Luận án - Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây tốc thằng cáng (anodendron paniculatum (wall. ex roxb.) a.dc.)

ngành: Hóa học hữu cơ Mã số: 62.44.01.14 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài HUẾ, NĂM 2018 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi dưới sự hướng dẫn khoa học của PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài. Các kết quả thu được trong luận án hoàn toàn trung thực và chưa được ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Hoàng Thị Như Hạnh LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập, nghiên cứu và thực hiện luận án, tôi đã nhận được sự giúp đỡ, tạo điều kiện nhiệt tình và quý báu của nhiều cá nhân và tập thể. Trước hết, cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến PGS.TS. Nguyễn Thị Hoài, người đã tận tình hướng dẫn tôi trong suốt thời gian thực hiện luận án này. Tôi xin trân trọng cảm ơn Ban Giám Hiệu Trường Đại học Khoa học - Đại học Huế, Ban Chủ nhiệm Khoa Hóa học, Bộ môn Hóa hữu cơ và Ban Giám Hiệu Trường THPT Đặng Trần Côn đã giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Phòng Thử nghiệm sinh học, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã giúp đỡ tôi hoàn thành các nghiên cứu về hoạt tính sinh học. Tôi cũng xin chân thành cám ơn tập thể cán bộ phòng Dược liệu – Dược cổ truyền – Thực vật dược, Khoa Dược – Trường Đại học Y Dược Huế đã hỗ trợ tôi trong quá trình thực hiện luận án. Cuối cùng, tôi xin chân thành cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn cổ vũ, động viên tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi xin trân trọng cảm ơn ! Huế, ngày tháng năm 2018 Tác giả luận án Hoàng Thị Như Hạnh i MỤC LỤC MỤC LỤC ............................................................................................................... i DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT ........................................... iii DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... vi DANH MỤC CÁC HÌNH .................................................................................... vii DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC ............................................................................... x MỞ ĐẦU ................................................................................................................ 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae) ..................................... 3 1.2. Giới thiệu về chi Anodendron ..................................................................... 3 Vị trí phân loại ..................................................................................... 3 Đặc điểm thực vật và phân bố ............................................................. 4 Các nghiên cứu về thành phần hóa học ............................................... 6 Các nghiên cứu về hoạt tính sinh học ................................................ 18 1.3. Giới thiệu sơ lược về loài Tốc thằng cáng ................................................ 21 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 23 2.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................... 23 2.2. Phương pháp nghiên cứu .......................................................................... 24 Phương pháp phân lập, tinh chế các hợp chất ................................... 24 Phương pháp xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất ................ 24 Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học ......................................... 26 Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ ...................................................... 29 3.1. Xử lý mẫu và chuẩn bị các cao chiết ........................................................ 29 3.2. Quá trình phân lập các hợp chất ............................................................... 30 3.3. Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập ................. 33 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số chất tinh khiết .................... 36 Chương 4. BÀN LUẬN ....................................................................................... 38 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập ......................... 38 Hợp chất AP1: Cycloartenol.............................................................. 38 Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) .......................................... 40 Hợp chất AP3: (E)-Phytol ................................................................. 49 Hợp chất AP4: Desmosterol .............................................................. 50 Hợp chất AP5: Ursolic acid ............................................................... 52 Hợp chất AP6: Vanillin ..................................................................... 54 Hợp chất AP7: Esculentic acid .......................................................... 55 Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside ...................................... 57 Hợp chất AP9: Rutin ......................................................................... 60 Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) ........................................ 62 Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới) ........................................ 71 ii Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) ........................................ 79 Hợp chất AP13: Sargentol ............................................................... 87 Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid .. 89 Hợp chất AP15: Inugalactolipid A .................................................. 90 Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A ............................................... 94 Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B ............................................... 97 Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C ............................................... 99 Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl- (1→6)-O-β-D-galactopyranosyl]glycerol ................................................. 101 Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6- sulfoquinovopyranosyl)glycerol ................................................................ 102 4.2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết .. 105 KẾT LUẬN ........................................................................................................ 112 KIẾN NGHỊ ....................................................................................................... 113 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ.......................................... 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO .................................................................................. 115 iii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT Các phương pháp sắc ký CC Column Chromatography Sắc ký cột GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometry Sắc ký khí ghép khối phổ TLC Thin Layer Chromatography Sắc ký bản mỏng Các phương pháp phổ 1H-NMR Proton Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton 13C-NMR Carbon-13 Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân carbon 13 COSY Correlation Spectroscopy Phổ tương tác hai chiều 1H-1H DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer Phổ DEPT EIMS Electron Impact Mass Spectrometry Phổ khối va đập điện tử ESIMS Electrospray Ionization Mass Spectrometry Phổ khối ion hóa phun mù điện tử HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HRESIMS High Resolution - Electrospray Ionization - Mass Spectrometry Phổ khối phân giải cao ion hóa phun mù điện tử HSQC Heteronuclear Single Quantum Coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua một liên kết HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence IR Infrared Spectroscopy Phổ hồng ngoại J (Hz) J coupling constant Hằng số tương tác tính bằng Hz NOESY Nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ NOESY ROESY Rotating frame nuclear Overhauser Effect Spectroscopy Phổ ROESY UV Ultraviolet Spectroscopy Phổ tử ngoại δ (ppm) δ (ppm = part per million) Độ dịch chuyển hóa học tính bằng phần triệu s singlet q quartet dt double triplet d doublet quint quintet br broad t triplet dd double doublet m multiplet iv Các dòng tế bào A549 Human bronchogenic carcinoma Ung thư phổi H522 LU-1 H460 Bcap-37 Human breast adenocarcinoma Ung thư vú MCF-7 BGC Human gastrocarcinoma Ung thư dạ dày MCG MKN-7 Bel-7402 Human hepatoma Ung thư gan Hep-G2 DU145 Human prostate adenocarcinoma Ung thư tuyến tiền liệt LNCaP PC-3 HeLa Human cervical adenocarcinoma Ung thư cổ tử cung ME-180 HL-60 Human promyelocytic leukemia Ung thư máu cấp tính P-388 Lymphocytic leukemia Ung thư máu lympho HT-29 Human colon carcinoma Ung thư ruột kết SW-480 K562 Chronic myelogenous leukemic Ung thư bạch cầu tủy KB Human epidermoid carcinoma Ung thư biểu mô M-14 Melanoma Khối u ác tính NBT-T2 Rat bladder epithelial Ung thư bàng quang chuột Các ký hiệu viết tắt khác CTPT Công thức phân tử DBE Double Bond Equivalent Số tương đương nối đôi ED50 Effective Dose 50% Liều có tác dụng đối với 50% cá thể FAME Fatty Acid Methyl Ester Dẫn xuất methyl ester của acid béo FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power Lực chống oxy hóa được đo bằng khả năng khử ion sắt (III) IC50 Inhibitory Concentration 50% Nồng độ ức chế 50% MBC Minimum Bactericidal Concentration Nồng độ diệt khuẩn tối thiểu v MFC Minimum Fungicidal Concentration Nồng độ diệt nấm tối thiểu MIC Minimum Inhibitory Concentration Nồng độ ức chế tối thiểu mp Melting point Điểm chảy OD Optical Density Mật độ quang CHCl3 Chloroform SRB Sulforhodamine B DMSO Dimethylsulfoxide Ac Acetyl EtOAc Ethyl acetate Me Methyl MeOH Methanol TMS Tetramethylsilane Ghi chú: Tên các hợp chất, lớp chất, nhóm thế, chức hóa học được viết theo nguyên bản Tiếng Anh để đảm bảo tính thống nhất và chính xác. vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1. Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận ....................... 4 Bảng 1.2. Sự phân bố các loài thuộc chi Anodendron ở Việt Nam ....................... 5 Bảng 1.3. Hoạt tính kháng khuẩn của các hợp chất phân lập từ A. formicinum . 19 Bảng 1.4. Hoạt tính ức chế sự phát triển của ấu trùng Bombyx mori của cardenolide từ A. affine ........................................................................................ 20 Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc của các hợp chất đã phân lập trên các dòng tế bào ung thư .................................................................................................................... 1 Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP1 và hợp chất tham khảo .............. 39 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR hợp phần triterpenoid của hợp chất AP2 ................ 41 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR hợp phần acid béo của hợp chất AP2 ..................... 42 Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP3 và hợp chất tham khảo .............. 49 Bảng 4.5. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP4 và hợp chất tham khảo .............. 51 Bảng 4.6. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP5 và hợp chất tham khảo .............. 53 Bảng 4.7. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP6 và hợp chất tham khảo .............. 55 Bảng 4.8. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP7 và hợp chất tham khảo .............. 56 Bảng 4.9. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP8 và hợp chất tham khảo .............. 58 Bảng 4.10. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP9 và hợp chất tham khảo ............ 61 Bảng 4.11. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP10 ........................ 70 Bảng 4.12. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP10 và chất tham khảo .............................................................................................................................. 71 Bảng 4.13. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP11 ........................ 77 Bảng 4.14. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP11 ............................ 78 Bảng 4.15. Số liệu phổ NMR phần aglycone của hợp chất AP12 ........................ 84 Bảng 4.16. Số liệu phổ NMR phần đường của hợp chất AP12 ............................ 85 Bảng 4.17. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP13 và hợp chất tham khảo .......... 88 Bảng 4.18. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP14 và hợp chất tham khảo .......... 90 Bảng 4.19. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP15 ................................................ 92 Bảng 4.20. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP16 và hợp chất tham khảo .......... 95 Bảng 4.21. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP17 và hợp chất tham khảo .......... 97 Bảng 4.22. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP18 và hợp chất tham khảo ........ 100 Bảng 4.23. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP19 và hợp chất tham khảo ........ 102 Bảng 4.24. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP20 và hợp chất tham khảo ........ 104 Bảng 4.25. Thống kê các hợp chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng ................. 105 vii DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc chung (a) và vị trí dễ bị oxy hóa (b) của cardenolide ........... 15 Hình 1.2. Con đường sinh tổng hợp của cardenolide .......................................... 15 Hình 1.3. Hệ thống vòng ngưng tụ kiểu cis-trans-cis của cardenolide aglycone 16 Hình 1.4. Phần đường của các cardenolide glycoside phân lập từ họ Apocynaceae......................................................................................................... 17 Hình 2.1. Loài Tốc thằng cáng: a. Phần trên mặt đất, b. Lá và quả, c. Đại bổ đôi, d. Hạt mang chùm lông ........................................................................................ 23 Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng ...................................................................................................................... 29 Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform của cây Tốc thằng cáng ...................................................................................................................... 31 Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước của cây Tốc thằng cáng 32 Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 .................................................... 38 Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 .................................................... 43 Hình 4.3. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP2 .......................... 44 Hình 4.4. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP2 ........................................ 44 Hình 4.5. Phổ HRESIMS của hợp chất AP2 ........................................................ 44 Hình 4.6. Phổ UV của hợp chất AP2 ................................................................... 45 Hình 4.7. Phổ IR của hợp chất AP2 ..................................................................... 45 Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2 ........................................................... 46 Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP2 ......................................................... 46 Hình 4.10. Phổ HMQC của hợp chất AP2 ........................................................... 47 Hình 4.11. Phổ HMBC của hợp chất AP2 ........................................................... 47 Hình 4.12. Phổ COSY của hợp chất AP2 ............................................................. 48 Hình 4.13. Phổ NOESY của hợp chất AP2 .......................................................... 48 Hình 4.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP3 .................................................. 50 Hình 4.15. Tương tác HMBC chính của hợp chất AP3 ....................................... 50 Hình 4.16. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP4 ............................................................................................................... 52 Hình 4.17. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP5 .................................................. 54 Hình 4.18. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP6 .................................................. 54 Hình 4.19. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP7 ............................................................................................................... 57 Hình 4.20. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP7 ...................................... 57 viii Hình 4.21. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP8 ............................................................................................................... 59 Hình 4.22. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP9 ............................................................................................................... 60 Hình 4.23. Phổ HRESIMS của hợp chất AP10 .................................................... 63 Hình 4.24. Phổ IR của hợp chất AP10 ................................................................. 63 Hình 4.25. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP10 ....................................................... 64 Hình 4.26. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP10 ..................................................... 64 Hình 4.27. Phổ DEPT của hợp chất AP10 ........................................................... 65 Hình 4.28. Phổ HMQC của hợp chất AP10 ......................................................... 65 Hình 4.29. Phổ HMBC của hợp chất AP10 ......................................................... 66 Hình 4.30. Phổ COSY của hợp chất AP10 ........................................................... 66 Hình 4.31. Phổ ROESY của hợp chất AP10 ......................................................... 67 Hình 4.32. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP10 ................................................ 68 Hình 4.33. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP10 ...................... 68 Hình 4.34. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP10 ..................................... 69 Hình 4.35. Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất alditol hexaacetate của hợp chất AP10 ..................................................................................................................... 69 Hình 4.36. Phổ HRESIMS của hợp chất AP11 .................................................... 72 Hình 4.37. Phổ IR của hợp chất AP11 ................................................................. 72 Hình 4.38. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP11 ....................................................... 73 Hình 4.39. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP11 ..................................................... 73 Hình 4.40. Phổ DEPT của hợp chất AP11 ........................................................... 74 Hình 4.41. Phổ HMQC của hợp chất AP11 ......................................................... 74 Hình 4.42. Phổ HMBC của hợp chất AP11 ......................................................... 75 Hình 4.43. Phổ COSY của hợp chất AP11 ........................................................... 75 Hình 4.44. Phổ ROESY của hợp chất AP11 ......................................................... 76 Hình 4.45. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP11 ................................................ 76 Hình 4.46. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP11 ...................... 78 Hình 4.47. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP11 ..................................... 79 Hình 4.48. Phổ HRESIMS của hợp chất AP12 .................................................... 80 Hình 4.49. Phổ IR của hợp chất AP12 ................................................................. 80 Hình 4.50. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP12 ....................................................... 81 Hình 4.51. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP12 ..................................................... 81 ix Hình 4.52. Phổ DEPT của hợp chất AP12 ........................................................... 82 Hình 4.53. Phổ HMQC của hợp chất AP12 ......................................................... 82 Hình 4.54. Phổ HMBC của hợp chất AP12 ......................................................... 83 Hình 4.55. Phổ COSY của hợp chất AP12 ........................................................... 83 Hình 4.56. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP12 ................................................ 85 Hình 4.57. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP12 ...................... 86 Hình 4.58. Phổ ROESY của hợp chất AP12 ......................................................... 86 Hình 4.59. Tương tác ROESY chính của hợp chất AP12 ..................................... 86 Hình 4.60. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY (b) chính của hợp chất AP13 ............................................................................................................. 88 Hình 4.61. Cấu trúc hóa học (a) và tương tác HMBC, COSY chính (b) của hợp chất AP14 ............................................................................................................. 89 Hình 4.62. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP15 ................................................ 93 Hình 4.63. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP15 ...................... 93 Hình 4.64. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP16 ................................................ 96 Hình 4.65. Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP16 .............. 96 Hình 4.66. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP17 ................................................ 98 Hình 4.67. Sự tạo thành sản phẩm oxy hóa sơ cấp của hợp chất AP17 .............. 99 Hình 4.68. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP18 .............................................. 100 Hình 4.69. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP19 .............................................. 101 Hình 4.70. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP20 .............................................. 103 Hình 4.71. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP20 .................... 103 x DANH MỤC CÁC PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phổ của hợp chất AP1 ............................................................... PL1 Phụ lục 2. Các phổ của hợp chất AP2 ............................................................... PL3 Phụ lục 3. Các phổ của hợp chất AP3 ............................................................... PL6 Phụ lục 4. Các phổ của hợp chất AP4 ............................................................... PL9 Phụ lục 5. Các phổ của hợp chất AP5 ............................................................. PL13 Phụ lục 6. Các phổ của hợp chất AP6 ............................................................. PL17 Phụ lục 7. Các phổ của hợp chất AP7 ............................................................. PL20 Phụ lục 8. Các phổ của hợp chất AP8 ............................................................. PL24 Phụ lục 9. Các phổ của hợp chất AP9 ............................................................. PL29 Phụ lục 10. Các phổ của hợp chất AP10 ......................................................... PL34 Phụ lục 11. Các phổ của hợp chất AP11 ......................................................... PL37 Phụ lục 12. Các phổ của hợp chất AP12 ......................................................... PL39 Phụ lục 13. Các phổ của hợp chất AP13 ......................................................... PL41 Phụ lục 14. Các phổ của hợp chất AP14 ......................................................... PL46 Phụ lục 15. Các phổ của hợp chất AP15 ......................................................... PL50 Phụ lục 16. Các phổ của hợp chất AP16 ......................................................... PL56 Phụ lục 17. Các phổ của hợp chất AP17 ......................................................... PL58 Phụ lục 18. Các phổ của hợp chất AP18 ......................................................... PL60 Phụ lục 19. Các phổ của hợp chất AP19 ......................................................... PL62 Phụ lục 20. Các phổ của hợp chất AP20 ......................................................... PL64 Phụ lục 21. Biên bản giám định tên khoa học của cây Tốc thằng cáng .......... PL69 Phụ lục 22. Biên bản thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng .......................................................................................... PL70 1 MỞ ĐẦU Sự gia tăng nhanh chóng của nhiều căn bệnh nguy hiểm có khả năng lan rộng như HIV/AIDS, ung thư, viêm đường hô hấp cấp SARS, cúm gia cầm H5N1, cúm lợn H1N1, dịch Ebola, chứng đầu nhỏ do virus Zika đang là một cuộc khủng hoảng thực sự cho sức khỏe cộng đồng và là thách thức không nhỏ cho hệ thống y tế trên toàn thế giới. Nhằm bảo vệ con người trước những nguy cơ về bệnh tật, các nhà khoa học đang không ngừng nghiên cứu để tìm ra các loại thuốc mới, các phương thức điều trị mới vừa hiệu quả vừa an toàn với cơ thể. Một xu hướng quan trọng trong quá trình này là tìm kiếm các hoạt chất có nguồn gốc thiên nhiên bởi chúng thường phù hợp với cơ thể sống, ít độc, thân thiện với môi trường, đa dạng về cấu trúc, có thể sử dụng trực tiếp để làm thuốc, hoặc làm các mô hình để nghiên cứu tổng hợp thuốc mới. Nhiều nghiên cứu trên thế giới cũng như trong nước cho thấy thực vật là nguồn tài nguyên có giá trị trong việc khám phá và phát triển thuốc. Có thể kể một vài ví dụ điển hình như taxol từ cây Thông đỏ (Taxus brevifolia); vinblastine, vincristine từ cây Dừa cạn (Catharanthus roseus); camptothecin từ cây Hỉ thụ (Camptotheca acuminata); podophyllotoxin từ cây Khoai ma Mỹ (Podophyllum peltatum) Trong quá trình sàng lọc hoạt tính diệt tế bào ung thư một số cây thuốc của đồng bào Pako, Vân Kiều ở Quảng Trị mà chúng tôi đã khảo sát, 10 cây thuốc chữa bệnh liên quan đến tác dụng chống ung thư đã được đưa vào sàng lọc hoạt tính gây độc tế bào in vitro. Trong đó, cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum Roxb. A.DC. – Apocynaceae) thể hiện hoạt tính ức chế sự phát triển của tế bào ung thư tốt trên 5 dòng tế bào ung thư thử nghiệm với giá trị IC50 thấp, đặc biệt là trên các dòng tế bào LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan) và MKN-7 (ung thư dạ dày) [4]. Tuy nhiên cho đến nay, ở Việt Nam chưa có nghiên cứu nào về thành phần hóa học và tác dụng sinh học của loài này. Việc sử dụng cây Tốc thằng cáng để chữa các bệnh liên quan đến khối u chủ yếu dựa vào tri thức bản địa của đồng bào Pako, Vân Kiều. Điều này cho thấy loài cây này cần được nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học. 2 Từ những lí do trên, chúng tôi đề xuất đề tài: “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính gây độc tế bào ung thư của cây Tốc thằng cáng (Anodendron paniculatum (Wall. ex Roxb.) A.DC.)” Mục tiêu của luận án: 1. Nghiên cứu để làm rõ thành phần hóa học chính của loài Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC. 2. Đánh giá hoạt tính gây độc tế bào ung thư của các hợp chất phân lập được từ loài này Nội dung nghiên cứu của luận án: 1. Chiết tách, phân lập, tinh chế các hợp chất từ loài Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC. 2. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập 3. Thử hoạt tính gây độc các dòng tế bào ung thư của các hợp chất đã phân lập. 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu sơ lược về họ Trúc đào (Apocynaceae) Họ Trúc đào (Apocynaceae) là họ lớn, được chia thành 5 phân họ (Plumerioideae, Apocynoideae, Periplocoideae, Secamonoideae và Asclepiadoideae) với gần 200 chi, hơn 2000 loài, phân bố rộng ở vùng nhiệt đới [2], [8]. Họ Trúc đào gồm các đại diện là thân cỏ hoặc thân gỗ to hay nhỏ, phần lớn là dây leo hay bụi đứng. Cây có nhựa mủ trắng, thường độc. Lá đơn, nguyên, mọc đối, đôi khi mọc cách hoặc mọc vòng, không có lá kèm. Hoa đơn độc hoặc tập hợp thành cụm hoa vô hạn hoặc hình xim, ở nách lá hay ở ngọn. Hoa đều, lưỡng tính, mẫu 5, đài 5 thường hợp. Tràng hình ống thường có phần phụ ở trong ống tràng, giống như lông hay vảy hoặc tạo thành tràng phụ. Tiền khai hoa vặn [2]. Bộ nhị gồm 5 nhị đính trên ống tràng. Chung đới có thể kéo dài thành mũi nhọn, đôi khi có mang lông dài hoặc úp lên mặt trên của đầu nhụy. Chỉ nhị rời hoặc dính liền thành một ống bao quanh bầu. Bao phấn thường chụm vào nhau tạo như một cái mái che trên đầu nhụy và có thể đính vào đầu nhụy (phân họ Echitoideae) hoặc đính vào 5 mặt của đầu nhụy 5 góc. Phía ngoài bộ nhị có thể mang những phụ bộ, tạo thành một tràng phụ thứ nhì do nhị sinh ra. Hạt phấn rời hay dính thành tứ tử hoặc phấn khối [2]. Bộ nhụy gồm 2 lá noãn (ít khi 3-5), tự do ở phần đầu, dính nhau ở phần vòi, một vòi duy nhất. Đầu nhụy hình trụ ngắn hoặc hình mâm 5 góc. Mỗi lá noãn có nhiều noãn tạo thành bầu 2 ô, đính noãn trung trụ hay bầu 1 ô, đính noãn bên. Đáy bầu thường có đĩa mật. Quả đại, quả nang, đôi khi gặp quả mọng. Hạt có cánh hay có chùm lông và nội nhũ. Các cây trong họ Trúc đào thường có ống nhựa mủ thật, libe quanh tủy. Trong thân có hai vòng libe. Mạch thủng lỗ đơn, một số có mạch thang ngắn. Ở Việt Nam, họ Apocynaceae có khoảng 100 chi với khoảng 280 loài [2], [8]. 1.2. Giới thiệu về chi Anodendron Vị trí phân loại Theo hệ thống phân loại của Takhtajan [116], chi Anodendron A.DC. có vị trí phân loại như sau: Ngành Ngọc lan (Magnoliophyta), lớp Ngọc lan 4 (Magnoliopsida), phân lớp Hoa môi (Lamiidae), bộ Long đởm (Gentianales), họ Trúc đào (Apocynaceae), chi Anodendron. Dự án “The plant list” khởi động từ năm 2010 đã thống kê được 38 tên loài thuộc chi Anodendron thu thập từ nhiều cơ sở dữ liệu khác nhau trên thế giới, trong đó chỉ có 17 tên loài được chấp nhận (Bảng 1.1) [52]. Bảng 1.1. Các tên loài thuộc chi Anodendron đã được chấp nhận STT Tên khoa học 1 Anodendron affine (Hook. &Arn.) Druce 2 Anodendron axillare Merr. 3 Anodendron benthamianum Hemsl. 4 Anodendron borneense (King & Gamble) Mabb. 5 Anodendron candolleanum Wight 6 Anodendron coriaceum (Blume) Miq. 7 Anodendr... tạo thành [55]. Các dẫn xuất FAME được phân tích bằng phương pháp GC-MS. b) Phân tích GC-MS đối với các FAME Các dẫn xuất FAME được phân tích trên máy Shimadzu QP2010 Plus [Cột Equity®-5 (Supelco) (0,25 mm x 30 m)] cùng với đầu dò khối phổ MS QP2010 Plus. Chế độ ion hóa va đập điện tử được sử dụng với năng lượng 70 eV. Khí mang He với tốc độ dòng 1,5 mL/phút. Nhiệt độ buồng tiêm, giao diện MS, buồng ion hóa lần lượt là 250, 250 và 300oC. Điện thế đầu dò 0,82 kV, dải quét 15÷350 amu. Chương trình nhiệt độ lò GC: nhiệt độ đầu 100oC, tăng 5oC/phút đến 185oC (giữ đẳng nhiệt trong 10 phút), tăng 5oC/phút đến 220oC (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút) (CT1) hoặc nhiệt độ đầu 80oC (giữ đẳng nhiệt trong 2 phút), tăng 5oC/phút đến 185oC (giữ đẳng nhiệt trong 10 phút), tăng 10oC/phút đến 250oC (giữ đẳng nhiệt trong 5 phút) (CT2). Việc nhận dạng các hợp chất được thực hiện bằng cách so sánh dữ kiện phổ EIMS của chúng với giá trị tương ứng đã được liệt kê trong các thư viện NIST 11, WILEY 7. Hàm lượng của các FAME được tính toán thông qua diện tích của píc tương ứng trên sắc ký đồ GC. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học a) Vật liệu + Hóa chất: các hóa chất cần thiết khác của các hãng Sigma, Gibco, Invitrogen bao gồm: L-glutamine, sodium bicarbonate, glucose, HEPES (4-(2- hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid), sodium pyruvate, fetal bovine serum, sulforhodamine B, DMSO 10%, trichloroacetic acid, 5% acetic acid, tris(hydroxymethyl)aminomethane. 27 + Mẫu thử: các chất tinh khiết được phân lập từ cây Tốc thằng cáng. + Các dòng tế bào thử nghiệm: HL-60 (ung thư máu cấp tính), LNCaP (ung thư tiền liệt tuyến), MCF-7 (ung thư vú), LU-1 (ung thư phổi), Hep-G2 (ung thư gan), KB (ung thư biểu mô), MKN-7 (ung thư dạ dày), SW-480 (ung thư ruột kết) do GS. J. M. Pezzuto, Trường Đại học Hawaii (Mỹ) và GS. Jeanette Maier, Trường Đại học Milan (Italia) cung cấp. b) Phương pháp nuôi cấy tế bào in vitro Các dòng tế bào ung thư được nuôi cấy dưới dạng đơn lớp trong môi trường nuôi cấy DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle Medium) với thành phần kèm theo gồm 2 mM L-glutamine, 1,5 g/L sodium bicarbonate, 4,5 g/L glucose, 10 mM HEPES, và 1,0 mM sodium pyruvate, ngoài ra bổ sung 10% fetal bovine serum- FBS (Gibco). Tế bào được cấy chuyển sau 3-5 ngày với tỉ lệ (1:3) và nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện 37oC, 5% CO2. c) Phương pháp thử tác dụng gây độc tế bào ung thư Phương pháp thử độ độc tế bào in vitro được Viện Ung thư Quốc gia Hoa Kỳ (National Cancer Institute - NCI) xác nhận là một trong những phép thử độ độc tế bào chuẩn nhằm sàng lọc, phát hiện các chất có khả năng kìm hãm sự phát triển hoặc diệt tế bào ung thư ở điều kiện in vitro. Phép thử này được thực hiện theo phương pháp của Monks [81]. Phép thử tiến hành xác định hàm lượng protein tế bào tổng số dựa vào mật độ quang học (Optical Density - OD) đo được khi thành phần protein của tế bào được nhuộm bằng Sulforhodamine B (SRB). Giá trị OD máy đo được tỉ lệ thuận với lượng SRB gắn với phân tử protein, do đó lượng tế bào càng nhiều (lượng protein càng nhiều) thì giá trị OD càng lớn. Phép thử được thực hiện trong điều kiện cụ thể như sau: - Chất thử (10 µL) pha trong DMSO 10% (trong nước cất vô trùng) được đưa vào các giếng của khay 96 giếng để có nồng độ sàng lọc là 100 µg/mL. Chất thử có hoạt tính được xác định IC50 nhờ dải nồng độ 100, 20, 4, 0,8 và 0,16 µg/mL. Mỗi nồng độ của mẫu thử được chuẩn bị thành 3 giếng. - Trypsin hóa tế bào thí nghiệm để làm rời tế bào và đếm trong buồng đếm để điều chỉnh mật độ cho phù hợp với thí nghiệm. 