Nghiên cứu các điều kiện tối ưu cho quá trình sấy vi khuẩn Lactobacillus Acidophillus DH để thu được tỉ lệ sống sót là cao nhất

Các phương pháp sấy khô vi khuẩn 11 III.1/ Cơ sở của phương pháp 11 III.2/ Một số phương pháp sấy khô vi khuẩn phổ biến 11 III.2.1. Sấy đông khô 11 III.2.2.Sấy chân không 12 III.2.3. Sấy phun 13 III.2.4 Sấy tầng sôI 13 III.3/ Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào vi khuẩn sau khi sấy 14 III.3.1. Anh hưởng của chế độ sấy 14 III.3.2/ Anh hưởng của chủng giống. 15 III.3.3/ Anh hưởng của thành phần môi trường sinh trưởng16 III.3.3.1.Sự tích luỹ các chất hoà tan tương thích 16 III.3.3.2/ Những xử lý dưới mức gây chết. 17 III.3.4 Thành phần môI trường sấy 18 III.3.5. Bảo quản và hydrat 20 IV.Nội dung nghiên cứu trong đề tài 22 V.Phương pháp nghiên cứu: 22 1.Chuẩn bị môI trường nuôI cấy 22 2.Tiến hành nuối cấy 23 3.Ly tâm 23 4.Chuẩn bị môi trường sấy 23 5.Chuẩn bị mẫu sấy đông khô 23 6.Rehydrat 24 7.Đánh giá khả năng sống sót của tế 24 Tài liệu tham khảo 25 Phần B: Báo cáo thực tập tốt nghiệp 28 I Giới thiệu chung về nhà máy bia á Châu 29 I.1.tổ chức nhân sự 29 I.2 sơ đồ mặt bằng nhà máy 30 I.3.Tình hình nguyên liệu và phụ liệu 31 I.3.1.Nguyên liệu sản xuất chính: 31 I.3.2 Nguồn cung cấp năng lượng 31 I.4.Sản phẩm 32 I.4.1. Bao bì: 32 I.4.2. Đóng gói: 32 II/ Thuyết minh dây chuyền 34 Phần I: Nguyên liệu và xử lý nguyên liệu 34 A. Nguyên liệu 34 1. Malt đại mạch. 34 1.1 Chỉ tiêu cảm quan: 34 1.2Chỉ số cơ học: 34 2. Gạo 35 2.1 Yêu cầu chung về gạo 35 2.2.Thành phần hoá học của gạo 35 3. Hoa houblon 35 3.1 Yêu cầu của hoa houblon 35 3.2.Thành phần hoá học của hoa houblon 36 4. Nước 36 B. Xử lý nguyên liệu 37 1. Nghiền malt 37 2 Nghiền gạo. 39 Phần II: Phân xưởng nấu 41 II.1 Hồ hoá 41 II.2 Đường hoá. 43 II.3 Lọc dịch đường 44 II.4/ Nấu hoa ( hoa houbol hoá dịch đường) 45 II.5/ Lắng trong và làm lạnh sơ bộ dịch đường 48 II.6/Làm lạnh nhanh 49 Phần III: Phân xưởng lên men 50 III.1 Gây men giống: 50 III.2 Lên men: 51 III.3 Lọc trong bia 54 Phần IV. Phân xưởng chiết chai 57 IV.1 Máy rửa chai 57 IV.2Máy rửa két 58 IV.3 Chiết bia 59 IV.4 Thanh Trùng 60 IV.5. máy dán nhãn 60 Phần V . Phân Xưởng phụ trợ 61 V.1.Hệ thống xử lí nước RO 61 V.2 Chế độ vệ sinh thiết Bị (hệ thống CIP) 61 V.3 hệ thống xử lí nước thảI 64 Phần A : Tổng quan đề tài nghiên cứu tốt nghiệp I/Vai trò của vi khuẩn lactic: Vi khuẩn lactic được ứng dụng rộng rãi trong công nghiệp thực phẩm, trong công nghiệp sản xuất axit lactic, nông nghiệp và các sản phẩm probiotic điều trị các bệnh đường ruột ở người, động vật và bảo quản. Trong công nghiệp thực phẩm, các quá trình lên men lactic để chế biến rau quả, thịt, cá vừa nhằm mục đích bảo quản vừa đem lại cho sản phẩm các tính chất và hương vị hấp dẫn. Trong công nghiệp người ta thường sử dụng loài vi khuẩn Lactobacilus delbrueckii và loài L. coagulas để sản xuất axit lactic và các loại lactat. Axit lactic được sử dụng như một chất gia vị để bổ sung vào các đồ uống nhẹ, dịch quả, mứt và siro cũng như trong ngành đồ hộp rau quả và cá. Muối của axit lactic (muối canxi hay muối sắt) có tác dụng điều trị, bổ sung các chất khoáng thiếu hụt trong cơ thể … Trong chăn nuôi thức ăn gia súc: Quá trình lên men lactic dùng để ủ chua thức ăn. Nhờ quá trình ủ chua này mà thức ăn có thể giữ được lâu ở trạng thái tươi đồng thời không những không làm giảm giá trị dinh dưỡng mà còn làm tăng hàm lượng vitamin trong thức ăn so với trước khi ủ. Trong y dược: các vi khuẩn lactic được sử dụng như các probiotic. Trong ruột chỉ có khoảng 1% trong số hơn 400 loài vi khuẩn khác nhau là có hại. Còn lại phần lớn các vi khuẩn đường ruột là có ích, chúng được chế biến thành chế phẩm tế bào ở dạng khô, gọi là các probiotic. Chế phẩm probiotic là các tế bào vi