Nghiên cứu các điều kiện tối ưu của quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic

âng cao chất lượng quá trình lên men lactic, việc bổ sung các chủng vi khuẩn thuần khiết đã được tuyển chọn ngày càng trở nên phổ biến, khơng những rút ngắn được thời gian lên men mà cịn kiểm sốt và nâng cao được chất lượng của sản phẩm tạo thành. Trên thế giới, việc sản xuất ra các chế phẩm vi khuẩn ứng dụng trong cơng nghiệp là một trong những thành tựu nổi bật trong hai thập niên gần đây, trong khi đĩ ở Việt Nam, đây vẫn là một lĩnh vực mới mẻ. Xuất phát từ sự cần thiết của việc sản xuất các chế phẩm vi khuẩn lactic, chúng tơi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Nghiên cứu các điều kiện tối ưu của quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic ”. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 2 Phần 1: Tổng quan 1.1. Vi khuẩn lactic Vi khuẩn lactic là nhĩm các vi sinh vật cĩ hình dáng, kích thước rất khác nhau, quá trình trao đổi chất nhằm mục đích tạo ra axit lactic. Vi khuẩn lactic là các vi khuẩn Gram (+), thường khơng di động, khơng tạo bào tử, yếm khí tuỳ tiện, khơng catalaza. Khả năng sinh tổng hợp các chất ở các vi sinh vật này kém do đĩ phải cung cấp vào mơi trường các axit amin, các bazơ nucleotit, các vitamin và một vài axit béo. Dựa vào sản phẩm lên men, người ta phân vi khuẩn lactic thành hai nhĩm : +Lên men đồng hình: Là con đường lên men tạo ra 70% - 90% axit lactic. Một số chủng lên men đồng hình: Lactobacillus, Bulgaricus, Streptococcus thermophilus, Lactobacillus acridophilus. +Lên men dị hình: Là con đường lên men tạo ra ít hơn 50% axit lactic và tạo ra các sản phẩm khác như axit lactic, CO2 và Etanol. Một số chủng lên men dị hình: Lactobacillus casei, Bifido bateries. 1.1.1. Đặc điểm hình thái Các giống vi khuẩn khác nhau cĩ hình dạng và kích thước khác nhau. Ngồi ra hình dạng và kích thước tế bào vi khuẩn lactic cịn phụ thuộc vào mơi trường, điều kiện nuơi cấy, sự cĩ mặt của oxy và tuổi tế bào. Những tế bào hình cầu, hình ovan thường cĩ đường kính từ 0,5-2m, sắp xếp riêng biệt, cặp đơi hay thành chuỗi dài. Các giống Streptococcus, Lactococcus, và Enterococcus được tạo thành từ những tế bào hình ovan sắp xếp thành cặp hay thành chuỗi. Giống Leuconostoc được tạo thành từ những tế bào hình thấu kính (hình hột đậu lăng) xắp xếp thành cặp hay chuỗi. Các giống Pediococcus, Aerococcus, Tetragenococcus được tạo thành từ những tế bào hình cầu ghép nối 4 tế bào. Giống Atopobium lại cĩ hình dạng thay đổi theo từng chủng: cĩ thể hình cầu nhỏ, hình thấu kính, hình gậy hay hình trung gian của các loại hình trên. Những tế bào hình que cân đối cĩ kích thước 0,5-2 m chiều rộng, 1- 10 m chiều dài, sắp xếp riêng biệt, cặp đơi hoặc thành chuỗi dài.Theo Orla Jensen, giống Lactobacillus cĩ thể chia thành 3 lồi: lồi Thermobacterium (lên men đồng hình chặt chẽ) được tạo thành từ những tế bào hình que dài hoặc ở dạng chuỗi xoắn, lồi Streptobacterium (lên men dị hình tuỳ tiện) được tạo thành từ những tế bào hình que ngắn đơi khi cĩ dạng cong, sắp xếp thành chuỗi ngắn hoặc rất dài, lồi Betabacte rất ngắn, thẳng, sắp xếp riêng biệt. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 3 Giống Carnobacterium được tạo thành từ những tế bào mà chiều dài của chúng thay đổi theo tuổi Những tế bào hình que khơng cân đối điển hình là Bifido bacterium. Chúng dược tạo thành từ những tế bào hình que sần sùi, phân nhánh thành hình ngơi sao, hình giàn đậu, hình chữ V. Thành phần mơi trường cũng như sự cĩ mặt của oxy cĩ ảnh hưởng lớn tới hình dạng tế bào.Trong mơi trường cĩ hàm lượng Etanol cao sẽ làm chiêu dài tế bào dài ra. Mặt khác etanol cịn kìm hãm sự phân chia tế bào mạnh hơn so