Nghiên cứu các phương pháp phân tích đánh giá Rutin trong nụ hòe

lêi nãi ®Çu Y häc cµng ph¸t triÓn, chóng ta cµng t×m ®­îc rÊt nhiÒu ph­¬ng ph¸p ch÷a trÞ c¸c bÖnh nguy hiÓm. Do ®ã, vai trß cña ngµnh c«ng nghiÖp d­îc phÈm ngµy cµng ®­îc n©ng cao. C¸c lo¹i thuèc hiÖn nay ®­îc s¶n xuÊt tõ rÊt nhiÒu nguån kh¸c nhau, tõ qu¸ tr×nh sinh tæng hîp ®Õn c¸c lo¹i ®éng thùc vËt, nÊm, t¶o, vi sinh vËt… C¸c lo¹i thùc vËt trong tù nhiªn ®ãng mét vai trß v« cïng to lín trong c«ng nghiÖp d­îc phÈm, chóng cung cÊp c¸c acaloid, glycosid, vitamin... vµ ®Æc biÖt lµ nhãm flavonoid, mét nhãm hîp chÊt cã mÆt trong rÊt nhiÒu d­îc phÈm. Rutin còng lµ mét flavonoid ®­îc t×m thÊy trong nhiÒu lo¹i c©y, nã ®­îc dïng lµm thuèc t¨ng thµnh m¹ch vµ trÞ c¸c bÖnh liªn quan ®Õn cao huyÕt ¸p. Trªn thÕ giíi, rutin ®­îc s¶n xuÊt tõ nhiÒu thùc vËt kh¸c nhau nh­ lóa m¹ch ba gãc ë ch©u ¢u, l¸ b¹ch ®µn ë ¤xtr©ylia, l¸ c©y t¸o ta... Nhu cÇu vÒ rutin trªn thÕ giíi lµ rÊt lín, chØ riªng n­íc Ph¸p h»ng n¨m s¶n xuÊt 10 tÊn rutin vÉn kh«ng ®¸p øng ®­îc nhu cÇu sö dông. ë n­íc ta, nguån nguyªn liÖu ®Ó s¶n xuÊt rutin chñ yÕu lµ nô hoÌ víi hµm l­îng cao h¬n nhiÒu so víi c¸c nguyªn liÖu kÓ trªn. MÆt kh¸c, ®iÒu kiÖn khÝ hËu vµ thæ nh­ìng ë n­íc ta rÊt thuËn lîi cho c©y hße ph¸t triÓn, thu h¸i ®Ó chÕ biÕn d­îc liÖu. HiÖn nay, ®· cã dù ¸n x©y dùng nhµ m¸y s¶n xuÊt rutin ®Æt ë Diªm DiÔn – Th¸i B×nh víi n¨ng suÊt 300 tÊn rutin/n¨m. Do ®ã, nh÷ng ph©n tÝch, ®¸nh gi¸ hµm l­îng cña rutin trong nô hße vµ chÊt l­îng cña rutin s¶n phÈm lµ v« cïng quan träng. NhËn thøc ®­îc vÊn ®Ò ®ã, t«i ®i vµo nghiªn cøu c¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch ®¸nh gi¸ rutin. Tõ ®ã, x©y dùng ph­¬ng ph¸p ®¸nh gi¸ ph©n tÝch rutin phï hîp víi ®iÒu kiÖn hiÖn cã. phÇn tæng quan I. Giíi thiÖu vÒ c©y hoÌ vµ rutin I.1. C©y hoÌ Tªn khoa häc: Sophora japonica L. Tªn ®ång nghÜa: Stypnolobium japonicum (L.) [4]. Tªn kh¸c: Hße hoa, hoÌ mÔ, lµi luång (Tµy) [4]. Tªn n­íc ngoµi: Japanese pagoda – tree (NhËt), chinese scholar tree (Trung Quèc), Umbrella tree (Anh), sophora (Ph¸p) [4]. Hä: §Ëu (hay c¸nh b­ím) Fabaceae [4] I.1.1. M« t¶ C©y hße cao 5 - 7m, cã khi ®Õn 10m. Th©n cã vá h¬i nøt nÎ vµ cµnh n»m ngang. Th©n, cµnh h×nh trô, nh½n, mµu lôc nh¹t, cã nh÷ng chÊm tr¾ng. L¸ kÐp l«ng chim lÎ, mäc so le, 11 - 17 l¸ chÐt mäc ®èi, h×nh bÇu dôc – thu«n, gèc trßn, ®Çu nhän, dµi 3 - 4,5cm, réng 1,2 - 2cm, mµu lôc nh¹t. Côm hoa mäc ë ®Çu cµnh thµnh chïm dµi 20cm, ph©n nh¸nh nhiÒu. Hoa nhá mµu tr¾ng hoÆc vµng nh¹t, ®µi h×nh chu«ng. Mïa hoa th­êng ë c¸c th¸ng 5 - 10, ré nhÊt vµo th¸ng 7 - 9 [4,5]. Theo kinh nghiÖm d©n gian, ng­êi ta ph©n biÖt c©y hße nÕp, hße tÎ [4]: Hße nÕp: Hoa to, nhiÒu, ®Òu, në cïng mét lóc, cã mµu nh¹t, cuèng ng¾n. C©y ph¸t triÓn nhanh, ph©n nhiÒu cµnh. Hße tÎ: Hoa nhá, th­a thít, kh«ng ®Òu, në nhiÒu ®ît, cã mµu sÉm h¬n, cuèng dµi. C©y vuång cao, ph©n Ýt cµnh. I.1.2. Ph©n bè, sinh th¸i Hße thuéc lo¹i c©y gç trung sinh, ­a s¸ng vµ ­a Èm, th­êng ®­îc trång xen víi c©y ¨n qu¶. C©y hße ph©n bè chñ yÕu ë vïng nhiÖt ®íi vµ cËn nhiÖt ®íi [4]. VÝ dô: C©y hoÌ ph©n bè nhiÒu ë vïng §«ng ¸, §«ng Nam ¸: Trung Quèc, NhËt B¶n, TriÒu Tiªn,ViÖt Nam, vïng Trung ¸: Capcad¬, b¸n ®¶o Cr­m vµ mét sè n­íc Ch©u ©u nh­ Anh, Hungary... [4,5]. ë n­íc ta, c©y hße ®­îc trång réng r·i ë c¸c tØnh phÝa B¾c. Nh÷ng tØnh trång nhiÒu hoÌ hiÖn nay lµ Th¸i B×nh, Ninh B×nh, Thanh Hãa, NghÖ An, Hµ Nam, Lai Ch©u (vïng §iÖn Biªn), S¬n La, VÜnh Phóc, B¾c Giang... [5]. I.1.3. Bé phËn dïng Nô hoa ®· ph¬i hoÆc sÊy nhÑ ®Õn kh« (d©n gian th­êng gäi lµ hße mÔ). §Ó thu h¸i nô ng­êi ta chän nh÷ng chïm cã 5 - 10 hoa në. Thêi gian thu h¸i chñ yÕu vµo th¸ng 5 - 10 vµ th­êng thu h¸i vµo buæi s¸ng. Sau ®ã, ph¬i lu«n trong ngµy cho ®Õn khi nô gißn tan [4, 5]. Cã n¬i nh©n d©n thu h¸i lµm 2 vô [4]: -Vô mïa: tõ th¸ng 4 - 9, n¨ng suÊt thu ho¹ch cao nh­ng hµm l­îng rutin kh«ng b»ng vô