Luận án Nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục ulva lactuca và ulva reticulata

NH SINH HỌC TỪ RONG LỤC ULVA LACTUCA VÀ ULVA RETICULATA Chuyên ngành: Hóa lý thuyết và Hóa lý Mã sỗ: 62.44.01.19 LUẬN ÁN TIẾN SỸ HÓA HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS Thành Thị Thu Thủy 2. PGS.TS Trần Thị Thanh Vân Hà Nội - 2017 i LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu khoa học của riêng tôi dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Thành Thị Thu Thủy và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân. Các số liệu, kết quả nêu trong luận án là trung thực và chưa từng được công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tác giả luận án Quách Thị Minh Thu ii LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới tập thể cán bộ hướng dẫn khoa học PGS.TS Thành Thị Thu Thủy - Viện Hóa học và PGS.TS Trần Thị Thanh Vân – Viện Nghiên cứu và Ứng dụng công nghệ Nha Trang - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Hai PGS là những người Thầy đã chia sẻ kinh nghiệm, hướng dẫn tôi cách tiếp cận với lĩnh vực khoa học chuyên sâu mà tôi đang theo đuổi, cũng như các vấn đề khác trong cuộc sống trong suốt thời gian thực hiện luận án. Đặc biệt, tôi xin cảm ơn Trung tâm Các phương pháp phổ ứng dụng - Viện Hóa học - Viện Hàn lâm Khoa Học và Công nghệ Việt Nam đã tạo mọi điều kiện tốt nhất về thời gian cũng như trang thiết bị nghiên cứu để tôi có thể hoàn thành luận án của mình. Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Yuguchi Yoshiaki– Trường Đại học Điện -Truyền thông Osaka đã giúp thực hiện phép đo SAXS và tạo mọi điều kiện thuận lợi để tôi có thể hoàn thành công việc trong thời gian thực tập tại Nhật Bản. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn Ban Lãnh đạo Viện Hóa học, các anh chị phụ trách Đào tạo sau Đại học - Viện Hóa học và Học viện Khoa học và Công nghệ đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp tôi hoàn thành các học phần của luận án và mọi thủ tục cần thiết. Cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và những người thân luôn giúp đỡ, động viên tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. TÁC GIẢ LUẬN ÁN Quách Thị Minh Thu iii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ........................................................................................... i LỜI CẢM ƠN ................................................................................................ ii MỤC LỤC .................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................ vi DANH MỤC HÌNH .................................................................................... viii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................... x MỞ ĐẦU ....................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN .......................................................................... 3 1.1. Rong biển và sulfate polysaccharide từ rong biển ............................... 3 1.1.1. Phân loài rong biển ............................................................................ 3 1.1.2. Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển ........................... 6 1.1.3. Sulfate polysaccharide từ rong biển ................................................... 7 1.1.3.1. Sulfate polysaccharide từ rong nâu ............................................... 7 1.1.3.2. Sulfate polysaccharide từ rong đỏ ................................................. 8 1.1.3.3. Sulfate polysaccharide từ rong lục ................................................ 9 1.1.4. Rong lục chi Ulva và ulvan ............................................................ 12 1.1.4.1. Rong lục chi Ulva ....................................................................... 12 1.1.4.2. Thành phần và cấu trúc hóa học của ulvan .................................. 12 1.1.4.3. Các tính chất hóa lý của ulvan .................................................... 16 1.1.4.4. Hoạt tính sinh học và ứng dụng của ulvan .................................. 18 1.2. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide ...................... 22 1.2.1. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC ........................................... 22 1.2.2. Phương pháp phổ hồng ngoại IR ...................................................... 22 1.2.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR ........................... 23 1.2.4. Phương pháp phổ khối lượng MS ..................................................... 27 1.2.5. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS ......................................... 28 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án. ................................................................. 30 iv 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ..................................................... 30 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới ................................................... 32 CHƯƠNG 2. THỰC NGHIỆM .................................................................... 38 2.1. Chuẩn bị mẫu nghiên cứu ................................................................ 