Nghiên cứu bệnh thối củ hại trên cây sì to và khảo sát một số biện pháp phòng trừ

trong luận văn là do tơi thực hiện, các số liệu cơng bố hồn tồn trung thực và chưa hề được sử dụng để bảo vệ một học vị nào Tơi xin cam đoan rằng, mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cám ơn và các thơng tin trích dẫn trong luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Vũ Thị Tuyết Mai Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........ii LỜI CẢM ƠN Tơi xin chân thành cảm ơn: Ban Giám hiệu Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội, Viện đào tạo Sau đại học, khoa Nơng học, Bộ mơn Bệnh cây. Hồn thành luận văn này tơi xin bày tỏ lịng cảm ơn chân thành sâu sắc đến: PGS.TS Ngơ Bích Hảo - Bộ mơn Bệnh cây - Khoa Nơng học - Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội đã dành nhiều thời gian quý báu tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện luận văn này; Các thầy cơ giáo, cán bộ cơng nhân viên thuộc Bộ mơn Bệnh cây - Khoa Nơng học - Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội; Ban lãnh đạo Trung tâm Nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội - Viện Dược liệu, TS. Phan Thuý Hiền - trưởng Bộ mơn Canh tác - bảo vệ thực vật đã tạo giúp đỡ tơi trong suốt quá trình thực hiện đề tài này. ðể hồn thành luận văn này, tơi cịn nhận được sự động viên khích lệ của những người thân trong gia đình và bạn bè. Tơi xin chân thành cảm ơn những tình cảm cao quý đĩ. Tác giả luận văn Vũ Thị Tuyết Mai Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix 1. MỞ ðẦU 1 1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài 2 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài 2 1.4 ðối tượng phạm vi nghiên cứu 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 4 2.1 ðặc điểm nơng sinh học và tác dụng dược lý của cây sì to 4 2.2 Nguồn gốc và sự phân bố nấm Phytophthora cinnamomi 5 2.3 Triệu chứng bệnh và sự gây hại của Phytophthora cinnamomi 9 2.4 Tác động đến đa dạng sinh học 11 2.5 Phạm vi ký chủ của nấm Phytophthora cinnamomi 14 2.6 ðặc điểm sinh học, sinh thái nấm Phytophthora cinnamomi. 15 2.7 Chiến lược quản lý Phytophthora cinnamomi 20 2.7.1 Sử dụng cây chỉ thị để phát hiện bệnh do nấm P.cinnamomi sớm 20 2.7.2 Ngăn chặn sự lây lan của nấm Phytophthora cinnamomi 21 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1 Vật liệu nghiên cứu 26 3.2 Nội dung nghiên cứu 26 3.3 Phương pháp nghiên cứu 27 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........iv 3.3.1 Phương pháp phân lập, xác định tác nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. 27 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh thái của tác nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc 29 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu quy luật phát sinh, phát triển của bệnh chết nhanh trên đồng ruộng tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc 30 2.3.4 Nghiên cứu các biện pháp phịng trừ bệnh thối củ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc 30 4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 34 4.1 Thành phần bệnh hại cây Sì to (Valeriana jatamansi Jones ) tại Tam ðảo - Vĩnh Phúc và Sa pa - Lào Cai. 34 4.2 ðặc điểm hình thái nấm Phytophthora cinnamomi gây bệnh 38 4.3 Kết quả lây bệnh nhân tạo 40 4.3.1 Ảnh hưởng của phương pháp lây khác nhau đến khả năng nhiễm nấm P. cinnamomi gây thối củ rễ cây Sì to 40 4.3.2 Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của nấm P. cinnamomi gây bệnh thối củ rễ cây sì to tại Tam ðảo - Vĩnh Phúc và Sapa - Lào Cai 43 4.4 Nghiên cứu ðặc điểm phát sinh phát triển của bệnh thối củ cây Sì to trên đồng ruộng tại Tam ðảo - Vĩnh phúc và Sa pa - Lào Cai 46 4.4.1 Mức độ gây hại của bệnh ở những địa điểm trồng khác nhau 46 4.4.2 Diễn biến của bệnh thối củ Sì to (P.cinnamomi) trên đồng ruộng 49 4.5 Ảnh hưởng của một số yếu tố sinh thái đến bệnh thối củ hại cây Sì to trên đồng ruộng 51 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........v 4.5.1 Ảnh hưởng của việc sử dụng các loại phân bĩn khác nhau 51 4.5.2 Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch đến năng suất dược liệu và tỷ lệ bệnh thối củ hại trên cây Sì to 53 4.6 Ảnh hưởng của biện pháp canh tác đến bệnh thối củ Sì to. 56 4.6.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của vật liệu tủ gốc đến bệnh thối củ Sì to 56 4.6.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của phân bĩn đến bệnh thối củ cây Sì to 58 4.7 Ảnh hưởng của biện pháp hố học 62 4.7.1 Hiệu quả ức chế của một số loại thuốc hố học đến sự phát triển của nấm P.cinnamomi (Thí nghiệm trong phịng) 62 4.7.2 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hố học đến bệnh thối củ cây Sì to (Thí nghiệm ngồi đồng ruộng) 65 4.7.3 Hiệu lực của một số loại thuốc hố học đến bệnh thối củ cây Sì to 67 5. KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 68 5.1 Kết luận 68 5.2 ðề nghị 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO 70 PHỤ LỤC 74 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........vi DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CDTR Chiều dài thân rễ CCC Chiều cao cây CRT Chiều rộng tán NSDL Năng suất dược liệu Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........vii DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 4.1 Thành phần bệnh hại cây Sì to (Valeriana jatamansi Jones ) tại Tam ðảo - Vĩnh Phúc và Sa pa - Lào Cai 34 4.2 ðặc điểm hình thái nấm Phytophthora cinnamomi gây bệnh 38 4.3 Kết quả lây bệnh nhân tạo nấm P.cinnamomi cho cây Sì to bằng các phương pháp lây khác nhau 40 4.4 Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ tới sự phát triển của sợi nấm P.cinnamomi 43 4.5 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P.cinnamomi 45 4.6 Mức độ gây hại của bệnh thối củ hại trên cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc 47 4.7 Diễn biến lượng mưa, độ ẩm và tỷ lệ bệnh qua các tháng trong năm 2010 50 4.8 Ảnh hưởng của chế độ phân bĩn đến sự phát triển bệnh thối củ và năng suất cây Sì to tại Tam ðảo - Vĩnh Phúc 52 4.9 Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch đến năng suất dược liệu và tỷ lệ bệnh thối củ hại trên cây Sì to.\ 54 4.10 Ảnh hưởng của vật liệu tủ gốc đến bệnh thối củ hại trên cây Sì to 57 4.11 Ảnh hưởng của phân gà và phân chuồng tới sự phát triển của nấm P.cinnamomi gây thối củ Sì to 58 4.12 Ảnh hưởng của liều lượng phân bĩn đến sinh trưởng phát triển của cây Sì to 60 4.13 Ảnh hưởng của liều lượng phân bĩn đến tỷ lệ bệnh, năng suất và chất lượng củ cây Sì to 61 4.14 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hố học đến sự phát triển của tản nấm P.cinnamomi 64 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........viii 4.15 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hố học đến bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa pa – Lào Cai 65 4.16 Hiệu lực của một số loại thuốc hố học đến bệnh thối củ cây Sì to 67 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........ix DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 4.1 Sợi nấm Rhizoctonia solani 35 4.2 Triệu chứng cây Sì to bị đốm lá. 35 4.3 Triệu chứng cây Sì to bị bệnh thối củ (Nhiễm nhẹ) 37 4.4 Triệu chứng cây Sì to bị bệnh thối củ (Nhiễm nặng) 37 4.5 Cây Sì to bị thối củ, mạch dẫn thâm đen (nhiễm nhẹ) 37 4.6 Cây Sì to bị thối tồn bộ củ, mạch dẫn thâm đen( Nhiễm nặng) 38 4.7 Tản nấm Phytophthora cinnamomi sau 3 ngày nuơi cấy trên mơi trường PDA 39 4.8 Sợi nấm Phytophthora cinnamomi với các u lồi 39 4.9 Bào tử hậu của nấm Phytophthora cinnamomi. 39 4.10 Nhân sinh khối nguồn nấm bệnh 41 4.11 Lây bệnh bằng phương pháp áp thạch 42 4.12 Triệu chứng sau khi lây bệnh bằng phương pháp tưới trực tiếp dung dịch cĩ mẫu nấm vào đất. 42 4.13 Ảnh hưởng của điều kiện nhiệt độ tới sự phát triển của sợi nấm P. cinnamomi. 44 4.14 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P.cinnamomi 45 4.15 Ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của nấm P.cinnamomi 46 4.16 Ảnh hưởng của độ pH đến sự phát triển của nấm P.cinnamomi 46 4.17 Mức độ gây hại của bệnh thối củ hại trên cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc 47 4.18 Ảnh hưởng của thời điểm thu hoạch đến năng suất dược liệu và tỷ lệ bệnh thối củ hại trên cây Sì to 55 4.19 Ảnh hưởng của vật liệu tủ gốc đến bệnh thối củ hại trên cây Sì to 57 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........x 4.20 Ảnh hưởng của liều lượng phân bĩn đến tỷ lệ bệnh thối củ cây Sì to 62 4.21 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hố học đến sự phát triển của tản nấm P.cinnamomi 64 4.22 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hố học đến bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa pa – Lào Cai 66 4.23 Ảnh hưởng của một số loại thuốc hố học đến năng suất cây Sì to tại Sa pa – Lào Cai 66 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........1 1. MỞ ðẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Cây Sì to (Nữ lang nhện) – Valeriana jatamansi Jones thuộc họ Nữ lang (Valerianaceae) là cây thuốc quí được người H’Mơng ở Sa Pa - Lào Cai; Quản Bạ - Hà Giang và Kỳ Sơn – Nghệ An sử dụng làm thuốc an thần trong trường hợp trẻ em bị sốt cao, quấy khĩc, chống co thắt, chữa bệnh tim, bồi bổ sức khỏe và dùng cho phụ nữ sau khi sinh ...