽ được thực hiện. Phương pháp SAAT mới được nghiên cứu và ứng dụng nhưng mang lại nhiều thành công và hứa hẹn trong công nghệ chuyển gen nói chung và chuyển gen thực vật nói riêng. [3, 12, 15, 28] Đoạn gen tách dòng, gen chỉ thị, gen chọn lọc. 1.1.2.1 Đoạn gen cần tách dòng và gen ipt (isopentenyl transferase) Gen cần tách dòng hay còn gọi là gen cần thiết thường là những gen mã hóa các protein, enzym hoặc gen mã hóa các đặc điểm quí (năng suất cao, khả năng chống chịu bệnh…) cần thiết cho con người trong thực tiễn sản xuất hoặc trong nghiên cứu. Gen cần tách dòng có thể được chuẩn bị theo hai con đường: tách chiết từ bộ gen vi sinh vật, động thực vật, con người, hoặc tổng hợp nhân tạo các oligonucleotid. Trong thực tế, các gen mang đặc điểm quí thường được tách chiết từ vi sinh vật hay các sinh vật bậc cao. Trong thí nghiệm này, đoạn gen cần tách dòng là gen tổng hợp cytokinin isopentenyl transferase (ipt). Nghiên cứu về sinh lý đã cho thấy là trong nhiều loài, cytokinin có thể ức chế lão suy và mức độ cytokine nội sinh đó giảm đi cùng với tiến trình lão suy (reviewed by Gan and Amasino, 1996). Biểu hiện của gen ipt sẽ dẫn đến việc sản xuất cytokinin. Nhiều chiến lược (với các promoter khác nhau) đã được thực hiện để điều khiển sự biểu hiện của gen ipt trong cây chuyển gene, gồm các promoter cảm ứng nhiệt, vết thương, sáng và những promoter đặc hiệu. Hầu hết những cây chuyển gen cấu trúc có chứa gen ipt đều biểu hiện chậm lão suy, cũng như có những bất thường về phát triển và phát sinh hình thái. Điều này có thể do cytokinin tác động mạnh đến quá trình phát triển ngoài lão suy, và việc sản xuất quá mức cytokinin trước khi lão suy xảy ra sẽ can thiệp vào sự phát triển bình thường của cây. Để tránh vấn đề này, promoter SAG12 đặc hiệu cao cho lão suy được dùng để điều khiển biểu hiện của gen ipt (Gan and Amasino, 1995). Promoter này kích hoạt biểu hiện của gen ipt tại thời điểm bắt đầu lão suy, dẫn đến tăng lượng cytokinin, ngăn cản quá trình lão suy. Lượng cytokinin ức chế lão suy sẽ tăng đến một ngưỡng nào đó và bắt đầu làm yếu đi promoter đặc hiệu lão suy, do đó ngăn cản được việc tích trữ cytokinin ở một mức độ mà nó có thể can thiệp tới những mặt phát triển khác của cây.[3, 9] Isopentenyl transferase Lão suy Cytokinin SAG 12 promoter Lượng Cytokinin cao Hình 1.11: Promoter đặc hiệu lão suy SAG12 được kết hợp với gen tổng hợp cytokinin isopentenyl transferase. (Sự bắt đầu của lão suy kích hoạt promoter SAG 12 điều khiển sự sản xuất của cytokinin. Cytokinin được tạo ra ức chế quá trình lão suy, và nếu lượng cytokinin cao sẽ quay lại ức chế hoạt động promoter SAG để ngăn cản sự sản xuất quá mức các cytokinin) Những nghiên cứu chuyển gen ipt ở cây trồng Các nghiên cứu chuyển nạp gen ipt của các tác giả Gan và cs, 1996; Wang và cs, 1997 trên cây thuốc lá (Nicotiana tabacum L.) cho thấy hàm lượng cytokinin tăng lên trong cây chuyển gen và do đó làm chậm sự lão hoá của lá và hoa. Năm 2001, công trình "Ảnh hưởng của biểu hiện gen ipt promoter SAG12 đối với sự phát triển và lão suy ở cây cải xà lách (Lactuca sativa