sinh vật có ích đã được tách nước đến độ ẩm nhất định, bảo quản ở dạng khô, các tế bào có thể được tái sinh bằng cách cho tế bào hoạt hoá nước trở lại (rehydrat) trong môi trường. Các vi khuẩn probiotic này giúp cải thiện sức khoẻ bằng cách: hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn có hại (chúng tạo ra những chất gồm axit lactic, axit axetic, axit benzoic, hydroperoxit và các chất kháng sinh tự nhiên làm hạn chế sự sinh sản của vi khuẩn gây bệnh nào đó). thúc đẩy sự tiêu hoá và tăng cường sức đề kháng nhiễm trùng. Phần lớn các probiotic đã được tiêu thụ như một khẩu phần ăn có vi sinh vật, như sữa có Lb. acidophilus, sữa chua, sữa đậu … Thực tế, các vi sinh vật không thể sống quá lâu trong đại tràng, chúng sẽ vị thải ra ngoài cùng với phân, do đó việc bổ sung thường xuyên các sản phẩm thực phẩm chứa probiotic là một giải pháp hữu hiệu để duy trì khu hệ vi sinh vật đường ruột khoẻ mạnh [30,31,34,39]. Đối với những người sau khi sử dụng thuốc kháng sinh thì các sản phẩm thực phẩm có chứa probiotic là một giải pháp khôi phục lại hệ vi khuẩn đường ruột một cách nhanh nhất, giúp duy trì một hệ tiêu hoá khoẻ mạnh [27,46]. ứng dụng chế phẩm probiotic vào môi trường nuôi cá. Trong nông nghiệp, nuôi cá nước ngọt chiếm một quy mô khá lớn.Thế nhưng số lượng các bệnh do vi sinh vật gây ra ở cá ngày một gia tăng. Đã có nhiều nghiên cứu để phát hiện các vi sinh vật có hại trong hệ thống tiêu hoá của cá và các phương pháp điều khiển chúng, nhưng lại có rất ít các công trình nghiên cứu đề cập đến những vi sinh vật có ích với cá, đặc biệt là nhóm vi khuẩn lactic và tác dụng của chúng với cá. Các chế phẩm probiotic chứa vi khuẩn lactic có thể sử dụng như những chất kháng sinh bổ sung vào môi trường giúp ngăn chặn các nhân tố gây bệnh và thúc đẩy sự sinh trưởng, phát triển của cá. Một số chủng probiotic được sử dụng phổ biến : Carnobacterium divergens : loài này được phân lập từ cá hồi Atlantic, ban đầu có tên là Lactobacillus plantarum. Các thí nghiệm in vitro cho thấy Carnobacterium divergens kìm hãm Vibrio anguillarum, Vibrio salmonicida và Proteus vulgaris. Các thí nghiệm in vitro cho thấy Carnobacterium divergens cấy cho ấu trùng mới nở, sau 5 ngày chúng chiếm 70% số lượng hệ vi sinh vật của ấu trùng, trong khi đó hệ vi sinh vật của các ấu trùng không được cấy Car. divergens có thành phần nổi trội là các nhóm cơ hội Cytophaga/Flexibacter (45%) và Pseudomonas sp (45%). Carnobacterium sp. K1 : chủng này được phân lập từ đường ống tiêu hoá của cá hồi non. Nó có khă năng chống lại Aeromonas hydrophila, A. salmonicida, Flavobacterium psychrophilum, Photobacterium damselae, Streptococcus milleri, Vibrio anguillarum và V. rodalii. Một số thí nghiệm in vitro cho thấy Carnobacterium sp. K1 theo đường miệng thâm nhập vào cá, bám chặt vào dịch ruột, sống sót và tồn tại một số ngày (> 106 CFU/g phân), kìm hãm Vibrio anguillarum, Aeromonas salmonicida(ở cá chép) và A. salmonicida, Yersinia ruckerii (ở cá trắm đen). Lactobacillus rhamnosus (ATCC 53103) : được phân lập từ người và có khả năng kháng lại A. salmonicida. Lactobacillus sp. DS-12 (Weissella hellenica) : được phân lập từ ruột cá bơn, có khả năng chống lại Edwardsiella tarda, Pasteurella piscida, Aeromonas hydrophila và Vibrio anguillarum, chịu được nồng độ muối mật 10% và chịu axit (pH 3 trong 90 phút). Trong số các vi sinh vật đường ruột, Lactobacillus acidophilus cũng là vi sinh vật đường ruột có ích được biết đén nhiều. Đó là vi khuẩn có ích nổi trội nhất trong dịch ruột trước, chúng có dạng hình que tròn ở hai đầu, kích thước 0,6 -0,9 x 1,5 mm. Nó giúp làm giảm mức độ có mặt của các vi khuẩn, nấm men có hại trong ruột nhỏ, sinh ra enzym lactaza - một enzym quan trọng đối với sự tiêu hoá sữa và sinh ra các VTM B (niacin, axit folic và piridoxin) trong quá trình tiêu hoá [29,30,34]. II/ Đặc điểm sinh lý, sinh hoá của vi khuẩn lactic II.1/ Đặc điểm chung Chúng là những vi khuẩn Gram(+), không sinh bào tử, catalaza âm tính, oxydaza âm tính, khử nitrat âm tính và hầu hết đều không di động. Chúng không có khả năng tổng hợp nhân hem của các pocphyrin, chúng không chứa các xitocrom. Chúng có thể sinh trưởng được khi có mặt oxy, là loại cơ thể duy nhất có khả năng lên men hiếu khí cũng như kị khí [1 ] . II.2/ Nhu cầu dinh dưỡng của vi khuẩn lactic Vi khuẩn Lactic có nhu cầu dinh dưỡng rất phức tap., ngoài nguồn cacbon, nitơ, còn phảI có các yếu tố tăng trưởng như VTM B, các axits amin, bazơ pyruvic, pyrimic. Đó là lý do giảI thích cho sự phân bố rộng rãI cùa vi khuẩn này trong môI trường giàu dinh dưỡng như sữa. Vì vậy môI trường nuôI cấy vi khuẩn Lactic thường dùng là môI truờng MRS. [1 ]. a)Nguồn cacbon Vi khuẩn lactic có thể sử dụng nguồn cacbon từ nhiều loại hydratcacbon khác nhau như các hexoza (glucoza, fructoza, mannoza, galactoza), các đường đôi (saccaroza, lactoza, maltoza, trehalose ) và cả các polysacarit (tinh bột). Ngoài ra LAB còn sử dụng cả cellobiose, Melibiose, raffinose [2 ]. Tuy nhiên, nguồn cacbon quan trọng nhất đối với vi khuẩn lactic vẫn là monosaccarit và disaccarit, chúng được dùng để cung cấp năng lượng, xây dựng cấu trúc tế bào và sinh ra các axit hữu cơ như axit lactic, malic, pyruvic, fumaric, axetic... b) Nguồn nitơ Chỉ có một số ít loài vi khuẩn lactic có khả năng sinh tổng hợp các hợp chất nitơ hữu cơ từ nguồn nitơ vô cơ, còn lại phần lớn các vi khuẩn lactic không thể tham gia phản ứng phosphỏyl hoá nên những loài này thì chúng phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường. Chính vì vậy, ngoài nguồn dinh dưỡng là axit amin, trong môi trường nuôi cấy người ta còn bổ sung các hợp chất chứa nitơ như: pepton, cao thịt, cao men, casein...[3] c) Nguồn cung cấp vitamin cho vi khuẩn lactic Hầu hết các vi khuẩn lactic không tự tổng hợp được các vitamin. Vì vậy, trong suốt quá trình nuôi cấy vi khuẩn lactic người ta phải bổ sung các nguồn cơ chất chứa nhiều vitamin vào môI trường. Tuy nhiên, nhu cầu vitamin của vi khuẩn lactic phụ thuộc vào loài vi khuẩn, môi trường và điều kiện nuôi cấy ví dụ như L. fermenti cần nhiều B1, L. casei cần nhiều B2 để tạo FAD, FMN; L. lactIS cần nhiều B12; l. Arabinosus cần nhiều biotin…[2] d) Các muối vô cơ và các hợp chất hữu cơ cần thiết khác Lactobacillus đòi hỏi những inon Mg+2, Mn+2 để sinh trưởng và phát triển [1]. Ion .Mn+2 đóng vai trò trong việc bảo vệ chúng khỏi các tác đọng bất lợi của oxy. Ngoài ra các muối NaH2PO4, Na2HPO4 Còn đóng vai trò tạo môI trường đệm cho chúng trong quá trưởng sinh trưởng phát triển. Axit oleic cũng rất cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn lactic. Vì vậy, người ta thường bổ sung Tween 80 - một dẫn xuất của axit oleic vào môi trường nuôi cấy [3]. II.3/ Một số yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn lactic II.3.1. ảnh hưởng của các hợp chất vô cơ Phốt phát là loại muối quan trọng nhất mà các vi khuẩn lactic yêu cầu. .Hợp chất mangan ngăn cản sự tự phân của tế bào, tham gia vào cấu trúc và đảm bảo chức năng hoạt động của enzym, giải độc các tế bào khỏi sự có mặt của oxy. Mn2+ thay thế dioxit dimustaza để thải các gốc O2-, mặt khác mangan còn tham gia vào sự ổn định cấu trúc của riboxom . II.3.2.ảnh hưởng của oxy Vi khuẩn lactic là loài hô hấp tuỳ tiện, nhưng chủ yếu là kỵ khí và vi hiếu khí. II.3.3.ảnh hưởng của pH Các loài vi khuẩn lactic có khả năng tạo ra lượng axit rất khác nhau trong môi trường. Chính vì vậy, sức chịu axit của chúng rất khác nhau. Lactobacillus acidophillus có pH hoạt động là 4.0 – 6.8 ; pH tối ưu là 5.8 – 6.6 [1]. Trong quá trình lên men lactic, axit lactic sinh ra đầu tiên có tác dụng ức chế các loại vi sinh vật khác, sau đó khi lượng axit tích luỹ đủ lớn thì ức chế luôn cả chính bản thân vi khuẩn lactic. II.3.4.