Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và NaCl trong qúa trình lên men vang vải thiều (Litchi chinensis sonn )

ương thức sản xuất khác nhau và hàng trăm loại rượu vang ra đời (độ rượu 9% - 14% ): Chianti, chablis, rượu Rhine, Granache rose, Burskendy, sautesne, Zinfandet,[2]. Thực chất của rượu vang bắt nguồn từ sự biến đổi tự nhiên của các loại hoa quả có đường, do hệ enzim có trong một loại vi sinh vật là nấm men Sacharomyces mà chủ yếu là loài: Sacharomyces cerevisiae, ngoài ra còn có các phụ phẩm khác: các chất thơm, tanin, axít hữu cơ, vitamin, chất khoáng, muối và các este. Do đó, rượu vang không chỉ có đặc điểm nổi bật là gây say êm dịu mà còn có giá trị dinh dưỡng cao, kích thích tiêu hoá, thần kinh, tim mạch. Việt Nam là một nước nhiệt đới khí hậu nóng ẩm, hoa quả nhiều về số lượng, phong phú về chủng loại, thuận lợi cho sản xuất rượu vang từ các nguồn nguyên liệu khác nhau như: Dâu, dứa, vải, táo, chuối, mơ trong đó phổ biến nhất là vang vải vì vang vải đã được sản xuất ở một số nước như: Florida (Mỹ ), Trung Quốc [12, 17]. Bên cạnh đó, quả vải giá thành thấp lại rất đa dạng, phong phú. Tổng số diện tích trồng khoảng 28.000 ha, sản lượng cho thu hoạch khoảng 36.000 tấn/ năm. Nơi có diện tích trồng và thu hoạch nhiều nhất là Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (Hưng Yên ) [12, 17]. Quả vải dùng chủ yếu để ăn (chiếm khoảng 30% - 35% sản lượng quả cho thu hoạch, số còn lại buộc phải sấy khô hoặc bán thẩm lậu qua biên giới Việt – Trung. Việc chế biến quả vải thiều ở dạng nước giải khát đóng hộp cũng chỉ đáp ứng một phần nhỏ sản lượng thu hoạch hàng năm và sản phẩm rất khó được thị trường chấp nhận [12, 17]. Ngành sản xuất rượu vang ở Việt Nam thực sự phát triển từ những năm 80 của thế kỷ XX được đánh dấu bằng sự xuất hiện của vang Thăng Long, sau đó là một số cơ sở sản xuất khác hiện lên: vang Gia Lâm, vang Thanh Ba, vang Đà Lạt, nhưng lại thiếu nguồn nguyên liệu. Do đó theo chúng tôi, việc nghiên cứu sử dụng quả vải thiều để sản xuất rượu vang là rất cần thiết và phù hợp với thực tiễn ở Việt Nam. Chúng tôi tiến hành lựa chọn và nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng của hàm lượng đường và NaCl trong qúa trình lên men vang vải thiều (Litchi chinensis sonn )”. 1.2. Mục đích nghiên cứu - Từ nguồn nguyên liệu vài thiều phân lập và tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang vải thiều. - Nghiên cứu ảnh hưởng hàm lượng đường, KH2PO4, NaCl, pH, men giống và nhiệt độ để lựa chọn mức thích hợp cuả các nhân tố này tới quá trình lên men vang vải thiều với quy mô phòng thí nghiệm. - Xây dựng quy trình công nghệ sản xuất vang từ quả vải thiều. 1.3. Nhiệm vụ Giúp sinh viên biết phương pháp sản xuất rượu vang ở Việt Nam tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có 1.4. ý nghĩa lý luận và ý nghĩa thực tiễn của đề tài Nghiên cứu nhằm đi sâu tìm hiểu đặc điểm hình thái, đặc tính sinh lý, sinh hoá của chủng nấm men Sacharomyces cerevisiae H7 và C13 có khả năng lên men vang vải thiều. Từ đó tìm hiểu quá trình sản xuất vang vải thiều trên quy mô phòng thí nghiệm để ứng dụng sản xuất vang trong gia đình tận dụng nguồn nguyên liệu sẵn có ở Việt Nam. Phần 2 Tổng quan tài liệu 2.1. Khái quát chung về rượu vang 2.1.1. Các loại rượu vang Rượu vang là loại nước thơm ngon giàu chất bổ dưỡng với độ cồn nhẹ và hương thơm trái cây còn giữ lại được trong rượu [1]. Rượu vang theo đúng nghĩa là rượu lên men từ nước ép quả nho (không chưng cất ). Gần đây, người ta mở rộng khái niệm rượu vang để chỉ các loại rượu lên men từ các loại hoa quả khác nhau như: mơ, dứa, táo, vải, xoài, nhãn. Sự đa dạng về các loại rượu vang đang là kết quả của sự biến đổi sinh hoá khi lên men. Trong rượu vang người ta còn chia thành hai