Một số đặc trưng sinh học và sản xuất kháng huyết thanh virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV) năm 2008 - 2009

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ------------ —– ---------- NGUYỄN ĐỨC THÀNH MỘT SỐ ĐẶC TRƯNG SINH HỌC VÀ SẢN XUẤT KHÁNG HUYẾT THANH VIRUS KHẢM ĐỐM GÂN LÁ ỚT (CHILLI VEINAL MOTTLE VIRUS - ChiVMoV) NĂM 2008 - 2009 LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: BẢO VỆ THỰC VẬT Mã số : 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS. VŨ TRIỆU MÂN HÀ NỘI - 2009 LỜI CAM ĐOAN T«i xin cam ®oan ®©y lµ c«ng tr×nh nghiªn cøu cña riªng t«i. KÕt qu¶ nghiªn cøu trong luËn v¨n lµ kÕt qu¶ lao ®éng cña chÝnh t¸c gi¶. C¸c sè liÖu vµ kÕt qu¶ tr×nh bµy trong luËn v¨n lµ trung thùc vµ ch­a tõng ®­îc ai c«ng bè trong bÊt cø c«ng tr×nh nµo kh¸c. T«i xin cam ®oan r»ng mäi sù gióp ®ì cho viÖc thùc hiÖn luËn v¨n nµy ®· ®­îc c¶m ¬n vµ c¸c th«ng tin trÝch dÉn trong luËn v¨n ®Òu ®· ®­îc chØ râ nguån gèc. T¸c gi¶ luËn v¨n NguyÔn §øc Thµnh LỜI CẢM ƠN §Ó hoµn thµnh ®Ò tµi tèt nghiÖp ngoµi sù cè g¾ng cña b¶n th©n t«i ®· nhËn ®­îc rÊt nhiÒu sù quan t©m gióp ®ì nhiÖt t×nh cña thÇy c«, b¹n bÌ vµ ng­êi th©n. Tr­íc tiªn, t«i xin ®­îc bµy tá lßng biÕt ¬n s©u s¾c tíi thÇy gi¸o GS.TS. Vò TriÖu M©n vµ TS. Hµ ViÕt C­êng - Gi¸m ®èc Trung t©m BÖnh c©y nhiÖt ®íi -tr­êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi ®· tËn t×nh h­íng dÉn, gióp ®ì t«i trong qu¸ tr×nh thùc hiÖn ®Ò tµi vµ hoµn thµnh b¶n luËn v¨n nµy. T«i xin ®­îc göi lêi ch©n thµnh c¶m ¬n tíi c¸c thÇy c« gi¸o trong Khoa N«ng häc, ViÖn §µo t¹o Sau ®¹i häc. T«i xin göi lêi c¶m ¬n tíi c¸c bµ con n«ng d©n t¹i nhiÒu n¬i ®· t¹o ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho t«i trong thêi gian thùc hiÖn ®Ò tµi. T«i còng xin ®­îc ch©n thµnh c¶m ¬n c¸c c¸n bé t¹i Trung t©m BÖnh c©y nhiÖt ®íi, tr­êng §¹i häc N«ng nghiÖp Hµ Néi ®· nhiÖt t×nh gióp ®ì vµ t¹o mäi ®iÒu kiÖn thuËn lîi cho t«i trong thêi gian thùc hiÖn ®Ò tµi. Bªn c¹nh ®ã t«i xin göi lêi c¶m ¬n ch©n thµnh tíi tÊt c¶ ng­êi th©n, b¹n bÌ nh÷ng ng­êi lu«n bªn c¹nh ®éng viªn gióp ®ì t«i trong qu¸ tr×nh häc tËp vµ thùc hiÖn b¶n luËn v¨n nµy. Hµ Néi, ngµy 19 th¸ng 9 n¨m 2009 T¸c gi¶ luËn v¨n NguyÔn §øc Thµnh MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục các hình viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TT Chữ viết tắt Từ viết vắt BVTV Bảo vệ thực vật CPB Cây phát bệnh CS Cộng sự CT Công thức KHT Kháng huyết thanh NXB Nhà xuất bản SCTN Số cây thí nghiệm TLB Tỷ lệ bệnh TKTD Thời kỳ tiềm dục AVRDC Asian Vegetable Research and Development Center ChiVMoV Chilli Veinal Mottle Virus Da Dalton DEP Dilution End Point ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay ICTV International Comittee on Taxonomy of Viruses LIV Longevity In Vitro OD Optical Density ORF Open Reading Frame PCR Polymerase Chain Reaction PVMV Pepper Veinal Mottle Virus PVY Potato Virus Y RNA Ribonucleic Acid RT - PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction SD Standard Deviation TIP Thermal Inactivation Point UTR Untranslated Region DANH MỤC CÁC BẢNG TT Tên bảng Trang 4.1. Diễn biến bệnh do virus trên giống ớt cay Capsicum frutescens cv. Lai số 20 tại Hoàng Hanh - Ninh Giang - Hải Dương, vụ đông xuân 2008 - 2009 42 4.2. Diễn biến bệnh do virus trên giống ớt ngọt Mỹ Capsicum annuum L. tại Tiên Dương - Đông Anh - Hà Nội, vụ đông xuân 2008 - 2009 45 4.3. Kết quả kiểm tra một số loại virus gây hại ớt ngoài đồng, vụ đông xuân 2008 - 2009 bằng phương pháp ELISA 47 4.4. Kết quả kiểm tra virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) và virus đốm hình nhẫn ớt (ChiRSV) bằng phương pháp RT-PCR vụ đông xuân 2008 - 2009 50 4.5. Kết quả lây nhiễm ChiVMoV lên cây chỉ thị, cây trồng và cỏ dại bằng phương pháp tiếp xúc cơ học 54 4.6. Kết quả lây nhiễm ChiVMoV lên cây chỉ thị bằng phương pháp tiếp xúc cơ học trong điều kiện mùa hè 58 4.7. Kết quả xác định khả năng lan truyền của ChiVMoV qua rệp bông Aphis gossypii Glover 62 4.8. Kết quả xác định khả năng lan truyền của ChiVMoV qua ghép cây 63 4.9. Kết quả xác định khả năng lan truyền của ChiVMoV qua gieo hạt giống 64 4.10. Kết quả xác định khả năng lan truyền của ChiVMoV bằng phương pháp tiếp xúc cơ học từ nguồn cây nhiễm bệnh 65 4.11. Đánh giá ảnh hưởng của ChiVMoV đến một số chỉ tiêu sinh trưởng của giống ớt cay C. frutescens cv. Red Chilli trong thí nghiệm chậu vại 66 4.12. Kết quả đánh giá mức độ kháng, nhiễm ChiVMoV của một số giống ớt trong điều kiện lây bệnh nhân tạo trong nhà lưới 69 4.13. Kiểm tra sự có mặt của kháng thể ChiVMoV trong cơ thể thỏ thí nghiệm sau các tuần tiêm 73 4.14. Kết quả xác định ngưỡng pha loãng dịch cây với kháng huyết thanh ChiVMoV 75 4.15. Kết quả xác định ngưỡng pha loãng kháng huyết thanh ChiVMoV 77 4.16. Kết quả thử phản ứng chéo kháng huyết thanh ChiVMoV với một số virus khác 79 4.17. Kết quả thử nghiệm dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo và không dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo 83 4.18. Kết quả thử nghiệm dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo có ly tâm và dùng dịch cây khoẻ hấp phụ chéo không ly tâm 84 4.19. Kết quả kiểm tra một số virus gây hại ớt trên các mẫu ớt thu thập ngoài đồng, vụ hè thu 2009 bằng phương pháp ELISA 86 DANH MỤC CÁC HÌNH TT Tên hình Trang 4.1. Triệu chứng khảm gân xanh trên giống ớt cay C. frutescens cv. Lai số 20 40 4.2. Triệu chứng khảm gân xanh trên giống ớt ngọt Mỹ C. annuum L. 40 4.3. Triệu chứng khảm lùn trên giống ớt cay C. frutescens cv. Lai số 20 40 4.4. Triệu chứng khảm lùn trên giống ớt ngọt Mỹ C. annuum L. 40 4.5. Triệu chứng khảm biến dạng lá trên giống ớt cay C. frutescens cv. Lai số 20 41 4.6. Triệu chứng khảm biến dạng lá trên giống ớt ngọt Mỹ C. annuum L. 41 4.7. Triệu chứng khảm vàng loang lổ trên giống ớt cay C. frutescens cv. Lai số 20 41 4.8. Triệu chứng cuốn lá trên giống ớt ngọt Mỹ C. annuum L. 41 4.9. Triệu chứng khảm đốm hình nhẫn trên giống ớt ngọt Mỹ C. annuum L. 41 4.10. Diễn biến bệnh do virus trên giống ớt cay C. frutescens cv. Lai số 20 tại Hoàng Hanh - Ninh Giang - Hải Dương, vụ đông xuân 2008 - 2009 43 4.11. Diễn biến bệnh do virus trên giống ớt ngọt Mỹ C. annuum L. tại Tiên Dương - Đông Anh - Hà Nội, vụ đông xuân 2008 - 2009 46 4.12. Kết quả kiểm tra ChiVMoV và ChiRSV bằng phương pháp RT-PCR trên một số mẫu ớt thu thập ngoài đồng vụ đông xuân 2008 - 2009 50 4.13. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống thuốc lá N. tabacum cv. Samsun 59 4.14. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống thuốc lá N. tabacum cv. Xanthi-nc 59 4.15. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống thuốc lá N. tabacum cv. White Burley 59 4.16. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên thuốc lá cảnh Petunia hybrida 59 4.17. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống thuốc lá trồng N. tabacum cv. CB326 59 4.18. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống thuốc lá N.benthamiana 59 4.19. Triệu chứng nhiễm ChiVMoVtrên giống thuốc lào Nicotiana glutinosa 60 4.20. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên cây thù lù cạnh Physalis angulata L. 60 4.21. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên hoa và thân cây giống thuốc lá N. tabacum cv. White Burley 60 4.22. 1. Cây cà gai Datura sp. không nhiễm bệnh 60 2. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên cây cà gai Datura sp. 60 4.23. Rệp bông Aphis gossypii Glover dùng trong thí nghiệm 60 4.25. Số lá/cây và chiều cao cây của cây nhiễm ChiVMoV và cây khoẻ 67 4.26. Chiều dài lá và chiều rộng lá của cây nhiễm ChiVMoV và cây khoẻ 67 4.27. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống cay chỉ thiên quả nhỏ Capsicum minimum L. và cây khoẻ 71 4.28. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống ớt cay C. frutescens cv. Red Chilli 71 4.29. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống ớt sừng bò Bắc Ninh C.baccatum cv. Sungbo và cây khoẻ 71 4.30. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống ớt C. frutescens cv. LN-57 71 4.31. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống ớt C. frutescens cv. HB14 71 4.32. Triệu chứng nhiễm ChiVMoV trên giống ớt C. frutescens cv. MH-1107 và cây khoẻ 71 4.33. Sản phẩm kháng huyết thanh ChiVMoV tạo được 80 4.34. Kết quả kiểm tra sự có mặt của kháng thể ChiVMoV trong cơ thể thỏ sau các tuần tiêm 80 4.35. Kết quả xác định ngưỡng pha loãng dịch cây bệnh với kháng huyết thanh ChiVMoV 80 4.36. Kết quả xác định ngưỡng pha loãng kháng huyết thanh ChiVMoV 81 4.37. Kết quả thử nghiệm phản ứng chéo với kháng huyết thanh ChiVMoV 81 4.38. Kết quả kiểm tra ELISA các mẫu thí nghiệm trong nhà lưới 81 1. MỞ ĐẦU 1.1 Đặt vấn đề Rau là loại thực phẩm rất cần thiết cho đời sống hàng ngày và không thể thay thế được vì rau có vị trí quan trọng đối với sức khoẻ con người. Rau cung cấp cho cơ thể những chất quan trọng như protein, lipid, v.v... Rau có ưu thế hơn một số cây trồng khác về vitamin và chất khoáng. Rau là loại hàng hoá có giá trị xuất khẩu cao. Năm 1997, kim ngạch xuất khẩu rau quả của Việt Nam đạt 140 triệu USD, tăng 170% so với năm 1985 và chiếm 1,6% tổng kim ngạch xuất khẩu trong cả nước. Rau vừa là cây lương thực, vừa là nguyên liệu sử dụng trong công nghiệp chế biến (dẫn theo [4]). Về mặt y học, một số cây rau được sử dụng như những cây dược liệu quý. Về mặt xã hội, ngành sản xuất rau phát triển sẽ góp phần tăng thu nhập cho người lao động, sắp xếp lao động hợp lý, mở rộng ngành nghề, giải quyết việc làm cho nông dân trong những lúc nông nhàn, hỗ trợ các ngành khác trong nông nghiệp phát triển như cung cấp thức ăn cho chăn nuôi, v.v... Cây ớt (Capsicum spp.) thuộc chi Capsicum, họ Cà Solanaceae. Có hai loài phổ biến là ớt cay (Capsicum frutescens L.) và ớt ngọt (Capsicum annuum L.) được trồng rộng khắp trên thế giới. Trong những loại rau - gia vị thì ớt là cây được trồng ở nước ta từ lâu và là phần không thể thiếu trong bữa ăn hàng ngày của nhân dân ta, tiềm năng phát triển cây ớt ở nước ta là rất to lớn. Những năm gần đây, nhiều nơi đã trồng ớt ngọt cung cấp cho các nhu cầu đang phát triển của dân cư thành phố. Sản phẩm ớt ngọt được xem là loại rau đắt giá và hiệu quả gieo trồng cao. Có nhiều giống ớt khác nhau, có tên gọi cũng rất khác nhau tuỳ hình dạng hay đặc tính như ớt cay, ớt ngọt, ớt chỉ thiên, ớt hạt tiêu, ớt cà, v.v... Ớt được sử dụng với nhiều mục đích khác nhau như làm rau, làm thuốc, làm gia vị, làm cây cảnh. Sản phẩm ớt được sử dụng dưới nhiều dạng như lá, quả ớt tươi, ớt khô, ớt bột, muối mặn, vừa để đáp ứng nhu cầu trong nước, vừa là mặt hàng xuất khẩu có giá trị kinh tế cao. Theo Nguyễn Văn Luật (2008)[12], trong quả ớt có các chất nitơ (15%), tinh dầu (1,12%), dầu cố định (12,5%), các chất không có nitơ (35%), tro (15%), chất thơm, vitamin C (0,05%). Về hàm lượng dinh dưỡng, trong 100 g rau ớt có năng lượng là 29 Calo; 1,3 mg protein; 5,5 mg caroten và 250 mg vitamin C. Trong y học cổ truyền, ớt có vị cay xé, dẫn hoả, tính rất nóng có tác dụng làm ấm bụng, sát trùng, lợi tiểu, kích thích dạ dầy. Lá ớt có vị đắng, tính mát có tác dụng thanh nhiệt, giải độc. Trong quả ớt cay có chứa capsaicin (8 - methyl - N - vanilly - 6 - noneamide: C18H27NO3) và nhiều hợp chất khác gọi chung là nhóm capsaicinoid có vị cay, nóng, kích thích tiêu hoá, tạo cảm giác ngon miệng, giảm đau, v.v... Trong những năm gần đây, năng suất, sản lượng ớt ngày càng tăng cao, đồng thời ớt là cây cho thu hoạch nhiều lứa trong một năm, với những lợi thế như vậy kết hợp với việc giá cả ngày một tăng chính là động lực thúc đẩy cho người nông dân phát triển sản xuất. Tuy nhiên, trên thực tế cây ớt bị rất nhiều sâu bệnh phá hại, ví dụ như bệnh nấm, bệnh virus, héo xanh vi khuẩn, v.v... làm ảnh hưởng trực tiếp đến năng suất và chất lượng ớt, nhiều khi không cho thu hoạch. Bệnh do virus gây ra không những làm giảm năng suất, chất lượng ớt, mà đồng thời gây thoái hoá giống. Thành phần virus hại ớt bao gồm nhiều virus khác nhau thể hiện nhiều dạng triệu chứng khác nhau trên cây ớt sản xuất ngoài đồng ruộng. Cho đến nay những nghiên cứu về virus hại ớt còn rất hạn chế, rất ít tài liệu viết về virus hại ớt tại Việt Nam. Virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV) được coi là loài virus phổ biến nhất, làm giảm sút nghiêm trọng năng suất và sản lượng ớt ở các vùng trồng thuộc Châu Á. Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về các đặc trưng sinh học, đặc trưng hoá lý, hình thái học, huyết thanh học và sản xuất kháng huyết thanh ChiVMoV trong nước vẫn chưa được thực hiện. Do đó, nghiên cứu virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) nói riêng, các loại virus hại ớt nói chung là vấn đề quan trọng để từng bước góp phần định hướng phòng chống bệnh virus hại ớt phục vụ sản xuất. Xuất phát từ những vấn đề trên, được sự đồng ý của Bộ môn Bệnh cây, Khoa Nông học, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, dưới sự hướng dẫn của GS.TS. Vũ Triệu Mân, chúng tôi tiến hành nghiên cứu, thực hiện đề tài: “Một số đặc trưng sinh học và sản xuất kháng huyết thanh virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV) năm 2008 - 2009”. 1.2 Mục đích và yêu cầu 1.2.1 Mục đích - Xác định một số đặc trưng sinh học của virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV). - Thử nghiệm sản xuất kháng huyết thanh ChiVMoV. 1.2.2 Yêu cầu - Điều tra tình hình bệnh virus hại ớt tại một số vùng thuộc Hà Nội và phụ cận vụ đông xuân 2008 - 2009. - Mô tả triệu chứng bệnh trên ớt do virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) gây ra. - Xác định đặc điểm lan truyền của ChiVMoV qua tiếp xúc cơ học, qua côn trùng môi giới, qua ghép cây và qua hạt giống. - Làm sạch và thử nghiệm kháng huyết thanh ChiVMoV sản xuất. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Lược sử nguồn gốc, vị trí phân loại, tình hình sản xuất ớt trên thế giới và tại Việt Nam 2.1.1 Lược sử cây ớt Ớt đã là một phần trong ẩm thực của loài người ít nhất là 7.500 năm trước Công nguyên và có lẽ còn sớm hơn. Theo Wikipedia (2006)[74], ớt được trồng khắp nơi trên thế giới sau thời Christopher Columbus. Chanca D.A. trong chuyến đi thứ hai của Columbus C. vào năm 1493 đã mang những hạt ớt đầu tiên về Tây Ban Nha và đã lần đầu viết các tác dụng dược lý của ớt vào năm 1494. Từ Mexico, ớt đã nhanh chóng được chuyển qua Philippines, sau đó là Trung Quốc, Triều Tiên, Nhật Bản. Một con đường khác mà ớt di chuyển là do người Bồ Đào Nha lấy từ Tây Ban Nha sau đó đưa qua Ấn Độ, qua Trung Á và Thổ Nhĩ Kỳ, đến Hungary nơi ớt trở thành một gia vị quốc gia dưới dạng paprika. 2.1.2 Vị trí phân loại cây ớt Cây ớt Capsicum spp. thuộc chi Capsicum, họ Cà Solanaceae. Có 5 loài ớt được trồng phổ biến nhất (Wikipedia, 2006)[74]: Capsicum annuum: bao gồm các loại phổ biến như ớt chuông, paprika, cayenne, jalapeủos và chiltepin. Capsicum frutescens: bao gồm các loại ớt tabasco. Capsicum chinensis: bao gồm các loại ớt cay nhất như naga, habanero, Datil và Scotch bonnet. Capsicum pubescens: bao gồm các loại ớt rocoto Nam Mỹ. Capsicum baccatum: bao gồm các loại ớt aji Nam Mỹ. Theo Berke (2002)[23], có khoảng 150 loài ớt khác nhau dựa vào màu sắc, hình dạng và độ cay. 2.1.3 Tình hình sản xuất ớt trên thế giới Trong các cây họ Cà Solanaceae, ớt được coi là cây có tầm quan trọng thứ hai chỉ sau cây cà chua (Yoon et al., 1990)[76]. Châu Á được coi là vùng đất gia vị của thế giới, được biết đến bởi nguồn gốc xuất xứ, nơi sản xuất, tiêu thụ và xuất khẩu hàng đầu của hầu hết các loại gia vị. Trên thế giới có khoảng 70 loài cây trồng làm gia vị thì đều được trồng chủ yếu ở Châu Á như hồ tiêu, ớt, gừng, v.v… nổi tiếng với các nước như Ấn Độ, Việt Nam, Trung Quốc, Indonesia, Thái Lan, v.v…(Chomchalow, 1996)[31]. Theo Tổ chức Nông nghiệp và Lương thực của Liên Hiệp quốc (FAO, 1999) (dẫn theo [53]), sản lượng ớt của thế giới tăng từ 11 triệu tấn vào năm 1990 lên đến 16 triệu tấn vào năm 1996. Giá trị thương mại thế giới về ớt quả tươi đạt 1.400 triệu đô la Mỹ (USD) vào năm 1999. Theo Ali (2006)[21], diện tích trồng ớt ở Châu Á năm 2003 là 2,5 triệu ha chiếm 67% diện tích trồng ớt của thế giới, còn tổng sản lượng đạt 22,4 triệu tấn, chiếm 67,8% và đạt giá trị xuất khẩu 396 triệu USD. Hiện nay, Ấn Độ là nước xuất khẩu ớt lớn nhất thế giới, chiếm 25% tổng sản lượng toàn cầu, tiếp theo là Trung Quốc (24%), Tây Ban Nha (17%), Mexico (8%). Các nước nhập khẩu các sản phẩm từ ớt lớn nhất thế giới là Các tiểu vương quốc Ả Rập thống nhất (UAE), Liên minh Châu Âu (EU), Sri Lanca, Malaysia, Nhật Bản, Hàn Quốc. Trao đổi thương mại toàn cầu về ớt đạt gần 16% tổng sản phẩm gia vị, chiếm vị trí thứ hai chỉ sau cây hồ tiêu. 2.1.4 Tình hình sản xuất ớt tại Việt Nam Sản phẩm ớt bột trong nhiều thập kỷ trước đứng vị trí thứ nhất trong mặt hàng rau - gia vị xuất khẩu. Trong 5 năm (1986 - 1990), Tổng Công ty rau quả Việt Nam đã xuất sang thị trường Liên Xô (cũ) 22.900 tấn ớt bột. Riêng diện tích gieo trồng ớt cay ở các vùng ớt tập trung vào khoảng 3.000 hecta, năm 1998 lên đến 5.700 hecta [18]. Cây ớt được coi là một trong năm loại cây trồng chủ lực trong chương trình chọn tạo giống rau của Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn giai đoạn 2006 - 2010. Ớt được trồng tập trung chủ yếu ở các tỉnh thuộc miền Trung, Nam Bộ và cũng dần được mở rộng ra nhiều tỉnh khác trong cả nước với diện tích lớn nhằm cung cấp nguyên liệu cho các nhà máy, các công ty xuất khẩu đem lại lợi nhuận cao. Ninh Thuận là tỉnh có diện tích trồng ớt cay lớn nhất cả nước. Ớt ngọt cũng được trồng ở nhiều nơi có khí hậu mát mẻ, mang lại thu nhập đáng kể cho người sản xuất. 2.2 Những nghiên cứu ngoài nước 2.2.1 Một số nghiên cứu về bệnh virus hại ớt Ước tính thiệt hại do bệnh virus gây ra trên các loại cây trồng khoảng 15 tỉ USD mỗi năm, đặc biệt là ở các nước nhiệt đới và bán nhiệt đới (Van Fanbing, 1999) (dẫn theo [30]). Trên ớt có nhiều sâu nhện hại, như nhện trắng, rệp muội, bọ trĩ còn là các vector lan truyền bệnh virus, ngoài ra còn có nhiều bệnh hại quan trọng khác như bệnh héo xanh do vi khuẩn, do nấm Phytopthora sp., bệnh thán thư hại quả, đặc biệt là các bệnh do virus được coi là tác nhân chính, là trở ngại lớn nhất gây cản trở sản xuất ớt, làm giảm năng suất từ 60 - 100% (Yoon et al., 1990; Green, 1992a và 1993)[76], [39], [41]. Theo Green và Kim (1991)[38] có khoảng 35 loài virus khác nhau gây hại trên ớt, cho đến năm 2001 thì đã có tới hơn 65 loài virus khác nhau đã được phát hiện (AVRDC, 2001) (dẫn theo [67]). Số lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được phát hiện thêm. Riêng trên cây ớt có hơn 10 loài thuộc chi Potyvirus khác nhau gây hại. Potato virus Y (PVY) phân bố rộng rãi trên toàn thế giới và là loài virus duy nhất thuộc chi Potyvirus gây hại trên ớt ở các nước thuộc Châu Âu. Chilli veinal mottle virus (ChiVMoV) (Burnett, 1947; Ong et al., 1979), chilli ringspot virus (ChiRSV) (Ha et al., 2008)[43] phân bố ở Châu Á. Pepper veinal mottle virus (PVMV) phân bố ở Châu Phi (Brunt và Kenten, 1972; Wijs, 1973)[25], [73]. PVMV cũng được phát hiện ở Ấn Độ (Ravi et al., 1997)[63], ở Afghanistan (Cerkauskas, 2004)[28]. Pepper serve mosaic virus (PepSMV) (Feldman và Gracia, 1977), peru tomato virus (PTV) (Fernadez và Fulton, 1980), pepper mild mosaic virus (PMMV) (Debrot et al., 1981; Ladera et al., 1982), tobacco etch virus (TEV) (Purcifull và Hiebert, 1982)[61], pepper mottle virus (PepMoV) (Nelsson et al., 1982), pepper yellow mosaic virus (PepYMV) (Inoue et al., 2002)[48] và ecuadorian rocoto virus (ERV) (Bérenger et al., 2008)[24] phân bố chủ yếu ở Châu Mỹ. TEV và PepMoV cũng đã được phát hiện thấy ở nhiều nước thuộc các châu lục khác. Cây ớt nhiễm tomato mosaic virus (ToMV) thường có triệu chứng khảm lá nặng, kèm theo vết chết hoại màu vàng úa và cây trở lên còi cọc (Hollings và Huttinga, 1976)[44]. Tobacco ringspot virus (TRSV) gây hại trên ớt được mô tả lần đầu bởi Bidari và Reddy (1983) (dẫn theo [69]), phân bố rộng khắp trên toàn thế giới. Tobacco mosaic virus (TMV) gây nhiễm hệ thống trên ớt, với triệu chứng khảm lá kèm theo các vết đốm chết hoại, xuất hiện ở trên cả cuống lá, thân cây. Quả trên cây nhiễm bệnh nhỏ, biến dạng và có các vết chết hoại (Pategas et al., 1989). Cucumber mosaic virus (CMV) gây triệu chứng khảm lá và đốm hình nhẫn trên cây ớt (Palukaitis và Arenal, 2003)[58]. Cây ớt nhiễm tomato spotted wilt virus (TSWV) thường xuất hiện triệu chứng khảm lá nặng kèm theo các vết chết hoại màu vàng, trên thân có các vết bệnh dạng sọc màu vàng hoặc màu vàng úa, năng suất quả giảm sút nghiêm trọng. Quả trên cây nhiễm bệnh xuất hiện các vết chết hoại màu vàng thường nằm tập trung lại với nhau, đôi khi quả còn bị khảm sọc và đốm hình nhẫn (Cerkaukas, 2004; Kormelink, 2005)[28], [51]. Ở Afghanistan, một vài loài virus hại ớt được phát hiện dựa vào các đặc trưng sinh học như triệu chứng học, cây ký chủ, sự lan truyền của virus (Lal và Singh, 1988) (dẫn theo [67]). Ở Malaysia, theo kết quả điều tra bệnh virus hại ớt từ năm 1989 đến năm 1992 trên các vùng trồng ớt chủ yếu dựa vào đặc điểm triệu chứng gây hại, một số đặc trưng sinh học, hoá lý và huyết thanh học, tỷ lệ ớt nhiễm cucumber mosaic virus (CMV) là cao nhất, tiếp theo là chilli veinal mottle virus (CVMV), tobacco mosaic virus (TMV), tomato mosaic virus (ToMV), pepper veinal mottle virus (PVMV), tomato spotted wilt virus (TSWV) và tobacco etch virus (TEV). Đặc biệt, ở vùng Sarawak và Selangor, tỷ lệ cây nhiễm CVMV và CMV là cao nhất (Ong et al., 1979; Fujisawa et al., 1990). Theo kết quả nghiên cứu của Chew và Ong (1992) (dẫn theo [67]), trong suốt năm 1992, bệnh do virus truyền qua các môi trùng môi giới làm giảm năng suất ớt tới 60%. Theo Green (1992b và 1993)[40], [41], tính đến năm 1991, trong tổng số hơn 35 loài virus khác nhau gây hại trên ớt ở các vùng trồng trên thế giới đã được phát hiện thì có 12 loài gây hại trên ớt ở Châu Á Thái Bình Dương. Các loài phổ biến và quan trọng nhất là cucumber mosaic virus (CMV), chilli veinal mottle virus (CVMV), potato virus Y (PVY) và các virus thuộc chi Tobamovirus. Các loài ít quan trọng hơn là broad bean wilt virus (BBWV), alfalfa mosaic virus (AMV) và potato virus X (PVX). Alfalfa mosaic virus (AMV) xuất hiện trên ớt trồng ở các vùng lạnh như Hàn Quốc, Nhật Bản và các cao nguyên ở Indonesia và Philippines. Broad bean wilt virus (BBWV) thông