28 - Thêm vào các giếng thí nghiệm lượng tế bào phù hợp (trong 190 µL môi trường) và để chúng phát triển trong vòng 3-5 ngày. - Một khay 96 giếng khác không có chất thử nhưng có tế bào ung thư (190 µL) được chuẩn bị thành 3 cột để làm đối chứng ngày 0. Sau 1 giờ, đĩa đối chứng ngày 0 sẽ được cố định tế bào bằng Trichloroacetic acid - TCA. - Sau giai đoạn phát triển trong tủ ấm CO2, tế bào được cố định vào đáy giếng bằng TCA trong 30 phút, được nhuộm bằng SRB trong 1 giờ ở 37oC. Đổ bỏ SRB và các giếng thí nghiệm được rửa 3 lần bằng 5% acetic acid rồi để khô trong không khí ở nhiệt độ phòng. - Cuối cùng, sử dụng dung dịch tris(hydroxymethyl)aminomethane 10 mM để hòa tan lượng SRB đã bám và nhuộm các phân tử protein, đưa lên máy lắc đĩa lắc nhẹ trong 10 phút và sử dụng máy ELISA Plate Reader (Bio-Rad) để đọc kết quả về hàm lượng màu của chất nhuộm SRB thông qua phổ hấp thụ ở bước sóng 515 nm. Khả năng sống sót của tế bào khi có mặt chất thử sẽ được xác định thông qua công thức sau: [OD (chất thử) – OD (ngày 0)] x 100 % Tế bào sống sót = [OD (đối chứng âm) – OD (ngày 0)] % Tế bào bị ức chế = 100 % - % Tế bào sống sót Các phép thử được lặp lại 3 lần để đảm bảo tính chính xác. Ellipticine (Sigma-Aldrich, Mỹ) luôn được sử dụng làm chất đối chứng dương và được thử nghiệm ở các nồng độ 10, 2, 0,4 và 0,08 µg/mL. DMSO 10% luôn được sử dụng như đối chứng âm. Giá trị IC50 sẽ được xác định nhờ vào phần mềm máy tính TableCurve 2Dv4 (System software Inc., San Jose, California, Mỹ). 29 Chương 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1. Xử lý mẫu và chuẩn bị các cao chiết Phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng sau khi thu hái được loại bỏ phần hư hỏng, rửa sạch, thái nhỏ, phơi trong bóng râm rồi sấy ở 50–60oC cho đến khô. Bột nguyên liệu khô (2,5 kg) được chiết với MeOH (10,0 lít x 3 lần) ở nhiệt độ phòng (72 giờ/lần), cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được cao chiết MeOH (105 g). Cao chiết này được phân tán vào nước rồi lần lượt chiết với CHCl3 (2 lít x 3 lần), EtOAc (2 lít x 3 lần). Cất loại dung môi dưới áp suất thấp thu được các phân đoạn tương ứng là phân đoạn CHCl3 (AC, 50,7 g), phân đoạn EtOAc (AE, 10,2 g) và phân đoạn nước (AW, 27,5 g) (Hình 3.1). Hình 3.1. Sơ đồ chiết các phân đoạn từ phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng Phần trên mặt đất của cây Tốc thằng cáng (2,5 kg) Cao chiết MeOH (105 g) AC (50,7 g) Phân đoạn CHCl3 AE (10,2 g) Phân đoạn EtOAc AW (27,5 g) Phân đoạn nước 1. Ngâm chiết bằng MeOH (10 lít x 3) 2. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp 1. Bổ sung nước (2 lít) 2. Chiết lần lượt với CHCl3 (2 lít x 3), EtOAc (2 lít x 3) 3. Cất loại dung môi dưới áp suất thấp 30 3.2. Quá trình phân lập các hợp chất Phân đoạn AC được tách bằng cột pha thường, rửa giải theo gradient nồng độ bằng hệ CHCl3–MeOH (100:0; 40:1; 20:1; 10:1; 5:1; 2:1; 1:1; 0:100, v/v) thu được 8 phân đoạn tương ứng, AC1–AC8. Phân đoạn AC2 (8,3 g) được tách trên cột pha thường, rửa giải theo gradient nồng độ bằng hệ n-hexane–acetone lần lượt với các tỉ lệ 100:0; 60:1; 40:1; 20:1; 10:1; 4:1 (v/v) thu được 6 phân đoạn, AC2.1– AC2.6. Phân đoạn AC2.2 (1,2 g) tiếp tục được tách trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ n-hexane–EtOAc (10:1, v/v) thu được hợp chất AP2 (4,5 mg) và AP3 (100,5 mg). Phân đoạn AC2.3 (0,75 g) được cho qua cột pha đảo với pha động là hệ MeOH–acetone–H2O (10:5:1, v/v) thu được hợp chất AP1 (7,5 mg) và AP4 (45,7 mg). Phân đoạn AC2.4 (1,32 g) được tinh chế trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ n-hexane–acetone (5:1, v/v) thu được hợp chất AP5 (156,5 mg) và AP6 (15,8 mg). Hợp chất AP7 (27,0 mg) thu được từ phân đoạn AC2.5 (0,64 g) bằng cột pha thường với pha động là hệ CHCl3–MeOH (20:1, v/v) (Hình 3.2). Phân đoạn AW được tách bằng cột diaion HP-20, rửa giải theo gradient nồng độ bằng hệ MeOH–H2O (0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0, v/v) thu được 4 phân đoạn, AW1– AW4. Phân đoạn AW1 (4,5 g) được tách trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ MeOH– H2O (1:1, v/v) thu được 3 phân đoạn, AW1.1–AW1.3. Phân đoạn AW1.1 (1,05 g) được tinh chế cột pha thường, rửa giải bằng hệ CHCl3–MeOH–H2O (4:1:0,1, v/v) thu được hợp chất AP8 (20,5 mg), AP9 (38,6 mg). Phân đoạn AW2 (10,5 g) được tách trên cột silica gel, rửa giải bằng hệ CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) thu được 7 phân đoạn, AW2.1–AW2.7. Phân đoạn AW2.4 (0,55 g) tiếp tục được tinh chế trên cột Sephadex LH-20, rửa giải bằng hệ MeOH–H2O (4:1, v/v), theo sau bởi cột YMC RP-18 với dung môi giải ly là MeOH–MeCN–H2O (3:2:3, v/v) thu được hợp chất AP10 (32,2 mg), AP11 (10,8 mg) và AP12 (25,6 mg). Phân đoạn AW3 (1,25 g) được tách trên cột sephadex LH-20 với dung môi rửa giải là MeOH, thu được 3 phân đoạn, AW3.1–AW3.3. Phân đoạn AW3.3 (0,6 g) được tách tiếp trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) thu được 5 phân đoạn, AW3.3.1–AW3.3.5. Phân đoạn AW3.3.3 (230 31 mg) được tách tiếp trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) thu được hợp chất AP13 (132 mg). Phân đoạn AW3.3.4 (104 mg) được tách trên cột pha đảo, rửa giải bằng hệ MeOH–H2O (3:2, v/v) thu được hợp chất AP14 (15,5 mg). Phân đoạn AW4 (4.2 g) được tách trên cột silica gel, giải li bằng hệ CHCl3– MeOH–H2O (5:1:0,1, v/v) thu được 4 phân đoạn, AW4.1–AW4.4. Phân đoạn AW4.3 (0,7 g) được tinh chế trên cột YMC RP-18 với hệ dung môi rửa giải là MeOH–H2O (6:1, v/v) thu được hợp chất AP15 (18,7 mg), AP16 (12,5 mg), AP17 (10,7 mg), AP18 (13,8 mg) và AP19 (9,6 mg). Phân đoạn AW4.4 (75 mg) được tách trên cột pha thường, rửa giải bằng hệ EtOAc–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) thu được hợp chất AP20 (17,3 mg) (Hình 3.3). Pha tĩnh Pha động (1) Silica gel Gradient CHCl3–MeOH (100:00:100, v/v) (2) Silica gel Gradient n-hexan–acetone (100:04:1, v/v) (3) Silica gel n-hexan–EtOAc (10:1, v/v) (4) YMC RP-18 MeOH–acetone–H2O (10:5:1, v/v) (5) Silica gel n-hexan–acetone (5:1, v/v) (6) Silica gel CHCl3–MeOH (20:1, v/v) Hình 3.2. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn chloroform của cây Tốc thằng cáng AC2.4 (1,32 g) AC2.3 (0,75 g) (2) AC Phân đoạn CHCl3 (50,7 g) AC2.2 (1,2 g) AC2 (8,3 g) AP2 AP3 AP1 AP4 AP5 AP6 AP7 (1) (3) (4) (5) AC2.5 (0,64 g) (6) 32 Pha tĩnh Pha động (1) Diaion HP-20 Gradient MeOH−H2O (0:1, 1:3, 1:1, 3:1, 1:0, v/v) (2) YMC RP-18 MeOH–H2O (1:1, v/v) (3) Silica gel CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) (4) Sephadex LH-20 MeOH (5) Silica gel CHCl3–MeOH–H2O (5:1:0,1, v/v) (6) Silica gel CHCl3–MeOH–H2O (4:1:0,1, v/v) (7) Sephadex LH-20 MeOH–H2O (4:1, v/v), (8) YMC RP-18 MeOH–MeCN–H2O (3:2:3, v/v) (9) Silica gel CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) (10) Silica gel CHCl3–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) (11) YMC RP-18 MeOH–H2O (3:2, v/v) (12) YMC RP-18 MeOH–H2O (6:1, v/v) (13) Silica gel EtOAc–MeOH–H2O (3:1:0,1, v/v) Hình 3.3. Sơ đồ phân lập các chất từ phân đoạn nước của cây Tốc thằng cáng (1) AW Phân đoạn nước (27,5 g) AW1 (4,5 g) AW1.1 (1,05 g) AW2 (10,5 g) AW2.4 (0,55 g) AW3 (1,25 g) AW3.3 (0,6 g) AW4 (4,2 g) AW4.3 (0,7 g) AP8 AW4.4 (75 mg) AP9 AP10 AP11 AP12 AP13 AW3.3.3 (230 mg) AW3.3.4 (104 mg) AP14 AP15 AP16 AP17 AP18 AP19 AP20 (2) (3) (4) (5) (6) (9) (10) (11) (7) (8) (12) (13) 33 3.3. Tính chất vật lý và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập Hợp chất AP1: Cycloartenol Chất bột màu trắng; mp 101–103oC, IR (KBr) max (cm-1): 3418, 2928, 1670, 1443, 1377; CTPT C30H50O; M = 426; 1H- và 13C-NMR: xem Bảng 4.1 và Phụ lục 1. Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3443, 2922, 2853, 1736, 1630, 1466, 1377, 1260, 1180, 1094; UV (MeOH) max (nm): 201, 231; HRESIMS: m/z 725,5805 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C48H78O3Na, 725,5849); CTPT: C48H78O3; M = 702; 1H- và 13C-NMR: Bảng 4.2, 4.3 và Phụ lục 2. Hợp chất AP3: (E)-Phytol Chất dầu không màu; IR (KBr) max (cm-1): 3449, 2932, 1636, 1462, 1381, 1003; HRESIMS: m/z 319,2931 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C20H40ONa, 319,2977); CTPT C20H40O; M = 296; 1H- và 13C-NMR: xem Bảng 4.4 và Phụ lục 3. Hợp chất AP4: Desmosterol Chất bột màu trắng; mp 122–124oC; IR (KBr) max (cm-1): 3445, 2936, 1636, 1462, 1377, 1053; HRESIMS: m/z 385,3513 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C27H45O, 385,3470); CTPT C27H44O; M = 384; 1H- và 13C-NMR: xem Bảng 4.5 và Phụ lục 4. Hợp chất AP5: Ursolic acid Chất bột màu trắng; 20[ ]D +65 (c 0,5, EtOH), mp 284–286 oC, UV (MeOH) λmax (nm): 201, 230; IR (KBr) νmax (cm-1): 3433, 2870, 1690; ESIMS: m/z 479,2 [M+Na]+, 455,2 [M-H]-; CTPT C30H48O3; M = 456; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.6 và Phụ lục 5. Hợp chất AP6: Vanillin Chất bột màu trắng; mp 82–84oC, UV (MeOH) λmax (nm): 204, 231, 278, 309; IR (KBr) νmax (cm-1): 3310, 1674, 1589, 1512, 1026, ESIMS: m/z 175,0 [M+Na]+; CTPT C8H8O3; M = 152; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.7 và Phụ lục 6. Hợp chất AP7: Esculentic acid Chất bột màu trắng; mp 267–268oC; IR (KBr) νmax (cm-1): 3425, 2927, 2363, 1690, 1458, 1038; HRESIMS: m/z 511,3390 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công 34 thức C30H48O5Na, 511,3399); CTPT: C30H48O5; M = 488; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.8 và Phụ lục 7. Hợp chất AP8: Kaempferol-3-O-rutinoside Chất bột màu vàng; [] +11 (c 0,8, MeOH); mp 188–190oC, UV (MeOH) λmax (nm): 203, 267, 351; IR (KBr) νmax (cm-1): 3410, 1659, 1605, 1497, 1566, 1180, 1065; ESIMS: m/z 617,1 [M+Na]+, 593,1 [M-H]-; CTPT C27H30O15; M = 594; 1H- NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.9 và Phụ lục 8. Hợp chất AP9: Rutin Chất bột màu vàng; [] +4 (c 0,5, MeOH), mp 193–195oC, UV (MeOH) λmax (nm): 204, 257, 357; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 1651, 1605, 1504 , 1204, 1065; ESIMS: m/z 633,1 [M+Na]+, 609,1 [M-H]-; CTPT C27H30O16; M = 610; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.10 và Phụ lục 9. Hợp chất AP10: Anopanin A (Chất mới) Chất bột trắng; mp 213–215oC; 22[ ]D -19,9 (c 0.1, MeOH); IR (KBr) max (cm-1): 3418, 2932, 1713, 1632, 145, 1383, 1265, 1070, 1030; HRESIMS: m/z 1025,5294 [M+Na]+ (tính toán cho C50H82O20Na, 1025,5297); CTPT: C50H82O20; 1H-NMR (600 MHz, C5D5N) và 13C NMR (150 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.11, 4.12, Phụ lục 10. Hợp chất AP11: Anopanin B (Chất mới) Chất bột trắng; mp 222–224oC; 22[ ]D +77,7 (c 0,1, MeOH); IR (KBr) max (cm-1): 3443, 2930, 1730, 1647, 1460, 1377, 1252, 1074, 1028; HRESIMS: m/z 1027,5452 [M+Na]+ (tính toán cho C50H84O20Na, 1027,5454); CTPT: C50H84O20; 1HNMR (600 MHz, C5D5N) và 13C NMR (150 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.13, 4.14, Phụ lục 11. Hợp chất AP12: Anopanin C (Chất mới) Chất bột trắng; mp 218–219oC; 22[ ]D +66,7 (c 0,1, MeOH); IR (KBr) max (cm-1): 3428, 2932, 1709, 1630, 1456, 1381, 1261, 1072, 1028; HRESIMS: m/z 1025,5293 [M+Na]+ (tính toán cho C50H82O20Na, 1025,5297); CTPT: C50H82O20; 1H-NMR (600 MHz, C5D5N) và 13C NMR (150 MHz, C5D5N): xem Bảng 4.15, 4.16, Phụ lục 12. 