Nghiên cứu chế biến và bảo quản chế phẩm koji nếp than

ần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 2 LỜI CẢM TẠ Xin chân thành cảm ơn thầy cô trường đại học Cần Thơ, khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng và bộ môn Công nghệ thực phẩm đã trang bị cho tôi những kiến thức chuyên môn cần thiết để tôi hoàn thành luận văn này. Xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Công Hà và cô Lâm Thị Việt Hà đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm luận văn tốt nghiệp. Chân thành cảm ơn quí thầy cô phụ trách phòng thí nghiệm bộ môn Công nghệ thực phẩm và bộ môn Chăn nuôi - thú y đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn tất các thí nghiệm. Và sau cùng tôi gởi lời cảm ơn đến các bạn lớp Công nghệ thực phẩm khóa 28 về tất cả những gì các bạn đã dành cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Chân thành cảm ơn! Cần thơ, ngày 15 tháng 6 năm 2007 SINH VIÊN THỰC HIỆN PHẠM THẾ DƯƠNG THANH THẢO Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 3 TÓM TẮT Với mục tiêu tìm ra qui trình chế biến chế phẩm enzyme thô trên môi trường nếp than từ nấm mốc Aspergillus oryzae, hướng tới sản xuất rượu nếp than. Đề tài được thực hiện gồm 2 thí nghiệm: - Khảo sát độ ẩm nguyên liệu, nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy tối thích Aspergillus oryzae sinh sản và phát triển, có khả năng tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất. - Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than không làm chết nấm mốc và giảm hoạt tính của enzyme amylase. Qua quá trình thí nghiệm đã cho các kết quả như sau: - Độ ẩm nếp than nuôi cấy: 60%. - Nhiệt độ môi trường nuôi cấy tối ưu: 300C. - Thời gian thu nhận chế phẩm koji thích hợp: 2 ngày. - Nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than sau nuôi cấy: 500C,16 - 18h Trong quá trình chế biến chế phẩm koji nếp than cần quan tâm đến những nhân tố trên. Giữa chúng có sự tương tác qua lại và mỗi nhân tố có ảnh hưởng nhất định đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm mốc Aspergillus oryzae cũng như khả năng tổng hợp enzyme amylase. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 4 MỤC LỤC Lời cảm ơn....................................................................................................i Tóm tắt .........................................................................................................ii Mục lục.........................................................................................................iii Danh sách bảng.............................................................................................v Danh sách hình .............................................................................................vi Chương1. GIỚI THIỆU ................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ......................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu .......................................................................1 Chương 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................2 2.1 Giới thiệu sơ lược về chế phẩm koji................................................2 2.2 Nguyên liệu làm chế phẩm koji nếp than .......................................2 2.3 Nấm mốc Aspergillus oryzae ..........................................................4 2.4 Hệ enzyme......................................................................................5 2.4.1 Enzyme amylase ....................................................................5 2.4.2 Enzyme protease....................................................................6 2.5 Phương pháp nuôi cấy ....................................................................7 2.5.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt ................................................7 2.5.2 Phương pháp nuôi cấy chìm...................................................8 2.