Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản rượu nếp than sản xuất bằng công nghệ Enzyme và nấm men thuần chủng

công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng” do Trần Thị Hồng Chúc thực hiện và báo cáo, đã được hội đồng chấm luận văn thông qua. Cán bộ hướng dẫn Hội đồng phản biện Nguyễn Công Hà Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng i LỜI CẢM TẠ Em xin gởi lời cảm ơn đến tất cả các thầy cô trong phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm đã giúp đỡ em trong quá trình thực hiện đề tài này, các thầy cô đã tận tình và hỗ trợ đến mức có thể nhằm giúp em hoàn thành tốt luận văn này. Đặc biệt, em xin gởi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến thầy Nguyễn Công Hà đã tận tình chỉ dạy, giúp em tích lũy được những kiến thức bổ ích trong suốt thời gian qua. Cuối cùng xin gởi đến quí Thầy Cô và tất cả ban bè lời chúc tốt đẹp nhất. Sinh viên thực hiện Trần Thị Hồng Chúc Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng ii TÓM TẮT Kết quả của mục tiêu nghiên cứu đề tài này sản phẩm sau khi lên men có chất lượng và đạt yêu cầu, đồng thời tìm ra điều kiện bảo quản thích hợp cho sản phẩm ruợu nếp than nhằm cải tiến chất lượng của rượu. Đề tài nghiên cứu này đã tiến hành khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α- amylase đến hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa và khảo sát ảnh hưởng của chất bảo quản, bao bì, nhiệt độ đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian. Trong quá trình nghiên cứu và thực hiện thí nghiệm chúng tôi thu được kết quả sau: Nồng độ khi sử dụng α- amylase và glucoamylase trong quá trình đường hóa lần lượt là 0,3% và 0,4%, thời gian thích hợp nhất trong quá trình thủy phân bằng α- amylase và glucoamylase là 30 phút tương ứng. Trong quá trình bảo quản sản phẩm rượu nếp than ta thấy: nhiệt độ 100C giữ màu của sản phẩm tốt hơn nhiệt độ 280C. Màu chai không ảnh hưởng đến chất lượng rượu trong thời gian bảo quản 12 ngày. Sử dụng acid sorbic sẽ giữ màu anthocyanin tốt hơn so với acid ascorbic. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng iii MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ.............................................................................................................. i TÓM TẮT .................................................................................................................. ii MỤC LỤC................................................................................................................. iii DANH SÁCH BẢNG .................................................................................................v DANH SÁCH HÌNH................................................................................................. vi CHƯƠNG I GIỚI THIỆU..........................................................................................1 1.1 Đặt vấn đề..........................................................................................................1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu..........................................................................................1 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU .....................................................................2 2.1 Nguyên liệu .......................................................................................................2 2.1.1 Gạo nếp than ...............................................................................................2 2.1.2 Enzyme .......................................................................................................3 2.1.3 Nấm men.....................................................................................................4 2.1.4 Nước dùng trong sản xuất rượu nếp than ...................................................6 2.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men...............................................................7 2.2.1 Quy trình sản xuất rượu vang nếp than.......................................................7 2.2.2 Khái quát về quá trình lên men rượu ..........................................................9 2.2.3 Cơ chế của quá trình lên men .....................................................................9 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men ..........................................10 2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men...........12 2.3 Sắc tố anthocyanin trong rượu vang nếp than ................................................14 2.3.1 Sắc tố anthocyanin....................................................................................14 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến anthocyanin...................................................15 2.4 Vi sinh vật trong rượu .....................................................................................16 2.4.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic ......................................................................16 2.4.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic ...............................................................17 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM....................20 3.1. Phương tiện.....................................................................................................20 3.1.1 Nguyên liệu...............................................................................................20 3.1.2. Hoá chất ...................................................................................................20 3.1.3. Trang thiết bị............................................................................................20 3.2. Phương pháp thí nghiệm.................................................................................21 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng iv 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α - amylase đến hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa ......21 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, chất bảo quản, bao bì đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian ..............................22 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN...........................................................25 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α - amylase đến hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa. .................25 4.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, chất bảo quản, bao bì đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian.........................................30 4.2.1 Khi bảo quản bằng acid ascorbic ..............................................................30 4.2.2 Khi bảo quản bằng acid sorbic..................................................................34 CHƯƠNG V KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ................................................................39 5.1 Kết luận ...........................................................................................................39 5.2 Đề nghị ............................................................................................................41 TÀI LIỆU THAM KHẢO.........................................................................................42 PHỤ LỤC................................................................................................................. vii 1. Các phương pháp phân tích .............................................................................. vii 2. Phương pháp cảm quan ................................................................................... xiii 3. Tiêu chuẩn Việt Nam.........................................................................................xv 4. Kết quả thống kê.............................................................................................. xix Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng v DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Thành phần hóa học của gạo nếp than...........................................................2 Bảng 2: Thành phần hóa học của nấm men ................................................................5 Bảng 3: Hàm lượng muối của nước sử dụng trong sản xuất rượu bia .......................6 Bảng 4: Kết quả thống kê độ Brix và hàm lượng đường khử theo thời gian............26 Bảng 5: Kết quả thống kê độ Brix và hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme ......................................................................................................................26 Bảng 6: Kết quả thống kê hàm lượng đường khử theo thời gian và nồng độ enzyme