35 Hợp chất AP13: Sargentol Chất bột màu trắng; [] –70 (c 0,05, MeOH), mp 271–272oC, UV (MeOH) λmax (nm): 207, 273; IR (KBr) νmax (cm-1): 3387, 1597, 1504, 1466, 1234, 1072; CTPT C17H24O10, M = 388; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.17 và Phụ lục 13. Hợp chất AP14: 4-O-β-D-Glucopyranosyl-3-prenylbenzoic acid Chất bột màu trắng; UV (MeOH) λmax (nm): 250, 205; IR (KBr) νmax (cm-1): 3379, 2916, 1694, 1605, 1504, 1250, 1084, 1042; HRESIMS: m/z 391,1398 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C18H24O8Na, 391,1369); CTPT C18H24O8, M = 368; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.18 và Phụ lục 14. Hợp chất AP15: Inugalactolipid A Chất bột màu trắng; HRESIMS: m/z 937,5842 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C49H86O15Na, 937,5864); CTPT C49H86O15; M = 914; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.19 và Phụ lục 15. Hợp chất AP16: Gingerglycolipid A Chất bột màu trắng; 22[ ]D +35,7 (c 0,1, MeOH); CTPT C33H56O14; M = 676; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.20 và Phụ lục 16. Hợp chất AP17: Gingerglycolipid B Chất bột màu trắng; 22[ ]D +57,0 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z 701,3721 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H58NaO14, 701,3724); CTPT C33H58O14; M = 678; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.21 và Phụ lục 17. Hợp chất AP18: Gingerglycolipid C Chất bột màu trắng; 22[ ]D +29,4 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z 703,3878 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C33H60NaO14, 703,3881); CTPT C33H60O14; M = 680; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.22 và Phụ lục 18. Hợp chất AP19: (2S)-1-O-Palmitoyl-3-O-[-D-galactopyranosyl-(1→6)- O-β-D-galactopyranosyl]glycerol Chất bột màu trắng; 22[ ]D +51,6 (c 0,1, MeOH); HRESIMS: m/z 677,3746 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C31H58O14Na, 677,3724); CTPT C31H58O14; M = 654; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.23 và Phụ lục 19. 36 Hợp chất AP20: (2R)-1-O-Palmitoyl-3-O-α-D-(6- sulfoquinovopyranosyl)glycerol Chất bột màu trắng; IR (KBr) νmax (cm-1): 3418, 2932, 2367, 1713, 1383, 1265, 1070; HRESIMS: m/z 579,2797 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho công thức C25H48O11SNa, 579,2815); CTPT C25H48O11; M = 556; 1H-NMR và 13C-NMR: xem Bảng 4.24 và Phụ lục 20. 3.4. Hoạt tính gây độc tế bào ung thư của một số chất tinh khiết Hoạt tính gây độc tế bào in vitro của các hợp chất tinh khiết được thử nghiệm trên các dòng tế bào ung thư LU-1, Hep-G2, HL-60, KB, LNCaP, MKN-7, SW-480 và MCF-7 theo phương pháp được mô tả ở mục 2.2.3. Kết quả được trình bày ở Bảng 3.1, Phụ lục 22. 37 Bảng 3.1. Hoạt tính gây độc của các hợp chất đã phân lập trên các dòng tế bào ung thư STT Hợp chất IC50 (µg/mL) LU-1 MKN-7 Hep-G2 KB SW-480 HL-60 MCF-7 LNCaP 1 AP3 >100 >100 – – – – – – 2 AP4 41,41±2,31 38,06±1,18 30,01±2,92 28,11±1,95 40,10±2,39 – – – 3 AP5 44,37±5,40 30,89±3,60 – – – – – – 4 AP7 >100 >100 – – – – – – 5 AP8 >100 >100 – – – – – – 6 AP9 >100 >100 – – – – – – 7 AP10# >100 >100 >100 >100 >100 – – – 8 AP11# >100 >100 >100 >100 >100 – – – 9 AP12# >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 >100 10 AP13 >100 >100 – – – – – – 11 AP14 >100 >100 – – – – – – 12 AP15 >100 >100 – – – – – – 13 AP16 >100 >100 >100 >100 >100 – – – 14 AP17 >100 >100 >100 >100 >100 – – – 15 AP18 >100 >100 >100 >100 >100 – – – 16 AP19 >100 >100 93,95±4,99 >100 >100 – – – 17 AP20 66,66±5,85 72,42±8,05 – – – – – – 18 Ellipticine 0,31±0,07 0,39±0,02 0,39±0,02 0,44±0,07 0,50± 0,04 0,47±0,03 0,33±0,04 0,48±0,05 (-):Không thử nghiệm; #Chất mới. 38 Chương 4. BÀN LUẬN 4.1. Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất đã phân lập Hợp chất AP1: Cycloartenol Hợp chất AP1 được tách ở dạng bột trắng. Phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu đặc trưng của 1 proton olefin tại δH 5,10; proton của 1 nhóm oxymethine tại δH 3,38; 7 nhóm methyl tại δH 0,81 (s, H3-29), 0,88 (d, J = 6,5 Hz, H3-21), 0,89 (s, H3-30), 0,96 (s, H3-18 & H3-28), 1,60 (s, H3-27) và 1,68 (s, H3-26). Đặc biệt, tín hiệu của 2 proton thuộc nhóm methylene tại 0,33 (br.d, J = 3,5 Hz, H-19a), 0,55 (br.d, J = 3,5 Hz, H-19b) chứng minh sự hiện diện của vòng 3 cạnh. Phổ 13C-NMR và HMQC chỉ ra tín hiệu của 30 carbon gồm 7 nhóm methyl, 11 nhóm methylene, 6 nhóm methine và 6 carbon không mang hydro. Trong đó, sự hiện diện của 1 liên kết đôi 3 lần thế được thể hiện qua tín hiệu của 2 carbon olefin tại δC 125,4 (C-24), 131,1 (C-25). Tín hiệu của carbon oxymethine được quan sát tại δC 79,0. Sự định hướng của nhóm 3-OH được xác định là β thông qua việc so sánh giá trị độ dịch chuyển hóa học của C-3 (δC 79,0), C-5 (δC 47,2) với giá trị tương ứng ở các hợp chất có cấu trúc tương tự như 3-hydroxy-5-cycloart-24-en-23-one, 24(E)-3-hydroxy-5-cycloart-24-en-26-al, 24(E)-3-hydroxy-5-cycloart-24-en- 26-oic acid [3-OH: δC ~ 77 (C-3), ~ 41 (C-5)]; 3β-hydroxy-5-cycloart-24-en-21- al, 5-cycloart-24-en-3β,21β-diol, 3β-hydroxy-5-cycloart-24-en-21-oic acid [3β- OH: δC ~ 79 (C-3), ~ 47 (C-5)] [17], [59]. HO 1 3 5 810 13 14 17 20 21 24 26 27 28 29 18 19 30 H Hình 4.1. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP1 39 Bảng 4.1. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP1 và hợp chất tham khảo C δC#, a δCa, b δHa, c (J, Hz) 1 32,06 32,1 1,24*, 1,60* 2 30,48 30,5 1,55*, 1,76* 3 78,90 79,0 3,38 (m) 4 40,56 40,6 – 5 47,22 47,2 1,30* 6 21,17 21,3 0,79*, 1,57* 7 26,07 26,2 1,08*, 1,32* 8 48,00 48,1 1,50 dd (12,5; 4,5) 9 20,12 20,1 – 10 26,25 26,2 – 11 26,60 26,6 1,06*, 1,98* 12 33,02 33,0 1,61* 13 45,40 45,4 – 14 48,91 48,9 – 15 35,65 35,7 1,28* 16 28,18 28,3 1,28*, 1,90* 17 52,38 52,4 1,58* 18 18,05 18,2 0,96 s 19 29,90 30,0 0,33 br.d (3,5) 0,55 br.d (3,5) 20 35,94 36,0 1,38* 21 18,31 18,4 0,88 d (6,5) 22 36,44 36,5 1,04*, 1,41* 23 25,02 25,1 1,86*, 2,03* 24 125,35 125,4 5,10 t (6,5) 25 130,84 131,1 – 26 25,70 25,9 1,68 s 27 17,64 17,8 1,60 s 28 25,49 25,6 0,96 s 29 14,04 14,1 0,81 s 30 19,36 19,4 0,89 s #δC của cycloartenol [80], ađo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập. Các dữ kiện phổ 1H-, 13C-NMR gợi ý hợp chất AP1 là một triterpene khung cycloartane. Đối chiếu với chất tham khảo ở tài liệu [80], hợp chất AP1 được xác định là cycloart-24-en-3β-ol (Hình 4.1). Hợp chất này còn được gọi tên là cycloartenol. 40 Hợp chất AP2: Anopaniester (Chất mới) Hợp chất AP2 được tách ở dạng dầu, không màu. Píc ion giả phân tử tại m/z 725,5805 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho C48H78O3Na là 725,5849) trên phổ HRESIMS (Hình 4.5) đề nghị CTPT của hợp chất này là C48H78O3 (DBE = 10). Phổ UV (MeOH) chỉ ra các cực đại hấp thụ tại λ 201 và 231 nm (Hình 4.6). Phổ IR (KBr) (Hình 4.7) gợi ý sự hiện diện của nhóm hydroxyl (3443 cm-1), carbonyl (1736 cm-1) và liên kết đôi (1630 cm-1). Phổ 1H-NMR (Hình 4.8) chỉ ra tín hiệu đặc trưng của 6 nhóm methyl bậc 3 (18H , δH 0,84, 0,89, 0,89, 0,96, 1,60, 1,68), một nhóm methyl bậc 2 [δH 0,88 (d, J = 7,0 Hz, H3-21)] và một nhóm methyl bậc 1 [δH 0,97 (t, J = 7,5 Hz, H3-18)]. Ngoài ra các tín hiệu của 2 nhóm oxymethine [δH 4,20 (m, H-13); 4,56 (dd, J = 11,0, 4,5 Hz, H-3)] và 7 proton olefin [δH 5,10 (t, J = 6,0 Hz, H-24), 5,36 (td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-15), 5,43 (td, J = 10,5, 8,0 Hz, H-9), 5,57 (td, J = 10,5, 7,5 Hz, H-16), 5,69 (dd, J = 15,0, 6,5 Hz, H-12), 5,97 (dd, J = 11,5, 10,5 Hz, H-10), 6,51 (dd, J = 15,0, 11,5 Hz, H-11)] cũng được ghi nhận. Mặc khác, tín hiệu của 2 proton methylene tại δH 0,33 và 0,57 (br.d, J = 4,0 Hz, H-19) trên phổ 1H-NMR xác nhận sự tồn tại của nhóm cyclopropyl trong cấu trúc của AP2. Phổ 13C-NMR (Hình 4.9) và HMQC (Hình 4.10) chỉ ra tín hiệu của 48 carbon bao gồm 8 nhóm methyl, 20 nhóm methylene, 13 nhóm methine và 7 carbon không mang hydro. Ngoài ra, trên phổ 13C-NMR cũng ghi nhận các tín hiệu tương ứng của 1 carbon carbonyl [δC 173,1 (C-1)], 8 carbon olefin (δC 123,9–135,3) và 2 carbon oxymethine [δC 72,3 (C-13) và 80,5 (C-3)]. Các dữ kiện phổ 1H- và 13C-NMR gợi ý hợp chất AP2 là một ester, tạo thành từ một triterpenoid khung cycloartane và acid béo không no [122]. Việc gán ghép đầy đủ cho tất cả proton và carbon được thực hiện qua phân tích chi tiết phổ HMQC (Hình 4.10), HMBC (Hình 4.11) và COSY (Hình 4.12). 41 Bảng 4.2. Số liệu phổ NMR hợp phần triterpenoid của hợp chất AP2 C δCa, b δHa, c (J, Hz) HMBC (HC) 1 31,7 1,22*, 1,60* 3, 5 2 27,0 1,61*, 1,74* 3 80,5 4,56 dd (11,0; 4,5) 1, 2, 28, 29 4 39,6 – 5 47,3 1,42* 6 21,1 0,79*, 1,57* 7 26,0 1,08*, 1,31* 8 48,0 1,52 dd (12,0; 4,5) 9 20,3 – 10 26,1 – 11 26,6 1,11*, 1,98* 12 33,0 1,61* 13 45,4 – 14 48,9 – 15 35,7 1,28* 16 28,3 1,29*, 1,92* 17 52,4 1,58* 18 18,1 0,96 s 12, 13, 14, 17 19 29,9 0,33 br.d (4,0); 0,57 br.d (4,0) 5, 8 20 36,0 1,38* 21 18,4 0,88 d (7,0) 17, 20, 22 22 36,5 1,04*, 1,41* 23 25,1 1,86*, 2,03* 24 125,3 5,10 t (6,0) 26, 27 25 131,0 – 26 25,9 1,68 s 24, 25, 27 27 17,8 1,60 s 24, 25, 26 28 25,6 0,84 s 3, 4 29 15,4 0,89 s 3, 4, 5 30 19,4 0,89 s 8, 13, 14, 15 aĐo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập. 42 Bảng 4.3. Số liệu phổ NMR hợp phần acid béo của hợp chất AP2 C δCa, b δHa, c (J, Hz) HMBC (HC) 1′ 173,8 – 2′ 35,0 2,30* 1, 3, 4 3′ 25,2 1,61* 4′ 29,1# 1,30* 5′ 29,2# 1,30* 6′ 29,6# 1,30* 7′ 29,8 1,36* 8′ 27,8 2,17 td (8,0; 7,0) 9, 10 9′ 133,1 5,43 td (10,5; 8,0) 8, 11 10′ 127,9 5,97 dd (11,5; 10,5) 8, 12 11′ 126,0 6,51 dd (15,0; 11,5) 9, 13 12′ 135,2 5,69 dd (15,0; 6,5) 10 13′ 72,3 4,20 m 14′ 35,4 2,33* 13, 15, 16 15′ 123,9 5,36 td (10,5; 8,0) 17 16′ 135,3 5,57 td (10,5; 7,5) 14 17′ 20,9 2,06 m 15, 16 18′ 14,4 0,97 t (7,5) 16, 17 aĐo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập; #giá trị có thể hoán đổi cho nhau. Tín hiệu của nhóm oxymethine tại δC 80,5 được gán cho C-3 dựa trên tương tác HMBC giữa H3-28 (δH 0,84)/H3-29 (δH 0,89) với C-3 (δC 80,5). Tương tự, tương tác giữa H3-26 (δH 1,68)/H3-27 (δH 1,60) và C-24 (δC 125,4)/C-25 (δC 131,0) trên phổ HMBC khẳng định vị trí của liên kết đôi tại C-24/C-25 trên mạch carbon. Dựa vào phổ 1H-NMR và NOESY (Hình 4.13), cấu trúc tương đối của hợp phần triterpene ở AP2 đã được xác định. Tương tác NOESY (Hình 4.4) giữa H-3 (δH 4,56) và H3-28 (δH 0,84)/H-5 (δH 1,42) cũng như hằng số tương tác giữa H-2 (δH 1,61, 1,74) và H-3 (J=11,0 Hz, 4,5 Hz) đề nghị định hướng  của H-3 và H-5. Từ các dữ kiện trên cấu trúc của hợp phần triterpene của AP2 được xác định là cycloartenol [80]. Dựa vào các tương tác trên phổ COSY và HMBC, vị trí của 3 liên kết đôi cũng như nhóm hydroxyl của hợp phần acid béo được xác định lần lượt tại C-9/C- 10, C-11/C-12, C-15/C-16 và C-13 (Hình 4.3). Hằng số tương tác J = 10,5 Hz 43 giữa H-9 và H-10 đề nghị cấu hình Z của liên kết đôi tại C-9/C-10. Kết luận trên được củng cố dựa vào tương tác chính giữa H-8 (δH 2,17) và H-11 cũng như sự vắng mặt tương tác giữa H-8 và H-10, giữa H-9 và H-11 trên phổ NOESY. Tương tự, hằng số tương tác J lớn (15,0 Hz) giữa H-11 và H-12 cùng với tương tác H-10/H-12, H-11/H-13 và sự vắng mặt tương tác H-10/H-13 trên phổ NOESY cho phép khẳng định cấu hình E của liên kết đôi tại C-11/C-12 (Hình 4.4). Ngoài ra, cấu hình Z của liên kết đôi tại C-15/C-16 cũng được xác định dựa vào hằng số tương tác 3JH-15/H-16 (10,5 Hz) cũng như sự vắng mặt tương tác giữa H-14 (δH 2,33) và H-16, H-15 và H-17 (δH 2,06) trên phổ NOESY[122], [25]. Ngoài ra, tương tác giữa H-3 với C-1 trên phổ HMBC chỉ ra nhóm chức ester gắn ở vị trí C-3 của hợp phần triterpenoid. Điều này giải thích cho sự dịch chuyển của C-3 (δC 80,5) về phía trường thấp so với giá trị tương ứng của cycloartenol (δC 78,9) [80]. Do sự khan hiếm của mẫu nên cấu hình của C-13 chưa được thiết lập. Từ những lập luận trên, cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 được thiết lập là 3β-O-(13-hydroxy- 9Z,11E,15Z-octadecatrienoyl) cycloart-24-ene (Hình 4.2). Đây là một ester mới, lần đầu tiên được phân lập từ tự nhiên. Hợp chất này được đặt tên là anopaniester. Hình 4.2. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP2 44 Hình 4.3. Tương tác HMBC và COSY chính của hợp chất AP2 Hình 4.4. Tương tác NOESY chính của hợp chất AP2 Hình 4.5. Phổ HRESIMS của hợp chất AP2 45 Hình 4.6. Phổ UV của hợp chất AP2 Hình 4.7. Phổ IR của hợp chất AP2 46 Hình 4.8. Phổ 1H-NMR của hợp chất AP2 Hình 4.9. Phổ 13C-NMR của hợp chất AP2 47 Hình 4.10. Phổ HMQC của hợp chất AP2 Hình 4.11. Phổ HMBC của hợp chất AP2 48 Hình 4.12. Phổ COSY của hợp chất AP2 Hình 4.13. Phổ NOESY của hợp chất AP2 49 Hợp chất AP3: (E)-Phytol Hợp chất AP3 được tách ở dạng dầu, không màu. Píc ion giả phân tử tại m/z 319,2931 [M+Na]+ (tính toán lý thuyết cho C20H40ONa là 319,2977) trên phổ HRESIMS đề nghị CTPT của hợp chất này là C20H40O (DBE = 1). Phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu đặc trưng của 1 proton olefin tại δH 5,41; 1 nhóm oxymethylene tại δH 4,15; 5 nhóm methyl tại δH 0,86 (H3-16H3-19) và 1,67 (s, H3-20). Phổ 13C-NMR và HMQC chỉ ra tín hiệu của 20 carbon trong đó có một số tín hiệu đặc trưng như 2 carbon olefin tại δC 123,2 (C-2), 140,4 (C-3); carbon oxymethylene tại δC 59,5 (C-1). Các dữ kiện phổ HRESIMS, 1H-, 13C-NMR gợi ý hợp chất AP3 là một diterpenoid. Bảng 4.4. Số liệu phổ NMR của hợp chất AP3 và hợp chất tham khảo C δC#, a δCa, b δHa, c (J, Hz) HMBC (H→C) 1 59,4 59,5 4,15 d (7,0) 2, 3 2 123,1 123,2 5,41 t (7,0) 4, 20 3 140,3 140,4 – 4 39,9 40,0 1,99 2, 3, 5, 6, 20 5 25,1 25,3 1,20–1,55 6 36,7 36,8 1,35 7 32,7 32,8 1,43 8 37,4 37,6 1,11 9 24,5 24,6 1,20–1,55 10 37,4 37,5 1,11 11 32,8 32,9 1,43 12 37,3 37,4 1,11 13 24,8 24,9 1,20–1,55 14 39,4 39,5 1,19* 15 28,0 28,1 1,52 m 16 22,7 22,9 0,86 14, 15, 17 17 22,6 22,8 0,86 14, 15, 16 18 19,7 19,9 0,86 10, 11, 12 19 19,7 19,8 0,86 6, 7, 8 20 16,2 16,3 1,67 s 2, 3, 4 #δC của (E)-phytol [95], ađo trong CDCl3, b125 MHz, c500 MHz, *tín hiệu chập. Phổ HMBC thể hiện các tương tác giữa H3-16/H3-17 và C-14 (δC 39,5)/C-15 (δC 28,1), giữa H3-18 và C-10 (δC 37,5)/C-11 (δC 32,9)/C-12 (δC 37,4), giữa H3-19 và C-6 (δC 36,8)/C-7 (δC 32,8)/C-8 (δC 37,6) cho phép định vị các methyl tại C-7, C- 50 11 và gem-dimethyl tại C-15. Tương tác HMBC giữa H-1 (δH 4,15)/H3-20 và C- 2/C-3 chứng tỏ nhóm hydroxyl tại C-1 và liên kết đôi -2 (Hình 4.15). Cấu hình (E) của liên kết đôi được thiết lập thông qua việc so sánh giá trị độ chuyển dịch hóa học của C-4 (δC 40,0), 3-Me (δC 16,3) với các giá trị tương ứng của geraniol [(E): δC 39,7 (C-4), 16,0 (3-Me)] và nerol [(Z): δC 32,1 (C-4), 23,5 (3-Me)] [27], [95]. OH 13 16 17 18 19 20 71115 Hình 4.14. Cấu trúc hóa học của hợp chất AP3 OH Hình 4.15. Tương tác HMBC chính của hợp chất AP3 Từ các dữ kiện đã phân tích trên kết hợp việc đối chiếu với các giá trị tương ứng của hợp chất tham khảo ở tài liệu [95], hợp chất AP3 được kết luận là (E)-phyt- 2-en-1-ol hay (E)-phytol (Hình 4.14). Hợp chất AP4: Desmosterol Hợp chất AP4 được tách ở dạng bột trắng, mp 122–124oC. Píc ion giả phân tử tại m/z 385,3513 [M+H]+ (tính toán lý thuyết cho C27H45O là 385,3470) trên phổ HRESIMS đề nghị CTPT của hợp chất này là C27H44O (DBE = 6). Phổ 1H-NMR chỉ ra tín hiệu đặc trưng...selwood, D. C., Kyle, J. A., and Collins, A. R. (2000), Bioavailability and efficiency of rutin as an antioxidant: a human supplementation study, European Journal of Clinical Nutrition, 54 (10), 774–782. [30]. Bubb, W. A. (2003), NMR spectroscopy in the study of carbohydrates: Characterizing the structural complexity, Concepts in Magnetic Resonance Part A, 19A (1), 1–19. [31]. Cantrell, C.L., Franzblau, S.G., and Fischer, NH. (2001), Antimycobacterial plant terpenoids, Planta Medica, 68 (7), 685–694. [32]. Choe, E., and Min, D. B. (2006), Mechanisms and factors for edible oil oxidation, Comprehensive Reviews in Food Science and Food Safety, 5 (4), 169–186. [33]. D'Abrosca, B., Fiorentino, A., Monaco, P., and Pacifico, S. (2005), Radical- scavenging activities of new hydroxylated ursane triterpenoids from cv. Annurca apples, Chemistry & Biodiversity, 2 (7), 953–958. [34]. Damu, A. G., Kuo, P. C., Shi, L. S., Hu, C. Q., and Wu, T. S. (2003), Chemical constituents of the stem of Sargentodoxa Cuneata, Heterocycles, 60 (7), 1645–1652. [35]. Dar, M. A., and Nahida, T. (2012), Rutin - potent natural thrombolytic agent, International Current Pharmaceutical Journal, 1 (12), 431–435. [36]. Elsebai, M. F., Kehraus, S., Gütschow, M., and König, G. M. (2010), Spartinoxide, a new enantiomer of A82775C with inhibitory activity toward HLE from the marine-derived fungus Phaeosphaeria spartinae, Natural Product Communications, 5 (7), 1071–1076. [37]. Forster, P. I. (1993), The synonymy of Anodendron paniculatum (Apocynaceae) with notes on distribution and ethnobotany in Papuasia, Kew Bulletin, 48, 139–142. [38]. Fukuyama, Y., Ochi, M., Kasai, H., and Kodama, M. (1993), Insect growth inhibitory cardenolide glycosides from Anodendron affine, Phytochemistry, 32 (2), 297–301. [39]. Fukuyama, Y., Ochi, M., Kasai, H., and Kodama, M. (1994 ), A cardenolide from Anodendron affine, Phytochemistry, 35 (4), 1077–1079. [40]. Fusetani, N., and Hashimoto, K. (1975), Structures of two water soluble hemolysins isolated from the green alga Ova pertusa, Agricultural and Biological Chemistry, 39 (10), 2021–2025. [41]. Gamal-Eldeen, A. M., Kawashty, S. A., Ibrahim, L. F., Shabana, M. M., and El- Negoumy, S. I. (2004), Evaluation of antioxidant, anti-inflammatory, and antinociceptive properties of aerial parts of Vicia sativa and its flavonoids, Journal of Natural Remedies, 4 (1), 81–96. [42]. Gao, J., Tang, X., Dou, H., Fan, Y., Zhao, X., and Xu, Q. (2004), Hepatoprotective activity of Terminalia catappa L. leaves and its two triterpenoids, Pharmacy and Pharmacology, 56 (11), 1449–1455. [43]. Gardner, H. W. (1989), Oxygen radical chemistry of polyunsaturated fatty acids, Free Radical Biology & Medicine, 7 (1), 65–86. 118 [44]. Giuseppe, G., Davide, B., Claudia, G., Ugo, L., and Corrado, C. (2007), Flavonoid composition of Citrus juices, Molecules, 12, 1641–1673. [45]. Hanada, R., Abe, F., Mori, Y., and Yamauchi, T. (1992), Anodendrosins J and K, two sucrose bisglycosylnervogenates from the seeds of Anodendron affine (Anodendron. IX), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40 (9), 2292–2294. [46]. Hanada, R., Abe, F., Mori, Y., and Yamauchi, T. (1992), Reinvestigation of cardenolide glycosides from seeds of Anodendron affine, Phytochemistry, 31 (10), 3547–3551. [47]. Hayes, P.Y., Jahidin, A.H., Lehmann, R., Penman, K., Kitching, W., and De Voss, J.J. (2008), Steroidal saponins from the roots of Asparagus racemosus, Phytochemistry, 69, 796–804. [48]. Hikino, H., Okuyama, T., Arihara, S., Hikino, Y., Takemoto, T., Mori, H., and Shibata, K. (1975), Shidasterone, an insect metamorphosing substance from Blechnum niponicum: Structure, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 23, 1458–1479. [49]. Hirotani, M., Zhou, Y., Lui, H., and Furuya, T. (1994), Astragalosides from hairy root cultures of Astragalus membranaceus, Phytochemistry, 36, 665– 670. [50]. Hong, H. C., Li, S. L., Zhang, X. Q., Ye, W. C., and Zhang, Q. W. (2013), Flavonoids with α-glucosidase inhibitory activities and their contents in the leaves of Morus atropurpurea, Chinese Medicine, 8 (1), 19. [51]. [52]. [53]. Hussain, H., Green, I. R., Ali, I., Khan, I. A., Ali, Z., Al-Sadi, A. M., and Ahmed, I. (2017), Ursolic acid derivatives for pharmaceutical use: a patent review (2012-2016), Expert Opinion on Therapeutic Patents, 27 (9), 1061– 1072. [54]. Ibrahim, T.B., Francis, O.S., Adelakun, E.A., Andy, R.O., and Rebamang, A.M. (2013), Platelet-aggregation inhibitory activity of oleanolic acid, ursolic acid, betulinic acid, and maslinic acid, Pharmacognosy and Phytochemistry, 1 (6), 54–60. [55]. Ichihara, K., and Fukubayashi, Y. (2010), Preparation of fatty acid methyl esters for gas-liquid chromatography, Journal of Lipid Research, 51 (3), 635–640. [56]. Inada, A., Ohtsuki, S., Sorano, T., Murata, H., Inatomi, Y., Darnaedi, D., and Nakanishi, T. (1997), Cycloartane triterpenoids from Aglaia harmsiana, Phytochemistry, 46, 379–381. [57]. Islam, M. T., de Alencar, M. V., da Conceição, M. KA., da Conceição M. KE., de Carvalho Melo-Cavalcante, A. A., de Sousa, D. P., and de Freitas, R. M. (2015), Phytol in a pharma-medico-stance, Chemico-Biological Interactions, 240, 60–73. [58]. Jang, S. M., Yee, S. T., Choi, J., Choi, M. S., Do, G. M., Jeon, S. M., Yeo, J., Kim, M. J., Seo, K. I., and Lee, M. K. (2009), Ursolic acid enhances the 119 cellular immune system and pancreatic beta-cell function in streptozotocin- induced diabetic mice fed a high-fat diet, International Immunopharmacology, 9 (1), 113–119. [59]. Januário, A. H., Das, M. F., Silva, G. F. D., Vieira, P. C., and Fernandes, J. B. (1992), Dammarane and cycloartane triterpenoids from three Rapanea species, Phytochemistry, 31 (4), 1251–1253. [60]. Jung, J. H., Lee, H., and Kang, S. S. (1996), Diacylglycerylgalactosides from Arisaema amurense, Phytochemistry, 42 (2), 447–452. [61]. Kashiwada, Y., Wang, H.K., Nagao, T., Kitanaka, S., Yasuda, I., and Fujioka, T. (1998), Anti-AIDS agents. 