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp enzyme amylase ....9 2.7 Sấy .................................................................................................10 2.7.1 Đặc điểm của quá trình sấy ....................................................11 2.7.2 Độ ẩm cân bằng .....................................................................12 2.8 Các công trình nghiên cứu ..............................................................13 2.8.1 Các công trình nghiên cứu trong nước....................................13 2.8.2 Các công trình nghiên cứu nước ngoài ...................................13 2.9 Các vấn đề cần nghiên cứu và giải quyết trong đề tài ......................14 2.9.1 Qui trình ................................................................................15 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 5 2.9.2 Giải thích qui trình.................................................................15 Chương 3. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ...............16 3.1 Phương tiện thí nghiệm...................................................................16 3.1.1 Địa điểm, thời gian ................................................................16 3.1.2 Đối tượng nghiên cứu ............................................................16 3.1.3 Thiết bị, hoá chất ...................................................................16 3.1.4 Môi trường nuôi cấy ..............................................................16 3.2 Phương pháp nghiên cứu ................................................................17 3.2.1 Phương pháp phân tích...........................................................17 3.2.2 Phương pháp thí nghiệm ........................................................17 3.3 Nội dung và bố trí thí nghiệm .........................................................17 3.3.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát độ ẩm môi trường, nhiệt độ môi .. trường và thời gian nuôi cấy Aspergillus oryzae....................17 3.3.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than .19 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .....................................................22 4.1 Hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình nuôi cấy ở nhiệt độ môi trường, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy khác nhau......22 4.2 Hoạt tính enzyme amylase trong quá trình sấy chân không ở những nhiệt độ khác nhau ............................................................27 Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .........................................................32 5.1 Kết luận ..........................................................................................32 5.2 Đề nghị ...........................................................................................32 Tài liệu tham khảo ........................................................................................34 Phụ lục..........................................................................................................vii Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 6 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc ..........................................4 Bảng 2: Thành phần hóa học của nếp than ....................................................9 Bảng 3: Hoạt tính của enzyme amylase.........................................................22 Bảng 4: Biến đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ môi trường, độ ẩm môi trường và thời gian nuôi cấy ...........................................25 Bảng 5:Thay đổi trạng thái ẩm của sản phẩm koji trong quá trình sấy ...........27 Bảng 6: Hoạt tính của enzyme amylase trong quá trình sấy ở những nhiệt độ sấy khác nhau .....................................................................30 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 7 DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Nếp than...........................................................................................3 Hình 2: Aspergillus oryzae............................................................................4 Hình 3: Chế phẩm koji gạo ...........................................................................13 Hình 4: Quá trình chế biến koji .....................................................................15 