với sự sinh trưởng.Thực tế là trong mơi trường cĩ etanol trực khuẩn lactic sẽ dài ra, mảnh hơn, cịn cầu khuẩn thì bảo tồn được hình dạng của mình. 1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hố Cĩ nhiều đặc điểm sinh lí sinh hố được sử dụng để phân loại vi khuẩn lactic : hàm lượng axit lactic tạo thành trong quá trình nuơi cấy; Nhiệt độ tối thiểu, tối ưu và cực đại cho sinh trưởng phát triển các chủng; Khả năng chịu oxy và chịu muối; Khả năng tạo khí và các hợp chất bay hơi; Khả năng chống chịu thực khuẩn thể; Độ nhạy cảm với các chất kháng sinh; Tạo các chất ức chế như các loại bacterioxin,... Bảng 1 : Nhiệt độ phát triển tối ưu và nhiệt độ giới hạn của các vi khuẩn lactic Chủng vi khuẩn Nhiệt độ tối ưu Nhiệt độ giới hạn Carnobacterium 22 - 30 o C 0 - <40 o C Leuconostoc 18 - 30 o C <5 - <40 o C Vagococcus 25 - 30 o C <5 - <40 o C Lactococcus 27 - 32 o C <10 - <40 o C Pediococcus 25 - 40 o C <15 - <45 o C Lactobacillus(Ưa ấm) 30 - 35oC <15 - <45oC Enterococcus 30 - 40 o C <10 - <50 o C Bifidobacterium 37 - 41 o C 25 - 45 o C Streptococcus thermophilus 42 - 43 o C 20 - <50 o C Lactobacillus(ƯChịu nhiệt) 40 - 45oC <30 - <52oC 1.1.3. Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic khác nhau thì khác nhau, đặc biệt là nhu cầu về vitamin và nitơ. Chẳng hạn, lồi Lactobacillus dược coi là nhĩm vi khuẩn cĩ địi hỏi về dinh dưỡng cao nhất. Chúng địi hỏi khơng chỉ các cơ chất phức tạp chứa cacbon, nitơ, photphat và lưu huỳnh mà cịn cĩ nhu cầu rất lớn về các yếu tố cần cho sự phát triển như vitamin, muối vơ cơ a. Nhu cầu dinh dưỡng cacbon Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 4 Vi khuẩn lactic cĩ thể sử dụng được rất nhiều loại hydratcacbon, từ các hexoza (glucoza, fructoza, manoza, galactoza) các đường đơi (saccaroza, lactoza, maltoza) cho đến các polysacarit (tinh bột, dextrin) Nguồn năng lượng quan trọng nhất cho vi khuẩn lactic là monosaccarit và disaccarit. Các nguồn cacbon này được dùng để cung cấp năng lượng , xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như aixit malic, pyruvic, fumaric, axetic… Một vài lồi vi khuẩn lactic lên men dị hình, phân lập được từ các sản phẩm thực phẩm, cĩ thể sử dụng các axit gluconic và galactorunic tạo thành CO2, axit axetic và axit lactic. Trong quá trình lên men các cơ chất chứa cacbon, vi khuẩn lactic cĩ thể sử dụng cả các axit amin như axit glutamic, arginin, tirozin làm nguồn cung cấp năng lượng. Khi đĩ xảy ra quá trình decacboxyl và tạo ra CO2. Các loại vi khuẩn khác nhau thì địi hỏi nguồn cacbon khác nhau. Chẳng hạn Lactobacillus delbrueckii cĩ thể sử dụng các đường glucoza, maltoza, galactoza, sacaroza, dextrin và khơng sử dụng dược lactoza, raffinoza trong khi đĩ Lactobacillus bulgaricus lại cĩ thể sử dụng lactoza trong nhưng lại khơng sử dụng dược maltoza và saccaroza. Một số lồi vi khuẩn lactic lại cĩ thể sử dụng được dextrin, tinh bột b. Nhu cầu dinh dưỡng nitơ Một số lớn các vi khuẩn lactic khơng thể sinh tổng hợp được các hợp chất hữu cơ phức tạp cĩ chứa nitơ. Vì vậy để đảm bảo cho sự phát triển của mình chúng phải sử dụng nguồn nitơ cĩ sẵn trong mơi trường. Chỉ cĩ một số ít lồi vi khuẩn lactic cĩ khả năng sinh tổng hợp các hợp chất hữu cơ từ nguồn nitơ vơ cơ. Đơi khi trong một số trường hợp sự phát triển của một vài lồi vi khuẩn lactic, như Lactobacillus helyeticus, cĩ thể bị kích thích bởi sự cĩ mặt của muối amoni trong mơi trường. Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 5 Bảng 2 : Nhu cầu axit amin của một số lồi vi khuẩn lactic Axit amin Vi khuẩn lactic cĩ nhu cầu Nồng độ đảm bảo cho sự phát triển (g /ml) Alanin Arginin Asparagin Xisterin (hoặc Xistin) Axit glutamic Glyxin Histidin Isolơxin Lơxin Lyzin Metionin Phenylalanin Prolin Serin Treonin Tryptophan Tyrozin Valin Leuconostoc citrovorum Lactobacillus casei Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Lactobacillus arabinosus Lactobacillus arabinosus Leuconostoc mesenteroides Streptococcus faecalis Leuconostoc mesenteroides Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus delbrrueckii Streptococcus faecalis Lactobacillus pentosus Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus arabinous 0-10 0-10 0-40 0-10 0-50 0-10 0-6 0-10 0-10 0-20 0-10 0-15 0-6 0-20 0-10 0-3 0-6 0-10 Theo Orla-Jensen, dựa vào nhu cầu dinh dưỡng nitơ cĩ thể chia vi khuẩn lactic thành 3 nhĩm sau: Các vi khuẩn cần hỗn hợp phức tạp các axit amin trong mơi trường (Thermobacterium) Các vi khuẩn cĩ thể phát triển tốt trên moi trường chỉ cĩ xistein và muối amoni (Streptobacterium) Các vi khuẩn cĩ thể phát triển trên mơi trường cĩ nguồn nitơ duy nhất là muối amoni ( Streptococcus). Như đã nĩi ở trên, để sinh trưởng và phát triển bình thường, ngồi nitơ dưới dạng hỗn hợp các axit amin, vi khuẩn lactic cịn cần những hợp chất hữu cơ phức tạp chứa nitơ như các sản phẩm thuỷ phân protein từ thịt, lactanbumin, casein, peptone, peptit, nấm men thuỷ phân… c. Nhu cầu vitamin Các vi khuẩn lactic, đặc biệt là lồi Lactobacillus, rất cần vitamin cho sự phát triển. Thường thì phải bổ sung vào mơi trường các chất cĩ chứa vitamin như nước khoai tây, ngơ, cà rốt, dịch tự phân nấm men và nhiều chất Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 6 khác. Các vitamin đĩng vai trị là co eonzym trong quá trình trao đổi chất của tế bào. Rất ít vi khuẩn lactic cĩ khả năng sinh tổng hợp được vitamin. Nhu cầu vitamin B6, ở cả dạng tự do và dạng liên kết (pyridoxine, pyridoxan, pyridõamin, pyridoxnphotphat) là đặc biệt lớn ở các lồi Streptococcus và Lactobacillus. Các vitamin nhĩm B này kích thích sự phát triển của vi khuẩn lactic. Rogosa và cộng sự (1961) đã chỉ ra rằng axit nicotinic và axit pantotenic rất cần thiết cho sự phát triển của tất cả các lồi vi khuẩn lactic. Trong khi đĩ vi khuẩn lactic lên men dị hình rất cần thiamin, nhưng axit folic và axit p-aminobenzoic khơng ảnh hưởng đến sự phát triển của các lồi Lactobacillus. Cơ chế tích tụ các vitamin trong tế bào vi khuẩn lactic đang được nghiên cứu. Người ta cho rằng tế bào của lồi Lactobacillus leichmannii và Lactobacillus delbrueckii cĩ chứa vitamin B12 hấp thụ từ mơi trường với tỷ lệ khoảng 0,5 g/g chất khơ. Khi đĩ hầu như tồn bộ lượng vitamin này được phát hiện thấy ở trong thành tế bào liên kết chặt chẽ với các chuỗi polypeptit ở đĩ. Tế bào vi khuẩn lactic cĩ thể hấp thụ một lượng vitamin như vitamin B6, thiamin, lớn hơn nhu cầu của chúng để tạo ra một số lượng lớn tế bào (cịn gọi là sự tiêu thụ thừa vitamin). Nhu cầu vitamin cịn bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố như nhiệt độ nuơi cấy, pH, lượng CO2 ban đầu và thế oxy hố khử của mơi trường. Chẳng hạn khi thay đổi nhiệt độ khoảng 3 - 40C thì nhu cầu trao đổi riboflavin với mơi trường bên ngồi của Lactobacillus helveticus thay đổi khoảng 25%. Nhu cầu vitamin cũng bị ảnh hưởng bởi thành phần mơi trường. Điều này liên quan chặt chẽ tới sự cĩ mặt của các axit amin, axit hữu cơ, dezoxyribozit…Chẳng hạn vi khuẩn lactic sẽ khơng cần vitamin B12 nữa nếu trong mơi trường đã cĩ dezoxyribozit. Tương tự như vậy bazơ purin cũng ảnh hưởng tới nhu cầu axit p-aminobenzoic của vi khuẩn lactic . d. Các chất hữu cơ khác cần cho sự phát triển của vi khuẩn lactic Ngồi axit amin và vitamin ra, vi khuẩn lactic cịn cĩ nhu cầu rất lớn về các hợp chất hữu cơ khác cho sự phát triển của chúng. Dưới đây là một số chất hữu cơ ảnh hưởng đến sự phát triển hoặc kích