glucoamylase.............................................................................................................27 Bảng 7: Kết quả thống kê màu theo mẫu ..................................................................29 Bảng 8: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nồng độ acid ascorbic ...............................................................................30 Bảng 9: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo màu chai....................................................................................................32 Bảng 10: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nhiệt độ ....................................................................................................32 Bảng 11: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo thời gian ...................................................................................................33 Bảng 12: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nồng độ acid sorbic..................................................................................34 Bảng 13: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo màu chai....................................................................................................35 Bảng 14: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo nhiệt độ .....................................................................................................36 Bảng 15: Kết quả thống kê độ rượu, hàm lượng acid tổng số, ester, aldehyde, màu rượu theo thời gian ....................................................................................................37 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng vi DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Gạo nếp than ..................................................................................................2 Hình 2: Saccharomyces cerevisiae..............................................................................4 Hình 3: Bột nếp than ...................................................................................................8 Hình 4:Công thức cấu tạo của anthocyanidin ...........................................................15 Hình 5: Đồ thị biểu diễn độ Brix và hàm lượng đường khử theo thời gian..............25 Hình 6: Đồ thị biểu diễn hàm lượng đường khử ở các nồng độ khác nhau theo thời gian khi sử dụng enzyme glucoamylase....................................................................27 Hình 7: Sản phẩm rượu nếp than ..............................................................................29 Hình 8: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nồng độ acid ascorbic .....................31 Hình 9: Đồ thị biểu diễn màu rượu theo nồng độ acid ascorbic ...............................31 Hình 10: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo màu chai........................................32 Hình 11: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nhiệt độ .........................................33 Hình 12: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo thời gian........................................34 Hình 13: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nồng độ acid sorbic.......................35 Hình 14: Đồ thị biểu diễn màu rượu theo nồng độ acid sorbic.................................35 Hình 15: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo màu chai........................................36 Hình 16: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo nhiệt độ .........................................36 Hình 17: Đồ thị biểu diễn chất lượng rượu theo thời gian........................................37 Hình 18: Đồ thị biểu diễn màu rượu khi sử dụng acid ascorbic và acid sorbic theo thời gian.....................................................................................................................38 Hình 19: Qui trình sản xuất đề nghị.. ........................................................................40 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 1 CHƯƠNG I GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Do xã hội ngày càng phát triển, nhu cầu của con người ngày càng cao do đó trên thị trường đã xuất hiện nhiều sản phẩm bánh kẹo, đồ hộp, rượu bia, nước giải khát… không những đáp ứng cho nhu cầu cảm quan về mẫu mã, màu sắc mà còn cung cấp cho người những sản phẩm thực phẩm có chất lượng cũng như an toàn trong thực phẩm. Một trong những sản phẩm quen thuộc và phổ biến được khá nhiều người biết đến đó là các sản phẩm lên men, có rất nhiều sản phẩm lên men trên thị trường nhưng sản phẩm lên men quen thuộc nhất và được nhiều người biết đến đó là rượu. Sản phẩm rượu hiện nay rất đa dạng có loại đục, trong, không màu, có màu… Một sản phẩm khá phổ biến cũng góp phần vào sự đa dạng đó chính là sản phẩm rượu nếp than- với công nghệ lên men bằng enzyme và nấm men thuần chủng thì đã rút ngắn được thời gian, tăng hiệu suất lên men. Nhưng để có được chất lượng rượu và giá trị cảm quan cao nhằm thu hút nhiều hơn đến gần với sản phẩm hấp dẫn này cần phải có những nghiên cứu các yếu tố tác động đến chất lượng của rượu để từ đó tìm ra những điều kiện thích hợp để bảo quản rượu. Chính vì lẽ đó mà chúng tôi nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình bảo quản rượu nếp than sản xuất bằng công nghệ enzyme và nấm men thuần chủng”. Nhưng một vấn đề gặp phải tồn tại trong thí nghiệm trước là kết quả nghiên cứu của anh Lê Minh Châu đã sử dụng α – amylase trong quá trình đường hóa để lên men nên hiệu quả lên men chưa cao, bên cạnh đó kết quả nghiên cứu của anh Nguyễn Thanh Vũ chưa khảo sát hàm lượng đường khử trong quá trình đường hóa để nấm men sử dụng lên men đạt hiệu quả. Cho nên, một vấn đề đặt ra trước tiên của đề tài này là xác định lại giai đoạn đường hóa nhằm tăng hiệu quả lên men. 1.2 Mục tiêu nghiên cứu Để làm rõ hơn hiệu quả của quá trình lên men thì mục tiêu nghiên cứu của chúng tôi là:  Tối ưu hóa các quá trình thủy phân bằng enzyme.  Tìm ra được điều kiện chế biến và bảo quản rượu nếp than ở quy mô phòng thí nghiệm tốt nhất. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 2 CHƯƠNG II LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Nguyên liệu 2.1.1 Gạo nếp than Gạo nếp than là một loại gạo đặc biệt được trồng nhiều ở Nam Bộ. Vì thế rượu nếp than được sản xuất chủ yếu ở vùng Nam Bộ. Gạo nếp than gồm 4 loại: - Nếp cẩm Đức Hòa. - Nếp đen Khánh Vĩnh . - Nếp than Long Đất. - Lúa lức nếp cẩm. Các loại lúa này có năng suất không cao, thường chỉ đạt 2,8 – 3,3 tấn/ha. Hiện nay dân vùng Đồng bằng Nam bộ phân loại nếp than theo màu sắc hạt gạo. Theo cách này nếp than được chia thành 2 loại: - Nếp than đen huyền. - Nếp than hồng đỏ. Màu của nếp than là màu của anthocyanin. Anthocyanin tinh khiết ở dạng tinh thể hoặc vô định hình là hợp chất khá phân cực nên tan tốt trong dung môi phân cực. Màu sắc của anthocyanin luôn thay đổi phụ thuộc vào pH, các chất màu có mặt và nhiều yếu tố khác, tuy nhiên màu sắc của anthocyanin thay đổi mạnh nhất phụ thuộc vào pH môi trường. pH thấp anthocyanin thường có màu đỏ, trở thành không màu ở pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa. Tuy khác nhau về màu sắc bên ngoài, nhưng thành phần hoá học của các loại nếp than không khác nhiều. Bảng 1: Thành phần hóa học của gạo nếp than Thành phần Hàm lượng Nước Protein Lipid Glucid Acid hữu cơ Tro 14 8,2 1,5 74,9 0,6 0,8 Nguyễn Đức Lượng,2003 Hình 1: Gạo nếp than Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 3 2.1.2 Enzyme Hệ enzyme thủy phân tinh bột thành đường là hệ enzyme amylase. Hệ này tồn tại trong nước bọt, trong dịch tiêu hoá, trong hạt nảy mầm, nấm mốc, nấm mem … Có nhiều loại enzyme amylase: α-amylase, β-amylase, γ-amylase và một số mới tìm ra từ nguồn gốc vi sinh vật là: pullutanase, isoamylase … Có nhiều nguồn cung cấp amylase khác nhau, cho nên tuỳ thuộc vào nguồn ra mà enzyme sẽ có điều kiện phát triển riêng. Đề tài này sẽ đề cập đến việc sử dụng enzyme amylase thương mại để thực hiện quá trình đường hoá.  α-amylase α-amylase bị kìm hãm bởi các ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+. α-amylase kém bền trong môi trường acid nhưng khá bền nhiệt. Nhiệt độ tối thích của α amylase là 72 – 760C, pH hoạt động tối thích là 5,3 – 5,8. α-amylase bị vô hoạt ở 800C. α-amylase có khả năng phân cắt liên kết α - 1,4 Glucozit ở bất kỳ vị trí nào trên mạch tinh bột đã được hồ hóa. Do đó được gọi là enzyme nội phân (endoenzyme). Amylose bị phân cắt khá nhanh tạo thành oligoshaccaride gồm 6 -7 gốc glucose, sau này các mạch này bị phân cắt và bị phân giải chậm thành maltose. Sản phẩm thủy phân amylose bao gồm: 87% maltose, 13% glucose. Amylosepectin bị phân giải khá nhanh nhưng α-amylase không phân cắt liên kết α - 1,6 glucozit nên sản phẩm thủy phân có khoảng 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và 8% izomaltose.  