[2, 3, 4, 5]. Do trữ lượng ít, phân bố hạn hẹp, nên trong nhiều năm nay lồi cây này được đưa vào Sách đỏ Việt Nam và Danh lục ðỏ cây thuốc Việt Nam để chú ý bảo vệ [1,7,8]. Trong vài năm gần đây, Viện Dược liệu đã tiến hành những nghiên cứu sơ bộ về mặt sinh học, hĩa học cũng như tác dụng sinh học của lồi Sì to [3] Những kết quả ban đầu đạt được rất khả quan và đang được tiếp tục nghiên cứu sản xuất thuốc an thần từ lồi cây thuốc này. Do nhu cầu sử dụng Sì to ngày một tăng cao mà qua quá trình trồng trọt và theo dõi, chúng tơi nhận thấy vào mùa mưa tháng 6 trở đi khi nhiệt độ và độ ẩm mơi trường cao Sì to bị thối củ, rễ chết hàng loạt do dịch bệnh phát sinh và gây hại, thậm chí cịn khơng cho thu hoạch [9] Kết quả giám định ban đầu tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu, cho thấy nấm Phytophthora cinnamomi là nguyên nhân gây bệnh thối củ Sì to. Tuy nhiên hiện nay ở Việt Nam chưa cĩ kết quả nghiên cứu một cách cụ thể nào về lồi nấm này. Do vậy để chủ động việc phịng trừ nấm bệnh đạt hiệu quả cao phục vụ sản xuất tạo nguồn nguyên liệu làm thuốc, chúng tơi đề nghị đi sâu nghiên cứu nấm bệnh Phytophthora cinnamomi hại trên cây Sì to và khảo sát một số biện pháp phịng trừ. Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự đồng ý của bộ mơn bệnh cây- nơng dược, khoa nơng học, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Ngơ Bích Hảo - trường ðại Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........2 học Nơng Nghiệp Hà Nội và TS. Phan Thuý Hiền - Viện Dược Liệu, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu bệnh thối củ hại trên cây Sì to và khảo sát một số biện pháp phịng trừ". 1.2 Mục tiêu nghiên cứu của đề tài Nghiên cứu xác định nấm bệnh gây thối củ cây sì to, đặc điểm phát sinh, phát triển của bệnh và các biện pháp phịng trừ bệnh cĩ hiệu quả cao phục vụ cho nhu cầu sản xuất giống và dược liệu Sì to. 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài + Ý nghĩa khoa học: - Kết quả nghiên cứu của đề tài cung cấp dẫn liệu chi tiết về sinh học sinh thái nấm gây bệnh thối củ cây sì to, cĩ ý nghĩa về đa dạng sinh học của các vi sinh vật gây hại trên cây trồng. - Mơ tả triệu chứng bệnh thối củ hại trên cây sì to, nghiên cứu đặc điểm sinh học, sinh thái của nấm, quy luật diễn biến và các yếu tố ảnh hưởng đến phát sinh và gây hại của bệnh, làm cơ sở khoa học để xây dựng và đề xuất các biện pháp phịng trừ bệnh thối củ cây Sì to cĩ hiệu quả và làm tài liệu phục vụ cho đào tạo và cho các nghiên cứu ứng dụng khác. + Ý nghĩa thực tiễn: - Kết quả của đề tài giúp cho chẩn đốn chính xác triệu chứng, tác nhân gây bệnh thối củ, rễ cây Sì to tại Sa pa - Lào cai và Tam ðảo - Vĩnh phúc. Các cán bộ BVTV cĩ thể nhận biết bệnh trong điều tra và phịng trừ bệnh. - ðề xuất các biện pháp phịng trừ hiệu quả gĩp phần hạn chế bệnh, giảm lượng thuốc hố học sử dụng trên đồng ruộng, nâng cao năng suất, chất lượng Sì to, gĩp phần nâng cao thu nhập cho người dân. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........3 1.4 ðối tượng phạm vi nghiên cứu - ðối tượng nghiên cứu: Nấm gây bệnh thối củ cây Sì to tại Sa pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu nấm bệnh gây thối củ rễ cây Sì to, đặc điểm gây hại của bệnh thối củ rễ Sì to và một số biện pháp phịng trừ bệnh cĩ hiệu quả và an tồn với mơi trường tại Sa pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. - Thời gian nghiên cứu: năm 2009 - 2010 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........4 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 ðặc điểm nơng sinh học và tác dụng dược lý của cây sì to Sì to hay cịn được gọi là cây nữ lang nhện hoặc liên hương thảo cĩ tên khoa học là Valeriana jatamansi Jones., thuộc họ Nữ lang - Valerianaceae [2]. Cây dạng thân thảo sống nhiều năm, cao 30-50cm, cĩ lá khơng nhiều, mọc đối, nguyên, kéo dài, thuơn, các lá ở thân nhỏ, phiến hình tim, to 3 - 6 x 2,5 - 4 cm, mỏng, cĩ lơng, mép cĩ răng khơng đều; cuống 6 - 7cm, cĩ lơng. Trục đứng cao 20 - 40cm, mang 1-3 nhánh; hoa màu hồng, thành xim đơn phân; lá bắc hẹp dài. Quả bế dẹp, cao 3mm, một bên cĩ một sĩng, một bên cĩ 3 sĩng, ở đỉnh cĩ mào lơng dài do đài biến thành. Cây ra hoa từ tháng 10 cho đến tháng 2 năm sau. Ở nước ta, cây mọc khá phổ biến ở những chỗ ẩm ướt dựa vực, suối ở các khu vực miền núi như Sa Pa, Bắc Hà của tỉnh Lào Cai, ở Hà Giang, Nghệ An. Người H’Mơng đã đưa cây về trồng làm thuốc với tên Sì to. Về mùa xuân và hạ, thu hái cả cây dùng tươi, về mùa đơng đào thân rễ rửa sạch, phơi khơ trong râm để dùng. Bộ phận được dùng là tồn cây và thân rễ (củ) - Herba et Rhizoma Valerianae. Thân rễ to bằng ngĩn tay nhỏ, xám sẫm và mang một bĩ sợi màu nâu đo đỏ, mỏng, dựng đứng do cuống của lá ở gốc. Thân rễ chứa tinh dầu, một chất acid kết tinh, acid jatamansic. Chúng cĩ vị cay, đắng, ngọt, mùi thơm; cĩ tác dụng giảm đau, trừ thấp tán hàn, điều kinh hoạt huyết và cầm máu. Tinh dầu cĩ tác dụng kháng sinh và kháng động vật nguyên bào [4,9] Từ xưa, cây đã được xem như là một hương liệu thuộc loại quý. Người ta cũng sử dụng làm thuốc như dược thảo để trị: nhức đầu, đau dạ dày, đau các khớp xương, thuỷ thũng, kinh nguyệt khơng đều, địn ngã tổn thương, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........5 mụn nhọt với liều dùng uống trong từ 9 - 15g tồn cây, dạng thuốc sắc. Hoặc thân rễ 6 - 12g, dạng thuốc sắc hoặc thuốc ngâm rượu, hoặc nghiền nhỏ thành bột uống mỗi lần 0,6 - 1,5g. Dùng ngồi lấy thân rễ với lượng thích hợp đập nhỏ, đắp vào chỗ đau. Người H’Mơng ở Sa Pa - Lào Cai; Quản Bạ - Hà Giang và Kỳ Sơn – Nghệ An sử dụng làm thuốc an thần trong trường hợp trẻ em bị sốt cao, quấy khĩc, chống co thắt, chữa bệnh tim, bồi bổ sức khỏe và dùng cho phụ nữ sau khi sinh [2,3,4,5] Ở Ấn ðộ, người ta dùng để trị động kinh, hysteria và co giật, cũng dùng chữa chứng tim đập nhanh; cĩ khi dùng trị đau ruột. Do trữ lượng ít, phân bố hạn hẹp, nên trong nhiều năm nay lồi cây này được đưa vào Sách đỏ Việt Nam và Danh lục ðỏ cây thuốc Việt Nam để chú ý bảo vệ [1,7,8]. Bên cạnh đĩ, nhu cầu sử dụng Sì to ngày một tăng nhưng vào mùa mưa tháng 6 trở đi khi nhiệt độ và độ ẩm mơi trường cao Sì to bị thối củ chết hàng loạt do dịch bệnh phát sinh và gây hại, thậm chí cịn khơng cho thu hoạch. Kết quả giám định ban đầu tại Trung tâm nghiên cứu trồng và chế biến cây thuốc Hà Nội, Viện Dược liệu, cho thấy nấm Phytophthora cinnamomi Rands là nguyên nhân gây bệnh thối củ Sì to. Tuy nhiên hiện nay ở Việt Nam chưa cĩ kết quả nghiên cứu một cách cụ thể nào về lồi nấm này. 2.2 Nguồn gốc và sự phân bố nấm Phytophthora cinnamomi Tên: Phytophthora cinnamomi Rands Phân loại vị trí: –Lớp Oomycetes, Bộ Peronosporales, Họ Pythiaceae Phytophthora ( phát âm là Fy-TOFF-thora) là lồi nấm tồn tại trong đất và nước thuộc lớp, Oomycetes, ngành Oomycota. Các lồi thuộc ngành này cĩ dạng sợi và hấp thu dinh dưỡng tương tự như các lồi nấm thật, nhưng Oomycota khơng thuộc giới nấm thật và cĩ một vài điểm khác biệt. Oomycota là dạng nấm lưỡng bội và sản sinh ra bào tử nỗn trong khi nấm thật khơng sản sinh bào tử nỗn và là dạng đơn bội hoặc nhân kép. Oomycota cĩ thành cấu tạo từ β-glucan và cellulose trong khi nấm thật cĩ thành tế bào Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........6 chứa kitin. Cả hai nhĩm đều cĩ các lồi cĩ thể sản sinh ra bào tử động, nhưng chỉ cĩ Oomycota cĩ hai loại lơng roi (đuơi roi và tiên mao). Oomycota cĩ tiên mao dạng ống trong khi của nấm thật là dạng dẹt. Oomycota là nguyên nhân gây bệnh trên rễ, thân và dẫn đến chết cây ở một số lượng lớn các lồi thực vật bao gồm cả cây ăn quả, cây lấy hạt và cây cảnh. Cĩ ít nhất 300 lồi thuộc nhĩm Phytophthora trên tồn thế giới và khơng dưới 13 lồi được tìm thấy ở Nam Úc, bao gồm cả P.cinnamomi, P.cactorum, P.citricola, P.megasperma, P.crytogea và P.parasitica. P. cinnamomi là lồi phổ biến, gây hại nhiều và cĩ nhiều phân lồi. P. cinnamomi lần đầu tiên được mơ tả bởi Rands vào năm 1922 sau khi được phân lập từ cây quế Sumatra ở Indonesia. Mầm bệnh này hiện đã được tìm thấy trên khắp thế giới và được biết là lây nhiễm hơn 2.000 lồi thực vật trong đĩ cĩ nhiều lồi cĩ tầm quan trọng về kinh tế như Abies fraseri (linh sam Fraser), Eucalyptus spp., Persea americana (bơ), Pinus spp. (thơng), Quercus spp. (sồi), và các lồi trong họ Ericaceae (Rhododendron spp., Vv) (Zentmyer 1980)[33]. Do phạm vi phân phối rộng rãi, P. cinnamomi là nguyên nhân gây thiệt hại trong một loạt các lĩnh vực kinh tế liên quan đến rừng, cây lâm nghiệp. Nguồn gốc địa lý của P. cinnamomi khơng rõ ràng, Zentmyer (1988)[34] cho thấy rằng lồi này cĩ nguồn gốc bản địa ở ðơng Nam Á và miền nam châu Phi. Nĩ lây lan trên khắp Thái Bình Dương đến Châu Mỹ Latin trong thế kỷ 18. Tuy nhiên, khơng cĩ bằng chứng rõ ràng nào về sự lây lan xảy ra. Sự xuất hiện của các loại nấm trong nhiều khu vực trong thời gian gần đây khơng thực sự hữu ích trong việc đưa ra một sự phân bố địa lý cho các quốc gia Ngày nay, P. cinnamomi được phát hiện trên tồn thế giới và ảnh hưởng đến một số lượng lớn các lồi thực vật (Summerell và cs 