L. cv. ‘Evola’) chuyển gen", tác giả Matthew S. McCabe và cộng sự thực hiện chuyển gen ipt điều khiển bởi promoter SAG12 bằng phương pháp gián tiếp qua vi khuẩn A. tumefaciens trên đối tượng lá mầm cây cải xà lách. Kết quả cho thấy hàm lượng cytokinin tăng trong cây chuyển gen và làm chậm đáng kể sự lão suy lá trong quá trình phát triển cây cũng như sau thu hoạch của cây chuyển gen. Năm 2003, Công trình "Sản xuất thừa các cytokinins trong hoa cây thuốc lá cảnh (Petunia) được chuyển gen ipt - promoter SAG12, làm chậm lão suy tràng hoa và giảm sự nhạy cảm đối với Ethylene". Hsiang Chang và cộng sự đã nghiên cứu chuyển gen ipt được điều khiển bởi promoter SAG12 vào cây hoa Dã yên (Petunia hybrida cv. ‘V26’) bằng phương pháp dùng vi khuẩn A. tumefaciens. Kết quả cho thấy hoa của các dòng cây chuyển gen có tuổi thọ dài hơn 6-10 ngày so với đối chứng và hoa cây chuyển gen kém mẫn cảm hơn đối với ethylen ngoại sinh. Kết luận quan trọng của nghiên cứu này là có thể sử dụng gen ipt trong nghiên cứu chuyển nạp gen tạo giống cây trồng tăng tuổi thọ của hoa như hoa phong lan, cẩm chướng, lily… Năm 2006, công trình nghiên cứu "Sự chậm lão suy lá trong cây cỏ linh lăng (Medicago sativa) chuyển gen ipt được kiểm soát bởi promoter đặc hiệu lão suy SAG12" do Ornella Calderini và cộng sự thực hiện, tạo cây cỏ linh lăng tăng giá trị về chất và lượng khi sử dụng làm nguồn thức ăn gia súc. Phương pháp chuyển gen gián tiếp qua A. tumefaciens. Một nghiên cứu quan trọng gần đây nhất do hai nhóm nghiên cứu của Mỹ và Nhật Bản ( Rivero và cs, 2007) đã tạo ra cây biến đổi gen có khả năng chống chịu được hạn hán bằng phương pháp chuyển gen ipt vào cây thuốc lá. Các nhà nghiên cứu hy vọng phát hiện này sẽ giúp giảm những thiệt hại về mùa màng do hạn hán và cho phép sản xuất lương thực tại các vùng thiếu nước. 1.1.2.2 Gen chỉ thị, gen chọn lọc Bằng các phương pháp sinh học phân tử có thể tạo ra các cấu trúc DNA plasmid, trong đó ngoài các promoter, các gen của vi khuẩn Agrobacterium giúp cho DNA plasmid gắn được vào bộ gen thực vật, gen ngoại lai (gen cần tách dòng)… còn có các gen giúp phân lập ra tế bào hoặc mô thí nghiệm. Các gen được lắp ghép vào DNA của plasmid với mục đích này được gọi là gen chỉ thị chọn lọc hay gen chỉ thị sàng lọc. Gen chỉ thị chọn lọc thường dùng nhất là các gen mã hóa cho một số enzyme chỉ có trong vi khuẩn ở điều kiện tự nhiên mà không có trong giới thực vật. Sau khi chuyển gen, nếu thấy enzyme vi khuẩn hoạt động thì có thể suy ra là toàn bộ T-DNA plasmid đã được gắn vào bộ gen của thực vật và gen ngoại lai mà ta cần chuyển đã trở thành một bộ phận của bộ máy di truyền thực vật. Các gen chỉ thị thường dùng nhất : gusA, gfp. Gen uidA (hay còn gọi là gen gusA): Gen mã hóa cho sinh tổng hợp enzyme β-glucuronidase. β-glucuronidase là một hydrolase xúc tác cho sự phân giải các β-glucuronide. Sản phẩm của quá trình chuyển hóa sẽ cho màu xanh chàm đặc trưng, dễ nhận biết thông qua dung dịch là X-Gluc ( 5-bromo-4-chloro-3-indolyl- β-D-glucuronide). Gen gfp: Gfp tự nhiên tách chiết từ sứa hấp thu ánh sáng xanh dương ở bước