ảnh hưởng của nhiệt độ Khoảng nhiệt độ phát triển của Lactobacillus acidophillus là khá rộng từ 15 – 45 0C, dưới 15 oC chúng không phát triển được[ 2]. Chúng khá nhạy cảm với nhiệt độ, số lượng tế bào giảm mạnh khi nhiệt độ tăng hoặc giảm ngoài giới hạn. II.3.5. ảnh hưởng của áp suất thẩm thấu Màng tế bào vi khuản là màng bán thấm. Hoạt động trao đổi chất qua màng tế bào phụ thuộc vào hệ enzym pecmeraza nằm trên màng và áp suất thẩm thấu mỗi cơ chất có trong môi trường. áp suất thẩm thấu của môi trường tỷ lệ với nồng độ chất khô hoà tan trong môi trường. Ngườita nhận thấy hàm lượng NaCl lớn hơn 5% thì phần lớn các vi khuẩn lactic không phát triển, trừ Enterococcus có thể chịu hàm lượng muối lên tới 6,5% ở pH = 9,5[28]. III/ Các phương pháp sấy khô vi khuẩn Để tạo chế phẩm probiotic, người ta tiến hành tách nước tế bào vi khuẩn, có thế nói khi đó tế bào ở ” trạng thái tiềm sinh”. Có nhiều phương pháp để tách nước khỏi tế bào vi sinh vật nhưng tách nước khỏi tế bào bằng phương pháp sấy khô đang phát triển mạnh mẽ và trở thành một lĩnh vực đầy triển vọng. Tuy nhiên do vi khuẩn lactic có khả năng sống sót kém dưới những thay đổi bất lợi của môi trường nên vấn đề đặt ra là tìm điều kiện thích hợp cho quá trình sấy vi khuẩn Lactobacillus acidophillus để thu được chế phẩm thô có tỷ lệ tế bào sống cao nhất đồng thời giữ nguyên được các tính chất ban đầu của chúng. III.1/ Cơ sở của phương pháp Nước chiếm 70 - 80% trọng lượng tế bào vi sinh vật trong đó một phần ở trạng thái liên kết( nghĩa là tạo thành dạng keo của tế bào và tham vào cấu trúc tế bào) một phần ở trạng thái tự do ( dạng dung dịch các hợp chất hữu cơ, vô cơ hình thành trong tế bào liên quan đến quá trình trao đổi chất). Nước trong tế bào là môi trường hoạt động cho rất nhiều các phản ứng hoá sinh xảy ra trong quá trình trao đổi chất như các phản ứng tổng hợp và phân huỷ các thành phần cấu trúc tế bào. Nếu lượng nước trong tế bào bị mất đi ít hay nhiều đều làm cho chúng không xảy ra được hoặc xảy ra một cách hết sức chậm chạp. Tế bào bị mất nước thì các hoạt động trao đổi chất cũng như các quá trình oxy hoábị đình trệ, có thể nói "tế bào ở trạng thái tiềm sinh". Từ cơ sở đó người ta đã đề xuất phương pháp bảo quản khô vi khuẩn bằng cách loại nước khỏi tế bào . III.2/ Một số phương pháp sấy khô vi khuẩn phổ biến III.2.1. Sấy đông khô Trong phương pháp sấy này, nước được tách một cách đặc biệt ra khỏi tế bào, chúng được chuyển từ trạng thái rắn sang trạng thái hơi không qua trạng thái lỏng và đi ra khỏi tế bào. Vật liệu sấy được sấy trong môi trường chân không cao [5] ( với áp suất nhỏ hơn 256 mmHg, nhiệt độ sấy có thể đạt -80 0C). Do đó, có thể ngăn chặn được nguy cơ phá huỷ bởi nhiệt độ, các phân tử không kết hợp lại với nhau khi cô đặc tránh được các quá trình vi sinh vật xảy ra làm giảm chất lượng sản phẩm sấy. Vật liệu sấy trước khi sấy được làm lạnh đông sâu nhanh nhằm chuyển toàn bộ nước có trong vật liệu sang trạng thái rắn, các cấu tử hoà tan được cố định sao cho không kết hợp lại với nhau. Dưới áp suất rất thấp nước sẽ bay hơi, hơi ẩm sẽ bay sang thiết bị ngưng tụ và ngưng tụ thành nước đá. Thiết bị ngưng tụ này được làm lạnh bằng nước muối có nhiệt độ vào là - 10 0C và nhiệt độ ra là 40 0C. Trong quá trình làm lạnh sâu, vi sinh vật có thể bị chết . Nguyên nhân chính làm chết tế bào vi khuẩn trong sấy đông khô là do sự tạo thành các tinh thể đá, áp suất thăm thấu trong tế bào tăng lên nhiều do nồng độ chất hoà tan trong tế bào tăng cao. Chính sự tăng áp suất thẩm thấu này làm cho màng tế bào bị phá huỷ, gây biến tính cũng như làm mất tính chất ưa nước của các phần tử có phân tử lượng cao trong tế bào [6]. Vì vậy để khắc phục ta hiện tượng này người ta sử dụng các chất độn (chất mang) để nhũ hoá keo bảo vệ tế bào. Các chất độn thường sử dụng là sữa, huyết thanh, lòng trắng trứng, pepton, muxin hay các loại đường, betain, glycerol, dimethylssunphoaxit.