loại chính: Rượu vang không gaz và rượu vang có gaz. Trong hai loại chính này rượu vang lại được chia thành nhiều loại theo màu sắc, theo hàm lượng đường có trong rượu hoặc theo độ cồn. Theo màu sắc có vang trắng, vang đỏ (màu đỏ Bordaux). Theo hàm lượng đường có trong rượu vang thì có vang chát hay vang khô (ít đường ) và vang ngọt (nhiều đường ), vang nửa khô[13]. Vang khô thường uống giữa bữa ăn, vừa ăn, vừa uống. Vang ngọt dùng sau bữa ăn, vang nửa khô (vang Vermouth ) có mùi rất thơm (chứa 21% độ rượu ) dùng để khai vị. Champagne là loại rượu vang có qúa trình lên men phụ sinh CO2, nên khi uống thường có bọt và được dùng nhiều trong đại tiệc, phụ nữ thường ưa thích loại vang này[2]. 2.1.2. Nguyên liệu sản xuất rượu vang Việt Nam là một nước nhiệt đới gió mùa không thuận lợi cho nho phát triển, nhưng lại là xứ sở của nhiều loại hoa thơm, quả ngọt bốn mùa. Tất cả các loại quả nếu chứa đường, prôtêin, muối khoáng và không chứa chất độc hại với nấm men đều có thể chế biến lên men rượu vang. Như vậy, nguồn nguyên liệu sản xuất rượu vang chủ yếu là các loại quả trồng (mận, mơ, táo, dâu, dứa, chuối, vải, nhãn). Nói chung thành phần hoá học của quả có ảnh hưởng rất lớn đến chất lượng rượu vang. Điều kiện khí hậu, đất đai, nông hoá thổ nhưỡng, kỹ thuật canh tác cũng ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu vang, bởi chúng ảnh hưởng tới sự có mặt của các hợp chất hữu cơ có mặt trong quả. Bảng 1. Thành phần hoá học của các loại quả. [7, 16]. Tên quả Thành phần hoá học Nước Đường Axít tổng số Pectin Talin Nho ngọt Dâu Vải Dứa Mơ 73,1 84,74 84,28 54,3 73,8 9,88 9,19 1610,39 3,9 9,0 0,56 0,49 5,16 0,01 0,6 1,1 0,92 0,31 0,25 - - 0,07 0,035 0,83 - - 2.1.3.Tàng trữ rượu vang Vang truyền thống được tàng trữ từ 1ữ5 năm hoặc nhiều năm, hàng thế kỷ hoặc lâu hơn nữa. Trong thời gian này xảy ra sự oxi hoá khử màu tím sang màu đỏ tía. Vang trắng trở nên vàng, thậm chí đỏ nâu. Thành phần axít tăng, độ cồn giảm, este và hương vị tăng lên. [13], [14]. Cho nên, công nghệ cổ truyền người ta cho rằng cần tránh can thiệp nhân tạo khi bắt buộc điều chỉnh ở mức độ tối thiểu một số chỉ tiêu lý hoá. Ngược lại trong thực tế cơ chế thị trường đã thúc đẩy nhà sản xuất phải xử lý tăng tốc độ tàng trữ bằng các phương pháp công nghệ học, ly tâm, nạp khí CO2, làm lạnh. 2.2. Nấm men trong sản xuất rượu vang Nấm men đóng vai trò quyết định trong sản xuất rượu vang vì quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men là quá trình chuyển hoá nguyên liệu thành sản phẩm. Nấm men sản xuất rượu vang gồm nấm men thuần chủng và nấm men tự nhiên. 2.2.1. Sơ lược về nấm men Nấm men (yeast) là tên chung để chỉ nhóm nấm có cấu tạo đơn bào, thường sinh sản bằng nảy chồi . Từ năm 1680 Levenhuc đã quan sát thấy Nấm men, và từ 1857 Pasteur đã nghiên cứu khá tỉ mỉ về men rượu. Nấm men phân bố rộng rãi trong tự nhiên. (Trong đất, trong nước, trong không khí, trong lương thực, thực phẩm, trong hoa quả). Nhiều loài nấm men có khả năng lên men rượu do đó từ lâu con người đã biết sử dụng nấm men để nấu rượu, bia, sản xuất cồn. Nấm men sinh sản theo lối nảy chồi, sinh sản nhanh chóng, sinh khối của nấm men giàu prôtêin – vitamin. Vì vậy chúng còn được sử dụng rộng rãi trong các ngành công nghiệp sản xuất thức ăn bổ sung cho người, gia súc và gia cầm. Nấm men còn được sử dụng làm nở bột mì, gây hương cho nước chấm, sản xuất một số dược phẩm khác. Tuy nhiên bên cạnh đó có một số nấm men có hại cho người và gia súc, làm hư hỏng lương thực, thực phẩm [3]. 