Luận án Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng Tây Nguyên

HEO RỪNG TÂY NGUYÊN LUẬN ÁN TIẾN SỸ SINH HỌC Chuyên ngành: Sinh thái học Mã số: 62.42.01.20 Cán bộ hướng dẫn: PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn PGS.TS. Bùi Văn Lai Tp. HCM, năm 2017 i LỜI CAM ĐOAN Các số liệu trong luận án này là kết quả nghiên cứu của tôi và nhóm đồng tác giả nghiên cứu từ năm 2012 cho tới nay. Các đồng tác giả đã có cam kết đồng ý cho tôi sử dụng kết quả nghiên cứu chung trong luận án này. Các số liệu trong luận án này chưa được công bố bởi tác giả nào khác. Đà Lạt, ngày tháng năm 2017 Người cam đoan Nguyễn Thị Phương Mai ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận án này, tôi xin trân trọng cảm ơn: PGS.TS. Hoàng Nghĩa Sơn và Cố PGS.TS. Bùi Văn Lai, đã hướng dẫn khoa học, chỉ bảo kinh nghiệm quý báu, tận tình giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu để hoàn thành luận án. Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên và Viện Sinh học Nhiệt đới đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập cũng như quá trình thực hiện đề tài này. Các anh, chị, em đồng nghiệp tại Viện Nghiên cứu Khoa học Tây Nguyên đã luôn đồng hành và tạo mọi điều kiện thuận lợi. TS. Lê Thành Long và các anh chị em phòng Công nghệ sinh học động vật, Viện Sinh học nhiệt đới đã cùng thực hiện các nghiên cứu và công bố. Bố, Mẹ, Chồng, con và toàn thể thành viên trong gia đình luôn là nguồn động viên, an ủi, giúp đỡ và dành những tình cảm thiêng liêng nhất. Đề tài thuộc Chương trình Tây Nguyên 3 mã số TN3/C06 và các đề tài cấp cơ sở Viện Nghiên cứu khoa học Tây Nguyên đã hỗ trợ kinh phí thực hiện các nghiên cứu. Đà Lạt, ngày tháng năm 2017 Tác giả luận án Nguyễn Thị Phương Mai iii MỤC LỤC PHẦN MỞ ĐẦU ......................................................................................................... 1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ ......................................................................................................... 1 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI ...................................................................................... 1 3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI .................................................................. 2 4. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI ....................................................................................... 2 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................... 3 1.1. Giới thiệu về heo rừng ......................................................................................... 3 1.1.1. Vị trí phân loại .................................................................................................. 3 1.1.2. Sự phân bố của heo rừng ................................................................................... 4 1.1.3. Đặc điểm chung của heo rừng ........................................................................... 6 1.1.4. Phương thức tìm kiếm thức ăn .......................................................................... 7 1.1.5. Phạm vi sống và mật độ quần thể của heo rừng ................................................ 8 1.1.6. Đặc điểm của heo rừng Việt Nam ................................................................... 11 1.2. Tiến hóa và phát sinh loài .................................................................................. 12 1.2.1. Chọn lọc nhân tạo trong tiến hóa .................................................................... 12 1.2.2. Phát sinh loài và tiến hóa ................................................................................ 13 1.2.3. Các khái niệm về phát sinh loài ...................................................................... 15 1.3. Một số marker phân tử ....................................................................................... 18 1.3.1. ADN ty thể (mtADN)...................................................................................... 18 1.3.2. Gen cytochrome b ........................................................................................... 19 1.3.3. Vùng kiểm soát (control region) ..................................................................... 20 1.3.4. Gen 16S rRNA ................................................................................................ 21 1.3.5. Intron vùng nhân ............................................................................................. 22 1.3.6. Protein kinase C .............................................................................................. 22 1.3.7. Các nghiên cứu về quan hệ phát sinh loài phân tử của heo rừng .................... 23 1.4. Bảo tồn heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên .......................................... 24 1.4.1. Bảo tồn giao tử heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên ........................... 25 1.4.2. Bảo tồn tế bào sinh dưỡng ............................................................................... 29 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ............................ 32 2.1. Vật liệu ............................................................................................................... 32 iv 2.2. Phương pháp....................................................................................................... 32 2.2.1. Điều tra các giống heo rừng đang được nuôi tại khu vực Tây Nguyên .......... 32 2.2.2. Phân tích ADN, đánh giá hình thái. ................................................................ 33 2.2.3. Thu thập, nuôi thuần dưỡng heo rừng thuần Tây Nguyên thu nhận được ...... 38 2.2.4. Bảo tồn nguồn gen heo rừng thuần Tây Nguyên ............................................ 39 2.2.5. Phương pháp thống kê ..................................................................................... 46 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN ............................................................... 47 3.1. Điều tra các giống heo rừng đang được nuôi tại khu vực Tây Nguyên ............. 47 3.2. Phân tích ADN, đánh giá hình thái. ................................................................... 47 3.2.1. Kết quả phân tích trình tự D-loop ................................................................... 52 3.2.2. Kết quả phân tích trình tự cytochrome b ......................................................... 57 3.2.3. Kết quả phân tích trình tự 16S ........................................................................ 62 3.2.4. Đánh giá hình thái heo rừng thuần Tây nguyên .............................................. 48 3.3. Thuần dưỡng heo rừng thuần Tây Nguyên Việt Nam thu nhận được ............... 65 3.3.1. Mô tả đặc điểm sinh học heo rừng thuần Tây Nguyên ................................... 65 3.3.2. Thuần hóa heo rừng thuần Tây Nguyên .......................................................... 66 3.4. Bảo tồn nguồn gen heo rừng thuần Tây Nguyên- Việt Nam ............................ 70 3.4.1. Tinh trùng heo rừng ........................................................................................ 70 3.4.2. Đông lạnh tế bào ............................................................................................. 76 KẾT LUẬN ............................................................................................................... 79 ĐỀ NGHỊ................................................................................................................... 80 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ ................................................ 81 TÀI LIỆU THAM KHẢO ......................................................................................... 82 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC TỪ, KÍ HIỆU VIẾT TẮT ADN : Acid Deoxyribo Nucleic bp : base pair CPA : Cryoprotectant agents ĐDSH : Đa dạng Sinh học DMEM : Dulbecco's Modified Eagle's Medium DMSO : Dimethyl Sulfoxide EDTA : Ethylene Diamine Tetraacetic Acid FBS : Fetal Bovine Serum GEYC : Glycerol Egg Yolk Citrate HST : Hệ sinh thái IIF : Intracellular Ice Formation NIH : National Institutes of Healthn PBS : Phosphate-Buffered Saline PCR : Polymerase Chain Reaction ROS : Reactive Oxygen Species SNP : Single Nucleotide Polymorphisms TAE : Tris-Acetate-EDTA TBT : Tế bào trứng UV : Ultra Violet YBP : Year Before Present vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Heo rừng trong điều kiện tự nhiên .............................................................. 4 Hình 1.2. Phân loại cây phát sinh loài theo Page và Holmes ................................... 16 Hình 1.3. Cấu trúc ADN ty thể. ................................................................................ 18 Hình 1.4. Cấu trúc của protein cytochrome b .......................................................... 20 Hình 1.5. Cấu trúc vùng kiểm soát của ty thể ở động vật có vú ............................... 21 Hình 2.1. Các thông số đo bên ngoài của cơ thể heo rừng ...................................... 33 Hình 2.2. Các chỉ số hộp sọ được phân tích. ............................................................. 34 Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích ADN ty thể .......................................... 35 Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt quá trình thuần hóa. ............................................................ 38 Hình 2.5. Heo rừng thuần nguồn gốc Tây Nguyên. .................................................. 39 Hình 2.6. Sơ đồ tóm tắt thí nghiệm bảo tồn nguồn gen heo rừng ............................. 40 Hình 2.7. Buồng đếm Neubauer ................................................................................ 41 Hình 2.8. Các dạng kì hình của tinh trùng. ............................................................... 43 Hình 2.9. Thu nhâṇ tinh từ mào tinh.. ....................................................................... 44 Hình 3.1. Các vị trí biến đổi trong vùng D-loop ty thể của các cá thể heo rừng. ..... 53 Hình 3.2. Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự D-loop ...................... 55 Hình 3.3. Các vị trí biến đổi trong vùng cytochrome b ............................................ 58 Hình 3.4. Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự cytochrom b .............. 61 Hình 3.5. Các vị trí biến đổi trong trình tự 16S. ....................................................... 63 Hình 3.6. Cây phát sinh loài được thiết lập dựa trên trình tự 16S ........................... 64 Hình 3.7. Heo rừng Sus scrofa khu vực Tây Nguyên. .............................................. 