Hình 5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 1 ..................................................................19 Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2 ..................................................................21 Hình 7: Hoạt tính enzyme amylase................................................................22 Hình 8: Chế phẩm koji nếp than sau 2 ngày nuôi cấy ....................................26 Hình 9: Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase ( chế phẩm được nuôi ở 300C, 60% ẩm, 2ngày) ..............................26 Hình 10: Phản ứng thủy phân tinh bột của enzyme amylase ( chế phẩm được nuôi ở 270C, 70% ẩm, 3 ngày) .............................26 Hình 11:Thay đổi độ ẩm của chế phẩm theo thời gian sấy.............................27 Hình 12: Chế phẩm koji nếp than trước khi sấy.............................................29 Hình 13: Chế phẩm koji nếp than sau khi sấy................................................29 Hình 14: Chế phẩm koji nếp than sau khi nghiền ..........................................29 Hình 15: Thay đổi hoạt tính của enzyme amylase theo nhiệt độ sấy ..............30 Hình 16: Hoạt tính của enzyme amylase theo thời gian sấy ở 400C ...............31 Hình 17: Hoạt tính của enzyme amylase theo thời gian sấy ở 500C ...............31 Hình 18: Quá trình chế biến koji nếp than đề xuất.........................................33 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 8 Chương 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1 Đặt vấn đề Các loại sản phẩm lên men truyền thống là một trong các sản phẩm lên men phổ biến của các dân tộc trên thế giới. Đó là một loại sản phẩm được sản xuất thủ công, mang sắc thái kinh nghiệm và bản sắc riêng của từng dân tộc, được truyền từ đời này sang đời khác. Theo thời gian các sản phẩm lên men truyền thống càng được mở rộng cả về chủng loại lẫn về phương pháp chế biến. Hầu như mỗi dân tộc trên thế giới đều có riêng những sản phẩm thực phẩm lên men truyền thống của mình. Sản phẩm này có thể là một bộ phận không thể tách rời trong đời sống hàng ngày của dân tộc. Bộ môn Công nghệ thực phẩm trường đại học Cần Thơ nghiên cứu rượu nếp than nhằm phát triển thành sản phẩm truyền thống của đất nước. Bên cạnh qui trình công nghệ sản xuất rượu thì vấn đề được quan tâm nhiều nhất là nguồn vi sinh vật hay những chế phẩm enzyme dùng trong lên men nếp than. Do đó enzyme được lấy từ nhiều nguồn: enzyme thương mại, enzyme được trích ly từ hạt ngũ cốc nảy mầm hay enzyme của vi sinh vật, chúng được so sánh và chọn ra nguồn thích hợp cho rượu nếp than có chất lượng tốt nhất. Chỉ tiêu để đánh giá chất lượng của enzyme, cụ hể là hệ enzyme amylase dùng trong sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa nhiều tinh bột như nếp than là khả năng thủy phân tinh bột thành đường đơn, cung cấp chất dinh dưỡng cho quá trình lên men tiếp theo. Ngày nay do ưu thế về nhiều mặt, vi sinh vật trở thành nguồn thu enzyme amylase chủ đạo. Tùy theo mục đích sử dụng người ta thường sản xuất các loại chế phẩm: chế phẩm enzyme thô, chế phẩm enzyme bán tinh khiết, chế phẩm enzyme tinh khiết, chế phẩm vi sinh vật có khả năng tổng hợp enzyme mạnh. Ba dạng chế phẩm đầu, người ta quan tâm đến hoạt tính xúc tác và độ tinh sạch của enzyme. Dạng sau cùng, được quan tâm cả đến hoạt tính sinh học và khả năng sinh sản, phát triển của vi sinh vật tạo ra enzyme đó. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Chế phẩm koji nếp than thuộc dạng chế phẩm enzyme thô với nấm mốc Aspergillus oryzae trong môi trường nuôi cấy là nếp than. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Nuôi cấy Aspergillus oryzae trên môi trường nếp than, khảo sát độ ẩm nguyên liệu, nhiệt độ môi trường và thời gian nuôi cấy Aspergillus oryzae sinh sản và phát triển, có khả năng tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất. Xác định nhiệt độ sấy chế phẩm koji nếp than không làm giảm hoạt tính của enzyme amylase. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 9 Chương 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu sơ lược về chế phẩm koji Thuật ngữ “Koji” có nghĩa là hạt ngũ cốc lên mốc, nó còn có tên khác như: “shui” ở Trung Quốc, “ku” ở Hàn Quốc và “koji” ở Nhật. Chế phẩm koji được xem như là một bước tiến quan trọng trong quá trình lên men từ các nguồn thực phẩm đa dạng ở Đông Á. Cơ bản đó là quá trình nuôi cấy mốc trên môi trường dinh dưỡng rắn để tạo ra những enzyme thủy phân từ hạt đậu nành hay những hạt ngũ cốc khác. Vì vậy koji được xem là một nguồn đa dạng các enzyme xúc tác sự thủy phân nguyên liệu thô rắn để hoà tan các chất có trong nguyên liệu cung cấp chất dinh dưỡng cho nấm men và vi khuẩn phát triển ở giai đoạn lên men tiếp theo. Ngoài những enzyme chính có trong nguyên liệu thì còn nhiều chất quan trọng khác, cần thiết cho giai đoạn lên men thứ hai hoặc tạo mùi thơm cho sản phẩm. Phương pháp làm koji được truyền đến Nhật vào thế kỷ XIV bởi những tăng ni đạo Phật. Mặc dù nó bắt nguồn từ Trung Quốc nhưng việc nghiên cứu và phát triển hướng tới cải tiến phương pháp này lại được thực hiện ở Nhật. Kết quả là hiện nay việc làm koji ở Nhật có sự khác biệt so với cách trước đây và dây chuyền này trở nên nổi tiếng khắp thế giới bởi người Nhật với thuật ngữ “koji”. Khi việc nuôi cấy mốc trên hạt ngũ cốc được quan tâm thì hàng loạt các sản phẩm lên men được sản xuất ở các nước trong đó có sản phẩm rượu gạo. Trung Quốc được coi là cái nôi của chế phẩm này nhưng ở các nước khác lại cho đó là phương pháp cổ truyền của cha ông họ, được truyền qua nhiều thế hệ. Trong các sản phẩm lên men thì rượu Saké (rượu gạo) của Nhật là bằng chứng tốt ở cả hai khía cạnh lịch sử và kỹ thuật. Do đặc tính có ích, dễ làm của koji đồng thời dây chuyền sản xuất koji ngày càng hiện đại đã thúc đẩy quá trình sản xuất tạo nhiều loại sản phẩm phi thực phẩm (enzyme công nghiệp, chất độc, thuốc chống vi sinh vật). Tóm lại koji là loại bán thành phẩm, được sử dụng như một nguồn cung cấp enzyme và những chất hóa học cần thiết cho quá trình lên men tiếp theo. 2.2 Nguyên liệu làm chế phẩm koji nếp than Nếp than là một đặc sản của Việt Nam và được trồng nhiều ở các tỉnh Hòa Bình, Bắc Giang, Lạng Sơn, Cao Bằng, Yên Bái và ở vùng Nam Bộ... Việc mở rộng hơn nữa diện tích trồng lúa nếp than ở các tỉnh trên và một số tỉnh khác là hoàn toàn có thể được khi nhu cầu chế biến nếp than tăng cao. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 10 Ở Nam Bộ, nếp than được chia ra thành bốn loại: Nếp cẩm Đức Hoà. Nếp đen Khánh Vinh. Nếp than Long Đất. Lúa lứa nếp cẩm. Các loại này có năng suất không cao, thường chỉ đạt 2,8 – 3,3 tấn/ha. Hiện nay dân vùng đồng bằng Nam Bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo. Theo cách này nếp than được chia thành hai loại: Nếp than đen tuyền. Nếp than hồng đỏ. Các sắc tố của nếp than dễ tan trong nước, vì thế sản phẩm rượu mang màu sắc đặc trưng của loại gạo nguyên liệu.Tuy khác nhau về hình thức bên ngoài nhưng các loại nếp than có thành phần hoá học không khác nhau nhiều. Trong những năm gần đây, khi mức thu nhập của người dân tăng nhanh thì nhu cầu sử dụng rượu nếp than cũng tăng nhanh, yêu cầu về chất lượng của sản phẩm cũng đòi hỏi ngày càng phải được nâng cao. Điều đó chứng tỏ sản xuất rượu nếp than của Việt Nam là hướng đi phù hợp và cần thiết. Tuy nhiên để nếp than trở thành rượu đặc sản thực sự thì cần phải có sự đầu tư thỏa đáng không chỉ khoa học, kỹ thuật, kinh nghiệm cổ truyền mà còn phải có kinh phí dành cho các cơ sở nghiên cứu và sản xuất chuyên ngành, tạo ra một bước “đột phá” về công nghệ, để tạo được một sản phẩm có chất lượng cao. Hình 1: Nếp than ( Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 11 2.3 Nấm mốc Aspergillus oryzae Aspergillus spp. hiện diện rất nhiều trong thiên nhiên, không phải loài nào cũng được sử dụng trong thực phẩm. Chẳng hạn trong số 278 loài Aspergillus spp. được tiến hành thử nghiệm thì chỉ có 34 loài tạo α - amylase và maltase với lượng đáng kể (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004). Một số loài có khả năng sinh độc tố gây ung thư. Loài vi sinh vật được dùng trong thí nghiệm là Aspergillus oryzae. Nấm sợi này có khả năng sinh tổng hợp enzyme amylase, protease, pectinase và cả cellulase