2.2.2. Hình thái, kích thước và cấu tạo của tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae Hình thái: Đa số nấm men có hình ovan, hình trứng. Hình dạng và kích thước điển hình của tế bào nấm men chỉ tạo được trong điều kiện nhất định. Nếu thay đổi thì hình dạng tế bào cũng thay đổi. Kích thước của tế bào nấm men vào khoảng 4- 10 àm x 2- 8àm. Tế bào nấm men lớn gấp 10 lần tế bào vi khuẩn, cấu tạo tế bào nấm men phức tạp hơn tế bào vi khuẩn. Về mặt hoá học, có sự phân bố rõ ràng, tế bào nấm men Sacharomyces cerevisiae được bao bởi lớp thành tế bào. Cấu tạo chủ yếu của thành tế bào là Hêmixenlulô chiếm 70% trọng lượng khô (trong đó 31% manan, 29% glucan ). Ngoài ra còn chứa 1%- 3% kitin, 6% - 10% prôtêin, 8% - 8,5% lipit, 7% chất khoáng. Thành tế bào có cấu tạo nhiều lớp là cơ quan bảo vệ và duy trì hình dạng tế bào. Thành tế bào nấm men có khả năng kết dính, có ý nghĩa lớn trong công nghiệp sản xuất rượu vang và bia. Bên ngoài chất nguyên sinh là màng sinh chất (màng chất nguyên sinh ) có chức năng quan trọng là hấp phụ các chất dinh dưỡng và thải các các sản phẩm trao đổi chất. Màng chất nguyên sinh là lipoprotêin chứa nhiều hợp chất canxi. Màng chất nguyên sinh ăn sâu vào trong tạo thành mạng lưới nội chất gồm 2 lớp và dày khoảng 30- 40A0 và có ty thể. Ty thể của nấm men có dạng hình hạt và có thể thay đổi tuỳ thuộc điều kiện của môi trường cũng như trạng thái sinh lý của tế bào, kích thước khoảng 0,2 – 0,6 cm, ty thể có màng trong suốt, mỏng (60 – 80 A0 ), có tính thấm cao, màng ty thể có cấu tạo 2 lớp, lớp trong hình thành nếp gấp hoặc ống nhỏ hình răng lược. Lớp ngoài được cấu tạo bằng nhiều đơn vị hình thái. Ty thể được cấu tạo chủ yếu bằng hợp chất prôtêin, lipit trong đó chiếm một lượng lớn nuclêoprôtêin, photpholipit. Số lượng ty thể trong tế bào nấm men từ 10 đến 20. Chúng tham gia vào quá trình sinh trưởng của tế bào, sự hình thành và nảy mầm của bào tử. [1, 3, 9 ]. Trong tế bào nấm men có chứa một hoặc một hệ thống không bào được hình thành từ thể glogi hay mạng lưới nội chất, không bào có tính chất thẩm thấu cao và là nơi tích luỹ các sản phẩm của trao đổi chất. Không bào chứa một hệ thống keo, trong đó gồm các điện tử, enzim, protit, hiđrat cacbon, các muối canxi, photpho, kali, axit nuclêic. Hình dạng của không bào thường thay đổi do sự co rút của chất nguyên sinh. Trong không bào thường xảy ra các phản ứng oxi hoá - khử nhờ vào hệ thống enzim xitocromoxidaza trong không bào. Một dạng dự trữ của tế bào là glucogen trong môi trường giàu hiđrat cacbon, glicogen của tế bào nấm men được tích luỹ khá nhiều. Khác với tế bào vi khuẩn, tế bào nấm men có nhân thật, nhân có hình tròn, hình ôvan nằm gần không bào trung tâm có kích thước 1- 2,4 àm. Nhân tế bào được bao bọc bởi 2 lớp màng tế bào, mỗi màng có cấu trúc như màng cơ sở, gồm 3 lớp phân tử, những lớp này được liên hệ với nhau ở gần lỗ màng nhân. Lỗ màng nhân tham gia việc kiểm tra quá trình trao đổi chất tế bào. [6, 9]. 2.2.3. Sinh sản của tế bào nấm men Nấm men có nhiều hình thức sinh sản (sinh sản vô tính, sinh sản hữu tính,). Bình thường tế bào nấm men sinh sản nảy chồi khi gặp điều kiện không thuận lợi một số có thể sinh sản theo cách tạo bào tử. [1, 12 ]. Sinh sản vô tính: Sinh sản nảy chồi là hình thức sinh sản phổ biến nhất. Khi tế bào phát triển đến mức độ nhất định thì cơ thể của nó đâm ra một chồi nhỏ gọi là mầm (hay chồi ). Mầm sinh ra ở vị trí lệch tâm trên đầu của tế bào mẹ. Cùng một lúc tế bào mẹ có thể đâm ra nhiều những chồi ở nhiều phía khác nhau. ở mỗi chồi sẽ nhận được một phần chất nhân và chất nguyên sinh ở tế bào mẹ. Sau khi nảy mầm tế bào con có thể tách khỏi tế bào mẹ sống độc lập, cũng có thể không tách khỏi tế bào mẹ mà tiếp tục nảy mầm tạo ra một lớp tế bào nấm men giống hình cành cây. Trong điều kiện thuận lợi một tế bào được hình thành điều chỉnh và tách khỏi tế bào mẹ với thời gian 20- 30 phút. Nấm men còn có khả năng hình thành bào tử. Bào tử túi được sinh ra trong những túi nhỏ gọi là túi nang. Mỗi túi nang