Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố mùa vụ, phương pháp khai thác đến kết quả thu tế bào trứng và môi trường nuôi cấy, đông lạnh đến kết quả thụ tinh ống nghiệm trứng bò

1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Cùng với sự bùng nổ dân số là những yêu cầu cấp thiết về an ninh lương thực, thực phẩm. Làm thế nào để tăng nhanh số lượng và chất lượng thực phẩm trong khi đất đai dành cho trồng trọt và chăn nuôi ngày càng bị thu hẹp? Một trong các giải pháp để giải quyết vấn đề đó là áp dụng công nghệ sinh học hiện đại vào cuộc sống. Công nghệ phôi (embryo biotechnology) là một công nghệ sinh học hiện đại, được hiểu như là một tổ hợp các kỹ thuật sinh sản, di truyền, sinh học tế bào và phân tử nhằm sử dụng hợp lý các nguồn nguyên liệu mang thông tin di truyền. Sự kết hợp và ứng dụng các kỹ thuật trên vào chăn nuôi giúp chúng ta có thể nâng cao năng suất sinh học của vật nuôi, tạo các động vật có tiềm năng di truyền cao hoặc phục vụ các mục đính đặc biệt của con người. Công nghệ phôi đồng thời góp phần bảo tồn sự đa dạng của các nguồn gen thông qua việc thành lập các ngân hàng tế bào sống. Mặt khác công nghệ phôi đã mở ra hàng loạt các kỹ thuật như thụ tinh ống nghiệm, xác định giới tính, cloning, nhân bản vô tính, đông lạnh phôi, ghép phôi, chuyển gen... Thụ tinh ống nghiệm (TTON) là quá trình kết hợp giữa tinh trùng (giao tử đực) với tế bào trứng (giao tử cái) để tạo ra hợp tử ngoài cơ thể mẹ (trong phòng thí nghiệm) trong các môi trường nhân tạo có điều kiện thích hợp giống như trong cơ thể mẹ về nhiệt độ, độ ẩm, áp suất thẩm thấu... Đây là kỹ thuật nền nhằm tạo ra lượng phôi lớn để phục vụ các nghiên cứu cơ bản khác trong công nghệ phôi. Trên thế giới, thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ trước và con thỏ đầu tiên ra đời bằng kỹ thuật này vào năm 1959, em bé thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời vào năm 1978 ở Anh và con bê TTON đầu tiên ra đời năm 1981 ở Mỹ (Brackett và cs (1982)[23]). Bê đực này là kết quả thụ tinh trong ống nghiệm giữa các tinh trùng với tế bào trứng đã thành thục in vivo, sau đó hợp tử được cấy vào vòi trứng bò nhận. Tại Việt nam, TTON đã được nghiên cứu trên gia súc từ đầu những năm 1990 và tiếp tục được nghiên cứu tại Viện Công Nghệ Sinh Học và Viện Chăn nuôi Quốc Gia. Với mục đích nâng cao hiệu quả của kỹ thuật TTON và tạo tiền đề áp dụng kỹ thuật siêu âm hút tế bào trứng từ con vật sống để sản xuất phôi có chất lượng cao, chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài:” Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố mùa vụ, phương pháp khai thác đến kết quả thu tế bào trứng và môi trường nuôi cấy, đông lạnh đến kết quả thụ tinh ống nghiệm trứng bò”. 1.2. MỤC TIÊU VÀ Ý NGHĨA Mục tiêu: - Xác định ảnh hưởng của yếu tố mùa vụ, phương pháp khai thác đến kết quả thu tế bào trứng. - Xác định ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy, đông lạnh đến kết quả thụ tinh ống nghiệm. - Có thể ứng dụng kết quả trên trong công nghệ sản xuất phôi bò. Ý nghĩa: Góp phần tạo phôi trong ống nghiệm với số lượng lớn, chất lượng cao và giá thành hạ nhằm phục vụ các nghiên cứu cơ bản khác như: cấy truyền phôi, đông lạnh phôi, cắt phôi, xác định giới tính, chuyển gen... 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ THỤ TINH ÔNG NGHIỆM TRONG VÀ NGOÀI NƯỚC Thí nghiệm đầu tiên về cấy phôi thành công trên thỏ được tiến hành do giáo sư Walter Heape thực hiện năm 1890. Đến năm 1932, cấy truyền phôi đã thành công trên dê bởi Warwich và Berry và con bê đầu tiên trên thế giới đã ra đời bằng cấy phôi bởi Willet và cs (1951)[69]. Từ đó công nghệ phôi đã đạt được các kết quả mới như đông lạnh phôi, cắt phôi, ghép phôi, xác định giới tính sớm từ giai đoạn phôi… Những năm tiếp theo, nhiều phòng thí nghiệm trên thế giới và các kỹ thuật liên quan đến công nghệ phôi tiếp tục được nghiên cứu cải tiến như nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm (Fukui và cs (1983)[31]; Beker và cs (2002)[17]), thụ tinh ống nghiệm (Leibfreid-Rutledge và cs (1986)[44]), nuôi phôi trong ống nghiệm (Ali và cs (2003)[13]), xác định giới tính phôi giai đoạn sớm bằng kỹ thuật PCR, khai thác trứng ở con vật sống với sự hỗ trợ của máy siêu âm (Ovum Pick Up - OPU)( Galli và cs (2001)[33])… Trên thế giới, thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu từ những năm đầu của thế kỷ trước và con thỏ đầu tiên ra đời bằng kỹ thuật này vào năm 1959, em bé thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1978 ở Anh và con bê thụ tinh ống nghiệm đầu tiên ra đời năm 1981 tại Mỹ . Tại Việt Nam, thụ tinh ống nghiệm đã được nghiên cứu trên gia súc từ đầu những năm 1990. Bùi Xuân Nguyên và cộng sự (1994)[1] đã báo cáo kết quả bước đầu nghiên cứu nuôi trứng và thụ tinh ống nghiệm ở trâu bò. Nguyễn Thị Ước và cs (1996)[7] đã nghiên cứu về sự chín nhân ở tế bào trứng trâu đầm lầy nuôi trong ống nghiệm. Nguyễn Hữu Đức và cs (1996)[4] đã nghiên cứu về trạng thái phát triển nhân tế bào trứng thu từ buồng trứng của bò nội Việt Nam. Nguyễn Thị Ước và cs (1999)[8] đã báo cáo về sản xuất phôi bò bằng thụ tinh ống nghiệm và nghiên cứu sản xuất bò sữa giống thương phẩm bằng cấy phôi thụ tinh ống nghiệm và xác định giới tính (Nguyễn Thị Ước và cs (2003)[9]). Nguyễn Hữu Đức và cs (2003)[5] đã báo cáo kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi ở bò lai Sind và con bê thụ tinh ống nghiệm ra đời vào ngày 28/11 năm 2002 tại Viện Công Nghệ Sinh Học. Tại Viên Chăn Nuôi Quốc Gia, tác giả Nguyễn Văn Lý và cs (2003)[10] đã báo cáo nghiên cứu tạo đàn bê bằng phôi thụ tinh ống nghiệm. 2.2. ĐẶC ĐIỂM SINH LÝ SINH DỤC BÒ CÁI 2.2.1. Chu kỳ động dục của bò cái Chu kỳ động dục được bắt đầu từ khi gia súc thành thục về tính và ở cơ quan sinh dục không có bào thai, không có hiện tượng bệnh lý, ở bên trong buồng trứng có quá trình phát triển của noãn bao, trứng chín và rụng. Ở bò thời gian bắt đầu thành thục về tính trung bình từ 8-24 tháng tuổi, lúc đó cơ thể con cái đặc biệt là cơ quan sinh dục có biến đổi kèm theo sự rụng trứng. Dưới sự điều tiết của hocmon thuỳ trước tuyến yên, trứng phát triển, chín, rụng một cách có chu kỳ và biểu hiện bằng những triệu chứng động dục theo chu kỳ gọi là chu kỳ tính. Bò thuộc loài gia súc đa chu kỳ, mỗi chu kỳ từ 18-24 ngày trung bình là 21 ngày. Chu kỳ tính chia làm 4 giai đoạn: Giai đoạn trước động dục: là giai đoạn từ khi thể vàng tiêu huỷ đến lần động dục tiếp theo, chuẩn bị điều kiện cho đường sinh dục cái và trứng để tiếp nhận tinh trùng, đón trứng rụng và thụ tinh. Thời gian của giai đoạn này là khoảng 3 ngày. Giai đoạn này biểu hiện các đặc điểm sau: đường sinh dục xung huyết và tăng cường nhu động. Các tuyến sinh dục phụ tiết chất nhầy, âm đạo tiết dịch nhầy loãng làm trơn đường sinh dục, con vật bắt đầu xuất hiện tính dục. Giai đoạn động dục: gồm ba thời kỳ liên tiếp là hưng phấn, chịu đực và hết chịu đực. Đây là giai đoạn quan trọng nhưng thời gian lại ngắn khoảng 1-3 ngày. Ở giai đoạn này con vật có những biểu hiện: âm đạo xung huyết, sưng tấy chuyển từ màu hồng nhạt sang màu mận chín; dịch trong suốt từ âm đạo chảy ra nhiều, con vật ở trạng thái không yên tĩnh, ăn ít hoặc bỏ ăn, phá chuồng kêu rít, nhảy lên lưng con khác hay để con khác nhảy lên lưng, xuất hiện các tư thế của phản xạ giao phối như hai chân sau dạng ra, đuôi cong về một bên...Sau khi hết chịu đực 6-10 giờ thì trứng rụng. Khi trứng rụng mà được thụ tinh thì chuyển sang thời kỳ chửa, nếu không được thụ tinh thì chuyển sang giai đoạn sau động dục. Giai đoạn sau động dục: bắt đầu từ khi kết thúc động dục và kéo dài vài ngày, các hưng phấn thần kinh giảm dần, sự tăng sinh và tiết dịch của tử cung ngừng lại. Biểu hiện về hành vi tính dục là không muốn gần con đực. Con vật dần trở lại trạng thái sinh lý bình thường. Giai đoạn yên tĩnh: đây là giai đoạn dài nhất, thường bắt đầu từ ngày thứ tư sau khi trứng rụng mà không thụ tinh và kết thúc khi thể vàng tiêu huỷ. Giai đoạn này không có biểu hiện về hành vi sinh dục. Đây là giai đoạn nghỉ ngơi yên tĩnh để khôi phục lại cấu tạo chức năng cũng như năng lượng cho chu kỳ tiếp theo. 2.2.2. Thần kinh và thể dịch điều tiết hoạt động sinh sản ở bò cái Hoạt động sinh lý sinh sản của gia súc chịu sự điều tiết của hệ thống thần kinh và thể dịch (Hypothalamus - tuyến yên - tuyến sinh dục phụ) dưới tác động của các nhân tố bên trong và bên ngoài. Nhân tố nội tại: là hàm lượng Estrogen trong cơ thể gia súc khi đã thành thục về tính. Estrogen tác động lên khu vỏ não và ảnh hưởng đến Hypothalamus, gây tiết GnRH theo chu kỳ. Nhân tố ngoại cảnh: nhiệt độ, ánh sáng, chế độ chăm sóc nuôi dưỡng đặc biệt là Steroid tự nhiên trong thức ăn xâm nhập vào cơ thể thông qua tiêu hoá, qua da vào cơ quan trong cơ thể gây nên những kích thích mãnh liệt tác động lên vỏ đại não. Vỏ đại não sau khi tiếp thu những kích thích sẽ truyền xung động đến Hypothalamus gây tiết các yếu tố giải phóng mà ngày nay gọi là các hocmon giải phóng. Các hocmon đó gồm: LRH kích thích thuỳ trước tuyến yên tiết ra hoàng thể tố (Luteino Releslaing Hocmon – LH), LH tác động vào buồng trứng làm trứng chín. LH kết hợp với FSH làm bao noãn vỡ gây hiên tượng rụng trứng... hình thành thể vàng. PRH kích thích thuỳ trước tuyến yên phân tiết LTH (Luteinotrofic hocmon). LTH tác động vào buồng trứng duy trì sự tồn tại của thể vàng, kích thích thể vàng tiết Progesteron. Progesteron tác động lên tuyến yên gây ức chế quá trình phân tiết FSH, LH. Quá trình động dục chấm dứt, nó tác động vào tử cung làm tử cung tăng sinh tạo điều kiện cho sự làm tổ của hợp tử. Như vậy, hoạt động chu kỳ tính của gia súc chịu sự chi phối của các hocmon FSH, LH, LTH trong đó FSH và LH đóng vai trò quan trọng. FSH và LH tuy được phân tiết riêng lẻ song lại hoạt động phối hợp chặt chẽ nhịp nhàng với nhau. Sự cân bằng nội tiết được giữ vững bởi cơ chế điều khiển ngược. Khi hocmon của tuyến nội tiết nào tăng hoặc giảm sẽ gây hiện tượng giảm hoặc tăng hocmon tương ứng của tuyến yên. Cơ chế đó được gọi là cơ chế điều khiển ngược dương tính. Cơ chế điều khiển ngược có ba kiểu: Điều khiển ngược vòng dài (Long feed back): Hypothalamus và tuyến yên có những cảm thụ và chịu tác động của các hocmon tuyến sinh dục. Điều khiển ngược vòng ngắn (Shor feed back): do các hocmon tuyến yên tác động vào cơ quan thụ cảm đặc biệt của Hypothalamus. Điều khiển vòng cực ngắn (Ultra- Shor feed back): do chính các hocmon của Hypothalamus quay lại điều hoà chính Hypothalamus. Hypothalamus Tuyến yên Tuyến đích Tổ chức ngoại vi (3) RF và IF (2) TSH, ACTH, GH (1) và gonadotropin Sơ đồ : mối liên hệ điều khiển hoạt động hệ nội tiết (1): Sự điều khiển ngược vòng dài (Long feedback) (2): Sự điều khiển ngược vòng ngắn (Short feedback) (3): Sự điều khiển ngược vòng cực ngắn (ultra-short feedback) 2.2.3. Cấu tạo buồng trứng và tế bào trứng 2.2.3.1. Cấu tạo và chức năng buồng trứng Buồng trứng là cơ quan sinh sản cơ bản ở gia súc cái bởi vì chúng sản sinh ra giao tử cái (noãn bào - tế bào trứng) và hocmon sinh sản cái (oestrogen và progesterone). Trâu, bò, ngựa, cừu là gia súc đơn thai, bình thường mỗi chu kỳ động dục chỉ có một tế bào trứng chín và rụng vì vậy mỗi lần chửa chúng chỉ đẻ một con. Lợn là gia súc đa thai, mỗi chu kỳ động dục có từ 10-25 tế bào trứng chín và rụng do vậy có nhiều thai ở mỗi lần có chửa. Buồng trứng bò có hình ô van dẹt, nhưng hình dáng này cũng bị thay đổi do những nang trứng phát triển hay do sự tồn tại của thể vàng. Buồng trứng