sóng 395 nm với một đỉnh nhỏ hơn ở 470 nm, và phát ra ánh sáng xanh lục với đỉnh phát sáng ở bước sóng 508 nm. Sự phát sáng này rất ổn định. Gfp họat động như một protein phát sáng thứ cấp, nhận năng lượng từ qequorin được hoạt hóa. Quá trình phát sáng của gfp là một quá trình tự xúc tác không cần sự có mặt của bất kỳ cofactor hay enzyme nào. Các gen chọn lọc thường dùng: hpt, Bar, npt2. Gen hpt: mã hóa hygromycin phosphotransferase kháng kháng sinh hygromcin có nguồn gốc từ giống vi khuẩn Streptomyces hygroscopius. Gen này có tác dụng mạnh nên thường dùng ở nồng độ thấp hơn so với loại kháng sinh khác như kanamycin. (Bùi Chí Hữu - Nguyễn Thị Lang, 2004. Di truyền phân tử. Nxb Nông Nghiệp.) Gen Bar: mã hóa cho phosphinothricin acetyltransferase (PAT) có khả năng kháng thuốc diệt cỏ. Gen Bar có nguồn gốc từ vi khuẩn Streptomyces hygroscopius (Thompson và cs.1987) Gen npt2: mã hóa neomycin phosphotransferase nguồn gốc từ vi khuẩn Escherichia coli kháng lại neomycin.[3] Các phương pháp phân tích cây chuyển gen Ta nhận biết mô thí nghiệm mang gen chuyển nhờ vào các phương pháp sinh học hiện đại như phương pháp PCR, phương pháp phân tích điện di, phương pháp Southern blot, phương pháp thử GUS, phương pháp thử khả năng kháng hygromycin, kanamycin, PPT (phosphinothiricin) của cây tái sinh... Phương pháp thử khả năng kháng hygromycin, kanamycin, PPT (phosphinothiricin) của cây tái sinh. Các mô sau thí nghiệm chuyển gen được cấy chuyền trên môi trường có kháng sinh hygromycine, kanamycine hoặc PTT với nồng độ thích hợp tùy từng loài thực vật để theo dõi khả năng sinh trưởng, tái sinh tạo chồi, rễ. Mẫu mô đã chuyển gen sẽ sinh trưởng bình thường, mẫu mô không có gen chuyển sẽ chết. Có thể kiểm tra bằng cách nuôi cấy một số loại mô hay mảnh lá, đoạn thân trên môi trường tạo mô sẹo hoặc tạo chồi có chứa các tác nhân nói trên với nồng độ thích hợp. Trong môi trường này, mô cấy đối chứng sẽ chết, mô cấy có khả năng tạo mô sẹo và chồi bình thường là mô mang gen chuyển. Có thể thử invivo khả năng kháng hygromycin (gen hpt), kanamycin (gen kanR), PPT (gen bar) như sau: các mảnh lá của cây 1 tháng tuổi được trồng trong nhà kính với môi trường MS (không có vitamin và đường), bổ sung 0.5mg/l BA và nồng độ thích hợp hygromycin, kanamycin hoặc PPT tùy thuộc vào loài thực vật. Theo dõi hiện trượng mất màu diệp lục trong khoảng từ 5 – 7 ngày. Mảnh lá của cây chuyển gen vẫn giữ được màu diệp lục, còn mảnh lá của cây đối chứng sẽ chết (hygromycin), bị hạt trắng (kanamycin) hay bị cháy vàng (PPT). Ngoài ra, tính kháng PPT của cây cũng được kiểm tra bằng cách quét 0.3 – 1.0mg/l PTT có bổ sung 0.1mg/l Tween 20% trên phiến lá, ghi nhận khả năng kháng PPT trong 7 ngày. Có thể dùng thuốc trừ cỏ BASTA (vì PPT có hoạt chất của thuốc này) để kiểm tra cây mang gen bar. Cây chuyển gen lá sẽ vẫn xanh, cây đối chứng sẽ bị cháy vàng. Phương pháp thử GUS Gen gusA được tách từ E. coli (Jelferson và cs, 1987) là gen mã hóa cho sinh tổng hợp β-glucuronidase. β-Glucuronidase là một hydrolase xúc tác sự phân giải các β-glucuronide. β-glucuronide thường dùng