β-amylase β-amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+, urê, iodo, acetanic, iod, ozon. pH tối thích trong dung dịch nấu là 5-5.6. Nhiệt độ tối thích trong dung dịch nấu là 60-65oC và bị vô hoạt ở 70oC. β-amylase xúc tác sự thủy phân các liên kết α-1,4 glucozid trong tinh bột, glycogen, polysaccharide đồng loại. Phân cắt tuần tự từng gốc maltose một ở đầu không khử. β-amylase được gọi là enzyme ngoại phân (exo-enzyme). β-amylase phân giải 100% amylose thành maltose. Phân giải 54-58% amylopectin thành maltose, phần còn lại là dextrin. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 4  γ-amylase Hoạt động tốt ở 50oC, hoạt lực tối đa trong vùng pH = 3,5-5,5. γ-amylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α -1,4; 1,6 glucozid trong tinh bột, glycogen, polysaccharide kiểu maltose. Là enzyme ngoại phân exo-enzyme. Nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử tuần tự từng gốc glucose một, không thủy phân các dextrin vòng. Sản phẩm tạo thành: Glucose và dextrin vòng. 2.1.3 Nấm men Cấu tạo và sinh sản của nấm men Nấm men có cấu tạo đơn bào và thường sinh sản bằng cách nẩy chồi và phân cắt. Tế bào nấm men có thể có hình trứng (men bia), hình elip (men rượu vang), hình cầu (Torulopsis), hình gậy (Candida), hình quả chanh. Kích thước của tế bào nấm men khoảng 8 - 15µm. Nấm men sinh sản chủ yếu bằng hình thức nảy chồi. Tế bào mẹ nảy sinh ra thành một chồi nhỏ rồi lớn dần lên và sẽ tách ra. Quá trình này xảy ra khoảng 2 giờ. Ở một số giống nấm men, tế bào con không tách rời mà kết thành chuỗi. Đặc tính này có ở các nấm men tạo màng. Hình 2: Saccharomyces cerevisiae Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 5 Thành phần hóa học của nấm men Thành phần hóa học của tế bào nấm men được thể hiện trong bảng sau: Bảng 2: Thành phần hóa học của nấm men Thành phần Hàm lượng (% chất khô) Cacbon CaO Nitro Hydro P2O5 K2O SO3 MgO Fe2O3 SiO 49,8 12,4 6,7 3,54 2,34 0,04 0,42 0,38 0,035 0,09 “Nguyễn Đức Lượng, 1996”  Nấm men trong sản xuất rượu từ tinh bột Saccharomyces Cerevisiae Rasse II: Chủng này sinh sản trong môi trường nước đường, thường tụ lại thành đám, sau thời gian ngắn lắng xuống. Đặc điểm của loài này trong tế bào có nhiều hạt glycogen, không bào lớn hình thành bào tử nội sinh ít và chậm, sinh bọt nhiều và thích nghi với độ acid thấp, có sức kháng cồn cao, không lên men được lactose, kích thước tế bào từ 5-7μ m. Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII: Phân lập được ở Đức năm 1902. Tốc độ phát triển nhanh, sau 24 giờ từ một tế bào có thể phát triển thành 55 tế bào mới. ở loài này không bào nhỏ, ít sinh bọt, tế bào hình trứng hoặc hình tròn, kích thước vào khoảng 5-8μ m, lên men ở nhiệt độ cao và lên men được đường glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose và 1/3 đường rafinose, không lên men đường lactose, có thể lên men đến 13% rượu. Nấm men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII thuộc loại men nổi, phân bố rất đều trong dịch lên men không tạo thành đám trắng. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 6 R211 Loại nấm men này được phân lập từ men thuốc bắc ở nhà máy rượu Hà Nội. Tế bào hình ovan có kích thước (3-5) x (5-8) μ m, nó có thể lên men được ở đường glucose, fructose, galactose, sucrose, maltose. Được dùng trong sản xuất rượu từ nguyên liệu chứa tinh bột như: gạo, ngô, khoai, sắn. Sinh sản nhanh sau khi cấy từ 12 đến 16 giờ, lên men tốt trong dịch đường 120-140g/l và ở 160-180g/l vẫn có thể lên men được nhưng hiệu suất chuyển hóa thấp. Nồng độ rượu tạo thành trong môi trường lên men là 10- 12 %. Nhiệt độ lên men thích hợp là 28 đến 300C, nhưng đến 380C thì vẫn có thể lên men được. Chúng có khả năng chịu được chất sát trùng Na2SiF6, nồng độ 0,02% (nồng độ này vi khuẩn bị ức chế). “Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002” 2.1.4 Nước dùng trong sản xuất rượu nếp than Độ cứng không quá 7 mg đương lượng / lit phải trong suốt không màu không mùi, hàm lượng muối không được quá giới hạn Bảng 3: Hàm lượng muối của nước sử dụng trong sản xuất rượu bia Ion Hàm lượng (mg/l) Ion Hàm lượng (mg/l) Cl- SO42- As Pb NO3 0,5 80 0,05 0,1 40 F Zn Cu Fe 3 3 5 0,3 (Bùi Thị Quỳnh Hoa , 2002) Khả năng oxy hóa một lit nước không quá 2ml dd KMnO4 (0,01N). Chất cặn không vượt quá 1000ml/l. Hàm lượng các chất hữu cơ không vượt quá 4mg/l. Vi sinh vật hầu như không có. pH kiềm không thích hợp cho quá trình nấu nguyên liệu, có khả năng tạo điều kiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển và thúc đẩy quá trình tạo thành glyceryl trong quá trình lên men. Ecoli < 20 tế bào/ lit. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 7 2.2 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men 2.2.1 Quy trình sản xuất rượu vang nếp than - Sơ đồ quy trình Nấm men (1%) Enzyme amylase Gạo nếp than Nghiền Nấu Lọc Làm nguội (33oC) Lên men (4 ngày) Sản phẩm Chiết Thanh trùng Hãm cồn (20%V) Lên men phụ (6 tháng) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 8 - Thuyết minh một số công đoạn của qui trình Nghiền Gạo nếp than sau khi được làm sạch sẽ đem đi nghiền mịn nhằm giúp cho tinh bột và một số chất khô khác dễ hòa tan hơn trong quá trình nấu. Nấu Mục đích của quá trình nấu là phá vỡ màng tế bào tinh bột, chuyển hạt tinh bột từ trạng thái không tan thành trạng thái hoà tan trong nước nhằm tạo điều kiện cho enzyme amylase dễ dàng tấn công vào hạt tinh bột. Cho khoảng 10% enzyme vào nếp than đã được nghiền và pha loãng sẵn, sau đó nâng nhiệt lên đến 72oC thì giữ ở nhiệt độ này 15 phút để cho enzyme dịch hoá. Tiếp tục đun cho dịch cháo đến sôi và giữ ở nhiệt độ sôi 10 phút cho tinh bột hồ hoá hoàn toàn. Làm nguội dịch cháo đến nhiệt độ cần khảo sát (65 – 75oC) rồi cho hết lượng enzyme vào. Giữ ở nhiệt độ này khoảng 30 phút cho đến khi quá trình đường hóa kết thúc rồi đem lọc. Nấu còn có tác dụng tiêu diệt hầu hết các vi sinh vật gây hại cho quá trình lên men về sau. Thanh trùng Tiêu diệt các vi sinh vật không mong muốn phát triển cạnh tranh với nấm men. Làm nguội Hỗn hợp sau khi thủy phân tinh bột có nhiệt độ là khá cao. Trong khi nấm men phát triển tốt ở nhiệt độ khoảng 30 – 33oC. Vì vậy ta phải làm nguội hỗn hợp xuống để tạo môi trường thuận lợi cho nấm men phát triển. Lên men Tiến hành lên men ở nhiệt độ thường, thời gian này có hai quá trình xảy ra song song với các mức độ khác nhau, đó là quá trình tăng sinh khối của nấm men và quá trình rượu hóa. Ổn định Rượu vang nếp than được lên men ở nhiệt độ cao lại không qua chưng cất, nên sau khi lên men xong sẽ còn nhiều rượu bậc cao và các aldehyde gây độc cho cơ thể người. Vì vậy, cần có thời gian dài để cho các sản phẩm phụ này chuyển hóa và ổn định rượu, làm cho chất lượng rượu được tốt hơn. Hình 3: Bột nếp than Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 9 2.2.2 Khái quát về quá trình lên men rượu Lên men rượu là một quá trinh trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học (được sinh ra từ sự trao đổi chất để duy trì sự sống của nấm men). Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên, có hai hình thức lên men chính: lên men yếm khí và lên men hiếu khí. - Lên men yếm khí: là sự phân hủy đường không có sự hiện diện của oxy như quá trình lên men lactic, len men rượu, butylic… - Lên men hiếu khí: là sự phân hủy đường có sự hiện diện của O2 như quá trình lên men axit acetic, citric… Lên men rượu, bia đều là quá trình lên men yếm khí với sự có mặt của nấm men (Yeast). Nấm men chuyển hóa đường lên men thành rượu etylic và CO2. Nguời ta còn có thể gọi là quá trình cồn hóa, rượu hóa. Trong quá trình lên men rượu người ta chia làm hai thời kì chính: - Thời kì phát triển sinh khối: giai đoạn này với sự có mặt của O2 tế bào nấm men phát triển sinh khối (gia tăng kích thước và số lượng). - Thời kì lên men chuyển đường thành rượu và CO2: giai đoạn này, nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình để thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống tạo thành rượu và CO2. 