[7], [19]. Đây là một phương pháp được chứng minh là cho tỷ lệ sống sót của tế bào một số loài vi khuẩn sau khi sấy là cao nhất. Phần trăm số lượng tế bào sống sót cao (khoảng 90%) tuỳ theo từng loại chất độn được bổ sung [5]. III.2.2.Sấy chân không Phương pháp sấy chân không được thực hiện dựa trên nguyên tắc : áp suất hơi bão hoà giảm thì nhiệt độ sôi giảm và ngược lại. Do đó, người ta tiến hành sấy ở áp suất thấp nhằm giảm nhiệt độ sấy để thu được tỷ lệ tế bào vi khuẩn sống sót sau khi sấy cao . Phương pháp sấy chân không thấy là cho tỷ lệ tế bào sống sót nhỏ hơn so với phương pháp sấy đông khô. Phương pháp này được áp dụng khi độ ẩm vật liệu không quá cao, khi đó thời gian sấy sẽ không quá lâu, ảnh hưởng đến sự sống của tế bào. Phương pháp này ít được sử dụng do tỷ lệ tế bào sống sótứau khi sấy không cao lắm, khoảng 60 - 70%, do độ ẩm vật liệu trước khi sấy không cao thì sự phối trộn giữa vật liệu sấy và chất mang không đều khiến chất mang sẽ không phát huy được khả năng bảo vệ của mình. III.2.3. Sấy phun: Là phương pháp sấy dựa trên nguyên tắc bay hơi ẩm nhờ sự chênh lệch nhiệt độ giữa vật liệu và tác nhân sấy. Tác nhân sấy thường là không khí nóng, nhiệt độ đầu vào là 100 - 120 0C, nhiệt độ đầu ra là 60 - 90 0C. Trong các phương pháp sấy thì sấy phun là phương pháp sấy có số lượng tế bào sống thấp nhất, hầu như là dưới 60%, thậm chí có thể dưới 30%. Hơn nữa, nhiều nghiên cứu cho thấy, chế phẩm sấy phun có thời hạn sử dụng ngắn, số tế bào chết tăng nhanh trong quá trình bảo quản do đã bị suy yếu trong quá trình sấy và không đủ khả năng chống chịu tiếp trong khi bảo quản, tỷ lệ tế bào chết có thể lên đến 70 -79% sau 2-3 tháng bảo quản , tuy nhiên chúng không cần sử dụng các tác nhân bảo vệ làm môI trường sấy nên giảm giá thành sản phẩm so với sấy đông khô[21]. III.2.4 Sấy tầng sôi: Sấy tầng sôi là phương pháp sấy dùng không khí nóng hoặc hơi nước làm tác nhân sấy có nhiệt độ, độ ẩm, tốc độ phù hợp chuyển động chảy trùm lên vật liệu sấy làm cho nước trong vật liệu sấy bay hơi rồi đi theo tác nhân sấy. Sau thời gian sấy nào đó ta thu được sản phẩm sấy có độ ẩm theo yêu cầu. Dòng khí nóng chảy qua các lớp vật liệu sấy dưới những điều kiện xác định về tốc độ và hướng để tạo nên một trạng thái sôi, chúng có thể được cung cấp các ống xen vào giữa lớp vật liệu sấy. Trong phương pháp sấy tầng sôi, vật liệu sấy có thể trải qua các quá trình : sấy khô, làm nguội, kết tụ và tạo các hạt. Quá trình kết tụ và tạo hạt có thể được thực hiện theo nhiều cách khác nhau tuỳ thuộc vào dạng vật liệu sấy và tính chất của sản phẩm cần đạt được. Thông thường, đối với vật liệu sấy là tế bào vi sinh vật thì người ta trộn sinh khối tế bào với các loại chất độn khác nhau trước rồi mới đưa vào sấy. Phương pháp sấy tầng sôi có ưu điểm là cho phép sấy ở nhiệt độ thấp, thời gian ngắn và thời gian làm nguội sản phẩm nhanh, chúng thích hợp cho cả các vật liệu sấy dễ bị hoặc không bị tổn thương bởi nhiệt. Phương pháp này hiện nay đang được ứng dụng nhiều trong thực tế . III.3/ Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sống của tế bào vi khuẩn sau khi sấy III.3.1. Anh hưởng của chế độ sấy Các phương pháp sấy khác nhau cho tỷ lệ tế bào sống sau khi sấy khác nhau. Các yếu tố của chế độ sấy bao gồm: kiểu tách nước ra khỏi tế bào, nhiệt độ sấy, thời gian sấy, hàm lượng ẩm còn lại sau khi sấy ...