chiªm. - Vô chiªm: tõ th¸ng 10 ®Õn th¸ng 1 n¨m sau, n¨ng suÊt thu ho¹ch thÊp, hµm l­îng rutin l¹i cao. C¸c bé phËn kh¸c còng dïng lµm thuèc lµ hoa ®· në (hße hoa) chøa kho¶ng 8% rutin, vá qu¶ (hße gi¸c) chøa kho¶ng 4 - 11% rutin, vµ l¸ cã kho¶ng 5 - 6% rutin [4, 5]. I.1.4. Hße d­íi con m¾t §«ng Y [7] Tôª TÜnh: Hße vÞ ®¾ng, tÝnh hoµ b×nh, kh«ng ®éc, s¸t trïng, ch÷a ghÎ, trÞ ®au m¾t, ®¹i tiÖn ra m¸u(tr­êng phong h¹ huyÕt), ®au yÕt hÇu. Lý thêi Tr©n: Hoa hße sao th¬m, nhÊm dÇn ch÷a c¸c chøng mÊt tiÕng, tª hÇu, thæ huyÕt, nôc huyÕt, b¨ng huyÕt. I.1.5. Thµnh phÇn ho¸ häc Ngµy nay, nô hoÌ lµ nguyªn liÖu ®Ó chiÕt xuÊt rutin (C27H30O16), mét lo¹i vitamin P cã t¸c dông t¨ng c­êng søc chÞu ®ùng cho mao m¹ch. Nô hße lµ nguyªn liÖu giµu rutin so víi nhiÒu nguyªn liÖu kh¸c. Víi nô hoÌ ViÖt Nam, hiÖu suÊt chiÕt xuÊt cã thÓ ®¹t tõ 28 - 36 % theo khèi l­îng kh« [6]. D­îc ®iÓn ViÖt Nam quy ®Þnh hµm l­îng ph¶i ®¹t Ýt nhÊt lµ 20% theo khèi l­îng kh« [3]. Cã thÓ so s¸nh víi mét sè nguyªn liÖu kh¸c: - Nô hße Hungary cã kho¶ng 12% rutin theo khèi l­îng kh« [1,3,4,5]. - M¹ch nha ba gãc ch©u ¢u chøa 2 - 3% rutin theo khèi l­îng kh« [1,4]. - L¸ b¹ch ®µn (¤xtr©ylia) cã kho¶ng 10-19% rutin theo khèi l­îng kh« [1]. - L¸ c©y t¸o ta cã kho¶ng 1,5% theo khèi l­îng kh« [1]. Hße nÕp chøa nhiÒu rutin (44%) h¬n hße tÎ (40,6%) [4]. Qua chÕ biÕn, hµm l­îng rutin cã thÓ thay ®æi: D¹ng sèng ®¹t kho¶ng 34,7%, d¹ng sao vµng ®¹t 28,9%, d¹ng sao ch¸y ®¹t 18,5% [4]. Ngoµi rutin, trong nô hoÌ cßn chøa betulin lµ dÉn chÊt trierpeniod nhãm lupan, sophoradiol lµ dÉn chÊt cña nhãm olean, Sophorin A (C20H36O17), Sophorin B (C27H45O10), Sophorin C (C27H48O10), sophorose, pectin... vµ c¸c flavonoid kh¸c [1,4,5]. I.2. Rutin Rutin lÇn ®Çu tiªn ®­îc ph©n lËp tõ c©y cöu lý h­¬ng (tªn khoa häc lµ Ruta graveolens L) vµo n¨m 1842 bëi Veyss, nªn cã tªn lµ rutin (tªn rutin theo tªn khoa häc cña c©y cöu lý h­¬ng). Rutin lµ mét glucozit mµ phÇn aglycon lµ quercetin (quercetol) vµ phÇn ®­êng lµ rutinose (). C«ng thøc ph©n tö: C27H30O16.3H2O. Khèi l­îng ph©n tö: - Khi ngËm 3 ph©n tö n­íc: 644,57. - Khèi l­îng khan: 610,53. C«ng thøc cÊu t¹o: H×nh 1 - C«ng thøc cÊu t¹o cña rutin. I.2.1. TÝnh chÊt vËt lý Rutin kÕt tinh d¹ng bét h×nh kim nhá, mµu vµng h¬i xanh lôc, kh«ng mïi, kh«ng vÞ, ra ¸nh s¸ng cã thÓ h¬i sÉm mµu [3]. *§é hoµ tan [3] -RÊt khã tan trong n­íc l¹nh: 1g/10.000ml. - Tan trong n­íc s«i: 1g/100ml. - Khã tan trong cån l¹nh: 1g/650ml. - Tan trong cån nãng: 1g/60ml. Rutin tan trong cån metylic, pyridin vµ trong c¸c dung dÞch kiÒm lo·ng, h¬i tan trong glycerin, khã tan trong etanol vµ isopropanol, thùc tÕ kh«ng tan trong n­íc, aceton, ete, cloroform, ete dÇu háa, bezen vµ cacbon disunfid. Tõ 183 - 1940C rutin bÞ ch¶y, víi tèc ®é t¨ng nhiÖt ®é lµ 50C/phót, qu¸ 1940c th× bÞ ch¶y vµ ph©n huû [3]. I.2.2. T¸c dông d­îc lý [4] 1- T¨ng c­êng søc ®Ò kh¸ng, gi¶m tÝnh thÈm thÊu cña mao m¹ch. Rutin lµ mét lo¹i vitamin P, cã t¸c dông t¨ng c­êng søc ®Ò kh¸ng, gi¶m tÝnh thÈm thÊu cña mao m¹ch, phôc håi tÝnh ®µn håi cña mao m¹ch ®· bÞ tæn th­¬ng. Trªn thá thÝ nghiÖm, rutin tiªm tÜnh m¹ch víi liÒu 1 mg/kg lµm chËm sù khuÕch t¸n cña c¸c chÊt mµu (nh­ xanh trypan, xanh evans) vµo tæ chøc d­íi da. Theo Parrot, c¬ chÕ t¸c dông cña rutin nh­ sau: Nã tham gia vµo qu¸ tr×nh oxy ho¸ - khö lµm gi¶m sù oxy ho¸ cña adrenalin b»ng c¸ch c¹nh tranh víi men catecholamin – O – methyltrasferase. Adrenalin cã t¸c dông t¨ng søc chÞu ®ùng cña mao m¹ch. MÆt kh¸c, rutin l¹i cã kh¶ n¨ng lµm co m¹ch trùc tiÕp hÖ mao qu¶n, nªn hiÖn t­îng gi¶m tÝnh thÈm thÊu cña mao m¹ch cßn do t¸c dông trùc tiÕp g©y nªn. ë ng­êi cao tuæi, mao m¹ch kh«ng cßn nguyªn vÑn nh­ tr­íc vµ sù trao ®æi chÊt gi¶m dÇn cµng thóc ®Èy qu¸ tr×nh l·o ho¸. Trong tr­êng hîp nµy, rutin l¹i cã kh¶ n¨ng duy tr× t×nh tr¹ng b×nh th­êng cña mao m¹ch, b¶o ®¶m cho mao m¹ch lµm ®­îc chøc n¨ng trao ®æi