66 Hình 3.8. Heo rừng được thuần hóa. ......................................................................... 67 Hình 3.9. Tinh trùng nhuộm Eosin-Nigrosin. ........................................................... 72 Hình 3.10. Sự kết dính tinh trùng. ............................................................................. 73 Hình 3.11. Kỳ hình tinh trùng heo rừng thuần Tây Nguyên ..................................... 74 Hình 3.12. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy sơ cấp. ............................ 77 Hình 3.13. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên nuôi cấy chuyền trong phòng thí nghiệm. ...................................................................................................................... 77 Hình 3.14. Tế bào heo rừng thuần Tây Nguyên sau giải đông. ................................ 78 vii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong PCR và giải trình tự ..................................... 36 Bảng 2.2.Thành phần phản ứng ................................................................................ 36 Bảng 2.3. Chu kì phản ứng ........................................................................................ 37 Bảng 2.4. Nhiệt độ phản ứng của các đoạn mồi........................................................ 37 Bảng 3.1. Nguồn gốc giống heo rừng đang nuôi trên điạ bàn Tây Nguyên ............. 47 Bảng 3.2. Thông số đo cơ thể của heo. ..................................................................... 49 Bảng 3.3. Thông số đo hộp sọ của heo. .................................................................... 51 Bảng 3.4. Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei giữa các quần thể heo rừng dựa trên trình tự D-loop. ........................................................................................... 54 Bảng 3.5. Ma trận khoảng cách di truyền Tamura-Nei giữa các quần thể heo rừng dựa trên trình tự cytochrome b. ................................................................................. 59 Bảng 3.6. Điạ điểm và số lươṇg heo rừng thu nhâṇ trong tư ̣nhiên .......................... 67 Bảng 3.7. Tỷ lê ̣thuần hóa thành công ....................................................................... 68 Bảng 3.8. Một số đặc điểm sinh sản của heo rừng Tây Nguyên trong giai đoạn sinh con ............................................................................................................................. 69 Bảng 3.9. Một số đặc điểm sinh sản của heo rừng Tây Nguyên sau giai đoạn sinh con ............................................................................................................................. 70 Bảng 3.10. Các thông số của tinh dịch .................................................................... 71 Bảng 3.11. Tỉ lệ tinh trùng sống sau giải đông ở các nghiệm thức khác nhau ......... 75 Bảng 3.12. Tỷ lê ̣sống của tinh trùng thu từ mào tinh đông laṇh ............................. 76 1 PHẦN MỞ ĐẦU 1. ĐẶT VẤN ĐỀ Việt Nam là một trong những nơi được đánh giá có mức độ đa dạng sinh học cao nhất trên thế giới. Hai loài heo rừng được xác định có tồn tại ở Việt Nam là Sus bucculentus và Sus scrofa. Tuy nhiên, loài Sus bucculentus hiện nay khó tìm thấy còn sống trong tự nhiên; loài Sus scrofa được cho là phân bố khá rộng, đặc biệt có nhiều ở vùng rừng núi khu vực Tây Nguyên. Các nghiên cứu về đặc điểm hình thái và di truyền của quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên cho đến nay còn rất hạn chế. Ở khu vực Tây Nguyên, các giống heo rừng mà người dân địa phương đang nuôi hầu hết đều là heo lai được nhập từ các nước Thái Lan, Malaysia Các dòng heo lai này có đặc điểm di truyền không rõ ràng, không có lý lịch và nguồn gốc cụ thể. Việc phát triển chăn nuôi tự phát các giống heo rừng lai này sẽ làm tăng nguy cơ đe dọa tới sự bảo tồn nguồn gen các quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên. Thêm vào đó, tình hình săn bắt bừa bãi, nạn chặt phá rừng đang là nguyên nhân làm cho số lượng heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên bị giảm sút nhanh và sẽ có nguy cơ đe dọa tới sự tồn vong của chúng. Do đó, các nghiên cứu về việc thu nhận, thuần hóa và nhân rộng các quần thể heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên có vai trò rất quan trọng trong việc bảo tồn loài heo rừng của Việt Nam nói chung và khu vực Tây Nguyên nói riêng. Sự phân biệt những nhóm heo rừng khác nhau ngoài việc dựa vào đặc điểm hình thái thì hiện nay người ta còn dựa vào kiểu gen, đặc biệt là các trình tự đặc trưng trong các vùng bảo tồn của ADN nhân hoặc ADN ty thể. Các loài heo rừng khác nhau có các vị trí đa hình nucleotide đơn (single nucleotide polymorphism) tạo nên các haplotype đặc trưng cho loài heo đó. Trên cơ sở đó xây dựng cây phát sinh loài để xác định được nguồn gốc và sự khác biệt giữa heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên với các giống heo rừng khác. Xuất phát từ những tình hình trên, chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học và di truyền của heo rừng Tây Nguyên”. 2 2. MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI - Xây dựng được cây phát sinh loài và đánh giá một số đặc điểm sinh học heo rừng Tây Nguyên. - Góp phần bảo tồn nguồn gen heo rừng Tây Nguyên trong tự nhiên và trong phòng thí nghiệm. 3. Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI Đề tài có ý nghĩa thực tiễn quan trọng trong việc xác định nguồn gốc di truyền của heo rừng có nguồn gốc Tây Nguyên. Các kết quả đạt được giúp định hướng bảo tồn nguồn gen quý hiếm của heo rừng và từ đó có thể được ứng dụng trong sản xuất giống heo rừng thuần và heo rừng lai từ nguồn gen heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên. 4. TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI - Xác định được vị trí phân loại của heo rừng có nguồn gốc khu vực Tây Nguyên trong mối quan hệ phát sinh loài của heo rừng trên thế giới. - Xác định được 3 vị trí SNP mới của vùng D-loop và 3 vị trí SNP mới của gen cytochrome b của heo rừng Tây Nguyên, giúp phân biệt giữa heo rừng Tây Nguyên và các nhóm heo rừng khác. - Đánh giá một số đặc điểm sinh học (sinh học sinh sản) của heo rừng khu vực Tây Nguyên. - Đánh giá đặc điểm sinh học của tinh heo rừng khu vực Tây Nguyên. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. GIỚI THIỆU VỀ HEO RỪNG 1.1.1. VỊ TRÍ PHÂN LOẠI Heo rừng (Sus scrofa) không phải là động vật quý hiếm, nổi tiếng như sao la (Psendoyx nghetinhensis) hay mang lớn (Megamuntiacus vuquangensis) nhưng lại là loài động vật có giá trị kinh tế cao. Theo IUCN, heo rừng được xếp vào nhóm gặp nguy hiểm (Endangered – EN). Hiện nay heo rừng đang phải đối mặt rất cao với nguy cơ tuyệt chủng trong tự nhiên do săn bắt và các nguyên nhân khác [77]. Heo rừng còn gọi là lợn lòi, tên khoa học là Sus scrofa (Linnaeus, 1758) thuộc họ heo (Suidae), bộ ngón chẵn (Artiodaclyta) (Hình 1.1). Heo rừng có rất nhiều loài phụ. Các loài phụ khác nhau có thể được phân biệt dựa trên chiều dài, hình dáng của xương hốc mắt ví dụ như S.scrofa cristatus và S.scrofa vittatis có xương hốc mắt ngắn hơn các loài Châu Âu [58]. Dưới đây là một số phụ loài heo rừng đã được nhận biết [40]: Nòi Viễn Tây (nhóm scrofa)  Heo rừng phổ biến nhất Sus scrofa scrofa: phân bố chính từ Pháp tới vùng phía Tây Châu Âu (Nga).  Heo rừng Iberia Sus scrofa baeticus: một phụ loài nhỏ trên bán đảo Iberia.  Heo rừng Castilia Sus scrofa castilia: lớn hơn S. s. baeticus, phân bố chính ở phía Bắc Tây Ban Nha.  Heo rừng Sandinia Sus scrofa meridionalis: một loài heo rừng nhỏ từ Corsica, Sadinia và Andalisua.  Heo rừng Italia Sus scrofa majori: loài heo rừng này nhỏ hơn S. s. scrofa.  Sus scrofa Attila: loài heo rừng rất lớn sống ở phía Tây Châu Âu từ Kazakhstan, tới bắc Caucausus và Iran.  Heo rừng Barbary Sus scrofa algria: sống ở vùng Maghreb phía Tây Bắc Châu Phi.  Sus scrofa lybica: một loài heo rừng nhỏ sinh sống ở khu vực Caucasus, đồng bằng sông Nile, Thổ Nhĩ Kì và khu vực Balkan.  Sus scrofa sennaarensis: phân bố ở Ai Cập và phía Bắc Sudan. 4  Sus scrofa nigripes: loài heo rừng chân đen sinh sống ở dãy núi Tianshan, khu vực Trung Á. Nòi heo Ấn Độ  Heo rừng Ấn Độ Sus scrofa cristatus: sinh sống ở vùng phía Nam núi Hymalaya tới trung Ấn Độ và phía Tây Indonesia.  Sus scrofa affinis: phân bố vùng phía Nam Ấn độ và Srilanka.  Sus scrofa davidi: phân bố phía Đông Iran tới phía Bắc Tajikistan. Hình 1.1. Heo rừng trong điều kiện tự nhiên ( Nòi heo Đông Á  Heo rừng Manchuria Sus scrofa ussuricus: loài heo rừng lớn nhất, phân bố từ Manchuria tới Hàn Quốc.  Heo rừng Nhật Bản Sus scrofa leucomystax: là loài heo nhỏ phân bố ở Nhật Bản (trừ đảo Hokkaido).  Heo rừng Ruykyu Sus scrofa riukiuanus: phân bố ở quần đảo Ryukyu.  Heo rừng Formosa Sus scrofa taivanus, phân bố ở Đài Loan.  Sus scrofa moupinensis: phân bố ở Trung Quốc và Việt Nam.  Heo rừng Siberia Sus scrofa sibiricus: phân bố ở Mông Cổ và Transbaikalia. Nòi Sundaic  Sus scrofa vittatus: loài heo rừng nhỏ, mặt ngắn, phân bố từ bán đảo Malaysia và Indonesia từ đảo Sumatra và Java tới Komodo. 1.1.2. SỰ PHÂN BỐ CỦA HEO RỪNG Suidae là một họ bao gồm tất cả các loài heo. Ngoài 16 loài đang có hiện nay, một số lượng lớn các loài hóa thạch cũng được công nhận thuộc họ heo này. 5 Những loài hiện nay được phân loại thành từ 4 đến 8 chi. Mẫu hóa thạch sớm nhất có từ kỷ nguyên Oligocene ở Châu Á và con cháu của chúng di cư tới Châu Âu trong suốt kỷ nguyên Miocene. Heo rừng hiện nay có thể tìm thấy ở nhiều môi trường và vùng địa lý khác nhau. Môi trường sống chủ yếu của loài này là ở những khu rừng ẩm ướt, vùng đất đầy bụi gai. Chúng được tìm thấy nhiều nhất vào mùa đông do nhiệt độ thấp cản trở việc di chuyển và kiếm mồi [4]. Heo rừng Sus scrofa là loài phân bố rộng rãi nhất của của họ Suidae. Phạm vi của chúng kéo dài từ Tây Âu và lưu vực Địa Trung Hải đến Taiga (Nga), qua Ấn Độ và Đông Nam Á đến các đảo Sri Lanka và Nhật Bản. Ở Bắc Âu, gần đây chúng đã xâm lấn sang Thụy Điển, Phần Lan, Estonia và Karelia (Liên Xô), sự hiện diện của chúng được ghi lại ở cả 65 độ Bắc [23], ngoại trừ Nam Cực [87], heo rừng Châu Âu đã được đưa vào Bắc Mỹ và heo hoang dã thuộc cùng một loài đã sống ở Úc, New Zealand, và nhiều đảo ở Thái Bình Dương [118]. Heo rừng Sus scrofa đã từng có nguồn gốc từ nước Anh nhưng có thể bị con người săn bắn đến tuyệt chủng vào khoảng cuối thế kỷ XIII [90]. Tuy nhiên, sự phát triển của việc chăn nuôi heo rừng bắt đầu vào những năm 1980 [9], cùng với việc một số con thỉnh thoảng thoát ra từ các trang trại và cơ sở giết mổ dẫn đến việc hình thành một số lượng nhỏ các quần thể heo rừng sinh sản. Ngoài khu phân bố tự nhiên của chúng, heo rừng hay heo hoang dã đã thích nghi rộng rãi, bao gồm các vùng của Hoa Kỳ, Châu Phi và hầu hết