ảnh hưởng trực tiếp đến hoạt độ nước của tế bào, đến sự tổn thương các thành phần tế bầo. Hoạt độ của nước là một yếu tốquan trọng tác động đến hoạt đông sinh lý và trao đổi chất của vi sinh vật [17]. Trong quá trình sấy nếu aw giảm chậm thì sẽ cho phép cảI thiện một cách có ý nghĩa khă năng sống sót của tế bào , ngược lại tốc độ tách nước ra khỏi tế bào càng lớn, hoạt độ nước của tế bào bị giảm đột ngột, tế bào dễ bị sốc và chết. Nghiên cứu về L. plantarum trong phương pháp sấyphun cho thấy , để đạt được cùng một hoạt độ nước cuối cùng là aw = 0.29 , nếu thực hện sock nhệt thí % tế bào sóng là 41%; nếu thời gian sấy kéo dài tới 135 phút thì đạt được 85 % tế bào sóng sót[8] Vi khuẩn Lactic rất nhạy cảm với nhiệt độ, đặc biệt là khi nhiệt đô lớn hơn 450C. Vì vậy nhiệt dộ sấy càng thấp thì cho khả năng sống sót càng cao. Nghiên cứu thực hiền sấy chân không L. bungraricus ( t = 150 phút) cho thấy [24] Nhiệt độ 300C 350C 400C 450C Tỷ lệ sống sót( n/no) o.95 0.9 0.85 0.5 Nhiệt độ sấy cao gây biến tính protein, oxy hoá các chất béo, tác động xấu đến không bào, ribosome , gây kết tụ phân tử AND, thay đổi khả năng hoà tan của một số ổtein hoặc gây ra các tổn thương khó hồi phục cho tế bào, làm chết tế bào. [8]. Trong sấy đông khô, trong qúa trình làm lạnh và làm tan giá liên quan tới sự phá huỷ màng tế bào sinh vật ( sự tạo lỗ hổngtrên màng tế bào, làm nứt , vỡ tế bào). Với sấy phun, khả năng sống sót của LAB càng giảm khi nhiệt độ ra của tác nhân sấy càng cao. Thời gian sấy cũng là một yếu tố quan trọng, thời gian tiếp xúc với các điều kiện bất lợi càng lâu, khả năng sống sót của tế bào càng giảm [20]. Do vậy, việc lựa chọn phương pháp sấy có thời gian sấy ngắn và nhiệt độ sấy thấp là một điều hết sức có ý nghĩa. III.3.2/ Anh hưởng của chủng giống. Trong quá trình sấy đông khô và bảo quản ở trạng thái khô, các chủng khác nhau của các giống khác nhau có tỷ lệ sóng sót khác nhau và mang tính đặc hiệu của loài đó. Sự khác biệt này vẫn chưa được giải thích, tuy nhien có một số giả thiết cho rằng:(i) có thể là do trình tự gen khác nhau dẫn tới những thay đổi về kiểu hình của các chủng L. lactic; (ii) sự khác nhau về cấu trúc và thành phần của màng và thành tế bào khác nhau dẫn tới những tổn thương khác nhau. III.3.3/ Anh hưởng của thành phần môi trường sinh trưởng Các LAB sử dụng trong công nghiệp thực phẩm luôn phảI tiếp xúc với các điều kiện áp lực bất lợi như nhiệt độ thấp, pH thấp, áp suất thẩm thấu lớn Khi ở trạng thái này, màng tế bào chất cho phép vận chuyển nước và ngăn cản hiệu quả sự vận chuỷên các chất hoà tan từ tế bào ra môI trường ngoại bào. Khi áp suất của môI trường ngoài tăng đột ngột làm cho nước thấm từ trong ra ngoài , điều đó làm giảm sự trương nở của tế bào, làm biến dạng tế bào, thau đổi nồng độ các thành phần trong tế bào chất, làm giảm thể tích tế bào. Ngược lại, khi có một sự sốc trương, nước từ môI trường ngoại bào đI vào môI trường nội bào , làm tăng thể tích tế bào, tăng áp lực trương nở. Cả hai sự thay đổi áp suất thẩm thấu này đều bất lợi đối với tế bào vi khuẩn. Để sống sót được vi khuẩn phảI phát triển những phương thức thích hợp để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu giữa bên trong tế bào và môi trường ngoài tế bào [33], [34],[35]. III.3.3.1.Sự tích luỹ các chất hoà tan tương thích Các phản ứng thích nghi của vi khuẩn trong môI trường áp lực xảy ra theo hai khía cạnh: một là chúng tích luỹ các tác nhân bảo vệ thẩm thấu với nồng độ cao; hai là chúng tăng cường khả năng chịu đựng nhiều chiều với các áp lực môI trường khác nhau [13], [22]. Các tác nhân bảo vệ thẩm thấu là các chất hữu cơ có thể được tích luỹ với nồng độ cao trong tế bào chất, chúng không phản ứng với các thành phầncủa tế bào, ở những điều kiện bất lợi thẩm thấu chúng làm cho tế bào thiết lập lại được cân bằng thẩm thấu. Các tác nhân