chÊt. Ngoµi ra, rutin cßn cã thÓ lµm t¨ng tr­¬ng lùc tÜnh m¹ch, cñng cè søc bÒn thµnh m¹ch, do ®ã h¹n chÕ ®­îc hiÖn t­îng suy tÜnh m¹ch lóc tuæi giµ. 2- T¸c dông chèng viªm ThÝ nghiÖm trªn chuét cèng tr¾ng, rutin cã t¸c dông øc chÕ phï bµn ch©n do albumun, histamin, serotonin g©y nªn còng nh­ s­ng khíp khuûu do men hyaluronidase t¹o nªn. ThÝ nghiÖm g©y viªm tÜnh m¹ch trªn chã b»ng c¸ch tiªm dÇu th«ng, dïng rutin ®iÒu trÞ cã t¸c dông thóc ®Èy qu¸ tr×nh håi phôc bÖnh. 3- T¸c dông b¶o vÖ c¬ thÓ chèng chiÕu x¹ Trªn chuét nh¾t tr¾ng, rutin tiªm d­íi da víi liÒu l­îng 2 mg/kg cã t¸c dông lµm gi¶m tû lÖ tö vong cña sóc vËt bÞ chiÕu x¹ víi liÒu l­îng lín. 4- T¸c dông h¹ huyÕt ¸p, h¹ cholesterol – m¸u DÞch chiÕt tõ nô hoÌ, b»ng ®­êng tiªm tÜnh m¹ch trªn chã ®· g©y mª cã t¸c dông h¹ huyÕt ¸p râ rÖt. Trªn chuét cèng tr¾ng, cao huyÕt ¸p di truyÒn, rutin tiªm tÜnh m¹ch víi liÒu l­îng 1 mg/kg còng cã t¸c dông h¹ huyÕt ¸p. 5- T¸c dông chèng kÕt tËp tiÓu cÇu Trªn thá thÝ nghiÖm, tiªm phóc m¹c víi liÒu 0,2 g/kg lµm gi¶m sè l­îng tiÓu cÇu vµ øc chÕ tËp kÕt tiÓu cÇu. 6-Mét sè t¸c dông kh¸c Cã b¸o c¸o cho biÕt rutin víi liÒu 40 - 400 mg/kg, quercetin víi liÒu 20 - 80 mg/kg cã t¸c dông kÐo dµi thêi gian sèng cña chuét nh¾t ®· ®­îc tiªm truyÒn tÕ bµo u NK/Ly. Ngoµi ra, rutin cßn cã t¸c dông b¶o vÖ gan. ThÝ nghiÖm trªn chuét cèng tr¾ng, dïng tetraclorua cacbon g©y tæn th­¬ng gan th× ho¹t ®éng cña men cytochrom P–450 bÞ øc chÕ. Dïng rutin theo ®­êng d¹ dµy víi liÒu 100 mg/kg cã t¸c dông kÝch ho¹t trë l¹i ho¹t ®éng cña men trªn. I.2.3. C«ng dông [4,5] Trong y häc hiÖn ®¹i, nô hoÌ vµ rutin ®­îc dïng lµm thuèc cÇm m¸u trong c¸c tr­êng hîp xuÊt huyÕt, ®Ò phßng tai biÕn do m¹ch m¸u bÞ x¬ v÷a, gißn dÔ v÷a, khi cã biÓu hiÖn vÒ tæn th­¬ng mao m¹ch, xuÊt huyÕt d­íi da, xuÊt huyÕt vâng m¹c, xuÊt huyÕt cã liªn quan ®Õn x¬ v÷a ®éng m¹ch, t¨ng huyÕt ¸p. rutin th­êng dïng cho nh÷ng bÖnh nh©n t¨ng huyÕt ¸p, mao m¹ch dÔ vì, ®Ò phßng ®øt m¹ch m¸u n·o, xuÊt huyÕt cÊp tÝnh do viªm thËn. Cã thÓ dïng phèi hîp víi papaverin. Trªn thÞ tr­êng hiÖn cã viªn nÐn rutin lo¹i 0,02g. Cã thÓ dïng phèi hîp víi vitamin C: ViÖt Nam cã s¶n xuÊt viªn rutin – vitamin C (hay rutin –C) gåm 0,02g rutin vµ 0,05g Vitamin C. ThÕ giíi cßn cã lo¹i thuèc tiªm rutin tan, ®­îc gäi lµ Solurutin dïng ®Ó tiªm b¾p thÞt hoÆc tÜnh m¹ch khi cÇn thiÕt. I.2.4. C¸c nguån d­îc liÖu ®Ó chiÕt rutin [1,3] 1-Lóa m¹ch 3 gãc: Tªn khoa häc: Fagopyrum esculentum Moench [1]. Tªn ®ång nghÜa: Polygonum fagopyrum L [1]. Hä: Rau r¨m Polygonaceae [1]. §©y lµ lo¹i c©y l­¬ng thùc, h¹t cã nhiÒu tinh bét. C©y mäc hµng n¨m, th©n cã thÓ cao 80cm. L¸ h×nh mòi m¸c, hoa mµu tr¾ng hoÆc hång, qu¶ cã 3 gãc dµi 5 - 6mm, réng 2 - 3mm, mµu n©u. Lóa m¹ch 3 gãc kh«ng ®ßi hái ®Êt mµu mì, cã thÓ trång ë c¸c vïng ®Êt nghÌo nh­ Hoµng Liªn S¬n, Cao B»ng… Khi c©y b¾t ®Çu ra hoa (nghÜa lµ kho¶ng 5 - 6 tuÇn sau khi gieo h¹t) th× m¹ch 3 gãc ®­îc thu ho¹ch ®Ó chiÕt rutin. L¸ c©y chøa 2 - 3% rutin (theo khèi l­îng kh«). B»ng kü thuËt c¶i t¹o gièng (g©y ®a béi) ng­êi ta ®· t¹o ®­îc nh÷ng chñng m¹ch 3 gãc cã hµm l­îng 5 - 8% rutin. Tû lÖ rutin cao ë c©y tr­íc khi ra hoa. Th©n vµ hoa cã Ýt rutin, h¹t kh«ng cã rutin. L¸ cã chøa mét s¾c tè ®á lµ fagopyrin. ChÊt nµy xuÊt hiÖn vÒ sau trong qu¸ tr×nh tr­ëng thµnh cña c©y, ®©y lµ dÉn xuÊt dianthron. Trong qu¸ tr×nh chiÕt xuÊt rutin cÇn ph¶i lo¹i bá chÊt nµy b»ng c¸ch cho hÊp phô lªn Silicagel. 2- C©y t¸o ta Tªn khoa häc: Ziziphus mauritiana Lamk [1]. Tªn ®ång nghÜa: Zizyphus jujuba Lamk [1]. Hä: t¸o ta Rhamanceae [1]. L¸ t¸o còng cã rutin víi hµm l­îng 1,5% theo khèi l­îng kh«. 