gồm có hai miền: miền tuỷ bên trong và miền vỏ bên ngoài. Miền tuỷ có nhiều mạch máu, thần kinh và mô liên kết. Miền vỏ gồm các tế bào và các mô có nhiệm vụ tạo ra tế bào trứng và hocmon. Lớp ngoài cùng của miền vỏ buồng trứng là biểu mô bề mặt. Biểu mô bề mặt là một lớp tế bào lập phương, đầu tiên được gọi là biểu mô sinh dục bởi vì người ta tin rằng nó là nguồn gốc của tế bào sinh dục cái. Giờ đây người ta biết rằng tế bào sinh dục không xuất phát từ lớp biểu mô này. Chúng có nguồn gốc từ mô ruột của phôi và sau đó di chuyển vào miền vỏ tuyến sinh dục của phôi. Ngay bên dưới biểu mô bề mặt là một lớp mỏng, dày đặc các mô liên kết gọi là áo trắng buồng trứng. Phía dưới áo trắng là nhu mô, được coi là lớp chức năng bởi vì nó chứa nang trứng và các tế bào phân tiết hocmon buồng trứng. Người ta cho rằng tất cả nang sơ cấp được hình thành trước khi con vật cái được sinh ra. Nang sơ cấp (nang bậc I) là một tế bào sinh dục được bao quanh bởi một lớp tế bào hạt. Chúng nằm trong nhu mô và thường xuyên được nhìn thấy theo nhóm gọi là tổ trứng. Người ta ước lượng rằng có khoảng 75000 nang sơ cấp được tìm thấy trong buồng trứng bê. Với sự phát triển liên tục và thành thục trong suốt đời sống sinh sản, mỗi bò già chỉ có khoảng 2500 noãn bào có khả năng phát triển. Một số noãn bào có khả năng phát triển đã thành thục hoàn toàn và được giải phóng vào đường sinh dục để thụ tinh và phát triển thành bê. Nhưng hầu hết noãn bào còn lại đã phát triển và thoái hoá. Vì thế, số noãn bào có khả năng phát triển thu được từ buồng trứng để tạo bê lớn hơn rất nhiều so với thực tế nhận thấy. Nang trứng thường xuyên ở trạng thái phát triển và thành thục. Sau giai đoạn nang sơ cấp là sự tăng sinh các tế bào hạt bao quanh một tế bào trứng có khả năng phát triển. Một tế bào trứng có khả năng phát triển được bao quanh bởi hai hay nhiều lớp tế bào hạt gọi là nang thứ cấp (nang bậc II). Trong quá trình phát triển, các tế bào hạt nang thứ cấp tiết ra dịch, đẩy chúng tách rời và hình thành một xoang. Khi một xoang đã được hình thành thì nang đó được gọi là nang bậc III. Nang bậc III thành thục khi quan sát thấy nó chứa đầy dịch và nổi lên bề mặt buồng trứng, được gọi là nang Graaf. Dịch trong nang bậc III được gọi là dịch nang trứng. Đây là một dịch nhớt giàu hocmom sinh sản và các yếu tố khác giúp điều hoà chức năng buồng trứng. Có nhiều lớp tế bào trong nang Graaf được coi là có chức năng quan trọng. Ngoài cùng là lớp tế bào sợi được gọi là tế bào vỏ bên ngoài. Tiếp theo là lớp tế bào vỏ bên trong. Trong lớp này có nhiều mạch máu. Các tế bào vỏ và các mạch máu được hình thành khi nang trứng lớn lên và di chuyển vào miền tuỷ. Màng mềm tách lớp tế bào vỏ bên trong khỏi lớp tế bào trong cùng - lớp tế bào hạt và ngăn cản sự di chuyển của hệ thống mạch máu vào các tế bào này. Các tế bào hạt bao quanh xoang. Ngoài ra khối Cumulus Oophorus - tế bào hạt nằm ở bên kia của xoang. Noãn bào có khả năng phát triển nằm trong khối tế bào Cumulus với các tế bào hạt bao quanh. Những tế bào hạt bao quanh và tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng có khả năng phát triển được gọi là vành phóng xạ. Khi rụng trứng xảy ra, nang trứng vỡ đẩy dịch nang trứng, một số tế bào hạt và tế bào trứng có khả năng phát triển vào xoang cơ thể gần với chỗ mở ra của ống dẫn trứng. Trong lúc giải phóng ra, tế bào trứng được bao quanh bởi vành phóng xạ và một khối tế bào hạt (Cumulus) dính giúp ống dẫn trứng thu tế bào trứng và dịch chuyển trong ống dẫn trứng. Nang trứng vỡ làm chảy máu, do đó hình thành cục máu ở vị trí trứng rụng. Nang trứng vỡ chứa đầy máu được gọi là thể huyết. Thể huyết sau đó được thay thế bằng thể vàng là một thể cứng được hình thành nhanh chóng bởi hỗn hợp tế bào vỏ và tế bào hạt. Có hai loại tế bào được tìm thấy trong thể vàng. Loại tế bào thể vàng nhỏ có nguồn gốc từ tế bào vỏ và loại tế bào lớn có nguồn gốc từ tế bào hạt. Trong thể vàng có nhiều mạch máu và là nguồn progesterone và các progestin khác duy nhất của buồng trứng. Khi thể vàng thoái hoá, nó không còn phân tiết progesterone nữa. Nó thay đổi màu sắc cuối cùng trở thành một cái sẹo màu trắng trên bề mặt buồng trứng. Nếu gia súc có chửa, thể vàng sẽ được duy trì đến cuối giai đoạn mang thai. 2.2.3.2. Cấu tạo tế bào trứng Hình thái: tế bào trứng bò là một loại tế bào lớn nhất trong cơ thể (0,135-0,145mm), có dạng hình cầu. Cấu tạo tế bào trứng gồm ba phần: (Trần Tiến Dũng và cs (1997)[12]) nguyên sinh chất, nhân và màng bao. Đi từ ngoài vào trong thì tế bào trứng có cấu tạo: Màng ngoài cùng: là đám tế bào Cumulus, có dạng lầy nhầy, không rõ hình dạng, cấu trúc, bao gồm nhiều lớp tế bào hình nang, hình chóp, những tế bào này được phân bố khắp xung quanh tế bào trứng nên được gọi là màng phóng xạ. Các tế bào này được gắn với nhau bởi axit Hyanuronilic. Lớp màng giữa: bao gồm nhiều tế bào, được sinh ra từ lớp tế bào hình nang, là lớp nuôi dưỡng tế bào trứng còn được gọi là màng trong suốt, màng này đảm bảo dinh dưỡng cho tế bào trứng ở trong buồng trứng. Lớp màng trong: là một lớp tế bào màng mỏng bao bọc phần nguyên sinh chất gọi là màng noãn hoàng hay màng nguyên sinh chất. Màng này có tác dụng nuôi dưỡng trứng đã thụ tinh. Ở giữa màng trong suốt và màng noãn hoàng có khoảng trống. Khoảng trống có độ dầy 14-15µm, có độ pH = 3-5, chứa dịch có nồng độ ion cao. Nguyên sinh chất: bao quanh nhân trứng, thành phần chủ yếu của nguyên sinh chất là: nước, muối khoáng, các vật chất hữu cơ, các men và đặc biệt là các bào quan của tế bào. Nhân trứng: bao gồm lưới nhiễm sắc thể (NST) và nhiều hạt nhân. Ở bò có 29 cặp nhiễm sắc thể thường và một cặp nhiễm sắc thể giới tính. 2.2.3.3. Sóng nang trứng. Trong những năm gần đây, một số nhà khoa học đã nghiên cứu đến các đợt sóng nang (Follicular wave) trong chu kỳ động dục của bò. Sóng nang là sự phát triển đồng loạt của một số bao noãn ở cùng một thời gian trong chu kỳ động dục. Các công trình nghiên cứu, theo dõi sự phát triển noãn nang của buồng trứng in vitro bằng phương pháp nội soi và siêu âm được nhiều tác giả công bố. Các tác giả cho thấy ở bò trong một chu kỳ thường có 2 - 3 đợt sóng nang phát triển một số ít có 4 đợt, đợt một bắt đầu diễn ra rụng trứng, vào ngày 3 - 9 của chu kỳ; đợt 2 vào ngày 11 - 17 và đợt 3 vào ngày 18 - 0. Mỗi đợt sóng nang có thể huy động tới 15 nang kích thước từ 5 - 7 mm phát triển sau này có một nang phát triển mạnh hơn gọi là nang trội (nang khống chế). Kích thước của nang khống chế ở đợt 1, 2, 3 có thể đạt 12 - 15 mm và các đỉnh kích thước nang tương ứng quan sát thấy vào các ngày 6, 12, 21. Đặc điểm chính trong các đợt phát triển nang này là sự phát triển có tính tự điều khiển và cạnh tranh giữa các nang. Mỗi đợt có một nang chiếm ưu thế (nang khống chế) tiết ra chất nihibin đè nén sự tăng trưởng của các nang khác. Tuy vậy, trong khi thể vàng còn tồn tại nang khống chế này sẽ bị thoái hoá; chỉ có ở đợt cuối cùng, khi thể vàng không còn thì nang khống chế mới phát triển tới chín và sự rụng trứng mới xảy ra, chính đây là lý do giải thích tại sao mỗi chu kỳ động dục của bò chỉ có 1 trứng chín và rụng (cá biệt có 2). Trong mỗi đợt sóng như vậy, sự tồn tại của các nang không phải nang khống chế dao động 5 - 6 ngày. Riêng nang khống chế có thể phát triển nhanh sau 18 ngày, tốc độ phát triển nang ở thời điểm này có thể đạt 1,6mm/ngày. Trong công nghệ cấy phôi, việc gây rụng trứng nhiều trong một lần động dục bằng cách đưa gonadtropin ngoại lai vào cơ thể là quá trình khống chế ảnh hưởng của nang trội đối với các nang phát triển, hoặc làm thoái hoá nang trội, tạo điều kiện cho một loạt nang phát triển đồng thời tới chín và rụng để quá trình thụ tinh tạo được nhiều phôi trong một chu kỳ động dục của bò Sóng nang và tính trội của sóng nang 2.3. THU TẾ BÀO TRỨNG BÒ Một bước quan trọng trong kỹ thuật thụ tinh ống nghiệm cũng như trong kỹ thuật cloning tế bào soma là việc thu tế bào trứng để nuôi thành thục trong ống nghiệm. Tế bào trứng bò có thể được thu từ buồng trứng lấy ở lò mổ bằng kỹ thuật hút dịch nang trứng, kỹ thuật giải phẫu nang trứng hay từ gia súc sống bằng kỹ thuật nội soi và siêu âm. Có thể hút dịch nang trứng từ gia súc sống 2 lần/tuần trong khoảng thời gian dài và đây là một phương pháp thay thế cho tế bào trứng thu được từ buồng trứng lấy ở lò mổ để tạo phôi với số lượng lớn (Bols và cs (2004)[19], Galli và cs (2001)[33]. Các tác giả này đã khẳng định rằng hút dịch nang trứng từ gia súc sống lặp lại có thể thực hiện ít nhất 2 lần/tuần trong nhiều tháng mà không cần phải dùng hocmon để kích thích. Việc áp dụng kỹ thuật nào để thu tế bào trứng phụ thuộc vào trang thiết bị và kỹ thuật của mỗi phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, kỹ thuật thu tế bào trứng ở gia súc sống có ý nghĩa lớn vì biết rõ được nguồn gốc và tiềm năng di truyền của con cái. Kỹ thuật này đòi hỏi trình độ kỹ thuật cao và trang thiết bị hút nội soi đắt tiền. Lựa chọn tế bào trứng bò cho, nuôi trong ống nghiệm (IVM) trên cơ sở đánh giá dưới kính hiển vi về những đặc điểm hình thái của chúng . Loos và cs (1989)[48] đã chia trứng bò nuôi trong ống nghiệm thành 4 loại dựa trên sự chặt chẽ và trong suốt của tế bào Cumulus bao quanh tế bào trứng, sự đồng nhất và trong suốt của noãn bào chất (ooplasma). Sau đó Loos và cs đã mô tả hình thái của trứng sau khi IVM và so sánh với hình thái của tế bào trứng thành thục In -vivo. Các tác giả này kết luận rằng có một sự dao động đáng kể về hình thái giữa các tế bào trứng có khả năng phát triển bình thường. Tế bào trứng thành thục In-vivo, các tế bào trứng thứ cấp hình thành một nhóm đồng nhất về hình thái, trong khi đó các tế bào trứng nuôi thành thục trong ống nghiệm hình thành nên các nhóm không đồng nhất. Loại Tổ hợp tế bào trứng-Cumulus (Cumulus-Oocyte Com plex – COC) 1 Các lớp Cumulus chặt chẽ, noãn bào chất đông nhất. Khối COC sáng và trong suốt. 2 Các lớp Cumulus chặt chẽ, noãn bào chất đông nhất, nhưng có những vùng tối phía ngoài tế bào trứng; khối COC sáng ít và ít trong suốt. 3 Các lớp Cumulus ít chặt chẽ, trứng không đều có các đám đen, khối COC tối hơn loại 1 và 2 ở trên 4 Các lớp Cumulus giãn nở, các tế bào Cumulus tụ tập thành từng đám tối, noãn bào chất không đồng đều với các đám tối, khối COC tối và không đều. 2.4. NUÔI TẾ BÀO TRỨNG THÀNH THỤC TRONG ỐNG NGHIỆM 2.4.1. Môi trường nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm Môi trường dùng cho nuôi tế bào trứng thành thục trong ống nghiệm không chỉ ảnh hưởng tới tỷ lệ tế bào trứng bò đạt tới trung kỳ II và có khả năng diễn ra thụ tinh, mà còn ảnh hưởng tới sự phát triển tiếp theo của phôi. Các môi trường thường dùng để nuôi thành thục tế bào trứng bò trong ống nghiệm có thể chia thành 2 loại: đơn giản và phức tạp. Các loại môi trường đơn giản thường là các hệ thống đệm bicacbonate có chứa muối sinh lý cơ bản với pyruvat, lactate và glucose. Những khác biệt chính giữa các loại môi trường đơn giản là sự khác biệt về nồng độ ion của chúng và nồng độ các nguồn năng lượng. Các loại môi trường thường được bổ sung thêm huyết thanh hay albumin và kháng sinh (penicillin, stretomycin, gentamycin). Môi trường phức tạp, ngoài các thành phần cơ bản của môi trường đơn giản, có chứa các axit amin, vitamin, purin và các chất khác, chủ yếu là các chất được tìm thấy trong huyết thanh. Một trong những môi trường phức tạp được sử dụng rộng rãi để nuôi tế bào trứng bò trong ống nghiệm là môi trường nuôi cấy mô 199 (TCM-199). Môi trường này chứa các loại muối