bảo vệ thẩm thấu này còn được gọi là các chất hoà tan tương thích. Các chất hoà tan tương thích này có thể được tích luỹ bằng con đường sinh tổng hợp( các chất hoà tan tương thích nội sinh như glutamat, proline) hoặc bằng cách hấp thụ từ môi trường ( chất hoà tan tương thích ngoại sinh như glycine betaine, các disaccarit như sucro, maltose, trehalose…) [36], [22]. Một số vi khuẩn Lactic không có khả năng tổng hợp các chất hoà tan tương thích, ví dụ như L. plantarum không tổng hợp được glycine betaine, chất này được vận chuyển từ môI trường vào nội bào khi tế bào bị sốc trương[32]. Môi trường MRS chứa nguồn axit amin tự do, cao thịt , cao nấm men, các thành phần này cung cấp cho LAB một lượng lớn choline, carnitin, dimethylsulfonoacetat… Nhiều nghiên cứu chỉ ra rằng trong môI trường MRS có bổ sung muối NaCl sẽ là tăng khả năng tạo chất hoà tan tương thích. Các phân tích môI trường MRS bởi C- NMR quang phổ cho thấy, khi không bổ sung muối vào thì những dấu hiệu tạo thành proline( chất hoà tan tương thích) rất mờ nhạt ( các pick proline yếu), Còn khi bổ sung 1 Mol NaCl dấu hiệu tạo thành glycine betaine rất rõ ràng [14]. Ngoài ra sự có mặt của NaCl trong môI trường nuôi cấy cũng làm tăng tỷ lệ axit béo no/ axit béo chưa no (do đó thúc đẩy sự tạo thành axit lactobacilic); đồng thời làm tăng tính thẩm thấu các ion nhỏ như Ca+2, H+, Na+ nhưng cơ chế của này vẫn chưa đựoc giảI thích rõ ràng [15]. Do vậy môi trường sinh trưởng cũng có những ảnh hưởng nhất định lên khả năng sống sót của tế bào vi khuẩn trong quá trìng sây. III.3.3.2/ Những xử lý dưới mức gây chết. Dưới những điều liện sinh trưởng khắc nghiệt dưới mức gây chết, tế bào vi khuẩn phảI phát triển hệ thống tự bảo vệ để sống sót, thích nghi. Hệ thống tự bảo vệ này cố thể được tạo ra do đột biến gen để tế bào thích ứng với những tác động lý hoá học bất lợi hoặc tế bào ở pha cân bằng có những biến đổi thao các cachs khác nhau để đối phó với các áp lực môI trường. Nghiên cứu của Waston etal năm 1998 về việc bỏ đói tế bào Gran (+) Staphylococcus aureus ( sau 25 ngày nuôi cấy trong môI trường thiếu glucose) tế bào vi khuẩn đã phát triển khả năng sống sót bằng cách giảm kích thước tế bào. Còn tế bào vi khuẩn E. faecalis đối phó với sự thiếu glucose bằng cách tăng sự thẩm thấu các tác nhân bảo vệ thẩm thấu vào trong nội bào[30]. Đối với L. lactis, khi có các tác động lý ghoá thì xảy ra sự đột biến các gen liên quan tới sự tỏng hợp guanine nucleotit làm cho tế bào đột biến bền hơn với các điều kiện áp lực đa chiều của môI trường trong suốt pha mũ. III.3.4 Thành phần môI trường sấy Sấy đông khô thường được sử dụng để bảo quản các mẫu sinh vật. Tuy nhiên chúng lại dễ làm biến tính protein và do đó làm giảm tỷ lệ sống của nhiều loại tế bào [40], [41].. Để ngăn chặn và làm giảm những hiện tượng này các chất bảo vệ như sữa gấy, sucrose, trehalose glycerol,dimethylsulfoxit được thêm vào các mẫu trước khi làm lạnh và lạnh đông khô[42].Trong khi thêm những dung dịch trên để làm tăng số tế bào sống trong những mẫu sấy đông khô, duy trì khả năng sống, thấp hơn so với môi trườngban đầu [40]. Cơ chế trehalose bảo vệ sự sống sót tế bào vi khuẩn trong quá trình sấy Có 2 yêu cầu đối với các chất được sủ dụng trong môI trường sâý: là bào vệ màng tế bào nguyên vẹn và bảo vệ cấu trúc protein trong suốt quá trình sấy và rehydrat. Disacarit trehalose, sucrose đáp ứng đầy đủ được 2 yêu cầu này. Trong quá trình sấy đông khô, khi nước được thoát khỏi màng chất béo thì các nhóm có cực ở đầu được xích lại gần nhau, do đó làm tăng lực Van der Walls ở các mạch vòng. Chính sự tăng tương tác Van der Walls này thúc đẩy sự tạo thành trạng thái keo ở nhiệt độ phòng, điều này dẫn tới sự phân tách riêng các thành phần của màng tế bào. Khi màng lipid khô