3-C©y b¹ch ®µn Tªn khoa häc: Eucalyptus macrorrhyncha F Muell [1]. C©y cao 25 - 30m, vá mµu ®á, cã nhiÒu ë Autralia (bang Victoria), c©y mäc ë ®é cao 300 - 1000m. L¸ sÊy kh« ngay ë nhiÖt ®é 1000C. Hµm l­îmg rutin trong l¸ trung b×nh 10% vµ cã thÓ ®Õn 19% trong l¸ non. ë Australia, rutin ®­îc chiÕt xuÊt b»ng n­íc nãng, ®Ó nguéi, rutin th« kÕt tña, trong dÞch chiÕt cßn l¹i tanin vµ c¸c t¹p chÊt kh¸c. Tinh chÕ b»ng c¸ch kÕt tinh l¹i trong n­íc hoÆc trong cån lo·ng. 4-Nô hße Nh­ ®· nªu ë trªn, nô hoÌ cã ë nhiÒu n¬i trªn thÕ giíi tuy nhiªn hµm l­îng rutin trong nô hoÌ ë ViÖt Nam lµ cao h¬n c¶, cã thÓ ®¹t tíi 44% ë hße nÕp vµ 40,6% ë hße tÎ theo khèi l­îng kh« [4]. II. Nghiªn cøu c¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch rutin II.1. C¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch th«ng th­êng II.1.1. C¸c ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch ®Þnh tÝnh Sau ®©y lµ mét sè nh÷ng ph¶n øng nhËn biÕt sù cã mÆt cña rutin trong dung dÞch [3]: LÊy 0,5g bét hoÌ ®un s«i víi 5ml cån 950 trong 3 phót, läc: 1.LÊy 0,5ml dÞch läc trªn thªm 5ml dung dÞch NaOH 0,1N sÏ thÊy mµu vµng t¨ng lªn. 2. LÊy 0,5ml dÞch läc, pha lo·ng víi cån, thªm 5 giät HCl ®Ëm ®Æc vµ mét Ýt bét magiª, sau vµi phót sÏ xuÊt hiÖn mµu hång ®Õn ®á. 3. Hoµ tan kho¶ng 0,02g bét nô hoÌ trong 5ml ethanol b»ng c¸ch ®un nãng nhÑ, thªm 1ml axit HCl 25% vµ 0,1g bét kÏm, dung dÞch chuyÓn sang mµu ®á. 4. Hoµ tan kho¶ng 0,01g bét nô hoÌ trong 10ml ethanol thªm 1 - 2 giät FeCl3 3% sÏ cã mµu n©u h¬i lôc. 5. LÊy 0,1g chÕ phÈm, thªm 3ml axÝt HCl lo·ng vµ 10ml n­íc. §un c¸ch thuû, cã l¾p sinh hµn ng­îc, trong 2 giê. §Ó nguéi råi läc. LÊy 5ml dÞch läc, trung hoµ b»ng dung dÞch NaOH 10%, thªm 3ml thuèc thö Fehling, ®un c¸ch thuû s«i 10 phót sÏ xuÊt hiÖn kÕt tña ®á g¹ch. II.1.2. §Þnh l­îng rutin b»ng ph­¬ng ph¸p khèi l­îng [1,3] Ph­¬ng ph¸p khèi l­îng hay cßn gäi lµ ph­¬ng ph¸p c©n. Nguyªn t¾c cña ph­¬ng ph¸p lµ chuyÓn rutin thµnh quercetin rÊt Ýt tan. Tõ ®ã tÝnh ra rutin. Trong m«i tr­êng axÝt, rutin thñy ph©n ra quercetin theo ph­¬ng tr×nh sau: + - D – glucoza vµ L- ramnoza *C¸ch tiÕn hµnh: C©n 2g bét hoÌ, ng©m víi 20ml HCl 0,5%, thØnh tho¶ng khuÊy m¹nh. Sau 2 giê, g¹n dung dÞch qua phÔu läc. Röa bét nhiÒu lÇn víi n­íc cho ®Õn khi dÞch läc trung tÝnh. ChuyÓn hÕt bét d­îc liÖu qua phÔu, dïng n­íc röa vµ còng läc qua phÔu. GiÊy läc vµ bét ®­îc chiÕt víi 20ml cån ethanol 95o trong mét b×nh cã l¾p èng sinh hµn ng­îc. Sau khi cån s«i 15 phót, lµm nguéi b×nh vµ g¹n qua phÔu läc vµo mét cèc. Bét l¹i ®­îc chiÕt víi 25 ml cån 95o còng lµm nh­ trªn. TiÕp tôc chiÕt víi nh÷ng l­îng 10 ml cån 95o cho ®Õn khi dÞch chiÕt kh«ng mµu vµ kh«ng cho mµu vµng víi dung dÞch NaOH 0,1N. Röa b×nh vµ phÔu víi 10ml cån 95o nãng. TËp trung c¸c dÞch chiÕt vµ dÞch röa l¹i, cho vµo b×nh cÇu 200ml vµ lµm bèc h¬i cån ®Õn gÇn kh«. Thªm vµo b×nh 100ml dung dÞch axit H2SO4 2%, ®un s«i trong 3 giê. Thu toµn bé kÕt tña quercetinvµo mét phÔu thuû tinh. Röa kÕt tña 4 lÇn, mçi lÇn víi 5ml n­íc l¹nh. SÊy kh« tña ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi ë 1250C. Hµm l­îng phÇn tr¨m rutin = (%) (1) Trong ®ã: P: khèi l­îng quercetin thu ®­îc. 2,019: 1g quercetin t­¬ng øng víi 2,019g rutin khan (C27H30O16). II.2. Ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn [3] II.2.1. C¬ së ph­¬ng ph¸p Ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn cßn ®­îc gäi lµ ph­¬ng ph¸p quang phæ hÊp thô ®iÖn tö, lµ mét trong nh÷ng ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch dùa trªn sù hÊt thô bøc x¹ ®iÖn tõ. §Þnh luËt c¬ b¶n vÒ sù hÊp thô bøc x¹ ®iÖn tõ cña c¸c dung dÞch lµ ®Þnh luËt Lambert – Beer, biÓu thÞ b»ng ph­¬ng tr×nh sau: . (2) Trong ®ã: I0: c­êng ®é cña bøc x¹ tíi. I: c­êng ®é cña bøc x¹ sau khi ®· qua dung dÞch (c­êng ®é bøc x¹ truyÒn qua). l: chiÒu dµy líp dung dÞch (culvet). k: hÖ sè hÊp thô, lµ h»ng sè ®èi víi mét chÊt. C: nång ®é dung dÞch. T= I/I0 : ®é truyÒn qua. = D =E : ®é hÊp thô ( hoÆc mËt ®é quang) cña dung dÞch. §é hÊp thô E cã gi¸ trÞ cùc ®¹i khi ë b­íc sãng hÊp thô cùc ®¹i. §Þnh luËt Lambert – Beer cho phÐp x¸c ®Þnh nång ®é cña c¸c dung dÞch hÊp thô bøc