2.2.3 Cơ chế của quá trình lên men Để lên men, người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt được > 100 triệu tế bào trong 1 ml dung dịch lên men. Do diện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng rất mạnh. Đuờng lên men và các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men sau đó khuếch tán qua màng tế bào vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 10 Rượu ethylic tạo thành khuếch tán ra môi truờng bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan vô hạn trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường. CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn. Ở áp suất 800mmHg, nhiệt độ 25 – 300C là 0,857 – 0,837 lít CO2 trong 1 lít nước. Vì thế, CO2 sinh ra trong quá trình lên men sẽ khuếch tán vào trong môi trường và nhanh chóng đạt được trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành những bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền nhau, bọt khí sinh ra ngày càng nhiều và lớn dần lên hình thành túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi đột ngột sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho khí CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Qúa trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động, làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường điều này làm cho quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men. Khí CO2 ức chế quá trình lên men, nhưng trong quá trình thoát khí CO2 làm tăng khả năng lên men của nấm men. Kích thước, vật liệu chế tạo của thiết bị lên men, các chất hòa tan mang điện tích, các vật lơ lửng khác hiện diện trong dịch lên men điều ảnh hưởng đến sự thoát khí CO2 nên cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men. “Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002” 2.2.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Có năm yếu tố cơ bản ảnh hưởng đến quá trình lên men rượu như sau: - Nồng độ đường Nấm men chỉ có khả năng lên men đường thành rượu trong khoảng nồng độ thích hợp từ 10 – 18%, nồng độ đường quá cao sẽ ức chế nấm men và khả năng lên men rượu giảm khi nồng độ đường 30 – 35%, nồng độ đường thấp quá cũng làm giảm năng lực lên men. - Ảnh hưởng của nhiệt độ Để thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động sống của nấm men cụ thể nấm men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu. Nấm men chủng XII phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30 – 330C, nhiệt độ tối đa là 380C, tối thiểu là 50C. Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17 – 220C có năng lực l._.ên men rất lớn. Đối với quá trình lên men thì nấm men sẽ chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1 – 450C. Nếu nhịêt độ quá 500C nấm men sẽ chết. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 11 - Ảnh hưởng của acid (pH) Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH = 2 – 8 nhưng thích hợp nhất là 4 – 4,5. Vi khuẩn bắt đầu phát triển ở pH = 4,2 và cao hơn, khi pH < 4,2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy, trong lên men rượu để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn người ta thực hiện trong giới hạn pH = 3,8 – 4,0. Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần ( thuần hoá) với độ pH thấp nên ngoài việc ứng dụng điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3,8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào, miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men. - Ảnh hưởng của nồng độ rượu Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu ảnh hưởng đến tốc độ phát triển riêng của nấm men còn phù thuộc vào thời gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị cho môi trường nuôi cấy. Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng nấm men cho vào bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4 – 6% đã có ảnh hưởng xấu. - Ảnh hưởng của oxy Nấm men là loại vi sinh vật kỵ khí không bắt buộc. Trong điều kiện không có oxy nấm men sẽ lên men đường tạo thành rượu và CO2, còn trong điều kiện đầy đủ oxy nấm men có khả năng oxy hóa đường thành rượu và CO2 và tăng sinh khối. “Hiệu ứng Pastuer” kìm hãm sự lên men rượu bằng O2. Oxy là thành phần không thể thiếu được ở giai đoạn phát triển sinh khối. Tùy nhiên nó là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu trong giai đoạn chế biến còn lại. Với sự có mặt của O2 nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối. Trong giai đoạn bảo quản thì chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyt, sản phẩm rất dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu gây tối màu cho sản phẩm, làm chua sản phẩm do sự hình thành acid hữu cơ (vi khuẩn lactic, acetic…) gây thối cho sản phẩm rượu theo thời gian bảo quản (do rượu bia là môi trường rất giàu chất dinh dưỡng cho vi khuẩn gây thối phát triển. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 12 Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ lượng O2 cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ lượng tế bào lên men ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất. Tuy nhiên lại có một số nấm men phát triển nhanh và tạo ra hàm lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trường ban đầu có đầy đủ oxy. “Bùi Thị Quỳnh Hoa, 2002” 2.2.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men - Sự tạo thành acid Trong quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyrovic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid latic. Acid acetic có thể được tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic – 1 phân tử bị oxy hoá, phân tử thứ hai sẽ bị khử: CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH Acid lactic được tạo bởi pyrovat dehydronase theo phản ứng: CH3CO-COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4 Acid citric theo Laphon được tạo từ aldehyde acetic. Phản ứng được biểu diễn tổng quát như sau: 9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH Acid succinic được tạo thành có thể theo hai con đường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic: 2CH3-COOH + CH3CHO Æ COOHCH2CH2COOH + C2H5OH Hoặc được tạo thành do deamin acid glutamic. Trường hợp này aldehyde glyceric tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin. Phương trình tổng quát tạo acid succinic cùng với glycerin từ acid glutamic được biểu diễn như sau: C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O = COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 +NH3 + CO2. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 13 Glycerin và aldehyde đều là sản phẩm trung gian của lên men rượu. Trong điều kiện lên men nhằm mục đích chỉ thu rượu etylic, người ta khống chế pH dịch lên men trong giới hạn 4,5 – 5,2. Với điều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 – 0,45% dịch giấm chín, tương ứng tiêu tốn đường 2 – 3% so với lượng đưa vào. Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng đường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và đường tạo aldehyde nhưng chưa chuyển thành rượu đạt 11,9%. Lên men đường xảy ra theo phương trình: 2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH “Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng. 2005” - Sự tạo thành rượu bậc cao Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu, là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai. Các alcol này tuy ít nhưng nếu lẫn vào etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm. Đó là các alcol propylic, izobutylic, izoamylic, amylic .v.v…Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0,4 – 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu. Các alcol này có tên chung là dầu fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin. Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao được đơn giản theo phản ứng: R-CH(NH2)-COOH + H2O Æ RCH2OH + NH3 + CO2. Như vậy việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với sự biến đổi của acid amin xảy ra trong điều kiện yếm khí chỉ có thể đồng thời với lên men rượu, sự tạo thành alcol cao phân tử khi lên men là do axit amin bị mất NH3, sau đó mất CO2 và cuối cùng aldehyt bị khử để tạo ra alcol. Bằng con đường tương tự, nhiều acid amin cũng được tạo thành như valin và izolơxin … chúng là tiền đề để tạo ra các alcol bậc cao sau này. Thực ra quá trình amin hoá acid pyrovic xảy ra rất phức tạp, qua nhiều giai đoạn có liên hệ chặt chẽ với nhau. Acid acetic tạo thành có hoạt tính cao lại tác động cho các quá trình khác tiếp theo. - Sự tạo thành ester và các sản phẩm phụ khác Sự tạo thành ester Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng. Phương trình tổng quát: R1CH2OH + R2COOH Æ R2COO-CH2R1 + H2O Este etylic có thể được tạo thành do alcol etylic kết hợp với axit axetic hoặc là do sự tham gia phản ứng của các aldehyde. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 14 Sự tạo thành metanol Trong quá trình nấu nguyên liệu, các chất pectin este của axit polygalacturovic bị thủy phân tạo thành axit pectic và alcol metylic Sự tạo thành fufurol Đường chứa trong nguyên liệu chủ yếu là saccaroza, glucoza, fructoza và một ít maltoza được tạo thành trong thời gian nấu. Ở nhiệt độ cao các đường sẽ bị phân hủy và mất nước để tạo thành caramen, fufurol, oxymetyl fufurol và melanoidin. Đường pentoza bị mất ba phân tử nước tạo thành fufurol. Sự tạo thành aldehyde Là sản phẩm của quá trình trao đổi chất ở nấm men và cũng có thể được tạo thành qua con đường oxy hóa các loại rượu. Chủ yếu là hàm lượng acetaldehyde. Acid pyruvic accetaldehyde Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. 