các nhóm đảo đại dương [65]. Tại châu Âu, sự gia tăng của heo rừng trong vài thập kỷ qua là do một số yếu tố như sự thay đổi kinh tế xã hội, sự đa dạng trong các loại cây trồng chủ đạo, ít động vật ăn thịt, săn bắn bị hạn chế, thêm thực phẩm và biến đổi khí hậu [34] đã cải thiện điều kiện môi trường sống cho các loài. Sự phân loại heo rừng ở châu Âu là phức tạp do chúng di chuyển và giao phối giữa các động vật có xuất xứ địa lý khác nhau hoặc với heo nhà. Tuy nhiên, gần đây Genov đã kết luận rằng tất cả các con heo châu Âu thuộc về một phân loài là Sus scrofa [33]. Ở Việt Nam, heo rừng có mặt từ trung du đến miền núi. Phạm vi hoạt động của heo rừng rất rộng. Chúng sống được trong nhiều sinh cảnh khác nhau như rừng thứ sinh, rừng thưa (trừ núi đá) nhưng thích hợp nhất là những thung lũng ven các suối nước, đầm lầy có độ ẩm cao, nhiều thức ăn như rừng tre nứa, gần nương rẫy. Heo rừng thường sống theo bầy đàn, có những bầy đàn lớn từ 20 – 100 con. Tuy 6 nhiên, chúng ta thường chỉ gặp những đàn dưới 20 con. Những con đực bình thường vẫn kiếm ăn một mình, đến mùa động dục chúng mới nhập đàn, tìm bạn tình. Heo rừng trong tư ̣nhiên thường kiếm ăn vào ban đêm, khoảng từ chập tối đến gần sáng và nghỉ ngơi trong bụi rậm vào ban ngày. Mùa đông, chúng làm tổ để nằm. Thỉnh thoảng chúng cũng ra khỏi rừng tìm đến những nương rẫy hoặc những nơi có sẵn măng tre vào sáng sớm hoặc chiều tối. 1.1.3. ĐẶC ĐIỂM CHUNG CỦA HEO RỪNG Heo thuộc Bộ ngón chẵn và nhìn chung chúng được đánh giá là các dạng sống giống nhất với các dạng tổ tiên thuộc bộ này. Heo rừng vừa là tổ tiên vừa có thể giao phối tự do với heo nhà. Một số quần thể heo hoang dã, chẳng hạn như ở Úc và các vùng của Bắc Mỹ, có nguồn gốc hoàn toàn từ heo nhà nhưng các loài động vật hiện tại ở Anh với hình dáng giống heo rừng, có thể là heo rừng thuần hoặc lai heo rừng [65]. Tuy nhiên, kể từ khi một số nông trại cho lai với heo nhà thì tình trạng di truyền thực sự của các quần thể hoang dã là không chắc chắn, rõ ràng. Heo rừng là thủy tổ của heo nhà nên hình dáng heo rừng cũng tương đồng như heo nhà, phần mông của heo rừng nhỏ hơn heo nhà nhưng phần đầu và ngực của heo rừng rất phát triển. Bộ lông thô, dài, cứng, màu đen xám bao phủ toàn thân heo rừng. Lông gáy dày và rậm, khi bị kích động hàng lông này dựng lên [4]. Heo rừng trưởng thành có chiều dài khoảng 90 - 180 cm, chiều dài đuôi khoảng 30 cm, chiều cao vai khoảng 55 - 110 cm, trọng lượng cơ thể từ 50 - 350 kg. Con đực thường lớn hơn con cái, heo rừng thường có 2 đôi răng nanh, 6 cặp vú. Sọ heo rừng khá dài, khẩu cái dài 20 – 22 cm, phù hợp cho việc đào bới, ủi đất tìm kiếm thức ăn [4]. Dưới tác động của phân vùng địa lý, da heo rừng có màu khác nhau, chiều dài đuôi và hình dáng mõm cũng thay đổi. Heo rừng có thân mình thon dài, lưng thẳng, mõm dài và nhọn, tai nhỏ, mắt màu nâu lợt và ánh mắt hoang dại, lông màu đen hoặc nâu sậm, bốn chân nhỏ và khỏe. Heo rừng có bờm lông ở trên gáy mọc dài theo sống lưng. Chùm lông bờm dài và dày, có ba chấu mọc thành hình tam giác đặc trưng [4]. Heo rừng trưởng thành là loài động vật cỡ lớn và có thể nặng tới 300 kg nhưng phần lớn trọng lượng lúc trưởng thành là khoảng 100 kg đối với con đực và 75 kg đối với con cái [84]. Tại Châu Âu, kích thước cơ thể của heo rừng trưởng thành thay đổi 35 - 230 kg, các cá thể nhỏ nhất được tìm thấy ở các nước Địa Trung Hải [107]. Bộ lông của heo rừng có màu tối nhưng có thể thay đổi từ màu vàng xám 7 nhạt đến toàn thân đỏ - nâu hoặc đen [67]. Heo con khi mới sinh dài khoảng 25 cm và cân nặng nhỏ hơn 1 kg. Chúng có bộ lông màu đỏ nâu với các sọc dọc. Bộ lông sẽ được thay đồng đều thành màu đỏ nâu ở tháng thứ 4 đến tháng thứ 5, sau đó có bộ lông của con trưởng thành ở khoảng tháng thứ 10 đến tháng 12 [70]. Mặt, má và họng có nhúm lông hoa râm hơi trắng, lưng tròn và chân tương đối dài. Heo rừng đực trưởng thành đều có răng nanh. Răng nanh thường dài khoảng 6 cm. Răng nanh trên mọc hướng lên phía trên và cong ra ngoài. Răng nanh dưới thì giống dao cạo, tự mài sắc bằng cách tỳ sát vào răng nanh trên. Heo rừng cái cũng có răng nanh nhưng nhỏ hơn heo rừng đực và không nhô ra ngoài. Đuôi ngắn với 1 chùm lông đơn giản phía cuối. Răng của heo rừng phản ánh chế độ thức ăn. Họ heo vẫn còn răng cửa trên trong khi ở các họ khác của Bộ ngón chẵn không còn. Răng nanh phát triển to, lồi lên, dùng để ủi đất ẩm ướt hoặc bụi cây thấp và để chiến đấu. Số lượng răng thay đổi giữa các loài. Họ heo có thính giác rất phát triển và chúng giao tiếp với nhau bằng một loạt các tiếng kêu đặc trưng. Heo rừng bơi rất giỏi, có tài liệu ghi lại rằng chúng có thể bơi giữa các đảo cách nhau đến 7 km [70]. Heo rừng là loài ăn tạp. Thức ăn phổ biến là các loại củ quả giàu tinh bột và các loại cây nhiều chất xơ như chuối, măng. Heo rừng sinh sản quanh năm. Thời gian mang thai là 4 tháng, mỗi năm đẻ 1 - 2 lứa, mỗi lứa 5 - 6 con. Tuy nhiên, mùa sinh sản thích hợp nhất là mùa xuân và mùa thu. 1.1.4. PHƯƠNG THỨC TÌM KIẾM THỨC ĂN Heo rừng là loài ăn tạp, nguyên liệu thực vật chiếm từ 80 đến 90% trong chế độ ăn uống [33]. Heo rừng có thể tiêu thụ từ các loại động vật như chim, động vật có vú, lưỡng cư, bò sát, trứng, xác chết, động vật chân đốt, động vật thân mềm đến thức ăn thực vật gồm các nhóm thực phẩm như trái cây và các loại hạt (hạt, hoa quả, trái cây rừng nhiệt đới); lá và thân cây: cỏ, mía, cây chuối, thân rễ; củ và quả, bao gồm cả cây củ như khoai tây và những loại thức ăn khác là phân, nấm[1]. Ở phía Đông và Tây Ba Lan, nơi heo rừng sống ở rừng rụng lá và rìa đồng ruộng, Genov đa ̃tìm thấy 131 loài thực vật được heo rừng tiêu thụ trong hơn một năm; những loài được trồng chiếm 71% trong dạ dày (theo khối lượng), các loài cỏ và cây rừng chiếm 21% và nguyên liệu động vật là 9%. Một phần đáng chú ý của chế độ ăn của heo rừng là các loại thức ăn dưới lòng đất như rễ, củ và động vật không xương sống 8 [33]. Thức ăn động vật chỉ đóng vai trò thứ yếu trong chế độ ăn của heo rừng, ước tính khoảng 2-9% [33], bao gồm ấu trùng côn trùng, giun đất, ốc sên và xác thối rữa [20]. Heo rừng có nhu cầu năng lượng tương đối cao, đặc biệt là trong thời gian cho con bú và tăng trưởng của heo con [17]. Heo nái cần khoảng 15% protein thô trong chế độ ăn uống để cho con non bú. Lượng protein này có thể được đáp ứng từ nguyên liệu thực vật nhưng thường được đáp ứng nhiều hơn từ động vật. Cây trồng nông nghiệp là loaị thức ăn được heo rừng sử dụng nhiều. Ở châu Âu heo rừng tiêu thụ chủ yếu là khoai tây, nho và ngũ cốc [36]. Heo rừng có dạ dày đơn, do đó ít có khả năng phân hủy và thu nhâṇ carbohydrate từ cellulose so với các động vật móng guốc nhai lại khác. Khi cây trồng và thực phẩm bổ sung không có sẵn, các thực phẩm giàu năng lượng như quả sồi rất được ưa thích trong chế độ ăn uống tự nhiên của heo rừng [71]. Heo rừng cũng sống trong rừng lá kim và lau sậy và do đó chế độ ăn uống của chúng dựa trên một hỗn hợp thức ăn dưới lòng đất, vỏ cây, động vật không xương và xác thối [23]. Thói quen của heo rừng là bắt đầu đi tìm thức ăn từ lúc trời vừa chạng vạng tối đến lúc trời hừng sáng mới trở về nơi ở của chúng. Như vậy, chúng đi tìm thức ăn suốt đêm và ban đêm mới là bữa ăn chính. Khi đi tìm thức ăn, heo rừng không những chỉ ăn trên mặt đất mà thường dùng mõm đào bới dưới mặt đất sâu để tìm được các thứ củ quả, rễ non để ăn. Chúng thường men theo bờ sông, suối để đào bới dưới đất cát để tìm cá, tôm, sò, ốc [4]. Thức ăn bổ sung có chủ đích cho heo rừng thường là ngô, viêc̣ này rất quan trọng đối với một số vùng của châu Âu vào mùa đông, chiếm khoảng 50% chế độ ăn uống [29]. Heo rừng có khả năng thích ứng cao với sự thay đổi của nguồn thức ăn [34]. 1.1.5. PHẠM VI SỐNG VÀ MẬT ĐỘ QUẦN THỂ CỦA HEO RỪNG Heo rừng được tìm thấy ở nhiều môi trường sống khác nhau, từ các khu vực khô cằn, rừng núi cao và đồng cỏ, đến rừng mưa nhiệt đới dày đặc. Môi trường sống của heo rừng được xác định bởi lượng lương thực sẵn có, chỗ trú ngu ̣và điều kiện thời tiết [9]. Heo rừng trong tư ̣nhiên chọn môi trường sống là nơi có thể cung cấp thực phẩm năng lượng cao, trốn các động vật ăn thịt và chúng tránh những khu vực có điều kiện thời tiết cực đoan, ví dụ như nơi tuyết che phủ cản trở đến sự di chuyển [106]. Trong mùa hè nóng, heo rừng thích những khu vực râm mát bởi vì chúng thiếu tuyến mồ hôi, chúng cần phải điều chỉnh nhiệt bằng cách đầm mình và nghỉ 9 ngơi ở những nơi mát. Nước rất cần thiết để heo rừng sống sót. Nơi nghỉ ngơi thường là những khu vực có thảm thực vật dày đặc, chúng nằm trên một mặt đất lún [116]. S...rừng Trung Quốc [92]. 24 Hiện nay, một số nghiên cứu trên heo rừng thuần Việt Nam đã được tiến hành. Vùng D-loop của ADN heo rừng Việt Nam ở một số tỉnh miền Bắc đã được giải trình tự và xác định các biến dị giữa các loài heo bản địa cũng như so sánh loài heo Việt Nam với loài heo của Nhật Bản [122]. Microsatellites cũng được sử dụng để đánh giá, so sánh tính đa hình cũng như mức độ đa dạng di truyền của một số loài heo rừng miền Bắc với Châu Âu [117]. Tuy nhiên, các nghiên cứu sử dụng heo rừng khu vực miền Trung, miền Nam cũng như trình tự cytochrome b và 16S trong đánh giá biến dị và đa dạng di truyền vẫn chưa được quan tâm nghiên cứu đầy đủ. Trong đề tài này, chúng tôi tiến hành giải trình tự vùng D-loop, cytochrome b và 16S của ADN ty thể heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên và phân tích điểm đa hình cũng như những khác biệt di truyền của heo rừng Việt Nam khu vực Tây Nguyên so với một số loài heo rừng các nước khác. Kết quả nghiên cứu này là cơ sở cho các nghiên cứu tiếp theo như bảo tồn hay sử dụng nguồn gen heo rừng Tây Nguyên trong công tác lai tạo giống. 