x¹ ®iÖn tõ b»ng c¸ch ®o ®é hÊp thô: (3) §Þnh luËt Lambert – Beer chØ nghiÖm thËt ®óng khi dïng bøc x¹ ®¬n s¾c, do ®ã ®Ó ¸p dông trong ph­¬ng ph¸p ®o quang phæ hÊp thô cÇn ph¶i t¹o ra bøc x¹ ®¬n s¾c (b»ng l¨ng kÝnh hoÆc c¸ch tö nhiÔu x¹). Trong thùc tÕ th­êng gÆp c¸c tr­êng hîp kh«ng tu©n theo ®óng ®Þnh luËt Lambert – Beer. Khi ®ã, ta dïng ®­êng cong chuÈn “mËt ®é quang/nång ®é” ®Ó suy ra kÕt qu¶ ®Þnh l­îng. Ph­¬ng ph¸p quang phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn dïng c¸c bøc x¹ ®iÖn tõ trong vïng tö ngo¹i gÇn (200 - 400nm) vµ trong vïng kh¶ kiÕn (400 - 800nm). II.2.2. M¸y quang phæ hÊp thô [9] HiÖn t¹i c¸c m¸y quang phæ hÊp thô trong vïng tö ngo¹i gÇn vµ nh×n thÊy (kÝ hiÖu lµ UV – VIS ), ®­îc thiÕt kÕ lµm viÖc trong vïng 200 - 1500nm. ë miÒn bøc x¹ nhá h¬n 200nm m¸y lµm viÖc khã kh¨n, ph¶i lµm viÖc trong ch©n kh«ng nªn Ýt sö dông. §Ó lµm viÖc ë vïng tõ 200 - 1500nm trong m¸y thiÕt kÕ hai nguån ph¸t bøc x¹. Khi lµm viÖc ë b­íc sãng cã <350nm, ng­êi ta dïng ®Ìn ph¸t x¹ lµ c¸c lo¹i hå quang ®iÖn trong mét sè bÇu khÝ nh­: hydro, ®¬t¬ri, xenon, h¬i thuû ng©n. Trong ®ã hå quang qua khÝ ®¬t¬ri lµ phæ biÕn nhÊt. Bé t¸n s¾c th­êng dïng lµ lo¹i c¸ch tö nhiÔu x¹ víi hµng sè c¸ch tö 1200 v¹ch/mm. Bé ghi bøc x¹ cã thÓ lµ c¸c tÕ bµo quang ®iÖn ghÐp nèi víi bé khuÕch ®¹i vµ bé vi xö lý nªn m¸y ®o cã ®é nh¹y rÊt cao vµ cã thÓ ghi theo chÕ ®é gi¸n ®o¹n hoÆc ghi liªn tôc theo chÕ ®é tù ®éng. Ngµy nay, m¸y quang phæ hÊp thô th­êng ®­îc kÕt nèi víi m¸y tÝnh vµ cã phÇn mÒm hç trî. Trªn h×nh 2 lµ s¬ ®å nguyªn lý ho¹t ®éng cña m¸y quang phæ. A P M C S H×nh 2 – S¬ ®å nguyªn lý ho¹t ®éng cña m¸y quang phæ tö ngo¹i ¸nh s¸ng tõ nguån A ®­îc ph©n t¸ch bëi l¨ng kÝnh P, råi héi tô trªn g­¬ng M, g­¬ng nµy tô tiªu phæ cña nguån ph¸t vµo mÆt ph¼ng khe hë S. Ng­êi ta cho chïm s¸ng ®i qua dung m«i hoÆc dung dÞch vµ ®o c­êng ®é cña nã nhê tÕ bµo quang ®iÖn hoÆc nh©n quang ®iÖn tö C. II.2.3. øng dông ph­¬ng ph¸p quang phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn Ph­¬ng ph¸p quang phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn ®­îc ¸p dông ®Ó ®Þnh tÝnh, thö tinh khiÕt vµ ®Þnh l­îng c¸c chÊt cã cÊu t¹o ®Æc biÖt nh­: c¸c hîp chÊt th¬m, hîp chÊt cã chøa c¸c liªn kÕt ch­a b·o hoµ, c¸c hîp chÊt mµu... * §Þnh tÝnh, thö tinh khiÕt: §Þnh tÝnh mét chÊt b»ng phæ hÊp thô tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn cña chÊt ®ã. Phæ hÊp thô lµ ®å thÞ biÓu diÔn sù phô thuéc cña ®é hÊp thô vµo b­íc sãng. ThiÕt lËp phæ hÊp thô b»ng c¸ch ®o ®é hÊp thô cña dung dÞch cã nång ®é x¸c ®Þnh víi c¸c bøc x¹ cã b­íc sãng t¨ng hoÆc gi¶m dÇn. Sau ®ã, vÏ ®å thÞ ®é hÊp thô/b­íc sãng, ta sÏ cã mét phæ hÊp thô. Trªn phæ hÊp thô sÏ nhËn thÊy c¸c cùc ®¹i hÊp thô ( øng víi b­íc sãng t¹i ®ã sù hÊp thô lµ cùc ®¹i) vµ c¸c cùc tiÓu nÕu cã. C¸c chÊt kh¸c nhau th­êng cã phæ hÊp thô kh¸c nhau. Do ®ã ng­êi ta th­êng dïng phæ hÊp thô ®Ó ®Þnh tÝnh hoÆc ®Ó thö tinh khiÕt c¸c chÊt, c¨n cø vµo d¹ng phæ, c¸c cùc ®¹i vµ cùc tiÓu hÊp thô, tû lÖ c­êng ®é hÊp thô cña c¸c cùc ®¹i hoÆc cùc tiÓu hÊp thô. * §Þnh l­îng: Ta ®Þnh l­îng mét chÊt b»ng c¸ch ®o ®é hÊp thô cña dung dÞch ë b­íc sãng x¸c ®Þnh, th­êng lµ ë b­íc sãng hÊp thô cùc ®¹i () cña nã. Nång ®é cña dung dÞch ®­îc tÝnh theo c«ng thøc (3). §Ó gi¶m sai sè cña ph­¬ng ph¸p, nªn chän nång ®é vµ chiÒu dµy líp dung dÞch sao cho ®é hÊp thô ®o ®­îc trong kho¶ng 0,2-0,7 vµ cµng gÇn gi¸ trÞ 0,43 cµng tèt. §Ó tÝnh hÖ sè hÊp thô k, ta ®o ®é hÊp thô cña c¸c dung dÞch cã nång ®é ®· biÕt råi tÝnh theo c«ng thøc: (4) NÕu nång ®é ®­îc tÝnh b»ng mol/lÝt vµ chiÒu dµy tÝnh b»ng cm, th× hÖ sè ®ã ®­îc gäi lµ hÖ sè hÊp thô ph©n tö gam vµ kÝ hiÖu lµ ä. NÕu nång ®é biÓu thÞ b»ng sè gam trong 100ml vµ chiÒu dµy líp dung dÞch ®o b»ng cm th× hÖ sè ®ã ®­îc gäi lµ hÖ sè hÊp thô riªng vµ kÝ hiÖu lµ E(1%, 1cm). Khi kh«ng biÕt hÖ sè k, ä hoÆc E(1%, 1cm) cña chÊt cÇn ®Þnh