2005)[31]. Sự xuất hiện của P. cinnamomi đã được ghi nhận ở nhiều nơi trên thế giới như: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........7 Châu Á: Trung Quốc (Giang Tơ), Ấn ðộ (Andhra Pradesh, Tamil Nadu, West Bengal), Indonesia (Java, Sumatra), Israel, Nhật Bản (Honshu, quần đảo Ryukyu), Malaysia (bán đảo, Sabah), Philippines, ðài Loan, Thổ Nhĩ Kỳ, Việt Nam. Châu Phi: Burundi, Cameroon, Congo, Cơte d'Ivoire, Gabon, Guinea, Kenya, Madagascar, Morocco, Réunion, Rwanda, Nam Phi, Uganda, Zaire, Zambia, Zimbabwe. Bắc Mỹ: Canada (British Columbia), Mexico, USA (Alabama, Arizona, Arkansas, California, Delaware, Florida, Georgia, Hawaii, Indiana, Kentucky, Louisiana, Maryland, Massachusetts, Mississippi, Missouri, New Jersey, New York, Bắc Carolina, Ohio, Oklahoma, Oregon, Pennsylvania, South Carolina, Tennessee, Texas, Virginia, Washington, West Virginia). Trung Mỹ và Caribbean: Barbados, Belize, Costa Rica, Cuba, Dominica, Cộng hồ Dominica, El Salvador, Guadeloupe, Guatemala, Haiti, Honduras, Jamaica, Martinique, Panama, Puerto Rico, St Lucia, St Vincent và Grenadines, Trinidad và Tobago. Nam Mỹ: Argentina, Bolivia, Brazil (Goias, São Paulo), Chile, Columbia, Ecuador, Guyana, Peru, Venezuela. Châu ðại Dương: Australia (New South Wales, Northern Territory, Queensland, Nam Úc, Tasmania, Victoria, Western Australia), đảo Cook, Fiji, Micronesia, New Zealand, Papua New Guinea. Nấm P. cinnamomi được đưa vào Úc trên đất quanh rễ loại cây trồng khi những người Châu Âu đến vùng đất này vào đầu những năm 1800. Tuy nhiên, phải đến những năm 1960 và 1970 mà P. cinnamomi lần đầu tiên được ghi lại trong nhiều tiểu bang của Úc. Tại Nam Australia, P. cinnamomi lần đầu tiên được xác định trên vùng Mount Lofty Ranges vào năm 1972 và trên đảo Kangaroo vào năm 1993, cĩ thể thơng qua chuyển giao thực vật hoặc đất bị nhiễm khuẩn vào các phương tiện đi lại, máy mĩc khác. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........8 Tại Úc, hàng trăm nghìn ha thảm thực vật bản địa ở Tây Úc, Victoria và Tasmania, và hàng chục ngàn ha tại Nam Úc, đang bị ảnh hưởng bởi các mầm bệnh. P. cinnamomi cũng được tìm thấy ở bờ biển phía đơng Queensland và New South Wales (NSW), mặc dù bệnh biểu hiện ở các vùng này thường khĩ hiểu hơn và mức độ đe dọa khơng rõ. Lượng mưa là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến sự phân bố của P. cinnamomi. Do đĩ, căn bệnh do mầm bệnh này thường bị giới hạn tại các khu vực để ẩm ướt hơn (Summerell và cs 2005) [31]. Nĩ xuất hiện trong rãnh, dọc theo các đường thốt nước và ở các khu vực của bề mặt. Các yếu tố khác ảnh hưởng mà biểu hiện bệnh là nhiệt độ, địa chất, điều kiện đất (bao gồm pH, dinh dưỡng, độ ẩm và kết cấu) và sự hiện diện của các lồi thực vật mẫn cảm (O'Gara và cs 2005b) [28]. ðánh dấu phân tử PCR là phương tiện xác định tính đa dạng về mặt cấu trúc di truyền của P. cinnamomi. Isozymes (Linde và cs 1997)[24], microsatellite (Dobrowolski và cs 2003) [15]. ða hình nucleotide đơn (SNP) (Lee và Taylor 1992), đa hình chiều dài đoạn khuếch đại (AFLP) (Duan và cs 2008)[ 17] và đa hình chiều dài các đoạn cắt giới hạn (RFLP) (Linde và cs 1997) [24]đã được sử dụng để tìm sự khác biệt trình tự nucleic acid. Isozyme phân tích xác định một số kiểu gen multilocus của P. cinnamomi được tìm thấy ở Papua New Guinea, nhưng chỉ cĩ ba kiểu gen multilocus đã được tìm thấy cho phân lập từ Australia (Old và cs 1988) [27], một cho loại A1 và hai cho A2. Kiểu gen được tìm thấy đã được phổ biến để phân lập từ khắp nơi trên thế giới, kết quả cho thấy chúng cĩ khả năng lây lan vơ tính (Dobrowolski và cs 2003) [15]. Mầm bệnh biến ở Nam Phi được cũng tương tự. Linde và cs (1997)[24] đã xem xét các phân tích isozyme cho 135 mẫu isolates P. cinnamomi phân lập được thu thập từ 1977-1986 và 1991-1993. Cĩ rất ít heterozygosity và biến thể di truyền trong sự phân bố (Linde và cs 1997). Giữa các nhĩm P. cinnamomi A1 và A2, cĩ khoảng cách di truyền cao, trong khi đĩ khoảng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........9 cách di truyền thấp giữa các isolates thu thập trong các giai đoạn 1977-1986 và 1991-1993, và giữa các nhĩm khác nhau về địa điểm thu thập, khu vực Cape và Mpumalanga(Linde và cs 1997) [24]. Những phát hiện này cho thấy P. cinnamomi là sinh vật lây lan ít biến đổi. Phân tích đa hình microsatellite các isolates của Úc cho thấy ba nhĩm kiểu gen (Dobrowolski và cs 2003). Hơn nữa, vị trí các mẫu cho thấy các nhĩm này được phân bố rộng về mặt địa lý (Dobrowolski và cs 2003)[15]. Linde và cộng sự (1997) [24] sử dụng RFLP phân tích khoảng cách các mẫu của Nam Phi và Úc cho thấy cĩ khoảng cách di truyền ngắn (Dm = 0,003) giữa hai khu vực địa lý. Loại kiểu gen lai được chia sẻ giữa hai nước. Một phân tích AFLP của các chủng miền Nam Carolina của P. cinnamomi từ 23 lồi cây chủ, bao gồm đỗ quyên, hoa trà, nhựa ruồi, và bách, cũng báo cáo khơng giơng nhau về gen giữa A1 và A2 được phân lập (Duan và cs 2008)[17]. Một kiểm tra của 200 loci thơng tin trong 49 mẫu phân lập A2 và 2 mẫu phân lập A1 đã cho giá trị cao hơn của tính đa hình trong mẫu phân lập A1, trong khi mẫu phân lập A2 đã giảm biến thể di truyền (Duan et al 2008). 2.3 Triệu chứng bệnh và sự gây hại của Phytophthora cinnamomi Cây bị nhiễm Phytophthora cinnamomi thường cĩ hiện tượng mục nát rễ hút. Tổn thương cĩ thể lan ra rễ lớn hơn và cĩ thể gây ra thối gốc. Khi bị thối rễ, lá cây cĩ thể héo, trở thành màu vàng nhạt, và chết (Zentmyer 1980; Erwin và Ribeiro 1996) [19, 33]. Thực vật bị nhiễm bệnh cĩ thể gãy đổ bất ngờ và chết, cĩ thể dần dần suy giảm, hoặc cĩ thể vẫn cịn triệu chứng vệt trong nhiều năm (Zentmyer 1980; Erwin và Ribeiro 1996). ðộ ẩm và nhiệt độ cĩ thể đĩng một vai trị trong khả năng chống chịu. ðiều kiện ẩm ướt, mát mẻ thì miễn nhiễm cĩ nhiều khả năng xảy ra (Erwin và Ribeiro 1996) [19]. Rễ và thân cây bị ảnh hưởng bởi P. cinnamomi xâm nhập mạch dẫn và sau đĩ phá hủy để trích xuất nước và chất dinh dưỡng. Khi cây bị nhiễm sau đĩ sẽ thiếu nước do khơng hút được nước và bị “nội hạn hán”. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........10 Các triệu chứng cĩ thể nhìn thấy bằng mắt thường đầu tiên của bệnh thường được hiển thị như vàng của lá (úa lá), tiếp theo chết khơ đen tồn bộ cây. Tùy thuộc vào điều kiện mơi trường, điều này cĩ thể xảy ra trong vài tuần cho cây bụi nhỏ hoặc thậm chí vài năm đối với cây bụi lớn hay cây gỗ. Một loạt các triệu chứng cĩ thể được hiển thị: Lá cĩ thể chuyển sang màu vàng do hĩa chất, hoặc, cơn trùng cĩ thể gấp, nhai, hoặc hình thức chết gân trên lá. Các triệu chứng gây ra bởi yếu tố mơi trường cĩ nhiều khĩ khăn để xác định kể bằng mắt thường. Tuy nhiên, cây cĩ thể phục hồi với cải thiện điều kiện mơi trường. Các triệu chứng khác nhau ở các lồi thực vật khác nhau. Xanthorrhoea là ví dụ, chết nhanh chĩng và cĩ thể sụp đổ. Acacia myrtifolia cĩ thể chết một cách nhanh chĩng, nhưng các triệu chứng cĩ thể bị nhầm bởi nguyên nhân khác như: điều kiện khơ hạn nĩi chung. Lá của Banksia spp. và Eucalyptus spp. cĩ dấu hiệu chậm hơn nhưng trên nhánh cĩ thể tạm thời tái sinh chồi. Các cây họ đậu, keo, tràm và một số cây họ mã kỳ bị biến thành màu vàng và chết trong thời kỳ ẩm ướt ấm áp trong suốt mùa xuân và mùa thu. Chúng cĩ thể phục hồi và sinh trưởng trong thời gian khơ vào mùa hè hoặc thời gian giữa mùa đơng lạnh. Chu kỳ sống tiếp tục và xảy ra chết đen thân vào mùa xuân và mùa thu. Chết đen thân, củ cũng cĩ thể được gây ra bởi các yếu tố khác ngồi P. cinnamomi. Nguyên nhân cĩ thể do hĩa chất, tuổi cây, hỏa hoạn, thiệt hại cơ học, cơn trùng, mơi trường bao gồm các yếu tố bao gồm hạn hán, úng, muối, sương giá và mưa đá. P. cinnamomi cũng ảnh hưởng đến cây ăn quả, các loại cây lấy hạt và cây rau. Cây cảnh cũng bị gây hại như hoa lily, hoa trà, dâm bụt và đỗ quyên... Cĩ cả cây lớn hơn bao gồm một số lồi cây thơng như Pinus radiata. Theo luật bảo tồn và bảo vệ mơi trường 1999, Chính phủ liên bang Úc đã coi P. cinnamomi là một lồi gây hại chính ở Úc. ðiều này cĩ nghĩa P. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........11 cinnamomi được coi là mối đe dọa lớn tới nguồn tài nguyên động thực vật của các quốc gia, đặc biệt là đối với nguồn tài nguyên động thực vật ở Úc. ðây là một mối đe dọa nguồn tài nguyên quốc gia. Dịch bệnh nghiêm trọng của P. cinnamomi đã gây ra thiệt hại rộng lớn đến khu rừng bạch đàn ở Úc (Weste & Taylor, 1971)[35]. Phytophthora cịn đe dọa thơng Wollemi mới được phát hiện vào năm 1994 bởi một nhân viên NPWS. Thơng Wollemi (Wollemi nobilis) là một trong những lồi thực vật hiếm nhất trên thế giới và đang đứng trước nguy cơ tuyệt chủng. Nhiễm nấm P. cinnamomi và lửa là mối đe dọa lớn nhất đối với sự sống cịn của lồi cây này trong tự nhiên. Năm 2005, P. cinnamomi được tìm thấy là nguyên nhân của hiện tượng chết đen lá ở cây thơng Wollemi. Các bệnh trên bơ gần đây đã được nghiên cứu bởi Coffey (1992)[14]. P. cinnamomi đã được nhận thấy gây hại trên bơ do nấm từ đất và khơng cĩ ký chủ chính, cĩ thể tự do di chuyển từ một trong những cây trồng khác. P. cinnamomi cũng đã gây hại trên bơ trong một số các nước ðịa Trung Hải. Ở các vùng ơn đới, P. cinnamomi gây thiệt hại nghiêm trọng đến các cây trồng cĩ giá trị cao, cây cảnh và cây bụi. 2.4 Tác động đến đa dạng sinh học Các mức độ của tác động đến đa dạng sinh học là điều kiện do tương tác giữa các mầm bệnh và mơi trường (dưới điều kiện thuận lợi của địa phương và thời gian), cùng với sự nhạy cảm của các lồi cây mục tiêu, vai trị chức năng của nĩ trong hệ sinh thái. Trên khắp nước Úc, số lượng các lồi thực vật của Úc dễ bị Phytophthora cinnamomi gây hại là khơng rõ nhưng cĩ khả năng là hàng ngàn. Ở phía Tây Nam Australia, Shearer và cs (2003) [30] đã ước tính, trên cơ sở tỷ lệ các lồi mà tính nhạy cảm được biết, cĩ khoảng 2.300 lồi dễ bị lây nhiễm và 800 trong số này cĩ thể sẽ là rất dễ mắc. Một số họ thực vật cĩ nguồn gốc ở Úc thì mẫn cảm hơn các họ khác. Các họ dễ bị ảnh hưởng bao Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........12 gồm quắn hoa (Proteaceae), mã kỳ (Epacridaceae), họ ðậu và họ Sổ (Dilleniaceae) (Weste 1994). Chỉ cĩ một vài chi của họ Sim (Myrtaceae), bao gồm bạch đàn là rất dễ mắc bệnh (McDougall & Summerell 2002) [26]. Cỏ, cĩi và cỏ gà thường cĩ nhiều khả năng chống chịu P. cinnamomi hơn cây lâu năm thân gỗ (DSE 2005). Do đĩ, các khu vực bị nhiễm khuẩn đơi khi được đặc trưng bởi sự ít đa dạng hơn các lồi lâu năm thân gỗ và phong phú về các lồi cây bụi và bao gồm cả sự gia tăng đa dạng của cây họ hịa thảo (Weste 1981, 1986; Laidlaw & Wilson 2003; McDougall & Summerell 2002, 2003) [21,26]. Các nghiên cứu đã chứng minh tác động đáng kể đến sự đa dạng lồi, cĩ nơi cĩ 60% lồi dưới tán trước đã bị loại bỏ. Các khu vực bệnh đang dần dần bị xâm chiếm bởi các lồi chống chịu, sau đĩ thay đổi cấu trúc thảm thực vật, thành phần lồi và năng suất của hệ sinh thái, với các hiệu ứng do hậu quả phụ thuộc vào hệ thực vật và động vật (Wilson và cs 2003). Tại Úc, các triệu chứng bệnh tàn phá hầu hết đã được quan sát trong rừng khơ mở, rừng cây thơng thường . Sự biến đổi tính nhạy cảm cũng đã được quan sát trong phạm vi chi. Trong chi Bạch đàn, lợi, hộp là tương đối kháng với nhiễm trùng, trong khi thơng và bạc hà thường nhạy cảm hơn (Phytophthora Technical Group 2003). Ngồi ra, các biến thể trong tính nhạy cảm đã được quan sát thấy các nhĩm phân bố k._.hác nhau của cùng một đơn vị phân loại, cũng như trong quần thể (Harris et al 1983). Tại Victoria, các báo cáo nghiên cứu giám sát tái sinh của nhiều lồi thực vật trong các lồi dễ bị nhiễm khuẩn trong 30 năm trở lại đây. Dịch bệnh vẫn tái định kỳ tại các khu vực này trong điều kiện thuận lợi (Weste năm 1997; Weste et al 1999). động vật bản địa cĩ thể là gián tiếp bị ảnh hưởng bởi P. cinnamomi qua việc mất chỗ ở (ví dụ bao gồm thực vật) và các nguồn cung cấp thực phẩm (ví dụ như mật hoa, phấn hoa, hạt, và con mồi, đặc biệt là vật khơng xương sống). Tại bang New South Wales - Úc (NSW), mức độ ảnh hưởng của P. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........13 cinnamomi nĩi chung là khơng rõ. P. cinnamomi khơng gây ra sự mất mát đáng kể đối với các lồi thực vật phổ biến như đã được quan sát thấy ở các bang miền nam nước Úc. Tuy nhiên, mầm bệnh cĩ tác động đáng kể đến thực vật bản địa ở một số khu vực phía đơng NSW, và những tác động này chủ yếu đối với các lồi dưới tán (McDougall & Summerell 2005) [26]. Các lồi thực vật dễ bị đe dọa được liệt kê trong luật TSC bao gồm các nguy cơ tuyệt chủng Bạch đàn imlayensis (Imlay Mallee), Wollemia nobilis (thơng Wollemi), Leionema ralstonii (leionema của Ralston) và Tasmannia purpurascens (pepperbush lá rộng). Hoa Telopea speciosissima (waratah) cũng rất dễ bị các mầm bệnh trong trồng trọt (McDougall & Summerell 2005) [26]. 78 lồi hiếm hơn nữa hoặc bị đe dọa được cho là cĩ nguy cơ từ các mầm bệnh như là kết quả của sự gần gũi của họ gây hại đã biết hoặc sự xuất hiện của họ mới trong mơi trường sống (McDougall & Summerell 2005) [26]. Thay đổi trong cấu trúc thảm thực vật gây ra do P. cinnamomi đã được quan sát thấy ở NSW. Ví dụ, các khu vực bị nhiễm khuẩn của rừng bạch đàn ở Mount sieberi Imlay Vườn quốc gia đang thay đổi từ một khu rừng với các lồi cây bụi phong phú và Xanthorrhoea dưới tán một với ưu thế bởi các loại thảo mộc Lomandra confertifolia và Tetrarrhena juncea (McDougall & Summerell 2005). Tương tự như vậy, đã cĩ một sự thay đổi rõ ràng trong cơ cấu thực vật phụ núi cao tại Vườn quốc gia Barrington Tops, nơi mà trước đây dưới tán một bụi cây rậm rạp chủ yếu đã được thay thế với một chi phối bởi các giống cỏ Poa (McDougall & Summerell 2003). Việc mất liên tục của các lồi dưới tán trong các khu rừng bạch đàn trên bờ biển phía Nam Úc sẽ ảnh hưởng nguy cấp đến hai lồi động vật cĩ vú là chuột khĩi (Chuột giả vịnh fumê - Pseudomys fumeus) và Chuột nâu lớn miền Nam (Isoodon obesulus) (McDougall & Summerell 2005). Các giớng cây nhỏ đứng dưới tán của các khu rừng cung cấp cho các lồi và mơi trường sống (Xanthorrhoea australis, cây cỏ) cho Chuột nâu lớn miền Nam. Các loại trái cây nhiều thịt và hạt của thực vật trong các Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........14 khu rừng là những thành phần quan trọng của chế độ ăn uống của chuột khĩi (McDougall & Summerell 2005) [26]. 2.5 Phạm vi ký chủ của nấm Phytophthora cinnamomi Phạm vi ký chủ P. cinnamomi là rất rộng; với gần 1.000 lồi ký chủ (Zentmyer, 1983). Các lồi hại chủ yếu là cây bơ (Persea americana), và dứa (Ananas comosus. P. cinnamomi cũng gây hại nặng trên cây dẻ (Castanea dentata), quế (Cinnanomum spp.), đỗ quyên (Rhododendron spp.), bạch đàn (Eucalyptus spp.), hạnh nhân, xơ ri, đào, mận (Prunus spp.), sồi (Quercus spp.) và nhiều cây cảnh và cây bụi. Ký chủ của nĩ bao gồm hầu hết các loại cây ăn quả ơn đới, nhưng đây khơng phải là cây chủ quan trọng trong thực tế. Tại khu vực EPPO, lê là một cây chủ quan trọng.. Nghiên cứu về sự gây hại của P. cinnamomi đã cho thấy sự biến đổi giữa các chủng trên cây chủ khác nhau. Zentmyer và cs (1980) [33] thấy rằng một mẫu phân lập A2 của P. cinnamomi từ bơ (Persea americana) cĩ khả năng gây bệnh trên bơ nhưng khơng gây hại trên hoa trà (Camellia spp). Trong khi một mẫu phân lập A1 từ trà đã gây bệnh trên cả bơ và trà. Tuy nhiên, trong nghiên cứu của mình Zentmyer chỉ kiểm tra hai isolates. Weste (1975) cũng tìm thấy một sự khác biệt trong mức độ gây hại của chủng A2 và A1 ở P. cinnamomi. Isolates của hai loại đã gây bệnh trên Nothofagus cunninghamii, nhưng các cây cấy với chủng A2, thu thập từ Isopogon ceratophyllus, cĩ tỷ lệ chết 60% trong khi những cây cấy với chủng A1, thu thập từ Tristania conferta, cĩ tỷ lệ chết 100% ( Weste 1975). Thêm các nghiên cứu gần đây của Dudzinski và cs (1993) [18], Robin và Desprez-Loustau (1998) [29] và Huberli và cs (2001) [21] tìm thấy sự thay đổi trong lần gây hại khơng bị bĩ buộc ký chủ đặc trưng. Dudzinski và cs (1993) sử dụng nhiều tiêu chí để đo mức độ gây hại: khởi phát các triệu chứng bệnh, số ngày đến khi cây bị chết, tăng trưởng khối lượng khơ và khối lượng gốc. Robin và Desprez-Loustau (1998) đo chiều dài tổn thương về hạt dẻ, Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........15 bạch đàn, gỗ sồi và cây thơng để đánh giá những gây hại của 48 phân lập được thu thập chủ yếu trong phạm vi nước Pháp từ 16 lồi (bao gồm cả hạt dẻ, bạch đàn, sồi, thơng). Huberli et al (2001) đã kiểm tra 73 mẫu của Úc phân lập từ 2 ký chủ là trên cây Eucalyptus marginata và Corymbia calophylla. Chiều dài tổn thương và sự sống cây trồng đã được sử dụng để xác định mức độ hại. Trong nghiên cứu khác, Podger (1989) cũng khơng tìm thấy mối quan hệ giữa isotype gây hại và phân lập, khí hậu xuất xứ, hoặc phân loại học của cây chủ. 2.6 ðặc điểm sinh học, sinh thái nấm Phytophthora cinnamomi. Phytophthora cinnamomi tuy phân bố rộng khắp thế giới nhưng nhìn chung đặc điểm sinh học của chúng tương tự nhau. Chu kỳ tồn bộ cuộc sống của P. cinnamomi xảy ra trong các mơ đất và cây trồng; các nguồn thức ăn của nấm là gốc rễ và thân cây mơ thực vật sống. Tăng trưởng và sinh sản được ưa chuộng bởi điều kiện đất ẩm và nhiệt độ ấm (DSE 2005). Trong trạng thái sinh trưởng sinh dưỡng, P. cinnamomi phát triển thành dạng khơng màu gọi là sợi nấm (O'Gara et al 2005b). Ba loại bào tử sinh sản vơ tính được sản xuất bởi các sợi nấm bao gồm túi bào tử, bào tử động và hậu bào tử. Mặc dù tất cả các bào tử cĩ khả năng trực tiếp lây nhiễm lên thực vật, các bào tử động được cho là các phơi vơ tính chính của sự lây nhiễm (O'Gara et al 2005b)[28]. Bọc bào tử cĩ hình trứng mọc dài ra (Erwin và Ribeiro 1996). Bọc bào tử kích thước và hình dạng cĩ thể khác nhau (Erwin và Ribeiro 1996) [19]. Bọc bào tử khơng được hình thành trong đất giàu mùn nhưng được sản xuất trong đất bạc màu hoặc trong các dung dịch khống yếu (Zentmyer 1980; Erwin và Ribeiro 1996). Bào tử động cĩ thể sẽ được tung ra từ bọc bào tử ở nhiệt độ tối ưu, pH và mơi trường thích hợp. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........16 Hậu bào tử là những cấu trúc sinh sản vơ tính sống được sản xuất khi nguồn thức ăn cạn kiệt (rễ của cây bị nhiễm bệnh chết), hoặc trong khoảng thời gian của nhiệt độ thấp hoặc hạn hán. Hậu bào tử của mầm bệnh thường mọc cụm gồm 3-10 bào tử. Chúng là những hình cầu, vách mỏng, kích thước đường kính khoảng 31-50 µm (Erwin và Ribeiro 1996) [19]. Hậu bào tử lẫn trong đất, sỏi hoặc mơ cây trong thời kỳ khơ, nảy mầm khi độ ẩm thuận lợi và phát triển để tạo thành sợi nấm và túi bào tử hoặc hậu bào tử nhiều hơn nữa. ðiều này cĩ thể tiếp tục chu kỳ ít nhất 5 năm, với điều kiện cĩ một nguồn chất dinh dưỡng (chất hữu cơ) và một hệ vi đất khơng cạnh tranh. P. cinnamomi là dạng dị tản, địi hỏi các cá thể cĩ dạng giới tính A1 và A2 giao phối để hình thành bào tử trứng (Galindo-A. và Zentmyer 1964). Trong số 2 dạng giới tính, A2 xảy ra thường xuyên hơn (Zentmyer 1980). Bào tử trứng trịn, gần như trong suốt đến vàng nâu, cĩ đường kính từ 19 – 54 µm (Erwin và Ribeiro 1996). Khi đến thời điểm, nấm phát triển với số lượng lớn túi bào tử động và cĩ thể di động dể dàng vào đất xung quanh (DEH 2004). Các bào tử động được thu hút về mặt hĩa học do rễ cây tiết ra, chúng bơi khoảng cách rất ngắn. Chúng cĩ thể được phân tán qua một khoảng cách tương đối lớn qua bề mặt nước và dịng chảy dưới bề mặt. Sự lây lan lên đến 400 mét/năm dựa theo lượng nước mưa hàng năm. Bào tử động cũng dễ dàng vận chuyển trong đất bị ơ nhiễm và trên các cơng cụ, giày dép và các loại xe (Summerell và cs 2005) [31]. Cả hậu bào tử và du động bào tử cĩ thể sống một thời gian dài trong đất và tàn dư thực vật, và chúng sẽ nảy mầm và bước vào chu kỳ sống mới khi điều kiện thuận lợi. Chúng hoạt động như nguồn gây bệnh cho cây con và cĩ thể lây lan khoảng cách xa thơng qua sự chuyển động của đất bị nhiễm mầm bệnh và các nguyên liệu thực vật chết. Sự thâm nhập xảy ra trong vịng 24h sau nảy mầm (Zentmyer, 1961). Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........17 Nấm này sau đĩ lây lan trên rễ hút gây thối cĩ thể kéo dài tới thân cây. Phơi vơ tính cịn cĩ thể bị văng lên và lây nhiễm sang các bộ phận trên khơng của cây. Nhiệt độ, độ ẩm và độ pH ảnh hưởng đến sự tăng trưởng và sinh sản của nấm. Ảnh hưởng của các yếu tố này đã được xem xét bởi Weste (1983). P. cinnamomi sinh trưởng phát triển tốt nhất ở 24-28 ° C. Phạm vi nhiệt độ tối đa cho sự tăng trưởng là 32-34 ° C và tối thiểu là 5-6 ° C (Erwin và Ribeiro 1996) [19]. Mặc dù các báo cáo ban đầu về P. cinnamomi chủ yếu là trong các nước nhiệt đới và cận nhiệt đới, lồi nấm này cĩ thể tồn tại và phát triển ở các nước lạnh hơn, và cĩ vẻ khơng bị hạn chế rõ rệt bởi chế độ canh tác hoặc nhiệt độ mùa đơng. 2.6.1 Vịng đời Phytophthora cinnamomi khơng thể nhìn thấy bằng mắt thường. Dưới kính hiển vi nĩ cĩ hình dạng như một sợi tĩc trắng. Các bọc bào tử được hình thành trong điều kiện ẩm và hiếu khí ở nhiệt độ 22-280C. Trong mỗi bọc bào tử cĩ mang 30-40 bào tử động được hình thành và phát tán. Bào tử động cĩ thể cử động dễ dàng bằng hai lơng roi, cho phép P. cinnamomi lây nhiễm sang đầu rễ khỏe mạnh mới. Bào tử động cĩ thể tồn tại đến bốn ngày. Khi điều kiện cho sự sinh trưởng trở nên kém thuận lợi (thường khi đất khơ), sợi nấm cĩ thể tạo thành các hậu bào tử (chlamydospore). Bào tử này cĩ một thành tế bào dày và cĩ thể tồn tại trong đất hay lưu trữ mơ trong nhiều năm, chờ cho đến khi điều kiện phát triển thuận lợi hơn. Các sợi nấm cũng cĩ thể tồn tại trên tàn dư thực vật, hoặc trong đất. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........18 2.6.2 Nhân tố mơi trường và sự phát triển Mơi trường ảnh hưởng mạnh nhất đến sự phát triển bệnh khi cĩ sự hiện diện đồng thời của bào tử nấm và vật chủ. Tàn dư thực vật Cây bị bệnh Sợi nấm từ rễ cây bị bệnh Tấn cơng vào cây Gây hại Bào tử nấm cĩ khả năng di động Hình thành bào Hậu bào tử Nấm Phytophthora cinnamomi Vật chủ Phytophthora cinnamomi Mơi trường Thời gian Biểu hiện bệnh Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........19 Một loạt các yếu tố xác định mức độ nghiêm trọng của bệnh và tỷ lệ lan rộng của bệnh bao gồm nhiệt độ, lượng mưa, loại đất và đặc điểm, mật độ của mầm bệnh trong đất. P. cinnamomi thường thấy ở các nơi: • Lượng mưa trung bình hàng năm lớn hơn 500 mm; • Các loại đất: - acid để trung hịa với một lượng thấp của các chất dinh dưỡng và chất hữu cơ; - Cĩ vài vi sinh vật; - ðã thốt nghèo. ðốt nương hoặc cháy rừng cĩ thể phá hủy P. cinnamomi tới độ sâu 15 cm dưới mặt đất. Tuy nhiên, đám cháy cũng làm giảm chất hữu cơ trên bề mặt đất và số lượng vi khuẩn, là điều kiện thuận lợi hơn cho sự phát triển của P. cinnamomi. Cịn lại, hoặc tái sinh trên cây chủ hoặc sau đĩ cĩ thể chết. 2.6.3 Lây lan của Phytophthora cinnamomi. Nguyên nhân quan trọng nhất trong sự lây lan của P. cinnamomi là thơng qua việc vận chuyển sỏi, đất và nguyên liệu thực vật, mà các xe cộ và máy mĩc nặng. máy mĩc thiết bị như vậy thường được sử dụng trong khai thác gỗ, chữa cháy, đường xây dựng và bảo trì các tuyến đường. Một chiếc xe khơng được làm sạch sau khi làm việc trong một khu vực bị nhiễm nấm cĩ thể dễ dàng lây bệnh sang nhiều khu vực khác cách xa nhiều km. Trên một quy mơ địa phương, mầm bệnh cĩ thể được di chuyển tự nhiên bằng cách dính vào đất, nhờ giĩ thổi bay, hoặc qua di chuyển của nước tưới từ nguồn nước ra mương thủy lợi. Mầm bệnh cũng cĩ thể được lây lan qua máy mĩc được sử dụng để trồng trọt hay thu hoạch. Việc sỏi đường bị nhiễm nấm đã dẫn đến khởi đầu của dịch bệnh mới ở Australia (Weste, 2002) [35]. ðất bị ơ nhiễm với cây cảnh trồng trong chậu cĩ thể lây lan mầm bệnh đến các khu vực sạch bệnh, và đây là con đường cĩ thể xảy ra nhất đối với lây Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........20 lan quốc tế. P. cinnamomi cũng cĩ thể lây lan trong các cách sau: • Thơng qua vận chuyển đất cĩ thể lây lan P. cinnamomi trên một nguyên liệu thực vật khoảng cách dài bằng xe đạp, giày dép, cơng cụ và thiết bị cắm trại. • Trong nước (như thốt ra, thủy lợi, chuyển đất nước). P. cinnamomi sẽ lây lan nhanh chĩng xuống dốc trong bề mặt và dịng chảy nước dưới bề mặt. Nếu tìm thấy dọc theo nguồn nước, sau đĩ mặt nước rất cĩ thể sẽ mang P. cinnamomi vào lưu vực này. • Bằng chuyển sỏi, nước, đất hoặc bất kỳ nguyên vật liệu khác cĩ mầm bệnh. • Từ cây trồng liên hệ thơng qua với gốc dưới bề mặt. Sự lan truyền lên dốc và trên mặt đất bằng phẳng là chậm (khoảng 1 mét/năm) như nĩ cĩ giới hạn liên hệ từ cây trồng cho cây trồng. • Bằng cách chuyển các cây bị nhiễm khuẩn cho các vùng khác. • ðộng vật, đặc biệt là những người cĩ mĩng guốc sự chẻ đơi. 2.7 Chiến lược quản lý Phytophthora cinnamomi 2.7.1 Sử dụng cây chỉ thị để phát hiện bệnh do nấm P.cinnamomi sớm. P. cinnamomi thơng thường tìm thấy trong các khu rừng cây tại tầng đặc trưng của cây bụi khơ và bụi cây cĩ hoa. Lồi chỉ thị tốt nhất là cỏ rất nhạy cảm (Xanthorrhoea spp.), chúng cho các triệu chứng đầu tiên của bệnh nấm P. cinnamomi. Các lồi khác bao gồm cả Họ Phi lao, họ mã kỳ, đậu răng ngựa, họ trinh nữ, họ tường vi, họ cơm vàng... Cĩ thể sử dụng một số dạng cây chỉ thị để phân biệt bệnh do nấm PP. cinnamomi gây nên sớm. Dấu hiệu về sự cĩ mặt của P. cinnamomi trên các cây chỉ thị này cĩ thể là biểu hiện của: • Chết một phần hoặc chết tồn cây đối với các lồi cây chỉ thị nhạy cảm • Cây chết với tán lá đổi màu (vàng, nâu hoặc đỏ) • Cây chết với sự thể hiện bệnh theo thời gian Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........21 • Sự hiện diện sắc nét của bệnh hoặc ranh giới giữa vùng thực khỏe với thực vật bị nhiễm bệnh. Một cây bị bệnh khơng thể dễ dàng phân biệt với cây đã chết, như gốc cây của Xanthorrhoea spp. Trong một thời gian dài nĩ cũng cĩ thể được ghi nhận khi các thảm thực vật dưới tán, trừ các loại cỏ bản địa và vật một lá mầm khác, bị tiêu diệt. Cỏ ngoại lai và dạng cĩi thường kháng với P. cinnamomi. 2.7.2 Ngăn chặn sự lây lan của nấm Phytophthora cinnamomi Một nghiên cứu của MacDonald và cs 1994 tìm thấy P. cinnamomi trong các hệ thống thủy lợi, ao thải thu được từ vườn ươm tại California. Các nghiên cứu khác cũng tìm thấy Phytophthora spp. trong nước thủy lợi được sử dụng cho các vườn ươm loại cây cảnh (Bush và cs 2003; Themann và cs 2002). Vì vậy, điều quan trọng cho vườn ươm để cĩ được giống sạch bệnh là thực hiện các quy tắc vệ sinh vườn ươm như lọc nước thủy lợi. Trong một nghiên cứu gần đây, Ufer và cs (2008) đã chứng minh hiệu quả của lọc cát chậm và lọc hạt dung nham cho việc loại bỏ các Phytophthora spp. từ nước tưới. Cả hai hệ thống lọc loại bỏ Phytophthora từ các nguồn nước thủy lợi. Nước lọc phải được lưu trữ trong hồ chứa cách ly đất để ngăn chặn sự quay trở lại nước của nấm bệnh. Sử dụng hĩa chất cũng được ưu tiên trong các vườn ươm cây cảnh để kiểm sốt Phytophthora. Hai thuốc diệt nấm, mefenoxam và AI fosetyl hoặc phosphonate kali, được khuyến nghị cho việc kiểm sốt hĩa học của P. cinnamomi (Hướng dẫn sử dụng hĩa chất nơng nghiệp Bắc Carolina, 2008). Nghiên cứu này là cĩ liên quan với việc sử dụng mefenoxam như một biện pháp kiểm sốt. Mefenoxam kháng một số Phytophthora spp. trong cây cảnh ở Bắc Carolina. Tuy nhiên, sức đề kháng mefenoxam đã khơng được báo cáo với trường hợp của P. cinnamomi. Duan và cs (2008) [27] kiểm tra tính kháng mefenoxam 51 chủng của P. cinnamomi và thấy tất cả đều nhạy cảm. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........22 Hiện nay, phương pháp kiểm sốt phù hợp nhất là tiêu diệt nấm và bảo vệ đất. Tiêu diệt nấm trong đất, phương tiện vận chuyển cĩ thể thực hiện được với phương pháp xơng khĩi như methyl bromide hoặc với hơi nước khơng khí tại 160 0F trong 1giờ (Haj Hoitink). Phương pháp bảo vệ đấtcủa Hoitink và Schmitthenner được vạch ra chi tiết. Tĩm lại, những phương pháp này bao gồm sử dụng cây con khỏe mạnh, loại bỏ rễ mầm bệnh trong mơi trường tự do, và sử dụng giá thể trồng với mơi trường đất thốt nước tốt. Giá thể trồng cây cung cấp khoảng 20% khơng gian khơng khí và thốt nước tốt bao gồm một sự kết hợp của than bùn giống rong thủy Canada hay ðức, đá trân châu xốp hoặc, và cát thơ. Biện pháp kiểm sốt bao gồm giảm độ ẩm đất và cải thiện bằng cách tăng thơng khí, thốt nước, và chú ý đến dinh dưỡng khống. Phơi ải đất cũng hạn chế được P. cinnamomi trên các cây bơ trẻ. Xem xét sự kết hợp của các biện pháp kiểm sốt bệnh ở vườn ươm. Phương pháp phịng trừ tổng hợp thường được dùng để kiểm sốt P. cinnamomi trên bơ (Coffey, 1984) [14]. Hĩa chất cĩ thể kiểm sốt với các thuốc diệt nấm cĩ hệ thống, nhất là fosetyl nhơm (và phosphonic acid) và metalaxyl áp dụng ngâm nươc đất, phun trên lá hoặc tiêm thân cây. Bổ sung nguyên tố lưu huỳnh tỷ lệ mắc bệnh giảm trong dứa, rõ ràng thơng qua các hiệu ứng về độ pH của đất. Khơng cĩ cách chữa cho bệnh thối gốc do nấm P. cinnamomi, và cũng rất khĩ để ngăn chặn lây lan khi nĩ đã bị nhiễm một khu vực. Tuy nhiên, cĩ thể làm chậm sự lây lan của nĩ và giảm thiểu sự thâm nhập vào các khu vực mới bằng một số cách. Trong đĩ cách tốt nhất để kiểm sốt lây lan của nĩ là ngăn chặn sự phát tán của đất hoặc tàn dư thực vật bị nhiễm khuẩn. a. Khu nguy cơ nhiễm Ba khu nguy cơ cần được xác định trong quản lý sự xuất hiện và gây hại của P. cinnamomi • Khu nguy cơ cao: một khu vực được xác nhận bởi phịng thí nghiệm hoặc bị Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........23 nghi ngờ (sau kiểm tra trực quan) là cĩ P. cinnamomi • Khu trung bình: khu vực P. cinnamomi khơng nghi ngờ hoặc đã xác nhận, nhưng là nơi tiềm năng để trở thành là cao (loại đất, khí hậu cĩ tiềm năng cao cho sự phát triển và sự sống cịn, và các lồi cây trồng dễ nhiễm cĩ mặt) • Khu nguy cơ thấp: khu vực P. cinnamomi xác nhận khơng cĩ, và tiềm năng bị nhiễm là thấp (loại đất, khí hậu, khơng cĩ lồi thực vật ký chủ cho P. cinnamomi là điều quan trọng nhất). b. Nguyên tắc vệ sinh khu vực Thực hiện các quy tắc sau đây sẽ giúp giảm thiểu sự lây lan của P. cinnamomi : 1/. Với các khu nguy cơ trong vùng: Nếu khơng chắc chắn liệu P. cinnamomi cĩ mặt tại một khu vực hay khơng, thì cần cĩ biện pháp phịng ngừa để giảm thiểu bất kỳ nguy cơ cĩ thể lây lan của bệnh. 2/. Sau khi hoạt động trong khu cĩ nguy cơ lây nhiễm cao cần đảm bảo rằng các phương tiện, máy mĩc thiết bị như lốp xe đạp và giày dép phải làm sạch trước khi rời khỏi. 3/. ðảm bảo làm sạch sau khi từ khu vực cĩ nguy cơ lây nhiễm trung bình và thấp trước khi chuyển vào khu cĩ nguy cơ lây nhiễm cao. Khơng bao giờ di chuyển từ một khu vực cĩ nguy cơ cao vào một khu vực trung bình hoặc khu cĩ nguy cơ lây nhiễm thấp, trừ khi xe cộ, máy mĩc, thiết bị được làm sạch. 4/. Tránh xung quanh vùng đất vẫn đang trong quá trình lây nhiễm và theo dõi bất cứ nơi nào cĩ thể. 5/. Tránh các vùng dễ bị ngập. P. cinnamomi rất cĩ thể được lưu giữ trong khu vực ẩm ướt quanh năm. 6/. Nguồn tàn dư từ thực vật chỉ nằm trong một khu cĩ nguy cơ lây nhiễm thấp hoặc vừa phải. Khơng được mang tàn dư thực vật trong khu nguy cơ lây nhiễm cao ra Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........24 ngồi kể cả vật chất khác bao gồm gạch vụn, sỏi, cát và đất. ðảm bảo thực hiện các thủ tục thể hiện vệ sinh thích hợp. 7/. ðảm bảo tất cả nguồn nước được sử dụng là khơng cĩ P. cinnamomi. Khử trùng nước lấy từ các đập nước và dịng suối với clo (6 ml clo hịa với 10l nước). Nước từ nguồn cung cấp như nhà máy, giếng khoan sâu hoặc nước mưa thường khơng cần khử trùng và được lưu trữ trong thùng chứa tránh tiếp xúc với đất và chất hữu cơ. 8. Khơng dùng lại nước, đất hoặc tàn thực vật từ khu vực cĩ nguy cơ lây nhiễm cao. Hạn chế di chuyển trong vùng đất này. 9. Hạn chế sử dụng hĩa chất bảo vệ thực vật. Cĩ thể sử dụng hĩa chất bảo vệ thực vật kiểm sốt cây trồng và cỏ dại mà khơng gây tác hại đối với đất. 11. Tuân thủ tất cả các dấu hiệu cảnh báo. Nếu cĩ nghi ngờ P. cinnamomi gây hại từ một kiểm tra trực quan, quan sát thực địa cĩ thể được xác nhận bằng cách thu thập và thử nghiệm các mơ đất và cây trồng trong phịng thí nghiệm. Tuy nhiên điều này khơng luơn luơn xác nhận sự hiện diện của P. cinnamomi. Các mẫu đất chứa nấm cĩ thể dễ dàng thể bỏ qua tại nơi lấy mẫu bởi vì phân bố của nấm trên tồn đất thường khơng thống nhất. Do đĩ khơng cĩ kết quả xét nghiệm"âm tính" mà chỉ đơn giản là 'khơng xác nhận'! Trong khi P. cinnamomi cĩ thể được giám định quanh năm, thời gian tốt nhất để thu thập mẫu là trong những tháng ấm áp trong suốt mùa xuân và đầu mùa hè khi đất vẫn cịn ẩm. ðiều kiện đất ẩm trong thời gian này là cơ hội lớn nhất để phát hiện P. cinnamomi trong phịng thí nghiệm. Khuyến khích sử dụng phương pháp sau đây để thu thập các mẫu đất được. Chỉ thu thập mẫu nếu đất bị ẩm và đảm bảo rằng tất cả các dụng cụ lấy mẫu đất đều sạch bệnh. Khử trùng các dụng cụ bằng cồn (đã pha lỗng) hoặc bằng thuốc tẩy gia dụng (pha lỗng 1 phần trong 4 phần nước) sau đĩ rửa sạch với nước cất và lau khơ bằng khăn giấy sạch. Sau đĩ: Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........25 1. Thu thập đất và mẫu thực vật cho thấy các triệu chứng sớm của bệnh (ví dụ đổi màu lá) 2. Hủy bỏ rác. 3. Thu thập mẫu đất từ mọi phía của cây 5-20 cm dưới bề mặt bằng cách sử dụng một thuổng 4. ðặt các mẫu phụ trong một túi nhựa sạch sẽ để làm thành một mẫu đại diện của khoảng 500 gram. Mẫu từ các cây bị nhiễm khuẩn cĩ thể được gộp lại với nhau. 5. ðảm bảo rằng các mẫu đã được dán nhãn đúng với: • Liên hệ chi tiết (người liên lạc, địa chỉ bưu điện và số điện thoại) • mẫu chi tiết (bản đồ vị trí tham chiếu và ngày) • Một số thơng tin cơ bản (bao gồm cả các cây bị nhiễm). 6. Khử trùng các dụng cụ, giày dép và tay với dung dịch cồn methyl hoặc thuốc tẩy sau mỗi lần lấy mẫu. 7. Giữ mẫu từ 10-25 º C (khơng để trong tủ lạnh). Vào mùa hè, mẫu phải được vận chuyển trong một hộp chứa cách nhiệt. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........26 3. VẬT LIỆU, NỘI DUNG PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu * Các vật liệu nghiên cứu trong phịng: - Mơi trường nuơi cấy: Thành phần (trong 1 lít mơi trường): + Mơi trường PDA: Khoai tây (250gr), ðường Dextro (20gr), Agar (20gr) + Mơi trường PCA: Khoai tây (20gr), Cà rốt (20gr), Agar (20gr) + Mơi trường WA: Agar (20gr), Nước cất (1000ml) + Mơi trường PSM: Cà rốt (khơng gọt vỏ)(20g), Khoai tây (khơng gọt vỏ): 20g, Thạch rau câu (12g), Nước cất (1000ml) - Các hố chất: Piranicin, Rifampicin, Streptomycin sulfate, Dichloran, Neomycin sulfate, các loại thuốc BVTV: AGRI - FOS, Aliette, ..... - Các trang thiết bị và dụng cụ: Tủ sấy dụng cụ, buồng cấy, nồi hấp, tủ định ơn, máy đo độ pH, dụng cụ nuơi cấy nấm ... 3.2 Nội dung nghiên cứu - Triệu chứng và đặc điểm hình thái tác nhân gây bệnh thối củ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. - Nghiên cứu phân lập, xác định tác nhân gây bệnh thối củ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. - Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh thái của tác nhân gây bệnh thối củ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. - Nghiên cứu quy luật phát sinh, phát triển của bệnh thối củ cây Sì to trên đồng ruộng tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. - Nghiên cứu các biện pháp phịng trừ bệnh thối củ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........27 3.3 Phương pháp nghiên cứu 3.3.1 Phương pháp phân lập, xác định tác nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc. Việc xác định tác nhân gây bệnh được tiến hành theo quy tắc Koch (1876): với 4 bước 1. Mơ tả triệu chứng và nhận dạng chi tiết. Ví dụ: Triệu chứng héo, đốm, thối thân rễ... và nhận dạng: màu sắc, kích thước, hình dạng... 2. Phân lập tác nhân gây bệnh và thơng qua đĩ mơ tả và giám định. 3. Lây bệnh nhân tạo tác nhân gây bệnh lên cây khoẻ, quan sát triệu chứng bệnh biểu hiện cĩ giống mơ tả ban đầu 4. Phân lập lại tác nhân gây bệnh từ cây lây bệnh cĩ xuất hiện triệu chứng bệnh, xác định xem cĩ giống với tác nhân gây bệnh phân lập từ cây bệnh ban đầu. Phương pháp phân lập và nuơi cấy nấm bệnh trong phịng thí nghiệm được tiến hành theo Burgess và cộng sự (2008) 3.3.1.1 Phương pháp phân lập mẫu bệnh chung a. Phương pháp để ẩm - Rửa mẫu bệnh sạch đất cát dưới vịi nước. - ðặt mẫu bệnh vào hộp Petri cĩ giấy thấm vơ trùng - Sau 1 - 2 ngày quan sát vi sinh vật gây bệnh từ mơ bệnh b. Phương pháp phân lập ký sinh gây bệnh trực tiếp từ mẫu cây bệnh - Rửa mẫu bệnh dưới vịi nước - Lựa chọn các mơ bệnh điển hình - Cắt mơ bệnh thành những miếng cĩ kích thước 1 x 1 cm. Miếng cắt phải nằm ở ranh giới giữa mơ bệnh và mơ khỏe, cĩ cả mơ bệnh và mơ khoẻ. Khử trùng bề mặt bằng cồn 700C trong 15 - 20 giây, sau đĩ rửa sạch bằng nước cất vơ trùng. - Thấm khơ miếng cắt bằng giấy thấm vơ trùng, dùng dao đã khử trùng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........28 cắt vết bệnh thành các miếng nhỏ 5 x 5 mm. - ðặt các mảnh mơ cây vào mơi trường phân lập bao gồm WA cĩ kháng sinh hoặc mơi trường PSM. - Khi nấm đã phát triển với kích thước đường kính tản nấm 1 - 2 cm, cấy truyền sang mơi trường thích hợp như: PDA, PCA và mơi trường WA (với mục đích làm thuần nấm). - Làm thuần mẫu nấm bằng cách cấy đỉnh sinh trưởng của một sợi nấm từ mơi trường WA sang mơi trường nuơi cấy PDA và PCAc. Phương pháp phân lập nấm Phytophthora từ đất và rễ cây Sì to. Phương pháp phân lập Phytophthora từ đất và rễ cây Sì to bằng sử dụng mồi bẫy: cánh hoa (Drenth và Sendall, 2004). - Lấy mẫu đất ở gốc của cây bị bệnh, bao gồm cả rễ cây bệnh - Cho đất vào 1/3 cốc, thêm nước cất vơ trùng vào tới khi đạt 3/4 cốc. Khuấy nhẹ đất trong cốc bàng đũa thuỷ tinh, để đất lắng xuống khoảng 2h ( tốt nhất để qua đêm) - Cắt cánh hoa hồng, kích thước khoảng 2 x 2 cm ( 1 mồi bẫy) thả vào cốc nước trên. - ðể cốc bẫy bào tử qua đêm ở nhiệt độ phịng (20 - 250C) - Quan sát cánh hoa sau: 1 ngày, 2 ngày, 3 ngày xem cĩ xuất hiện vết hoại tử. - Làm sạch cánh hoa cĩ vết bệnh, khử trùng bề mặt và tiến hành phân lập tác nhân gây bệnh như đối với mẫu sì to bị bệnh. 2.3.1.