2.3 Sắc tố anthocyanin trong rượu vang nếp than 2.3.1 Sắc tố anthocyanin Cấu tạo Anthocyanin là sắc tố tan trong nước, rất phổ biến trong thực vật, có màu đỏ, xanh da trời, màu do sự phối hợp giữa đỏ và xanh (thành màu tím), có trong trái cây, hoa, và những mô thực vật. Đây là chất màu có mặt rộng rãi trong thực vật ở khắp nơi trên thế giới. Anthocyanin là glycoside của các anthcyanidin với monosaccharide (glucose, galactose, rhamnose, xylose…), di và trisaccharide. Anthocyanidin ít tan trong nước hơn anthocyanin và không thấy tự do trong tự nhiên. Anthocyanin là các dẫn xuất polyhydroxy và methoxy của flavylium. Trong thực phẩm có 6 anthocyanidin phổ biến (pelargonnidin, cyaniding, delphinidin, peonidin, petunidin, malvidin), nó khác nhau do độ hydroxyl và methoxyl hóa vòng B. Decacboxyl hóa Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 15 Hình 4:Công thức cấu tạo của anthocyanidin Tính chất Màu của anthocyanin được xác định bởi cấu trúc hóa học và môi trường bên ngoài. Có thể hai anthocyanin khác nhau cho màu giống nhau hay hai anthocyanin giống nhau lại cho màu khác nhau. Khi tăng số nhóm hydroxyl vào phân tử sẽ làm cho nó chuyển từ màu đỏ sang màu xanh (blue). Khi thay nhóm hydroxyl bằng nhóm methoxyl sẽ làm ngược lại khuynh hướng đổi màu. pH thấp anthocyanin thường có màu đỏ, trở thành không màu ở pH cao rồi thành xanh ở pH cao hơn nữa. Sự biến đổi dạng anthocyanin theo pH: - pH thấp, tồn tại dạng cation, màu đỏ - pH gần đẳng điện, không mang điện, không màu. - pH cao, tồn tại dạng anion, màu xanh (blue).Ở pH cao hơn, các anthocyanidin tự do sẽ bị phân rã tạo thành aldehyde và acid carboxylic 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến anthocyanin Nhiệt độ: khi tăng nhiệt độ sẽ dẫn đến sự thay đổi độ hấp thu cực đại, màu của anthocyanin cũng giảm khi gia tăng nhiệt độ. pH: pH quá cao hoặc quá thấp sẽ dẫn đến sự thoái hóa màu anthocyanin, hiệu quả của chất màu này đạt cực đại ở pH = 3,5. Thời gian bảo quản và ánh sáng: tăng thời gian bảo quản thì chất màu anthocyanin giảm và khi bảo quản ở các điều kiện môi trường khác nhau cũng ảnh hưởng đến sắc tố anthocyanin. Thời gian bảo quản và chiếu sáng trực tiếp ảnh hưởng lên sự ổn định của anthocyanin. Các nhà nghiên cứu đã cho rằng giữ mẫu ngoài ánh sáng thì nồng độ của chất màu giảm mạnh hơn trong tối. Các yếu tố khác cũng có thể ảnh hưởng đến màu anthocyanin như nồng độ của các chất màu kết hợp với anthocyanin, tỉ lệ tương đối trong hỗn hợp các anthocyanin, ảnh hưởng của các sắc tố khác như carotenoid, chlorophyll. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 16 2.4 Vi sinh vật trong rượu Vi khuẩn có thể phát triển trong rượu là vi khuẩn acid acetic và acid lactic và 2 loại đòi hỏi cần phải có oxi. Vi khuẩn acetic cần có oxi để phát triển và chuyển thành giấm trong khi vi khuẩn acid lactic phát triển tốt trong điều kiện hàm lượng oxi thấp. Trong nước quả, ngoài men còn có nhiều loại khuẩn, khuẩn khó nghiên cứu hơn men vì kích thước nhỏ hơn men nhiều: chỉ gần đây nhờ có kính hiển vi điện tử mới biết rõ thêm về cấu trúc của chúng. Men chuyển đường thành rượu, gây một sự thay đổi có ích, còn khuẩn thì tác động đến nhiều thành phần của nước quả hay của rượu, chuyển thành các chất có hại: khuẩn xêrin, làm cho rượu có vị chua, vị đắng, có mùi hôi … 2.4.1 Hư hỏng do vi khuẩn acetic Vi khuẩn acid acetic là vi khuẩn thuộc giống Acetobater. Chúng có khả năng oxi hóa mạnh ở pH = 4,5 thì ethanol chuyển thành axit axetic và oxi hóa acid acetic thành CO2 và nước. Có 3 loài được công nhận đó là: A. aceti, A. pasteurianus và A. peroxydans được tìm thấy trong rượu. Một số loài khác ít quan trọng trong sự hư hỏng của rượu. A. xylinum là một loài phụ của A. aceti. Những giống A. aceti được sử dụng trong việc sản xuất ra giấm. Rượu pha thêm rượu mạnh: Bobadilla đề nghị rằng rượu được sử dụng trong việc sản xuất rượu pha chứa tối thiểu 14,5% ethanol. Tuy nhiên, Cruess thấy rằng sự hóa giấm xảy ra nhanh ở rượu nguyên chất chứa 14,7% ethanol ở California. Vaughn cho rằng hầu hết vi khuẩn acetic chịu được nồng độ ethanol tối đa nằm trong khoảng 14 – 15%; nhưng ông cho rằng loài và giống Acetobacter tồn tại nhưng không phát triển trên 10% ethanol. Rượu vang để tiếp xúc rộng rãi với không khí chỉ sau vài tuần bị một màng trắng bao phủ: đó là màng giấm. Khuẩn giấm biến cồn êtilic thành axit axetic, do đó rượu vang có mùi giấm. Một phần nhỏ axit axetic lại hợp với cồn êtilic thành một este, ethyl acetate và chất này có mùi chua gắt, khó chịu hơn cả giấm. Người ta nếm rượu căn cứ vào mùi ethyl acetate để đánh giá rượu có bị chua giấm hay không. Phản ứng tạo thành giấm C2H5OH + O2 → CH3COOH + H2O Tuy nhiên, Peynaud cho rằng mùi chua giấm là do ethyl acetate, một este được hình thành bởi vi khuẩn acetic C2H5OH + CH3COOH → CH3COOC2H5 + H2O Một số vi khuẩn lên men giấm sản xuất ra nhiều ethyl acetate hơn những sản phẩm khác, ethyl acetate có thể bị mất do sự bay hơi trước khi lên men và hòa vào trong rượu. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 17 Khuẩn giấm phát triển mạnh hay yếu, tùy thuộc các nhân tố sau đây: - Số lượng khuẩn ban đầu, do đó phải tìm cách lọc, giữ vệ sinh để giảm lượng này và rất khó loại hoàn toàn. - Độ nhiệt ảnh hưởng lớn, thí dụ lượng axit axetic hình thành ở 280C cao gấp đôi ở 230C. - Độ pH cũng ảnh hưởng lớn, rượu càng chua khuẩn giấm càng khó sinh sản, thí dụ dưới pH 3,2 rất ít khi thấy xuất hiện khuẩn giấm. - Polifênola - tanin có tác dụng kiềm hãm (nhẹ). - Các vitamin ảnh hưởng cũng như đối với khuẩn lactic, cần thiết nhất là axit pantothenic, nicotinamit, axit p - amino benzoic đôi khi thiamin (B1). - Khuẩn giấm cần rất nhiều oxy. Thí dụ muốn tăng axit bay hơi 0,8 g trong một lít rượu vang, khuẩn phải có tối thiểu 2 lít không khí. Vậy giữ rượu vang trong chai, lọ nút kín, không cho tiếp xúc với không khí là cách tốt nhất để chống bệnh chua giấm. Vì có nhiều yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của men giấm nên mặc dù có khuẩn, không nhất thiết rượu vang nào cũng bị bệnh chua giấm. Vậy phải thử khả năng bị chua giấm như sau: cho rượu vang muốn thử vào chai đã vô trùng, nút bằng bông và chỉ đổ rượu đầy tới 3/5 chai thôi. Để chống chua giấm nên đựng rượu vang trong các chai, lọ kín tuyệt đối và trong chai, rượu phải đầy lên sát nút, để lại trong chai càng ít không khí càng tốt. 2.4.2 Hư hỏng do vi khuẩn acid lactic a. Sinh thái khuẩn lactic Khuẩn nhỏ hơn men, di chuyển dễ hơn men, dựa vào các môi giới như côn trùng, gió...Nên có thể nghĩ rằng khuẩn cũng như men, xâm nhập vào nước quả nhờ đã có sẵn trên quả nho; nhưng chỉ ở những năm gần đây (khoảng 1960), người ta mới có bằng chứng chắc chắn nhờ có kỹ thuật phát hiện, phân lập tiến bộ hơn. Có thể hình dung ra như sau, quá trình hoạt động của các khuẩn lactic như sau: Trên quả đã có khuẩn lactic. Trong xưởng rượu trên các dụng cụ chế rượu cũng có. Vì vậy trong nước quả đã có sẵn nhiều loại khuẩn lactic. Không phải tất cả các khuẩn này đều có thể tồn tại: một số không thể sinh sản được vì pH quá thấp, nhưng ở xác, ở hạt, ở những chổ chua và giàu chất khoáng thì khuẩn vẫn sống được; có độ cồn tăng lên dần thì khuẩn bị ức chế. Cuối cùng chỉ có một tỉ lệ rất thấp các khuẩn có mặt ở quả lúc đầu sống sót và sau này gây lên men malôlactic (biến acid malic thành acid lactic), nhờ thích ứng được dần dần với điều kiện môi trường có cồn chúng sinh sản rất chậm sau một thời gian tiềm sinh. Cần chú ý là trong quá trình lên men, điều kiện không thuận cho khuẩn lactic tăng dần, nhất là khi người ta cho thêm các men với số lượng lớn. Tế bào men đông hơn, thích hợp với cồn, với pH Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 18 thấp hơn nên chiếm hết thức ăn của khuẩn; cho thêm SO2 vào lại thuận cho men hơn là cho khuẩn vì men chịu đựng giỏi hơn. Như vậy lên men malôlactic bắt đầu không muộn hơn lên men rượu, nhưng bị kiềm hãm dần lại và chỉ diễn ra thực sự vài ngày hoặc vài tuần sau khi lên men rượu xong và là kết quả của sự thích nghi dần của một số tế bào khuẩn giỏi chịu đựng. b. Hoạt động của khuẩn lactic Trong tự nhiên, lên men lactic diễn ra như nói trên: sau khi cho nước quả vào bể lên men, ngay những giờ đầu sự lên men lactic bắt đầu nhưng sau đó ngừng lại vì khuẩn lactic bị cồn etylic hình thành ức chế. Sau khi lên men rượu xong chỉ còn một số ít khuẩn, 2/3 số rượu thăm dò có khoảng trên 10 000 khuẩn/cc trong khi phải có khoảng 1.000.000 thì acid malic mới bị phân hủy đáng kể. Sau một thời gian tiềm sinh từ vài ngày đến vài tuần lễ, số lượng khuẩn lactic tăng dần, quá trình lên men malôlactic mới bắt đầu. Sau khi acid malic bị phân hủy hết thì số lượng khuẩn lactic lại giảm. - Độ pH có ảnh hưởng