l­îng hoÆc khi m¸y kh«ng chuÈn ho¸ ®­îc, ta ph¶i dïng ®­êng cong chuÈn, “mËt ®é quang/nång ®é ” nh­ trong ph­¬ng ph¸p ®o quang. II.2.4. Nghiªn cøu rutin b»ng ph­¬ng ph¸p quang phæ tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn Nh­ ta ®· biÕt, rutin lµ mét hîp chÊt th¬m víi nhiÒu liªn kÕt ch­a b·o hoµ trong ph©n tö. CÊu t¹o cña nã rÊt thÝch hîp ®Ó ¸p dông ph­¬ng ph¸p quang phæ tö ngo¹i vµ kh¶ kiÕn ®Ó nghiªn cøu vµ ph©n tÝch. Khi ®Þnh tÝnh, thö tinh khiÕt ta ®em so s¸nh víi phæ cña rutin chuÈn, khi ®Þnh l­îng ta dùa vµo ®é hÊt thô cña rutin ë c¸c nång ®é kh¸c nhau. 1-Ph©n tÝch ®Þnh tÝnh [3] Phæ hÊp thô tö ngo¹i cña dung dÞch rutin (trong cån methanol hoÆc dung dÞch cån etanol – axit acetic) cã c¸c cùc ®¹i ë 259 ± 1 nm vµ 362,5 ± 1 nm. C¸ch tiÕn hµnh ®­îc nªu ë phÇn ph©n tÝch ®Þnh l­îng d­íi ®©y. 2-Ph©n tÝch ®Þnh l­îng [3] a. §Þnh l­îng rutin dïng dung m«i methanol *Pha dung dÞch rutin chuÈn: C©n 50mg rutin chuÈn ®· ®­îc sÊy kh« tr­íc (trong ch©n kh«ng) tíi khèi l­îng kh«ng ®æi ë 1200C, vµo mét b×nh ®Þnh møc 10ml. Hoµ tan b»ng methanol ®Õn ®ñ thÓ tÝch, l¾c ®Òu. LÊy 1ml dung dÞch nµy cho vµo mét b×nh ®Þnh møc 10ml, thªm n­íc tíi ®ñ thÓ tÝch, l¾c kü. Dung dÞch rutin thu d­îc cã nång ®é 0,5mg/ml. *X©y dùng ®­êng chuÈn: LÊy chÝnh x¸c 0,50; 1,0 vµ 1,50ml dung dÞch chuÈn ë trªn vµo c¸c b×nh ®Þnh møc 10ml riªng biÖt, thªm methanol tíi ®ñ thÓ tÝch vµ l¾c ®Òu. TiÕn hµnh ph­¬ng ph¸p quang phæ, ®o ®é hÊp thô ë 362,5nm. §­êng chuÈn thu ®­îc do m¸y tÝnh tù ®éng vÏ, lÊy ®é hÊp thô lµm tung ®é, nång ®é lµm hoµnh ®é. *TiÕn hµnh: C©n 5g bét nô hoÌ ®· d­îc sÊy kh« ë 600C trong 6 giê, cho vµ dông cô chiÕt sohxlet. Thªm 250ml methanol vµ chiÕt tíi khi dÞch chiÕt kh«ng mµu. DÞch chiÕt ®­îc cÊt quay ch©n kh«ng thu håi dung m«i, cßn l¹i kÕt tña sÊy kh« 600C ®Õn khèi l­îng kh«ng ®æi vµ c©n. C©n 50mg kÕt tña ®· sÊy ë trªn vµ riÕn hµnh pha nh­ ë phÇn “dung dÞch rutin chuÈn”. Sau ®ã lÊy 1ml dung dÞch võa pha vµo b×nh ®Þnh møc 10ml, thªm methanol ®Õn ®ñ thÓ tÝch vµ l¾c ®Òu. TiÕn hµnh ph­¬ng ph¸p quang phæ nh­ ë phÇn “x©y dùng ®­êng chuÈn”, m¸y tÝnh sÏ tù ®éng hiÓn thÞ kÕt qu¶ nång ®é, khèi l­îng rutin trong dung dÞch mÉu thö. Tõ kÕt qu¶ thu ®­îc tÝnh to¸n ra hµm l­îng rutin trong nô hoÌ: (5) Trong ®ã: m: khèi l­îng rutin trong 10ml dung dÞch mÉu thö (mg) n: khèi l­îng kÕt tña thu ®­îc (g) b. §Þnh l­îng rutin dïng dung m«i ethanol [3] C©n 75mg rutin chuÈn cho vµo b×nh ®Þnh møc 100ml, hoµ tan víi ethanol tuyÖt ®èi b»ng ®un nãng. Sau ®ã thªm ethanol cho ®ñ thÓ tÝch vµ l¾c ®Òu. LÊy 2ml dung dÞch nµy cho vµo mét b×nh ®Þnh møc 100ml, thªm 1ml dung dÞch axÝt acetic 0,02N, sau thªm ethanol cho ®Õn v¹ch vµ l¾c ®Òu. X¸c ®Þnh ®é hÊp thô cña dung dÞch thu ®­îc ë c¸c b­íc sãng 362,5nm vµ 375nm, dïng mÉu tr¾ng lµ dung dÞch ethanol tuyÖt ®èi cã 1% axÝt acetic 0,02N. NÕu tû sè ®é hÊp thô A375/A362,5 ë trong kho¶ng 0,875 ± 0,004 th× quang phæ kÕ thÝch hîp ®Ó ®o ®é hÊp thô cña mÉu ®Þnh l­îng. NÕu tû sè A375/A362,5 n»m ngoµi kho¶ng trªn th× ta ph¶i t×m b­íc sãng x sao cho: x lµ vïng l©n cËn cña b­íc sãng 375nm vµ tû sè Ax/A362,5 ë trong kho¶ng trªn. B­íc sãng x t×m ®­îc sÏ thay thÕ cho b­íc sãng 375nm. * §o mÉu thö: C©n 75mg mÉu thö ®· sÊy kh« vµ tiÕn hµnh pha nh­ víi rutin chuÈn ë trªn. X¸c ®Þnh ®é hÊp thô cña dung dÞch mÉu thö ë c¸c b­íc sãng 362,5nm vµ 375nm (hoÆc xnm), mÉu tr¾ng dïng nh­ víi rutin chuÈn ë trªn. Gäi ®é hÊp thô ®o ®­îc cña mÉu thö ë 362,5nm lµ vµ ë 375nm (hay xnm) lµ . NÕu tû sè ë trong kho¶ng 0,875 ± 0,004, hµm l­îng phÇn tr¨m C27H30O16 trong mÉu thö ®­îc tÝnh theo c«ng thøc sau: (6) Trong ®ã: 325,5 lµ A(1%,1cm) cña rutin ë 362,5nm p: khèi l­îng mÉu thö tÝnh b»ng g. NÕu tû sè > 0,879, hµm l­îng phÇn tr¨m C27H30O16 trong mÉu thö ®­îc tÝnh theo c«ng thøc: (7) Trong ®ã: p: Khèi l­îng mÉu thö tÝnh b»ng g. II.3. Ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch s¾c ký S¾c ký lµ ph­¬ng ph¸p ph©n t¸ch, ph©n ly, ph©n tÝch c¸c chÊt dùa vµo sù ph©n bè kh¸c nhau cña chóng gi÷a hai pha ®éng vµ tÜnh. S¾c ký lµ qu¸ tr×nh t¸ch tõng vi ph©n hçn hîp c¸c chÊt do sù ph©n bè kh«ng ®ång ®Òu cña chóng gi÷a pha tÜnh vµ pha ®éng khi cho pha ®éng ®i xuyªn qua pha tÜnh [9,10]. Nguyªn t¾c chung cña ph­¬ng ph¸p ph©n tÝch s¾c ký nh­ sau: Hçn hîp chøa chÊt ph©n tÝch th­êng ë pha ®éng, c¸c chÊt kh¸c nhau trong hçn hîp sÏ cã ¸i lùc kh¸c nhau víi pha ®éng vµ pha tÜnh. Trong qu¸ tr×nh chuyÓn ®éng cña hçn hîp ph©n tÝch qua c¸c líp pha tÜnh, sÏ lÆp ®i lÆp l¹i qu¸ tr×nh hÊp phô – ph¶n hÊp phô. HÖ qu¶ lµ c¸c chÊt cã ¸i lùc lín víi pha tÜnh sÏ chuyÓn ®éng chËm h¬n so víi c¸c chÊt t­¬ng t¸c yÕu h¬n víi pha tÜnh. Nhê ®Æc ®iÓm nµy, ng­êi ta cã thÓ t¸ch c¸c chÊt b»ng qu¸ tr×nh s¾c ký [9]. II.3.1. Ph©n lo¹i s¾c ký Tuú thuéc vµo tr¹ng th¸i tËp hîp cña c¸c pha, lo¹i t­¬ng t¸c vµ sù h×nh thµnh s¾c ký mµ ng­êi ta ph©n biÖt c¸c lo¹i s¾c ký nh­ tr×nh bµy ë b¶ng 1. B¶ng 1 - C¸c d¹ng s¾c ký c¬ b¶n D¹ng s¾c ký Pha ®éng Pha tÜnh C¸ch ph©n bè pha tÜnh C¬ chÕ trao ®æi chÊt KhÝ KhÝ – hÊp phô KhÝ - láng Láng Láng – r¾n Láng – láng Láng – nhùa trao ®æi Líp máng GiÊy R©y ( s¾c ký gel ) khÝ khÝ láng láng láng láng láng láng láng r¾n láng r¾n láng r¾n r¾n láng láng láng cét cét cét cét cét líp máng líp máng giÊy s¾c ký cét hÊp phô ph©n bè hÊp phô ph©n bè trao ®æi ion hÊp phô ph©n bè ph©n bè theo kÝch th­íc ph©n tö II.3.2. S¾c ký khÝ Trong s¾c ký khÝ (gas chromatography, viÕt t¾t GC) th× tuú thuéc vµo tr¹ng th¸i pha tÜnh mµ ng­êi ta ph©n biÖt: s¾c ký khÝ-hÊp phô khi pha tÜnh lµ chÊt hÊp phô r¾n, s¾c ký khÝ-láng khi pha tÜnh lµ chÊt láng (hay chÝnh x¸c h¬n lµ mµng chÊt láng trªn bÒ mÆt chÊt mang r¾n). Cét s¾c ký ®­îc chÕ t¹o b»ng èng thñy tinh, thÐp, ®ång hoÆc b»ng chÊt dÎo ®Æc biÖt, ®­êng kÝnh cét cã thÓ tõ 3 - 6mm, cã thÓ dµi tõ vµi chôc centimet ®Õn hµng chôc mÐt. Cét cã thÓ d¹ng th¼ng, h×nh ch÷ U hoÆc h×nh xo¾n. Tuú theo lo¹i s¾c ký khÝ mµ bªn trong cét th­êng nhåi c¸c chÊt hÊp phô r¾n hoÆc chÊt mang cã phñ mµng máng (pha tÜnh láng). Trong s¾c ký khÝ-hÊp phô, chÊt r¾n hÊp phô cã thÓ dïng: than ho¹t tÝnh kh«ng ph©n cùc, silicagel, zeolit... Trong s¾c ký khÝ-láng, th­êng dïng c¸c dung m«i sau lµm pha tÜnh: dÇu vaz¬lin, dÇu silicon, dimetylformamit, tricresyl photphat, c¸c alkyl phtalat..., ®Æc biÖt lµ c¸c tinh thÓ láng nh­ c¸c este azocxy. ChÊt mang r¾n th­êng lµ c¸c chÊt tr¬, th­êng dïng kizengua, diatomit, teflon... Pha ®éng lµ mét dßng chÊt khÝ chän tr­íc ®Ó t¶i chÊt nghiªn cøu ë thÓ khÝ qua cét, chÊt khÝ nµy gäi lµ khÝ mang. ViÖc chän khÝ mang dùa vµo lo¹i detect¬ dïng trong hÖ s¾c ký. Detect¬ lµ bé phËn ghi nhËn sù thay ®æi liªn tôc cña nång ®é hay c¸c tham sè kh¸c trong dßng khÝ tho¸t ra khái cét s¾c ký. VÝ dô: Khi dïng catoromet hoÆc detect¬ ngän löa ion ho¸ ng­êi ta hay dïng khÝ heli, nit¬ lµm khÝ mang vµ khi dïng detect¬ kiÓu b¾t ®iÖn tö (vÝ dô detect¬ argon) ng­êi ta dïng nit¬ lµm khÝ mang... Trªn h×nh 3 tr×nh bµy s¬ ®å khèi cña mét m¸y s¾c ký khÝ, bé phËn quan träng cña m¸y lµ hÖ thèng cét t¸ch vµ detect¬. Nhê khÝ mang chøa trong b×nh (1), mÉu nghiªn cøu tõ buång h¬i (2) ®­îc dÉn vµo cét t¸ch s¾c ký (3), cét s¾c ký ®­îc æn nhiÖt theo yªu cÇu cña phÐp ph©n tÝch nhê thiÕt bÞ æn nhiÖt (8). Qu¸ tr×nh t¸ch sÏ x¶y ra trªn cét s¾c ký. Sau khi c¸c cÊu tö rêi khái cét t¹i c¸c thêi ®iÓm kh¸c nhau, sÏ ®i vµo detect¬ (4), t¹i ®ã chóng ®­îc chuyÓn thµnh tÝn hiÖu ®iÖn. C¸c tÝn hiÖu sÏ ®­îc khuÕch ®¹i ë bé khuÕch ®¹i (5) vµ ®­îc xö lý nhê c¸c bé vi xö lý d­a ra c¸c sè liÖu trªn bé ghi (6). 