30. Anti-HIV activity of oleanolic acid, pomolic acid, and structurally related triterpenoids, Journal of Natural Products, 61 (9), 1090–1095. [62]. Kiem, P. V., Minh, C. V., Nhiem, N. X., Cuong, N. X., Tai, B. H., Quang, T. H., Anh, H. le. T., Yen, P. H., Ban, N. K., Kim, S. H., Xin, M., Cha, J. Y., Lee, Y. M., and Kim, Y. H. (2012), Inhibitory effect on TNF-α-induced IL-8 secretion in HT-29 cell line by glyceroglycolipids from the leaves of Ficus microcarpa, Archives of Pharmacal Research, 35 (12), 2135–2142. [63]. Kim, J. S., Lee, Y. S., Shim, S. H., Lee, S. H., Chae, S. W., Han, S. J., Kang, S. S., Jung, S. H., and Shin, K. H. (2004), A monoacyldigalactosyl glycerol from the green alga Enteromorpha prolifera, Natural Product Sciences, 10 (6), 341–343. [64]. Kim S. Y., Gao, J. J., Lee, W. C., Ryu, K. S., Lee, K. R., and Kim, Y. C. (1999), Antioxidative flavonoids from the leaves of Morus alba, Archives of Pharmacal Research, 22 (1), 81–85. [65]. Knothe, G., and Kenar, J. A. (2004), Determination of the fatty acid profile by 1H-NMR spectroscopy, European Journal of Lipid Science and Technology, 106, 88–96. [66]. Korkmaz, B., Moreau, T., and Gauthier, F. (2008), Neutrophil elastase, proteinase 3 and cathepsin G: physicochemical properties, activity and pathophysiological functions, Biochimie, 90, 227–242. [67]. Kubo, I., Asaka, Y., Stout, M. J., and Nakatsu, T. (1990), Structure of a novel phytoecdysteroid, vitexirone, and efficient isolation of phytoecdysteroids from Vitex fisherii, Journal of Chemical Ecology, 16, 2581–2588. [68]. Kucherbaev, K. Dzh., Uteniyazov, K. K., Kachala, V. V., Saatov, Z., and Shashkov, A. S. (2002), Triterpene glycosides from plants of the Astragalus genus. Structure of cyclounifolioside C from Astragalus unifoliolatus, Chemistry of Natural Compounds, 38, 447–449. [69]. Kucherbaev, K. Dzh., Uteniyazov, K. K., Kachala, V. V., Saatov, Z., and Shashkov, A. S. ( 2002), Triterpene glycosides from plants of the Astragalus genus. Structure of cyclounifolioside D from Astragalus unifoliolatus., Chemistry of Natural Compounds, 38, 574–576. [70]. Kucherbaev, K. J., Uteniyazov, K. K., Kachala, V. V., Saatov, Z., and Shashkov, A. S. (2002), Triterpene glycosides from plants of the Astragalus 120 genus. Structure of cyclounifolioside A from Astragalus unifoliolatus, Chemistry of Natural Compounds, 38, 175–178. [71]. Lee, I. K., Kim, D. H., Lee, S. Y., Kim, K. R., Choi, S. U., Hong, J. K., Lee, J. H., Park, Y. H., and Lee, K. R. (2008), Triterpenoic acids of Prunella vulgaris var. lilacina and their cytotoxic activities in vitro, Archives of Pharmacal Research, 31 (12), 1578–1583. [72]. Li, R., Guo, M., Zhang, G., Xu, X., and Li, Q. (2006), Neuroprotection of nicotiflorin in permanent focal cerebral ischemia and in neuronal cultures, Biological and Pharmaceutical Bulletin, 29 (9), 1868–1872. [73]. Lichtia, H., Euw, J. V., Stockel, K., Polonia, J., and Reichstein, T. (1972), Die verrnutliche struktur der anodendroside, Helvetica Chimica Acta, 53, 16961728. [74]. Ling, T., Zhang, Z., Xia, T., Ling, W., and Wan, X. (2009), Phytoecdysteroids and other constituents from the roots of Klaseopsis chinensis, Biochemical Systematics and Ecology, 37, 49–51. [75]. Lipkind, G. M., Shashkov, A. S., Knlrel, Y. A., Vinogudov, E. V., and Kochetko, N. K. (1988), A computer-assisted structural analysis of regular polysaccharides on the basis of 13C-N.M.R data, Carbohydrate Research, 175, 5975. [76]. Liu, M. C., Yang, S. J., Jin, L. H., Hu, D. Y., Xue, W., Song, B. A., and Yang, S. (2012), Synthesis and cytotoxicity of novel ursolic acid derivatives containing an acyl piperazine moiety, European Journal of Medicinal Chemistry, 58, 128–135. [77]. Ma, C. M., Cai, S. Q., Cui, J. R., Wang, R. Q., Tu, P. F., Hattori, M., and Daneshtalab, M. (2005), The cytotoxic activity of ursolic acid derivatives, European Journal of Medicinal Chemistry, 40, 582–589. [78]. Máñez, S., Recio, M.C., Gil, I., Gómez, C., Giner, R. M., Waterman, P. G., and Ríos, J. L. (1999), A glycosyl analogue of diacylglycerol and other antiinflammatory constituents from Inula viscosa, Journal of Natural Products, 62, 601–604. [79]. Middleton, D. J. (1996), A revision of Anodendron A.DC. (Apocynaceae), Blumea, 41 (1), 37–68. [80]. Milon, A., Nakatani, Y., Kintzinger, J. P., and Ourisson, G. (1989), The conformation of cycloartenol investigated by NMR and molecular mechanics, Helvetica Chimica Acta, 72 (1), 1–13. [81]. Monks, A., Scudiero, D., Skehan, P., Shoemake, R., Paull, K., Vistica, D., Hose, C., Langley, J., Cronise, P., Campbell, H., Mayo, J., and Boyd, M. (1991), Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines, Journal of National Cancer Institute, 83 (11), 757–766. [82]. Nam, H., and Kim, M. M. (2013), Ursolic acid induces apoptosis of SW480 cells via p53 activation, Food and Chemical Toxicology, 62, 579–583. [83]. Nascimento, P. G., Lemos, T. L., Bizerra, A. M., Arriaga, A. M., Ferreira, D. A., Santiago, G. M., Braz-Filho, R., and Costa, J. G. (2013), Antibacterial 121 and antioxidant activities of ursolic acid and derivatives, Molecules, 19 (1), 1317–1327. [84]. Neto, C. C., Vaisberg, A. J., Zhou, B. N., Kingston, D. G., and Hammond, G. B. (2000), Cytotoxic triterpene acids from the Peruvian medicinal plant Polylepis racemosa, Planta Medica, 66 (5), 483–484. [85]. Neumann, K., Kehraus, S., Gütschow, M., and König, G. M. (2009), Cytotoxic and HLE-inhibitory tetramic acid derivatives from marine-derived fungi, Natural Product Communications, 4, 347–354. [86]. Niu, X. F., Mu, Q. L., Li, W. F., Yao, H., Li, H. N., and Huang, H. M. (2014), Esculentic acid, a novel and selective COX-2 inhibitor with antiinflammatory effect in vivo and in vitro, European Journal of Pharmacology, 740, 532–538. [87]. Nthambeleni, R. (2008), Isolation and characterisation of cytotoxic compounds from Anthospermum hispidulum and Eriocephalus tenuifolius, MSc. Thesis. Pietermaritzburg, SA: University of KwaZulu-Natal. [88]. Ohta, K., Hanashima, S., Mizushina, Y., Yamazaki, T., Saneyoshi, M., Sugawara, F., and Sakaguchi, K. (2000), Studies on a novel DNA polymerase inhibitor group, synthetic sulfoquinovosylacylglycerols: inhibitory action on cell proliferation, Mutat Res, 467, 139–152. [89]. Okada, N., Takebayashi, K., Kawashima, J., Niwano, M., Mimura, A., Takahara, Y., and Tokuda, H. (1994), Inhibition of Epstein-Barr Virus (EBV) activation by triterpenes in Sesamum indicum L. callus, Plant Tissue Culture Letters, 11 (2), 145–149. [90]. Omobuwajo, O. R., Martin, M. T., Perromat, G., Sevenet, T., Awang, K., and Païs, M. (1996), Cytotoxic cycloartanes from Aglaia argentea, Phytochemistry, 41, 1325–1328. [91]. Osorio, A. A., Lopez M. R., Jimenez I. A., Moujir L. M., Rodriguez, M. L., and Bazzocchi, I. L. (2014), Elaeodendron orientale as a source of cytotoxic cardenolides, Phytochemistry, 105, 60–67. [92]. Passos Oliveira, A., Raith, M., Kuster, R. M., Rocha, L. M., Hamburger, M., and Potterat, O. (2012), Metabolite profiling of the leaves of the Brazilian folk medicine Sideroxylon obtusifolium, Planta Medica, 78, 703–710. [93]. Pettolino, F. A., Walsh, C., Fincher, G. B., and Bacic, A. (2012), Determining the polysaccharide composition of plant cell walls., Nature Protocols, 7, 1590–1607. [94]. Polonia, J., Jiiger, H., Euw, J. V., and Reichstein, T. (1970), Die cardenolide von Anodendron paniculatum (Roxb.) A.DC., Helvetica Chimica Acta, 53, 12531271. [95]. Pongprayoon, U., Baeckström, P., Jacobsson, U., Lindström, M., and Bohlin, L. (1992), Antispasmodic activity of beta-damascenone and E-phytol isolated from Ipomoea pes-caprae, Planta Medica, 58 (1), 19–21. [96]. Qin, X. J., Lunga, P. K., Zhao, Y. L., Li, J. L., Yang, X. W., Liu, Y. P., and Luo, X. D. (2014), Antibacterial prenylbenzoic acid derivatives from Anodendron formicinum, Fitoterapia, 92, 238–243. 122 [97]. Rho, M. C., Matsunaga, K., Yasuda, K., and Ohizumi, Y. (1996), A novel monogalactosylacylglycerol with inhibitory effect on platelet aggregation from the Cyanophyceae Oscillatoria rosea, Journal of Natural Products, 59, 308–309. [98]. Riccio, R., Zollo, F., Finamore, E., Minale, L., Laurent, D., Bargibant, G., and Pusset, J. (1985), Starfish saponins, 19. A novel steroidal glycoside sulfate from the starfishes Protoreaster nodosus and Pentaceraster alveolatus, Journal of Natural Products, 48, 266–272. [99]. Roslund, M. U., Tähtinen, P., Niemitz, M., and Sjöholm, R. (2008), Complete assignments of the 1H and 13C chemical shifts and JH,H coupling constants in NMR spectra of D-glucopyranose and all D-glucopyranosyl-D- glucopyranosides, Carbohydrate Research, 343 (1), 101–112. [100]. Sahara, H., Ishikawa, M., Takahashi, N., Ohtani, S., Sato, N., Gasa, S., Akino, T., and Kikuchi, K. (1997), In vivo antitumour effect of 3'- sulphonoquinovosyl 1'-monoacylglyceride isolated from sea urchin (Strongylocentrotus intermedius) intestine, British Journal of Cancer, 75, 324–332. [101]. Sakurai, K., Hosomi, K., Arakawa, T., Uzawa, M., Ito, Y., and Saburi, Y. (1992), Isolation and Characterization of an Allergy Inhibitor from the Jelutong, Dyera costulata Hook. f., Bioscience, Biotechnology, and Biochemistry, 56 (6), 975. [102]. Sang, S., Lapsley, K., Rosen, R. T., and Ho, C. T. (2002), New prenylated benzoic acid and other constituents from almond hulls (Prunus amygdalus Batsch), Journal of Agricultural and Food Chemistry, 50, 607−609. [103]. Sasaki, K., and Hirata, Y. (1969), The structures of two new zwitterionic alkaloids from Anodendron affine Druce., Tetrahedron Letters, 46, 4065– 4067. [104]. Sasaki, K., and Hirata, Y. (1970), The alkaloids of Anodendron affine Druce, Tetrahedron, 26, 2119–2126. [105]. Sharma, S., Ali, A., Ali, J., Sahni, J. K., and Baboota, S. (2013), Rutin : therapeutic potential and recent advances in drug delivery, Expert Opinion on Investigational Drugs, 22 (8), 1063–1079. [106]. Sheu, J. R., Hsiao, G., Chou, P. H., Shen, M. Y., and Chou, D. S. (2004), Mechanisms involved in the antiplatelet activity of rutin, a glycoside of the flavonol quercetin, in human platelets, Journal of Agricultural and Food Chemistry, 52 (14), 4414–4418. [107]. Shima, K., Hisada, S., and Inagaki, I. (1971), Constituents of Anodendron affine, Phytochemistry, 10, 11631164. [108]. Shima, K., Hisada, S., and Inagaki, I. (1971), Flavonoids of Anodendron affine, Phytochemistry, 10, 893894. [109]. Shima, K., Hisada, S., and Inagaki, S. (1971), Isolation of glucosyringic acid from Anodendron affine, Phytochemistry, 10, 894–895. 123 [110]. Shima, S., Hisada, S., and Inagaki, I. (1971), Studies on the constituents of Anodendron affine Drurce. III. Structure of a new benzopyran compound, Yakugaku Zasshi, 91 (10), 11241126. [111]. Shima, S., Hisada, S., and Inagaki, I. (1972), Studies on the constituents of Anodendron affine Drurce. IV. Isolation of kaempferol, astragalin and dambonitol from leaves, Yakugaku Zasshi, 92 (4), 507509. [112]. Shima, S., Hisada, S., and Inagaki, I. (1972), Studies on the constituents of Anodendron affine Drurce. V. Structure of a two new constituents, Yakugaku Zasshi, 92 (11), 14101414. [113]. Silchenko, A. S., Avilov, S. A., Kalinovsky, A. I., Dmitrenok, P. S., Kalinin, V. I., Morre, J., Deinzer, M. L., Woodward, C., and Collin, P. D. (2007), Glycosides from the North Atlantic sea cucumber Cucumaria frondosa V – Structures of five new minor trisulfated triterpene oligoglycosides, frondosides A7-1, A7-2, A7-3, A7-4, and isofrondoside C, Canadian Journal of Chemistry, 85, 626–636. [114]. Singh, B., and Rastogi, R. P. (1970), Cardenolides—glycosides and genins, Phytochemistry, 9 (2), 315–331. [115]. Smith, L. R., Mahoney, N., and Molyneux, R. J. (2003), Synthesis and structure-phytotoxicity relationships of acetylenic phenols and chromene metabolites, and their analogues, from the grapevine pathogen Eutypa lata, Journal of Natural Products, 66, 169–176. [116]. Takhtajan (2009), Flowering Plants, Springer Verlag, 521. [117]. Tang, J., Ma, R. L., Ouyang, Z., and Chen, H. S. (2012), Chemical constituents from the water-soluble fraction of wild Sargentodoxa cuneat, Chinese Journal of Natural Medicines, 10 (2), 115-118. [118]. Tebben, J., Motti, C. A., Siboni, N., Tapiolas, D. M., Negri, A. P., Schupp,P. J., Kitamura, M., Hatta, M., Steinberg, P. D., and Harder, T. (2015), Chemical mediation of coral larval settlement by crustose coralline algae, Scientific Reports, 5 (10803). [119]. Thien, D. D, Tam, N. T., Thien, D. G., Anh, N. T. H., and Sung, T. V. (2013), Synthesis and cytotoxic activity of ursolic acid derivatives, Zeitschrift für Naturforschung B, 68b, 201–206. [120]. Tigoufack, I. B., Ngnokam, D., Tapondjou, L. A., Harakat, D., and Voutquenne, L. (2010), Cycloartane glycosides from leaves of Oxyanthus pallidus, Phytochemistry, 71, 2182–2186. [121]. Uddin, M.H., Roy, M.C., and Tanaka, J. (2011), Cytotoxic cholic acid type sterones from a marine soft coral Paraminabea sp., Chem. Nat. Compd., 47, 64-67. [122]. Wakana, D., Kawahara, N., and Goda, Y. (2011), Three new triterpenyl esters, codonopilates A–C, isolated from Codonopsis pilosula, Journal of Natural Medicines, 65, 18–23. [123]. Wan, C., Yu, Y., Zhou, S., Tian, S., and Cao, S. (2011), Isolation and identification of phenolic compounds from Gynura divaricata leaves, Pharmacognosy Magazine, 7 (26), 101108. 