Earle, đệm bằng N-(2-hydroxyethyl)-piperazine-N’-(2-ethanesulphonic acid) và sodium bicarbonate và bổ sung thêm pyruvat, lactate, axit amin, vitamin, purin và các chất khác tìm thấy rong huyết thanh. TCM -199 là môi trường chuẩn để nuôi tế bào trứng bò và cừu trong ống nghiệm ở Ailen. Ở Đan Mạch và Canada, môi trường F10 được dùng nhiều cho nuôi tế bào trứng trong ống nghiệm. Hầu hết các phòng thí nghiệm TTON đều sử dụng TCM-199 làm môi trường cơ bản cho nuôi tế bào trứng trong ống nghiệm và có rất ít báo cáo chỉ ra rằng các môi trường khác có phù hợp không. Kajihara và cs (1999)[40] nhận thấy rằng không có sự khác nhau về tỷ lệ phân chia, tỷ lệ phôi dâu, phôi nang giãn nở khi tế bào trứng sau khi được nuôi thành thục, thụ tinh trong môi trường M-199 so với CR1aa. Môi trường F-10 gồm hệ đệm Kreb Ringer Bicacbonate bổ sung thêm pyruvat, lactate, axit amin, vitamin, các nguyên tố vi lượng và các chất khác tìm thấy trong huyết thanh như thymidyne và hypoxanthine. Ngoài ra cong có penicillin, streptomycin, albumin và huyết thanh bổsung. Một điểm chính cần biết về các loại môi trường nuôi tế bào trứng trong ống nghiệm, dù đơn giản hay phức tạp là cần phải xác định chính xác các thành phần trên cơ sở các nhu cầu đã cải tiến. Thực tế, môi trường được bổ sung hypoxathine có thể được sử dụng với mục đích giúp phân bào giảm nhiễm trở lại của tế bào trứng ở một số động vật có vú. Các môi trường sử dụng cho nuôi tế bào trứng trong ống nghiệm hiện nay có chứa huyết thanh bò hay các thành phần tế bào, điều đó có nghĩa là nhiều chất chưa được biết đang có mặt trong môi trường nuôi và nồng độ của nhiều chất không thể xác định được một cách chính xác. Đã có nghiên cứu chỉ ra rằng tế bào trứng chuột có thể nuôi thành thục và thụ tinh trong môi trường không có huyết thanh. Họ đã sử dụng môi trường Ham’ F10 có bổ sung albumin huyết thanh bò (Bovine Serum Albumin- BSA) để cung cấp một môi trường không có huyết thanh và nhận thấy “màng trong suốt cứng lại” không phải là do thiếu huyết thanh. Tuy nhiên, Eppig và cs (1992)[29] đã báo cáo rằng có thể bổ sung fetuin vào môi trường nuôi để ngăn cản sự cứng lại của màng trong suốt. Fetuin là một lycoprotein chính trong huyết thanh bào thai bê (FCS) và được coi là yếu tố ngăn cản màng trong suốt cứng lại khi tế bào trứng chuột được nuôi trong môi trường không có huyết thanh. Đã có nhiều nghiên cứu báo cáo rằng gonadotropin, steroid và các yếu tố tế bào tất cả tương tác với nhau để hỗ trợ trứng thành thục In-vivo. Nang trứng trước rụng trứng có thể coi là một cấu trúc, mà ở đó hàng triệu tế bào soma đóng góp cho sự phát triển của tế bào sinh dục: tế bào trứng. Trong nhiều năm người ta biết rằng tế bào trứng có quan hệ chặt chẽ với tế bào Cumulus. Những tế bào Cumulus tiếp xúc trực tiếp với tế bào trứng có nguyên sinh chất kéo dài, xuyên qua màng trong suốt và kết thúc ở chỗ phồng ra gần với màng tế bào trứng. Tầm quan trọng của chỗ nối này tăng lên khi người ta biết rằng màng tế bào trứng không có khả năng xuyên thấm đối với các chất trao đổi có phân tử lượng thấp. Sự xâm nhập của các chất đó được biết là thông qua chỗ tiếp xúc giữa tế bào trứng và tế bào Cumulus. Sự tương tác trao đổi chất giữa tế bào trứng và tế bào Cumulus đóng một vai trò dinh dưỡng quan trọng trong giai đoạn trứng thành thục. Người ta cũng biết rõ rằng các tế bào Cumulus liên kết với nhau bằng những chỗ trống tiếp xúc và những chỗ trống tiếp xúc này cho phép các chất có phân tử lượng thấp đi qua từ tế bào này sang tế bào khác. Các tế bào Cumulus liên kết với các tế bào hạt, mà các tế bào hạt lại đi kèm với các tế bào vỏ bên trong. Như vậy, có khả năng các chất do tế bào hạt tạo ra sẽ đi vào các tế bào nang trứng và sau đó đi vào tế bào trứng. 2.4.2. Đánh giá tế bào trứng thành thục trong quá trình nuôi trong ống nghiệm Các giai đoạn thành thục nhân. Trong quá trình nuôi thành thục trứng bò, cấu trúc chất nhiễm sắc trong trứng chưa thành thục diễn ra một loạt sắp xếp hình thái, bắt đầu từ tiền kỳ của sự phân chia giảm nhiễm lần thứ nhất và tiếp tục đến trung kỳ của lần phân chia giảm nhiễm lần thứ 2. Một số tác giả đã mô tả những thay đổi xảy ra trong quá trình nuôi trong ống nghiệm. Screenan (1968)[59] báo cáo rằng 80% tế bào trứng bò thành thục sau khi bắt đầu nuôi 24 giờ trong ống nghiệm, màng nhân biến mất sau 5-6 giờ và đạt tới trung kỳ I sau 12 giờ. Khoảng thời gian đỉnh điểm tế bào trứng đạt tới trung kỳ II là 24 giờ. Phát triển của tế bào Cumulus. Quá trình thành thục của trứng bò trong ống nghiệm liên quan đến sự phát triển và những thay đổi ở tế bào Cumulus bao quanh trứng. Như báo cáo của Hensleigh và Hunter (1985) [38], các tế bào Cumulus phát triển hình thành một khối hình cầu và khối tế bào - Cumulus (COC) dường như nổi lên trong đĩa nuôi. Người ta biết rằng các tế bào Cumulus được kích thích bởi gonadotrophin (FSH) và yếu tố sinh trưởng (EGF) để tạo ra và phân tiết hyaluronic axit, một chất làm phân tán tế bào, một quá trình được coi như phát triển giãn nở. 2.5. HOẠT HOÁ TINH TRÙNG 2.5.1. Khái niệm. Việc sản xuất ra tinh trùng ở con đực là một quá trình phức tạp, xảy ra ở tinh hoàn, tế bào mầm tinh nguyên bào (Spermatogonia) trên cơ sở của ống sinh tinh (Seminiferous Tubules) phân chia nguyên nhiễm để duy trì số lượng của chúng và để theo chu kỳ tạo ra tinh bào sơ cấp, sau đó tinh bào sơ cấp trong quá trình phân bào giảm nhiễm tạo ra các tinh tử đơn bội, những tinh tử đơn bội đó được biệt hoá thành tinh trùng và giải phóng vào lòng ống sinh tinh. Kích thước tinh trùng bò rất nhỏ, chỉ bằng khoảng 1/20 nghìn thể tích tế bào trứng. Sự thụ tinh của tế bào trứng bò liên quan đến một loạt các hoạt động mà ở đó tinh trùng phải có: 1- vận động (tiến tới tế bào trứng và di chuyển qua màng trong suốt); 2- có khả năng hoạt hoá và có phản ứng acrosome; 3- có khả năng gắn vào màng trong suốt và màng noãn hoàng nhờ protein kết dính chính xác được tạo ra trong lúc trưởng thành và biểu lộ những bề mặt kết dính này với tế bào trứng ở một thời điểm phù hợp; 4- có khả năng hợp nhất với Oolêa và hoà nhập với nhân của tế bào trứng. Tinh trùng đạt được những khả năng này khi chúng đi qua phụ dịch hoàn. Khái niệm hoạt hoá lần đầu tiên được Austin (1951) [15] và Chang (1951) [26] nhận biết và mô tả một cách độc lập với nhau. Họ đã chứng minh rằng tinh trùng của động vật có vú có khả năng xâm nhập vào tế bào trứng thành thục chỉ sau khi chúng có một thời gian di chuyển ở trong đường sinh dục cái. Hoạt hoá giờ đây đã được nhận biết một cách rõ ràng như một quá trình mà ở đó tinh trùng diễn ra một loạt các phản ứng sinh lý và sinh hoá phức tạp trước khi có khả năng thụ tinh với tế bào trứng thành thục. Người ta cho rằng giai đoạn đầu tiên của quá trình hoạt hoá liên quan loại bỏ và thay thế các thành phần có nguồn gốc từ ống sinh tinh, phụ dịch hoàn, ống dẫn tinh và tinh thanh. Trong khi di chuyển từ tinh hoàn qua phụ dịch hoàn tinh trùng được thay đổi để trở thành những tế bào thành thục có khả nămg thụ tinh và dự trữ ở đuôi phụ dịch hoàn đến khi được giải phóng ra trong quá trình xuất tinh hay thải vào nước tiểu. Trong việc định nghĩa hoạt hoá, một số nhà nghiên cứu đưa cả khái niệm phản ứng acrosome vào, trong khi một số khác lại không đưa vào. Khái niệm được Furuya và cs (1992)[32] đưa ra: hoạt hoá là một chuỗi thay đổi sinh hoá mà những thay đổi đó làm tinh trùng có thể diễn ra phản ứng acrosome khi tiếp xúc với màng trong suốt, mà màng trong suốt dường như là tác nhân sinh lý gây nên phản ứng đó. Ở bò, dựa vào sự xâm nhập của tinh trùng đầu tiên vào tế bào trứng sau khi thụ tinh nhân tạo, thời gian cần cho hoạt hoá của tinh trùng trong đường sinh dục cái khoảng 6 giờ. Tuy nhiên, các yếu tố ở đường sinh dục bò cái liên quan tới hoạt hoá và nguồn gốc của chúng vẫn chưa được rõ. 2.5.2. Các kỹ thuật làm tăng hoạt lực tinh trùng trong TTON 2.5.2.1. Kỹ thuật bơi ngược dòng (siwm up) Chuyển động là một đặc điểm quan trọng của tinh trùng bò vì chúng phải đi qua đường sinh dục cái và ảnh hưởng đến sự thụ tinh. Sự xâm nhập của tinh trùng qua màng trong suốt đòi hỏi một sự chuyển động rất mạnh của tinh trùng. Kỹ thuật Swim-up trở thành một kỹ thuật có thể._. chấp nhận được để thu được tinh trùng có hoạt lực cao dùng cho TTON ở bò. Kỹ thuật Swim-up thường liên quan đến việc giải đông tinh trùng và đưa chúng vào một thể tích môi trường thích hợp. Môi trường này thường là môi trường không có canxi-tyrode/albumin/Na lactate/Na pyruvate (TALP)và được dùng cả cho kỹ thuật Swim-up và tiếp theo là rửa tinh trùng. Mẫu tinh trùng được để trong tủ nuôi ở nhiệt độ 39oC từ 30-60 phút, trong thời gian đó những tinh trùng có hoạt lực tốt trong tinh dịch sẽ bơi lên phía trên môi trường TALP. Mặc dù kỹ thuật Swim-up có thể cho mẫu tinh trùng có hoạt lực cao nhưng chúng cũng có những bất lợi vì số lượng tinh trùng bơi lên tương đối thấp, đó là điều quan tâm trong thực tế khi sử dụng tinh cọng rạ rất đắt. Các nhà khoa học cũng báo cáo rằng sử dụng kỹ thuật Swim-up trong TTON ở bò có một ảnh hưởng đáng kể đến tỷ lệ thụ tinh. Tỷ lệ thụ tinh thường tăng từ 46% lên 59% và các mẫu tinh trùng từ kỹ thuật Swim-up cho thấy tinh trùng có hoạt lực cao. Tuy nhiên trong thực tế Swim-up không dược sử dụng nhiều. Catt (1990) [25] chỉ ra rằng một số lượng lớn tế bào trứng đã được thụ tinh với phần môi trường có tinh trùng bị bỏ đi. Nhu cầu sử dụng kỹ thuật Swim-up có thể lớn hơn khi chất lượng tinh trùng và hoạt lực tinh trùng kém. 2.5.2.2. Kỹ thuật lọc qua màng lọc thuỷ tinh. Trong những năm 1950, người ta đã chỉ ra rằng tinh dịch bò pha loãng, khi lọc qua một lớp thuỷ tinh nhỏ thì những tinh trùng chết bị màng lọc giữ lại, còn những tinh trùng sống đi qua được. Gần đây, Daya và cs (1987)[28] đã sử dụng cột hạt thuỷ tinh để tách tinh trùng ở người; họ nhận thấy kỹ thuật này có thể tin tưởng được và là một kỹ thuật có kết quả ổn định để tách các tinh trùng có hoạt lực từ những tinh dịch có chất lượng kém. Khi lọc tinh trùng bằng cột màng thuỷ tinh cho số lượng tinh trùng có khả năng xâm nhập vào tế bào trứng cao. Khi so sánh với kỹ thuật lọc tinh trùng bằng Swim-up, tỷ lệ thụ tinh và tỷ lệ phát triển phôi là tương tự nhau song lọc bằng màng lọc thuỷ tinh chỉ đòi hỏi mất ba phút để hoàn thành, điều đó làm cho việc xử lý tinh trùng trong ống nghiệm tiết kiệm được nhiều. 