chứa từ 1 – 8 bào tử. (Thường từ 4 bào tử ). Nấm men được tạo thành từ 1 tế bào riêng rẽ không qua tiếp hợp. Bào tử túi gặp điều kiện thuận lợi sẽ phát triển thành tế bào nấm men. Tế bào này sinh sản theo lối nảy chồi (Lodder.J.1971 ). Sinh sản hữu tính là hình thức hợp nhất 2 tế bào nấm men thành hợp tử. Tế bào này phát triển thành túi trong đó có giảm nhiễm để hình thành các bào tử. Nhờ kính hiển vi điện tử khoa học đã thấy được sự khác nhau về thời gian hình thành thoi vô sắc trong sinh sản vô tính ở nấm men phân đôi và nấm men nảy chồi. Nấm men sinh sản vô tính bằng nảy chồi hoặc phân đôi. Giữa quá trình này có thể sinh sản hữu tính. 2.2.4. Nấm men thuần chủng Trong thiên nhiên tồn tại một số lượng lớn các chủng nấm men khác nhau, chúng có những đặc tính đặc biệt và được sử dụng trong sản xuất. Tế bào nấm men có thể tìm thấy ở khắp mọi nơi đặc biệt trên bề mặt trái cây. Tuy nhiên trên bề mặt trái cây tồn tại cả những nấm men dại, vi khuẩn, nấm mốc. Để tránh ảnh hưởng cuả nấm dại, vi khuẩn, nấm mốc,.. mà ngày nay xu thế lên men với chủng thuần khiết đang được phổ biến rộng rãi. Nấm men thuần chủng là nấm men được phát triển từ cùng một tế bào đã được phân lập và tuyển chọn trên môi trường Hansen. Nấm men được phổ biến và sử dụng nhiều trong sản xuất là loài Sacharomyces cerevisiae – loài này đôi khi được gọi là Sacharomyces ellípsoideus hoặc Sacharomyces vini nhưng những tên này được coi là lỗi thời, nó được đặt tên bởi Hoyer (1837 ), được mô tả từ đầu bởi Schwann trong cùng một năm. * Một số chủng hay dùng trong sản xuất rượu vang: Sacharomyces vini trước đây gọi là Sacharomyces cerevisiae vaxini nấm men này chiếm tới 80% Saccharomyces. Trong khi lên men loại này có khả năng lên men glucza, fructoza, mantoza, glactoza, lactoza, peptoza, dextrin. Saccharomyces oriformis được tách từ nước nho lên men tự nhiên, đặc biệt loại này chịu được đường cao, tạo độ rượu cao (10% V) trong qúa trình lên men. Trong quá trình lên men giống nhau tạo thành màng trên bề mặt dịch quả, có khả năng lên men glucoza, fructoza, mantoza. Saccharomyces cerevisiae dùng sản xuất bánh mỳ, bia rượu vang, trước đây gọi là Saccharomyces ellipsoides khi lên men đạt 10 – 20% V cồn. * Khả năng lên men đường của Saccharomyces Sự lên men rượu xảy ra qua một số giai đoạn trong thời kỳ đầu khi môi trường còn chứa nhiều hàm lượng oxy đã hoà tan, nấm men chủ yếu oxy hoá đường đến CO2 và H2O, và sinh sôi nảy nở một cách mạnh mẽ. Năng lượng của sự lên men không đảm bảo cho mức độ phát triển cao của tế bào thời kỳ này. Trong giai đoạn cuối cùng của sự lên men, vì đường còn lại ít trong môi trường nấm men sẽ sử dụng các glicogen đã được tích luỹ trong đó, do đó hàm lượng glicogen trong tế bào giảm dần. Tốc độ lên men của các chủng Saccharomyces lên men rượu bia là khác nhau đối với mỗi loại đường. Tốc độ lên men đường glucoza và fructoza nhanh hơn xaccaroza. Tốc độ lên men được xác định lượng CO2 bay ra từ một thể tích môi trường nhất định trong một đơn vị thời gian (Nelte và cộng sự, 1976 ). * Có nhiều ý kiến khác nhau về việc sử dụng chủng nấm men thuần chủng cho sản xuất rượu vang [7]. Nhưng chỉ từ khi có những hãng rượu sản xuất được vang ngon từ giống thuần chủng thì vấn đề này mới được quan tâm, phát triển. Nấm men sử dụng rộng rãi trong sản xuất là giống Saccharomyces cerevisiae. Chúng có sự luân phiên thế hệ n và 2n. Thành phần hoá học của nấm men dao động mạnh phụ thuộc vào dạng của chúng và môi trường nuôi cấy. Trung bình nấm men chứa 75% nước, 25% chất khô. Theo quan điểm kinh tế, người ta chia nấm men ra thành các chủng như sau: + Chủng lên men với hiệu suất cồn cao, ở thời gian tối ưu sản xuất thì đạt 20,5% V cồn. + Chủng lên men trong thời gian ngắn, sản sinh 8 – 12% V cồn, thậm chí ở nhiệt