nhất trong phản ứng nhận biết sự tồn tại của gen gusA là X-Gluc (5-bromo-4-4cloro-3-indolyl- β-D-glucuronide). Dung dịch X-Gluc không màu dưới tác động của enzyme β-Glucuronidase sẽ chuyển màu xanh chàm rất đặc trưng. Trong tự nhiên, β-Glucuronidase không tồn tại trong thực vật, vì vậy gusA là một gen chỉ thị rất tốt trong công nghệ gen thực vật. Mặt khác, sản phẩm màu của gen gusA rất bền vững và phản ứng rất ít bị ảnh hưởng của pH nên rất thuận lợi cho việc theo dõi. GusA có mặt trong E. coli và nhiều vi sinh vật khác, vì vậy, thí nghiệm yêu cầu độ vô trùng nghiêm ngặt. Cách thử Ủ mô sẹo, lá, thân, rễ... cây chuyển gen trong thuốc thử GUS ở 370C trong 24 giờ. Rửa mẫu bằng dung dịch cồn 70% cho đến khi mất màu diệp lục và quan sát màu xanh chàm dưới kính lúp. Lưu ý : Đối với mẫu có biểu hiện mạnh, ta có thể nhận thấy ngay màu xanh đặc trưng sau khi ủ mẫu qua đêm mà không cần phải rửa bỏ diệp lục tố [3]. Phương pháp PCR (Polymerase chain reaction) Phương pháp này dựa trên sự khám phá hoạt tính sinh học ở nhiệt độ cao của DNA polymerase được tìm thấy trong các sinh vật ưa nhiệt (vi khuẩn sống trong các suối nước nóng). Phần lớn các DNA polymerase chỉ làm việc ở nhiệt độ thấp. Nhưng ở nhiệt độ thấp, DNA xoắn chặt vì vậy DNA polymerase không có nhiều khả năng làm biến tính phần lớn các phần của phân tử. Nhưng các polymerase chịu nhiệt này hoạt động ở nhiệt độ rất cao, có thể lên đến 100oC. Ở nhiệt độ này DNA (dạng thẳng) sẽ bị biến tính. Có 3 giai đoạn chính trong một chu kỳ phản ứng PCR và chúng được lặp đi lặp lại nhiều lần (chu kỳ) (thường từ 25 đến 75 chu kỳ). Giai đoạn biến tính (denaturation) Trong giai đoạn này phân tử DNA mẫu bị biến tính ở nhiệt độ cao (thường là từ 94-95oC, lớn hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử) trong vòng 30 giây đến 1 phút, tất cả các liên kết hydro giữa hai mạch của phân tử bị bẻ gãy và tạo thành các DNA sợi đơn. Giai đoạn lai Nhiệt độ được hạ thấp ( thường từ 40-70oC, thấp hơn nhiệt độ nóng chảy của mồi được sử dụng khoảng từ 3-5oC) cho phép các mồi bám vào các phân tử DNA sợi đơn, đánh dấu phần DNA cần được khuếch đại. Giai đoạn này kéo dài từ 30 giây đến một phút (còn được gọi là giai đoạn ủ). Nếu nhiệt độ quá thấp thì các mồi sẽ gây nên nhiều lỗi và kết quả là sẽ tạo nên nhiều sản phẩm phụ. Nếu nhiệt độ quá cao thì phản ứng sẽ không có kết quả. Công thức để xác định nhiệt độ nóng chảy là Tm=4(G+C)+2(A+T). Giai đoạn kéo dài Nhiệt độ được tăng lên đến 72oC giúp cho DNA polymerase xúc tác tổng hợp DNA tốt nhất. Công việc của DNA polymerase là di chuyển dọc theo DNA sợi đơn và sử dụng nó làm khuôn để tổng hợp sợi DNA mới bổ sung với DNA mẫu bằng cách kéo dài các phần đã được đánh dấu bởi các mồi. Thời gian của giai đoạn này phụ thuộc vào kích thước của DNA mẫu, thường kéo dài từ 30 giây đến nhiều phút. Ở giai đoạn này của chu kỳ cuối cùng, thời gian được tăng thêm vài phút để các sợi DNA chưa được sao chép xong hoàn thành qúa trình tổng hợp. Sau mỗi chu kỳ, số bản sao của DNA mẫu lại được tăng gấp đôi. Ðây là sự nhân bản theo cấp số nhân. Như vậy cứ 1 phân tử DNA