tùy theo cơ chất cảm ứng mà ta đưa vào. Khi được tổng hợp, enzyme lẫn trong các thành phần môi trường, tan trong nước, có trong sinh khối của nó. Toàn bộ khối vật chất thu nhận được trong quá trình nuôi cấy bao gồm: sinh khối vi sinh vật, nước trong đó, enzyme trong và ngoài tế bào, và cả khối lượng môi trường mà vi sinh vật không sử dụng hết được gọi là chế phẩm enzyme thô. Aspergillus oryzae là loài hiếu khí bắt buộc, mới phát triển có màu trắng, khi già thì khuẩn ty chuyển sang màu vàng nên còn được gọi là nấm sợi màu vàng. Bảng 1: Điều kiện sinh trưởng của loài nấm mốc (Nguyễn Đức Lượng et al., 2004) Hình 2: Aspergillus oryzae (http:// www004.upp.so-net.ne.jp/ichi/r9707066.jpg) Độ ẩm pH môi trường Độ ẩm không khí Nhiệt độ nuôi Thời gian 45 ÷ 55 % 5,5 ÷ 6,5 85 ÷ 95 % 27 ÷ 30 0C 30 ÷ 36 giờ Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 12 2.4 Hệ enzyme Để thu amylase người ta thường dùng các giống nấm sợi Aspergillus, Rhizopus và một số loài của Neurospora, Mucor sinh tổng hợp mạnh mẽ không những chỉ có α -amylase mà cả glucoamylase (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Aspergillus oryzae được nuôi cấy trên môi trường nếp than nên các enzyme được tổng hợp chủ yếu là: amylase và protease. 2.4.1 Enzyme amylase Enzyme amylase bao gồm nhiều loại: α - amylase, β - amylase, γ - amylase, glucose isomease, pullulanose và isoamylase. Trong đó hoạt lực α -amylase, β - amylase, γ -amylase tiêu biểu cho quá trình thủy phân tinh bột thành đường glucose. • Enzyme α - amylase (1,4-α -glucan 4-glucanhydrolase) Có khả năng phân cắt các liên kết α -1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên và là enzyme nội bào (endoenzyme). α -amylase không chỉ có khả năng phân hủy hồ tinh bột mà còn có khả năng phân hủy cả hạt tinh bột nguyên vẹn. Sự thủy phân tinh bột của α -amylase trải qua nhiều giai đoạn. Trước tiên enzyme này phân cắt một số liên kết trong tinh bột tạo ra một lượng lớn dextrin phân tử thấp, sau đó các dextrin này bị phân hủy tiếp tục để tạo ra maltose và glucose. Sau thời gian tác dụng lâu dài, sản phẩm của quá trình thủy phân amylose là 13% glucose và 87% maltose. Còn sản phẩm thủy phân amylopectin là 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và isomaltose 8% do α - amylase không thể cắt được liên kết 1,6-glucoside ở mạch nhánh của phân tử amylopectin. Khả năng dextrin hóa của α -amylase rất cao do đó người ta còn gọi α -amylase là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột: - Giai đoạn dextrin hoá: Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp - Giai đoạn đường hoá: Dextrin tetra và trimaltose di- và monosaccharide Amylose oligosaccharide polyglucose Maltose maltosetriose maltotetrose α -amylase α -amylase α -amylase Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 13 • Enzyme β -amylase (1,4-α -glucan-maltohydrolase): β -amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α -1,4 glucan trong tinh bột, phân cắt từng tự từng gốc maltose một từ đầu không khử của mạch. Khác với α -amylase, nó hầu như không thủy phân hạt tinh bột nguyên lành mà thủy phân mạnh mẽ hồ tinh bột. β -amylase phân giải 100% amylose thành maltose và phân giải 54-58% amylosepectin thành maltose. Quá trình thủy phân amylosepectin được tiến hành từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng. Mỗi nhánh ngoài có từ 10-26 gốc glucose nên tạo thành 10-12 phân tử maltose. Khi gặp liên kết α -1,4 glucoside đứng kế liên kết α -1,6 glucoside thì nó ngừng tác dụng. Phần saccharide còn lại là dextrin phân tử lớn chứa rất nhiều liên kết α -1,6 glucoside cho màu tím đỏ với iod. Độ nhớt của dung dịch giảm chậm. Tác dụng của β -amylase lên tinh bột có thể biểu diễn bằng sơ đồ sau: Tinh bột 54-58% maltose + 42-46% dextrin Nếu cho cả α -amylase và β -amylase cùng tác dụng đồng thời lên tinh bột thì tinh bột bị thủy phân tới 95%. • Enzyme γ -amylase (glucoamylase, α -1,4-glucan-glucohydrolase) Glucoamylase là enzyme ngoại phân, thủy phân liên kết α -1,4 glucoside trong tinh bột, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch. Glucoamylase xúc tác thủy phân cả liên kết α -1,6 glucoside thành glucose. Tóm lại nó có thể thủy phân hoàn toàn tinh bột tới glucose. 