độ thấp 4 – 100 c không bị kìm hãm. + Chủng chịu được nông độ đường cao, lên men được rượu vang gần 30% đường với hàm lượng cồn 10 -13% V. 2.3. Các biến động sinh lý, sinh hoá vi sinh khi lên men rượu vang, khả năng lên men đường của Saccharomyces cerevisiae Quá trình sản xuất rượu vang bắt đầu bằng công đoạn: đầu tiên nấm men sinh sản trong môi trường dịch quả. Lúc đầu cần nhiều oxy kích thích sinh trưởng của nấm men. Sau đó tạo điều kiện lên men rượu etylic yếm khí nhanh chóng, chiếm toàn bộ khoảng không cho quá trình lên men tạo thành CO2 và rượu etylic xảy ra mạnh mẽ, sự lên men rượu etylic được biểu diễn theo phương trình sau: [1, 12]. C6H12O6 2C2H5OH + 2CO2 + Q Năng lượng sinh ra phục vụ cho hoạt động sống của tế bào nấm men và tích luỹ trong sản phẩm rượu. Quá trình lên men rượu xảy ra qua 5 giai đoạn: Giai đoạn 1: Giai đoạn hoạt hoá phân tử glucoza gồm 3 phản ứng. Phân tử glucoza nhở enzim: hexotrinaza chuyển một gốc photphat từ ATP sang tạo ra glucoza 6 - ố là dạng hoạt động. Glucoza 6 -ố bị tác dụng của enzim iromeza chuyển thành fructoza 6 - ố có cấu tạo kém bền vững hơn. Fructoza 6 – ố bị photphoril hoá 2 lần nhờ enzim photphorictokinaza với sự tham gia của phân tử ATP lần 2 tạo ra fructoza 1,6 đi photphoglyxeric * Giai đoạn 2: Giai đoạn cắt mạch. Fructo 1,6 đi ố dễ dàng biến đổi thành 3 – Photphoglyxeralđehyt và đioxyhiđrooxy axeton photphat nhờ xúc tác của enzim aldolaza. ở giai đoạn này dưới tác dụng của trioza – photphatizomericeza có thể chuyển hoá lẫn nhau. Đioxyaxeton photphat alđehyt – 3 – photphoglyxeric. * Giai đoạn 3: Oxy hoá Dưới tác dụng của enzim alđehyt photphoglyxeriđehyđrogenaz mà alđehyt – 3 – photphoglyxeric bị oxy hoá thành axit 1,3 đi phophoglixeric. Axit này chuyển gốc photphat cao năng cho ADP thành ATP. Phản ứng này có ý nghĩa hơn vì năng lượng giải phóng cho quá trình oxy hoá được tích luỹ trong các phân tử ATP, đảm bảo cung cấp năng lượng cho quá trình hoạt động của tế bào trong điều kiện không có oxy. Phản ứng do enzim photpho – glyxeratkitonaza xúc tác tạo axit 3 – photphoglyxeric. * Giai đoạn 4: Sự tạo thành axit piruvic Dưới sự tác dụng của enzim photphat glyxeranmutaza mà axit 3 – photphoglyxeric bị chuyển thành axit 2 – photphoglyxeric. Do tác dụng của enzim enolaza mà axit 2 – photphoglyxeric chuyển thành axit enol piruvic Dước sự tác dụng của enzim piruvat kinaza mà axit 2 photpho enol piruvic chuyển thành axit piruvic. * Giai đoạn 5: Sự chuyển axit piruvic thành rượu. Đầu tiên axit piruvic bị khử nhóm cacboxyl thành CO2 và axetalđehyt nhờ enzim xúc tác là pyruvat đecacbonxylaza. Sau đó axetalđehyt bị khử thành etanol nhờ enzim alcođehiđrogenaz. Phương trình tổng quát quá trình lên men: C6H12O6 + 2ADP+ 2H3PO4 2C2H5OH + 2CO2 + 2ATP + 6H2O Như vậy sự lên men chuyển đường thành rượu là một dãy các quá trình oxy hoá khử có enzim trong tế bào nấm men tham gia. 2.4. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men rượu vang, bệnh vang 2.4.1. Nấm men 2.4.2. Nấm mốc Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của sản xuất rượu vang, thùng chứa thiết bị hoặc do bụi, không khí đưa đến như nấm mốc thuộc chi Rhizopus, Aspergillus. 2.4.3. Vi khuẩn Trong nước hoa quả và nước rượu vang có thể phát triển những dạng vi khuẩn có tính ổn định lớn với rượu và axit hữu cơ. Chúng có thể gây ra những biến đổi sâu sắc trong rượu vang về vị chua, mùi và có loài còn gây bệnh làm đục cho vang, đó thường là các vi khuẩn Acetorbacter xylium, Acetorbacter aceti. Pasteur đã khám phá cơ chế làm hoá lỏng vang của các vi sinh vật khi rượu vang tiếp xúc với không khí nhiễm vi khuẩn Bacillus. Do vậy, để bảo quản rượu vang người ta có thể thanh trùng pasteur nhưng nó làm giảm chất lượng rượu vang, phương pháp vi lọc hoặc dùng một số chất bảo quản phổ biến như SO2 ( 75 – 120 mg/l ). 