2.5.2.3. Sử dụng sự chênh lệch tỷ trọng. Số lượng tinh trùng bò có hình thái bình thường, hoạt lực và khả năng sống cao khi sử dụng chênh lệch albumin huyết thanh bò (BSA) không liên tục. Ở lợn số lượng tinh trùng có hoạt lực cao với các đặc điểm về khả năng thụ tinh cao đã được tách ra bằng sự chênh lệch BSA không liên tục tương tự, kỹ thuật này đã cho kết quả mẫu tinh trùng có hơn 90% tinh trùng có hoạt lực tốt. Ở sự chênh lệch tỷ trọng Percoll, tinh trùng được tách bằng cách cân bằng, khi tỷ trọng của tinh trùng tương đương với tỷ trọng của sự chênh lệch. Người ta cho rằng những tinh trùng có hình thái nhân tố dầy đặc hơn so với những tinh trùng kém hơn và được lựa chọn ở phần tỷ trọng cao hơn của sự chênh lệch Percoll. Người ta cũng nhận thấy rằng tách tinh trùng bằng Percoll cho tinh trùng có chất lượng tốt nơn so với phương pháp lựa chọn tinh trùng bằng Swim-up. 2.6. SINH LÝ QUÁ TRÌNH THỤ TINH 2.6.1. Quá trình thụ tinh Thụ tinh là quá trình đồng hoá giữa trứng và tinh trùng để tạo thành hợp tử 2n NST có bản chất hoàn toàn mới và có khả năng phân chia nguyên nhiễm liên tiếp tạo thành phôi. Đó là sự tái tổ hợp các gen từ hai nguồn gen khác nhau. Sau khi rụng, tế bào trứng và dịch nang trứng được hút vào loa kèn rồi vận chuyển nhanh đến chỗ phình của ống dẫn trứng. Trong thời gian di chuyển, dịch ống dẫn trứng có tác động nhất định đối với tế bào trứng, lớp tế bào vành phóng xạ của tế bào trứng cũng bị mất đi một phần bởi tế bào hình trụ ống dẫn trứng bào mòn. Sau khi thụ tinh, nhân tạo hay phối giống, tế bào tinh trùng tiến nhanh qua tử cung đến 1/3 phía trên của ống dẫn trứng trong vòng 5-15 giờ tuỳ loài nhờ nhu động của tử cung, ống dẫn trứng và hoạt lực tiến thẳng của tinh trùng. Quá trình thụ tinh xảy ra tốt nhất khi trứng và tinh trùng gặp nhau tại 1/3 phía trên ống dẫn trứng. Các giai đoạn của quá trình thụ tinh diễn ra như sau: Khi trứng di chuyển trong ống dẫn trứng, nó tiết ra một chất kích thích Ferilinzin làm cho tinh trùng hoạt động mạnh và tiến tới bao vây trứng. Đồng thời xoang Aroxom của tinh trùng cũng tiết ra men Hyaluronidaza để phá vỡ lớp tế bào của màng phóng xạ nhờ hai quá trình phân giải và thuỷ phân. Lượng tinh trùng để tiết ra men Hyaluronidaza làm nhiệm vụ phá vỡ lớp tế bào của màng phóng xạ ở các loài gia súc phải có một số lượng nhất định, men này cho hiệu quả tốt nhất khi có nồng dộ 4-6 mg% trong tinh dịch. Tinh trùng của loài nào thì thụ tinh với trứng của loài đó đây chính là tín hiệu loài, tuy nhiên men Hyaluronidaza do tinh trùng tiết ra không đặc trưmg cho loài cho nên tinh trùng của gia súc này có thể tiết men Hyaluronidaza để phá vỡ tế bào vành phóng xạ của tế bào trứng của loài gia súc khác. Tinh trùng đi vào tế bào trứng: Sau khi phá vỡ lớp tế bào của màng phóng xạ nhờ men Hyaluronidaza, tinh trùng tiếp xúc với màng trong suốt của tế bào trứng. Tại đây, tinh trùng tiết ra men Zonalizin phá vỡ màng trong suốt tạo thàh khe hở, tạo điều kiện cho vài chục tinh trùng chui vào “khoảng trống”, ở đây tinh trùng được hồi phục sức lực. Số tinh tùng này tiếp tục phá vỡ màng noãn hoàng nhờ men Muraminidaza và chỉ cho một tinh trùng đi vào nhân tế bào trứng. Hai men Zonalizin và Muraminidaza là hai men đặc hiệu chủng loài nên chỉ cho phép tinh trùng cùng loài đi vào trong nhân của tế bào trứng để xảy ra quá tình thụ tinh. Những khe hở để tinh trùng đi qua được đóng mở theo cơ chế đông máu với sự tham gia của ion Ca++. Khi tinh trùng đi vào giữa tế bào trứng thì phần đầu của tinh trùng kết hợp với nhân tế bào trứng và xảy ra quá trình đồng hoá, dị hoá giữa hai loại tế bào, phần thân và đuôi của tinh trùng được nguyên sinh chất của tế bào trứng đồng hoá và tiêu tan. Sau khi tinh trùng đi vào giữa tế bào trứng, lúc này xảy ra quá trình đồng hoá và dị hoá phức tạp. Thực chất của quá trình thâm nhập là khích thích tế bào phân chia giảm nhiễm lần II hoàn thành quá trình chín của nó. Sau khi thâm nhập vào tế bào trứng đầu tinh trùng tăng lên về thể tích rồi hình thành các nhân nguyên, sau đó các nhân nguyên chui qua màng tế bào. Khi nhân nguyên đực và nhân nguyên cái phối hợp với nhau có chọn lọc hình thành hợp tử và tiếp tục phân chia. 2.6.2. Đặc điểm của phôi giai đoạn đầu Sau khi hợp tử hình thành cùng với sự di chuyển của tế bào trứng đến nơi làm tổ theo quy định của giống loài, trứng bắt đầu phân chia theo cấp sô nhân: 1 thành 2, 2 thành 4 ... Do sự phân chia mà hình thành nên đường biên giới giữa các tế bào gọi là cầu phân chia, cầu phân chia có những rãnh dọc ngang gọi là rãnh phân chia. Cầu phân chia to nhỏ khác nhau, màu sáng tối không giống nhau. Những cầu mầu tối sẽ hình thành thân phôi, cầu màu sáng sẽ hình thành nên các khí quan, quá trình phân chia này diễn ra ở ống dẫn trứng. Một đặc điểm nữa của phôi là giai đoạn đầu của quá trình phân chia không làm phôi lớn lên về kích thước vì toàn bộ quá trình phân chia diễn ra trong màng trong suốt. Trong quá trình phân chia, cầu phân chia nhỏ đi hình thành các đám tế bào, giữa các đám tế bào đó có xoang chứa dịch keo to dần lên, lúc này kích thước phôi mới tăng lên, cuối cùng phá vỡ màng trong suốt, phôi chui ra ngoài, giai đoạn này tương ứng với ngày thứ 9-11 sau khi thụ tinh. Thông thường phôi ở ngày thứ 5, 6 có 16-32 hoặc 64 phôi bào trở nên được gọi là phôi dâu (morulla) vì trông nó nổi lên giống hệt quả dâu khi nhìn qua kính hiển vi. Giai đoạn giữa và cuối của phôi dâu khó xác định được số phôi bào đã phân chia. Những tế bào phôi sẽ tiết ra một ít dịch và hình thành nên một xoang gọi là xoang phôi (blastococla), xoang này dần lớn lên và có thể nhận biết qua kính hiển vi. Phôi khi đã hình thành xoang gọi là phôi nang (blastocyst). Xoang phôi lớnn dần lên đẩy khối tế bào về một cực, khối tế bào này gọi là đĩa phôi hay mầm phôi. Mầm phôi sau này biệt hóa hình thành nên các cơ quan bộ phận của cơ thể. Khối tế bào bao bọc mầm phôi và thành vách của xoang phôi gọi là lớp màng nuôi hay dưỡng bào (trophoblast) sau hình thành nên hệ thống nhau thai. Dựa vào các đặc điểm trên cùng kết quả của các nghiên cứu, phôi thường được thu vào ngày thứ 7 sau khi phối giống hoặc thụ tinh do phôi ở thời điểm này là phôi dâu, phôi nang, là loại phôi tốt nhất cho đông lạnh cũng như cấy truyền. 2.7. TẠO PHÔI BẰNG TẾ BÀO TRỨNG THU TỪ BÒ SỐNG Công nghệ cấy truyền phôi (CTP) truyền thống ngày nay đã có một kết quả tương đối ổn địnhvà nhiều kỹ thuật viên CTP đã có trên 20 năm kinh nghiệm trong một công nghệ đã chín muồi. Năm 1999, hơn 500.000 phôi đã được tạo ra và khoảng 440.000 phôi đã được cấy cho con nhận, trong đó khoảng 31.000 phôi thụ tinh ống nghiệm đã được cấy cho con nhận. Ở giai đoạn đầu của kỹ thuật tạo phôi trong ống nghiệm, nguồn tế bào trứng được thu từ buồng trứng lấy ở lò mổ. Từ năm 1988, tế bào trứng đầu tiên được Pieterse và cs [54]thu từ gia súc sống với sự trợ giúp của hệ thống siêu âm qua âm đạo (OPU). Siêu âm hút trứng qua âm đạo là một kỹ thuật thu tế bào tứng chưa thành thục từ con cho còn sống. Phương pháp này được xây dựng trên cơ sở phương pháp hút trứng với sự trợ giúp của máy siêu âm dùng trong các kỹ thuật hỗ trợ sinh sản của người. Phương pháp OPU được sử dụng để khai thác trứng từ các cá thể có tiềm năng di truyền cao, kết hợp thụ tinh ống nghiệm cho phép tạo ra các phôi có chất lượng tốt bằng việc chủ động dùng các nguồn tinh đực giống. Các phôi này được cấy vào các bò nhận đồng pha để sinh ra các bê con có tiềm năng năng suất cao. Các thí nghiệm về thu tế bào trứng bò bằng phương pháp dùng siêu âm được tiến hành đầu tiên bởi Callesen và cs (1987)[24]; sau đó Pieterse và cs. (1988)[54] là những người đầu tiên sử dụng phương pháp OPU như là một phương pháp khai thác trứng một cách hiệu quả và đều đặn trên đối tượng bò. Phương pháp OPU đòi hỏi phải có các thiết bị và dụng cụ chuyên dụng như máy siêu âm, đầu dò, kim chọc hút cũng như tay nghề cao của người thao tác. Phương pháp OPU cho phép hút các trứng trong nang của buồng trứng từ con vật đang sống. Con vật đưa vào khai thác được đứng trong giá cố định và người thao tác một tay đưa vào trực tràng kiểm soát buồng trứng, áp buồng trứng vào đầu dò, tay kia điều kiển kim hút. Khi quan sát thấy nang trứng xuất hiện trên màn hình của máy siêu âm, một tay (thông qua trực tràng) cố định buồng trứng áp sát vào đầu dò và tay kia ấn nhẹ kim chọc hút vào lòng nang trứng. Thao tác này diễn ra nhẹ nhàng và hình ảnh kim hút chọc vào nang sẽ hiện rõ trên màn hình máy siêu âm giúp người thao tác điều chỉnh chính xác và nhịp nhàng kim hút. Những hình ảnh lần lượt hiện ra trên màn hình máy siêu âm giúp chúng ta biết được hướng đi của kim, vị trí nang trứng và vị trí kim chọc vào nang. Phương pháp khai thác trứng bò từ buồng trứng (phương pháp in-vitro và phương pháp OPU) phục vụ công nghệ phôi cho phép cung cấp một số lượng lớn trứng với chất lượng tốt. Phương pháp thu trứng in-vitro được sử dụng cho các nghiên cứu cơ bản tại hầu hết các phòng thí nghiệm trên thế giới. Phương pháp OPU kết hợp thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi đặc biệt có giá trị trong việc nhân nhanh các cá thể có tiềm năng năng suất cao. Trứng bò sau khi được khai thác từ buồng trứng bò bằng một trong các phương pháp trên , chúng được phân loại và lập tức đưa vào các môi trường nuôi giàu dinh dưỡng. Tạo phôi trong ống nghiệm từ tế bào trứng của những con vật sống là một kỹ thuật linh hoạt bởi vì nó có thể áp dụng cho những con cho ở tất cả các giai đoạn tuổi từ bê 2 tháng tuổi đến những con bò rất già. Nó có thể sử dụng cho những con cạn sữa hay đang vắt sữa và thậm chí ở giai đoạn có chửa đến tháng thứ 3 hay thứ 4. Nó không ảnh hưởng đến trạng thái sinh lý của con cho bởi vì không đòi hỏi sự khích thích của hocmon. 2.8. NUÔI PHÔI TRONG ỐNG NGHIỆM Trong những thập kỷ qua, khả năng nuôi phôi trong ống nghiệm ở giai đoạn đầu của nhiều loài động vật có vú trở thành hiện thực. Từ cuối những năm 1960, các nhà nghiên cứu đã sử dụng nhiều loại môi trường khác nhau để nuôi phôi ở giai đoạn đầu và hầu hết các loại môi trường đều dựa vào các chất có trong ống dẫn trứng và dựa vào kiến thức về trao đổi chất của phôi. Tế bào của ống dẫn trứng được sử dụng thành công đầu tiên trong các hệ thống nuôi kết hợp ở cừu và bò, việc sử dụng hệ thống nuôi các tế bào ống dẫn trứng ở cừu đã đặt những nền móng quan trọng cho việc nuôi trong ống nghiệm . Tuy nhiên, sau đó người ta đã biết rõ rằng không chỉ các tế bào ống dẫn trứng mà còn nhiều loại tế bào sô ma khác cũng có khả năng cung cấp môi trường phù hợp để phôi vật nuôi có thể phát triển. Các môi trường nuôi thông thường là những môi trường được phát triển để nuôi tế bào. Việc sử dụng các loại môi trường này để nuôi phôi vật nuôi cho kết quả không thống nhất. Các nhà khoa học đã báo cáo rằng hầu hết phôi nuôi bằng những môi trường này thường dừng phát triển ở giai đoạn 8 tế bào. Ngoài ra chỉ số ít phôi nuôi lâu hơn cho thấy sự phân chia bình thường và hầu hết không phát triển khi cấy cho con nhận. Khi nuôi phôi ở giai đoạn đầu, nhiều công thức dựa trên dung dịch muối Krebs ringer Bicarbonate (KRB) đã sử dụng pyruvate, glucose và lactate làm nguồn năng lượng. Những môi trường này còn được bổ sung thêm một nguồn protein như huyết thanh thai bê (FCS) hay albumin huyết thanh bò (BSA). Ở hầu hết các phòng thí nghiệm, phôi dâu và phôi nang động vật có vú có thể thu được bằng sự nuôi trứng thành thục trong ống nghiệm/thụ tinh ống nghiệm tế bào trứng. Tuy nhiên dừng phát triển ở giai đoạn trước hay sau 8 tế bào khi sử dụng các loại môi trường nuôi chỉ bổ sung thêm huyết thanh bê đã đưa các nhà khoa học phải nghĩ đến các môi trường nuôi thay thế có sử dụng tế bào Cumulus hay tế bào ống dẫn trứng. Một kỹ thuật nuôi thay thế khác nữa là sử dụng môi trường nuôi không bổ sung thêm các loại tế bào, điển hình là môi trường nuôi cấy mô TCM-199 có bổ sung thêm huyết thanh. 