2.4.2 Enzyme protease Protease là nhóm enzyme thủy phân các liên kết peptid (-CO-NH-) trong phân tử protein hoặc các polypeptid. Ngoài ra còn có peptidase. Protease phân hủy phân tử protein thành polyleptid và pepton, chúng có đặc tính đặc hiệu tương đối rộng. Tiếp theo đó la sự phân hủy các peptid phân tử nhỏ này thành các acid amin tự do dưới tác dụng của peptidase. Protease nấm mốc có khoảng pH hoạt động rộng hơn so với protease động vật và vi khuẩn. Protease của vi khuẩn hoạt động ở pH = 7 – 8. Còn protease của A. oryzae hoạt động trong khoảng pH = 3.5 – 9, tối thích ở pH = 7 – 8. Dựa vào khoảng pH hoạt động người ta chia protease thành ba loại: loại acid hoạt động ở vùng pH = 2.5 – 3, loại trung tính hoạt động ở pH = 6 – 6.5 và loại kiềm hoạt động trong khoảng pH = 8 – 11. (Lương Đức Phẩm, 1998) β -amylase Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 14 Theo Oresenko (1963) ngoài amylase canh trường bề mặt của Aspergillus- oryzae còn có protease acid và trung tính (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004), phân hủy protein thành các chuỗi peptid và amino acid. 2.5 Phương pháp nuôi cấy 2.5.1 Phương pháp nuôi cấy bề mặt Phương pháp nuôi cấy bề mặt là phương pháp nuôi cấy vi sinh vật đã được nghiên cứu và phát triển rất mạnh mẽ trong những năm đầu của thế kỷ XX. Sau đó, phương pháp nuôi cấy chìm được thay thế vào những năm 50 – 60 của thế kỷ trước. Phương pháp nuôi cấy bề mặt là tạo điều kiện cho vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường, phương pháp này lại được phục hồi rất mạnh vào những năm 1970 đến nay. • Những ưu điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt Dễ thực hiện. Qui trình công nghệ thường không phức tạp. Thực chất của phương pháp nuôi cấy bề mặt theo qui mô công nghiệp được xuất phát từ các quá trình lên men truyền thống của các nước. Ở đó người dân đã biết sử dụng hệ vi sinh vật tự nhiên. Người ta chỉ cần nấu (hoặc hấp) các nguyên liệu, để nguội và khi đó vi sinh vật trong không khí sẽ rơi xuống khối nguyên liệu, tự chúng phát triển tuân theo qui luật cạnh tranh trong tự nhiên. Những giống vi sinh vật nào đó có khả năng trao đổi chất mạnh, có khả năng phát triển mạnh sẽ lấn át các vi sinh vật khác. Và như vậy người ta đã đặt nền móng cho sự ra đời của công nghệ nuôi cấy bề mặt. Lượng enzyme tạo thành từ môi trường thường cao hơn rất nhiều so với nuôi cấy chìm. Đây là đặc điểm rất ưu việt rất quan trọng giải thích tại sao phương pháp nuôi cấy bề mặt hiện nay phát triển mạnh trở lại. Chế phẩm enzyme thô (bao gồm thành phần môi trường, sinh khối vi sinh vật, enzyme và nước) sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và dễ bảo quản. Không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hành công nghệ cũng như đầu tư vừa đơn giản vừa không tốn kém. Trong trường hợp nhiễm vi sinh vật lạ, dễ dàng xử lý. Môi trường đặc là môi trường tĩnh, không có sự xáo trộn nên khu vực nào bị nhiễm ta chỉ cần loại bỏ khu vực đó khỏi toàn bộ khối nuôi cấy. Những khu vực khác sẽ hoàn toàn được an toàn. • Những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy bề mặt Phải có diện tích lớn khi thực hiện phương pháp này. Trong phương pháp này, vi sinh vật phát triển trên bề mặt môi trường (môi trường lỏng và môi trường bán rắn) Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 15 nên cần rất nhiều diện tích. Trong những năm gần đây, người ta đã cải tiến các thiết bị để vi sinh vật có thể phát triển ở 4 mặt. Phương pháp nuôi cấy bề mặt khó cơ giới hoá, tự động hóa. 2.5.2 Phương pháp nuôi cấy chìm Phương pháp nuôi cấy chìm là vi sinh vật phát triển hẳn trong lòng môi trường. Chính vì thế người ta thường sử dụng môi trường lỏng. • Phương pháp nuôi cấy chìm có những ưu điểm Phương pháp nuôi cấy chìm thường chiếm diện tích ít. Quá trình nuôi cấy thường được thực hiện trong các thiết bị lên men. Các thiết bị lên men thường rất gọn. Phương pháp nuôi cấy chìm có thể tự động hóa và cơ giới hóa ở mức độ cao. Trong nuôi cấy chìm thường phải thiết lập hệ thống cánh khuấy và hệ thống thổi khí bằng hệ thống tự động hoàn