2.4.4. Bệnh vang Bệnh vang đã được Pasteur nghiên cứu và khám phá. Bệnh vang là hiện tượng rượu bị chua đi và phẩm chất giảm rất nhanh. [1,18]. Nguyên nhân: Do rượu vang tiếp xúc với không khí và do đó dưới tác dụng của vi khuẩn axit axetic phát triển đã biến cồn thành axit. Ngoài ra bệnh vang còn có thể do vi sinh vật lên men kỵ khí. 2.5. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình sinh trưởng của nấm men 2.5.1. Nguồn cacbon Cacbon có trong tế bào chất thành tế bào, trong tất cả các phản ứng enzim axit nucleic và sản phẩm trao đổi chất. Vì vậy các hợp chất cacbon có vị trí quan trọng hàng đầu cho sự sinh trưởng nấm men. Nguồn thức ăn chủ yếu của nấm men là hyđrat cacbon, nó đáp ứng 3 nhu cầu của nấm men là: - Sản sinh năng lượng - Tạo thành những tiền chất - Thực hiện quá trình oxy hoá khử để biến những tiền chất này thành sản phẩm trung gian, để xây dựng tế bào hoặc tích tụ trong môi trường. 2.5.2. Nguồn nitơ và muối khoáng - Nguồn nitơ: Trong quá trình sống của nấm men cũng như tất cả những cơ thể sống khác đều cần nitơ để xây dựng tế bào. Do đó môi trường nuôi cấy cần cung cấp đầy đủ các hợp chất nitơ mà nấm men có thể đồng hoá. - Các nguyên tố của photpho, lưu huỳnh đóng vai trò quan trọng trong quá trình trao đổi chất của tế bào nấm men, tham gia chủ yếu vào thành phần của nhân, hạt nhiễm sắc thể, enzim. Các ion: Ca2+, Mg2+ điều chỉnh sự phát triển của tế bào nấm men. Các ion: Fe3+, Mg2+ nằm trong thành phần của enzim hoạt động sinh học cũng ảnh hưởng tới sinh trưởng và phát triển của nấm men [16]. 2.5.3. Nguồn Oxi Đối với nấm men dùng để lên men, oxi cần trong giai đoạn đầu giúp nấm men sinh trưởng, tăng sinh khối. Quá trình lên men rượu diễn ra ở điều kiện yếm khí để tăng hiệu quả tạo cồn. Sự khuấy đảo làm tăng tốc độ lên men, rút ngắn thời gian lên men có lợi về mặt kinh tế nhưng không có lợi về công nghệ do tạo sản phẩm bậc hai quá lớn. 2.6. Các yếu tố ảnh hưởng tới quá trình lên men 2.6.1. pH môi trường Trong quá trình nuôi cấy, pH môi trường bị biến đổi khiến cho sự sinh sản của nấm men cũng bị biến đổi, ở giai đoạn cuối pH tăng lên một ít do môi trường lúc này bắt đầu khan hiếm chất dinh dưỡng và hoạt lực enzim trong tế bào lớn. Vì vậy nấm men tự phân huỷ và giải phóng NH3. Khi pH dưới 2 – 3 thì quá trình lên men bị yếu đi. Nếu pH trên 6,5 – 7,5 khả năng lên men vang phát triển tốt: 4,0 – 5,0. 2.6.2. ảnh hưởng của nhiệt độ Quá trình lên men thường sinh ra nhiệt và lượng nhiệt này có ảnh hưởng lớn đến chất lượng rượu. Nhiệt độ ảnh hưởng lớn đến quá trình phát triển của nấm men do các phản ứng sinh hoá diễn ra trong tế bào đều chịu sự chi phối của nhiệt độ. Nhiệt độ giới hạn của men rượu vang là không quá 300 c. ở 35 0c được coi là nhiệt độ nguy hiểm, tuy nhiên đây không được coi là quy luật chung tuyệt đối về nhiệt độ. Nhiệt độ 35 0c nấm men mất tác dụng , quá trình lên men bị dừng lại nhưng không bị chết nấm men. Trong quá trình lên men rượu vang, việc khống chế nhiệt độ dưới 30 0c là điều rất quan trọng. Nếu vượt quá đến nhiệt độ tới hạn (350 c ), quá trình lên men rượu bị ngừng lại ảnh hưởng đến việc chuyển hoá đường thành cồn và CO2. Đồng thời lượng đường sót lại chưa được lên men là môi trường cho các vi khuẩn sinh khí hoạt động, đặc biệt vi khuẩn chuyển hoá đường thành axit lắc tíc hoặc axit axetic, đó là hiện tượng hoá chua axit, làm giảm chất lượng rượu vang. Ngược lại ở nhiệt độ thấp (<20 0c), quá trình lên men xảy ra chậm chạp, các cấu tử có lợi cho rượu vang được hình thành quá ít. Quá trình lên men bắt đầu tốt ở nhiệt độ 200 c, ở 25 0c quá trình lên men xảy ra rõ rệt sau 12 h, còn 17 - 18 0c xảy ra sau 24 h. Quá trình lên men không diễn ra ở nhiệt độ thấp 100c. Như vậy nhiệt độ thích hợp cho nấm men phát triển là 20 - 28 0c. 2.6.3. ảnh hưởng của nồng độ cồn Nghiên cứu cho biết nồng độ cồn thích hợp cho rượu vang phát triển tốt: 9 – 140. Hàm lượng cồn cao gây khó khăn cho quá trình lên men, làm chậm, thậm chí làm dừng lại quá trình lên men. ảnh hưởng của cùng một hàm lượng cồn ở 300 c và 200c là hoàn toàn khác nhau. ở 300 c cồn gây ảnh hưởng xấu hơn ở 20 0c. Điều này có ý nghĩa quan trọng trong việc cải tạo chất lượng rượu vang. Nhiều thí nghiệm chỉ ra rằng, chính hàm lượng cồn cao (nồng độ cồn 14% ) đã cản trở sự lên men chứ không phải sự thiếu vắng các chất sinh trưởng hoặc sự tạo thành các chất kháng khuẩn. Để phục vụ cho công nghiệp sản xuất rượu vang, cải thiện chất lượng vang, nhiều nhà nghiên cứu đã tạo ra những nòi nấm men thích ứng với nồng độ cao. Việc sử dụng các nòi nấm men này là bổ ích song các nòi này rất nhạy cảm với nhiệt độ cao. 2.6.4. ảnh hưởng của nồng độ đường và áp suất thẩm thấu Ngoài yếu tố pH, nhiệt độ, độ cồn thì nồng độ đường cũng là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến quá trình lên men. Nồng độ đường cao, ức chế quá trình lên men. Nồng độ đường thích hợp khoảng 200 – 280 g/l. Nếu cao hơn nữa tốc độ lên men giảm đi. Đường và các chất hoà tan khác trong môi trường tạo áp suất, áp suất thẩm thấu chênh lệch giữa tế bào nấm men và môi trường nuôi cấy. Sự chênh lệch này làm cho các chất dinh dưỡng dễ hòa tan và thấm vào môi trường tế bào qua màng và sản phẩm của tế bào hoà tan vào môi trường. áp suất thẩm thấu quá cao gây hiện tượng khô sinh lý teo chất nguyên sinh. Nồng độ quá cao tế bào nấm men không sinh trưởng được. Nồng độ đường quá thấp tế bào sẽ ngừng phát triển. Phần 3 Đối tượng và phương pháp nghiên cứu 3.1. Đối tượng nghiên cứu Quả vải thiều (Litchi chinensis sonn ) được thu nhận từ hai trung tâm trồng và thu hoạch nhiều nhất ở Việt Nam là huyện Lục Ngạn (Bắc Giang ) và Thanh Hà (Hưng Yên ). Các chủng nấm men nghiên cứu được phân lập từ dịch cùi quả vải thiều có vị trí phân loại theo Yelinov N.(1996 ) sau đây: Lớp : Ascomycetes Bộ : Saccharomyateae Họ phụ : Saccharomyateaetdieae Giống : Saccharomyces Loài : Cervisiae 3.2. Hoá chất - Đường: glucoza, sacaorza. - Một số chất vô cơ: KH2SO4 ( Kalihiđrophotphat ). MgSO4. 7H2O ( Magie sun phat ). - Một số chất hữu cơ: Thạch agar, peptôn, phenolphtalein. - Nước cất, nước máy. - Cồn. 3.3. Dụng cụ thiết bị - Nồi hấp áp lực. - Cồn kế. - Kính hiển vi quang học. - Buồng đếm Goriaev. - Cân kỹ thuật và cân phân tích. - Tủ sấy. - Buồng vô trùng. - ống nghiệm. - Máy đo pH và giấy đo pH. - Hộp pêtri. - Bình cầu, bình tam giác. - Bàn trong thuỷ tinh, phễu thuỷ tinh, côc thuỷ tinh. - Que cấy, đèn cồn. 3.4. Môi trường Dựa vào tính chất của nấm men Saccharomyces cerevisiae chúng tôi chọn môi trường vô cơ theo tỷ lệ sau: 3.4.1. Môi trường Hansen (MT1 ) g/l: Môi trường phân lập và sơ tuyển chủng nấm men - Đường glucoza : 50 g. - Pepton : 5,0 g. - MgSO4. 7 H2O : 0,5 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Thạch agar : 20 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.4.2. Môi trường nhân giống (MT2 ): g/l. - Đường glucoza : 50 g. - Pepton : 5,0 g. - MgSO4. 7 H2O : 0,5 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.4.3. Môi trường lên men (MT3 ) : g/l. - Dịch siro hoa quả :200 - MgSO4. 7 H2O : 1,0 g. - KH2PO4 : 1,0 g. - (NH4)2SO4 : 1,0 g. - Nước cất : 1000 ml. 3.5. Phương pháp nghiên cứu: Trong đề tài này tôi sử dụng phương pháp nghiên cứu sau: Tuyển chọn khuẩn lạc nấm men. Xác định hoạt lực lên men bằng: + Cân bình trọng lượng. +Xác định số lượng tế bào trên buồng đếm Goriaev và hoạt hoá giống. Xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế. Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. Quan sát tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. Các phương pháp phân tích: + Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng chuẩn độ NaOH 0,1 N. + Xác định độ cồn bằng ancol kế rồi quy về độ cồn chuẩn 150c, bằng phương pháp hoá học. Xử lý số liệu bằng thống kê toán học. 3.5.1. Phân lập và tuyển chọn khuẩn lạc nấm men trên môi trường thạch đĩa: Để tuyển chọn một tập hợp tế bào nấm men của cùng một nòi có kích thước hình thái và khả năng lên men như nhau, chúng tôi chọn phương pháp phân lập trên hộp pêtri. Môi trường để tuyển chọn khuẩn lạc nấm men là Hansen. Các tiến hành: Môi trường phân lập được khử trùng và phân vào các hộp pêtri vô trùng để nguội theo phương pháp Pasteur. Dịch hoa quả đã được pha loãng 10-1- 10-10 bằng nước cất. Nhờ một hai giọt huyền phù với độ pha loãng 10-9 lên bề mặt thạch dàn đều bằng bàn trang. Gói kín và nuôi trong tủ ẩm ở điều kiện 24 – 280c trong 4 ngày trên bề mặt xuất hiện các khuẩn lạc, với các đặc điểm trắng, bóng đặc trưng cho nấm men (mép răng cưa và nhẵn bóng ). 3.5.2. Phương pháp hoạt hoá giống Trước khi cấy nấm men vào dịch lên men để có những tế bào to khoẻ thì tôi tiến hành hoạt hoá giống bằng cách nuôi trên môi trường thạch nghiêng 24 – 280c trong vòng 24 h trên máy lắc. Sau đó đem cấy vào dịch nhân giống được pha ở nồng độ đường 10% trong vòng 24 h được giống cấp hai. 3.5.3. Phương pháp xác định hoạt lực lên men của nấm men Để biết được hoạt lực lên men so sánh giữa các chủng, chúng tôi đã tiến hành dùng các phương pháp sau: * Phương pháp cân bình trọng lượng: Dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250 ml môi trường, có cùng một lượng tế bào nấm men của các giống khác nhau. Sau 24 h lên men đem cân trọng lượng chênh lệch giữa 2 lần cân là 0,1 thì dừng lại. * Phương pháp xác định tế bào bằng buồng đếm Goriaev: Cấy giống vào môi trường nhân giống ở 280c, lắc đều canh trường dùng pipet chia độ pha loãng canh trường. Tuỳ theo mức độ giai đoạn phát triển mà độ pha loãng theo tỷ lệ khác nhau. Dùng pipet lấy dịch pha loãng nhỏ vào một khe hở giữa hai tấm kính, chú ý tránh tạo bọt khí sau đó đặt lá kính lên trên để yên 3 – 5 phút rồi tiến hành soi trên kính hiển vi ở vật kính 10 và 40 đếm số tế bào trong 5 ô lớn chéo nhau. Cách tính số tế bào trong 1 ml : M = A. 50. B. Trong đó: M: Số tế bào trong 1 ml dịch huyền phù. A: Số lượng tế bào trung bình trong 1 ô vuông. B : Hệ số pha loãng. 3.5.4. Phương pháp phân tích + Xác định hàm lượng đường bằng khúc xạ kế. + Xác định độ pH bằng giấy đo pH và máy đo pH. + Xác định hàm lượng axit trong dịch lên men bằng cách: Dựa vào nguyên tắc trung hoà axit bằng dung dịch NaOH 0,1 N từ số ml NaOH 0,1 N dùng để chuẩn ta suy ra hàm lượng axit trong dịch lên men. Phản ứng trung hoà: OH- + H+ H2O 3.5.5. Quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. 3.5.6. Phương pháp xử lý các kết quả bằng thống kê toán học Xử lý các kết quả nghiên cứu và đánh giá theo phương pháp thống kê toán học thông qua các thông số sau: - Giá trị trung bình số học: = - Độ lệch chuẩn: = nếu n < 30 = nếu n 30 - Sai số trung bình số học: m = - Hệ số biến động: Cv % = . 100 (%). n : Số lần lặp lại. Xi : Giá trị đo lần thứ i. Phần 4 Kết quả nghiên cứu và thảo luận 4.1. Phân lập, tuyển chọn và định loại chủng nấm men 4.1.1. Tiêu chuẩn chọn chủng Quá trình sản xuất etanol phụ thuộc vào chủng dùng trong lên men. Nấm men sử dụng để lên men rượu vang từ dịch vải thiều phải đạt các yêu cầu sau: [10, 12]. - Lên men tốt trong môi trường có hàm lượng đường cao. - Chịu độ cồn và độ axit cao. - Tốc độ phát triển nhanh, chu kỳ lên men ngắn. - Hương thơm có tạo các este đặc biệt. - Dễ lắng trong. - ổn định lâu dài trong sản xuất. 4.1.2. Phân lập và tuyển chọn Môi trường phân lập là môi trường Hansen được thanh trùng theo ._.