2.9. ĐÔNG LẠNH PHÔI Đông lạnh phôi là quá trình chuyển phôi từ trạng thái sinh lý bình thường (trong cơ thể mẹ hoặc ngoài cơ thể mẹ ở nhiệt độ 37oC) sang trạng thái tiềm sinh đông lạnh để cất giữ, bảo quản ở nhiệt độ sâu -196oC. Phôi đông lạnh vẫn có thể sống, phát triển bình thường sau giải đông và đem cấy cho con cái nhận phôi động dục đồng pha hoặc sử dụng trong các kỹ thuật sinh sản khác. Nhờ có kỹ thuật đông lạnh và bảo quản mà phôi động vật có thể thương mại hoá trong nước cũng như trên phạm vi quốc tế một cách dễ dàng vì không phải vận chuyển gia súc sống, tránh được sự thay đổi đột ngột bất lợi đối với gia súc cũng như tránh được sự lây truyền dịch bệnh giữa các vùng lãnh thổ. Ngoài ra, kỹ thuật đông lạnh và bảo quảm phôi còn là nền tảng cho việc duy trì ngân hàng phôi đông lạnh của những động vật có nguy cơ bị diệt vong. Thành công đầu tiên của việc đông lạnh phôi động vật có vú được báo cáo ở chuột (Whittingham (1972)[67]). Năm 1973, con bê đầu tiên ra đời bằng phôi đông lạnh - giải đông (Wilmut và Rowson [70]). Ở Việt Nam, nghiên cứu đông lạnh phôi bò đã được nghiên cứu từ năm 1984. Phương pháp đông lạnh nhanh (tốc độ hạ nhiệt 12oC/phút) sau khi khử nước bộ phận ở nhiệt độ hiện trường trên phôi bò đã thành công với 63,4% (33/52) phôi phát triển trong ống nghiệm sau 48 giờ và 44,2% (23/52) phôi nang thoát màng và tỷ lệ có chửa sau khi cấy phôi đông lạnh - giải đông là 33,3% (7/21) (Bùi Xuân Nguyên và cs (1984)[21]). Năm 2003, Lưu Công Khánh và cs [3] đã báo cáo thành công việc nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng glycerol. Năm 1990, bê Charolais đầu tiên được sinh ra từ phôi đông lạnh nhập khẩu. Đến nay đã có hàng trăm bê hướng sữa được sinh ra do cấy phôi đông lạnh trong nước cũng như phôi đông lạnh nhập khẩu. 2.9.1.Cơ chế đông lạnh phôi Khi hạ nhiệt độ, lúc xuất hiện tinh thể nước đầu tiên là bắt đầu thay đổi giai đoạn đông băng. Điều này chỉ có thể xảy ra khi nhiệt độ thấp hơn hoặc bằng độ hạ băng điểm của dung dịch. Theo định luật Loi Raoult, độ hạ băng điểm của dung dịch phụ thuộc vào nồng độ các chất hoà tan. Bên trong tế bào chứa hơn 80% nước, nồng độ nước này cao hơn bên ngoài tế bào. Vì vậy, sự thay đổi giai đoạn đông lạnh nội bào xảy ra ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ bên ngoài. Trong quá trình đông lạnh, những tinh thể nước được tạo thành trước tiên ở môi trường bên ngoài tế bào, làm tăng nồng độ chất hoà tan nhanh chóng. Đáp lại với sự tăng áp suất thẩm thấu này, nước sẽ đi ra ngoài tế bào, làm giảm thể tích tế bào. Mức độ mất nước tế bào phụ thuộc vào tốc độ đông lạnh (hạ nhiệt nhanh hay chậm), tốc độ này phải ở trên tốc độ giới hạn, mà tốc độ giới hạn lại thay đổi theo loại tế bào, khả năng tạo băng đá nội bào tăng lên cũng gây ra những tổn hại tế bào do đông lạnh hay giải đông. Tốc độ đông lạnh ở dưới tốc độ giới hạn thì sự sống của tế bào gắn liền với sự biến đổi các tính chất của dung dịch, trong đó nồng độ các chất hoà tan cũng đồng thời tăng lên ở bên ngoài tế bào. Trong môi trường huyền phù (vừa lỏng vừa tinh thể) nước tạo thành băng đá một cách từ từ và bên trong tế bào sẽ mất nước để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu với bên ngoài tế bào. Như vậy, sự hiện diện của tinh thể nước đá nội bào và những hiệu ứng của dung dịch là hai yếu tố chủ yếu chuyển biến theo tốc độ đông lạnh để quyết định khả năng sống sót của tế bào. Những hiện tượng vậy lý chính xảy ra trong quá trình đông lạnh tế bào như sau:khi nhiệt độ hạ xuống -5oC, tế bào và môi trường xung quanh nó vẫn chưa đóng băng bởi vì nhiệt độ lạnh chưa tạo đá (supercooling) và vì sự giảm điểm đông do sự có mặt của chất bảo vệ lạnh. Tinh thể sẽ hình thành ở bên ngoài tế bào ở nhiệt độ -5oC (do ngẫu nhiên hay do tạo mầm nước – seeding), nhưng các chất bên trong tế bào vẫn chưa đông lạnh và nhiệt độ chưa tạo đá, có thể màng tinh trùng ngăn cản sự lan rộng tinh thể nước vào trong tế bào chất. Theo định nghĩa, nước ở nhiệt độ lạnh chưa tạo đá bên trong tế bào có nồng độ hoá học cao hơn so với nước trong dung dịch được đông lạnh một phần bên ngoài tế bào, và đáp lại sự chênh lệch này nước sẽ đi ra ngoài tế bào và đông lạnh bên ngoài tế bào. Các hiện tượng vật lý xảy ra tiếp theo bên trong tế bào phụ thuộc vào tốc độ làm lạnh. Nếu nhiệt độ giảm chậm, tế bào có khả năng mất nước nhanh do ngoại thẩm thấu làm tăng nồng độ các chất nội bào đủ để loại bỏ nhiệt độ lạnh chưa tạo đá và duy trì tiềm năng các chất hoá học nội bào cân bằng với tiềm năng các chất hoá học ngoại bào . Kết quả là tế bào mất nước và không đông lạnh bên trong tế bào. Nhưng nếu tế bào được đông lạnh quá nhanh, nó không có khả năng mất nước nhanh để duy trì cân bằng và vì vậy nhiệt độ lạnh chưa tạo đá tăng lên và cuối cùng đạt được sự cân bằng bằng việc đông lạnh nội bào. Ở các loài động vật có vú, tuy đã có những phương pháp đông lạnh và giải đông thích hợp với phôi của mỗi loài, nhưng chúng đều phải chịu đựng những thay đổi như: sự bổ sung chất bảo vệ lạnh sinh học trong quá trình đông lạnh phôi còn gọi là chất bảo vệ sinh học lạnh và phân tách chúng ra trong quá trình giải đông, sự thay đổi về giai đoạn của môi trường ở nhiệt độ tạo tinh thể nước đá bằng cảm ứng, tốc độ đông lạnh, sự mất nước trong quá trình đông lạnh. 2.9.2. Những chất bảo vệ sinh học lạnh thông dụng Phôi chỉ sống sót khi người ta bổ sung một dung môi hữu cơ hay còn gọi là chất bảo vệ sinh học lạnh vào môi trường huyền phù để đông lạnh. Các chất thường được sử dụng là: glycol, dimethysufoxide (DMSO) và một số glycol (ethylen glycol, propylen glycol…) trong đó glycol là chất bảo vệ sinh học lạnh được sử dụng phổ biến trên nhiều loài động vật và có hiệu quả cao nhất. Glycerol có phân tử lượng 92, có độc tính nhẹ , có tác dụng như một chất chống đông, có khả năng thẩm thấu cao qua màng tế bào, hoà tan trong nước và cồn. Trong quá trình cân bằng, glycerolxâm nhập vào bên trong tế bào làm cho tế bào không bị giảm dung tích. Khi vào bên trong tế bào, các phân tử glycerol nằm xen kẽ với các phân tử nước, nên đóng băng ở dạng nhỏ, loại trừ được sự giãn nở của phân tử nước có kích thước lớn hơn, ngăn cản được sự phá vỡ màng tế bào. Vì vậy mà glycerol giữ được sự ổn định về nồng độ các chất hoà tan, không làm thay đổi áp suất thẩm thấu và hạn chế sự phá huỷ protein của tế bào trong quá trình đông lạnh. Để phôi có thể cân bằng với glycerol, người ta chuyển phôi vào dung dịch PBS có nồng độ glycerol tăng dần trong một khoảng thời gian nhất định để thực hiện rút nước nội bào và thay thế bằng glycerol. Điều quan trọng nhất là thời gian và nồng độ thích hợp để ngâm phôi, điều này phụ thuộc vào phôi của mỗi loài động vật và trạng thái phát triển của phôi. Năm 1977, Bilton và cs [18] đã sử dụng glycerol nồng độ 1,4M thu được phôi bò có sức sống cao khi đông lạnh với tốc độ -0,3oC/phút đến -30oC hoặc -35oC sau đó bảo quản phôi trong nitơ lỏng -196oC. Renard và cs (1982)[56] đã cân bằng sáu bước với nồng độ glycerol ở mỗi bước là 0,25M; 0,5M; 0,75M; 1M; 1,25M và 1,5M cách nhau 10 phút và giữ phôi ở nồng độ cuối cùng. Có thể thay thế Glycerol bằng Ethylene glycol, có phân tử lượng thấp hơn (62,07), chất này tương tự như glycerol nhưng thời gian ngâm phôi bò ngắn hơn. Ưu điểm của việc dùng ethylene glycol trong đông lạnh phôi bò là khi giải đông không cần rút chất này ra khỏi phôi theo các bước mà nó tự thẩm xuất ra khỏi tế bào, vì vậy người ta có thể cấy phôi ngay được. Điều cần lưu ý là Ethylene glycol rất độc cho phôi do đó phải thận trọng khi sử dụng. Hasler và cs (1997)[37] đã đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm trong dung dịch PBS có nồng độ 1,4M glycerol hay 1,5 ethylene glycol. Sau khi giải đông và nuôi 72 giờ, tỷ lệ phôi thoát màng tương ứng là 69,2% và 62,4%. Dimethylsulfoxide (DMSO) cũng là chất bảo vệ lạnh có phân tử lượng thấp (78,13). Chất này đầu tiên được Wilmut và Rowson (1973)[70] sử dụng để đông lạnh phôi bò. Tuy nhiên, nhiều tác giả nhận thấy rằng, có sự khác nhau về khả năng thẩm thấu của chất bảo vệ lạnh giữa phôi của các loài và đối với phôi bò thì glycerol có khả thẩm thấu tốt hơn DMSO. Vì thế đến cuối những năm 1970, glycerol được dùng nhiều hơn DMSO trong việc đông lạnh phôi bò. Đường (sucrose, lactose) và protein (bovine serum albumin, hyaluronic acid) cũng được dùng như những chất bảo vệ lạnh nhưng chúng thường được dùng với các chất bảo vệ lạnh khác. Các phòng thí nghiệm trên thế giới có thể sử dụng một chất bảo vệ lạnh duy nhất hoặc kết hợp nhiều chất bảo vệ lạnh như dimethy sulphoside, acetamide, propylen glycol, glycerol, ethylene glycol, polyethylene glycol, BSA, sucrose, trehalose và glucose với các nồng độ khác nhau để đông lạnh phôi động vật có vú. Theo Bui Xuan Nguyen (1997)[22], việc sử dụng các chất bảo vệ lạnh và khả năng sống của phôi đông lạnh có sự khác nhau giữa các loài. Đối với thỏ, khả năng sống của phôi đông lạnh trong hỗn hợp sucrose và glyceorol hay DMSO là rất thấp (0-5%) so với đông lạnh bằng propaneol (92%). Đối với phôi dâu - phôi nang bò, sử dụng chất bảo vệ lạnh propaneol tốt hơn so với sử dụng glycerol (75% so với 0%). Trong khi đó phôi bò được đông lạnh trong hỗn hợp bảo vệ lạnh sucrose-propaneol-glycerol có tỷ lệ sống cao hơn so với hỗn hợp sucrose-propaneol (65% so với 0%). Sự khác biệt về khả năng sống của phôi khi sử dụng các chất bảo vệ lạnh khác nhau giữa các loài khác nhau vẫn chưa được làm rõ. 2.9.3. Phương pháp đông lạnh Với quan điểm sinh học lạnh tế bào các tế bào phôi không khác biệt với các loại tế bào sống khác. Điều quan trọng nhất của quá trình đông lạnh là loại bỏ nước nội bào trước khi chúng được đông lạnh. Đã có nhiều nghiên cứu về kỹ thuật đông lạnh bao gồm chất bảo vệ lạnh và nồng độ sử dụng của chúng cũng như độ hạ nhiệt độ, nhiệt độ tạo đá và nhiệt độ chuyển phôi sang nitơ lỏng cũng như nhiệt độ và tốc độ giải đông. Nhìn chung, đông lạnh phôi có thể chia làm hai phương pháp: đông lạnh chậm và đông lạnh nhanh. Đông lạnh chậm là phương pháp mà ở đó quá trình làm mất nước nội bào và việc hạ nhiệt độ có kiểm soát xảy ra chậm trước khi phôi được chuyển vào bảo quản trong nitơ lỏng. Đối với phương pháp đông lạnh chậm, phôi được chuyển vào môi trường có chứa chất bảo vệ lạnh theo chiều bước với nồng độ chất bảo vệ lạnh tăng dần hay chuyển thẳng vào môi trường đông lạnh có nồng độ chất bảo vệ lạnh thích hợp. Thời gian cân bằng trong phương pháp này thường 10-30 phút. Sau khi cân bằng phôi được đông lạnh với tốc độ hạ nhiệt 0,3oC/phút xuống nhiệt độ -32oC hay -35oC và từ nhiệt độ này phôi được chuyển thẳng vào nitơ lỏng (-196oC). Ví dụ chuyển phôi vào dung dịch glycerol 6 bước với nồng độ tăng dần 0,25M; 0,5M; 0,75M; 1M; 1,25M và 1,5M hay 3 bước 0.47M; 0.93M; 1,4M glycerol và thời gian cân bằng ở mỗi bước khoảng 5 phút hay 1 bước vào dung dịch 1,8 Ethylene glycol và cân bằng 15 phút. Sau đó cọng rạ chứa phôi được chuyển thẳng vào máy đông lạnh và việc tạo đá được thực hiện ở nhiệt độ -3oC đến -7oC. Tạo mầm tinh thể nước (seeding) là thuật ngữ được để mô tả việc hình thành tinh thể đá có kiểm soát ở nhiệt độ lạnh, bằng cách chạm panh đã được nhúng trước vào nitơ lỏng vào thành của cọng rạ. Ngay sau khi tạo mầm tinh thể đá, đá sẽ được hình thành nhanh chóng trong toàn bộ cọng rạ chứa phôi và việc hạ nhiệt độ vẫn được thực hiện với tốc độ 0,3oC/phút xuống -35oC, từ nhiệt độ này phôi được chuyển thẳng vào nitơ lỏng để bảo quản. Phương pháp đông lạnh nhanh là những phương pháp đông lạnh mà thời gian từ lúc khử nước nội bào đến lúc kết thúc quá trình đông lạnh xảy ra rất nhanh. Phôi sau phi đã được khử nước nội bào được chuyển thẳng vào nitơ lỏng mà không cần phải sử dụng máy đông lạnh có kiểm soát nhiệt đã được lập trình sẵn. Trong gần 20 năm cuối thế kỷ XX, cùng với sự phát triển của công nghệ sinh học và công nghệ thông tin đã góp phần hiện đại hoá kỹ thuật đông lạnh bằng chương trình hoá các giai đoạn đông lạnh, nhiều loại thiết bị tự động đã được chế tạo. Hiện nay có nhiều loại máy đông lạnh phôi trong đó có hai loại được sử dụng phổ biến nhất là: Loại sử dụng rượu methanol đựng trong hộp làm lạnh và nối với hệ thống làm lạnh như Biocool của Mỹ. Loại làm lạnh bằng nitơ lỏng trong một hộp nối liền với bộ phận điều kiển máy vi tính như Freezer control của Úc. Các loại máy đều