1.4. BẢO TỒN HEO RỪNG THUẦN CÓ NGUỒN GỐC TÂY NGUYÊN Sinh học bảo tồn là một khoa học đa ngành được xây dựng nhằm hạn chế các mối đe dọa đối với đa dạng sinh học. Sinh học bảo tồn có hai mục tiêu: một là tìm hiểu những tác động tiêu cực do các hoạt động của con người gây ra đối với các loài, quần xã và các hệ sinh thái; hai là xây dựng các phương pháp tiếp cận để hạn chế tuyệt diệt của các loài và nếu có thể được, cứu các loài đang bị đe dọa bằng cách đưa chúng hội nhập trở lại các hệ sinh thái đang còn phù hợp đối với chúng. Các khoa học kinh điển như sinh học quần thể, phân loại học, sinh thái học, di truyền học là nội dung cơ bản của sinh học bảo tồn. Quỹ Bảo vệ Thiên nhiên Quốc tế (WWF) (1989) quan niệm: “Đa đạng sinh học (ĐDSH) là sự phồn thịnh của sự sống trên trái đất, là hàng triệu loài thực vật, động vật và vi sinh vật, là những gen chứa đựng trong các loài và là những Hệ sinh thái (HST) vô cùng phức tạp cùng tồn tại trong môi trường”. Do vậy, ĐDSH bao gồm sự đa dạng trong loài (đa dạng di truyền hay còn gọi là đa dạng gen), giữa các loài (đa dạng loài) và các HST (đa dạng HST). Việc bảo vệ đa dạng sinh học là trọng tâm của sinh học bảo tồn. Có nhiều phương pháp và công cụ để bảo tồn và quản lý ĐDSH. Một số phương pháp và công cụ được sử dụng để phục hồi một số loài đặc biệt nào đó, các 25 dòng di truyền hay các sinh cảnh. Một số khác được sử dụng để sản xuất một cách bền vững các sản phẩm, hàng hoá và dịch vụ từ các tài nguyên sinh học. Một số nữa có xu hướng tạo ra sự phân phối một cách công bằng các lợi nhuận thu được từ việc bảo tồn ĐDSH, sử dụng bền vững các tài nguyên sinh học [109]. Có thể phân chia các phương pháp và công cụ thành các nhóm như sau: Bảo tồn nguyên vị (in situ): Bảo tồn nguyên vị bao gồm các phương pháp và công cụ nhằm mục đích bảo vệ các loài, các chủng và các sinh cảnh, các HST trong điều kiện tự nhiên. Tùy theo đối tượng bảo tồn mà các hành động quản lý thay đổi. Thông thường bảo tồn nguyên vị được thực hiện bằng cách thành lập các khu bảo tồn và đề xuất các biện pháp quản lý phù hợp [109]. Bảo tồn chuyển vị (ex situ): Bảo tồn chuyển vị bao gồm các biện pháp di dời các loài cây, con và các vi sinh vật ra khỏi môi trường sống thiên nhiên của chúng. Mục đích của việc di dời này là để nhân giống, lưu giữ, nhân nuôi vô tính hay cứu hộ trong trường hợp: (1) nơi sinh sống bị suy thoái hay huỷ hoại không thể lưu giữ lâu hơn các loài nói trên, (2) dùng để làm vật liệu cho nghiên cứu, thực nghiệm và phát triển sản phẩm mới, để nâng cao kiến thức cho cộng đồng [109]. 1.4.1. BẢO TỒN GIAO TỬ HEO RỪNG THUẦN CO NGUỒN GỐC TÂY NGUYÊN 1.4.1.1. Bảo tồn tinh trùng Đông lạnh tinh heo là một biêṇ pháp hữu ích cho việc bảo quản các nguồn di truyền, cải thiện di truyền và tăng cường khả năng trao đổi di truyền giữa các nước khác nhau [52]. Hơn nữa, tinh dịch đông lạnh còn được sử dụng cho các công nghệ sinh sản như thụ tinh trong ống nghiệm (in vitro fertilization-IVF), chuyển phôi (embryo transfer) và chọn lọc giới tính [37]. Tuy nhiên, một điều không thuận lợi là những nghiên cứu của quá trình đông lạnh tinh diễn ra chậm. Ở heo, phương pháp đông lạnh tinh gặp một số khó khăn trong quá trình đông lạnh và giải đông. Việc sử dụng tinh trùng đông lạnh để thụ tinh vẫn cho tỉ lệ thụ tinh thấp hơn so với thụ tinh sử dụng tinh tươi [22]. Tinh dịch thường được pha loãng với môi trường thích hợp, có thành phần lòng đỏ trứng hay sữa. Nhiệt độ pha loãng phải tương thích với nhiệt độ cơ thể [86]. Đông lạnh gây ra các stress lên tinh trùng như sự sắp xếp lại cũng 26 như giảm tính bền vững các thành phần của màng tinh trùng và dòng canxi trong tinh trùng. Do đó, để đảm bảo chất lượng cũng như khả năng thụ tinh của tinh trùng, cần phải giảm các nhân tố có thể tác động xấu đến tinh trùng trong quá trình đông lạnh [96], [98]. Phương pháp đông lạnh và giải đông tinh heo được bắt đầu nghiên cứu và phát triển phục vụ gieo tinh nhân tạo cách đây khá lâu ở các nước châu Âu và Mỹ [63]. Trong những năm gần đây, nghiên cứu đông lạnh tinh trùng heo đã có những cải tiến và tối ưu hóa quan trọng [98]. Ví dụ như phương pháp ly tâm và giải đông tinh trùng cũng như bổ sung các nhân tố giúp cải thiện quá trình đông lạnh tinh trùng [97]. Tinh trùng heo khác với tinh trùng của các nhóm động vật khác, tinh dịch heo được sản xuất trên một thể tích lớn và tinh trùng nhạy cảm với shock nhiệt lạnh, khả năng sống của tế bào tinh giảm rõ rệt khi nhiệt độ thấp hơn 15oC [38]. Do đó, đông lạnh tinh heo đòi hỏi phải có những kỹ thuật đặc biệt [53]. Nhiều yếu tố có thể liên quan tới quá trình đông lạnh tinh heo bao gồm môi trường pha loãng, loại chất bảo vệ, thời gian đông lạnh, tốc độ làm lạnh và giải đông [53]. Ngày nay, có hai kỹ thuật chính trong đông lạnh tinh heo là đông lạnh truyền thống và đông lạnh kiểm soát tốc độ hạ nhiệt. Verheyen (1993) đã mô tả rằng kết quả tinh trùng sau giải đông sẽ tốt hơn khi máy tính kiểm soát tốc độ làm lạnh được sử dụng, kết quả này tốt hơn phương pháp đông lạnh không kiểm soát tốc độ làm lạnh. Việc kiểm soát tốc độ làm lạnh sẽ cải thiện rõ rệt khả năng di động của tinh trùng, khả năng sống khi so sánh với phương pháp đông lạnh truyền thống. Bên cạnh việc thụ tinh phụ thuộc vào các giống heo, các dữ liệu cho thấy khả năng di động của tinh trùng đông lạnh giữa giống heo Landrace và giống heo Duroc là khác nhau. Sự khác biệt này có nguyên nhân từ việc khác biệt trong thành phần lipid của màng sinh chất ở tinh trùng, nó có thể ảnh hưởng tới sự khác biệt chính trong tỉ lệ sống sót và thụ tinh sau giải đông giữa các giống heo khác nhau [81]. Hạn chế của tinh heo đông lạnh là tỉ lệ thụ thai thấp [53]. Tỉ lệ thụ tinh thấp của tinh trùng đông lạnh liên quan tới nhiều yếu tố: việc sản sinh mạnh các chất oxy hóa, hoạt đôṇg của ROS được cảm ứng bởi quá trình đông lạnh, các sai hỏng, kỳ hình tinh trùng. Sự sản xuất ROS còn liên quan tới quá trình làm giảm hoạt động của tinh trùng, giảm khả năng dung hợp giữa tinh trùng và trứng. Tinh trùng rất nhạy với quá trình peroxide hóa lipid, quá trình này dựa vào nồng độ cao của các 27 acid béo chưa bão hòa và chúng có khả năng tái tổng hợp các thành phần trên màng sinh chất của tinh trùng. Nhiều nghiên cứu cho thấy việc bổ sung các chất chống oxy hóa trong môi trường bảo quản tinh trùng heo có thể cải thiện cả tinh trùng heo tươi [30] và tinh trùng heo đông lạnh [12], [32], [83], [95]. Các nghiên cứu trước đây chỉ ra rằng việc bổ sung các chất chống oxy hóa như vitamin E 200 µM vào môi trường đông lạnh để đông lạnh tinh trùng sẽ làm giảm sư ̣sản sinh các chất oxy hóa ROS và cải thiện khả năng sống và di động của tinh trùng [83]. Funahashi và Sano (2005) chỉ ra rằng việc bổ sung glutathione hay L- cysteine 5 µM vào môi trường đông lạnh sẽ cải thiện khả năng sống của tinh trùng của tinh trùng trong quá trình dự trữ tinh ở 10oC trong vòng ít nhất 14 ngày [30]. Một nghiên cứu gần đây mô tả rằng việc bổ sung 1µM glutathione vào môi trường đông lạnh sẽ có tác động bảo vệ chức năng của tinh trùng [32]. Đông lạnh tinh dịch heo liên quan đến nhiều bước chung như pha loãng, đông lạnh, làm lạnh và giải đông, mỗi bước đều tác động đến cấu trúc và chức năng của tinh trùng. 1.4.1.2. Bảo tồn trứng Đông lạnh tế bào trứng (TBT) (giao tử cái, noãn bào) là quá trình đưa TBT sống từ điều kiện sinh lý xuống điều kiện nhiệt độ rất thấp (-1960C, trong môi trường có chất bảo quản đông lạnh). Tại điều kiện này, mọi hoạt động sống, các quá trình chuyển hóa và phát triển của TBT đều dừng lại, nhưng các cấu trúc và thành phần sinh học của chúng được bảo tồn, nhờ đó người ta có thể giữ TBT ở trạng thái tiềm sinh trong một thời gian dài [19], [42]. Các phương pháp đông lạnh hiện nay được sử dụng có thể chia làm hai nhóm chính: nhóm đông lạnh cân bằng (equilibrium cooling) với hai phương pháp là đông lạnh chậm (slow freezing) và đông lạnh nhanh (rapid freezing); nhóm đông lạnh không cân bằng (non – equilibrium cooling) với phương pháp đông lạnh cực nhanh (thủy tinh hóa, vitrification). Sự lựa chọn phương pháp đông lạnh phụ thuộc vào một số yêu cầu như: (1) tính hiệu quả, (2) tính an toàn, (3) tính tiện lợi. [25], [19], [42]. Đông lạnh chậm (Slow-cooling) Đông lạnh chậm sử dụng nồng độ chất bảo vệ lạnh (Cryoprotectant agents_CPA) với nồng độ thấp (khoảng 1 – 2M) thêm vào môi trường đông lạnh, 28 tốc độ làm lạnh giới hạn khoảng 0,1 – 1,0oC/phút). Quá trình làm lạnh thực hiện nhờ các máy giảm nhiệt, các tế bào được khử nước với tốc độ chậm. [19] Trước khi giảm nhiệt độ tế bào dưới 0oC, TBT sẽ được tiếp xúc với môi trường có CPA với nồng độ thấp (khoảng 1 – 1,5M/lít) để làm mất nước nội bào nhằm hạn chế sự hình thành tinh thể đá. Thường trong giai đoạn này, người ta chỉ sử dụng một loại CPA (propanediol_PROH, dimethylsulfoxide_DMSO hay ethylene glycol_EG). Do tính thấm qua màng tế bào của nước cao hơn của CPA, nên sự di chuyển của nước ra khỏi tế bào nhanh hơn sự di chuyển của CPA vào tế bào. Chính điều này làm cho tế bào ban đầu bị giảm thể tích, sau đó phục hồi dần thể tích [19], [42]. Giai đoạn mất nước thứ hai diễn ra khi cho TBT tiếp xúc với môi trường có CPA ban đầu kết hợp với một CPA không có khả năng thấm qua màng tế bào (sucrose hay oligosaccharide khác). Sau đó TBT được làm lạnh xuống dưới 0oC. Kết quả của phương pháp đông lạnh chậm sẽ tối ưu khi tốc độ hạ nhiệt tạo nên sự cân bằng giữa tốc độ nước ra khỏi tế bào và tốc độ nước hình thành nên tinh thể đá ngoại bào [19], [42]. Trong phương pháp này, các tổn thương do độc tính chất bảo vệ lạnh và nồng độ thẩm thấu cao thường không đáng kể. Tuy nhiên, nồng độ của các CPA không đủ để ngăn chặn sự hình thành tinh thể đá nội bào. Vì vậy, cần có một bước can thiệp trong phương pháp này, đó chính là sự tạo mầm tinh thể đá (seeding). Bước này kích thích sự hình thành tinh thể khác lan tỏa dần khắp môi trường, làm cho nồng độ thẩm thấu xung quanh TBT tăng dần. Lúc này nước thoát ra khỏi TBT nhờ hiện tượng thẩm thấu, vì vậy sẽ làm giảm nguy cơ hình thành tinh thể đá nội bào. Trong quá trình tiến hành cần kiểm soát chặt chẽ, nếu không sẽ làm tổn thương đến màng tế bào [19], [42]. Ở nhiệt độ -30oC đến -40oC, khi nước trong nội bào đã được loại bỏ hết và nước ngoại bào đã chuyển sang dạng tinh thể đá thì sẽ chuyển cọng rạ chứa TBT xuống -196oC và lưu trữ tại đây. Sau thời gian bảo quản, sẽ tiến hành rã đông tùy theo cách trữ lạnh. Quá trình rã đông diễn ra với nguyên lý hoàn toàn trái ngược với quy trình đông lạnh, trong đó quá trình bù nước phải diễn ra theo từng bước với nồng độ CPA giảm dần [19], [42]. 29 Đông lạnh nhanh (Rapid freezing) Phương pháp đông lạnh nhanh hầu như giống phương pháp đông lạnh chậm chậm (sử dụng nồng độ chất bảo vệ thấp tương tự như đông lạnh chậm) chỉ khác ở chỗ tốc tộ làm lạnh cao hơn: ngay sau khi ở nhiệt độ -5oC hay -7oC cọng rạ chứa TBT được nhấn chìm vào nitơ lỏng và giai đoạn cân bằng với chất bảo vệ lạnh có glycerol 1,08M và sucrose 0,4M kéo dài 20 phút [19], [42]. Đông lạnh cực nhanh (Thủy tinh hóa, vitrification) Thủy tinh hóa là một phương pháp trữ lạnh không cân bằng (non- equylibrium cryopreservation method) được thiết lập dựa trên nguyên lý cơ bản là không có sự hình thành tinh thể đá bên trong tế bào. Trong phương pháp này, mẫu tế bào được nhúng trực tiếp vào nitơ lỏng ngay khi được cho trao đổi với CPA mà không qua giai đoạn hạ nhiệt độ từ từ. Toàn bộ khối vật chất (kể cả nước) bên trong và môi trường bên ngoài tế bào sẽ chuyển thành thể rắn dạng “kính” (glass-like solidification) và hoàn toàn không có sự hình thành tinh thể đá [19], [42]. 