thích sự phát triển của axit lactic. Các bazơ nitơ : Adenin, Hypoxantin, Guanin, Uraxin, Thimin, Thimidin Axit hữu cơ : axit axetic và nhiều axit hữu cơ khơng bay hơi khác Axit amin: L-asparagin, L-glutamin Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 7 Trong mơi trường cĩ chứa các axit amin tự do, vitamin và nhiều cấu tử cần thiết khác, protein thuỷ phân chưa hồn tồn sẽ thúc đẩy sự phát triển nhất định của vi khuẩn lactic. Cĩ khả năng là các peptit thực hiện vai trị cung cấp axit amin cần thiết cho quá trình đồng hố. Chúng kích thích sự phát triển của tế bào hiệu quả hơn so với axit amin tự do. Một loại chất thuộc về nhĩm các yếu tố phát triển hữu cơ là axit axetic và axit xitric. ảnh hưởng thuận lợi của xitrat tới tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn lactic đã được chứng minh và đĩ là lý do tại sao hiện nay người ta lại sử dụng rộng rãi xitrat làm thành phần mơi trường để nuơi cấy, phân lập và bảo quản các chủng vi khuẩn lactic. Tương tự xitrat, axetat hay axit axetic cĩ tác động quan trọng đến sự sinh trưởng của tế bào. Axetat được dùng làm chất đệm cho mơi trường khi nuơi cấy nhiều lồi vi khu khuẩn lactic. Một loại axit hữu cơ quan trọng ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của hầu hết các lồi vi khuẩn lactic là axit oleic (cĩ thể thay thế bằng axit linoleic và axit linolenic). Đĩ chính là nguyên nhân tại sao người ta lại sử dụng Tween 800 - một dẫn xuất của axit oleic (Polyoxyethlene sorbiton monooleate), trong thành phần mơi trường phân lập, nuơi cấy vi khuẩn lactic. Một vài lồi vi khuẩn lactic (Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus bulgaricus) rất cần các axit béo khơng no cho sự phát triển . e. Nhu cầu các muối vơ cơ Để đảm bảo cho sinh trưởng và phát triển đầy đủ, vi khuẩn lactic cần rất nhiều các hợp chất vơ cơ như đồng, sắt, natri, kali, photpho, lưu huỳnh, mangan, magie… đặc biệt là mangan. Chính mangan ngăn cản quá trình tự phân của tế bào và nĩ cần thiết cho quá trình sống bình thường của vi khuẩn này. Đối với Lactobacillus thì Mn2+, Mg2+, Fe2+ cĩ tác động tích cực lên sự phát triển và sản sinh axit lactic. Một vài enzym cĩ sự tham gia của các iơn kim loại này trong cấu trúc trung tâm hoạt động, chẳng hạn như trường hợp của photphofructokinaza. 1.1.4. ứng dụng của vi khuẩn lactic Nĩi đến vi khuẩn lactic trước hết phải kể đến những ứng dụng của chúng trong các sản phẩm truyền thống như: muối chua rau quả, làm sữa chua, phomat, xúc xích, tơm cá muối chua, nem chua… Chúng khơng những cĩ tác dụng bảo quản nhờ vào khả năng lên men lactic chuyển hố đường thành axit lactic làm giảm pH của mơi trường, ức chế các vi sinh vật khác phát triển mà cịn tạo ra các sản phẩm cĩ tính chất và hương vị đặc biệt. Sử dụng vi khuẩn lactic là một trong những phương pháp bảo quản thực phẩm phổ biến nhất trên thế giới hiện nay. Trong một số trường hợp, người ta cịn lợi dụng các vi sinh Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 8 vật tự nhiên cĩ sẵn trong nguyên liệu. Trong một số trường hợp khác người ta bổ xung các chủng vi sinh vật thuần khiết để điều khiển quá trình lên men. Dưới đây là bảng đưa ra một vài ứng dụng của vi khuẩn lactic trong một số lĩnh vực thực phẩm. Bảng 3: Một vài sản phẩm thực phẩm được chế biến theo phương pháp lên men lactic Sản phẩm Nguyên liệu ban đầu Vi sinh vật lên men Nơi sản xuất Từ sữa Phomat Sữa Streptrococcus sp Leuconostoc sp Tồn thế giới kefir Sữa Streptrococcus lactis Lactobacillus bulgaricus Tồn thề giới Kumis Sữa ngựa tươi Lactobacillus bulgaricus Lactobacillus leichmannii Nga, Mơng cổ, Trung á Taette Sữa Streptrococcus lactis Var.taette Yoghurt Sữa tươi, sữa bột Streptrococcus thermophilus