được rehydrat thì nó phải trải qua một giai đoan chuyển hoá từ trạng thái keo sang trạng thái tinh thể lỏng, trong quá trình này có thể tạo ra các lỗ hổng trên màng lipid. Những lỗ hổng này làm rò rỉ các chất tan trong tế bào ra môI trường bên ngoài, làm chết tế bào. Khi thêm disacarit vào môI trường trước khi sấy như trehalose sẽ làm giảm nhiệt độ chuyển hoá trạng thái của màng tế bào khô bằng cách thay thế nước vào giữa các nhóm đầu của chất béo, ngăn cản sự tạo thành lỗ hổng khi rehdrat. Chính nhờ sự làm giảm nhiệt độ chuyển trạng thái của màng tế bào khô mà trehalose và sucrose đã bảo vệ cả cấu trúc và chức năng của các protein nhạy cảm trong suốt quá trình sấy. Do khi làm mất nước tế bào các disaccarit taol liên kết hydro với các protein , do đó ngăn chặn sự biến tính của protien , duy trì sự ổn định của protein trong quá trình sấy. Vì vậy, với sự có mặt của trehalose, sucrose khi sấy thì dường như sự tăng khả năng sống sót của vi khuẩn là do trehalose, sucrose làm giảm nhiệt độ chuyển trạng thái của màng tế bào, và duy trì được cấu trúc của protein ở trạng thái mất nước. Khi sấy tế bào mà không sử dụng đường, cả E.coli, B.thurigiensis đều có nhiệt độ chuyển hoá màng cao hơn nhiệt độ phòng., và những tế bào này khi rehydrat bằng nứơc ở nhiệt độ phòng sẽ làm cho chúng chịu một trạng thái chuyển hoá hướng nhiệt. Tuy nhiên khi sấy kho với sự có mặt của trehalose, sucrose thì nhiệt độ chuyển hoá màng ở những tế bào mất nước trở nên thấp hơn nhiệt độ phòng vì vậy khi rehydrat ở nhiệt độ phòng chúng không bị chuyển trạng thái. Tác dụng bảo vệ của sữa gầy: Sữ bột gày ngăn cản sự tổn thương tế bào khi sấy bằng cách làm ổn định các thành phần màng tế bào [19], hơn nữa protein của sữa có thể tạo lớp vỏ bảo vệ cho các protein của thành tế bào, còn canxi trong sữa làm tăng khả năng sống sót khi làm lạnh và đông khô tế bào [21]. Khi sấy đông khô L. salivarius[*] + nếu chỉ có sucrose : tăng khả năng sống sót 13% nhưng không bảo vệ khả năng sống trong quá trình bảo quản, và giảm 4% khă năng sông sau 3 tuần. +Sữa bột gầy: tăng 22.4% khả năg sống sau khi sấy, duy trì jkhả năng sống trong quá trình bảo quản. + Trehalose: ít nhất là 34% sống sót sau khi sấy. + Trehalose + sucre: > 78 % sống sót sau khi sấy. + Trehalose+ sữa gầy + sucre: 83 – 85% dsống sót sau khi sấy. *Carvalho nhận thấy monosodium glutamat (MSG) khi được dùng làm thành phần môi trường sấy đông khô cũng làm tăng khả năng sóng của phần lớn các LAB , bảo quản cấu trúc protein của chúng thông qua các phản ứng giữa nhóm axyl của chất bảo vệ với nhóm –COOH của các protein ở tế bào vi khuẩn, đồng thời MSG góp phần giữ lại độ ẩm lớn của tế bào sau khi sấy. III.3.5. Bảo quản và hydrat Trong quá trình bảo quản các mẫu tế bào khô, tính ổn định của chúng sẽ bị giảm, tỷ lệ sống sót sẽ cao hơn nếu nhiệt độ bảo quản thấp hơn. Thêm vào đó các điều kiện bảo quản như áp suất, tiếp xúc với ánh sáng và độ ẩm tương đối rõ ràng là rất quan trọng để hồi phục các tế bào sấy khô. * Đối với mẫu tế bào sau khi sấy đông khô Chứa trong T0(0C) AW( %) S.thermophilus(% sống) B.longum(% sống) Túi kim loại 4 25 3 3– 4.17 2.7 – 3.5 7.0 – 7.3 7.0 – 7.2 68 – 70 58 – 64 Chai thuỷ tinh 4 25 3.23 3.2 – 3.4 7.0 – 7.3 6.9 – 7.1 54 – 66 44 – 52 Chai PET 4 25 3.27 3.1 – 3.6 6.9 – 7.2 6.8 – 7.0 45 – 54 33 - 39 Kết quả trên cho thấynhững mẫu tế bào khô được bảo quản ở nhiệt độ 4 0C, trong bóng tối thì tính ổn định của chúng cao hơn, tỷ lệ sông sót cũng cao hơn. ảnh hưởng của các điều kiên rehydrat Một tế bào vi sinh vật sống sót qua nhiều khâu như làm lạnh, sấy khô và bảo quản có thể giảm khả năng sống khi rehydrat hoá. Rehydrat là một bước quan trọng phục hồi lại các vi sinh vật đã bị sấy khô, vì tế bào đã bị tổn thương gần chết có thể không sửa chữa được._.