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo (theo Burgess và cộng sự (2008) Tiến hành lây bệnh theo 3 phương pháp sau: - Phương pháp lây bệnh qua đất với Phytophthora gây thối củ: + Ngâm hạt kê và vỏ trấu (tỉ lệ 1:1 về thể tích) trong nước và để qua đêm trong tủ lạnh, để hỗn hợp ngấm nước + Chắt bỏ phần nước Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........29 + Cho 150ml giá thể vào một bình tam giác dung tích 250ml + Cuộn thật chặt một nút bơng gịn, bọc ngồi bằng vải màn để nút chặt miệng bình tam giác. + Dùng giấy nhơm phủ lên miệng bình và hấp khử trùng + ðể bình nguội, sau đĩ cấy các miếng thạch cĩ sợi nấm hoặc dịch bào tử vào giá thể trong bình tam giác. + Lắc bình tam giác 2-3 ngày sau khi cấy để đảm bảo nguồn bệnh được phân bố đều trong giá thể. + Nấm nhân nuơi trong bình tam giác khoảng 15 ngày, lấy ra trộn vào đất vào bốn phía của cây. - Lây bệnh trực tiếp lên mơ cây ký chủ: Nguồn bệnh được phân lập từ mẫu cây bị bệnh, được đặt trực tiếp lên bộ phận của cây. - Tưới trực tiếp dung dịch nấm bệnh vào xung quanh gốc cây: Sợi nấm được cấy thuần trên đĩa petri, cho nước cất vào với liều lượng 1% dung dịch đặc sợi nấm được cạo trên bề mặt sợi nấm trên đĩa petri, để tạo du động bào tử, liều lượng tưới 300ml/cây/lần, tưới 3 lần trong thời gian 3 tuần (Drenth và Guest, 2004)[16]. 3.3.2 Phương pháp nghiên cứu một số đặc điểm sinh học, sinh thái của tác nhân gây bệnh thối củ rễ cây Sì to tại Sa pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc 3.3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến sự phát triển của tản nấm Các ngưỡng nhiệt độ: 20, 25, 30, 350C 3.3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng của các độ pH khác nhau Các ngưỡng pH làm thí nghiệm là: 5; 6; 7; 8. Phương pháp tiến hành chung cho 4 thí nghiệm trên: - Sử dụng 3 mẫu nấm khác nhau đã được làm thuần - Mơi trường nuơi cấy nấm: PDA - Mỗi cơng thức thí nghiệm làm 3 lần nhắc lại, mỗi lần 1 hộp petri cho Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........30 mỗi mẫu nấm. - Theo dõi tốc độ phát triển của nấm ở các ngày 2,3,4,5 sau khi cấy bằng cách đo đường kính tản nấm. 2.3.3 Phương pháp nghiên cứu quy luật phát sinh, phát triển của bệnh chết nhanh trên đồng ruộng tại Sa Pa - Lào Cai và Tam ðảo - Vĩnh Phúc - Chọn địa điểm điều tra: Khu A, trạm nghiên cứu cây thuốc Tam ðảo - Vĩnh Phúc - Thời gian điều tra: ðịnh kì 1 tháng/1 lần - Phương pháp điều tra: Áp dụng phương pháp điều tra của tiêu chuẩn ngành. Mỗi điểm 1m2. Quan sát trên đồng ruộng kết hợp với kiểm tra mẫu trong phịng. 2.3.4 Nghiên cứu các bi._.ILE MAINDB 22/ 8/** 23: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 TLB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 824.763 274.921 ****** 0.000 2 * RESIDUAL 8 1.23168 .153960 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 825.995 75.0905 ----------------------------------------------------------------------------- Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........80 TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MAINDB 1/ 9/** 23: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLB 1 3 6.45667 2 3 10.4367 3 3 15.8633 4 3 28.4433 SE(N= 3) 0.226539 5%LSD 8DF 0.738720 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MAINDB 1/ 9/** 23: 9 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TLB 12 15.300 8.6655 0.39238 2.6 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSDL FILE MAINDB 1/ 9/** 23:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 NSDL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 478.270 159.423 249.74 0.000 2 * RESIDUAL 8 5.10676 .638345 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 483.377 43.9433 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MAINDB 1/ 9/** 23:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NSDL 1 3 38.4000 2 3 35.1000 3 3 30.5667 4 3 21.6000 SE(N= 3) 0.461283 5%LSD 8DF 1.50420 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MAINDB 1/ 9/** 23:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........81 OBS. TOTAL SS RESID SS | | NSDL 12 31.417 6.6290 0.79896 2.5 0.0000 Bảng 4.9 CDTRSP BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTR FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CDTR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 54.3198 27.1599 130.51 0.000 2 * RESIDUAL 6 1.24860 .208099 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 55.5684 6.94604 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 1/ 9/** 21:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CDTR 1 3 23.1033 2 3 21.1467 3 3 17.1967 SE(N= 3) 0.263375 5%LSD 6DF 0.911057 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:11 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CDTR 9 20.482 2.6355 0.45618 2.2 0.0001 TLBSP BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 TLB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 197.468 98.7338 144.54 0.000 2 * RESIDUAL 6 4.09852 .683086 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 201.566 25.1958 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLB 1 3 5.54000 2 3 9.39667 3 3 16.8267 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........82 SE(N= 3) 0.477174 5%LSD 6DF 1.65062 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:14 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TLB 9 10.588 5.0195 0.82649 7.8 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSDL FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:16 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 NSDL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 881.807 440.903 490.49 0.000 2 * RESIDUAL 6 5.39340 .898900 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 887.200 110.900 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:16 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NSDL 1 3 40.6000 2 3 32.3667 3 3 16.7333 SE(N= 3) 0.547388 5%LSD 6DF 1.89350 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:16 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NSDL 9 29.900 10.531 0.94810 3.2 0.0000 TD BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSDL FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 NSDL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 1029.15 514.574 466.38 0.000 2 * RESIDUAL 6 6.62006 1.10334 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 1035.77 129.471 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........83 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NSDL 1 3 40.8667 2 3 32.2333 3 3 15.1333 SE(N= 3) 0.606449 5%LSD 6DF 2.09781 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NSDL 9 29.411 11.379 1.0504 3.6 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 TLB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 257.826 128.913 145.55 0.000 2 * RESIDUAL 6 5.31434 .885724 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 263.140 32.8925 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLB 1 3 4.71000 2 3 9.31667 3 3 17.6433 SE(N= 3) 0.543361 5%LSD 6DF 1.87957 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:21 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........84 OBS. TOTAL SS RESID SS | | TLB 9 10.557 5.7352 0.94113 8.9 0.0000 BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTR FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:24 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CDTR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 60.8927 30.4463 57.95 0.000 2 * RESIDUAL 6 3.15247 .525412 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 64.0452 8.00564 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:24 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CDTR 1 3 21.7933 2 3 20.6400 3 3 15.7900 SE(N= 3) 0.418494 5%LSD 6DF 1.44764 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:24 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CDTR 