38 2.1.2. Phân tích thành phần hóa học của rong ............................................ 39 2.1.3. Chiết tách và tinh chế ulvan ............................................................. 42 2.1.4. Đánh giá hoạt tính sinh học .............................................................. 44 2.2. Xác định cấu trúc của ulvan ............................................................. 47 2.2.1. Phân tích thành phần hóa học của ulvan ........................................... 47 2.2.2. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel (GPC) ........................................ 48 2.2.3. Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ................................................... 48 2.2.4. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) ........................... 48 2.2.5. Phương pháp phổ khối lượng (MS) .................................................. 49 2.2.6. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS) ...................................... 49 2.2.7. Phương pháp hiển vi điện tử quét (SEM) ......................................... 49 2.3. Sulfate hóa và acetyl hóa mẫu ulvan tự nhiên ................................... 49 2.3.1. Sulfate hóa ....................................................................................... 49 2.3.2. Acetyl hóa ........................................................................................ 50 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ................................................ 52 3.1. Lựa chọn mẫu nghiên cứu ................................................................ 52 3.1.1. Kết quả xác định thành phần hóa học của ulvan ............................... 52 3.1.2. Kết quả khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan .................................. 53 3.2. Xác định cấu trúc của ulvan ............................................................. 58 3.2.1. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata (UR-H) ........................ 58 3.2.2. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata (UR-N) ....................... 67 3.2.3. Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca (UL-N) ........................... 82 3.2.4. Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca (UL-H) ............................ 92 3.3. Khảo sát ảnh hưởng của sự sulfate hóa và acetyl hóa đến hoạt tính sinh học của ulvan ....................................................................................... 101 v 3.3.1. Ảnh hưởng của sự sulfate hóa ........................................................ 101 3.3.2. Ảnh hưởng của sự acetyl hóa ......................................................... 106 KẾT LUẬN CHUNG ................................................................................. 108 KIẾN NGHỊ ............................................................................................... 110 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ ................................... 111 TÀI LIỆU THAM KHẢO .......................................................................... 113 PHỤ LỤC .................................................................................................. 131 vi DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Kí hiệu Tiếng Anh Diễn giải 13C- NMR Carbon-13 nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C 1H- NMR Proton nuclear magnetic resonance spectroscopy Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H AOAC Association of Official Analytical Chemist Hiệp hội hóa học phân tích COSY Correlation spectroscopy Phổ tương tác 2 chiều đồng hạt nhân 1H-1H CS% Cell survival % % tế bào sống sót DA Degree of Acetyl Mức độ acetyl hóa DPPH 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl DS Degree of Sulfation Mức độ sulfate hóa ESI -MS Electron spray ionization mass spectrometry Phổ khối lượng ion hóa phun mù điện Gal Galactose Galactose GlcA Glucuronic acid Glucuronic acid GPC Gel Permeation Chromatography Sắc ký thẩm thấu gel HeLa Henrietta lacks Dòng tế bào ung thư cổ tử cung Hep-G2 Human hepatocellular carcinoma Dòng tế bào ung thư gan người HMBC Heteronuclear mutiple bond connectivity Phổ tương tác dị hạt nhân qua nhiều liên kết HSQC Heteronuclear single-quantum coherence Phổ tương tác dị hạt nhân qua 1 liên kết IC50 Inhibitory concentration at 50% Nồng độ ức chế 50% đối tượng thử nghiệm IdoA Iduronic acid Iduronic acid IR Infrared spectroscopy Phổ hồng ngoại MALDI-MS Matrix assisted laser desorption ionization mass spectrometry Phổ khối lượng ion hóa khử hấp thụ nền laze Man Mannose Mannose MCF-7 Michigan cancer foundation-7 Dòng tế bào ung thư vú người MIC minimum inhibitory concentration Nồng độ ức chế tối thiểu Mn Number average molecular mass Khối lượng phân tử trung bình số Mw Weight average molecular mass Khối lượng phân tử trung bình khối NOESY Nuclear Overhauser effect Spectroscopy Phổ tương tác không gian đồng hạt nhân 1H- 1H OD Optical density Mật độ quang học Rha Rhamnose Rhamnose SAXS Small Angle X-ray scattering Tán xạ tia X góc nhỏ SEM Scanning Electron Microscope Hiển vi điện tử quét vii SP Sulfate polysaccharide Sulfate polysaccharide UL-H Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva lactuca UL-K Ulvan chiết kiềm từ rong lục Ulva lactuca UL-N Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva lactuca UR-Ac Ulvan acetyl hóa từ UR-N UR-H Ulvan chiết acid từ rong lục Ulva reticulata UR-K Ulvan chiết kiềm từ rong lục Ulva reticulata UR-N Ulvan chiết nước từ rong lục Ulva reticulata UR-S Ulvan sulfate hóa từ UR-N UroA Uronic acid Uronic acid Xyl Xylose Xylose viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Hình ảnh về một số loài rong nâu ............................................................. 