mẫu, sau phản ứng PCR với n chu kỳ sẽ tạo thành 2n bản sao phân tử DNA. Các thành phần chủ yếu của phản ứng PCR : DNA mẫu, mồi đặc hiệu, enzyme chịu nhiệt (Tag-polymerase), các loại Nu, thành phần môi trường là nước tinh khiết, dung dịch đệm và ion Mg 2+. Ưu điểm của phương pháp PCR là chỉ cần một thời gian ngắn đã cho một số lượng DNA theo mong muốn. Sản phẩm của phản ứng PCR được phân tách trên gel agarose đã nhuộm ethimidium bromide và quan sát dưới máy chiếu tia UV. [3, 4, 5 ] Phương pháp phân tích điện di Phương pháp này được sử dụng trong cả phân tích định tính lẫn trong việc thu nhận mẫu nucleic acid. Nguyên tắc của phương pháp điện di là dưa vào đặc tính cấu trúc của các nucleic acid. Đó là các đại phân tử tích điện âm đồng đều trên khắp bề mặt nên khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về cực dương của điện trường. Tính linh động của phân tử trong bản thạch (gel) dưới tác động của một điện trường được tính theo công thức: Log u = Log u0 - KrC Trong đó, Log u0 là tính linh động của phân tử trong môi trường lỏng, Kr là hằng số làm chậm (retardation coefficient) do cấu trúc gel đồng thời cũng phụ thuộc vào khối lượng phân tử của phân tử nucleic acid, C là nồng độ của gel. Gel agarose - loại gel thông dụng nhất, một phần do thao tác đơn giản, thường dùng để phân tách những đoạn có kích thước trong khoảng 0.5 – 2. kb. Gel được đổ trên một giá thể nằm ngang và điện di được thực hiện theo phương nằm ngang. Các nucleic acid trong gel agarose sẽ hiện hình dưới tia tử ngoại nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide. Chất này có khả năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang. Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ. Sau điện di, gel dược chiếu sáng bằng tia UV (λ ≈ 300 nm), nucleic acid sẽ hiện hình dưới dạng những vạch màu đỏ cam. Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose, người ta sử dụng một yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử (molecular weight marker - MWM). Đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DNA – DNA ladder), thông thường, người ta sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể λ được thủy giải bởi enxyme giới hạn HindIII.[3,4] Phương pháp Southern blot Từ sự phát hiện chuỗi DNA có tính chất tương đồng với probe, phương pháp Southern blot (Southern, 1975) là một đóng góp rất to lớn trong sinh học phân tử, đặc biệt là kỹ thuật “recombinant DNA”, và xét nghiệm sự thể hiện gen được chuyển nạp, giúp ta hiểu rõ về cấu trúc gen, sự thể hiện gen, và tổ chức bộ gen (Meinkoth và Wahl 1984). Ngoài ra, Southern blot còn giúp chúng ta chuẩn đoán các bệnh di truyền và phát hiện các pathogen là vi trùng hoặc virus (Karcher 1996). Sau quá trình lai DNA, người ta rửa màng lai để loại bỏ các mẫu dò không bắt cặp chuyên biệt với DNA cố định trên màng. Cuối cùng người ta sử dụng kĩ thuật phóng xạ tự ghi (autoradiography) để định vị các phân tử lai. Trong kĩ thuật này, người ta đặt một film nhạy cảm với tia xạ áp sát vào màng lai. Các phân tử lai (đúng hơn là mẫu dò có đánh dấu phóng xạ) sẽ tác động lên fi._.