báo được phát hiện thấy ở Trung Quốc và Nhật Bản. Hợp phần các virus gây cuốn lá được coi là virus quan trọng tiềm tàng gây hại trên ớt ở những vùng đất thấp nơi mà mật độ bọ phấn tăng cao và gây hại trên nhiều loại cây trồng khác (Varma, 1991) (dẫn theo [40]). Cũng có các công bố đã phát hiện thấy tobacco etch virus (TEV), tobacco rattle virus (TRV), tomato spotted wilt virus (TSWV) và pepper mottle virus (PepMoV) gây hại trên ớt ở Châu Á. Ở Ấn Độ, Dhawan và CS (1996)[33] đã chọn lọc được nhiều dòng giống kháng với các isolate CMV và PVY ở nước này. Theo Ravi và CS (1997)[63] có khoảng 10 loài virus khác nhau gây hại trên ớt ở Ấn Độ như pepper vein banding virus (PVBV), PVMV, CMV, PVY, TMV, tobacco streak virus (TSV) cũng đã được phát hiện trên cây ớt Capsicum annuum (Jain et al., 2004)[50]. Theo kết quả nghiên cứu của Khan và CS (2006)[52], triệu chứng cuốn lá ớt trồng ở Banthra lan truyền qua bọ phấn Bemissia tabaci là do chilli leaf curl virus (ChlCV) gây ra. Ở Sri Lanka, các loài virus gây hại có ý nghĩa quan trọng nhất là các loài gây triệu chứng cuốn lá và khảm lá. Trong các mẫu bệnh virus hại ớt thu thập ở nhiều vùng của nước này từ năm 1998 - 2000, các virus CMV và CVMV vẫn là phổ biến nhất với tỷ lệ bệnh từ 10-80% (Weeraratne và Yapa, 2002)[72]. Còn theo Galanihe và CS (2005)[35], bệnh do virus làm giảm sút năng suất ớt hơn 53%. Từ đó, các tác giả đã đánh giá và chọn lọc được nhiều dòng, giống ớt kháng với các CMV và CVMV ở Sri Lanka. Theo Shah và Khalid (2002)[66], trong 11 dòng ớt nhập nội thì có 6 dòng có tính kháng cao đối với các isolate CVMV gây hại trên ớt ở Pakistan. Ở Hàn Quốc, theo Choi và CS (2005)[30], từ năm 2001 đến 2004, các virus hại ớt được phát hiện ở các vùng trồng ớt của nước này là alfalfa mosaic virus (AMV), broad bean wilt virus (BBWV), cucumber mosaic virus (CMV), pepper mottle virus (PepMoV), pepper mild mottle virus (PMMoV), potato virus Y (PVY), tobacco mild green mosaic virus (TMGMV), tobacco mosaic virus (TMV), pepper vein chlorosis virus (PVCV), tomato spotted wilt virus (TSWV). Các virus CMV, PepMoV và PMMoV được coi là các virus gây hại phổ biến và quan trọng nhất trên đối với sản xuất ớt ở Hàn Quốc. Vào năm 2006, bùng phát dịch do virus gây ra trên hai giống ớt ngọt quả đỏ Capsicum annuum cv. Special và C. annuum cv. Fiesta trồng trong nhà kính ở tỉnh Jeonam, Hàn Quốc. Bằng phương pháp sinh học phân tử các tác giả đã xác định được tác nhân gây bệnh là do CMV và TSWV (Mun et al., 2008)[57]. Theo các kết quả điều tra ở các công ty bán hạt giống ở Châu Á thì có tới 16% các giống ớt đang được trồng tại Châu Á có mang nguồn gen từ AVRDC và đây là loại cây được trồng và tiêu thụ phổ biến ở các nước đang phát triển. Ngoài ra, một mô hình đã được thiết lập để đánh giá các isolate CMV, ChiVMoV và vi khuẩn héo xanh ở nhiều nước thuộc Châu Á nhằm quản lý tốt các bệnh hại này (Gniffke et al., 2005)[36]. Theo Moury và CS (2005)[56], các isolate của PVMV và ChiVMoV được sắp xếp vào kiểu hình 2 và 3 nằm trong mối liên quan đến các kiểu gen của ớt có mang các kiểu gen kháng khác nhau. Tính kháng đặc hiệu chỉ liên quan đến sự đa dạng phân tử của các isolate này. Chỉ có duy nhất một isolate PVMV gây hại trên ớt có các gen lặn pvr6 và pvr22, tuy nhiên các kiểu gen này không bị PVMV gây hại trên các cánh đồng trồng ớt ở Senegal mặc dù có sự xuất hiện của PVMV xung quanh các ruộng ớt. Ở Đài Loan, từ năm 1990 đến năm 2005, trong tổng số 1824 mẫu lá nhiễm virus thu thập tại các vùng khác nhau của Đài Loan thì có 37% số mẫu nhiễm ChiVMoV, 32% nhiễm CMV, 15% nhiễm PVY, 14% nhiễm PMMoV và 6% nhiễm ToMV, cũng không phát hiện thấy PVMV và virus thuộc chi Begomovirus (Green, 1992a; Zhang et al., 2006)[39], [77]. Ở Trung Quốc, theo Zhang và CS (2006)[77], trong tổng số 762 mẫu lá virus hại ớt thu thập tại các vùng trồng ở nước này từ năm 1999 đến năm 2005 được kiểm tra bằng phương pháp ELISA và PCR đã xác định được tỷ lệ nhiễm các virus ChiVMoV, CMV, PMMoV, ToMV và PVY lần lượt là 32%, 26%, 23%, 9% và 3%, trong các mẫu thử không có mẫu nào nhiễm PVMV và không nhiễm bất cứ một loại virus nào thuộc chi Begomovirus. ChiVMoV và CMV được coi là những loài virus phổ biến gây hại trên ớt ở Trung Quốc và Đài Loan. Các kết quả thực nghiệm đã chỉ ra rằng, các loài thuộc chi Begomovirus không gây hại trên ớt ở hai nước này mặc dù trước đó đã có các báo cáo công bố có hơn 9 loài virus thuộc chi Begomovirus gây hại trên các cây trồng khác ở Trung Quốc và Đài Loan (Fauquet et al., 2005) (dẫn theo [77]). Ở Nepal, theo Rashid và CS (2007)[62], bệnh virus hại trên ớt ngọt thường ở dạng hỗn hợp, phổ biến là các loài virus CMV và ChiVMoV với tỷ lệ bệnh từ 30 - 90% tuỳ theo từng địa phương khác nhau. Theo kết quả nghiên cứu của Bérenger và CS (2008)[24], dựa vào triệu chứng học và kết quả phân tích sinh học phân tử, một loài virus mới thuộc chi Potyvirus được phát hiện gây hại trên ớt Capsicum pubescens ở Ecuador, được đặt tên là ecuadorian rocoto virus (ERV). Các giống ớt có mang các gen pvr21, pvr22 và pvr4 lại có khả năng kháng với các isolate của ERV. 2.2.2 Những nghiên cứu về virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) Virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus) gây hại trên cây ớt cay (Capsicum frutescens L.) và cây ớt ngọt (Capsicum annuum L.) được Burnett (1947) mô tả lần đầu tiên ở Malaysia. Sau đó, virus khảm đốm gân lá ớt đã được giám định bằng phương pháp huyết thanh vào năm 1979 (Ong et al., 1979) (dẫn theo [67]). Virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus), ban đầu tên virus được viết tắt là CVMV, sau đó tên virus được viết tắt là ChiVMV và ChiVMoV. Hiện nay, để gọi đúng tên virus, từ viết tắt ChiVMoV được sử dụng nhiều nhất. Tên gọi khác: Chilli vein banding mottle virus (CVbMV) (Siriwong et al., 1995; Masato et al., 1999)[64], [54]. Pepper vein banding virus (PVBV) (Ravi et al., 1997)[63]. ChiVMoV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae. 2.2.2.1 Phân bố địa lý và những thiệt hại do ChiVMoV gây nên ChiVMoV đã được phát hiện và xác định ở Bắc Triều Tiên, Hàn Quốc, Đài Loan, Philippines, Thái Lan, Sri Lanka và nhiều nước khác (Brunt et al., 1990). ChiVMoV phổ biến ở các vùng trồng ớt thuộc Đông Nam Á và Nam Á. ChiVMoV gây hại trên ớt cay trồng ở vùng đất thấp thuộc miền Tây Malaysia là trở ngại lớn nhất cho việc phát triển sản xuất ớt ở vùng này. Còn ở vùng Penninsular, thiệt hại năng suất do ChiVMoV gây ra lên đến 50% trong trường hợp cây nhiễm bệnh sớm sau một tháng trồng. Còn ở nhiều vùng khác, cây nhiễm virus còn không cho thu hoạch, thiệt hại năng suất là 100%, phải nhổ bỏ trước khi được thu hoạch (Greenleaf, 1986) (dẫn theo [67]). Ở Pakistan, theo kết quả nghiên cứu của Hameed và CS (1995), dựa vào phương pháp huyết thanh học đã phát hiện tỷ lệ ớt nhiễm ChiVMoV là 21,03% vào năm 1993. Còn theo Shah và CS (2001)[65], tỷ lệ ớt nhiễm ChiVMoV lên đến 40,6% ở các tỉnh North West Frontier và tỷ lệ ớt nhiễm bệnh cao nhất lên đến 63% ở tỉnh Punjab. Ở Philippines, CVMV được phát hiện lần đầu trên ớt Capsicum annuum L. dựa vào đặc điểm triệu chứng gây hại trên cây ký chủ và được kiểm tra bằng phương pháp ELISA và xác định một số đặc trưng sinh học khác (Dolores và Makiling, 1996)[32]. Ở Ấn Độ, một tên khác của ChiVMoV là pepper vein banding virus (PVBV) gây hại trên ớt đã được phát hiện và được coi là loại virus phổ biến nhất, riêng ở vùng Karnataka tỷ lệ nhiễm PVBV lên đến 27% trong các mẫu thử (Ravi et al., 1997)[63]. Ở vùng Uttar Pradesh, tỷ lệ ớt nhiễm PVBV từ 5 - 75%, tỷ lệ trung bình lên đến 50% và tỷ lệ nhiễm PVBV cao nhất lên đến 75% ở vùng Gorakhpur trong năm 1997 - 1998. Triệu chứng nhiễm PVBV được chẩn đoán dựa vào việc quan sát triệu chứng, phổ ký chủ, đặc trưng sinh học, các đặc trưng hóa lý, hiển vi điện tử và huyết thanh học (Prakash et al., 2002) (dẫn theo [67]). Từ năm 1997, một dạng virus gây triệu chứng khảm sáng gân lá, cây còi cọc hại trên cây cà tím Châu Phi Solanum aethipicum cv. Tengeru White trồng ở miền Bắc Tanzania đã được phát hiện, với tỷ lệ bệnh điều tra từ 50 - 90%. Bằng phương pháp huyết thanh DAS-ELISA và xác định một số đặc trưng sinh học, các tác giả đã giám định được tác nhân gây bệnh là do ChiVMoV gây ra (Womdim et al., 2001)[75]. Đây là báo cáo đầu tiên về ChiVMoV gây hại trên cây cà tím ở Châu Phi. Theo kết quả điều tra của Trung tâm Nghiên cứu và Phát triển rau Châu Á (AVRDC) thực hiện ở 16 nước Châu Á thì tỷ lệ ớt nhiễm ChiVMoV trên đồng ruộng là 30%, làm giảm năng suất 55 - 95% đối với ớt ngọt và 9 - 74% đối với ớt cay (AVRDC, 2002) (dẫn theo [42], [67]). Theo các kết quả điều tra, ChiVMoV còn phát hiện thấy ở các vùng trồng ớt thuộc Australia, Indonesia, Papua New Guinea, quần đảo Torres Strait, Gove và Cape York Peninsular (Davis et al., 2004) (dẫn theo [67]). 2.._.2.2.2 Đặc trưng sinh học ChiVMoV thuộc chi Potyvirus, họ Potyviridae. Chi Potyvirus thuộc họ Potyviridae có hơn 200 loài virus khác nhau gây hại hơn 500 loài cây trồng thuộc hơn 60 thực vật và phân bố rộng khắp trên toàn thế giới. Các loài virus thuộc chi Potyvirus lan truyền qua tiếp xúc cơ học và lan truyền qua nhiều loài rệp muội theo phương thức truyền không bền vững, gây giảm sút nghiêm trọng năng suất của nhiều loài cây trồng thuộc họ Cà Solanaceae như khoai tây, cà chua, ớt, thuốc lá (Hollings và Brunt, 1981; ICTV, 2006a)[45], [46]. * Triệu chứng bệnh: Triệu chứng do ChiVMoV gây ra trên ớt thay đổi tuỳ thuộc vào cây ký chủ, isolate, thời gian lây nhiễm, phương thức trồng và các điều kiện môi trường. ChiVMoV thường gây ra các vết chết đốm hoại dạng hình tròn, màu vàng úa, gây nhiễm hệ thống toàn cây, trong khi đó PVMV cũng gây ra các vết chết hoại cục bộ nhưng không gây nhiễm hệ thống (Ong et al., 1979) (dẫn theo [67]) . Triệu chứng điển hình do ChiVMoV gây ra trên ớt là lá khảm đốm, gân lá có màu xanh đậm, ở vài giống, lá còn co nhỏ lại, biến dạng. Triệu chứng bệnh quan sát thấy rõ chủ yếu ở lá ngọn, lá bánh tẻ. Cây nhiễm bệnh sớm trở lên cằn cỗi, trên thân và nhánh xuất hiện các vết bệnh dạng sọc, màu xanh đậm, hầu hết hoa thường rụng sớm trước khi hình thành quả, nếu cây ra quả thì quả nhỏ bé, méo mó biến dạng, năng suất quả giảm sút rõ rệt. Trên các loài Capsicum annuum và Capsicum frutescens, triệu chứng do ChiVMoV gây ra là vết dạng khảm đốm màu xanh đậm nằm dọc theo gân lá chính, làm giảm kích thước lá và cây biến dạng, còi cọc. ChiVMoV gây ra triệu chứng khảm gân và biến dạng lá trên các loài Capsicum spp. khác, tuy nhiên triệu chứng bệnh thay đổi tuỳ thuộc vào giống trồng và thời gian nhiễm bệnh. Ở hầu hết các trường hợp, lá ở cây nhiễm bệnh xuất hiện các vết khảm đốm màu xanh đậm nằm chủ yếu ở các gân lá. Tuỳ thuộc vào giống, sự kéo dài thời gian lây nhiễm mà bệnh gây khảm lá, biến dạng lá, cây sinh trưởng còi cọc, đôi khi bệnh còn làm cho gân lá khảm vàng và xuất hiện các vết chết hoại ở phần đỉnh lá (Fujisawa et al., 1986; Green và Kim, 1991; Cerkauskas, 2004; ICTV, 2006b)[34], [38], [28], [47]. Theo Siriwong và CS (1995)[64], Prakash và CS (2002) (dẫn theo [67]) ChiVMoV tạo thể vùi dạng múi khế, dạng tròn và dạng lưỡi lam. Hiệu ứng của ChiVMoV còn liên quan đến sự hoạt động