4 Hình 1.2. Hình ảnh về một số loài rong đỏ............................................................... 4 Hình 1.3. Hình ảnh về một số loài rong lục .............................................................. 5 Hình 1.4. Biểu đồ biểu thị sự phân bố các loài rong lục có sulfate polysaccharide [38] ........................................................................................................................ 11 Hình 1.5. Cấu trúc chuỗi mạch chính trong ulvan [38] .......................................... 14 Hình 1.6. Cơ chế tạo hydrogel của ulvan qua Ca2+: hoặc a) của borate ester hoặc một phần của b) carboxylate hoặc một phần của c) sulfate [1, 51] ......................... 17 Hình 1.7. (a) Phổ 1H-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan; (b) Phổ 13C-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan ...................................... 24 Hình 1.8. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide ..... 26 Hình 1.9. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate [111] ............................................. 28 Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS ............................................... 29 Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa ............................ 35 Hình 2.1. Hình ảnh của mẫu rong nghiên cứu ........................................................ 38 Hình 2.2. Quy trình chiết tách và tinh chế ulvan từ rong lục .................................. 43 Hình 3.1. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc của phần trăm tế bào sống sót ................. 56 vào nồng độ ulvan UL-N ....................................................................................... 56 Hình 3.2. Phổ IR của UR-H .................................................................................. 59 Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của UR-H ........................................................................ 60 Hình 3.4. Phổ 13C-NMR của UR-H ....................................................................... 61 Hình 3.5. Phổ COSY của UR-H ........................................................................... 62 Hình 3.6. Phổ HSQC của UR-H ........................................................................... 62 Hình 3.7. Phổ HMBC của UR-H .......................................................................... 63 Hình 3.8. Phổ ESI-MS của UR-H ......................................................................... 65 Hình 3.9. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 ......................... 66 Hình 3.10. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3] - tại m/z 419 ........................ 67 Hình 3.11. Phổ IR của UR-N ................................................................................ 68 Hình 3.12. Phổ 1H-NMR của UR-N ...................................................................... 69 Hình 3.13. Phổ 13C-NMR của UR-N ..................................................................... 70 Hình 3.14. Phổ COSY của UR-N .......................................................................... 71 Hình 3.15. Phổ HSQC của UR-N .......................................................................... 72 ix Hình 3.16. Phổ HMBC của UR-N ......................................................................... 73 Hình 3.17. Phổ ESI-MS của UR-N ....................................................................... 74 Hình 3.18. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3] - tại m/z 243 ......................... 75 Hình 3.19. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaUroASO3]- tại m/z 419 ............. 76 Hình 3.20. Sơ đồ phá mảnh của UR-N ................................................................... 77 Hình 3.21. Cấu trúc ulvan UR-N từ rong lục Ulva reticulata .................................. 78 Hình 3.22. Biểu đồ Kratky của dung dịch UR-N 1% trong nước ............................ 78 và trong NaCl 0,5 M .............................................................................................. 78 Hình 3.23. Biểu đồ Guinier của dung dịch UR-N 1% trong nước........................... 79 và trong NaCl 0,5 M .............................................................................................. 79 Hình 3.24. a) Đơn vị cấu trúc để xây dựng mô hình cấu trúc phân tử, b) Mô hình cấu trúc phân tử của UR-N xây dựng dựa trên cấu trúc hóa học ............................. 