Lactobacillus bulgaricus Tồn thề giới Từ thịt, cá Xúc Xích khơ Thịt bị, thịt lợn Pediococcus cerevisiae Mĩ, Châu Âu Izushi Cá tươi, gạo, rau Lactobacillus ssp Nhật Bản Từ thực vật Kim Chi Bắp cai và các loại rau khác Vi khuẩn lactic Triều Tiên Ơ liu muối chua Ơ liu xanh Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus plantarum Tồn thề giới Dưa bắp cải Bắp cải Leuconostoc mesenteroides Lactobacillus plantarum Tồn thề giới Từ ngũ cốc Iddi Bột gạo, bột ngơ Leuconostoc mesenteroides ấn Độ Bánh chua lúa mạch đen Bột lúa mi đen Leuconostoc mesenteroides Thuỵ Sĩ và các vùng khác. 1.2. Quá trình tạo sinh khối vi khuẩn lactic 1.2.1. Đường cong sinh trưởng Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn trong điều kiện nuơi cấy tĩnh cĩ nghĩa là phương pháp nuơi cấy mà trong suốt thời gian đĩ ta khơng thêm vào chất dinh dưỡng cũng khơng loại bỏ đi sản phẩm cuối cùng của trao đổi chất. Sự sinh trưởng trong một hệ thống động như vậy tuân theo những quy Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 9 luật bắt buộc. Khơng những đối với những cơ thể đơn bào mà cả đối với các cơ thể đa bào. Sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn bao gồm cĩ 4 pha như sau:  Pha tiềm phát Pha này tính từ lúc bắt đầu cấy đến khi vi khuẩn đạt được tốc độ sinh trưởng cực đại. Trong pha tiềm phát vi khuẩn chưa phân chia (nghĩa là chưa cĩ khả năng sinh sản) nhưng thể tích và khối lượng tế bào tăng lên rõ rệt do quá trình tổng hợp các chất, trước hết là các cao phân tử (Protein, enzym, axitnucleic ..) diễn ra mạnh mẽ. Độ dài của pha tiềm phát phụ thuộc trước hết vào tuổi của giống, sự thích ứng của vi khuẩn với điều kiện nuơi cấy mới, vào lượng giống cấy và thành phần mơi trường. Thường tế bào càng già thì pha tiền phát càng dài. Rõ ràng nguyên nhân của pha tiền phát là sự khác biệt giữa các tế bào ở pha ổn định (hoặc bào tử) với các tế bào đang sinh trưởng logarit. Trong pha tiềm phát diễn ra việc xây dựng lại các tế bào nghỉ thành các tế bào sinh trưởng logarit.  Pha phát triển logarit Trong pha này vi khuẩn sinh trưởng và phát triển theo luỹ thừa, nghĩa là sinh khối và số lượng tế bào tăng theo phương trình: nNN 2.0 Pha tiềm phát Pha logarit Pha ổn định Pha suy thối Đường cong sinh trưởng vi khuẩn lactic Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 10 Trong đĩ: - N0 : số tế bào ban đầu - n: số lần phân chia - N: số tế bào tổng cộng Trong pha logarit thì kích thước của tế bào, thành phần hố học, hoạt tính sinh lý.. nĩi chung khơng thay đổi theo thời gian. Tốc độ sinh sản đạt mức cực đại và khơng đổi trong suốt thời gian của giai đoạn phát triển logarit. Tế bào sinh ra nhanh nên mơi trường sẽ vẩn đục nhanh, lượng cơ chất giảm rõ rệt và tỷ lệ nghịch với lượng tế bào sinh ra. Pha ổn định Trong pha này quần thể vi khuẩn ở trạng thái cân bằng động học, số tế bào mới sinh ra bằng số tế bào cũ chết đi. Kết quả: số tế bào và cả sinh khối khơng tăng cũng khơng giảm. Tốc độ sinh trưởng bây giờ phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Cho nên khi giảm nồng độ cơ chất (trước khi cơ chất bị cạn hồn tồn) tốc độ sinh trưởng của vi khuẩn cũng giảm. Do đĩ việc chuyển từ pha logarit sang pha ổn định diễn ra dần dần. Nguyên nhân tồn tại của pha ổn định rõ ràng là do sự tích luỹ các sản phẩm độc của quá trình trao đổi chất (như các loại rượu, axit hữu cơ) và việc cạn dần chất dinh dưỡng (thường chất dinh dưỡng cĩ nồng độ thấp nhất) Lượng sinh khối đạt được trong pha ổn định gọi là hiệu suất hoặc sản lượng. Sản lượng phụ thuộc vào tính chất và số lượng các chất dinh dưỡng sử dụng và vào điều kiện nuơi cấy. Đĩ là sự sai khác giữa số lượng vi khuẩn cực đại và khối lượng vi khuẩn ban đầu. Pha suy thối