9 19.408 2.8294 0.72485 3.7 0.0003 Bảng 4.11 tlb BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:28 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 TLB LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 922.331 461.166 662.61 0.000 2 * RESIDUAL 6 4.17587 .695978 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 926.507 115.813 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:28 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLB 1 3 3.74000 2 3 15.3367 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........85 3 3 28.5200 SE(N= 3) 0.481656 5%LSD 6DF 1.66613 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:28 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TLB 9 15.866 10.762 0.83425 5.3 0.0000 Cdtr BALANCED ANOVA FOR VARIATE CDTR FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:31 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CDTR LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 47.6156 23.8078 32.04 0.001 2 * RESIDUAL 6 4.45887 .743145 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 52.0744 6.50930 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:31 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CDTR 1 3 21.7300 2 3 20.8300 3 3 16.4633 SE(N= 3) 0.497710 5%LSD 6DF 1.72166 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:31 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CDTR 9 19.674 2.5513 0.86206 4.4 0.0009 Nsdl BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSDL FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:33 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 NSDL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........86 1 CT$ 2 651.069 325.534 432.13 0.000 2 * RESIDUAL 6 4.51996 .753327 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 655.589 81.9486 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:33 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NSDL 1 3 41.5667 2 3 31.2667 3 3 20.7333 SE(N= 3) 0.501108 5%LSD 6DF 1.73341 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 5/ 9/** 21:33 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NSDL 9 31.189 9.0525 0.86794 2.8 0.0000 Bảng 4.12 ccc BALANCED ANOVA FOR VARIATE CCC FILE MAINDB 5/ 9/** 21:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CCC LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 23.1612 7.72040 9.75 0.005 2 * RESIDUAL 8 6.33600 .792000 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 29.4972 2.68156 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MAINDB 5/ 9/** 21:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CCC 1 3 46.0000 2 3 45.3667 3 3 46.6067 4 3 42.9467 SE(N= 3) 0.513809 5%LSD 8DF 1.67548 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MAINDB 5/ 9/** 21:39 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........87 (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CCC 12 45.230 1.6375 0.88994 2.0 0.0051 Crt BALANCED ANOVA FOR VARIATE CRT FILE MAINDB 5/ 9/** 21:44 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 CRT LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 19.2512 6.41708 11.89 0.003 2 * RESIDUAL 8 4.31806 .539758 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 23.5693 2.14266 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MAINDB 5/ 9/** 21:44 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CRT 1 3 44.7100 2 3 44.1600 3 3 47.5000 4 3 45.3933 SE(N= 3) 0.424169 5%LSD 8DF 1.38317 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MAINDB 5/ 9/** 21:44 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CRT 12 45.441 1.4638 0.73468 1.6 0.0029 Sn/k BALANCED ANOVA FOR VARIATE SN FILE MAINDB 5/ 9/** 21:47 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 SN LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 3 7.26349 2.42116 3.73 0.060 2 * RESIDUAL 8 5.19040 .648800 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 11 12.4539 1.13217 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MAINDB 5/ 9/** 21:47 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS SN Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........88 1 3 13.2767 2 3 11.5900 3 3 12.3067 4 3 11.2433 SE(N= 3) 0.465045 5%LSD 8DF 1.51646 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MAINDB 5/ 9/** 21:47 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 12) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | SN 12 12.104 1.0640 0.80548 6.7 0.0605 BALANCED ANOVA FOR VARIATE 5NGAY FILE MAI 26/ 8/10 15:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 5NGAY LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 4 155.729 38.9323 652.28 0.000 2 * RESIDUAL 10 .596864 .596864E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 14 156.326 11.1662 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE MAI 26/ 8/10 15:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS 5NGAY 1 3 0.000000 2 3 0.000000 3 3 2.39000 4 3 3.69333 5 3 8.75000 SE(N= 3) 0.141051 5%LSD 10DF 0.444458 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE MAI 26/ 8/10 15:41 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 15) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | 5NGAY 15 2.9667 3.3416 0.24431 8.2 0.0000 Bang4.15 TLB BALANCED ANOVA FOR VARIATE TLB FILE TLBMAI 4/ 9/** 8:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 TLB Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........89 LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 .140222E-01 .701111E-02 0.40 0.693 2 * RESIDUAL 6 .106400 .177333E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 .120422 .150528E-01 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 4/ 9/** 8:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS TLB 1 3 2.66333 2 3 2.56667 3 3 2.61333 SE(N= 3) 0.768837E-01 5%LSD 6DF 0.265953 ------------------------------------------------------------------------------ ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 4/ 9/** 8:17 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | TLB 9 2.6144 0.12269 0.13317 5.1 0.6927 1 thang BALANCED ANOVA FOR VARIATE 1 THANG FILE TLBMAI 4/ 9/** 8:33 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 VARIATE V003 1 THANG THANG THANG THANG THANG THANG THANG THANG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 4.76542 2.38271 8.69 0.017 2 * RESIDUAL 6 1.64460 .274100 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 6.41002 .801253 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE TLBMAI 4/ 9/** 8:33 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS 1 THANG 1 3 3.35667 2 3 3.32333 3 3 4.88333 SE(N= 3) 0.302269 5%LSD 6DF 1.04560 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE TLBMAI 4/ 9/** 8:33 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........90 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | 1 THANG 9 3.8544 0.89513 0.52355 13.6 0.0175 2thang BALANCED ANOVA FOR VARIATE 2THANG FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 2THANG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 19.0605 9.53023 92.69 0.000 2 * RESIDUAL 6 .616934 .102822 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 19.6774 2.45967 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS 2THANG 1 3 6.79000 2 3 5.97333 3 3 9.38667 SE(N= 3) 0.185133 5%LSD 6DF 0.640404 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:30 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | 2THANG 9 7.3833 1.5683 0.32066 4.3 0.0001 3thang BALANCED ANOVA FOR VARIATE 3THANG FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:33 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 3THANG LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 252.800 126.400 242.55 0.000 2 * RESIDUAL 6 3.12673 .521122 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 255.927 31.9909 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:33 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS 3THANG Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nơng nghiệp .........91 1 3 12.7367 2 3 9.84333 3 3 22.2500 SE(N= 3) 0.416782 5%LSD 6DF 1.44172 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:33 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | 3THANG 9 14.943 5.6560 0.72189 4.8 0.0000 NSDL BALANCED ANOVA FOR VARIATE NSDL FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:35 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 1 VARIATE V003 NSDL LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 2 22.4622 11.2311 8.02 0.021 2 * RESIDUAL 6 8.40667 1.40111 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 8 30.8689 3.85861 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:35 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 2 MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS NSDL 1 3 30.6000 2 3 32.4000 3 3 28.5333 SE(N= 3) 0.683401 5%LSD 6DF 2.36399 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE QUYENMAI 4/ 9/10 12:35 ------------------------------------------------------------------ :PAGE 3 F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 9) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | NSDL 9 30.511 1.9643 1.1837 3.9 0.0208 ._.