được cài đặt chương trình đông lạnh khác nhau để phù hợp với phôi của từng loại động vật có vú. Nguyên và cs (1984)[21] đã đề xuất một khả năng đông lạnh nhanh hay siêu nhanh trên cơ sở thay thế việc mất nước tăng dần bởi nhiệt độ thấp bằng mất nước bộ phận nhanh ở nhiệt độ phòng. Dựa trên nguyên tắc này, một phương pháp đông lạnh nhanh, đơn giản trong nitơ lỏng được thực hiện bằng cách làm mất nước một phần (1-2 phút) ở nhiệt độ phòng và cân bằng ở nhiệt độ -30oC đã được công bố. Một trong những phương pháp đông lạnh nhanh được ngiên cứu rộng rãi hiện nay là phương pháp thuỷ tinh hoá (vitrification). Thuỷ tinh hóa là thuật ngữ chỉ quá trình đông cứng mà không tạo thành tinh thể đá, không có sự cô đọng các chất hoà tan như trong các phương pháp đông lạnh truyền thống, có sự tăng đột ngột sự đặc quánh (viscovity) trong môi trường lưu phôi, tạo nên chất rắn dạng thuỷ tinh. Ưu điểm của phương pháp này là thời gian đông lạnh nhanh, không cần thiết bị đông lạnh đắt tiền và điều quan trọng là tỷ lệ phôi sống sau đông lạnh và giải đông cao. 2.9.4. Giải đông phôi Tế bào phôi đông lạnh được bảo quản trong nitơ lỏng -196oC khi đem ra sử dụng tế bào phôi phải được phục hồi sự sống trong điều kiện bình thường ở trạng thái ban đầu có nghĩa là không có tinh thể nước đá, không có chất bảo vệ lạnh ở trong và ngoài tế bào phôi; tế bào phôi tiếp tục sống và phát triển trong điều kiện mới. Nhìn chung tế bào phôi từ trạng thái sinh học bình thường chuyển sang trạng thái tiềm sinh học lạnh -196oC rồi lại trở về trạng thái sinh học bình thường của môi trường, sức sống của tế bào phôi có thể bị giảm đi rất nhiều, số tế bào phôi chết có thể tăng lên. Về nguyên tắc, giải đông phôi và tách chất bảo vệ lạnh sinh học phụ thuộc vào phương pháp đông lạnh và bổ sung chất bảo vệ lạnh. Trong các quy trình pha loãng chất bảo vệ lạnh thông thường, phôi được tiếp xúc với nồng độ chất bảo vệ lạnh giảm dần. Quy trình này đòi hỏi phải sử dụng kính hiển vi và thao tác trong phòng thí nghiệm. Đầu những năm 1980, một số tác giả đã nghiên cứu phương pháp giải đông mới thay thế cho phương pháp giải đông nhiều bước (Renard và cs (1987)[57]). Ở phương pháp này, phôi bò đông lạnh-giải đông được chuyển từ môi trường có chất bảo vệ lạnh sang môi trường ưu trương các chất dinh dưỡng không thẩm thấu như sucrose. Khi quá trình này xảy ra, các chất bảo vệ lạnh nội bào thẩm thấu ra ngoài để duy trì sự cân bằng áp suất thẩm thấu. Khi phôi không còn chứa các chất bảo vệ lạnh nữa, nó co lại tới một thể tích do áp suất thẩm thấu của dung dịch sucrose và phôi nhanh chóng được pha loãng trong môi trường đẳng trương. 2.10. ẢNH HƯỞNG CỦA MÙA VỤ ĐẾN KHẢ NĂNG SINH SẢN CỦA BÒ Việt Nam thuộc khí hậu nhiệt đới gió mùa, nhiệt độ không khí bình quân trong năm ở miền Bắc khoảng 23,5oC, lượng mưa trung bình khoảng 1500mm, lượng mưa này thường tập chung vào mùa nóng. Yếu tố này quyết định đến sự phát triển các loại cỏ trong năm. Cỏ thường sinh trưởng mạnh từ đầu mùa mưa (tháng 4, 5) do vậy trong một năm có 6-7 tháng bò có nhiều cỏ ăn và 5-6 tháng là thiếu cỏ trầm trọng. Đồng thời nhân dân ta chủ yếu chăn nuôi theo hướng nhỏ lẻ, tận dụng, rất ít cơ sở chăn nuôi theo hướng công nghiệp, bán công nghiệp, dự trữ và chế biến chủ động thức ăn cho bò. Vì vậy hàng năm vào thời gian từ tháng 11 năm trước đến tháng 3 năm sau bò, bê đang lớn hầu như ngừng pháp triển, gầy sút, ảnh hưởng rõ rệt tới khả năng sinh sản, sức sản xuất. Đồng thời cùng với việc sử dụng đất không hợp lý làm cho đất ngày một xấu đi, trong đất thiếu canxi, photpho do vậy đồng cỏ chủ yếu gồm các loài hoà thảo, rất ít loài họ đậu. Những yếu tố khí hậu quyết định đến thảm cỏ, ảnh hưởng rõ rệt đến sinh trưởng và sinh sản của gia súc nhanh hay chậm, nhất là biên độ thay đổi nhiệt giữa các tháng cao hơn, ít có vùng đất tốt hơn nên phần lớn đàn bò của miền Bắc có tầm vóc nhỏ hơn các miền khác trong cả nước. Sau vụ khô hanh đến vụ cỏ, thể trạng của Bò dần dần được hồi phục, nhưng phải vào nửa cuối vụ cỏ nghĩa là trong vòng 3 tháng, thể trạng bò được bình phục rồi lại tiếp._.ng là 96,10%.Theo Sang Runzi và cs (1996)[58], tỷ lệ phôi sống sau giải đông đạt 76,20%, trong đó tỷ lệ phôi nang sống đạt 81,80% còn phôi dâu là 77,40% ; phôi loại A đạt tỷ lệ sống 91%, phôi loại B đạt tỷ lệ sống 63,30%. Có nhiều ý kiến khác nhau về sự ảnh hưởng của giai đoạn phát triển của phôi đến tỷ lệ sống sau giải đông. Những nghiên cứu trên phôi chuột từ 16 tế bào cho đến phôi nang đông lạnh ở -196oC của Whittingham (1972)[67] và Willadsen (1980)[68] đã làm cơ sở ban đầu để nghiên cứu ứng dụng ở các loài gia súc khác. Phôi bò ở giai đoạn 8-16 tế bào (Wilmuts và cs (1992)[71]) và 16-32 tế bào (Trouson và cs(1976)[64]), giảm sức sống ở 0oC trong khi ở giai đoạn phát triển cao hơn – phôi nang thì ở 0oC duy trì được 2 ngày (Trouson và cs (1980)[65] ; Bon Durant và cs(1982)[20]). Niemann và cs (1982)[52] nhận thấy rằng kỹ thuật đông lạnh nhanh thì kết quả phôi ở 8 ngày tuổi tốt hơn so với phôi ở 7 ngày tuổi. Seidel và cs (1983)[61] cũng nhận xét rằng tỷ lệ sống của phôi nang cao hơn của phôi dâu. Còn theo Sang Runzi và cs (1996)[58] lại cho rằng sử dụng phôi dâu và phôi nang để đông lạnh thì tỷ lệ sống sau đông lạnh-giải đông là như nhau. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh Trong khuôn khổ đề tài chúng tôi nghiên cứu ảnh hưởng của ba phương pháp đông lạnh tới chất lượng phôi sau đông lạnh. Kết quả được trình bày qua bảng 4.15. Sau quá trình đông lạnh-giải đông chúng tôi nhận thấy rằng có một số lượng phôi giảm chất lượng từ loại A xuống loại B hoặc C, từ loại B xuống loại C. Cụ thể như sau : Phương pháp đông lạnh ba bước: trước đông lạnh số phôi loại A là 48 chiếm 50,53% còn số phôi loại B là 47 chiếm 49,47%. Sau đông lạnh, tỷ lệ phôi loại A còn lại là 41,24% và tỷ lệ phôi loại B là 28,33% và xuất hiện 30,43% phôi loại C, đây là những phôi có chất lượng thấp hoặc phôi đã chết. Bảng 4.15. Ảnh hưởng của các phương pháp đông lạnh đến chất lượng phôi khi giải đông Phương pháp đông lạnh phôi n Chất lượng phôi trước đông lạnh Chất lượng phôi sau giải đông Loại A Loại B Loại A Loại B Loại C n (%) n (%) n (% ± SE) n (% ± SE) n (% ± SE) Ba bước 95 48 50,53 47 49,47 40 41,24 ± 0,32 27 28,33 ± 0,22 28 30,43 ± 0,61 Một bước 90 54 60 36 40 47 52,51 ± 1,02 25 26,78 ± 0,13 18 20,71 ± 0,43 Thuỷ tinh hoá 106 48 45,28 58 54,72 35 33,22 ± 0,46 38 35,92 ± 0,75 33 30,86 ± 0,86 Phương pháp đông lạnh một bước : trước đông lạnh tỷ lệ phôi loại A là 60% và phôi loại B là 40%, tuy nhiên sau quá trình đông lạnh và giải đông tỷ lệ phôi loại A, B giảm xuống chỉ còn lần lượt là 52,51% và 26,78% ; xuất hiện 20,71% phôi loại C. Phương pháp đông lạnh thuỷ tinh hoá: có 45,28% phôi loại A và 54,72% phôi loại B trước đông lạnh nhưng sau tác động của quá trình đông lạnh-giải đông tỷ lệ phôi loại A và B giảm xuống chỉ còn tương ứng là 33,22% và 35,92%, xuất hiện 30,86% phôi loại C. Nhìn chung cả ba phương pháp đều cho kết quả phôi loại A và B khá cao, tỷ lệ phôi thoái hoá và chết thấp. Tuy nhiên tỷ lệ này ở mỗi phương pháp là khác nhau, sở dĩ như vậy là ở mỗi phương pháp đều có những nhược điểm khó khăn trong quá trình tiến hành. Với phương pháp dông lạnh ba bước, tỷ lệ phôi kém chất lượng và chết chiếm tỷ lệ 30,43%. Để lý giải điều này ta xét đến kỹ thuật đông lạnh. Khi đưa phôi vào cân bằng với chất bảo vệ lạnh ở phương pháp này, với mỗi bước chúng tôi phải lưu phôi trong 5 phút. Tức là mỗi phôi phải trải qua 15 phút cân bằng. Trên thực tế nếu cân bằng riêng rẽ từng phôi một thì tốn rất nhiều thời gian. Vì vậy chúng tôi tiến hành xen kẽ tức là khi đưa phôi thứ nhất vào môi trường được khoảng 3 phút chúng tôi đưa phôi thứ hai vào. Khi phôi thứ hai lưu được 2 phút chúng tôi đưa tiếp phôi thứ ba vào. Khi đủ 5 phút chúng tôi chuyển phôi thứ nhất sang bước tiếp theo. Cứ như vậy cân bằng đến phôi cuối cùng. Quá trình cân bằng như vậy không tránh khỏi một số sai sót, phôi lưu chưa đủ thời gian cân bằng đã chuyển sang bước tiếp theo chính vì vậy không đảm bảo yêu cầu kỹ thuật làm cho sức sống của phôi giảm thậm chí thoái hoá hoặc chết phôi. Phương pháp đông lạnh một bước: Tỷ lệ phôi loại C là 20,71%. Có nhiều nguyên nhân dẫn đến thoái hoá hoặc chết phôi nhưng nguyên nhân chính là do Ethylen glycol rất độc cho tế bào. Nếu ở môi trường đông lạnh thì ít ảnh hưởng nhưng trong điều kiện phòng nếu thao tác không nhanh sẽ dẫn đến hiện tượng chết phôi. Ở phương pháp này tỷ lệ phôi loại C thấp hơn cả bởi vì quá trình cân bằng phôi diễn ra một bước nên ít xảy ra sai sót. Phương pháp thỷ tinh hoá : Phương pháp này đòi hỏi trình độ kỹ thuật kinh nghiệm cao, thao tác nhanh chính xác do thời gian cân bằng tính từ khi chuyển vào môi trường thuỷ tinh hoá V1,V2,V3 đến khi nạp phôi vào cọng rạ không quá một phút. Trên thực tế trong quá trình cân bằng không tránh khỏi những sai sót dẫn đến chất lượng phôi bị ảnh hưởng. Ba phương pháp đông lạnh và giải đông đều cho kết quả phôi có khả năng nuôi cấy cao, trong đó phương pháp thuỷ tinh thể là phương pháp mới được nghiên cứu trong những năm gần đây xong kết quả cũng rất khả quan. Đồng thời phương pháp này có những ưu điểm không đòi hỏi nhiều trang thiết bị máy móc, thời gian đông lạnh-giải đông nhanh, dễ thực hiện ở cơ sở tuy nhiên đòi hỏi kỹ thuật viên có trình độ kỹ thuật cao. Nếu đáp ứng được yêu cầu này thì đông lạnh phôi bò bằng phương pháp thuỷ hoá sẽ rất khả thi để ứng dụng vào thực tế. 4.6. KẾT QUẢ PHÁT TRIỂN CỦA PHÔI SAU GIẢI ĐÔNG. Để đánh giá đúng kết quả và hiệu quả của các phương pháp đông lạnh và giải đông phải dựa vào kết quả tỷ lệ bò có chửa sau khi cấy phôi đông lạnh, xong do điều kiện không cho phép nên thay vào đó chúng tôi đánh giá sự phát triển của phôi sau giải đông. Để đánh giá sự phát triển của phôi, sau giải đông phôi được nuôi 48 giờ. Sau đó quan sát dưới kính hiển vi soi nổi để đánh giá, kết quả được trình bày ở bảng 4.16 và biểu đồ 4.4. Trong tổng số 95 phôi đông lạnh bằng Glycerol khi nuôi cấy có 71 phôi phát triển (75,34%) trong đó có 66 phôi đã thoát màng (70,16%). Còn trong 90 phôi đông lạnh bằng Ethylen glycol có 73 phôi phát triển (80,63%) và 69 phôi đã thoát màng (76,58%). Và 106 phôi đông lạnh bằng phương pháp thuỷ tinh hoá có 75 phôi phát triển (70,24%), 71 phôi thoát màng (66,48%). Tỷ lệ phôi phát triển và thoát màng khi đông lạnh bằng Ethylen glycol và Glycerol có cao hơn khi đông lạnh theo phương pháp thuỷ tinh hoá, sự khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Tỷ lệ phôi phát triển và thoát màng ở nhóm phôi đông lạnh bằng Ethylen glycol có chiều hướng cao hơn nhóm đông lạnh bằng Glycerol, nhưng sự khác biệt này không có ý nghĩa thống kê. Bảng 4.16. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh tới sự phát triển của phôi sau đông lạnh-giải đông Phương pháp đông lạnh phôi n Phôi phát triển Phôi thoát màng n % ± SE n % ± SE Ba bước 95 71 75,34 ± 0,16 a 66 70,16 ± 0,64 a Một bước 90 73 80,63 ± 0,89 a 69 76,58 ± 0,75 a Thuỷ tinh hoá 106 75 70,24 ± 1,15 b 71 66,48 ± 0,24 b Biểu đồ 4.4: Kết quả phát triển của phôi sau giải đông Kết quả trên của chúng tôi không khác nhiều với kết quả của các tác giả khác. Kết quả đông lạnh bằng Glycerol của chúng tôi tương đương của Park và cs (1997)[53] đã thông báo. Theo tác giả này khi nghiên cứu đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm sử dụng chất bảo vệ lạnh là Glycerol 9% trong môi trường PBS và 10% huyết thanh thì tỷ lệ phôi thoát màng là 72,70%. Theo Lưu Công Khánh và cs (2003)[3], khi đông lạnh phôi bò in-vivo với 10% Glycerol tỷ lệ phôi sống sau giải đông là 80,95%. Hasler và cs (1997)[37] đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm với chất bảo vệ lạnh là 10% Glycerol trong môi trường PBS, sau giải đông và nuôi cấy in-vitro 24 giờ có 78,80% số phôi hồi phục và phát triển trong đó có 69,20% phôi thoát màng. Khi tác giả này sử dụng 1,5M Ethylen glycol trong môi trường PBS để đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm thì tỷ lệ phôi thoát màng là 62,40% thấp hơn khi sử dụng 10% Glycerol. Theo Lazar và cs (2000)[43] đã thông báo, đông lạnh phôi bò tạo ra trong ống nghiệm bằng phương pháp thuỷ tinh hoá, tỷ lệ phôi phát triển đến giai đoạn thoát màng là 69,20%. Tuy nhiên không có báo cáo nào so sánh số lượng lớn phôi bò được đông lạnh bằng Ethylen glycol và Glycerol. Như vậy cả ba phương pháp đều cho tỷ lệ phôi thoát màng cao sau 48 giờ nuôi cấy. Tuy nhiên mỗi phương pháp đều có những ưu nhược điểm của nó. Phương pháp ba bước có ưu điểm là đánh giá được chất lượng phôi sau giải đông. Tuy nhiên nhược điểm là phải chuẩn bị môi trường giải đông, cần tới kính hiển vi soi nổi. Còn phương pháp một bước và thuỷ tinh hoá không cần dung dịch giải đông, không cần kính hiển vi mà có thể cấy ngay cho bò nhận. Nhưng nhược điểm của hai phương pháp này là không đánh giá được chất lượng phôi trước khi cấy. Do vậy phụ thuộc vào điều kiện của từng phòng thí nhiệm, điều kiện sản xuất, hoàn cảnh, trình độ kỹ thuật của từng kỹ thuật viên mà lựa chọn phương pháp đông lạnh cho phù hợp. 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. KẾT LUẬN 5.1.1. Ảnh hưởng của mùa vụ tới kết quả thu tế bào trứng - Vụ Đông Xuân: Tế bào trứng trung bình/buồng trứng là 14,80; tỷ lệ thu tế bào trứng là 81,32%; tỷ lệ tế bào trứng có thể nuôi cấy là 79,83%. - Vụ Hè Thu: Tế bào trứng trung bình/buồng trứng là 13,88; tỷ lệ thu tế bào trứng là 77,38%; tỷ lệ tế bào trứng có thể nuôi cấy là 70,61% Như vậy thu tế bào trứng vào vụ Đông Xuân cho kết quả cao hơn Hè Thu về số lượng cũng như chất lượng tế bào trứng thu được. 5.1.2. Ảnh hưởng của phương pháp khai thác tế bào trứng tới kết quả thu tế bào trứng Phương pháp giải phẫu nang trứng cho kết quả thu tế bào trứng cao hơn phương pháp hút dịch nang trứng về số lượng tế bào trứng thu được (15 và 81,08% so với 14,15 và 78,92%) cũng như về chất lượng tế bào trứng ( tỷ lệ tế bào loại A, B và tỷ lệ tế bào có thể nuôi cấy của 2 phương pháp lần lượt là 40,15%, 27,66%, 81,54% so với 38,62%, 22,14% và 75,79%) 5.1.3. Ảnh hưởng của môi trường nuôi phôi. - Tế bào trứng có chất lượng tốt có ảnh hưởng tích cực đến kết quả nuôi thành thục tế bào trứng trong ống nghiệm cũng như tỷ lệ thụ tinh trong ống nghiệm. - Khi nuôi hợp tử trong 2 môi trường TCM 199 và CR1aa: tỷ lệ hợp tử phân chia và phát triển đến đến giai đoạn phôi dâu, phôi nang trong môi trường CR1aa tốt hơn khi nuôi trong môi trường TCM 199. 5.1.4. Đông lạnh phôi Đông lạnh phôi bằng 3 phương pháp: đông lạnh 3 bước, một bước và thuỷ tinh hoá cho kết quả phôi sống sau đông lạnh-giải đông cũng như phát triển đến giai đoạn thát màng cao. Tỷ lệ phôi phát triển và thoát màng khi đông lạnh bằng phương pháp ba bước và một bước cao hơn khi đông lạnh bằng phương pháp thuỷ tinh hoá ( 70,16%, 76,58% so với 66,48%). 5.2. ĐỀ NGHỊ Cấy truyền phôi là công nghệ sinh học bước đầu đang được nghiên cứu và ứng dụng trong chăn nuôi bò sữa ở nước ta do vậy còn hạn chế về kiến thức chuyên môn cũng như cơ sở vật chất. Chúng tôi đề nghị: Tiếp tục nghiên cứu tìm hiểu những yếu tố khác ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh nhằm nâng cao kết quả thụ tinh cũng như những hiểu biết về tụ tinh ống nghiệm. Tiếp tục nghiên cứu và ứng dụng phương pháp đông lạnh thuỷ tinh hoá. TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Bùi Xuân Nguyên, Nguyễn Hữu Đức, Lê Văn Ty, Nguyễn Thị Ước (1994), Kết quả bước đầu nghiên cứu nuôi trứng và thụ tinh in vitro trâu bò, Kỷ yếu Viện Công nghệ sinh học 1994, NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội: 166-168 Hoàng Kim Giao, Lưu Công Khánh, Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Thoa, Phan Lê Sơn, Đặng Văn Hoà, Chu Thị Yến, Tăng Xuân Lưu (2004). Đông lạnh phôi bò. Tạp chí Thông tin Khoa học Kỹ thuật Chăn nuôi. Số 6 Lưu Công Khánh, Nguyễn Văn Lý, Nguyễn Thị Thoa, Phan Lê Sơn, Đặng Vũ Hoà, Chu Thị Yến, Nguyễn Thị Kim Anh, Hoàng Kim Giao (2003), Nghiên cứu ứng dụng đông lạnh phôi bò bằng glycerol trong công nghệ cấy truyền phôi, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc. NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội : 720-722 Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Bùi Xuân Nguyên (1996),Trạng thái phát triển nhân tế bào trứng thu từ buồng trứng của bò nội Việt Nam, Kỷ yếu Viện công nghệ sinh học. Nguyễn Hữu Đức, Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Quảng Xuân Hữu, Nguyễn Trung Thành, Bùi Linh Chi, Nguyễn Văn Hạnh, Nguyễn Thuỳ Anh, Nguyễn Việt Liên, Bùi Xuân Nguyên (2003), Kết quả thụ tinh ống nghiệm và cấy phôi ở bò lai Sind, Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 699-702 Nguyễn Hữu Đức (2004), Nghiên cứu nuôi thành thục và thụ tinh ống nghiệm trứng bò nội tại Việt Nam, Luận án tiến sĩ Nông nghiệp, Nguyễn Thị Ước (1996), Nghiên cứu gây rụng trứng nhiều và gây động rụng đồng pha trong cấy phôi trâu bò, Luận án phó tiến sỹ khoa học nông nghiệp, 5-40 Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu Đức, Bùi Linh Chi, Hoàng Nghĩa Sơn, Bùi Xuân Nguyên (1999), Sản xuất phôi bò bằng thụ tinh ống nghiệm, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, NXB khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 934-936 Nguyễn Thị Ước, Lê Văn Ty, Nguyễn Hữu Đức, Bùi Linh Chi, Nguyễn Trung Thành, Nguyễn Việt Linh, Nguyễn Văn Hạnh, Quảng Xuân Hữu, Nguyễn Thuỳ Anh, Hoàng Nghĩa Sơn, Dương Đình Long, Bùi Xuân Nguyên (2003), Nghiên cứu sản xuất giống bò sữa thương phẩm bằng cấy phôi thụ tinh ống nghiệm và xác định giới tính, Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc, NXB khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội: 717-719 Nguyễn Văn Lý, Hoàng Kim Giao, Lưu Công Khánh, Nguyễn Thị Thoa, Phan Lê Sơn, Đặng Văn Hoà, Chu Thị Yến.(2003), Thu thập và nuôi cấy tế bào trứng bò In-vitro, Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn Nguyễn Văn Lý (2006), Nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến kết quả thụ tinh ống nghiệm trứng bò ở Việt Nam. Luận án tiến sĩ Nông nghiệp Trần Tiến Dũng, Dương Đình Long, Nguyễn Văn Thanh (1997), Sinh lý sinh sản gia súc, ĐHNNI-Hà Nội TÀI LIỆU THAM KHẢO NƯỚC NGOÀI Alia.A., BilodeauuJ.F., Sirard M.A., (2003), “Antioxidant requirements for bovine oocytes varies during in vitro maturation, fertilization and development”, Theriogenology 59 pp. 939-949 Almeida A.P.(1987), “Seasonal variation in the superovulating response to PMSG in dairy cows”, Theriogenology 27, pp. 404 Austin, C.R. (1951), “Observations on the penetration of the sperm into the mammalian egg”, Australian Journal of Scientific Resreach 4, pp. 581-596 Avery,B., Strobech,L., Jacobsen,T., Bogh,I.B. and Greve, T. (2003), “Invitro maturation of bovine cumulus-oocyte complexes in undiluted follicular fluid: effect on nuclear maturation, pronucleus formation and embryo development”, Theriogenology 59, pp. 987-999 Beker A.R.C.L., Colenbrander B., Bevers M.M.(2002), “Effect of 17β- Estradiol on the in vitro maturation of bovine oocytes”, Theriogenology 58, pp. 1666-1673 Bilton, R.J. and Moore, N.W.(1977), “In vitro culture, stor-age and transfer of goat embryos Aust.J”, Biol Sci 32, pp. 101-107 Bols, P.E.J.. Leroy, J.L.M.R., Vanholder, T. and Van Som, A (2004), “A comparision of a chemical sector and linear array transducer for ultrasound-giuded transvaginal oocyte retrieval (OPU) in cow”, Theriogenology 62, pp. 906-914 Bon Durant R.H., Anderson G.B., booland M., Cupps P.T. and Hughes M.A., (1982), “Pregnancy rate and embryos survival following transfer of bovine embruos stored at low temperature”, Theriognology 16, pp. 132 Bui Xuan Nguyen., Heyman, Y. and Renard, J. P (1984), “Direct freezing of cattle embryos after partial dehydration at room temperature”, Theriogenology 22, pp. 389-399 Bui Xuan Nguyen (1997), “Long term gamete and embryo preservation based on the asscociate treatments of partial dehydration and freezing. Proceeding of International Worshop on Ultra-long- term cryogenic preservation network of biological and environmental specimens”, Senri Life Science Center, Osaka, Japan: 192-198 Brackett, R.G., Bousquet, D., Boice, M.L., Donawick, W.J., Evans, J.F. and Drassel, M.A.(1982), “Normal development follwing in vitro fertilization in the cow”, Biology of Reproduction 27, pp. 147-158 Callesen H., Greev T.nad Hyttel.P.(1987), “Premature ovulation in superovulation cattle”, Theriogenology 28, pp. 155-156 Catt, J.W. (1990), “Operation of a bovine IVF center. Proceedings of the Third Symposium on Advanced Topics in Animal Reproduction FCAV-UNESP”. Jaboticabal 8, pp. 100 Chang, M.C.(1951), “Fertilising capacity of spermatozoa deporsited into the fallopiantube”, Nature 168, pp. 697-698. Chupin D and Procureur R.,(1982), “La Stimulation des I' ovaire pour produire embryos chez les bovins. In: transplantation embryonaire ". Ed. Par I' Insttut Technique de l' elevage bovin, compte rendu des journees d' information . ITEB-UNCWIA : 75-85 Daya, S., Gwakin, R.B.L. and Bissessar,H. (1987), “Separation of motile human sperm by means of glass bead column”. Gamete Resarch 17, pp. 375-387 Eppig ,J.J. Wiggleswoth,k. and O’Brien, M.J. (1992), “Comparisison of embryonic developmental compentence of mouse oocytes grown with and without serum”. Mocleccular Reproduction and Developmen 32, pp. 33-40 Fuhrer. F., Mayr.B., Schelader,K., M and schlega.W. (1989), “Maturration conpetence and chromatin beharvior in growthing and full grow cattle oocytes”, Jounal of veterrinary 36 Fukui Y., Fukushima M. and Ono H.(1983), “Fertilization in vitro of bovine oocytes after various sperm procedures”, Theriogenology 20, pp. 651-660 Furuya, S., Endo, Y., Oda, M., Matsui, Y., Nozawa, S. and Suzuki, S.(1992), “Protein phosphorilation regulates the mouse sperm carosome reaction induced by the zona pellucia”, Journal of Assisted Reproduction and Genetics 9, pp. 384-390 Galli C., Crotti G., Notari C., Turini P., Duchi R., Lazzani G.,(2001), “Embryo production by Ovm Pick Up from live donors”, Theriogenology 55, pp. 1341-1357 Gomez E., Diez C.(2000), “Effects of glocose and protein sources on bovine embryo development in vitro”, Anim. Reprod. Sci 58, pp. 23-37 Gordon I., Boland M.P., Govern H. Mc and Lynn G. (1987), “Effect of season on superovulatory responses and embryo quality in holstein cattle in Saudi Arabia”, Theriogenology 27, pp. 231 Hasler J.F.,Mc Cauley A.D., Schermerhorn E.C and Footer R.H (1983), “Superovulatory responses of Holstein cows”. Theriogenology 19, pp. 83-99 Hasler J.F., Hurtgen, P.J., Jin. Z.Q. and Stokes, J,E., (1997), “Survival of IVF – derived bovine embryos frozen in glycerol or ethylene glycol”, Theriogenology 48, pp. 563-579 Hensleigh H.C. and Hunter A.G.(1985), “In vitro maturation of bovine cumulus enclosed primary oocytes and their subsequent in vitro fertilization and cleavage”, J.Dairy Sci 68, pp. 1456-1562 Holm P., Booth P.J., Schmidt M.H., Greve T., Callesen H.