của các enzym peroxidase và catalase trên các bộ phận khác nhau của cây lây nhiễm. Enzym peroxidase tăng mạnh, còn enzym catalase lại giảm xuống rõ rệt ở lá cây bệnh so với lá cây khoẻ (Singh et al., 1996) (dẫn theo [67]) . * Sự lan truyền: ChiVMoV lan truyền qua tiếp xúc cơ học, côn trùng môi giới (vector) và ghép cây nhưng không lan truyền qua hạt giống (Cerkauskas, 2004; ICTV, 2006b) [28], [47]. - Sự lan truyền qua tiếp xúc cơ học: Trong điều kiện thí nghiệm, cây mẫn cảm nhiễm virus chỉ giới hạn trong vài họ thực vật, chủ yếu là các cây thuộc họ Cà Solanaceae. Các cây ký chủ mẫn cảm bao gồm: Capsicum annuum, C. frutescens, Hyoscyamus niger, Nicandra physalodes, N. megalosiphon, N. tabacum, Physalis floridana. Các cây lây nhiễm không phải là ký chủ mẫn cảm: Ageratum conyzoides, Arachis hypogaea, Brassica juncea, Brassica oleracea var. capitata, Cassia occidentalis, Catharanthus roseus, Chenopodium amaranticolor, C. capitatum, C. quinoa, Cucumis sativus, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Luffa acutangula, Lycopersicon esculentum, Nicotiana glutinosa, Nicotiana rustica, Passiflora edulis, Phaseolus vulgaris, Solanum melongena, Solanum nigrum, Tetragonia tetragonioides, Vigna unguiculata, Vigna sesquipedalis, Zea mays, Zinnia elegans. Các cây không mẫn cảm thuộc các họ thực vật: Amaranthaceae, Apocynaceae, Chenopodiaceae, Compositae, Cruciferae, Cucurbitacaeae, Gramineae, Leguminosae, Passifloraceae, Solanaceae, Tetragoniaceae. Cây duy trì và nhân nguồn: Capsicum annuum, Nicandra physalodes, N. megalosiphon, N. tabacum, Physalis floridana (ICTV, 2006b)[47]. Phổ ký chủ ngoài tự nhiên của ChiVMoV là các loài ớt Capsicum spp., cà chua (Lycopersicon esculentum Mill.), cà tím Châu Phi (Solanum aethiopicum) (Womdim et al., 2001)[75], hoa bướm Buddleja crispa (Mehra et al., 2005)[55], cà độc dược Datura metel (Shah, 2006)[67]. - Sự lan truyền qua côn trùng môi giới: ChiVMoV lan truyền qua nhiều loại rệp muội khác nhau như rệp đào (Myzus persicae), rệp bông (Aphis gossypii), rệp đen hại đậu đỗ (Aphis craccivora), rệp hại lá ngô (Rhopalosiphum maidis), rệp nâu hại cây có múi (Toxoptera citricidus), rệp hại cây mơ (Aphis spiraecola), rệp hại cây mận (Hysteroneura setariae) (Cerkauskas, 2004; ICTV, 2006b; Shah, 2006) [28], [47], [67]. Rệp chích hút mang virus từ cây nhiễm bệnh chỉ trong vòng vài giây. Rệp có thể truyền virus ngay lập tức ở lần chích hút khác rồi mất virus. Nhìn chung, virus được giữ lại trong cơ thể rệp không kéo dài hơn 60 phút. Rệp trưởng thành loại hình có cánh của các loại rệp muội trên là những vector chủ yếu lan truyền virus từ cây bệnh sang cây khoẻ và chúng là những vector khó phòng trừ nhất. Mức độ lan truyền của virus tăng mạnh khi mật độ rệp tăng cao. 2.2.2.3 Đặc trưng hoá lý Theo Fujisawa và CS (1986)[34], ChiVMoV có dạng hình sợi, kích thước (dài x rộng) 750 x 12 nm. Theo Siriwong và CS (1995)[64], Masato và CS (1999)[54], ChiVMoV có kích thước 765 x 13 nm, axit nucleic là RNA dạng sợi đơn, dương (+ ssRNA). Theo Prakash và CS (2002) (dẫn theo [67]) ChiVMoV có dạng hình sợi, kích thước chiều dài là 750 nm nhưng có đường kính rộng hơn là 20 nm. ChiVMoV có ngưỡng nhiệt độ mất hoạt tính (thermal inactivation point - TIP) từ 55 - 600C, thời gian tồn tại trong điều kiện phòng thí nghiệm (longevity in vitro - LIV) từ 7 - 8 ngày và ngưỡng pha loãng tới hạn (dilution end point - DEP) từ 10-3 đến 10-4 (Siriwong et al., 1995; ICTV, 2006b)[64], [47]. Theo kết quả nghiên cứu của Prakash và CS (2002) (dẫn theo [67]) ChiVMoV có TIP từ 60 - 650C, DEP từ 1/5000 đến 1/10.000 và LIV từ 2 đến 4 ngày. Theo Siriwong và CS (1995)[64], ChiVMoV có chứa RNA dạng sợi đơn, kích thước 10 kb và một protein chính dạng đơn có trọng lượng phân tử 34.000 Da (Daltons), protein vỏ (gen CP - coat protein gene) của ChiVMoV bao gồm 287 amino acid, có trọng lượng phân tử 32 K khi phân tích bằng phương pháp SDS-PAGE (sodium dadecyl sulfate - polyacrylamide gel electrophoresis), còn tỷ số A260/A280 từ 1,20 đến 1,28; hằng số sa lắng trong dung dịch CsCl đạt 1,328 g/m3. Theo Anindya và CS (2003)[22] bộ genom của PVBV có 971 nucleotide, ngoại trừ đuôi polyA (polyadenylated), chiều dài đầu 3’UTR (untranslated region) là 281 nucleotide, khung đọc mở (open reading frame -ORF) bắt đầu ở nucleotide 164 và kết thúc ở nucleotide 9430 mã hoá cho chuỗi polyprotein gồm 3088 amino acid. Theo ICTV (2006b)[47], axit nucleic của ChiVMoV là RNA, bộ genom của virus có cấu tạo cấu trúc protein và cấu trúc phi protein, chưa có công bố nào về lipid của virus. Theo kết quả nghiên cứu của Tsai và CS (2008)[29] bằng phương pháp sinh học phân tử xác định trình tự gen protein vỏ (CP gene) và đầu 3’UTR của 24 isolate ChiVMoV gây hại trên ớt thu thập tại các vùng thuộc các nước Trung Quốc, Ấn Độ, Indonesia, Đài Loan và Thái Lan vùng mã hoá cho gen CP có chiều dài 858 - 864 nucleotide và đầu 3’UTR có từ 275 - 289 nucleotide. Dựa vào kết quả phân tích tính đa dạng di truyền của 24 isolate đều thuộc cùng một loài ChiVMoV với hơn 94,8% amino acid và 89,5% trình tự nucleotide là giống nhau. Hai mươi bốn isolate ChiVMoV, các virus PVMV, chilli vein-banding mottle virus (CVbMV) và chilli vein-banding mottle virus Chiengmai (CVbMV-CM1) được sắp xếp thành ba nhóm. Ngoài ra, vùng bảo tồn có 204 amino acid ở điểm C trong gen CP của ChiVMoV và PVMV giống nhau hơn 90,2%, điều này có thể do phản ứng chéo huyết thanh giữa hai loài virus này. Kết quả này công bố cung cấp những thông tin hữu ích trong việc phát triển các nguồn gen kháng ChiVMoV và PVMV. 2.2.2.4 Mối quan hệ huyết thanh học ChiVMoV không có quan hệ huyết thanh với các virus cucumber mosaic virus (CMV), potato virus Y (PVY), potato virus X (PVX), pepper veinal mottle virus (PVMV), pepper mosaic virus (PMV), papaya ringspot virus (PRSV), peanut strip virus (PStV), tobacco etch virus (TEV), tobacco mosaic virus (TMV) (Ong et al., 1979; Prakash et al., 2002; Choi, 2003) (dẫn theo [67]), Siriwong et al. (1995)[64], Moury et al., 2005)[56], Shah (2006)[67]. 2.2.2.5 Biện pháp phòng chống Cho đến hiện nay vẫn chưa có loại thuốc hoá học nào phòng trừ được trực tiếp bệnh do virus gây ra. Theo nhiều công trình nghiên cứu khoa học của nhiều nhà khoa học trên thế giới, việc phòng chống bệnh do ChiVMoV có khả thi, có hiệu quả kinh tế là sử dụng giống kháng, giống chống chịu. Có nhiều dòng, giống ớt khác nhau đã được chọn lọc, lai tạo có tính kháng, chống chịu với ChiVMoV cùng với các isolate thuộc nhiều loài virus ở nhiều vùng địa lý khác nhau như VC 160A, LV.3633CVMV-R, HDA823, HDV, PSP-11, CV-1, CV-2, Blue star, Dalbon, Gypsy, Famer, Newcomer, v.v... Theo Poulos và CS (1991)[60], Caranta và Palloix (1996)[26], dòng ớt ngọt Capsicum annuum cv. Perennial kháng với isolate PVY-To72, ChiVMoV, PVMV, potyvirus E. Tính kháng đa gen đối với các virus thuộc chi Potyvirus trên một số dòng ớt ngọt được kết hợp bởi các isolate đặc hiệu và các isolate phổ rộng có mang hai gen lặn pvr22 và pvr6 (Caranta et al., 1997)[27] Theo Shied và CS (2005)[68], dòng ớt ngọt 0137-7002 kháng cao với tất cả các isolate ChiVMoV ở Đài Loan và ổn định trong điều kiện môi trường tự nhiên. Từ dòng ớt này, nhiều dòng, giống mới chịu nhiệt, chống chịu bệnh tốt được tạo ra nhằm phục vụ cho sản xuất ớt ngọt ở các vùng nhiệt đới. Trồng cây trong nhà lưới có mắt nhỏ để ngăn cản côn trùng. Sử dụng cây trồng khác bao quanh hoặc trồng xen khu ruộng trồng ớt, sử dụng bẫy dính màu vàng cùng kết hợp với các biện pháp quản lý dịch hại mang lại hiệu quả cao trong việc phòng chống các loài rệp muội là vector lan truyền, qua đó làm giảm tỷ lệ bệnh và thiệt hại do virus gây ra (Green, 1992a và 1992b; Cerkaukas, 2004; Cerruti et al., 2007)[39], [40], [29], [28]. Không trồng xen và luân canh ớt với các cây họ cà khác. Phát hiện sớm cây nhiễm bệnh để nhổ bỏ và phun thuốc hoá học để phòng trừ môi giới truyền bệnh nhằm hạn chế bệnh lây lan rộng. Vệ sinh đồng ruộng, khử trùng dụng cụ, cọc dàn và các trang thiết bị khác từ nơi có cây bệnh đến nơi cây sạch bệnh, trước và sau khi trồng và chăm sóc cây bằng hơi nước nóng và các hoá chất tẩy rửa như xà phòng. 2.3 Những nghiên cứu trong nước Theo kết quả nghiên cứu của Ngô Bích Hảo và Albrechtsen (2002)[9], trong 41 mẫu hạt giống đã được xác định của cây cà chua, cà tím, cà pháo, ớt cay và ớt ngọt thì có tới 24% mẫu hạt nhiễm tomato mosaic virus (ToMV). Trong 44 tài liệu công bố về loài nhện trắng Polyphagotarsonemus latus Bank từ năm 1934 - 1987 có tới 50% tài liệu gắn với điều tra phát hiện và phân biệt với bệnh virus. Điểm khác là mặt dưới lá mất màu xanh nhạt đặc trưng, chuyển sang màu xám hoặc thâm nâu hơi bóng láng. Đối với cây ớt khi bị nhện hại nặng lá nhỏ hơn bình thường, màu sắc đậm hơn, lá nhăn nheo và mép lá cong xuống phía dưới (Nguyễn Văn Đĩnh, 2004)[8]. Ở Việt Nam, bệnh hại trên ruộng ớt thường xuất hiện với những triệu chứng hỗn hợp do nhiều loại virus gây ra, thường ở một cây có 2 loại virus trở lên, có trường hợp tới 4 đến 5 loại virus (Vũ Triệu Mân và CS, 2007)[14]. Theo kết quả nghiên cứu của Hà Viết Cường và CS (2008)[43] đã xác định được 52 isolate của 13 loài virus khác nhau thuộc chi Potyvirus gây hại trên một số cây trồng ở Việt Nam, trong đó có virus hại ớt. Bằng cách xác định bộ genom của virus ở đầu 3’UTR, các tác giả đã xác định được 7 isolate của ChiVMoV gây hại trên ớt Capsicum annuum thu thập ở một số vùng của Việt Nam là Hà Nội (có 3 isolate), Yên Bái, Vĩnh Phúc, Huế và TP. Hồ Chí Minh đặt ký hiệu các isolate này là ChiVMoV-VN/C1-7. Bảy isolate này giống nhau đến 89,7 - 98,7% và giống với các isolate ChiVMoV phân lập ở Thái Lan và Ấn Độ đến 88,9 - 96,5%. Tuy nhiên, dựa vào kết quả phân tích cây phả hệ gen cho thấy, 7 isolate ChiVMoV ở Việt Nam thì giống hơn cả với các isolate ChiVMoV ở Thái Lan do có sự phân bố gần nhau về vị trí địa lý hơn so với các isolate ChiVMoV đã được phân lập ở Ấn Độ. Dựa vào các triệu chứng đặc trưng trên cây ký chủ và các kết quả phân tích sinh học phân tử, tác giả đã phát hiện được một loài gây hại mới trên ớt, đặt tên là chilli ringspot virus (ChiRSV). Đây là loài virus mới thuộc chi Potyvirus lần đầu tiên được phát hiện trên thế giới và mới chỉ phát hiện thấy ở Việt Nam. ChiRSV bao gồm có 2 isolate trên các mẫu virus hại ớt thu thập ở Ninh Thuận và Điện Biên Phủ, ký hiệu lần lượt là ChiRSV-VN/C8 và ChiRSV-VN/C9. Hai isolate này giống nhau đến 91,8% ở gen CP, 93% ở vùng 3’UTR và chúng có mối quan hệ gần với 4 isolate của tobacco vein banding mosaic virus (TVBMV), giống nhau 72,3 - 73,5% ở gen CP và giống 58,4 - 60% ở vùng 3’UTR. Tuy nhiên, phân tích cây phả hệ gen cho thấy ChiRSV và TVBMV là hai loài virus khác biệt nhau. 2.4 Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn 2.4.1 Ý nghĩa khoa học Virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV) là virus nguy hiểm gây hại trên ớt tại vùng Đông Nam Á và Nam Á. Việc nghiên cứu đề tài nhằm bổ sung, góp mới những nghiên cứu về bệnh virus hại trên ớt tại Việt Nam. 2.4.2 Ý nghĩa thực tiễn Việc nghiên cứu về ChiVMoV giúp bước đầu phát hiện, mô tả các dạng triệu chứng do ChiVMoV gây ra, để làm cơ sở cho phân biệt với các dạng triệu chứng khác do virus gây ra trên ớt. Sản xuất được kháng huyết thanh ChiVMoV dùng trong chẩn đoán, phát hiện nhanh tác nhân gây bệnh và chọn lọc giống ớt nhằm tạo các giống ớt kháng, chống chịu với bệnh do ChiVMoV gây ra. 3. ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Bệnh virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV). 3.2 Địa điểm nghiên cứu và thời gian thực hiện 3.2.1 Địa điểm nghiên cứu - Vùng trồng ớt tại một số tỉnh phía Bắc. - Trung tâm Nghiên cứu Bệnh cây nhiệt đới, Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 3.2.2 Thời gian thực hiện Từ tháng 12/2008 đến tháng 7/2009. 3.3 Vật liệu nghiên cứu 3.3.1 Thu thập mẫu, cây thí nghiệm và côn trùng môi giới - Mẫu lá ớt nghi nhiễm bệnh được thu thập trên những cây có triệu chứng bị virus điển hình, trên ruộng sản xuất tại các điểm điều tra. Ngắt 3 - 4 lá cho vào lọ nhựa có chứa các hạt silicagel đã được làm khô. Mô tả triệu chứng bệnh, đánh dấu ký hiệu lọ đựng mẫu. Với mẫu lá thu thập ở gần thì mang về phòng thí nghiệm, làm khô mẫu lá trong tủ sấy ở điều kiện nhiệt độ 370C. Khi mẫu lá khô, giòn lại cho vào lọ nhựa có chứa silicagel, đậy nắp cẩn thận và bảo quản trong ngăn mát của tủ lạnh. Với mẫu lá thu thập ở các địa điểm xa thì làm khô và bảo quản mẫu bằng silicagel. - Hạt, cây chỉ thị và cỏ dại dùng trong lây nhiễm bệnh nhân tạo. - Sử dụng côn trùng môi giới là rệp bông Aphis gossypii Glover thuộc họ Aphididae, bộ Cánh đều Homoptera. - Thỏ thí nghiệm. 3.3.2 Thiết bị, dụng cụ và hoá chất nghiên cứu * Thiết bị nghiên cứu: Máy đọc bản ELISA, máy PCR, tủ lạnh bảo quản mẫu, tủ định ôn, cân điện tử, bể nhiệt. * Dụng cụ nghiên cứu: - Pipet tự động 1 đầu côn : 10 - 20 mm, 100 mm, 200 mm, v.v... - Ống đong, bình thuỷ tinh, phễu lọc, vải lọc, giấy thấm. - Hộp nhựa có nắp để đựng bản ELISA. - Các khay, chậu nhựa để gieo và trồng cây chỉ thị. - Các dụng cụ khác: găng tay cao su, que thuỷ tinh, túi nhựa, v.v... * Hoá chất: - Các hoá chất thông dụng và hoá chất để pha dung dịch đệm, chất nền, các kháng huyết thanh của các virus thử nghiệm. - Các hoá chất dùng trong RT - PCR. 3.4 Nội dung nghiên cứu 1. Điều tra diễn biến bệnh theo các loại hình triệu chứng trên các giống ớt tại các điểm điều tra. 2. Xác định, mô tả triệu chứng bệnh virus trên ớt do ChiVMoV gây ra. 3. Thu thập mẫu bệnh tại các điểm điều tra. Giám định tác nhân gây bệnh do virus bằng phương pháp ELISA (enzyme linked immunosorbent assay), phương pháp RT - PCR (reverse transcription - polymerase chain reaction) và phương pháp cây chỉ thị (indicator plant). 4. Xác định một số đặc trưng sinh học của ChiVMoV. 5. Đánh giá mức độ kháng, nhiễm ChiVMoV của một số giống ớt trong thí nghiệm nhà lưới. 6. Lây nhiễm ChiVMoV lên cây thuốc lá để làm vật liệu cho sản xuất kháng huyết thanh. 7. Làm sạch và thử nghiệm kháng huyết thanh ChiVMoV sản xuất ra. 3.5 Phương pháp nghiên cứu 3.5.1 Phương pháp điều tra ngoài đồng Phương pháp nghiên cứu, điều tra và phát hiện bệnh hại [19]. Tiến hành điều tra bệnh hại ngoài đồng chuyên canh rau màu thuộc địa điểm nghiên cứu, chọn ruộng ớt đại diện cho giống, đại diện cho giai đoạn sinh trưởng và phát triển của ớt. Điều tra từ 3 - 5 điểm trên một cánh đồng. Tiến hành điều tra theo dõi các chỉ tiêu. Điều tra theo phương pháp 5 điểm trên đường chéo góc, mỗi điểm diện tích từ 50 - 100 cây đối với ruộng có diện tích lớn, điều tra 100% số cây đối với cây có diện tích nhỏ. Theo dõi định kỳ 10 ngày một lần, thu thập số liệu và tính tỷ lệ bệnh. Quan sát và mô tả đặc điểm cây nhiễm bệnh. Theo dõi diễn biến bệnh virus trên ớt theo loại hình triệu chứng, thu thập mẫu bệnh để kiểm tra bệnh do virus hại ớt ngoài đồng ruộng. 3.5.2 Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) bằng tiếp xúc cơ học Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) bằng tiếp xúc cơ học dựa theo tài liệu mô tả của Green (1991)[37], Vũ Triệu Mân (2003)[13] và [17]. 3.5.2.1 Giá thể để gieo cây chỉ thị, cây ký chủ phụ Đất phù sa được hấp khử trùng trong nồi hấp chuyên dụng ở nhiệt độ từ 115 đến 1200C trong thời gian 45 phút để tiêu diệt các nguồn bệnh vi sinh vật và các sinh vật khác có trong đất thí nghiệm. Đất sau khi đã được hấp khử trùng được bổ sung phân bón vi sinh và vỏ trấu hun tạo được giá thể dùng để gieo trồng cây chỉ thị. Cây chỉ thị được gieo trồng, chăm sóc cẩn thận. Khi cây lớn, đạt số lá thật nhất định thì tiến hành lây nhiễm nhân tạo. Với cây thuốc lá đạt 4 - 6 lá thật, cây rau muối và các cây khác có từ 7 - 10 lá thật. 3.5.2.2 Cây chỉ thị và cây ký chủ phụ Hạt cây chỉ thị dùng trong thí nghiệm do Trung tâm Bệnh cây nhiệt đới cung cấp có nguồn gốc từ Nhật Bản, Đan Mạch và Australia. Một số cây cỏ dại được thu thập từ đồng ruộng. Danh pháp tên gọi, phân loại thực vật thành phần cây thí nghiệm dựa theo tài liệu mô tả của Dương Văn Chín và CS (2000)[5], Wikipedia tiếng Việt (2006)[20], Hoàng Thị Sản (2009)[16]. Thành phần cây thí nghiệm:  * Họ Rền Amaranthaceae: Dền xanh Amaranthus viridis L.; nở ngày đất Gomphrena globosa L. * Họ Đu đủ Caricaceae: Đu đủ Carica papaya L. * Họ Bầu bí Cucurbitaceae: Dưa chuột Cucumis sativus L.; bí ngô Cucurbita pepo L.; bầu Lagenaria vulgaris Ser.; mướp hương Luffa acutangula (L.) Roxb. * Họ Rau muối Chenopodiaceae: Rau muối thân tím Chenopodium amaranticolor Coste.; rau muối hoang dại Chenopodium album L.; rau muối trắng Chenopodium quinoa Willd. * Họ Đậu Fabaceae: Đậu cô ve Phaseolus vulgaris L.; đậu đũa quả dài Vigna sesquipedalis Wight. * Họ Bông Malvaceae: Bông trồng Gossypium hirsutum L. * Họ Cà Solanaceae: Ớt cay Capsicum frutescens L.; ớt ngọt Capsicum annuum L.; thuốc lá Nicotiana benthamiana Domin, N. tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. White Burley, N. tabacum cv. Xanthi - nc, Petunia hybrida; thuốc lá trồng Nicotiana tabacum cv. CB326; thuốc lào Nicotiana glutinosa; cà chua Lycopersicon esculentum Mill.; thù lù cạnh Physalis angulata L.; lu lu đực Solanum nigrum L.; cà tím Solanum melongena cv. Mustang; cà pháo Solanum melongena var. depressum Bailey; cà gai Datura sp.; cà độc dược Datura stramonium L. 3.5.2.3 Cách lây nhiễm lên cây thí nghiệm Khi cây lây nhiễm có số lá thật đạt yêu cầu thí nghiệm thì tiến hành làm thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo lên cây lây nhiễm bằng phương pháp tiếp xúc cơ học và côn trùng môi giới. Tiến hành làm thí nghiệm vào buổi chiều. Cây chỉ thị được để trong bóng tối trước một ngày thí nghiệm. Nghiền mẫu lá bệnh trong dung dịch đệm 0,01M Phosphate, pH 7, với tỷ lệ 1 g lá bệnh/5 ml dung dịch đệm bằng chày cối sứ đã được khử trùng. Dung dịch 0,01M Phosphate, pH 7,0 được để lạnh trước khi làm thí nghiệm. Lọc phần dịch nghiền qua vải lọc để thu lấy dịch chiết và loại bỏ bã. Sau đó, thêm vào bột carborandum 600 Mesh vào hỗn hợp dịch đã được nghiền. Cối sứ chứa hỗn hợp dung dịch trên được đặt vào trong hộp đá lạnh. Đeo găng tay cao su và dùng ngón trỏ nhúng vào dịch hỗn hợp có chứa virus rồi sát nhẹ lên lá cây theo chiều từ cuống lá đến chóp lá. Sau thời gian lây nhiễm từ 30 phút, dùng bình xịt có chứa nước cất rửa dịch chiết và bột carborandum 600 Mesh bám trên bề mặt lá để thuận lợi cho việc quan sát triệu chứng bệnh sau này được rõ ràng. Cây thí nghiệm đặt trong nhà lưới chống côn trùng, thực hiện chăm sóc cây và theo dõi triệu chứng biểu hiện bệnh của cây lây nhiễm. Ghi chép, quan sát mô tả và đánh giá kết quả các chỉ tiêu theo dõi. Tiến hành theo dõi triệu chứng bệnh bằng việc hàng ngày quan sát các biến đổi trên cây, đặc điểm hình dạng và kích thước vết bệnh. 3.5.3 Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) bằng côn trùng môi giới 3.5.3.1 Phương pháp nuôi rệp Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) bằng côn trùng môi giới (vector) dựa theo tài liệu của Green (1991)[37], Nguyễn Thị Kim Oanh (1996)[15] và Bộ môn Côn trùng (2004)[1]. * Vector dùng trong thí nghiệm: Rệp bông Aphis gossypii Glover thu bắt trên cây đơn buốt, khoai nước và nuôi rệp trên cây ớt, thù lù cạnh. * Phương pháp tiến hành: Rệp non tuổi 1 đến trưởng thành được thu thập trên cây không triệu chứng ngoài đồng ruộng và được nuôi trên cây ký chủ ưa thích, không có triệu chứng bệnh. Cây lây rệp được giữ trong điều kiện cách ly. Dùng bút lông đã được thấm nước để bắt rệp. Công việc này tiến hành cẩn thận, từ từ, để rệp kịp rút ngòi ra khỏi cây, đồng thời tránh làm nát mẫu. Thu bắt rệp tuổi 2 - 3 đến trưởng thành (loại hình không có cánh). Thả rệp vào đĩa petri và để đói trong thời gian 60 phút, không bổ sung thức ăn cho rệp. Sau đó, bắt rệp thả vào lá nhiễm ChiVMoV được đặt trên giấy thấm chứa trong đĩa petri có đánh ký hiệu và số thứ tự. Lá được cắt và đặt nằm gọn trong đĩa petri, tránh rệp bò ra khỏi lá. Để rệp chích hút trong thời gian từ 2 - 3 phút rồi chuyển rệp lên cây thí nghiệm. Để rệp chích hút lên cây thí nghiệm trong thời gian 60 phút rồi sau đó phun thuốc Actara 25WG để diệt trừ rệp. Cây thí nghiệm được đặt trong lồng lưới cách ly côn trùng và để lồng vào trong nhà lưới. 3.5.3.2 Phương pháp lây nhiễm rệp muội với các cây thí nghiệm khác nhau Các cây thí nghiệm: thuốc lá Nicotiana tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. White Burley, N. tabacum cv. Xanthi-nc, ớt cay Capsicum frutescens cv. Red Chilli và rau muối Chenopodium amaranticolor. Mỗi công thức dùng 5 cây và thả 10 rệp/cây và có công thức đối chứng. Phương pháp tiến hành như mục 3.5.3.1. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%), triệu chứng bệnh và thời kỳ tiềm dục. 3.5.4 Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) qua ghép cây 3.5.4.1 Thiết kế thí nghiệm Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) qua ghép cây dựa theo tài liệu mô tả của Green (1991)[37]. Cây thuốc lá Nicotiana spp. được dùng trong thí nghiệm ghép cây. Cây dùng để ghép có cùng độ tuổi và chế độ chăm sóc là như nhau. Thí nghiệm gồm có 3 công thức. Mỗi công thức ghép 5 cây. Thiết kế thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (completely randomized design - CRD). - CT1: Ghép cành thuốc lá nhiễm ChiVMoV lên gốc ghép thuốc lá khoẻ. - CT2: Ghép cành thuốc lá khoẻ lên gốc ghép thuốc lá nhiễm ChiVMoV. - CT3: Ghép cành thuốc lá khoẻ lên gốc ghép thuốc lá khoẻ. 3.5.4.2 Phương pháp ghép cây Dùng dao lam đã được khử trùng cắt đoạn cành ghép ở phần ngọn cây có chiều dài khoảng 7-10 cm, cuối cành ghép cắt vát chéo một góc 40 - 450. Phần mang gốc ghép cũng cắt vát tương tự như đoạn cành ghép nhưng ngược chiều nhau. Sau đó, ép hai mặt cắt của cành mang đoạn ghép và gốc ghép vào với nhau, rồi dùng dây nilon mỏng màu trắng cố định chỗ ghép nối. Cuốn dây nilon cho kín vừa hết chỗ ghép nối. Sau mỗi công thức khác nhau thì thay dao lam mới. Đưa cây đã ghép vào trong buồng ẩm nhằm tránh chỗ ghép nối bị khô. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%), triệu chứng bệnh và thời kỳ tiềm dục. 3.5.5 Phương pháp xác định sự lan truyền của virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) qua hạt giống Tiến hành lây nhiễm ChiVMoV lên một số giống ớt cay và thuốc lá ở giai đoạn 12 - 14 lá thật. Mỗi giống lây 15 cây. Cách ly hoàn toàn cây đã lây nhiễm. Chăm sóc cho cây lớn để có thể ra hoa và kết trái được. Sau đó, thu các hạt từ các quả chín sinh lý của các cây lây nhiễm ChiVMoV để tiến hành làm các thí nghiệm khác. 3.5.5.1 Thí nghiệm lây nhiễm lên ChiVMoV cây chỉ thị Thu toàn bộ hạt trong quả trên cây đã nhiễm ChiVMoV, 10 quả/giống. Nghiền hạt bằng chày cối sứ đã được khử trùng trong đệm 0,01M Phosphate, pH 7,0. Cây thí nghiệm: thuốc lá Nicotiana tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. White Burley, N. tabacum cv. Xanthi - nc và ớt cay Capsicum frutescens cv. Red Chilli. Cách tiến hành lây nhiễm tương tự như mục 3.5.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%), triệu chứng bệnh và thời kỳ tiềm dục. 3.5.5.2 Thí nghiệm gieo hạt giống từ cây nhiễm bệnh Thu lấy hạt của quả chín sinh lý trên cây nhiễm ChiVMoV. Mỗi giống gieo 300 hạt vào khay trồng có lỗ gieo hạt. Khay trồng có 104 lỗ, gieo 1 hạt/lỗ. Cây thí nghiệm để trong nhà lưới chống côn trùng. Giá thể dùng để gieo hạt giống tương tự như mục 3.5.2.1. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ cây mọc (%), tỷ lệ cây có biểu hiện triệu chứng bất bình thường (%) và quan sát các biến đổi hàng ngày trên cây. 3.5.6 Phương pháp đánh giá ảnh hưởng của virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) đến một số chỉ tiêu sinh trưởng phát triển của ớt Cây thí nghiệm là giống ớt cay Capsicum frutescens cv. Red Chilli. Thiết kế thí nghiệm kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD) với 3 lần nhắc lại. Mỗi lần nhắc lại là 10 cây và có giống đối chứng. 3.5.6.1 Phương pháp gieo trồng Ngâm hạt bằng nước sạch trong 3 - 4 giờ, ủ cho hạt nứt nanh mới đem gieo. Gieo hạt giống ớt vào các khay nhựa. Giá để gieo hạt gồm đất phù sa đã được khử trùng, vỏ trấu hun và phân lân vi sinh theo tỷ lệ 2: 2: 1. Các thành phần giá thể được trộn đều, hạt đất đập nhỏ mịn. Khi cây có 1-2 lá thật chuyển cây trồng vào túi nhựa có kích thước dài x rộng là 23 x 18 cm. Giá thể dùng trồng cây gồm đất phù sa, vỏ trấu hun, phân lân vi sinh, phân hỗn hợp NPK và trộn đều nhau theo một tỷ lệ nhất định. 3.5.6.2 Phương pháp lây nhiễm ChiVMoV lên cây thí nghiệm Khi cây có 6-8 lá thật thì tiến hành lây nhiễm với ChiVMoV bằng phương pháp tiếp xúc cơ học, tương tự như mục 3.5.2.3. Cây thí nghiệm đặt trong nhà lưới cách ly côn trùng. Tiến hành chăm sóc và bón phân cho cây. 3.5.7 Phương pháp đánh giá giống kháng, nhiễm ChiVMoV trong nhà lưới Thí nghiệm đánh giá giống kháng, nhiễm bằng lây bệnh nhân tạo trong nhà lưới. Đánh giá phản ứng của giống với bệnh do ChiVMoV gây nên dựa vào thang phân cấp bệnh [19]. Thí nghiệm gồm 11 giống ớt được trồng phổ biến ở ngoài ruộng sản xuất. Mỗi giống ớt thí nghiệm 27 cây. Thiết kế thí nghiệm theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD). Giá thể dùng để gieo hạt giống tương tự như mục 3.5.2.1. Trồng 1 cây/1 chậu nhựa. Khi cây có 6-7 lá thật thì tiến hành lây nhiễm với ChiVMoV bằng phương pháp tiếp xúc cơ học, tương tự như mục 3.5.2.3. Sau 1 ngày lây nhiễm tiến hành lây nhiễm lại lần thứ 2. Cây thí nghiệm đặt trong nhà lưới cách ly côn trùng. Chỉ tiêu theo dõi: Tỷ lệ bệnh (%), triệu chứng bệnh và thời kỳ tiềm dục. 3.5.8 Phương pháp xác định virus bằng phương pháp huyết thanh Các phương pháp huyết thanh dựa theo tài liệu mô tả của Green (1991)[37] và Vũ Triệu Mân (2003)[13]. Sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp (Indirect - ELISA) để chẩn đoán một số bệnh virus thực vật. Các bước tiến hành: Bước 1: Cố định dịch cây cần kiểm tra vào bản, cần mỗi mẫu 0,2 g lá cho chày cối sứ đã được hấp khử trùng nghiền trong dung dịch Carbonate 0,05M pH 9,6 với tỷ lệ lá/dung dịch đệm (g/ml) 1/10 - 1/50. Hút lấy dịch trên tủa, nhỏ vào bản ELISA với lượng 100 ml/giếng. Sau đó để bản ELISA vào hộp ẩm và ủ qua một đêm ở nhiệt độ 40C. Bước 2: Chuẩn bị mẫu cây khoẻ nghiền trong dung dịch đệm pha huyết thanh (PBST-PVP-Ovalbumin) theo tỷ lệ 1/20 (g/ml). Cho kháng huyết thanh vào dịch cây khoẻ theo nồng độ đã pha loãng tuỳ từng loại kháng huyết thanh khuấy đều và để 45 phút trong điều kiện 370C. Bước 3: Rửa bản ELISA với đệm PBS - Tween 1X 3 lần và 2 lần bằng nước cất. Mỗi lần cách nhau 3 phút. Bước 4: Cố định kháng huyết thanh vào bản ELISA, nhỏ vào mỗi giếng 100 ml kháng huyết thanh đã pha loãng trong dịch cây khoẻ. Sau đó cho bản ELISA vào trong hộp ẩm và để ở điều kiện nhiệt độ 370C trong thời gian 1h30 phút. Bước 5: Rửa bản ELISA như ở bước 3. Bước 6: Cố định kháng huyết thanh của kháng nguyên IgG thỏ (conjugate AP-alkaline phosphate) với đệm PBST-PVP-Ovalbumin với độ hoà loãng 1/2000. Nhỏ vào mỗi giếng 100 ml. Đặt bản ELISA vào hộp ẩm và để ở nhiệt độ 370C trong 1h30 phút. Bước 7: Rửa bản ELISA như bước 3. Bước 8: Cố định chất nền và đánh giá kết quả: - Pha 0,5 mg NPP (p - nitrophenyl phosphate)/1ml đệm substrate rồi hoà tan bằng máy khuấy từ. - Sau đó nhỏ dung dịch trên vào bản ELISA, nhỏ 100 ml/giếng. Đưa bản ELISA vào hộp ẩm và để trong bóng tối ở điều kiện nhiệt độ phòng thí nghiệm với thời gian từ 60 - 90 phút. Bước 9: Đọc kết quả: Các giếng có màu vàng là các giếng có phản ứng (+) tức là cây nhiễm bệnh. Giếng không màu là cây không bị nhiễm bệnh. Đọc kết quả tiếp bằng cách đưa vào máy đọc ELISA ở bước sóng 405 nm. Dừng phản ứng bằng NaOH 3M với lượng 50 ml/giếng. 3.5.9 Phương pháp xác định virus bằng RT-PCR Phương pháp xác định virus bằng RT-PCR dựa theo tài liệu mô tả của Wang và CS (2003). 3.5.9.1 Tách chiết RNA tổng số từ mô lá Trước khi chiết, ủ đệm CTAB (cetyl trimethyl amonium bromide) đã được bổ sung β-ME (β-mercapto ethanol) theo tỷ lệ 10 ml/1 ml đệm trong bể nhiệt ở điều kiện nhiệt độ 600C trong thời g._.358 - 0.472 +/- 0.334 - 15 HN.VĐ3-03 Dải gân xanh lá, u sùi gân lá, cây thấp lùn, hoa rất ít 0.881 + 0.492 +/- 0.332 - 16 HN.VĐ3-04 Lá biến dạng co quắp, u sùi gân lá 0.362 - 0.396 - 0.324 - 17 HN.VĐ3-05 Khảm lá màu xanh đậm xanh nhạt 0.391 - 0.486 +/- 0.307 - 18 HN.TP1-01 01 Ớt cay, chỉ thiên Tiền Phong-Mê Linh - Hà Nội Khảm lá màu xanh nhạt vàng nhạt 0.387 - 0.254 - 0.311 - 19 HN.TP1-02 Khảm lá màu xanh đậm xanh nhạt 0.367 - 0.299 - 0.295 - 20 HN.TP1-03 Lá khảm vàng loang lổ 0.368 - 0.264 - 0.316 - 21 HN.TP2-01 02 Dải gân lá xanh, u sùi gân, lá biến dạng 0.590 +/- 0.558 +/- 0.310 - 22 HN.TP2-02 Lá biến dạng co quắp, cây thấp lùn 0.525 +/- 0.272 - 0.331 - 23 HN.TP2-03 Khảm lá màu xanh nhạt vàng nhạt 0.722 + 0.314 - 0.294 - 24 VP.NH-01 01 Ớt cay, chỉ thiên Nghĩa Hưng- Vĩnh Tường-Vĩnh Phúc Dải gân xanh lá 0.746 + 0.351 - 0.314 - 25 VP.NH-02 Khảm lá màu xanh đậm xanh nhạt 0.365 - 0.303 - 0.371 - 26 VP.NH-03 Gân lá khảm màu xanh đậm, lá co nhỏ 0.537 +/- 0.350 - 0.290 - 27 VP.CH1-01 01 Ớt cay, chỉ địa Chấn Hưng- Vĩnh Tường-Vĩnh Phúc Dải gân xanh lá 0.402 +/- 0.334 - 0.326 - 28 VP.CH1-02 Khảm lá màu xanh đậm xanh nhạt 0.421 +/- 0.263 - 0.316 - 29 VP.CH1-03 Gân lá khảm màu xanh đậm, u sùi gân, lá co nhỏ 0.410 +/- 0.334 - 0.342 - 30 VP.CH1-04 Hai mép lá co nhỏ lên phía mặt trên của lá 0.392 - 0.226 - 0.357 - 31 VP.CH2-01 02 Ớt cay, chỉ thiên Lá khảm vàng loang lổ 0.612 + 0.296 - 0.341 - 32 VP.CH2-02 Khảm lá màu xanh nhạt vàng nhạt, gân lá có mầu xanh 0.445 +/- 0.333 - 0.302 - 33 VP.CH2-03 Khảm lá màu xanh đậm xanh nhạt 2.051 + 0.325 - 0.332 - 34 VP.CH2-04 Lá khảm nặng, lá biến dạng co quắp 0.748 + 0.307 - 0.328 - 35 VP.CH2-05 Dải gân xanh lá 0.475 +/- 0.317 - 0.288 - 36 VP.CH3-01 03 Ớt cay, chỉ thiên Lá khảm vàng, gân lá có màu xanh đậm 0.761 + 0.368 - 0.234 - 37 VP.CH3-02 Khảm lá màu xanh đậm xanh nhạt 0.471 +/- 0.355 - 0.345 - 38 VP.CH3-03 Lá biến dạng co quắp, cây thấp lùn 0.382 - 0.297 - 0.300 - 39 VP.CH3-04 Dải gân xanh lá, u sùi gân lá 0.423 +/- 0.206 - 0.303 - 40 VP.CH4-01 04 Ớt cay, chỉ địa Lá khảm đốm hình nhẫn 0.401 +/- 0.331 - 0.348 - 41 VP.CH4-02 Khảm lá màu xanh đậm xanh nhạt, u sùi gân 0.391 - 0.343 - 0.335 - 42 VP.CH4-03 Khảm lá màu xanh đậm xanh nhạt 0.387 - 0.309 - 0.264 - 43 VP.CH4-04 Lá khảm nặng, lá biến dạng co quắp, cây thấp lùn 0.423 +/- 0.342 - 0.275 - 44 Đ/c (+) 0.743 + 2.702 + 1.189 + 45 Đ/c (-) 0.385 - 0.344 - 0.330 - 46 Đệm 0.347 - 0.285 - 0.316 - Ghi chú: Kết quả đọc sau 90 phút; CB: Cây bệnh; CK: Cây khoẻ; OD: Giá trị mật độ quang học đo ở bước sóng 405 nm; KL: Kết luận; +: Cây nhiễm bệnh; -: Cây khoẻ. 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận Qua kết quả nghiên cứu đề tài “Một số đặc trưng sinh học và sản xuất kháng huyết thanh virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV) năm 2008 - 2009”, chúng tôi có các kết luận như sau: 1. Điều tra diễn bệnh virus theo dạng triệu chứng cho thấy, tỷ lệ bệnh tổng số các virus hại ớt cao nhất lên đến 82,22% đối với giống ớt cay Capsicum frutescens cv. Lai số 20 tại Hoàng Hanh - Ninh Giang - Hải Dương và tỷ lệ bệnh tổng số cao nhất đối với giống ớt ngọt Mỹ Capsicum annuum L. tại Tiên Dương - Đông Anh - Hà Nội là 65,14%. 2. Kiểm tra các mẫu bệnh nghi nhiễm virus gây hại ớt ngoài đồng tại 8 xã thuộc 8 huyện của 7 tỉnh, thành phố khác nhau, vụ đông xuân 2008 - 2009 bằng phương pháp ELISA gián tiếp chưa phát hiện thấy mẫu bệnh nào nhiễm CMV, PVX và TMV. 3. Kiểm tra bằng phương pháp RT-PCR đã phát hiện thấy sự có mặt của virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV) gây hại trên ớt tại Hà Nội. Sản phẩm RT-PCR cho thấy virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) là một virus thuộc chi Potyvirus có kích thước đặc trưng là 415 bp. 4. Virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) có khả năng lan truyền qua tiếp xúc cơ học, qua côn trùng môi giới là rệp bông Aphis gossypii Glover và lan truyền qua ghép cây nhưng không truyền qua hạt giống trong thí nghiệm. 5. Các cây mẫn cảm với ChiVMoV trong điều kiện lây nhiễm bệnh nhân tạo đều thuộc họ Cà Solanaceae mà các loài cây thuộc các họ thực vật khác trong thí nghiệm không nhiễm ChiVMoV. Virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) lan truyền tốt trong điều kiện mùa đông và vẫn có khả năng lây nhiễm lên cây ký chủ trong điều kiện mùa hè nhưng tỷ lệ cây nhiễm bệnh thấp hơn hẳn và thời kỳ tiềm dục dài hơn. 6. Kết hợp với các mô tả triệu chứng ngoài đồng và lây nhiễm trong nhà lưới cho thấy virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) gây nên các triệu chứng đặc trưng hơn cả trên cây ớt là các dạng triệu chứng khảm gân xanh, lá biến dạng và gân lá u sùi. Trong điều kiện lây nhiễm bệnh nhân tạo trong nhà lưới cho thấy virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) làm giảm sút rõ rệt đến sự sinh trưởng của cây ớt nhiễm bệnh so với cây không lây nhiễm. 7. Đánh giá mức độ kháng, nhiễm một số giống ớt trong điều kiện chậu vại cho thấy, có 7 giống ớt nhiễm với virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV), giống ớt BM-738 có tính kháng vừa, còn các giống ớt CN225, BM-08 và MH-1107 có tính kháng với ChiVMoV hơn cả so với các giống ớt khác trong thí nghiệm. 8. Chúng tôi đã tạo được kháng huyết thanh virus khảm đốm gân lá ớt (chilli veinal mottle virus - ChiVMoV). Kháng huyết thanh ChiVMoV có ngưỡng pha loãng từ 1/100 đến 1/1500, với ngưỡng pha loãng dịch cây bệnh 1/10 đến 1/50 đều có khả năng phát hiện phân biệt cây bệnh và cây khoẻ. Kháng huyết thanh ChiVMoV có tính đặc hiệu cao, không phản ứng chéo với các virus PVY, PRSV, ScMV và TMV. Hấp phụ chéo dịch cây khoẻ với kháng huyết thanh ChiVMoV làm tăng tính đặc hiệu của phản ứng, tốt hơn so với không hấp phụ chéo dịch cây khoẻ. Việc hấp phụ chéo có ly tâm có tác dụng tốt hơn so với hấp phụ chéo không ly tâm trong việc chẩn đoán cây nhiễm ChiVMoV. 