1.4.2. BẢO TỒN TẾ BÀO SINH DƯỠNG 1.4.2.1. Đông lạnh tế bào sinh dưỡng Quá trình bảo quản tế bào ở nhiệt độ thấp dưới 0oC trong thời gian dài, được gọi là bảo quản lạnh. Tuy nhiên nhiệt độ dưới 0oC làm ngưng mọi hoạt động sinh học dẫn đến chết tế bào, do vậy phải có một quy trình giúp tế bào không chết và cũng không mất đi các thành phần, cấu trúc và nhiều tính năng sinh học sau đó. Về nguyên lí chung, đông lạnh tế bào là quá trình đưa tế bào từ điều kiện sinh lí (37oC, 5% CO2) vào môi trường dịch sinh lí, xuống điều kiện nhiệt độ rất thấp (-196oC, trong nitơ lỏng) ở dung dịch là môi trường đông lạnh (còn gọi là chất bảo quản đông lạnh- cryoprotectant). Tại điều kiện này, mọi hoạt động sống, các quá trình chuyển hoá và phát triển của tế bào dừng lại, nhưng chúng không chết, nhờ đó người ta có thể giữ tế bào ở trạng thái tiềm sinh trong một thời gian dài. Bảo quản lạnh đã giúp khả năng tối ưu hoá việc sử dụng, cũng như tính sẵn sàng để sử dụng đối với những vật liệu sinh học sống nói chung, một khi mà nguồn cung ứng ban đầu của chúng hạn chế. Công nghệ này cho phép lưu trữ lâu dài các nguồn vật liệu sinh học sống, mà không làm hư hỏng chúng trong thời gian lâu dài [3]. Với các quá trình, nguyên lí quan trọng của sinh học đông lạnh, rõ ràng khoa học của bảo quản lạnh đã được nghiên cứu có hệ thống, gần như đạt mức hoàn hảo 30 ngay từ cuối thế kỉ 20. Trong những năm gần đây, những tiến bộ của sinh học đông lạnh tiếp tục phát triển giúp hoàn thiện hơn lí thuyết cơ bản về sinh học đông lạnh (cryopreservation). Ở nhiệt độ rất thấp của nitơ lỏng (-196oC), nước bên trong tế bào và bên ngoài môi trường tồn tại ở dạng tinh thể và các dạng vật chất khác (không phải nước) sẽ ở dạng rắn giống như thủy tinh (glass-like). Phương pháp gọi là đông lạnh chậm (slow-freezing) thường được sử dụng. Với kĩ thuật này, những tế bào được làm lạnh ở một gradient nhiệt độ lạnh; tuy gọi là đông lạnh chậm, nhưng tiến trình cũng phải đủ nhanh, sao cho kịp khử hết nước bên trong tế bào, nhằm ngăn chặn sự hình thành đá nội bào (IIF), khiến tế bào vỡ do giãn nở thể tích. 1.4.2.2. Chất bảo quản đông lạnh Chất bảo quản đông lạnh có vai trò nhằm chống lại những tác động bất lợi của nhiệt độ thấp, hay nhiệt độ đông lạnh. Một chất bảo quản đông lạnh có thể làm cho nước đông lại giống như thủy tinh mà không hề hình thành các tinh thể đá. Những chất bảo quản này cũng ngăn chặn được sự tạo thành muối (tủa), cũng như việc tạo thành tinh thể trong tế bào trong suốt thời gian đông lạnh. Ở nồng độ muối cao và những tinh thể nước đá hình thành có thể làm tổn thương hoặc giết chết tế bào trong suốt quá trình đông lạnh cho đến khi tiến hành quá trình giải đông. Glycerol có khả năng bảo vệ tế bào trong điều kiện đông lạnh, đánh dấu một bước tiến triển mới trong lĩnh vực sinh học đông lạnh. Những chất thường được sử dụng trong thời gian đó để bảo quản tinh trùng là dung dịch muối sinh lý có bổ sung thêm bột sữa, lòng đỏ trứng, đường trái cây và một số chất khác [3]. Những nhà nghiên cứu đang cố gắng thay đổi thành phần các chất bảo quản đông lạnh và kiểm tra sự di động của tinh trùng sau khi đông lạnh. Kết quả trung bình đạt được là khoảng 5% tinh trùng di động sau khi giải đông. Lúc đầu, Glycerol được sử dụng như một chất đặc trưng để làm bất động tinh trùng khi quan sát chúng dưới kính hiển vi. Trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm, có lần các nhà khoa học đạt được mức độ di động của tinh trùng là 50% và kết quả này được xem như không bình thường. Họ đã lặp lại thí nghiệm nhiều lần và chúng vẫn cho kết quả tương tự. Ngày tiếp theo, trong khi các nhà nghiên cứu đang cố gắng chứng minh sự tiến bộ đáng chú ý này với các đồng nghiệp của họ trong một lô thí nghiệm mới, thì kết quả sau khi giải đông đã trở lại bình thường là 5%. Những phân tích về chất bảo 31 quản đông lạnh trước đó cho thấy một điều bất ngờ rằng, trong thành phần dung dịch bảo quản lần này, nồng độ glycerol cao hơn các lô thí nghiệm trước đây. Từ đó, glyceol được sử dụng như là một chất bảo quản lạnh, phương pháp bảo quản bằng đông lạnh đã được thay đổi căn cơ về bản chất. Khái niệm chất bảo quản đông lạnh ra đời, từ kết quả này, chiến dịch tìm kiếm những chất mới, được cho là có khả năng đóng vai trò là một chất bảo quản lạnh được tiến hành. Tất cả được khởi sướng từ một chất đầu tiên: glycerol (mà vào thời điểm đó, người ta sử dụng để làm bất động tinh trùng, phục vụ cho việc đánh giá hình thái học tế bào dưới kính hiển vi). Các chất bảo quản đông lạnh với nhiều thành phần các chất và hợp chất hoá học khác nhau, có tính tan trong nước cao, ít ảnh hưởng đến đặc tính tế bào, cũng như độc tính của chúng phụ thuộc vào nồng độ và nhiệt độ của môi trường chứa chúng. Trong quá trình hoà tan trong nước, chúng hình thành các cầu nối liên kết hydro với nước. Có thể phân loại các chất bảo quản đông lạnh bao gồm nhóm chất có khả năng xâm nhập và không xâm nhập tế bào. Những dạng ban đầu được sử dụng cho hiệu quả bảo vệ, thường thông qua các hoạt động liên kết yếu. Các chất bảo quản thâm nhập sẽ xuyên qua màng vào tế bào và sau đó, chúng tham gia trực tiếp hay gián tiếp việc cố định các protein nội bào. Khi nhiệt độ giảm xuống, tế bào có thể vượt qua cái chết (do sự hình thành băng nội bào) và giảm tác động của các chất điện phân (tập trung trong và ngoài tế bào). Như vậy, các tác động có tính gây độc, do nồng độ cao của các chất tan trong quá trình đông lạnh được giảm xuống rất nhiều. Với các chất bảo quản không xâm nhập, nói chung các tác động theo xu hướng bảo vệ của chúng, chủ yếu là do sự khử nước chọn lọc. Các chất bảo quản đông lạnh đặc trưng thường dùng như glycerol, etylen- glycol, DMSO (Dimethyl Sulfoxide) và 1,2 propanol. DMSO cho đến nay, chúng được xem như một chất bảo quản đông lạnh tốt hơn glycerol. Trọng lượng phân tử của DMSO tương đối thấp (<100). Điều này làm cho chúng dễ dàng thâm nhập qua màng và đi vào bên trong tế bào. Những đại phân tử như đường, protein và lipoprotein, cũng như các chất phân cực còn lại ở môi trường ngoài tế bào đóng vai trò như những chất bảo quản đông lạnh không xâm nhập. Những chất này hoạt động giống như hydroxyethylstarch vì chúng có khả năng làm giảm số lượng các tinh thể nước trong quá trình đông lạnh. 32 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên, heo rừng lai và heo bản địa khu vực Tây Nguyên – Việt Nam. Các khái niệm heo rừng thuần, heo rừng lai, heo bản địa được trình bày dưới đây: - Heo rừng thuần có nguồn gốc Tây nguyên là heo rừng thu được trong tự nhiên khu vực Tây Nguyên - Heo rừng lai là heo đang được người dân nuôi tại khu vực Tây Nguyên, có nguồn gốc không rõ ràng, có thể từ heo rừng Thái Lan, Malaysia,... - Heo bản địa là các giống heo đã được thuần hóa lâu đời và được người dân địa phương chăn nuôi: heo Móng Cái, heo Sóc, heo đen địa phương... 2.2. PHƯƠNG PHÁP 2.2.1. ĐIỀU TRA VÀ THU NHẬN HEO RỪNG THUẦN CÓ NGUỒN GỐC TÂY NGUYÊN Điều tra và thu nhận bao gồm cả các giống heo rừng đang được nuôi trên địa bàn các tỉnh Tây Nguyên. Quá trình điều tra và thu nhâṇ heo rừng có nguồn gốc khu vực Tây Nguyên cho nghiên cứu này được thực hiện với sự giúp đỡ của các traṃ kiểm lâm, Ban quản lý các vườn quốc gia cũng như môṭ số cán bô ̣thú y điạ phương và người dân. Heo rừng thu nhâṇ từ các vùng thuôc̣ các tỉnh Tây Nguyên hoăc̣ giáp ranh với các tỉnh Tây Nguyên như Đồng Nai, Bình Thuâṇ, Ninh Thuâṇ Đây là các khu vực rừng có đầm lầy giáp ranh giữa tỉnh Lâm Đồng và các tỉnh Đồng Nai, Bình Thuâṇ, Ninh Thuâṇ. Đối với heo rừng đang được người dân nuôi: Lập phiếu điều tra và tiến hành phỏng vấn các hộ chăn nuôi theo các câu hỏi đã đặt sẵn trên cơ sở tìm hiểu trước về thông tin của các hô ̣chăn nuôi nổi bâṭ từ Sở Khoa hoc̣ và Công nghê,̣ người dân , ghi chép số liêụ và dùng máy chup̣ ảnh ghi laị hình ảnh các giống heo rừng đang nuôi của từng hô,̣ trang traị cu ̣thể. Đánh giá sơ bô ̣về nguồn gốc, chất lươṇg giống heo rừng đang nuôi. 33 2.2.2. ĐÁNH GIÁ HÌNH THÁI VÀ PHÂN TÍCH ADN 2.2.2.1. Đánh giá hình thái Phương pháp đánh giá ngoaị hiǹh và đặc điểm sinh học: Heo rừng đươc̣ thu nhâṇ đầu tiên phải được xác định là heo có nguồn gốc tự nhiên, có ngoaị hình thon dài, phần đầu và ngưc̣ phát triển hơn phần sau, mõm dài, có 3 chấu lông chuṃ vào môṭ chỗ, lông màu xám. Heo rừng trưởng thành có da dày, màu xám, những con non lông có soc̣ dưa rõ. Tập tính sinh hoạt của heo rừng trong điều kiện bán tự nhiên được cán bộ kỹ thuật theo dõi hằng ngày và qua hệ thống camera gắn trong khu vực nuôi. Các thông số về chiều cao, chiều dài, cân nặng cũng như các thông số về sinh trưởng, phát triển và sinh sản được thu nhận và ghi chép theo dõi cho từng cá thể heo rừng. Khi đo các thông số ky ̃ thuâṭ, heo rừng đươc̣ đăṭ trong môṭ cũi bằng sắt taị môṭ nơi bằng phẳng. Đơị cho heo ổn điṇh mới tiến hành đo. Chiều dài thân đươc̣ tính từ trán (giữa 2 tai) đến khấu đuôi. Các chỉ tiêu về mặt cơ thể: Hình thái heo rừng được đánh giá qua các chỉ tiêu như: chiều dài thân, chiều dài chân sau, chiều dài đuôi, chiều dài tai, chiều dài mõm, chiều cao vai [103] (Hình 2.1). Hình 2.1. Các thông số đo bên ngoài của cơ thể heo rừng. A: Chiều dài cơ thể. B: Chiều dài đuôi. C: Chiều dài chân sau. D: Chiều cao vai. E: Chiều dài tai. F: Chiều dài mũi. Phân tích hộp sọ: các số đo của hộp sọ được sử dụng để phân tích được mô tả như trong hình 2.5 [11]. Các chỉ số hộp sọ được phân tích bao gồm: chiều dài hộp sọ, chiều dài hàm trên, chiều dài đường cơ bản, bề rộng gò má, bề rộng chẩm, chiều dài hàm ếch, chiều dài hàng răng trên, chiều dài hàng răng hàm ở phía trên, bề rộng thái dương, khoảng cách 2 hốc mắt, chiều dài đỉnh trán, chiều dài mũi (Hình 2.2). 34 Hình 2.2. Các chỉ số hộp sọ được phân tích. A: chiều dài hộp sọ, B: chiều dài từ mép trước của răng cửa trên đến xương chẩm, C-C’: chiều dài đường cơ bản, D: bề rộng gò má, E: bề rộng chẩm, F-C’: chiều dài hàm ếch, G: chiều dài hàng răng trên, H: chiều dài hàng răng hàm ở phía trên, I: bề rộng thái dương, J: khoảng cách 2 hốc mắt, L: chiều dài mũi, M: chiều cao chẩm, N: chiều cao hộp sọ, O: chiều dài hàng răng dưới, P: chiều dài răng cửa trên 35 2.2.2.2. Phân tích ADN Đối tượng nghiên cứu là mẫu mô tai heo rừng Tây Nguyên trong tư ̣nhiên, heo rừng đươc̣ nuôi taị các nông hô,̣ trang traị ở Tây Nguyên và heo bản điạ. Heo rừng hiêṇ nay đang đươc̣ nuôi taị các nông traị đươc̣ đánh giá là có nguồn gốc từ heo rừng Thái Lan và heo lai giữa heo đưc̣ rừng Thái Lan và heo cái bản điạ. Các mẫu mô tai heo được thu nhận từ các cá thể ở những địa phương thuộc khu vực Tây Nguyên. Quá trình phân tích ADN ty thể được tóm tắt theo hình 2.3. Các mẫu mô tai heo sau khi thu nhận được rửa sạch bằng dung dịch muối sinh lý 0,9%. Sau đó, mẫu mô được trữ ở -20oC trong eppendorf 1,5ml và chuyển nhanh về phòng thí nghiệm để thực hiện thí nghiệm. Hình 2.3. Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích ADN ty thể Tách chiết ADN: Mẫu mô tai heo được cắt nhỏ vào eppendof chứa 180 µl PureLink™ Genomic Digestion Buffer và 20 μl Proteinase K (trong bộ kit), vortex kỹ. Ủ qua đêm ở nhiệt độ 55°C. Thêm 20 µl RNase A (theo bộ kit) vào dung dịch ủ mẫu, hòa trộn kỹ và ủ ở nhiệt độ phòng trong 2 phút. Thêm 200 µl PureLink™ Genomic Lysis/Binding Buffer, vortex. Thêm 200 μl 100% ethanol, vortex kỹ trong 5 giây. Chuyển 640 µl dung dịch vào cột tách chiết ADN. Ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ dịch, chuyển cột ly trích qua tube mới. Thêm 500 µl dung dịch Wash buffer 1 vào cột và ly tâm 10.000 vòng trong 1 phút ở nhiệt 36 độ phòng. Loại bỏ tube cũ, chuyển cột qua tube mới. Thêm 500 µl dung dịch Wash buffer 2 vào cột và ly tâm 12000 vòng/phút, trong 3 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ tube cũ, chuyển cột qua tube mới. Thêm 50 µl dung dịch PureLink™ Genomic Elution Buffer vào cột và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 phút. Ly tâm 12.000 vòng/phút, trong 1 phút ở nhiệt độ phòng. Loại bỏ cột, thu nhận dung dịch trong tube. Dung dịch trong tube có chứa ADN, được bảo quản ở -20°C. Trình tự mồi khuếch đại các vùng gen mục tiêu: Đoạn mồi dùng cho quá trình khuếch đại vùng D-loop [122] và gen cytochrome b và gen 16S [26] ở ty thể heo rừng được mô tả trong bảng 2.1. Thành phần phản ứng được mô tả trong bảng 2.2 và chu kì phản ứng được mô tả trong bảng 2.3. Bảng 2.4 mô tả nhiệt độ bắt cặp của các mồi khác nhau Bảng 2.1. Trình tự mồi sử dụng trong PCR và giải trình tự Gen Vùng Trình tự 5’ – 3’ Kích thước (bp) D-loop F:AATATGCGACCCCAAAAATTTAACCA TT R: ACGTGTACGCACGTGTACGC 602 Cytochrome b CY1 F: CACGACCAATGACATGAAAAATC R: GCTGCGAGGGCGGTAAT 635 CY2 F: TCTTCGCCTTCCACTTTATCCTG R: TGGCCCTCCTTTTCTGGTTTA 661 16S F: ACCCCGCCTGTTTACCA R: ATAGCGGCTGCACCATTTG 664 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng Thành phần Thể tích (μl) Mẫu ADN 1 Mồi 3 dNTP 1 PCR buffer 5 Enzyme 0.5 Nước 38.5 Tổng phản ứng 50 37 Bảng 2.3. Chu kì phản ứng Nhiệt độ (oC) Thời gian Số chu kì 94 5 phút 1 94 30 giây 40 Theo bảng 2.4 45 giây 72 45 giây 72 10 phút 1 4 30 phút 1 Bảng 2.4. Nhiệt độ phản ứng của các đoạn mồi Đoạn mồi sử dụng Nhiệt độ bắt cặp (oC) D-loop 60 CY1 55°C CY2 55°C 16S 53°C Điện di: Gel 1% agarose được chuẩn bị bằng cách cho 1g agarose vào 100ml dung dịch 1X TAE. Sau đó, hỗn hợp được gia nhiệt trong lò vi sóng cho đến khi dung dịch trở nên trong suốt. Bổ sung dung dịch 1X TAE để bù vào lượng bay hơi cho đủ 100ml. Khi nhiệt độ dung dịch khoảng 50–60oC, thêm 2 µl ethidium bromide, lắc nhẹ để hòa đều dung dịch. Chuyển nhẹ toàn bộ dung dịch vào khuôn đổ gel và để nguội ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. Mảnh gel 1% agarose đạt chuẩn dày khoảng 5 mm và không có bọt khí bên trong. Chuyển mảnh gel vào buồng điện di có chứa dung dịch 1X TAE phủ ngập mảnh gel. Các mẫu chạy điện đi được hòa trộn kỹ với 5X loading buffer theo tỷ lệ: 3 µl mẫu + 3 µl 5X loading buffer. Bổ sung hỗn hợp vào các giếng trên mảnh gel. Thêm 3 µl thang chuẩn vào 1 giếng trên mảnh gel để làm thước đo so sánh. Tiến hành điện di trong 30 phút ở hiệu điện thế 95V. Chuyển mảnh gel vào buồng đọc kết quả. Dưới tác dụng của tia UV, các băng ADN sẽ phát sáng trên nền gel. Chụp lại kết quả và so sánh kích thước đoạn ADN với ADN marker. Sản phẩm PCR được điện di cùng với thang chuẩn 100 bp. Giải trình tự và phân tích dữ liệu: Sản phẩm PCR được tinh sạch bằng ExoSAP-IT PCR Clean up kit và được sử dụng làm khuôn cho giải trình tự. Các 38 trình tự nucleotide được xác định bằng hệ thống 3730XL ADN Analyzer (Macrogen, Hàn Quốc). Việc so sánh trình tự của vùng ADN ty thể được thực hiện cho các cá thể heo rừng Việt Nam và các cá thể heo rừng khác từ Genbank. Quá trình so sánh này được thực hiện bằng chương trình MEGA5 [116]. Trình tự vùng ADN ty thể được xếp dóng cột bằng chương trình CLUSTAL W. Mô hình Tamura và Nei được sử dụng để xác định khoảng cách di truyền. Phương pháp Neighbor- Joining được sử dụng để xây dựng cây phát sinh loài [102]. Phân tích bootstrap (lặp lại 1000 lần) được sử dụng để đánh giá mức độ tin cậy của các nhánh cây phát sinh loài. 2.2.3. THU THẬP, NUÔI THUẦN DƯỠNG HEO RỪNG THUẦN CÓ NGUỒN GỐC TÂY NGUYÊN - VIỆT NAM THU NHẬN ĐƯỢC Quá trình thu thập và nuôi dưỡng thuần hóa được tóm tắt trong hình 2.4 Hình 2.4. Sơ đồ tóm tắt quá trình thuần hóa. Chọn lọc cá thể heo rừng để thuần dưỡng có nguồn gốc Tây Nguyên: Những heo rừng đưc̣ và cái sau khi thu nhâṇ phải đươc̣ đánh giá nguồn gốc bằng phân tích ADN. Những con đươc̣ xác điṇh là heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên se ̃ đươc̣ đánh giá về môṭ số tiêu chuẩn như ngoaị hình, tính cách... trước khi choṇ để thuần hóa và nhân thuần [24], [27]. Chọn heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên đưc̣: Choṇ những cá thể đầu thanh, mặt dài, lưng thẳng, bụng thon không sệ, 4 chân cao, thẳng và vững 39 chắc. Lông bờm dựng đứng chạy dài từ cổ tới lưng. Da không sần sùi, không thô ráp. Choṇ những cá thể không quá nhát hoăc̣ không quá hung dữ. Hai tinh hoàn lộ rõ, to và cân đối, độ đàn hồi tốt, tính đưc̣ cao (Hình 2.5). Chọn heo rừng thuần có nguồn gốc Tây Nguyên cái: Khi chọn lọc cá thể heo cái sinh sản phải không có khuyết tật, nếu có sẽ ảnh hưởng tới khả năng sinh sản và nuôi con. Cần quan tâm tới 3 bộ phận: cơ quan sinh dục, vú và khung xương. Heo cái hâụ bị phải choṇ những cá thể có cơ quan sinh dục phát triển bình thường cả về hình thể và hoạt động. Heo cái phải có số vú đủ để nuôi đàn con đông. Heo rừng cái có 5 đôi vú xếp đồng đều mỗi bên, có khung xương và 4 chân chắc, khoẻ, nhanh nhẹn và linh hoạt se ̃đươc̣ choṇ (Hình 2.5). Hình 2.5. Heo rừng thuần nguồn gốc Tây Nguyên. A: Heo rừng đực. B: Heo rừ...2 vs. Col 3 33.575 10.736 <0.001 0.025 Yes Col 1 vs. Col 2 9.431 3.016 0.015 0.050 Yes H. Chiều dài răng nghiền trên One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Passed (P = 0.645) Equal Variance Test: Failed (P < 0.050) Test execution ended by user request, ANOVA on Ranks begun Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks Data source: Data 1 in Notebook2 Group N Missing Median 25% 75% Col 1 5 0 71.552 66.624 86.335 Col 2 2 0 59.754 58.801 60.706 Col 3 5 0 40.290 39.512 44.815 H = 9.423 with 2 degrees of freedom. P(est.)= 0.009 P(exact)= <0.001 The differences in the median values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001) To isolate the group or groups that differ from the others use a multiple comparison procedure. PL-46 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Dunn's Method) : Comparison Diff of Ranks Q P<0.05 Col 1 vs Col 3 7.000 3.070 Yes Col 1 vs Col 2 3.500 1.160 No Col 2 vs Col 3 3.500 1.160 No Note: The multiple comparisons on ranks do not include an adjustment for ties. I. Bề ngang post-orbital One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Passed (P = 0.874) Equal Variance Test: Passed (P = 0.237) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 5 0 33.990 6.469 2.893 Col 2 2 0 30.010 1.598 1.130 Col 3 5 0 41.098 7.959 3.559 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 2 220.902 110.451 2.348 0.151 Residual 9 423.322 47.036 Total 11 644.224 The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0.151). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.215 The power of the performed test (0.215) is below the desired power of 0.800. Less than desired power indicates you are less likely to detect a difference when one actually exists. Negative results should be interpreted cautiously. J. Chiều rộng ngang qua post-orbital One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Passed (P = 0.064) Equal Variance Test: Passed (P = 0.501) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 5 0 94.894 3.637 1.627 Col 2 2 0 93.434 2.389 1.689 Col 3 5 0 93.864 2.265 1.013 PL-47 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 2 4.144 2.072 0.236 0.795 Residual 9 79.132 8.792 Total 11 83.276 The differences in the mean values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0.795). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.050 The power of the performed test (0.050) is below the desired power of 0.800. Less than desired power indicates you are less likely to detect a difference when one actually exists. Negative results should be interpreted cautiously. L. Chiều dài mũi One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Passed (P = 0.984) Equal Variance Test: Passed (P = 0.226) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 5 0 341.010 10.754 4.809 Col 2 2 0 298.666 4.257 3.010 Col 3 5 0 220.200 9.738 4.355 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 2 37031.438 18515.719 193.760 <0.001 Residual 9 860.042 95.560 Total 11 37891.480 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means t Unadjusted P Critical Level Significant? Col 1 vs. Col 3 120.810 19.540 <0.001 0.017 Yes Col 2 vs. Col 3 78.466 9.594 <0.001 0.025 Yes Col 1 vs. Col 2 42.344 5.177 <0.001 0.050 Yes M. Chiều cao chẩm One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 PL-48 Normality Test: Passed (P = 0.875) Equal Variance Test: Passed (P = 0.245) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 5 0 103.886 2.814 1.258 Col 2 2 0 102.870 0.862 0.610 Col 3 5 0 97.200 4.423 1.978 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 2 120.781 60.391 4.912 0.036 Residual 9 110.655 12.295 Total 11 231.437 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = 0.036). Power of performed test with alpha = 0.050: 0.547 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means t Unadjusted P Critical Level Significant? Col 1 vs. Col 3 6.686 3.015 0.015 0.017 Yes Col 2 vs. Col 3 5.670 1.933 0.085 0.025 No Col 1 vs. Col 2 1.016 0.346 0.737 0.050 No N. Chiều cao hộp sọ One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Passed (P = 0.141) Equal Variance Test: Passed (P = 0.077) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 5 0 217.094 13.182 5.895 Col 2 2 0 196.444 0.251 0.178 Col 3 5 0 171.020 8.714 3.897 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 2 5316.482 2658.241 23.952 <0.001 Residual 9 998.846 110.983 Total 11 6315.328 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 PL-49 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means t Unadjusted P Critical Level Significant? Col 1 vs. Col 3 46.074 6.915 <0.001 0.017 Yes Col 2 vs. Col 3 25.424 2.884 0.018 0.025 Yes Col 1 vs. Col 2 20.650 2.343 0.044 0.050 Yes O. One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Passed (P = 0.998) Equal Variance Test: Failed (P < 0.050) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 5 0 130.068 3.578 1.600 Col 2 2 0 106.617 16.003 11.316 Col 3 5 0 89.852 5.762 2.577 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 2 4062.014 2031.007 41.536 <0.001 Residual 9 440.080 48.898 Total 11 4502.094 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means t Unadjusted P Critical Level Significant? Col 1 vs. Col 3 40.216 9.093 <0.001 0.017 Yes Col 1 vs. Col 2 23.452 4.009 0.003 0.025 Yes Col 2 vs. Col 3 16.764 2.865 0.019 0.050 Yes P. Chiều dài răng cửa trên One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook2 Normality Test: Passed (P = 0.982) Equal Variance Test: Failed (P < 0.050) Test execution ended by user request, ANOVA on Ranks begun PL-50 Kruskal-Wallis One Way Analysis of Variance on Ranks Data source: Data 1 in Notebook2 Group N Missing Median 25% 75% Col 1 5 0 40.894 40.176 42.335 Col 2 2 0 45.695 42.164 49.225 Col 3 5 0 42.810 41.508 44.435 H = 2.662 with 2 degrees of freedom. P(est.)