(1999), “High bovine blastocyst development in a static in vitro production system using SOFaa medium supplemented with sodium citrate and myo-inositol with or without serum-proteins”, Theriogenology 52, pp. 683-700 Kajihara Y.,Roses G.,Lago I., Calvo J., Fila D. and Crispo M.(1999), “Influence of culture medium on the development of bovine blastocysts”, Theriogenology, Vol 51, No.1, pp. 239 Katska, L. (1984), “Comparison of two methods for recovery of ovarian oocytes from slaughter cattle”, Animal Reproduction Scien 7 , pp. 461-463 Khurana. N. K., Niemann. H. (2000), “Effects of oocyte quality, oxygen tension, embryo density, cumulus cells and energy substrates on cleavage and morula/blastocyst formation of bovine embryos”, Theriogenology 54, pp. 741 - 756 Lazar L,J., Spak and V.David. (2000), “The vitrification of in vitro fertilized cow blastocysts by the open pulled straw method” Therigenology 54,pp. 571-578 Leibfried-Rutledge M.L., Critser E.SS., Eyestone W.H., Northey D.L and First N.L.(1986), “Development potential of bovine oocytes matured in vitro”, Congress proceeding, p. 342 Leibo S.P.,(1982), “A one - step method for direct nonsurgical transfer of frozen - thawed bovine embryos”, Theriogenology 21, pp. 767 Lindner G,M. and Wright R,W.,(1983), “Bovine embryo morphology and evalutio, Theriogenology 20, pp. 407-416 Lonergan P. Monaghan P ., Rizos D ., Boland M.P., Gordon I. (1994), “Effect of lollicle size on bovine oocyte qulity and developmental competence follwing maturation, fertilization and culture in vitro”, Mol. Reprod. Dev 37, pp. 48-53 Loos, de F., Van Vliet,C., van Maurik, P. and Kruip, T.A.M. (1989), “Morphology of immature bovine oocytes”, Gamete Research 24, pp. 197-204 Lussier J.G., Dufour J.J and Matton P.(1988), “Growth rater of follicles in the bovine ovary”, J. Amin ., Sc 51. suppl 1, pp. 353 Miyamoto.H., Ishibashi.T., (1987), “Protective action of glyceroles against freezing damage of mouse and embryos”, Journal of reproduction and fertility 54, pp. 427-432 Newton C.R., Hansen P.J., and Low B.G.(1988), “Characterization of a high molecular weight Glycoprotein secreted the pre-implantation bovine conceptus”, Biology of Reproduction 39, pp. 553-560 Niemann H. and Nienhaus P.(1982), “Comparison of survial rate of day 7 and 8 bovine blastocysts after fast freezing and thawing” Theriogenology 18, pp. 445-452 Park,H.D., Yoon,S.H., Kim,E.J., Lee,S.J., Lee,H.T., Chung,K.S. and Kato,S. (1997), “Effect of glycerol on in vitro development of embryos produced in vitro from bovine follicularn oocytes”, Proceedings Third Asian Symposium on Animal, Biotechnology. 374-379 Pieterse MC., Kappen KA., Kruip ThAM., Taverne MAM.(1988), “Aspiration of bovin oocytes during transvagial ultrasound scanning of the ovaries”, Theriogenology 30, pp. 751-761 Polge C., Wilmut I. and Rowson L.E.A (1974), “The low temperature preservation of cow, sheep and pig embryos”, Cryobiology 11, pp. 560 Renard, J.P., Ozil. P. and Heyman.Y (1982), “Crevical trans-fer of deep frozen cattle embryos”, Theriogenology 15. pp. 311-320 Renard, J.P., Menez O.Y., saumande J. and Heyman Y.(1987), “Attempts to predict the viability of cattle embryos produced by superovulation” In: control of reprod in the cow, Galmay, XX. Ed, pp. 398-417. Sang Runzi , Li Janguo, Wang Fengming, Zhao Yingjie, Lui Sujuan (1996), “Studies on improving survial and pregnancy rate of frozen bovine embryos”, 2nd Asian symposium on animal biotechnology, November, pp. 11-14 Screean J.(1968), “In vivo and in vitro culture of cattle eggs”. Proc 6th. Int. Congr. Anim. Reprod. & A.I., Paris, pp. 577-580 Shioya Y., Kuwayama m., Fukushima M., Iwasaki S. and Hanada A (1988), “In vivo fertilization and cleavage capability of bovine follicular oocytes classified by cumulus cells and matured in vitro” Theriogenology, Vol.13, No 3, pp. 489-496 Seidel G.E. (1983), “Field trais with cryopreserved bovine embryos” In: Beier H.M., Linder HR: Fertilization of the human egg itro, pp. 343-352 Sergeev N.I.(1987), “The improvement of hocmonal induction of superovulation in donor cow for embryo transfer”, Anim. Breed. Abstr 55 Shea B.F., Hines D.J., Light Foot D.E., Ollis G.W. and Olson S.M.(1981), “The transfer of bovine embryos”, Proc. EEC Seminar Egg Transfer in cattle , pp. 145-152 Trouson ,A.O., Willadsen S.M and Rowson L.E.A. (1976), “The influence of in vitro, culture and cooling on the survival and development of cow embryos”, J. Reprod. Fert 47, pp. 367-370 Trouson ,A.O., Pugh A., Aarts M.H. and Fielden E.D (1980), “The development of cow embryos after freezing and internation transport”, Prod. Aust. Soc. Reprod. Biol. 12, pp. 41 Trouson ,A.O., Woods,E. and leeton, J. (1982), “Freezing of embryos .An ethicl obligation”, Med.J, Aust 2, pp. 332-333 Whittingham,D.G., Leibo. S.P. and Mazur.P. (1972), “Survival of mouse embryos frozen to -196o C and -269o C”, Science 178, pp. 411 Willadsen S.M. (1980), “The viablity of early clevage containing the normal number of blastomeres in the sheep”, J. Reprod.Fert. Vo 59, pp. 357-362 Willet E.L.,Black W.G., Casida L.E., Stone W.M and Buckner P.J.(1951), “Successful transplantion of a fertilied bovin oum”. Science. N.Y, pp. 113, 247 Wilmut.I. and Rowson.L.E.A. (1973), “Experiments on the low-temperature preservation of cow embryos”, Vet. Rec. 92, pp. 686 Wilmut I. and Rowson L.E.A.,(1992), “Experiments on the low- temprature preservation of cow embryos”, Vet. Rec 92, pp. 686-690 PHỤ LỤC Nang trứng trtrứngtr]ngsNangtrNNang øng TVVàngV Phương pháp hút dịch nang trứng Tế bào trứng được ủ với tinh trùng Phôi 2 tế bào Phương pháp giải phẫu nang trứng Tế bào trứng đã được thụ tinh (xuất hiện thể cực thứ 2) Phôi 8-16 tế bào Phôi dâu loại A Phôi nang loại A Phôi nang trưởng nở Phôi dâu loại B Phôi nang loại B Phôi nang thoát màng MÔI TRƯỜNG 1. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG MDPBS Pha môi trường PBS(-) NaCl KCL Na2HPO4 KH2PO4 Nước cất 8,0g 0,2g 1,15g 0,2g 700ml Pha môi trường PBS(+) CaCl2 MgCl2.6H2O Nước cất khử ion 0,1g 0.1g 200ml Sau khi đã chuẩn bị xong, rót từ từ môi trường PBS (+) vào môi trường PBS (-) để tránh kết tủa. Sau đó bổ sung thêm 100ml nước cất khử ion để đủ 1000ml. Sau đó bổ sung thêm 1,0g glucose và 0,036g Natri pyruvate được mDBPS. Sau đó lọc seize và bảo quản trong tủ lạnh. 2. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG BO 2.1.Chuẩn bị môi trường BO gốc (BO= Brackett and Oliphan) Dung dịch A NaCl KCl CaCl2.2H2O NaH2PO4.2H2O MgCl2.6H2O Phenol Red (dung dich 0,5%) Nứơc khử ion 4,3092g 0,1974g 0,2171g 0,0840g 0,0697g 0,1ml Thêm đủ 500ml Dung dịch B NaHCO3 Phenol Red 0,5% Nước khử ion 2,5873g 0,04ml Thêm đủ 200ml 2.2.Chuẩn bị môi trường BO Dung dịch A Na Pyruvate Penicilin Streptomycin Dung dịch B 76ml 0,01375g 10.000iu 10mg 24ml Sau khi chuẩn bị xong, lọc bằng microfilter 2.3. Chuẩn bị môi trường hoạt hoá tinh trùng Dung dịch Bo Na Caffein benzoate Heparin (Novo-heparin: 5000iu/ml) 50ml 0,1942g 50µl 2.4.Chuẩn bị dung dịch rửa tế bào trứng Dung dịch BO BSA 2.5. Dung dịch thụ tinh ống nghiệm Dung dịch Bo BSA 40ml 400mg 10ml 200mg 3. CHUẨN BỊ MÔI TRƯỜNG NUÔI PHÔI CR1aa Dung dịch A NaCl KCL Na pyruvate NaHCO3 Phenol Red 5% Nước cất khử ion Dung dịch B Hemicalcium lactate Nước cất khử ion Môi trường CR1aa Dung dịch A Dung dịch B BMEEssential Amino Acids MEM Non Essential Amino Acids L-glutamic Acid (2mg/ml) BSA Penicillin-G Streptomycin Sulfate 6,7031g 0,231g 0,0440g 2,2011g 2ml Thêm đủ 760ml 0,5996g Thêm đủ 200ml 76ml 20ml 2ml 1ml 1ml 3mg/ml 10.000iu (100iu/ml) 10mg(100µg/ml) 4. DỤNG CỤ HOÁ CHẤT - Các loại kính hiển vi soi nổi : Kính hiển vi thao tác Niko TE 300; kính hiển vi soi nổi Wild M3B; kính hiển vi soi nổi Leica MZ6; kính hiển vi soi nổi Olympus SD 30; kính hiển vi soi nổi Olympus CH30. - Tủ nuôi cấy CO2 - Buồng vô trùng Labcaire. - Cân phân tích Precía - Máy li tâm Universal 32R - Bồn nước ổn nhiệt- Memer Waterbath - Máy ổn nhiệt Ht50 - Tủ sấy khô SL Shel lab. - Tủ sấy ẩm Sanyo Incubator - Tủ sấy áp suất Tomy autoclave SS - 325. - Máy đông lạnh CL-2000 - Buồng đếm Thoma - Pippetteman các cỡ. - Các loại đĩa petri - Pippete pasteur - Găng tay vô trùng, bơm tiêm 5ml, kim tiêm 18G, Microfilter 0,22µm - Các loại hoá chất chuyên dụng. Bé gi¸o dôc vµ ®µo t¹o Tr­êng ®¹i häc n«ng nghiÖp hµ néi -----------&----------- PHïng MINH NGUYÖt Nghiªn cøu ¶nh h­ëng cña yÕu tè mïa vô, ph­¬ng ph¸p khai th¸c ®Õn kÕt qu¶ thu tÕ bµo trøng vµ m«i tr­êng nu«i cÊy, ®«ng l¹nh ®Õn kÕt qu¶ thô tinh èng nghiÖm trøng bß LuËn v¨n th¹c sÜ n«ng nghiÖp Chuyªn ngµnh: Thó y M· sè: 60.62.50 Ng­êi h­íng dÉn khoa häc: PGS.TS. TRÇN TIÕN DòNG Hµ néi - 2008 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình của riêng tôi, các số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn này là trung thực và chưa từng được công bố trong bất cứ công trình nào khác. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn này đều đã được ghi rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Phùng Minh Nguyệt LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành gửi tới Ban Giám hiệu trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban chủ nhiệm khoa Sau Đại Học, Khoa Thú Y và các thầy cô giáo trong trường lời cảm ơn sâu sắc nhất. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới PGS.TS. Trần Tiến Dũng giảng viên Bộ môn Ngoại - Sản, khoa Thú Y - Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội đã tận tình chỉ bảo, hướng dẫn trong suốt thời gian học tập và giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới các cô, chú, anh, chị em phòng Thí nghiệm Trọng điểm Tế bào Động vật, Viện chăn nuôi Quốc gia và các bạn bè đồng nghiệp, đặc biệt là tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Thoa đã nhiệt tình giúp đỡ, góp ý, tạo điều kiện cho tôi trong quá trình thực hiện để luận văn này có thể hoàn thành. Cuối cùng tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới gia đình, anh em, bạn bè, đồng nghiệp đã động viên, khích lệ và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 20 tháng 10 năm 2008 Học viên Phùng Minh Nguyệt Môc lôc Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục các bảng vii Danh môc c¸c ch÷ viÕt t¾t OPU GnRH LH FSH TCM 199 BSA DMSO FCS BO TTON OVum Pick Up Gonadotropin Releasing Hormone Lutein hormone Follicle Stimulating Hormone Tissue Culture Medium 199 Bovine Serum Albumin Dimethyl Sulfoxide Foetal Calf Serum Brackett and Oliphan Thụ tinh ống nghiệm Danh môc b¶ng Bảng 4.1. Kết quả thu tế bào trứng bò từ lò mổ 45 Bảng 4.2. Ảnh hưởng của phương pháp thu trứng tới số lượng tế bào trứng 46 Bảng 4.3. Ảnh hưởng của mùa vụ thu trứng tới số lượng tế bào trứng 48 Bảng 4.4. Ảnh hưởng của phương pháp thu tới chất lượng tế bào trứng 49 Bảng 4.5. Ảnh hưởng của mùa vụ thu trứng tới chất lượng tế bào trứng 52 Bảng 4.6. Kết quả nuôi thành thục trứng trong ống nghiệm 54 Bảng 4.7. Ảnh hưởng của chất lượng tế bào tới tỷ lệ trứng thành thục 55 Bảng 4.8. Kết quả thụ tinh trứng bò trong ống nghiệm 57 Bảng 9: Ảnh hưởng của chất lượng tế bào trứng đến kết quả thụ tinh trong ống nghiệm 58 Bảng 4.10. Kết quả nuôi hợp tử trong ống nghiệm 60 Bảng 4.11. Ảnh hưởng của môi trường nuôi tới sự phát triển của hợp tử 62 Bảng 4.12. Kết quả phân loại phôi sau khi thu hoạch 65 Bảng 4.13. Chất lượng phôi trước đông lạnh 65 Bảng 4.14. Kết quả đánh giá chất lượng phôi sau giải đông 68 Bảng 4.16. Ảnh hưởng của phương pháp đông lạnh tới sự phát triển của phôi sau đông lạnh-giải đông 73 ._.