9. Kiểm tra bệnh virus gây hại ớt cay thu thập ngoài đồng trong vụ hè thu năm 2009 tại Hà Nội và Vĩnh Phúc phát hiện thấy sự có mặt của các virus ChiVMoV và CMV trong các mẫu kiểm tra nhưng chưa phát hiện thấy cây nhiễm virus TMV. 5.2 Đề nghị Hoàn toàn có thể sử dụng kháng huyết thanh ChiVMoV để phát hiện tác nhân gây bệnh là do virus khảm đốm gân lá ớt (ChiVMoV) gây ra. Cần chọn tạo được các giống ớt kháng, chống chịu tốt với ChiVMoV cũng như đối với một số virus có ý nghĩa khác gây hại trên ớt để đưa vào sản xuất. TÀI LIỆU THAM KHẢO A/ Tiếng Việt 1.Bộ môn Côn trùng (chủ biên) - trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (2004), Giáo trình Côn trùng chuyên khoa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 2.Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2006a), Giống ớt - qui phạm khảo nghiệm tính khác biệt, tính đồng nhất và tính ổn định, Tiêu chuẩn ngành 10TCN 690: 2006. 3.Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn (2006b), Giống ớt - qui phạm khảo nghiệm giá trị canh tác và giá trị sử dụng, Tiêu chuẩn ngành 10TCN 691: 2006. 4.Tạ Thu Cúc (chủ biên), Hồ Hữu An, Nghiêm Thị Bích Hà (2000), Giáo trình Cây rau, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 5.Dương Văn Chín, Hoàng Anh Cung, Suk Jin Koo, Yong Woong Kwon (2000), Cỏ dại phổ biến tại Việt Nam, NXB Nông nghiệp, TP. Hồ Chí Minh. 6.Phạm Tiến Dũng (2003), Xử lý kết quả thí nghiệm trên máy vi tính bằng IRRISTAT 4.0 trong Windows, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 7.Nguyễn Xuân Điệp (2008), Đánh giá khả năng chống chịu bệnh đốm gân ớt (Chilli veinal mottle virus - ChiVMV) của tập đoàn ớt (Capsicum spp.) tại khu vực Gia Lâm - Hà Nội vụ thu đông - xuân hè năm 2007 - 2008, Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp, chuyên ngành Di truyền - Chọn giống cây trồng, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 8.Nguyễn Văn Đĩnh (2004), Giáo trình Nhện nhỏ hại cây trồng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 9.Ngô Bích Hảo, Sven Erik Albrechten (2002), “Phát hiện những virus trên cà chua, ớt cay, ớt ngọt và nhận dạng Tomato mosaic virus ở miền Bắc Việt Nam”, Hội thảo Quốc gia Bệnh cây và Sinh học phân tử lần thứ 1 tại Trường Đại học Nông Lâm TP. Hồ Chí Minh, ngày 26/02/2002, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, Tr. 6 - 11. 10.Nguyễn Thị Lan (chủ biên), Phạm Tiến Dũng (2006), Giáo trình Phương pháp thí nghiệm, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 11.Nguyễn Thị Thuý Linh (2008), Thành phần sâu, nhện hại ớt, đặc điểm sinh vật học, sinh thái học và biện pháp phòng trừ loài rệp bông Aphis gossypii Glover hại ớt vụ xuân hè năm 2008 tại Mai Lâm - Đông Anh - Hà Nội, Luận văn Thạc sĩ Nông nghiệp, chuyên ngành Bảo vệ thực vật, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 12.Nguyễn Văn Luật (2008), Rau gia vị - kỹ thuật trồng, làm thuốc nam và nấu nướng, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 13.Vũ Triệu Mân (2003), Chẩn đoán nhanh bệnh hại thực vật, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 14.Vũ Triệu Mân (chủ biên) và các tác giả - trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội (2007), Giáo trình Bệnh cây chuyên khoa, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 15.Nguyễn Thị Kim Oanh (1996), Nghiên cứu thành phần, đặc tính sinh học, sinh thái học của một số loài rệp muội (Aphididae : Homoptera) hại cây trồng vùng Hà Nội, Luận án Tiến sĩ khoa học Nông nghiệp, trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 16.Hoàng Thị Sản (2009), Giáo trình Phân loại thực vật, NXB Giáo dục. 17.Nguyễn Văn Tuất (2002), Kỹ thuật chẩn đoán và giám định bệnh hại cây trồng, NXB Nông Nghiệp, Hà Nội. 18.Trần Khắc Thi và Nguyễn Công Hoan (2005), Kỹ thuật trồng rau sạch, rau an toàn và chế biến rau xuất khẩu, NXB Thanh Hoá. 19.Viện Bảo vệ thực vật (2000), Phương pháp nghiên cứu bảo vệ thực vật, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 20.Wikipedia tiếng Việt (2006), Phân loại thực vật, ân_loại_thực_vật B/ Tiếng Anh 21.Ali M. (editor) (2006), Chili (Capsicum spp.) Food Chain Analysis: Setting Research Priorities in Asia, Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, Taiwan, Technical Bulletin, No. 38, AVRDC Publication 06-678. 22.Anindya R., J. Joseph, T.D.S. Gowri and H.S. Savithri (2003), “Complet genomic sequence of Pepper vein banding virus (PVBV): a distinct member of the genus Potyvirus” (Summary), Original article Archives of Virology 149: 625-632, 23.Berke T. (2002), “The Asian Vegetable Research and Development Center Pepper Project”, In the Proceedings of the 16th International Pepper Conference, November 10 - 12, 2002, Tampico, Tamaulipas, Mexico. 24.Bérenger J., M.F. Fabre, A. Palloix and B. Moury (2008), “Characterization of a new potyvirus infecting pepper crops in Ecuador”, Brief report, Archives of Virology 153: 1543-1548, Published online as DOI 10.1007/s00705-008-0132-8. 25.Brunt A.A. and R.H. Kenten (1972), Pepper veinal mottle virus, Descriptions of Plant Viruses, No. 104/1972, 26.Caranta C. and A. Palloix (1996), “Both common and specific genetic factors are involved in polygenic resistance of pepper to several potyviruses”, Theoretical and Applied Genetics 92: 15-20. 27.Caranta C., V. Lefebvre and A. Palloix (1997), “Polygenic resistance of pepper to potyviruses consists of a combination of isolate - specific and broad - spectrum quantitative trait loci”, Molecular Plant Microb Interactions 10: 872-878. 28.Cerkauskas R. (2004), Pepper diseases, In the Fact Sheet, Asian Vegetable Research and Development Center, AVRDC Publication 04-586 : 596. 29.Cerruti R.H., A. Fereres and K.H. Wang (2007), Using protector plants to guard crops from aphid - borne non persistant viruses, Soil and Crop Management, Published by College of Tropical agriculture and Human resources, University of Hawaii at Manao, USA. 30.Choi G.S., J.H. Kim and K.H. Ruy (2005), “Occurrence and distribution of viruses infecting pepper in Korea”, Korean Journal of Plant Pathology 21(3): 258-261. 31.Chomchalow N. (1996), “Spice production in Asia - an overview”, Unpublished paper presented at the IBC’s Asia Spice Markets ’96 Conference, Singapore, 27 - 28 May, 1996. 32.Dolores L.M. and A.T. Makiling (1996), “Host range and symptomatology of Chilli veinal mottle virus (CVMV) and Cucumber mosaic virus (CMV) isolated from pepper Capsicum annuum L.” Summary in the Proceedings of the 27th Annual Scientific Meeting of the Pest Management, Coucil of the Philippines, Davao City, 7-10 May, 1996. 33.Dhawan P., J.K. Dang, M.S. Sangwan and S.K. Arora (1996), “Screening of chilli cultivars and accessions for resistance to Cucumber mosaic virus and Potato virus Y”, Capsicum and Eggplant Newsletter 16: 55-57. 34.Fujisawa I., T. Handa and S.B. Anang (1986), “Virus diseases occuring on some vegetable crops in West Malaysia”, Jpn. Agr. Res Quarterly 20(1): 78-84. 35.Galanihe L.D., M.G.D.L. Priyanth, D.R. Yapa, H.M.S. Bandara and J.A.D.A.R. Ranasinghe (2004), “Insect pest and disease incidences of exotic hybrid chili varieties grown in the low country dry zone of Sri Lanka”, Ananals of the Sri Lanka Department of Agriculture 6: 99-106. 36.Gniffke P.A., S.K. Green, J.F. Wang and T.C. Wang (2005), “Improving chilli peppers for developing countries” (Abstract), Hortscience 40 (4): 980. 37.Green S.K. (1991), Guideline for diagnostic work in plant virology, Asian Vegetable Research and Development Center, Technical Bulletin, No. 15, Second Edition, AVRDC Publication. 38.Green S.K. and J.S. Kim (1991), Characteristics and control of viruses infecting peppers: a literature review, Asian Vegetable Research and Development Center, Technical Bulletin, No. 18, AVRDC Publication. 39.Green S.K (1992a), Integrated control of diseases of vegetables in Taiwan, Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, Taiwan, pp. 35 - 68, AVRDC Publication. 40.Green S.K. (1992b), “Viruses in Asia Pacific region”, In the Proceedings of the Conference on chilli pepper production in the tropics, 13-14 October, 1992, Kuala Lumpur, Malaysia, pp. 99-129. 41.Green S.K. (1993), “Pepper virus research in Taiwan and other Asian countries”, In the Proceedings of the Symposium on Plant viruses and Virus - like diseases, Council of Agriculture Plant Protection, Series No.1, pp. 213 - 243, AVRDC Publication, 42.Green S.K. (2005), AVRDC develops pepper germplasm that is resistant to eight isolates of Chilli veinal mottle virus (ChiVMV), 43.Ha C., P. Revill, R.M. Harding, M. Vu, J.L. Dale (2008), “Identification and sequence analysis of potyviruses infecting in Vietnam”, Archives of Virology 153: 45-60, Published online as DOI: 10.1007/s000705-007-1067-1, Printed in The Netherlands. 44.Hollings M. and H. Huttinga (1976), Tomato mosaic virus, Descriptions of Plant Viruses, No. 156/1976, 45.Hollings M. and A.A. Brunt (1981), Potyvirus group, Descriptions of Plant Viruses, No. 245/1981, 46.ICTVdB Management (2006a), 00.057.0.01 - Potyvirus, In: ICTVdB - The Universal virus database, Version 4, Buchen - Osmond C. (editor), Columbia University, New York, USA, htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ICTVdb/ ICTVdB/00.057.0.01 47.ICTVdB Management (2006b), 00.057.0.01.016 - Chilli veinal mottle virus, In: ICTVdB - The Universal virus database, Version 4, Buchen - Osmond C. (editor), Columbia University, New York, USA, htpp://www.ncbi.nlm.nih.gov/ICTVdb/ ICTVdB/00.057.0.01.016 48.Inoue N.A.K., M.E.N. Fonseca, R.O. Resend, L.S. Boiteux et al. (2002), “Pepper yellow mosaic virus, a new potyvirus in sweet pepper Capsicum annuum”, Brief report, Archives of Virology 147: 849-855, Printed in Austria. 49.Im K.H. and S.K. Green (1988), “Purification and antisera productions of Chilli veinal mottle virus (CVMV) and Pepper mottle virus (PeMV)”, Plant Pathology, Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, Taiwan, AVRDC Publication, 50.Jain R.K., S. Bag and L.P. Awasthi (2004), First report of natural infection of Capsicum annuum by Tobacco streak virus in India, 51.Kormelink R. (2005), Tomato spotted wilt virus, Descriptions of Plant Viruses, No. 412/2005, 52.Khan S.M., S.K. Raj, T. Bano and V.K. Garg (2006), “Incidence and management of mosaic and leaf curl diseases in cultivars of chilli Capsicum annuum”, Journal of Food, Agriculture and Environment 4(1): 171 - 174. 53.Klieber A. (2000), Chilli spice production in Australia, RIRDC Production, No 00/33. 54.Masato I., A. Hideki and C. Pissawan (1999), “Nucleotide sequence of the 3’- terminal region of Chilli vein - banding mottle potyvirus isolated from pepper in Thailand”, Short Communication, World Journal of Microbiology and Biotechnology 15: 401-402, Published online as DOI 1023/A:1008935631895, Kluver Academic Publishers, Printed in The Netherlands. 