Trong pha này quá trình sinh sản bị đình chỉ hồn tồn, số lượng tế bào cĩ khả năng sống giảm theo luỹ thừa (mặc dù số lượng tế bào tổng cộng cĩ thể khơng giảm). Đơi khi các tế bào bị tự phân nhờ các enzym của bản thân. Các tế bào chết đi, sự cân bằng bị pha vỡ. Ngồi sự biến đổi về số lượng tế bào cịn cĩ sự thay đổi về kích thước. Sự đồng nhất quang học trong tế bào chất mất đi, một số lồi thành bào tử. Nguyên nhân của pha tử vong chưa thật rõ ràng, nhưng cĩ liên quan với điều kiện bất lợi của mơi trường. Trong trường hợp mơi trường ticchs luỹ các axit, hay nồng độ chất dinh dưỡng thấp dưới mức cần thiết cho hậu quả là làm giảm hoạt tính trao đổi chất, phân huỷ dần các chất dự trữ và cuối cùng dẫn đến sự chết hàng loạt của tế bào. Ngồi đặc tính của bản thân chủng vi khuẩn, tính chất của các sản phẩm trao đổi chất tích luỹ lại cũng ảnh hưởng tới tiến trình của pha tử vong. 1.2.2. Một số yếu tố ảnh hưởng đến quá trình tạo sinh khối Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 11 1.2.2.1. Chủng giống Việc lựa chọn chủng giống cho phép chọn lựa được những chủng phù hợp nhất với mục đích nghiên cứu. Quá trình chọn chủng trước tiên được tiến hành tại phịng thí nghiệm dựa trên các chỉ tiêu về khả năng sinh trưởng và khả năng tạo axit lactic, cngx như khả năng chống chịu được pH axit nhằm thu được năng suất sản phẩm ổn định. Sự ổn định gen của chủng giống được lựa chọn cũng phải được nghiên cứu kĩ lưỡng. 1.2.2.2. Thành phần của mơi trường nuơi cấy a. Nguồn cacbon Nếu glucoza, fructoza rất dễ được đồng hố bởi các trực khuẩn, saccaroza, lactoza, và tinh bột hồn tồn ngược lại. Tuy nhiên, các loại đường này lại được ứng dụng nhiều trong cơng nghiệp và thu nhận được từ nhiều ngành sản xuất khác nhau (bảng 4). Bảng 4 : Các nguyên liệu đầu khác nhau sử dụng trong cơng nghiệp Nguyên liệu đã sơ chế Nguyên liệu thơ Ngành Glucoza Saccharoza Lactoza Tinh bột Dịch thuỷ phân tinh bột Rỉ đường mía Sirơ đường Lactoserum Lactoserum đã loại protein Bột Ngũ cốc Củ cải đường Mía Sữa Ngũ cốc b. Nguồn nitơ Trong nhiều trường hợp, người ta sử dụng muối amonium, urê, amoniac làm nguồn nitơ. Tuy nhiên, trong một số trường hợp khác, ví dụ như đối với các vi khuẩn lactic, nguồn nitơ hữu cơ lại được sử dụng. Nười ta cĩ thể kể đến một vài nguồn nitơ thơng dụng trong cơng nghiệp như : cao nấm men, bột đậu nành, bột cốt tơng, dịch thuỷ phân các loại protein khác nhau,… c. Nguồn muối khống. [21] Nguồn muối khống thường sử dụng trong cơng nghiệp nhămg đảm bảo các yếu tố N, P, K và các nguyên tố vi lượng cho sự phát triển của vi sinh vật bao gồm : urê, (NH4)2SO4, (NH4)2HPO4, H3PO4, K2HPO4, KH2PO4, KCl, K2SO4, H2SO4, CaCO3, MgSO4, FeSO4, MnSO4, ZnSO4,… Thanh trùng Trước khi tiến hành lên men, cần phải tiệt trùng mơi trường và dụng cụ ; Để làm được điều này, người ta thường sử dụng hơi nước. Điều kiện xử lý nhiệt phụ thuộc vào bản chất cungd như mức độ nhiễm tạp vi sinh vật và nguy Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 12 cơ phân giải các chất. Trong quá trình tiệt trùng, các hiện tượng sau cĩ thể xảy ra : biến tính protêin, vơ hoạt enzim, phá huỷ các vitamin và các chất kích thích sinh trưởng, caramen hố đường, phản ứng maillard,… Trong trường hợp này, người ta buộc phải thanh trùng riêng biệt đường và các hợp chất chứa nitơ. Chúng sẽ được trộn vơ trùng trước khi sử dụng.