toàn có thể thực hiện với bất kỳ dung tích nào của thiết bị lên men. Ngoài ra, ta có thể kiểm soát được nhiệt độ và điều hòa sự thay đổi nhiệt độ bằng hệ thống điều khiển tự động. Sử dụng hợp lý các chất dinh dưỡng trong môi trường. Enzyme thu được ít lẫn tạp chất. • Những nhược điểm của phương pháp nuôi cấy chìm Trong nuôi cấy chìm, sự nhiễm các vi sinh vật lạ nếu xảy ra sẽ gây ra sự nhiễm toàn bộ hệ thống trong một thời gian rất ngắn. Dung dịch lên men trong thiết bị lên men luôn luôn trong trạng thái nhờ hoạt động của cánh khuấy và hệ thống thổi khí. Do đó, chỉ cần một điểm nào trong môi trường bị nhiễm ngay lập tức toàn bộ hệ thống bị nhiễm, khi đó ta rất khó kiểm soát và giải quyết hậu quả do sự nhiễm vi sinh vật lạ gây nên. Phương pháp nuôi cấy chìm thường đòi hỏi chi phí rất lớn. Những chi phí này bao gồm chi phí cho hệ thống lên men, năng lượng cho cánh khuấy, cho quá trình hoạt động của hệ thống cung cấp khí trong suốt quá trình lên men Nồng độ enzyme trong canh trường thấp nên phải cô đặc, giá thành cao.( Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2002) Với những ưu nhược điểm của hai phương pháp nuôi cấy vi sinh vật được trình bày ở trên. Trong thí nghiệm này, nấm mốc Aspergillus oryzae sẽ được nuôi cấy theo phương pháp bề mặt. Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 16 2.6 Các nhân tố ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp hoạt tính amylase • Thành phần môi trường dinh dưỡng Yêu cầu cơ bản đối với thành phần của môi trường nuôi vi sinh vật tạo enzyme amylase cũng giống như yêu cầu đối với môi trường nuôi vi sinh tạo các enzyme khác là tính hoàn thiện. Hầu hết vi sinh vật đều hấp thụ cacbon chủ yếu ở dạng các hợp chất hữu cơ (tinh bột, dextrin,…) và oxy ở trong thành phần cấu tử cơ bản của môi trường và ở dạng oxy phân tử. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Cấu tử chính của môi trường vi sinh vật tạo amylase bằng phương pháp nuôi cấy bề mặt là nếp than. Bảng 2: Thành phần hoá học của nếp than ( Nguyễn Thị Hiền, Công nghệ sản xuất mì chính và các sản phẩm lên men cổ truyền) • Độ ẩm của nguyên Độ ẩm môi trường có ảnh hưởng trực tiếp đến sự sinh tổng hợp enzyme. Nếu độ ẩm môi trường tăng cao quá sẽ làm giảm độ thoáng khí, thấp quá sẽ kiềm hãm sự sinh trưởng và phát triển cũng như tạo enzyme. • Nhiệt độ nuôi Nhiệt độ luôn thay đổi trong quá trình nuôi do mốc thủy phân tinh bột sinh ra nhiệt, cần phải đảo trộn đuổi bớt nhiệt nhằm duy trì nhiệt độ cần thiết cho mốc phát triển. Nếu nhiệt độ cao quá hoặc thấp quá đều ảnh hưởng đến sinh trưởng và phát triển của nấm sợi, kéo theo sự giảm hoạt tính amylase. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) • Thời gian nuôi Thời gian nuôi để có lượng enzyme cực lớn thường được xác định bằng thực nghiệm. Sự tạo bào tử là hiện tượng không mong muốn vì thường làm giảm hoạt lực enzyme. Đối với đa số nấm mốc Aspergillus oryzae, sự tạo enzyme cực đại thường kết thúc khi nấm mốc bắt đầu sinh đính bào tử. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) Thành phần Hàm lượng (%) Nước 14 Protein 8,2 Lipid 1,5 Gluxit 74,9 Axit hữu cơ 0,6 Tro 0,8 Luận văn tốt nghiệp khóa 28 – 2007 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Công nghệ thực phẩm – Khoa Nông nghiệp và Sinh học ứng dụng 17 • pH Khi nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt pH môi trường ảnh hưởng ít, do môi trường có dung dịch đệm cao và hàm ẩm thấp, pH không thay đổi mấy trong quá trình nuôi. Tuy nhiên, pH ban đầu của môi trường cũng có ảnh hưởng không nhỏ tới sự phát triển của nấm sợi và sự tạo enzyme. Đa số nấm mốc phát triển tốt và tạo enzyme trong môi trường acid yếu, nên có thể dùng HCl, H2SO4 và acid lactic làm ẩm môi trường. (Nguyễn Đức Lượng và ctv, 2004) 2.7 Sấy Khi Aspergillus oryzae sinh tổng hợp enzyme amylase mạnh nhất, tiến hành sấy đến độ ẩm khoảng 12% sẽ thu được chế phẩm thô dạng khô (PGS – TS Đặng Thị Thu và ctv, 2004). Đối tượng của quá trình sấy là vật liệu ẩm. Vật liệu ẩm được chia làm 3 nhóm chính: - Nhóm 1: Vật keo đặc trưng - vật liệu của nhóm này khí tách ẩm vẫn giữ nguyên kích thước và tính đàn hồi dẻo. - Nhóm 2: Vật ma._.