124 [124]. Wang, Y., Chen, P., Tang, C., Wang, Y., Li, Y., and Zhang, H. (2014), Antinociceptive and anti-inflammatory activities of extract and two isolated flavonoids of Carthamus tinctorius L, Journal of Ethnopharmacology, 151 (2), 944–950. [125]. Wang, Y., Tang, C., and Zhang, H. (2015), Hepatoprotective effects of kaempferol 3-O-rutinoside and kaempferol 3-O-glucoside from Carthamus tinctorius L. on CCl4-induced oxidative liver injury in mice, Journal of Food and Drug Analysis, 23 (2), 310–317. [126]. Wangensteen, H., Miron, A., Alamgir, M., Rajia, S., Samuelsen, A., and Malterud, K. (2006), Antioxidant and 15-lipoxygenase inhibitory activity of rotenoids, isoflavones and phenolic glycosides from Sarcolobus globosus, Fitoterapia, 77, 290–295. [127]. Wen, S., Chen, Y., Lu, Y., Wang, Y., Ding, L., and Jiang, M. (2016), Cardenolides from the Apocynaceae family and their anticancer activity, Fitoterapia, 112, 74–84. [128]. Wen, Z. (1998), Synthesis of sterol biosynthesis inhibitors and metabolism of isotopically labeled sterols by Saccharomyces cerevisiae, A doctoral dissertation in chemistry -Texas Tech University, 85. [129]. Widodo and Luthfi, M. J. (2017), Characteristic of Anodendron paniculatum (Apocynaceae) in Mount Nglanggeran, Yogyakarta, Indonesia, Biodiversitas, 18 (2), 645–651. [130]. Woo, W. S. (1975), The structure of esculentic acid: A new triterpene from Phytolacca esculenta, Phytochemistry, 14, 1885–1888. [131]. Xiang, M., Su, H., Hu, J., and Yan, Y. (2011), Isolation, identification and determination of methyl caffeate, ethyl caffeate and other phenolic compounds from Polygonum amplexicaule var. sinense, Journal of Medicinal Plants Research, 5 (9), 1685-1691. [132]. Xu, X., Xie, H., Xu, L., and Wei, X. (2011), A novel cyclopropyl-containing fatty acid glucoside from the seeds of Litchi chinensis, Fitoterapia, 82, 485– 488. [133]. Yamauchi, T., Abe, F., Nishishita, Y., Okabe, H., Shima, K., and Nishibe, S. (1979), Pregnanes of Anodendron affine, Phytochemistry, 18, 1240–1241. [134]. Yamauchi T., Miyahara, K., Abe, F., and Kawazaki, T. (1979), Affinoside B, a cardiac glycoside with a diosphenol system in the aglycone, from Anodendron affine (Anodendron. I), Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 27 (10), 2463–2467. [135]. Yoshikawa, M., Hatakeyama, S., Taniguchi, K., Matuda, S., and Yamahara, J. (1992), 6-Gingesulfonic acid, a new anti-ulcer principle, and gingerglycolipids A, B and C, three new monoacyldigalactosylglycerols, from Zingiberis rhizoma originating in Taiwan, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 40, 2239–2241. [136]. Yoshikawa, M., Yamaguchi, S., Kunimi, K., Matsuda, K., Okuno, Y., Yamahara, J., and Murakami, N. (1994), Stomachic principles in ginger. III. An anti-ulcer principle, 6-gingesulfonic acid, and three 125 monoacyldigalactosylglycerols, gingerglycolipids A, B, and C, from Zingiberis rhizoma originating in Taiwan, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 42, 1226–1230. [137]. Young, R. E., Thompson, R. D., Larbi, K. Y., La, M., Roberts, C. E., Shapiro, S. D., Perretti, M., and Nourshargh, S. (2004), Neutrophil elastase (NE)-deficient mice demonstrate a nonredundant role for NE in neutrophil migration, generation of proinflammatory mediators, and phagocytosis in response to zymosan particles in vivo, Journal of Immunology, 172, 4493– 4502. [138]. Zeng, X., Wang, H., Gong, Z., Huang, J., Pei, W., Wang, X., Zhang, J., and Tang, X. (2015), Antimicrobial and cytotoxic phenolics and phenolic glycosides from Sargentodoxa cuneata, Fitoterapia, 101, 153–161. [139]. Zhao, Z., Matsunami, K., Otsaka, H., Shinzato, T., and Takeda, Y. (2008), Tareciliosides A-G: cycloartane glycosides from leaves of Tarenna gracilipes (Hay.) Ohwi, Chemical and Pharmaceutical Bulletin, 56, 1153– 1158. [140]. Zhu, W. J., Yu, D. H., Zhao, M., Lin, M. G., Lu, Q., Wang, Q., Wei, Guan, Y. Y., Li, G. X., Luan, X., Yang, Y. F., Qin, X.M., Fang, C., Yang, G. H., and Chen, H. Z. (2013), Antiangiogenic triterpenes isolated from Chinese herbal medicine Actinidia chinensis Planch, Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry, 13, 195–198. [141]. Ziaee, A., Zamansoltani, F., Nassiri-Asl, M., and Abbasi, E. (2009), Effects of rutin on lipid profile in hypercholesterolemic rats, Basic & Clinical Pharmacology & Toxicology, 104, 253–258. PL1 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phổ của hợp chất AP1 Phổ IR của hợp chất AP1 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP1 PL2 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP1 Phổ HMQC của hợp chất AP1 PL3 Phụ lục 2. Các phổ của hợp chất AP2 Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP2 PL4 Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP2 Phổ 13C-NMR giãn (a) của hợp chất AP2 PL5 Phổ 13C-NMR giãn (b) của hợp chất AP2 PL6 Phụ lục 3. Các phổ của hợp chất AP3 Phổ HRESIMS của hợp chất AP3 Phổ IR của hợp chất AP3 PL7 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP3 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP3 PL8 Phổ HMQC của hợp chất AP3 Phổ HMBC của hợp chất AP3 PL9 Phụ lục 4. Các phổ của hợp chất AP4 Phổ HRESIMS của hợp chất AP4 Phổ IR của hợp chất AP4 PL10 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP4 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP4 PL11 Phổ HMQC của hợp chất AP4 Phổ HMBC của hợp chất AP4 PL12 Phổ COSY của hợp chất AP4 Phổ NOESY của hợp chất AP4 PL13 Phụ lục 5. Các phổ của hợp chất AP5 Phổ ESIMS (+) của hợp chất AP5 PL14 Phổ ESIMS (-) của hợp chất AP5 Phổ UV của hợp chất AP5 PL15 Phổ IR của hợp chất AP5 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP5 PL16 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP5 Phổ DEPT của hợp chất AP5 PL17 Phụ lục 6. Các phổ của hợp chất AP6 Phổ ESIMS của hợp chất AP6 Phổ UV của hợp chất AP6 PL18 Phổ IR của hợp chất AP6 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP6 PL19 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP6 Phổ DEPT của hợp chất AP6 PL20 Phụ lục 7. Các phổ của hợp chất AP7 Phổ HRESIMS của hợp chất AP7 Phổ IR của hợp chất AP7 PL21 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP7 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP7 PL22 Phổ HMQC của hợp chất AP7 Phổ HMBC của hợp chất AP7 PL23 Phổ COSY của hợp chất AP7 Phổ NOESY của hợp chất AP7 PL24 Phụ lục 8. Các phổ của hợp chất AP8 Phổ ESIMS () của hợp chất AP8 Phổ ESIMS (+) của hợp chất AP8 PL25 Phổ UV của hợp chất AP8 Phổ IR của hợp chất AP8 PL26 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP8 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP8 PL27 Phổ DEPT của hợp chất AP8 Phổ HSQC của hợp chất AP8 PL28 Phổ HMBC của hợp chất AP8 Phổ COSY của hợp chất AP8 PL29 Phụ lục 9. Các phổ của hợp chất AP9 Phổ ESIMS (+) của hợp chất AP9 Phổ ESIMS () của hợp chất AP9 PL30 Phổ UV của hợp chất AP9 Phổ IR của hợp chất AP9 PL31 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP9 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP9 PL32 Phổ DEPT của hợp chất AP9 Phổ HSQC của hợp chất AP9 PL33 Phổ HMBC của hợp chất AP9 Phổ COSY của hợp chất AP9 PL34 Phụ lục 10. Các phổ của hợp chất AP10 Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP10 PL35 Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP10 Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP10 PL36 Phổ EIMS của dẫn xuất alditol hexaacetate của hợp chất AP10 PL37 Phụ lục 11. Các phổ của hợp chất AP11 Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP11 PL38 Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP11 Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP11 PL39 Phụ lục 12. Các phổ của hợp chất AP12 Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP12 PL40 Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP12 Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP12 PL41 Phụ lục 13. Các phổ của hợp chất AP13 Phổ ESI-MS của hợp chất AP13 Phổ UV của hợp chất AP13 PL42 Phổ IR của hợp chất AP13 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP13 PL43 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP13 Phổ DEPT của hợp chất AP13 PL44 Phổ HSQC của hợp chất AP13 Phổ HMBC của hợp chất AP13 PL45 Phổ COSY của hợp chất AP13 PL46 Phụ lục 14. Các phổ của hợp chất AP14 Phổ HRESIMS của hợp chất AP14 Phổ IR của hợp chất AP14 PL47 Phổ UV của hợp chất AP14 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP14 PL48 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP14 Phổ HSQC của hợp chất AP14 PL49 Phổ HMBC của hợp chất AP14 Phổ COSY của hợp chất AP14 PL50 Phụ lục 15. Các phổ của hợp chất AP15 Phổ HRESIMS của hợp chất AP15 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP15 PL51 Phổ 1H-NMR giãn (a) của hợp chất AP15 Phổ 1H-NMR giãn (b) của hợp chất AP15 PL52 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP15 Phổ 13C-NMR giãn (a) của hợp chất AP15 PL53 Phổ 13C-NMR giãn (b) của hợp chất AP15 Phổ DEPT của hợp chất AP15 PL54 Phổ HSQC của hợp chất AP15 Phổ HMBC của hợp chất AP15 PL55 Phổ COSY của hợp chất AP15 Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất methyl ester của hợp chất AP15 PL56 Phụ lục 16. Các phổ của hợp chất AP16 Phổ HRESIMS của hợp chất AP16 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP16 PL57 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP16 Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP16 PL58 Phụ lục 17. Các phổ của hợp chất AP17 Phổ HRESIMS của hợp chất AP17 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP17 PL59 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP17 Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP17 PL60 Phụ lục 18. Các phổ của hợp chất AP18 Phổ HRESIMS của hợp chất AP18 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP18 PL61 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP18 Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP18 PL62 Phụ lục 19. Các phổ của hợp chất AP19 Phổ HRESIMS của hợp chất AP19 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP19 PL63 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP19 Phổ 13C-NMR giãn của hợp chất AP19 PL64 Phụ lục 20. Các phổ của hợp chất AP20 O O OH O O HO HO OH SO3H 13 1' 3' 5' 6' 1'' 16'' Phổ HRESIMS của hợp chất AP20 Phổ 1H-NMR của hợp chất AP20 PL65 Phổ 1H-NMR giãn của hợp chất AP20 Phổ 13C-NMR của hợp chất AP20 PL66 Phổ DEPT của hợp chất AP20 Phổ HSQC của hợp chất AP20 PL67 Phổ HMBC của hợp chất AP20 Phổ COSY của hợp chất AP20 PL68 Phổ NOESY của hợp chất AP20 Sắc ký đồ GC-MS của dẫn xuất methyl ester của hợp chất AP20 PL69 Phụ lục 21. Biên bản giám định tên khoa học của cây Tốc thằng cáng PL70 Phụ lục 22. Biên bản thử hoạt tính gây độc tế bào ung thư các chất phân lập từ cây Tốc thằng cáng PL71