9 8 7 MÉu 2 4 1 3 5 6 H×nh 3 – S¬ ®å khèi cña m¸y s¾c ký khÝ 1 – b×nh khÝ mang; 2 – bé n¹p khÝ; 3 – cét s¾c ký; 4 – detect¬; 5 – bé khuÕch ®¹i; 6 – bé ghi; 7, 8, 9 – æn nhiÖt. II.3.2.1. Ph©n tÝch ®Þnh tÝnh b»ng s¾c ký khÝ H C D B A tA tB tC tD tr H×nh 4- S¾c ký ®å hçn hîp A, B, C, D. Trong qu¸ tr×nh s¾c ký ng­êi ta sÏ ghi ®­îc s¾c ký ®å. Tõ s¾c ký ®å ta sÏ nhËn ®­îc c¸c pic s¾c ký t­¬ng øng cña tõng cÊu tö. Thêi gian l­u (tr) cña pic lµ ®Æc tr­ng ®Þnh tÝnh cho c¸c chÊt. §Ó ph©n tÝch ®Þnh tÝnh, ta so s¸nh kÕt qu¶ thu ®­îc víi b¶ng sè liÖu hoÆc kÕt qu¶ cña mÉu chuÈn ®­îc tiÕn hµnh cïng ®iÒu kiÖn. §Ó cã ®­îc kÕt qu¶ chÝnh x¸c h¬n, ng­êi ta th­êng tiÕn hµnh s¾c ký theo nhiÒu cÊp, nghÜa lµ thµnh phÇn t¸ch ë cét s¾c ký tr­íc ®­îc ®­a sang cét s¾c ký tiÕp theo, ë ®©y viÖc t¸ch sÏ thùc hiÖn s©u xa h¬n. HiÖn nay, ng­êi ta ®· chÕ t¹o ®­îc thiÕt bÞ s¾c ký khÝ kÕt hîp khèi phæ (Gas chromatography mass spectrum, viÕt t¾t lµ GCMS) vµ ®­îc kÕt nèi víi m¸y tÝnh nhê ®ã n©ng cao ®­îc ®é nh¹y, ®é chÝnh x¸c còng nh­ cã thÓ tù ®éng ho¸ qu¸ tr×nh ph©n tÝch s¾c ký. II.3.2.2. Ph©n tÝch ®Þnh l­îng b»ng s¾c ký khÝ Ph©n tÝch ®Þnh l­îng dùa vµo viÖc ®o c¸c tham sè kh¸c nhau cña pic s¾c ký nh­ chiÒu cao, diÖn tÝch, thêi gian l­u (hoÆc thÓ tÝch l­u) hoÆc tû sè gi÷a nã vµ chiÒu cao pic. C¸c ®¹i l­îng nµy vÒ nguyªn t¾c lµ tû lÖ víi nång ®é c¸c cÊu tö trong hçn hîp. C¸c ph­¬ng ph¸p s¾c ký khÝ ®Þnh l­îng chñ yÕu lµ: ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸, ph­¬ng ph¸p chuÈn ho¸ theo sè hiÖu chØnh, ph­¬ng ph¸p ®­êng chuÈn tuyÖt ®èi, ph­¬ng ph¸p néi chuÈn. ViÖc ¸p dông s¾c ký khÝ vµo ph©n tÝch ®Þnh l­îng rutin trong nô hoÌ nãi chung cßn khã kh¨n, nªn kh«ng ®i s©u vµo c¸c ph­¬ng ph¸p nµy. II.3.2.3. Nghiªn cøu rutin b»ng ph­¬ng ph¸p s¾c ký khÝ Ph­¬ng ph¸p s¾c ký khÝ ®­îc ¸p dông chñ yÕu ®Ó ph©n tÝch thµnh phÇn hçn hîp. V× vËy, ph­¬ng ph¸p nµy cã thÓ ¸p dông vµo ph©n tÝch thµnh phÇn nô hoÌ hoÆc lµ ®Þnh tÝnh rutin s¶n phÈm. C¸c ph­¬ng ph¸p ®Þnh l­îng b»ng s¾c ký khÝ nãi chung ®Òu lµ c¸c ph­¬ng ph¸p gÇn ®óng, h¬n n÷a rutin l¹i lµ chÊt r¾n nªn khã ¸p dông. b b lH xl xf a a a H×nh 5- X¸c ®Þnh Rf a-a: tuyÕn xuÊt ph¸t. b-b: tuyÕn dung m«i ë cuèi thÝ nghiÖm. ln II.3.3. S¾c ký líp máng VÒ b¶n chÊt, ®©y lµ hÖ s¾c ký láng-r¾n mµ pha tÜnh (pha r¾n) ®­îc tr¶i thµnh líp máng trªn b¶ng kÝnh, nhùa hay kim lo¹i. II.3.3.1 C¬ së ph­¬ng ph¸p TÝnh chÊt hÊp phô cña hÖ s¾c ký líp máng ®­îc ®Æc tr­ng b»ng ®é linh ®éng Rf Rf = xl/xf (8) Trong ®ã: xl: kho¶ng c¸ch tõ ®­êng xuÊt ph¸t ®Õn t©m vÕt s¾c ký. xf: kho¶ng c¸ch tõ ®­êng xuÊt ph¸t ®Õn møc dung m«i sau cïng so víi ®­êng xuÊt ph¸t. §óng ra Rf ph¶i ®­îc tÝnh b»ng tû sè gi÷a vËn tèc chuyÓn ®éng cña t©m vÕt s¾c ký víi vËn tèc cña dung m«i. Tuy nhiªn viÖc x¸c ®Þnh vËn tèc rÊt khã kh¨n nªn Rf ®­îc x¸c ®Þnh theo h×nh 5. Trªn lý thuyÕt th× Rf kh«ng phô thuéc vµo nång ®é vµ c¸c yÕu tè kh¸c. Tuy nhiªn, thùc nghiÖm chøng minh Rf kh«ng æn ®Þnh, nã phô thuéc vµo mét sè yÕu tè nh­: chÊt l­îng vµ ho¹t tÝnh cña chÊt hÊp phô, ®é Èm cña chÊt hÊp phô, chÊt l­îng cña dung m«i… Do ®ã trong thùc tÕ ng­êi ta th­êng dïng ®¹i l­îng t­¬ng ®èi Rftd: Rftd = Rf/Rfc = xl/xlc (9) Trong ®ã: Rfc: ®é linh ®éng cña chÊt chuÈn, tÝnh theo c«ng thøc (8). xlc: kho¶ng c¸ch tõ ®iÓm xuÊt ph¸t ®Õn t©m cña vÕt s¾c ký chÊt chuÈn. ChÊt chuÈn ®­îc hoµ tan trong cïng dung m«i víi chÊt nghiªn cøu vµ ®­îc nhá trªn ®­êng xuÊt ph¸t bªn c¹nh mÉu nghiªn cøu. Nh­ vËy, trong qu¸ tr×nh s¾c ký coi nh­ chÊt chuÈn vµ chÊt nghiªn cøu ®­îc thùc hiÖn trong cïng ®iÒu kiÖn. II.3.3.2. §Æc ®iÓm cña s¾c ký líp máng 1 – Líp máng §Ó tr¶i líp máng th­êng dïng c¸c b¶ng thñy tinh l¸ nh«m hoÆc mµng polyete. Cã lo¹i mµng trong suèt víi tö ngo¹i, cã ­u ®iÓm cã thÓ ®o quang trùc tiÕp nhiÒu hîp chÊt trong líp máng. ChÊt hÊp phô ®Ó tr¶i líp máng th­êng lµ bét silicagel, alumin (Al2O3), kizengua, bét xeluloz¬… 2 – Pha ®éng ViÖc chän dung m«i lµm pha ®éng phô thuéc vµo b¶n chÊt cña chÊt nghiªn cøu. Ng­êi ta cã thÓ dïng c¸c dung m«i ®¬n hoÆc c¸c hÖ dung m«i gåm hai hay ba thµnh phÇn víi tû lÖ thÝch hîp. C¸c dung m«i ®¬n th­êng dïng cã thÓ lµ: parafin cã nhiÖt ®é bay h¬i cao, xyclohexan, benzen, clorofom, ete, axetat etyl, r­îu ety._.