lớn, pH thích hợp cho khuẩn lactic là 4,2-4,5, nhưng ở độ pH này, khuẩn lactic thường là khuẩn que (lactobacillus) có khuynh hướng phân hủy không phải acid malic mà là đường, acid tatric ...làm hỏng rượu. Nếu pH thấp 3,5-3,2 thì khuẩn hoạt động rất khó khăn và chỉ còn sống sót một số khuẩn cầu (Leuconostoc); pH thấp, cần tới tác động của khuẩn lactic làm cho rượu bớt chua, thì khuẩn lại khó sinh sống: đó là mâu thuẩn và cần phải có sự thích ứng dần của một số dòng khuẩn; khi số lượng đã nhiều mới có thể lên men malôlactic. - Độ nhiệt tác động đến khuẩn cũng giống như đối với men, thích hợp nhất là vào khoảng 25-30 0C. Tuy nhiên độ nhiệt lên tới 300C khi lượng cồn etylic đã cao thì khuẩn lactic có thể bị diệt. Vì vậy khi lên men malolactic giữ rượu ở 20-250 thích hợp. - Yêu cầu đối với oxy. Người ta thường cho khuẩn lactic yếm khí, trái với khuẩn giấm háo khí. Thực ra khuẩn lactic có thể chịu được yếm khí nhưng nếu có oxy hòa tan trong nước thì hoạt động có phần tốt hơn khi hoàn toàn yếm khí. - Yêu cầu đối với acid amin. Mỗi loài khuẩn có những yêu cầu nhất định đối với từng loại acid amin; yêu cầu của khuẩn cầu cao hơn khuẩn que về mặt này. - Yêu cầu đối với các vitamin. Cũng như men, khuẩn cần có những vitamin nhất định ở trong môi trường và về mặt này yêu cầu của khuẩn que lại cao hơn khuẩn cầu. Acid pantothenic và nicotinic nói chung cần thiết cho đa số khuẩn; Riboflavin (B2), acid folic và đôi khi thiamin (B1) hoặc cần thiết hoặc có tính chất kích thích tùy theo loại khuẩn. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 19 c. Kết quả hoạt động của khuẩn lactic: lên men malôlactic và các bệnh rượu - Lên men malolactic. Khuẩn lactic gây nên những sự thay đổi trong rượu đa số là có hại, chỉ có một sự thay đổi có ích: biến acid malic thành acid lactic. Acid malic trong công thức có 2 nhóm COOH có hai chức acid: acid lactic có một nhóm COOH, một chức acid; nên khi biến acid malic thành acid lactic giảm độ chua được một nữa, rươu dịu đi, ngoài ra acid malic có vị chua gắt, khó chịu, còn acid lactic có vị mềm hơn. Lên men malôlactic không cung cấp năng lượng cho khuẩn lactic cho nên khuẩn lại phải phân hủy các thành phần khác của rượu để lấy năng lượng. Vì vậy không có khuẩn lactic nào hoàn toàn có ích cả. Thực ra người ta phân biệt hai nhóm khuẩn lactic: một nhóm bao giờ cũng nguy hiểm vì phân hủy các thành khác của rượu nhiều hơn là phân hủy acid malic, một nhóm thứ hai thường chỉ quen phân tích acid malic và là khuẩn có ích và chỉ có hại trong những điều kiện đặc biệt. Trong quá trình chế rượu, khi theo dõi lên men rượu, đồng thời cũng phải theo dõi lên men malôlactic. Phải phân tích định kỳ đều đặn độ chua tổng cộng, acid bay hơi, lượng acid malic. Khi nào hết axit malic thì gạn cặn, lọc để loại bớt khuẩn - nếu cần tiệt trùng. - Bệnh rượu vang. Chỉ có lên men malôlactic là tăng chất lượng của vang. Những biến đổi khác do khuẩn lactic gây ra đều có hại vì phá hủy các thành phần cơ bản của vang, làm cho vang bị bệnh. Bệnh vang dính (vins filants): khi rót rượu ra cốc vang không chảy đều, lỏng như nước mà dính như có hồ nếp. Đó là do khuẩn lactic nhất là loại Leuconostoc, trong những điều kiện nhất định, tiết ra quanh mình một loại đường riêng gọi là dextran. Bệnh này thường kéo theo bệnh chua tatric và bệnh vang đắng.. Bệnh chua lactic (piqure lactique). Xảy ra khi trong rượu vang còn lại đường khử, chưa chuyển hết thành rượu. Đường khử bị khuẩn lactic phá hủy chuyển thành đường manit và acid bay hơi, gây một mùi chua khó chịu. Là một bệnh phổ biến của rượu vang, xảy ra khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đường, kỹ thuật lên men thấp, làm cho "con men" ngừng hoạt động nửa chừng, cấy men Saccharomyces chưa đủ, lượng nhiệt quá cao, thiếu oxi. Bệnh chua tatric (tourne). Xảy ra khi khuẩn lactic phá hủy axit tatric làm cho rượu đục, tiết nhiều CO2, rượu chuyển màu nâu, có vị nhạt...Chỉ khi pH cao hơn 3,5 -3,6 mới có bệnh này vì vậy rượu cũ, rượu ngon hay bị bệnh. Bệnh đắng. Xảy ra khi men lactic phá hủy glixerin. Rượu trở thành chua, có vị đắng do các chất acrolêin hình thành. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 20 CHƯƠNG III PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM 3.1. Phương tiện Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Bộ môn Công Nghệ Thực Phẩm- Khoa Nông Nghiệp & SHƯD- Trường Đại học Cần Thơ. Thời gian thực hiện đề tài được tiến hành từ ngày 07/01/2008 đến ngày 12/04/2008. 3.1.1 Nguyên liệu - Nếp than được mua ở cửa hàng Kim Thoa, đường Hai Bà Trưng, Cần Thơ. - Nấm men được mua ở tiệm Hồng Hà, đường Nam Kỳ Khởi Nghĩa, Cần Thơ. - Enzyme α-amylase có nguồn gốc từ Bacillus được mua tại cửa hàng hóa chất Cần Thơ. - Enzyme glucoamylase có nguồn gốc từ Aspergillus niger mua tại Công ty TNHH TM-DV Nam Giang (133/11, Hồ Văn Huê, P9,Q. Phú Nhuận, TP. HCM). 3.1.2. Hoá chất Acid citric dùng để chỉnh pH. Cồn tinh khiết 99,8% không có aldehyde Acid cromotrropic 99% NaHSO3 khan 98% Dung dịch KMnO4 Dung dịch H2SO4 đậm đặc 98%, H2SO4 0,1N, H2SO4 1N Dung dịch iôt 0,1N, dung dịch tinh bột 1% KI tinh thể, Na2S2O3 3.1.3. Trang thiết bị - Chiết quang kế. - Cồn kế. - Kho lạnh - Máy đo màu quang phổ. - Nhiệt kế. - Máy đo pH. - Cân điện tử và một số dụng cụ thông thường: bếp gas, nồi nấu…. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 21 3.2. Phương pháp thí nghiệm 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α - amylase đến hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa Mục đích Khảo sát hàm lượng đường khử và độ Brix theo thời gian với mục đích tìm ra nồng độ α - amylase tối ưu cho quá trình đường hóa. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 nhân tố và 2 lần lặp lại. Nhân tố A: nồng độ enzyme A1 = 0.1; A2 = 0.2; A3 = 0.3; A4 = 0.4 Nhân tố B: thời gian (phút) B1 = 20 ; B2 = 25; B3 = 30; B4 = 35 Tổng nghiệm thức: 4 x 5 = 20 Tổng đơn vị thí nghiệm: 20 x 2 = 40 Bảng sơ đồ thí nghiệm Thời gian Nồng độ B1 B2 B3 B4 A1 A1B1 A1B2 A1B3 A1B4 A2 A2B1 A2B2 A2B3 A2B4 A3 A3B1 A3B2 A3B3 A3B4 A4 A4B1 A4B2 A4B3 A4B4 Tiến hành thí nghiệm Nếp than được nghiền thành bột mịn sau đó cho nước vào với tỉ lệ 4 lít nước/ 1kg nếp. Bột nếp được quậy đều trong nước rồi đem chỉnh pH về 6,5 sau đó cho vào trong dung dịch 0,08% enzyme amylase theo thể tích rồi đem nấu. Khi nhiệt độ tăng đến 850C thì giữ cố định 15 phút ở nhiệt độ này để dịch hóa. Nâng đến nhiệt độ sôi, giữ 10 phút sau đó để nguội ở 850C thì cho enzyme vào theo các nồng độ ở trên (theo thể tích) để đường hóa giữ cố định ở nhiệt độ 850C theo các nhân tố thời gian trên, sau đó đo độ Brix và đường khử theo thời gian. Kết quả ghi nhận Hàm lượng đường khử còn lại Độ brix theo thời gian Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 22 3.2.2 Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ, chất bảo quản, bao bì đến chất lượng của sản phẩm rượu nếp than theo thời gian Mục đích Tìm ra được nhiệt độ, nồng độ chất bảo quản và bao bì thích hợp cho sản phẩm rượu vang nếp than. Bố trí thí nghiệm Thí nghiệm được bố trí ngẫu nhiên với 3 nhân tố và 2 lần lặp lại. Nhân tố C: Acid ascorbic (mg/ kg sản phẩm) C1 = 0; C2 = 100; C3 = 200 Nhân tố D: Acid sorbic (mg/kg sản phẩm) D1 = 0 ; D2 = 500 ; D3 = 1000 Nhân tố E : Bao bì E1: bao bì không màu, E2: bao bì màu Nhân tố F: nhiệt độ (0C) F1 = 10; F2 = 28 Nhân tố G: Thời gian (ngày) G1 = 0 ; G2 = 3 ; G3 = 6 ; G4 = 9; G5 = 12 Tổng nghiệm thức: 3 x 3 x 2 x 2 x 5 = 180 Tổng đơn vị thí nghiệm: 90 x 2 = 360 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 23 Sơ đồ bố trí thí nghiệm Gạo nếp than Lên men (5 ngày) Lọc sơ bộ C D C1 C2 C3 D1 D2 D3 E1 E2 E1 E2 E1 E2 E1 E2 E1 E2 E1 E2 G12345 F12 F12 F12 F12 F12 F12 F12 F12 F12 F12 F12 F12 Nấm men (0,1%) Enzyme amylase Nghiền Nấu Lọc Làm nguội (33oC) Thanh trùng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 24 Tiến hành thí nghiệm Tiến hành như sơ đồ bố trí thí nghiệm. Sau khi lên men xong tiến hành bảo quản với các nồng độ chất bảo quản khác nhau (C1,C2, C3, D1, D2, D3), hai loại bao bì và nhiệt độ khác nhau, sau đó đo các chỉ tiêu theo thời gian. Các chỉ tiêu đánh giá Đánh giá cảm quan về màu sắc, độ trong, mùi vị. Đo màu sắc, xác định hàm lượng este, acid tổng số, aldehyde, fufurol. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 25 CHƯƠNG IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ enzyme α - amylase đến hàm lượng đường khử, độ Brix theo thời gian trong quá trình đường hóa. Dựa vào kết quả của Lê Thanh Vũ chúng tôi cố định quá trình dịch hóa là sử dụng 0,08 % enzyme α – amylase theo thể tích với nhiệt độ và pH tối thích là 850C và 6,5 (Nguyễn Thị Giang Thanh) trong 15 phút. Enzyme α – amylase làm giảm độ nhớt của dịch nếp, enzyme này sử dụng với nồng độ cao thì độ nhớt giảm nhanh và ngược lại. Tuy nhiên, độ nhớt của dịch nếp giảm đến một giá trị nào đó thì mức độ giảm không đáng kể. Thời gian dịch hóa càng dài thì độ nhớt của dịch nếp càng giảm và không đều. Độ nhớt giảm mạnh ở giai đoạn đầu nhưng giảm không đáng kể ở giai đoạn sau. Như vậy, thời gian dịch hóa hiệu quả nhất là 15 phút (Võ Văn Tuấn). Từ kết quả nghiên cứu của Nguyễn Thanh Vũ và Lê Minh Châu quá trình đường hóa chỉ sử dụng enzyme α – amylase do đó hiệu suất lên men không cao, độ rượu là 5 (% thể tích). Nguyên nhân có thể là do nghiên cứu này chưa phân tích hàm lượng đường khử trước khi lên men để lên men đạt độ rượu yêu cầu. Chính vì lẽ đó, ở thí nghiệm này chúng tôi đã phân tích lại lượng đường khử và độ Brix trong quá trình đường hóa khi sử dụng enzyme α – amylase theo thời gian. Kết quả cho thấy: 16 17 18 19 20 21 20 25 30 35 Thời gian (phút) độ B ri x 0,1 % 0,2 % 0,3 % 0,4 % 0 1 2 3 4 5 6 7 8 20 25 30 35 Thời gian (phút) Đ ư ờn g kh ử (% ) 0,1 % 0,2 % 0,3 % 0,4 % Hình 5: Đồ thị biểu diễn độ Brix và hàm lượng đường khử theo thời gian Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 26 Bảng 4: Kết quả thống kê độ Brix và hàm lượng đường khử theo thời gian Thời gian Brix Đường khử 15 17,1a 3,626a 20 18,45b 4,47b 25 19,13c 5,64c 30 19,3c 6d 35 19,45c 6,17d Ghi chú: Các số liệu có cùng chữ cái đi kèm thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ ý nghĩa 5%. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Bảng 5: Kết quả thống kê độ Brix và hàm lượng đường khử theo nồng độ enzyme Nồng độ enzyme Brix Đường khử 0,1 17,68a 3,4a 0,2 18,64b 5,41b 0,3 19,2c 5,89c 0,4 19,22c 5,95c Ghi chú: Các số liệu có cùng chữ cái đi kèm thể hiện sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ ý nghĩa 5%. Giá trị trong bảng là giá trị trung bình của 2 lần lặp lại. Từ đồ thị và kết quả thống kê cho thấy khi tăng nồng độ và thời gian thủy phân thì hàm lượng đường khử tăng và thấy ở (Bảng 4) không có sự khác biệt ở hai mức thời gian 30 và 35 phút, đồng thời cũng thấy ở (Bảng 5) không có sự khác biệt ở hai mức nồng độ 0,3 và 0,4. Hàm lượng đường khử thấp do α – amylase chỉ tác dụng lên liên kết α – 1,4 glucosit ở vị trí bất kỳ trong phân tử tinh bột, nhưng không tác dụng ở đầu mạch và không tác dụng lên các lên kết α – 1,6 glucosit của các mạch nhánh. Sản phẩm là hỗn hợp các đường và oligosaccharit. Do trong nếp có chứa nhiều amylopectin nên sản phẩm chủ yếu là 72% maltose, 19% glucose, dextrin phân tử thấp và 8% izomaltose (Bùi Thị Quỳnh Hoa, Nguyễn Thị Hiền). Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng 27 Quá trình lên men khi sử dụng enzyme α – amylase trong quá trình đường hóa thì hàm lượng đường khử không đủ để lên men rượu đạt nồng độ theo yêu cầu và thí nghiệm của Lê Thanh Vũ chưa khảo sát hàm lượng đường khử trong quá trình đường hóa khi bổ sung glucoamylase cho nên chúng tôi thực hiện thí nghiệm này với nhiệt độ tối thích của enzyme glucoamylase là 650C và do quá trình khảo sát động học của giá trị pH ở thời điểm này chưa có nên chúng._.0 - 6 *0.395833 0.31888 0 - 9 *0.5625 0.31888 0 - 12 *0.791667 0.31888 3 - 6 0.166667 0.31888 3 - 9 *0.333333 0.31888 3 - 12 *0.5625 0.31888 6 - 9 0.166667 0.31888 6 - 12 *0.395833 0.31888 9 - 12 0.229167 0.31888 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxiv ™ Acid 9 Acid ascorbic Bảng 17 Multiple Range Tests for luong acid by acid ascorbic -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD acid ascorbic Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 200 40 1616.0 X 100 40 1680.5 X 0 40 1787.88 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 100 *107.375 42.3808 0 - 200 *171.875 42.3808 100 - 200 *64.5 42.3808 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 18 Multiple Range Tests for luong acid by mau chai -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD mau chai Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 60 1690.58 X 1 60 1699.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 8.41667 34.6038 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 19 Multiple Range Tests for luong acid by nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 28 60 1642.92 X 10 60 1746.67 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 28 *103.75 34.6038 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxv Bảng 20 Multiple Range Tests for luong acid by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 9 24 1670.63 X 3 24 1693.13 X 0 24 1694.79 X 12 24 1696.46 X 6 24 1718.96 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 3 1.66667 54.7133 0 - 6 -24.1667 54.7133 0 - 9 24.1667 54.7133 0 - 12 -1.66667 54.7133 3 - 6 -25.8333 54.7133 3 - 9 22.5 54.7133 3 - 12 -3.33333 54.7133 6 - 9 48.3333 54.7133 6 - 12 22.5 54.7133 9 - 12 -25.8333 54.7133 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 9 Acid sorbic Bảng 21 Multiple Range Tests for acid by acid sorbic -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD acid sorbic Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1000 40 1799.5 X 0 40 1803.5 X 500 40 1820.75 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 500 -17.25 35.0782 0 - 1000 4.0 35.0782 500 - 1000 21.25 35.0782 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference Bảng 22 Multiple Range Tests for acid by mau chai -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD mau chai Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 60 1780.17 X 2 60 1835.67 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-55.5 28.6412 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxvi Bảng 23 Multiple Range Tests for acid by nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 10 60 1794.67 X 28 60 1821.17 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 28 -26.5 28.6412 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 24 Multiple Range Tests for acid by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 24 1764.58 X 6 24 1794.58 XX 12 24 1811.67 XX 3 24 1827.08 XX 9 24 1841.67 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 3 *-62.5 45.2857 0 - 6 -30.0 45.2857 0 - 9 *-77.0833 45.2857 0 - 12 *-47.0833 45.2857 3 - 6 32.5 45.2857 3 - 9 -14.5833 45.2857 3 - 12 15.4167 45.2857 6 - 9 *-47.0833 45.2857 6 - 12 -17.0833 45.2857 9 - 12 30.0 45.2857 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ™ Este 9 Acid ascorbic Bảng 25 Multiple Range Tests for este by acid ascorbic -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD acid ascorbic Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 40 2303.4 X 100 40 2310.0 X 200 40 2349.6 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 100 -6.6 135.95 0 - 200 -46.2 135.95 100 - 200 -39.6 135.95 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxvii Bảng 26 Multiple Range Tests for este by mau chai -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD mau chai Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 60 2279.2 X 2 60 2362.8 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -83.6 111.003 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 27 Multiple Range Tests for este by nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 28 60 2310.73 X 10 60 2331.27 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 28 20.5333 111.003 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference Bảng 28 Multiple Range Tests for este by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 24 2264.17 X 12 24 2289.83 XX 3 24 2291.67 XX 9 24 2295.33 XX 6 24 2464.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 3 -27.5 175.511 0 - 6 *-199.833 175.511 0 - 9 -31.1667 175.511 0 - 12 -25.6667 175.511 3 - 6 -172.333 175.511 3 - 9 -3.66667 175.511 3 - 12 1.83333 175.511 6 - 9 168.667 175.511 6 - 12 174.167 175.511 9 - 12 5.5 175.511 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxviii 9 Acid sorbic Bảng 29 Multiple Range Tests for este by acid sorbic -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD acid sorbic Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1000 40 2271.5 X 0 40 2415.05 XX 500 40 2475.