= 0.264 P(exact)= 0.292 The differences in the median values among the treatment groups are not great enough to exclude the possibility that the difference is due to random sampling variability; there is not a statistically significant difference (P = 0.292) PL-51 Phụ lục 4. Đông lạnh tinh trùng 4.1. Ảnh hưởng của tiến trình hạ nhiệt Tổng số tinh trùng sống trong 200 tinh trùng được đếm Nghiệm thức nt1 nt2 nt3 nt4 nt5 nt6 Lần 1 46 63 48 74 71 82 Lần 2 49 59 50 78 72 80 Lần 3 47 62 50 75 69 82 One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Passed (P = 0.471) Equal Variance Test: Passed (P = 0.926) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 3 0 23.667 0.764 0.441 Col 2 3 0 30.667 1.041 0.601 Col 3 3 0 24.667 0.577 0.333 Col 4 3 0 37.833 1.041 0.601 Col 5 3 0 35.333 0.764 0.441 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 4 473.600 118.400 161.455 <0.001 Residual 10 7.333 0.733 Total 14 480.933 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means t Unadjusted P Critical Level Significant? Col 4 vs. Col 1 14.167 20.261 <0.001 0.005 Yes Col 4 vs. Col 3 13.167 18.831 <0.001 0.006 Yes Col 5 vs. Col 1 11.667 16.686 <0.001 0.006 Yes Col 5 vs. Col 3 10.667 15.255 <0.001 0.007 Yes Col 4 vs. Col 2 7.167 10.250 <0.001 0.009 Yes Col 2 vs. Col 1 7.000 10.011 <0.001 0.010 Yes Col 2 vs. Col 3 6.000 8.581 <0.001 0.013 Yes Col 5 vs. Col 2 4.667 6.674 <0.001 0.017 Yes Col 4 vs. Col 5 2.500 3.575 0.005 0.025 Yes Col 3 vs. Col 1 1.000 1.430 0.183 0.050 No PL-52 4.2. Ảnh hưởng của nồng độ glycerol Tổng số tinh trùng sống trong 200 tinh trùng được đếm 5 10 15 20 S C S C S C S C Lần 1 26 174 25 175 50 150 38 162 Lần 2 30 170 28 172 47 153 42 158 Lần 3 26 174 25 175 54 146 39 161 S: sống, C: chết One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Passed (P = 0.155) Equal Variance Test: Passed (P = 0.741) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 3 0 13.603 1.005 0.580 Col 2 3 0 12.899 0.811 0.468 Col 3 3 0 25.142 1.616 0.933 Col 4 3 0 19.687 1.014 0.586 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 3 297.317 99.106 74.691 <0.001 Residual 8 10.615 1.327 Total 11 307.932 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: Comparison Diff of Means t Unadjusted P Critical Level Significant? Col 3 vs. Col 2 12.243 13.018 <0.001 0.009 Yes Col 3 vs. Col 1 11.539 12.269 <0.001 0.010 Yes Col 4 vs. Col 2 6.789 7.218 <0.001 0.013 Yes Col 4 vs. Col 1 6.085 6.470 <0.001 0.017 Yes Col 3 vs. Col 4 5.455 5.800 <0.001 0.025 Yes Col 1 vs. Col 2 0.704 0.749 0.476 0.050 No PL-53 Phụ lục 5: Trọng lượng heo con sơ sinh trong quá trình thuần hóa Cá thể heo Nhóm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Heo rừng tự nhiên 688 741 693 685 713 712 715 659 687 707 Heo rừng nuôi 500 550 600 530 550 560 540 570 Lai Thái Lan 598 614 603 595 605 597 602 600 586 Bản địa RagLey 390 400 390 398 392 395 400 Bản địa Lang Hanh (LĐ) 405 415 418 402 413 407 407 413 420 400 415 405 Heo Bản địa Đạ Oai (LĐ) 409 416 420 415 431 420 425 424 Heo rừng tự nhiên Heo rừng nuôi Lai Thái Lan Bản địa RagLey Bản địa Lang Hanh (LĐ) Heo Bản địa Đạ Oai (LĐ) Mean 700.0000 550.0000 600.0000 395.0000 410.0000 420.0000 SE 7.0993 10.3510 2.5495 1.6762 1.8749 2.4054 One Way Analysis of Variance Data source: Data 1 in Notebook1 Normality Test: Failed (P < 0.050) Equal Variance Test: Failed (P < 0.050) Group Name N Missing Mean Std Dev SEM Col 1 10 0 700.000 22.450 7.099 Col 2 8 0 550.000 29.277 10.351 Col 3 9 0 600.000 7.649 2.550 Col 4 7 0 395.000 4.435 1.676 Col 5 12 0 410.000 6.495 1.875 Col 6 8 0 420.000 6.803 2.405 Source of Variation DF SS MS F P Between Groups 5 722352.315 144470.463 582.249 <0.001 Residual 48 11910.000 248.125 Total 53 734262.315 The differences in the mean values among the treatment groups are greater than would be expected by chance; there is a statistically significant difference (P = <0.001). Power of performed test with alpha = 0.050: 1.000 All Pairwise Multiple Comparison Procedures (Holm-Sidak method): Overall significance level = 0.05 Comparisons for factor: PL-54 Comparison Diff of Means t Unadjusted P Critical Level Significant? Col 1 vs. Col 5 290.000 42.997 <0.001 0.003 Yes Col 1 vs. Col 4 305.000 39.291 <0.001 0.004 Yes Col 1 vs. Col 6 280.000 37.474 <0.001 0.004 Yes Col 3 vs. Col 5 190.000 27.354 <0.001 0.004 Yes Col 3 vs. Col 4 205.000 25.824 <0.001 0.005 Yes Col 3 vs. Col 6 180.000 23.517 <0.001 0.005 Yes Col 1 vs. Col 2 150.000 20.075 <0.001 0.006 Yes Col 2 vs. Col 5 140.000 19.472 <0.001 0.006 Yes Col 2 vs. Col 4 155.000 19.013 <0.001 0.007 Yes Col 2 vs. Col 6 130.000 16.506 <0.001 0.009 Yes Col 1 vs. Col 3 100.000 13.817 <0.001 0.010 Yes Col 3 vs. Col 2 50.000 6.532 <0.001 0.013 Yes Col 6 vs. Col 4 25.000 3.067 0.004 0.017 Yes Col 5 vs. Col 4 15.000 2.002 0.051 0.025 No Col 6 vs. Col 5 10.000 1.391 0.171 0.050 No Phụ lục 6: Một số bệnh thường gặp ở heo rừng trong quá trình thuần hóa Heo rừng là động vật hoang dã mới được thuần hóa, vấn đề sức đề kháng vẫn đang còn nhiều bàn cãi. Heo rừng có thể mắc một số bệnh truyền nhiễm như bệnh rối loạn hô hấp sinh sản, bệnh tiêu chảy, bệnh viêm phổi, bệnh tụ huyết trùng . Heo rừng cũng thường bị một số bệnh như dịch tả, tiêu chảy, tụ huyết trùng, lở mồm long móng, bệnh sán lá, bệnh ghẻ lở và một số bệnh thông thường khác. Chấn thương cơ học: Chấn thương là bệnh thường xuyên gặp khi heo rừng mới được mua về từ người dân. Nếu vết thương nhỏ thì rửa sạch và bôi thuốc sát trùng. Nếu chấn thương lớn thì rửa sạch, sát trùng trước và sau khi khâu, chích kháng sinh tổng hợp như Ampicyline, Tetracyline hoặc hỗn hơp̣ Peniciline + Streptomycine... Da heo rừng có khả năng tái sinh nhanh nên chóng lành. Trong thời gian đầu heo rừng rất nhát và rất hung dữ khi tiếp xúc với người nên rất khó bôi vết thương vì vậy cần nghiên cứu các dụng cụ xịt gián tiếp để xịt thuốc, thuốc sát trùng, nước muối vào vết thương. Trường hợp bị hoại tử nặng có thể phẩu thuật cắt bỏ phần cơ quan bị hoại tử. Nếu vết thương hở, có giòi và mủ thì hàng ngày xiṭ nước muối 1 - 2% nhiều lần vào vết thương, buổi chiều tối nên xiṭ dung dic̣h cồn I - ốt 10% và để khô đến sáng hôm sau. PL-55 Viêm phổi, ho: Đây cũng là một bệnh khá phổ biến đối với heo rừng trong giai đoạn thuần hóa. Nguyên nhân trước hết là do heo bị stress, sau đó có thể do mycoplasma gây ra và được gọi là viêm phổi địa phương. Heo bị sưng phổi thường sốt cao, biếng ăn, bỏ ăn. Điều trị sưng phổi bằng kháng sinh tổng hợp. Bệnh thường phát triển rất chậm trên nền của viêm phế quản phổi và thông thường có 2 thể biểu hiện: á cấp tính và mãn tính. Triệu chứng: Ở thể á cấp tính heo bệnh sốt nhẹ 40 - 41oC, bắt đầu từ những hắt hơi chảy nước mũi, sau đó chuyển thành dịch nhầy, heo thở khó, ho nhiều, sốt ngắt quãng, ăn kém. Lúc đầu ho khan từng tiếng, ho chủ yếu về đêm, sau đó chuyển thành cơn, ho ướt nghe rõ nhất là vào sáng sớm đặc biệt là các buổi khi thời tiết thay đổi nhanh từ nóng sang lạnh. Vì phổi bị tổn thương nên heo thở thể ngực phải chuyển sang thở thể bụng. Rõ nhất là sau khi bị xua đuổi, có những con mệt quá thở không được và lăn đùng ra chết. Nếu không điều trị heo bệnh sẽ chết sau 7- 20 ngày. Ở thể mãn tính heo bị bệnh ho liên tục, ho thành từng đợt và bệnh kéo dài gây cảm giác rất khó chịu. Heo bệnh vẫn ăn uống bình thường nhưng chậm lớn, còi cọc, da xù, lông cứng, xương sườn nhô lên. Cả hai thể dưới cấp và thể mãn tính đều có tiên lượng xấu đi do heo bị bệnh dẫn đến còi cọc, chậm lớn, chi phí thức ăn thuốc men tăng. Điều trị: Dùng các loại kháng sinh đặc trị viêm phổi như Tiamulin, Gentatylo, Biosone Táo bón: Heo bị bệnh táo bón thường có thể do rất nhiều nguyên nhân như thức ăn, bệnh truyền nhiễm, stress Đối với heo rừng giai đoạn đầu thuần hóa thì nguyên nhân chính là do thay đổi thức ăn khác với thức ăn tự nhiên heo rừng tự tìm kiếm và do mới bị bắt về nên heo có thể bị stress. PL-56 Triệu chứng: Heo có biểu hiện khó chịu, ỉa không được, phải rặn nhiều và lưng cong khi rặn, phân ra không thành khuân mà chỉ lổn nhổn, rắn, đôi khi có lẫn những màng trắng, lẫn máu phủ trên bề mặt của phân. Lợn kém ăn, thân nhiệt tăng lên và cũng có thể làm sức khỏe kém đi dẫn đến heo có thể bị một số bệnh thứ phát đi kèm theo. Bệnh tích: Ruột già và một phần ruột non chứa phân cục cứng, màu sẫm, thành ruột sung huyết nặng, khô, không trơn. Các hạch ruột, màng treo ruột to hơn bình thường. Nước tiểu trong bàng quang sẫm màu và có mùi hôi. Điều trị: Cần tăng cường rau xanh, cho heo uống nước sạch đầy đủ, giai đoạn đầu nên cho thêm chất điện giải và vitamin C. Giảm thức ăn tinh và đạm. Cho heo ăn các loại thức ăn nhuận trường như khoai lang, chuối chín, rau xanh Nếu bị nặng không ỉa được thì thụt rửa hậu môn bằng nước sạch, nước muối loãng, nước xà phòng ấm. Tiêm Pilocarpin: 0,5-5ml/con, cho uống hoặc tiêm Mg sulfate theo chỉ dẫn. Ký sinh trùng (ruôṭ, phổi, ngoài da) Với điều kiêṇ sống hoang da ̃thì viêc̣ bi ̣nhiêm̃ các loaị ký sinh trùng của heo rừng Tây Nguyên thu nhâṇ trong tư ̣nhiên là le ̃đương nhiên. Ve, mò, ghẻ, ruồi muỗi... bám trên da hút máu và truyền bệnh ít khi xảy ra. Do đặc tính hoang dã nên heo rừng không sợ muỗi hay côn trùng khác tấn công. Tuy nhiên, khi heo bị bệnh ký sinh trùng ngoài da, ta có thể dùng thuốc sát trùng bôi hay xịt đều có tác dụng tốt. Để phòng bệnh ký sinh trùng ngoài da, ta nên định kỳ vệ sinh sát trùng chuồng trại và môi trường xung quanh sạch sẽ. Heo bị nhiễm ký sinh trùng đường ruột, đường phổi thường còi cọc, chậm lớn, trong phân hoăc̣ trong dic̣h khi ho có ấu trùng giun, sán. Cần thiết phải tẩy sán lãi cho heo sau khi thu nhâṇ khoảng 5 - 7 ngày. PL-57 Hiǹh 6.1. Phổi heo bi ̣ nhiêm̃ giun phổi năṇg Bệnh ỉa chảy ở heo: Bệnh ỉa chảy ở heo thường có thể do rất nhiều nguyên nhân gây ra và mỗi nguyên nhân thì phải có một hướng điều trị riêng. Khi heo rừng mắc một số bệnh về đường tiêu hoá cần phải tìm rõ nguyên nhân để điều trị cho phù hợp. Có trường hợp do hoảng loạn thì chỉ cần tạo điều kiện yên tĩnh, thoáng mát cho heo con. Trường hợp bị rối loạn thức ăn thì cần