[19] 1.2.2.3. Điều kiện nuơi cấy a. Nhiệt độ [9] Nhiệt độ cĩ ảnh hưởng rất lớn đến hoạt động của vi khuẩn lactic. Điều này càng cĩ ý nghĩa hơn khi sử dụng chúng trong cơng nghiệp. Khoảng nhiệt độ phát triển của vi khuẩn lactic khá rộng: một số loại cĩ thể phát triển ở 550C trong khi một số khác cĩ thể phát triển được ở 50oC. Nĩi chung đa số vi khuẩn lactic cĩ thể phát triển trong khoảng nhiệt độ từ 15 - 400C. ảnh hưởng của nhiệt độ cĩ lẽ nhiều nhất là đến các phản ứng enzyme. Trong một khoảng nhiệt độ nào đĩ thì tốc độ phản ứng enzyme tăng khi nhiệt độ tăng, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì sẽ xảy ra sự biến tính protein. Các lồi cĩ nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 40 - 450C được gọi là vi khuẩn ưa nhiệt (thermophil). Các lồi khác cĩ nhiệt độ phát triển tối ưu trong khoảng 20 - 400C được gọi là loại ưa ấm (mesophil). b. pH [9] Hoạt động của vi khuẩn lactic, đặc biệt là của hệ enzyme của chúng, chịu tác động mạnh của pH. Mỗi enzyme đều cĩ vùng pH tối ưu mà tại đĩ hoạt lực của enzyme là cao nhất. Tuy nhiên pH nội bào của vi khuẩn lại khơng tương ứng với pH tối ưu của các enzyme nội bào mà nĩ chứa. Điều này cĩ thể được giả thiết rằng tác động của pH lên hoạt tính enzyme dựa trên sự tác động vào các yếu tố trao đổi chất của tế bào . Các vi khuẩn lactic cĩ pH tối ưu cho sự phát triển là 5,6 - 6,2 (Lactobacillus), 5,5 - 6,5 (Pediococcus), 6,3 - 6,5 (Leuconostoc). Giá trị pH cuối cùng mà mỗi giống vi khuẩn lactic cĩ thể chịu được lá khác nhau. Chẳng hạn Lactobacillus cĩ thể chịu được pH = 3,2 - 3,5; Pediococcus cĩ thể chịu được pH=3,5 - 4,4; Leuconostoc cĩ thể chịu được pH<5 . Vai trị của vi khuẩn lactic trong bảo quản thực phẩm khơng chỉ giới hạn ở việc hạ thấp pH của sản phẩm lên men mà cịn liên quan chặt chẽ đến việc giải phĩng ra các enzyme ngoại bào, và sau đĩ là enzyme nội bào sau khi tế bào bị phân hủy, vào mơi trường. Chính các enzyme này đã cải thiện khả năng dễ tiêu hố cũng như tính chất cảm quan của sản phẩm lên men. Các enzyme này rất nhạy cảm với pH: hoạt tính của chúng gần như bằng khơng khi pH thấp hơn 4,5. Chẳng hạn, hoạt tính proteaza cao nhất của chúng nằm trong khoảng 5 - 7,5 trong khi hoạt tính lipaza cao nhất lại nằm trong khoảng 7,5 – 9. Thế nhưng trong chế biến thực phẩm bằng lên men lactic thì pH thường thấp Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 13 hơn 5. Do đĩ protein chỉ bị tác động của proteaza nếu hệ vi sinh vật trong thực phẩm cĩ thể sinh ra các chất trung hồ axit. Sự phát triển kiểu này nhìn chung là cần được tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình chế biến lên men các nguyên liệu cĩ nguồn gốc động vật (phomat, xúc xích khơ, nước mắm…) và cần được tránh trong trường hợp chế biến các nguyên liệu cĩ nguồn gốc thực vật (dưa bắp cải,ủ chua cỏ…). c. Nồng độ cơ chất [1] Nếu nuơi cấy vi khuẩn trong mơi trường sinh tổng hợp chứa dư thừa tất cả các chất, nhưng lại thiếu mất một thành phần dinh dưỡng cần thiết, sinh trưởng phát triển của vi khuẩn sẽ khơng thể xảy ra. Thêm dần dần cơ chất này vào mơi trường thì tốc độ phát triển của vi sinh vật này sẽ tăng lên đến đạt cực đại. Tuy nhiên, khi nồng độ cơ chất dư thừa, tốc độ phát triển của vi khuẩn sẽ giảm xuống, thậm chí bị ngừng lại hồn tồn. d. Tỉ lệ tiếp giống [12] Tăng tỉ lệ tiếp giống cho phép giảm pha tiềm phát. Do đĩ cũng cĩ thể xác định được nồng độ tế bào cho vào mơi trường ban đầu nhằm cải thiện hiệu suất thu hồi sinh khối. 1.3. Thu hồi sinh khối vi khuẩn bằng các phương pháp sấy 1.3.1. Sấy phun Quá trình sấy thực hiện bằnh cách phun vật liệu (chất lỏng) thành hạt nhỏ vào mơi trường khơng khí nĩng. Mơi chất sấy (khơng khí nĩng, khĩi lị …) được thổi vào và chuyển động cùng với hạt vật liệu và sấy khơ vật liệu. Nhờ quá trình phun vật liệu thành hạt nhỏ nên bề mặt tiếp xúc giữa vật liệu và mơi chất sấy rất lớn nên cường độ sấy cao, thời gian sấy ngắn (vài giây đến vai chục giây). Sấy phun gồm cĩ 4 giai đoạn: phun vật liệu thành bụi, quá trình tiếp xúc giữa bụi và khơng khí nĩng, quá trình bay hơi ẩm, quá trình tách sản phẩm ra khỏi khơng khí. Các giai đoạn được trình bầy như sau: Giai đoạn 1: Phun vật liệu thành bụi à à M 1 2 3 S 1.Thiếu cơ chất 2.Khơng thiếu cơ chất 3.