55.Mehra A., V. Hallan, L. Brij and A.A. Zaidi (2005), Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Himalayan butterfly bush (Buddleja crispa), 56.Moury B., A. Palloix, C. Caranta, P. Gognalons, S. Souche, S.K. Gebre and G. Marchoux (2005), “Serological, molecular and pathotype diversity of Pepper veinal mottle virus and Chilli veinal mottle virus”, Phytopathology 95: 227 - 232. 57.Mun H.Y., M.R. Park, H.B. Lee and K.H. Kim (2008), “Outbreak of Cucumber mosaic virus and Tomato spotted wilt virus on bell pepper grown in Jeonnam province in Korea”, Korean Journal of Plant Pathology 24(1): 93-96. 58.Palukaitis P. and F.G. Arenal (2003), Cucumber mosaic virus, Descriptions of Plant Viruses, No. 400/2003, 59.Pasko P., R.G. Ortega and M.L. Arteaga (1996), “Resistance to Potato virus Y in peppers”, Capsicum and Eggplant Newsletter 16: 11- 27. 60.Poulos J.M., S.K. Green and J.T. Wang (1991), Genetic of resistance to Chili veinal mottle and Pepper veinal mottle viruses in Capsicum annuum, Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, Taiwan, AVRDC Publication, 61.Purcifull D.E. and E. Hiebert (1982), Tobacco etch virus, Descriptions of Plant Viruses, No. 258/1982, 62.Rashid M.H., K.M. Khalequzzaman, M.S. Alam, S.A. Uddin and S.K. Green (2007), “Screening of different sweet pepper lines against Cucumber mosaic virus and Chili veinal mottle virus”, Int. J. Sustain. Crop Prod. 2(3): 1-4. 63.Ravi K.S., J. Joseph, N. Nagaraju, P.S. Krishna, H.R. Reddy and H.S. Savithri (1997), “Characterization of Pepper vein banding virus from chili pepper in India”, Plant Disease 81: 673 - 676. 64.Siriwong P., K. Kittipakorn and M. Ikegami (1995), “Characterization of Chilli vein banding mottle virus isolated from pepper in Thailand” (Abstract), Original article Plant Pathology 57(3): 408 - 416, 65.Shah, H., S. Khalid and I. Ahmad (2001), “Prevalence and distribution of four pepper viruses in Sindh, Punjab and North West Frontier Province”, Online Journal of Biological Sciences 1(4): 214-217, Asian Network for Scientific Information, 66.Shah H. and S. Khalid (2002), “Screening of exotic pepper lines against local isolate of Chili veinal mottle Potyvirus”, Online Journal of Biological Sciences 1(1): 1078 - 1080, Asian Network for Scientific Information, 67.Shah H. (2006), Characterization of Pakistan isolates of Chilli veinal mottle virus Potyvirus (ChiVMV), PhD thesis, University of Arid Agriculture, Pakistan, 68.Shieh S.C., S.W. Lin, Z.M. Sheu, J.F. Wang, S.K. Green and P.A. Gniffke (2005), Development of a heat tolerant and disease resistant sweet pepper variety, 69. Smith R.S. (1985), Tobacco ringspot virus, Descriptions of Plant Viruses, No. 309/1985, 70.Tsai W.S., Y.C. Huang, D.Y. Zhang, K. Reddy, S.H. Hidayat, W. Srithongchai, S.K. Green and F.T. Jan (2008), Molecular characterization of CP gene and 3’UTR of Chilli veinal mottle virus from South and Southeast Asia, (Abstract), 71.Wang J., Z. Liu, S. Niu, M. Peng, D. Wang, Z. Weng and Z. Xiong (2006), “Natural occurrence of Chilli veinal mottle virus on Capsicum chinensis in China”, Plant Disease 90: 377, Published online as DOI: 10.1094/PD-90-0377C, 72.Weeraratne W.A.R.G. and D.R. Yapa (2002), “Reaction of chilli accessions to local isolates of Cucumber mosaic and Chilli veinal mottle viruses”, Ananals of the Sri Lanka Department of Agriculture 4: 345-352. 73.Wijs de J.J. (1973), “Pepper veinal mottle virus in Irovy Coast”, Neth. Journal of Plant Pathology 79: 189 - 193. 74.Wikipedia (2006), Chilli pepper, 75.Womdim R.N., I.S. Swai and M.L. Chadha (2001), “Occurrence of Chilli veinal mottle virus in Solanum aethiopicum in Tanzania”, Plant Disease 85(7): 801. 76.Yoon J.Y., S.K. Green, A.T. Tschanz, S.C.S. Tson and L.C. Chang (1990), “Pepper improvement for the tropics: problems and the AVRDC approach”, In: Tomato and Pepper production in the tropics, Asian Vegetable Research and Development Center, Tainan, Taiwan, pp. 86-98. 77.Zhang D.Y., Y. Liu, C.R. Zhuang, W.S. Tsai, S.L. Shih et al. (2006), “Survey for viruses-particularly begomoviruses infecting pepper crops in China”, Agricultural Science and Technology 7(4): 24, PHỤ LỤC XỬ LÝ THỐNG KÊ 1) Số lá/cây BALANCED ANOVA FOR VARIATE S_LA/CAY FILE HT_SL 29/ 5/** 10:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 So la/cay cua cay benh va cay khoe (la) VARIATE V003 S_LA/CAY la LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 1 13.5300 13.5300 16.53 0.016 2 * RESIDUAL 4 3.27387 .818467 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 5 16.8039 3.36078 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HT_SL 29/ 5/** 10:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 So la/cay cua cay benh va cay khoe (la) MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS S_LA/CAY C_BENH 3 18.9967 C_KHOE 3 22.0000 SE(N= 3) 0.522324 5%LSD 4DF 2.04740 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HT_SL 29/ 5/** 10:19 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 So la/cay cua cay benh va cay khoe (la) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 6) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | S_LA/CAY 6 20.498 1.8332 0.90469 4.4 0.0165 2) Chiều cao cây BALANCED ANOVA FOR VARIATE CC_CAY FILE HT_CC 29/ 5/** 10:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Chieu cao cay benh va cay khoe (cm) VARIATE V003 CC_CAY cm LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 1 61.1204 61.1204 26.44 0.008 2 * RESIDUAL 4 9.24787 2.31197 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 5 70.3683 14.0737 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HT_CC 29/ 5/** 10:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Chieu cao cay benh va cay khoe (cm) MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CC_CAY C_BENH 3 20.7900 C_KHOE 3 27.1733 SE(N= 3) 0.877870 5%LSD 4DF 3.44106 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HT_CC 29/ 5/** 10:20 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Chieu cao cay benh va cay khoe (cm) F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 6) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CC_CAY 6 23.982 3.7515 1.5205 6.3 0.0080 3) Chiều rộng lá BALANCED ANOVA FOR VARIATE RONG_LA FILE HT_CRL 29/ 5/** 10:44 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Chieu rong la (cm) cua cay benh va cay khoe VARIATE V003 RONG_LA cm LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 1 11.5094 11.5094 241.79 0.000 2 * RESIDUAL 4 .190400 .476001E-01 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 5 11.6998 2.33995 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HT_CRL 29/ 5/** 10:44 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Chieu rong la (cm) cua cay benh va cay khoe MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS RONG_LA C_BENH 3 2.37000 C_KHOE 3 5.14000 SE(N= 3) 0.125963 5%LSD 4DF 0.493748 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HT_CRL 29/ 5/** 10:44 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Chieu rong la (cm) cua cay benh va cay khoe F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 6) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | RONG_LA 6 3.7550 1.5297 0.21817 5.8 0.0005 4) Chiều dài lá BALANCED ANOVA FOR VARIATE CHD_LA FILE HT_CDL 29/ 5/** 10:53 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Chieu dai la (cm) cua cay benh va cay khoe VARIATE V003 CHD_LA cm LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 CT$ 1 63.5701 63.5701 159.43 0.001 2 * RESIDUAL 4 1.59494 .398735 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 5 65.1651 13.0330 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HT_CDL 29/ 5/** 10:53 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Chieu dai la (cm) cua cay benh va cay khoe MEANS FOR EFFECT CT$ ------------------------------------------------------------------------------- CT$ NOS CHD_LA C_BENH 3 5.94667 C_KHOE 3 12.4567 SE(N= 3) 0.364571 5%LSD 4DF 1.42904 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HT_CDL 29/ 5/** 10:53 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Chieu dai la (cm) cua cay benh va cay khoe F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |CT$ | (N= 6) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CHD_LA 6 9.2017 3.6101 0.63145 6.9 0.0007 5) Đánh giá mức độ kháng, nhiễm ChiVMoV của một số giống ớt trong điều kiện chậu vại BALANCED ANOVA FOR VARIATE CPB FILE HIEN T 20/ 6/** 9:09 ---------------------------------------------------------------- PAGE 1 Danh gia muc do khang, nhiem ChiVMoV cua mot so giong ot trong dieu kien chau vai VARIATE V003 CPB % LN SOURCE OF VARIATION DF SUMS OF MEAN F RATIO PROB ER SQUARES SQUARES LN ============================================================================= 1 GIONG$ 10 19219.4 1921.94 292.30 0.000 2 * RESIDUAL 22 144.657 6.57532 ----------------------------------------------------------------------------- * TOTAL (CORRECTED) 32 19364.1 605.128 ----------------------------------------------------------------------------- TABLE OF MEANS FOR FACTORIAL EFFECTS FILE HIEN T 20/ 6/** 9:09 ---------------------------------------------------------------- PAGE 2 Danh gia muc do khang, nhiem ChiVMoV cua mot so giong ot trong dieu kien chau vai MEANS FOR EFFECT GIONG$ ------------------------------------------------------------------------------- GIONG$ NOS CPB LN-57 3 74.3333 Lai so 20 3 52.5333 HB9 3 50.3333 HB14 3 49.9333 Ot d.phuong 3 79.2333 Ot sungbo BN 3 74.8000 Red Chilli 3 64.5667 BM-738 3 39.6667 CN 225 3 0.000000 BM-08 3 15.7667 MH-1107 3 30.5667 SE(N= 3) 1.48046 5%LSD 22DF 4.34197 ------------------------------------------------------------------------------- ANALYSIS OF VARIANCE SUMMARY TABLE FILE HIEN T 20/ 6/** 9:09 ---------------------------------------------------------------- PAGE 3 Danh gia muc do khang, nhiem ChiVMoV cua mot so giong ot trong dieu kien chau vai F-PROBABLIITY VALUES FOR EACH EFFECT IN THE MODEL. SECTION - 1 VARIATE GRAND MEAN STANDARD DEVIATION C OF V |GIONG$ | (N= 33) -------------------- SD/MEAN | | NO. BASED ON BASED ON % | | OBS. TOTAL SS RESID SS | | CPB 33 48.339 24.599 2.5642 5.3 0.0000  PHỤ LỤC HOÁ CHẤT DÙNG TRONG THÍ NGHIỆM (Indirect - ELISA, RT - PCR và làm sạch virus ChiVMoV) 1) Dung dịch nghiền mẫu Carbonate 0,05M, pH 9,6: Na2CO3 : 1,59 g NaHCO3 : 2,93 g NaN3 : 0,20 g Hoà tan các hoá chất trên trong 900 ml nước cất, chuẩn độ pH 9,6 bằng NaOH rồi thêm nước cất vừa đủ 1.000 ml. 2) Dung dịch đệm PBS 1X (phosphate buffer saline) pH 7,4: NaCl : 8,0 g Na2HPO4..12H2O : 1,15 g KH2PO4 : 0,2 g KCl : 0,2 g NaN3 : 0,2 g Hoà tan các hoá chất trên trong 900 ml nước cất, chuẩn độ pH 7,4 bằng NaOH rồi thêm nước cất vừa đủ 1.000 ml. 3) Dung dịch đệm PBS - Tween rửa bản ELISA: PBS 1X : 1.000 ml Tween 20 : 0,5 ml 4) Dung dịch đệm pha kháng huyết thanh: PBST : 1.000 ml PVP (polyvinyl pyrrolidone) : 2% Bột lòng trắng trứng gà : 0,2% 5) Dung dịch pha chất nền (substrate buffer) pH 9,8: Dietholamin (C4H11NO2) : 97 ml Nước cất : 900 ml NaN3 : 0,2 g Chuẩn độ pH 9,8 bằng HCl rồi thêm nước cất vừa đủ 1.000 ml. 6) Dung dịch đệm 0,2M Borate pH 8,0: Axít boric (H3BO3) : 24,74 g EDTA : 37,22 g Nước cất : 900 ml Chuẩn độ pH 8,0 bằng NaOH rồi thêm nước cất vừa đủ 1.000 ml. ._.