điều chỉnh thức ăn cho phù hợp. Trường hợp do nhiễm khuẩn thì phải sử dụng kháng sinh để tiêm hoặc cho uống. Trường hợp do virus gây ra thì phải phòng là chính, điều trị chỉ là hướng làm giảm sự tác động không tốt do ỉa chảy gây ra. Một số bệnh truyền nhiễm như phó thương hàn, dịch tả đều có thể gây ra hiện tượng ỉa chảy nhưng đó là ảnh hưởng gián tiếp. Các bệnh về đường tiêu hoá như sình bụng, đầy hơi, đau bụng, tiêu chảy, ngộ độc thức ăn... cũng gây ỉa chảy. Một số bệnh trực tiếp gây ỉa chảy: Viêm ruột hoại tử:Thường xảy ra chủ yếu ở heo sơ sinh đến 2 tháng tuổi. Tác nhân gây bệnh: Do Clostridium perfringens type C gây ra bệnh viêm ruột hoại tử. Clostridium perfringens thường hiện diện ở các cơ quan tiêu hóa của tất cả các heo con trước khi cai sữa. Nếu chăm sóc nuôi dưỡng không tốt, yếu tố ngoại cảnh xấu, sức đề kháng yếu thì heo con dễ phát bệnh. Triệu chứng: PL-58 Heo con bị bệnh viêm ruột hoại tử thường có biểu hiện viêm ruột chảy máu. Heo bệnh dễ bị chết rất nhanh và tỷ lệ chết cao. - Ở thể quá cấp tính: xảy ra rất nhanh trong vòng 8 giờ đầu tiên sau khi sinh, heo con trở nên yếu ớt dần dần rồi chết. Thường không biểu hiện triệu chứng gì bên ngoài, có khi thấy tiêu chảy ra máu. - Ở thể cấp tính: thường thấy trên heo con khoảng 2-5 ngày tuổi. Dấu hiệu đầu tiên là chết bất thình lình và kèm theo ỉa chảy ra máu, bệnh xảy ra rất nhanh heo chết sau khi tiêu chảy ra máu. - Ở thể bán cấp tính: heo con đi ỉa phân thường có màu nâu đỏ có chứa những mảng hoại tử, heo trở nên yếu dần rồi chết sau 2-3 ngày mắc bệnh. Điều trị: Tiêm kháng sinh trong vòng 3 – 5 ngày (các loại chuyên dùng trị ỉa chảy do viêm ruột). Tiêm Vitamin K để chống xuất huyết. Bổ sung thêm các loại vitamin, vi khoáng, acid amin để tăng sức đề kháng. Do heo con mới sinh nên việc dùng thuốc kháng sinh không phải dễ và thường để lại di chứng sau này nên việc chăm sóc nuôi dưỡng heo nái giai đoạn mang thai và sau khi đẻ tốt là rất cần thiết để giảm nguy cơ mắc bệnh cho heo con. Vệ sinh chuồng trại và sát trùng sạch sẽ kỹ lưỡng định kỳ 1 tuần 2 lần. Hồng lỵ: Tác nhân gây bệnh: Do Serpulina hyodysenteriae (Hay là Treponema hyodysenteriae) gây bệnh hồng lỵ. Xoắn khuẩn xâm nhập chủ yếu qua đường tiêu hóa. Mầm bệnh bài thải qua phân. Điều kiện chăn nuôi kém, sức đề kháng giảm làm cho heo dễ mắc bệnh và thường lây lan do nhốt chung với heo bị bệnh hồng lỵ. Triệu chứng: Bệnh thường xảy ra vào khoảng thời gian khí hậu trở nên lạnh và có mưa trong năm đối với heo 2-6 tháng tuổi. Bệnh hồng lỵ có tính lây mạnh ở heo con sau cai sữa và heo trưởng thành. Tiêu chảy phân lẫn máu và nhầy. Phân heo lẫn máu thải ra trên nền chuồng. - Thể cấp tính: Heo có biểu hiện đau vùng bụng, lưng còng lên, đỏ nhẹ ở da và bỏ ăn. Phân có nhiều chất nhầy, máu và nhiều cục hoại tử trong phân. PL-59 - Thể mãn tính: Thân nhiệt của heo giảm, xuất hiện tiêu chảy mạnh, phân tanh, gầy yếu dần rồi chết. Điều trị: Dùng các loại kháng sinh như Biosone, Tiamulin10%, Tylosin10% kết hợp với Flordoxin. Kết hợp tiêm Vitamin K chống xuất huyết và sử dụng thêm 1 số sản phẩm sau để tăng sức kháng bệnh, mau hồi phục như Bcomplex, vi khoáng tổng hợp, acid amin. Vệ sinh chuồng trại sạch sẽ tránh lây lan bệnh, cho heo ăn chế độ thức ăn hợp lý, không thay đổi thức ăn đột ngột. Khi mới mua heo về phải cách ly và kiểm tra theo dõi 15 ngày trước khi nhập chung đàn hoặc chung khu. Chú ý: Trong tất cả các trường hợp nếu heo bị ỉa chảy nặng cần phải cho heo rừng con uống nước có chất điện giải (pha theo tỷ lệ quy định). Nếu heo bị ỉa chảy nặng có thể cho uống Berberin hàng ngày hoặc tiêm các loại kháng sinh đặc hiệu tiêu chảy. Khi heo rừng mắc một số bệnh về đường tiêu hoá có thể dùng các loại thuốc trị đau bụng, sình bụng, đầy hơi, khó tiêu cho uống hay chích hoặc có thể bổ sung thức ăn, nước uống có tính đắng, chát như ổi xanh, cà rốt, rễ cau, rễ dừa. Để phòng bệnh, thức ăn phải đảm bảo vệ sinh, đầy đủ dinh dưỡng và không nên sử dụng các loại thức ăn hôi thối, ẩm mốc... PL-60 Bệnh còi cọc heo con sau cai sữa Bệnh còi cọc heo con là một bệnh do Porcine Circoviral Virus type 2 (PCV2) thuộc họ Circoviridae gây ra là một bệnh đáng ngại nhất trong chăn nuôi heo rừng thuần, thường tập trung ở heo từ 6 - 16 tuần tuổi, ngay cả thời kỳ đang bú sữa mẹ. Virus này có sức đề kháng cao với các loại thuốc sát trùng thông thường. Bệnh truyền chủ yếu từ heo bệnh sang heo khỏe qua phân, qua tiếp xúc trực tiếp Khi heo bị virus xâm nhập vào thì trong những ngày đầu virus có thể sinh sản không kiểm soát là hủy hệ thống miễn dịch của heo con và từ đó dễ bị nhiễm các loại bệnh khác. Bệnh để lại hậu quả rất lớn là tỷ lệ hao hụt của đàn heo rất cao, sức sống và tốc độ phát triển của những con còn sống cũng rất kém. Đặc biệt nguy hiểm là khi đàn heo bị bệnh còi cọc sẽ rất dễ bị kết hợp với các bệnh khác như: Rối loạn hô hấp sinh sản, lở mồm long móng, ỉa phân trắng Triệu chứng: Bệnh thường có quá trình tiến triển chậm. Tỷ lệ heo chết trên số heo bị bệnh khá cao. Heo bị bệnh kém vận động, gầy, giảm cân, lông khô, da xanh đôi khi trở nên vàng. Bệnh còi cọc thường đi kèm them các bệnh khác, đặc biệt tiêu chảy (30%), viêm phổi, thần kinh. Bệnh biểu hiện qua viêm vành tai, viêm da phía sau đùi, nặng hơn viêm da toàn thân (giống triệu chứng viêm da tiết dịch do nhiễm Stanphylococcus) bệnh có thể kéo dài nhiều tháng trong đàn, từ nhóm này sang nhóm khác. điều trị hiệu quả không cao. Phòng bệnh: Vệ sinh, tiêu độc sát trùng chuồng trại bằng các thuốc sát trùng như: Virkon, GPC*8, TH4... Tăng cường sức đề kháng cho toàn đàn Bằng các loại Vitamin, chế phẩm sinh học như: Multivitamin, Vitamin C, Beta-Glucan, Nano-Glucan... Định kì trộn kháng sinh để giảm mật độ vi khuẩn trong cơ thể heo. Điều trị theo triệu chứng bệnh phát sinh kèm theo. PL-61 Cần phải sát trùng chuồng trại sạch sẽ và nên tiêm vaccin Circovac (Pháp) cho heo mẹ trước khi đẻ 3 tuần, nhắc lại sau 2 tuần hoặc tiêm Circumvent PCV vaccine (Hà Lan) cho heo con sau 3 tuần, lặp lại sau 2 - 3 tuần. Bệnh tiến triển chậm, tỷ lệ chết rất cao nếu chăm sóc không đúng cách. Heo bị bệnh này thường hay bị tiêu chảy khó ngưng, thở khó, thân hình còi cọc, một số con gia đoạn cuối có triệu chứng thần kinh. Điều trị bệnh: Bệnh còi coc̣ heo con hiện nay chưa có thuốc trị đặc hiệu, chủ yếu tăng sức đề kháng bằng hình thức tăng cường dinh dưỡng, chuồng trại thoáng mát, vệ sinh tiêu độc sát trùng hàng ngày. Hiǹh 6.2. Heo 2,5 tháng tuổi bi ̣ chết do bêṇh còi coc̣ PL-62 Hôị chứng rối loaṇ hô hấp sinh sản (PRRS) Bêṇh Porcine reproductive and respiratory syndromedo một số virus thuộc họ Togaviridae, virus bị diệt dưới ánh nắng mặt trời, ở nhiệt độ 65oC. Các thuốc sát trùng thông thường đều diệt được Virus. Heo nái rừng Tây Nguyên thuần trong giai đoaṇ đầu thuần và nuôi nhốt rất dê ̃bi ̣ nhiêm̃ bêṇh PRRS. Triệu chứng: Khi heo nái bi ̣ bêṇh thường có biểu hiện như: viêm tử cung, âm đạo, chảy dịch; giảm tỷ lệ thụ thai khi phối giống; bi ̣ sẩy thai; thai chết lưu. Heo con theo mẹ và sau cai sữa biểu hiện như ho, thở khó, chảy dịch mũi do viêm phổi; tai xanh tái do tụ huyết, xuất huyết kéo dài; heo rất dê ̃chết do suy hô hấp, kiệt sức. Giai đoạn hậu bị heo cái thường chậm lên giống, tỉ lệ đậu thai rất thấp, giai đoạn mang thai hay bị thai khô, chết thai, sẩy thai, có thể đến 50% toàn đàn có hiện tượng khô chết thai hoặc sẩy thai. Sau khi sẩy thai, nái bị suy nhược, gầy ốm. Một số heo nái có biểu hiện khó thở, sốt, kém ăn rồi sẩy thai. Khi chết thường tím bầm ở vành tai heo nái. Heo con mới sinh yếu ớt, tỷ lệ chết cao trong giai đoạn theo mẹ. Nhiễm bệnh giai đoạn sau khi sinh do tiếp xúc với heo bệnh hoặc heo bài trùng (không có kháng thể mẹ truyền), hoặc kháng thể mẹ truyền thấp thì bệnh rất nặng và tỉ lệ chết cao. Heo con từ heo mẹ nhiễm bệnh, nếu kháng thể mẹ truyền cao, bệnh xuất hiện với thể viêm phổi nhẹ, tỉ lệ chết thấp. Phòng bệnh: Bổ sung các loại vitamin, acid amin để tăng sức đề kháng bệnh. Vaccine không ngăn ngừa được sự nhiễm bệnh, chỉ giúp giảm mức độ trầm trọng của bệnh. Trại có heo nhiễm bệnh, vaccin có tác dụng giảm tỉ lệ khô chết thai, giảm tỉ lệ heo con chết giai đoạn theo mẹ thông qua việc nâng cao hàm lượng kháng thể trong máu heo nái và kháng thể mẹ truyền cho heo con. Quy trình tiêm phòng: Heo nái nhiễm bệnh và nái chưa nhiễm bệnh đều có thể tiêm vaccine. Không tiêm cho heo nái đang mang thai và heo con mới sinh PL-63 tháng đầu. Heo hậu bị tiêm phòng trước khi phối giống 3 tuần. Heo nái tiêm phòng mỗi lứa tiêm 1 lần sau khi đẻ 1 tuần. Heo nọc tiêm phòng 6 tháng 1 lần. Điều trị bệnh: Hiêṇ nay chưa có thuốc điều tri ̣ đăc̣ hiêụ. Công viêc̣ quan troṇg nhất là phòng ngừa bằng cách tiêm ngừa vaccine cho tất cả các heo trong chuồng nuôi theo hướng dẫn của các hãng sản xuất vaccin. Chăm sóc và nuôi dưỡng tốt để nâng cao sức đề kháng của heo me ̣và heo con, đặc biệt vào thời điểm thời tiết nắng nóng, chuyển mùa từ mùa khô sang mùa mưa. Thường xuyên vệ sinh chuồng trại sạch sẽ bằng các chất sát trùng. Cần lập tức cách ly heo bi ̣ bêṇh và xác định bệnh để kịp thời điều trị triệu chứng và chủ yếu ngăn ngừa nhiễm bệnh kế phát. Hiǹh 6.3. Heo bi ̣ sẩy thai do heo me ̣nhiêm̃ bêṇh Rối loaṇ hô hấp sinh sản PL-64 Bêṇh heo con ỉa phân trắng Heo con ỉa phân trắng là bêṇh thường găp̣ đối với heo con tất cả các giống heo và gây thiêṭ haị lớn cho ngành chăn nuôi heo. Heo con bi ̣ bêṇh từ bắt đầu 4 ngày tuổi trở đi, chúng thường thể hiêṇ ỉa phân có màu trắng, ban đầu phân màu trắng có khuôn sau đó chuyển dần sang phân lỏng màu trắng và khi bêṇh năṇg thì heo con rất dê ̃bi ̣ chết. Heo con bị bệnh kém bú, trạng thái ủ rũ, đi đứng xiêu vẹo, ỉa phân màu trắng, da khô nhăn nheo, đầu to bụng hóp, gầy sút rất nhanh, hậu môn thường dính bết phân. Màu phân lúc đầu trắng sữa, có khuôn sau đó chuyển sang trắng đục, loãng, có mùi tanh khó chịu. Nguyên nhân có thể do chuồng traị ẩm ướt, bẩn; có thể do thay đổi thời tiết; có thể do heo me ̣ăn không đủ chất dinh dưỡng. Phòng bệnh - Yếu tố nhiệt độ rất quan trọng vì vậy ngay khi heo mẹ đẻ ra cần cho heo con chất độn chuồng để heo rúc vào, giữ chuồng khô ráo, thoáng mát. - Chăm sóc, nuôi dưỡng heo mẹ tốt để có sữa đầu nhiều và tốt cho heo con bú. Cần chú ý khâu thức ăn cho mẹ phải tốt cả về số lượng và chất lượng, không nên thay đổi thức ăn của heo mẹ trong quá trình đang cho heo con bú sữa. - Tập cho heo con ăn sớm với thức ăn có chất lượng cao, bổ sung khoáng và vitamin đầy đủ - Tiêm sắt cho heo con ngày thứ 5 – 7 sau khi sinh và sau 3 tuần nhắc lại. - Tiêm phòng bằng vắc xin cho heo mẹ 1 tháng trước khi đẻ và lăp̣ laị sau 15 - 20 ngày sau, cho heo con sau khi sinh 2 tuần. Điều trị bệnh Dùng các thuốc đặc trị tiêu chảy, kết hợp với các loại chất điện giải để chống mất nước, tăng cường sức đề kháng cho heo con ...