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 500 -59.95 171.79 0 - 1000 143.55 171.79 500 - 1000 *203.5 171.79 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference Bảng 30 Multiple Range Tests for este by mau chai -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD mau chai Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 60 2378.93 X 1 60 2395.43 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 16.5 140.266 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 31 Multiple Range Tests for este by nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 28 60 2324.67 X 10 60 2449.7 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 28 125.033 140.266 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxix Bảng 32 Multiple Range Tests for este by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 6 24 2288.92 X 9 24 2293.5 X 12 24 2297.17 X 0 24 2383.33 X 3 24 2673.0 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 3 *-289.667 221.779 0 - 6 94.4167 221.779 0 - 9 89.8333 221.779 0 - 12 86.1667 221.779 3 - 6 *384.083 221.779 3 - 9 *379.5 221.779 3 - 12 *375.833 221.779 6 - 9 -4.58333 221.779 6 - 12 -8.25 221.779 9 - 12 -3.66667 221.779 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ™ Aldehyde 9 Acid ascorbic Bảng 33 Multiple Range Tests for aldehyde by acid ascorbic -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD acid ascorbic Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 40 142.45 X 100 40 165.484 XX 200 40 172.764 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 100 -23.0348 24.0617 0 - 200 *-30.3147 24.0617 100 - 200 -7.28 24.0617 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 34 Multiple Range Tests for aldehyde by mau chai -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD mau chai Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 60 157.591 X 2 60 162.874 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -5.28267 19.6463 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxx Bảng 35 Multiple Range Tests for aldehyde by nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 10 60 152.202 X 28 60 168.264 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 28 -16.062 19.6463 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference Bảng 36 Multiple Range Tests for aldehyde by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 24 93.6637 X 3 24 122.068 X 6 24 157.436 X 9 24 202.637 X 12 24 225.358 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 3 -28.4042 31.0636 0 - 6 *-63.7725 31.0636 0 - 9 *-108.973 31.0636 0 - 12 *-131.695 31.0636 3 - 6 *-35.3683 31.0636 3 - 9 *-80.5692 31.0636 3 - 12 *-103.29 31.0636 6 - 9 *-45.2008 31.0636 6 - 12 *-67.9221 31.0636 9 - 12 -22.7213 31.0636 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 9 Acid sorbic Bảng 37 Multiple Range Tests for aldehyde by acid sorbic -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD acid sorbic Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 500 40 139.792 X 1000 40 165.356 X 0 40 186.915 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 500 *47.1228 17.3261 0 - 1000 *21.5598 17.3261 500 - 1000 *-25.563 17.3261 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxxi Bảng 38 Multiple Range Tests for aldehyde by mau chai -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD mau chai Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 60 159.506 X 2 60 168.536 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -9.02983 14.1467 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 39 Multiple Range Tests for aldehyde by nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 10 60 152.836 X 28 60 175.207 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 28 *-22.3708 14.1467 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 40 Multiple Range Tests for aldehyde by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 9 24 153.329 X 12 24 155.784 X 3 24 158.027 X 6 24 171.04 XX 0 24 181.926 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 3 *23.8992 22.3678 0 - 6 10.8854 22.3678 0 - 9 *28.5971 22.3678 0 - 12 *26.1421 22.3678 3 - 6 -13.0137 22.3678 3 - 9 4.69792 22.3678 3 - 12 2.24292 22.3678 6 - 9 17.7117 22.3678 6 - 12 15.2567 22.3678 9 - 12 -2.455 22.3678 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxxii ™ Màu rượu 9 Acid ascorbic Bảng 41 Multiple Range Tests for mau ruou by acid ascorbic -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD acid ascorbic Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 200 40 0.3867 X 100 40 0.406425 X 0 40 0.492025 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 100 *0.0856 0.043108 0 - 200 *0.105325 0.043108 100 - 200 0.019725 0.043108 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 42 Multiple Range Tests for mau ruou by mau chai -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD mau chai Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 60 0.428117 X 2 60 0.42865 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -0.000533333 0.0351975 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference Bảng 43 Multiple Range Tests for mau ruou by nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 28 60 0.3724 X 10 60 0.484367 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 28 *0.111967 0.0351975 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxxiii Bảng 44 Multiple Range Tests for mau ruou by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 24 0.382625 X 6 24 0.417042 X 3 24 0.431 XX 12 24 0.431208 XX 9 24 0.480042 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 3 -0.048375 0.0556521 0 - 6 -0.0344167 0.0556521 0 - 9 *-0.0974167 0.0556521 0 - 12 -0.0485833 0.0556521 3 - 6 0.0139583 0.0556521 3 - 9 -0.0490417 0.0556521 3 - 12 -0.000208333 0.0556521 6 - 9 *-0.063 0.0556521 6 - 12 -0.0141667 0.0556521 9 - 12 0.0488333 0.0556521 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. 9 Acid sorbic Bảng 45 Multiple Range Tests for mau ruou by acid sorbic -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD acid sorbic Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 500 40 0.602675 X 1000 40 0.78805 X 0 40 0.81695 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 500 *0.214275 0.0431336 0 - 1000 0.0289 0.0431336 500 - 1000 *-0.185375 0.0431336 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 46 Multiple Range Tests for mau ruou by mau chai -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD mau chai Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 60 0.732483 X 2 60 0.7393 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 -0.00681667 0.0352184 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxxiv Bảng 47 Multiple Range Tests for mau ruou by nhiet do -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhiet do Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 10 60 0.722333 X 28 60 0.74945 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 10 - 28 -0.0271167 0.0352184 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference Bảng 48 Multiple Range Tests for mau ruou by thoi gian -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD thoi gian Count LS Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 0 24 0.660667 X 3 24 0.725833 X 6 24 0.752833 X 9 24 0.768708 X 12 24 0.771417 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 0 - 3 *-0.0651667 0.0556853 0 - 6 *-0.0921667 0.0556853 0 - 9 *-0.108042 0.0556853 0 - 12 *-0.11075 0.0556853 3 - 6 -0.027 0.0556853 3 - 9 -0.042875 0.0556853 3 - 12 -0.0455833 0.0556853 6 - 9 -0.015875 0.0556853 6 - 12 -0.0185833 0.0556853 9 - 12 -0.00270833 0.0556853 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ™ Đánh giá cảm quan Bảng 49:Màu sắc theo nhân tố mẫu Multiple Range Tests for mau by nhan to mau -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhan to mau Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 4.2 X 1 10 4.4 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 0.2 0.542457 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 50:Độ trong theo nhân tố mẫu Multiple Range Tests for do trong by nhan to mau -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhan to mau Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 2 10 4.3 X 1 10 4.4 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 0.1 0.645653 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. Bảng 51: Mùi theo nhân tố mẫu Multiple Range Tests for mui by nhan to mau -------------------------------------------------------------------------------- Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp & Sinh học ứng dụng xxxv Method: 95.0 percent LSD nhan to mau Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 10 2.6 X 2 10 4.2 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-1.6 0.542457 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference Bảng 52: Vị theo nhân tố mẫu Multiple Range Tests for vi by nhan to mau -------------------------------------------------------------------------------- Method: 95.0 percent LSD nhan to mau Count Mean Homogeneous Groups -------------------------------------------------------------------------------- 1 10 2.0 X 2 10 4.1 X -------------------------------------------------------------------------------- Contrast Difference +/- Limits -------------------------------------------------------------------------------- 1 - 2 *-2.1 0.490216 -------------------------------------------------------------------------------- * denotes a statistically significant difference. ._.