ức chế thừa cơ chất Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 14 Cường độ quá trình sấy phun tỷ kệ thuận với độ phân tán của vật liệu sấyđược phun thành bụi. Ta cĩ thể dùng một trong ba phương pháp sau để phun chất lỏng thành bụi: ly tâm với tốc độ 2000 – 5000 v/p, dùng vịi phun trong đĩ chất lỏng được đẩy bằng bơm cĩ áp suất 200 at, dùng khí nén đẩy chất lỏng với áp suất 2,5 – 5 at. Thiết bị sấy trong đề tài này sử dụng cách thứ 3 theo cách này thì ta dùng khơng khí để phun dung dịch. Trước hết khơng khí qua ống phun tăng tốc rồi phun ra miêng phun, dùng bơm đưa dung dịch đến miệng vịi, khơng khí cĩ tốc độ cao sẽ thổi dung dịch văng ra thành hạt nhỏ. Tốc độ khí ra khỏi ống phun phụ thuộc vào tỷ số áp suăt trước và sau ống phun. Giai đoạn 2: Sự tiếp xúc giữa bụi và khơng khí Sự tiếp xúc giữa bụi và khơng khí phụ thuộc vào vị trí tương đối giữa vịi phun và đường khơng khí vào. Trong thiết bị sấy của chúng tơi, bụi được phun trực tiếp vào khơng khí nĩng trong buồng sấy. Đây chính là cách hay sử dụng nhất đặc biệt đối với vật liệu nhậy cảm như vi khuẩn vì sự bay hơi nhanh, thời gian bay hơi ngắn, tránh được sự phá huỷ bởi nhiệt độ. Giai đoạn 3: Sự bay hưoi ẩm Sự bay hơi ẩm gồm hai giai đoạn: ở giai đoạn đầu khi lượng ẩm trong vật liệu nhiều, lượng ẩm khuyếch tán từ trong vật liệu ra đến bề mặt lớn hơn lượng ẩm bốc hơi thì vận tốc bay hơi ẩm là khơng đổi. ở giai đoạc thứ hai, khi lượng ẩm đến một giá trị giới hạn nào đĩ, lượng ẩm khuyếch tán nhỏ hơn lượng ẩm bay hơi, thì tốc độ bay hơi giảm. Giai đoạn 4: Tách sản phẩm khơ ra khỏi khơng khí Tồn bộ hỗn hợp sinh khối khơ và khơng khí được hút sang thiết bị tách cyclon. Trong thiết bị này, dưới tác dụng của lực ly tâm, sinh khối khơ lắng xuống dưới cịn khơng khí đựơc bơm hút ra ngồi ở phía trên. 1.3.2. Phương pháp đơng khơ Đơng khơ cũng là một trong những phương pháp tách ẩm ra khỏi vật liệu để bảo quản tốt vi khuẩn. Thực chất đây là một phương pháp sấy đặc biệt, sấy thăng hoa, ẩm từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi khơng thơng qua trạng thái lỏng. Vật liệu được sấy ở mơi trường chân khơng cao < 456mHg nhiệt độ sấy cĩ thể đạt đạt đến –150C, nên ngăn chặn các nguy cơ phá huỷ bởi nhiệt độ, các phân tử hợp lại với nhau khi cơ đặc, khơng sảy ra quá trình vi sinh. Trước khi tiến hành sấy, vật liệu được làm lạnh đơng sâu nhanh nhằm biến đổi tồn bộ nước cĩ trong vật liệu trong trạng thái rắn, các cấu tử hồ tan được cố định tránh trường hợp các cấu tử này được tập hợp với nhau. Khi sấy ở áp suất rất thấp nước sẽ bay hơi, hơi ẩm thốt sang thiết bị ngưng tụ và ngưng tụ thành nước đá. Thiết bị ngưng tụ này được làm lạnh bằng hơi nước muối cĩ nhiệt độ vào là -100C và ra là 400C. Trong quá trình làm lạnh sâu cĩ Đồ án tốt nghiệp Nguyễn Thị Minh Huế 15 thể vi sinh vật bị chết. Để khắc phục ta phải tiến hành nhũ hố_keo bảo vệ hỗn dịch như: Sữa, huyết thanh, lịng trắng trứng, peptơn, muxin hay các loại đường. Thật vậy trong quá trình làm đơng khơ một số lớn vi sinh vật bị chết, tỷ lệ của những vi sinh vật sống sĩt cịn 5% - 30%. Khi cho nước vơ khuẩn vào phẩm vật đã đơng khơ, thì phục hồi được mơi trường chứa vi sinh vật, giữ nguyên vẹn được tồn bộ khả năng phát triển và đặc tính trao đổi chất của vi sinh vật. Các chất độn trước khi làm đơng khơ cần phải cĩ những yêu cầu sau: Đảm bảo cho mơi trường giống sau khi đơng khơ là một khối đặc cĩ chất bảo vệ giống cho khỏi bị khơ quá mức cĩ chất trung hồ nhĩm cacbonyl Chủng làm đơng khơ là các chủng trưởng thành n._.