81 Hình 3.25. Biểu đồ Kratky với các đường tán xạ từ thực nghiệm và từ mô hình cấu trúc phân tử. .......................................................................................................... 81 Hình 3.26. Phổ IR của UL-N ................................................................................ 83 Hình 3.27. Phổ 1H-NMR của UL-N ...................................................................... 84 Hình 3.28. Phổ 13C-NMR của UL-N ..................................................................... 85 Hình 3.29. Phổ COSY của UL-N .......................................................................... 86 Hình 3.30. Phổ HSQC của UL-N .......................................................................... 87 Hình 3.31. Phổ HMBC của UL-N ......................................................................... 88 Hình 3.32. Phổ ESI-MS của ulvan UL-N .............................................................. 90 Hình 3.33. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3] - tại m/z 243 ....................... 91 Hình 3.34. Phổ 1H-NMR của UL-H ...................................................................... 92 Hình 3.35. Phổ 13C-NMR của UL-H ..................................................................... 93 Hình 3.36. Phổ COSY của UL-H .......................................................................... 94 Hình 3.37. Phổ HSQC của UL-H .......................................................................... 95 Hình 3.38. Phổ HMBC của UL-H ......................................................................... 97 Hình 3.39. Phổ ESI-MS/MS của ion mảnh [RhaSO3]- tại m/z 243 ........................ 99 Hình 3.40. Phổ IR của UR-N (a) và UR-S (b) ..................................................... 102 Hình 3.41. Phổ 13C-NMR của UR-N (a) và UR-S (b) .......................................... 103 Hình 3.42. Phổ HSQC của UR-N (a) và UR-S (b) ............................................... 103 Hình 3.43. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-S (b) ................................................. 104 Hình 3.44. Phổ 1H-NMR a) và 13C-NMR b) của UR-Ac ...................................... 106 Hình 3.45. Ảnh SEM của UR-N (a) và UR-Ac (b) ............................................... 107 x DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loài rong lục trên thế giới có sulfate polysaccharide [38] ............... 10 Bảng 1.2. Một số nhóm đặc trưng của phổ IR của polysaccharide từ rong biển ...... 23 Bảng 1.3. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose và galactose [104] ..................................................................................... 25 Bảng 2.1. Thành phần hóa học của rong (% trọng lượng rong khô) ....................... 41 Bảng 2.2. Kết quả hiệu suất chiết tách 6 mẫu ulvan ............................................... 44 Bảng 3.1. Kết quả phân tích thành phần hóa học của 6 ulvan ................................. 52 Bảng 3.2. Kết quả thử hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định của 6 mẫu ulvan ...... 53 Bảng 3.3. Kết quả thử hoạt tính gây độc tế bào của 4 mẫu ulvan ........................... 55 Bảng 3.4. Kết quả thử hoạt tính chống oxy hóa của 6 mẫu ulvan .......................... 57 Bảng 3.5. Kết quả xác định khối lượng phân tử của 4 mẫu ulvan .......................... 58 Bảng 3.6. Kết quả phân tích phổ IR của UR-H ..................................................... 59 Bảng 3.7. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-H ................................ 64 Bảng 3.8. Kết quả phân tích phổ IR của UR-N ..................................................... 68 Bảng 3.9. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UR-N ................................ 74 Bảng 3.10. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-N ............................... 89 Bảng 3.11. Kết quả phân tích phổ 1H và 13C-NMR của UL-H ............................... 98 Bảng 3.12. Kết quả thử hoạt tính chống đông tụ máu của UR-N và UR-S .......... 105 1 MỞ ĐẦU Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho nhiều ngành công nghiệp như dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm và thực phẩm. Hàng năm, theo ước tính sản lượng rong biển của thế giới đạt 15 triệu tấn và dự tính khoảng 22 triệu tấn vào năm 2020. Polysaccharide là các polymer sinh học được tìm thấy trong tự nhiên trên cả thực vật và động vật, cả trên cạn và dưới nước, trong đó rong biển được xem là một nguồn cung cấp polysaccharide rất phong phú và đa dạng. Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định được khoảng 10 000 loài rong biển, chia làm 03 ngành rong chính dựa trên sắc tố của chúng là rong lục (Chlorophyte), rong nâu (Pheophyte) và rong đỏ (Rhodophyte). Rong lục được biết đến như là nguồn nguyên liệu để tách chiết các chất có hoạt tinh sinh học như lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, hợp chất phenolic, alkaloid, trong đó polysaccharide được quan tâm nghiên cứu nhiều nhất do khả năng ứng dụng đa dạng của nó [1]. Việt Nam là đất nước có một vùng biển nhiệt đới rộng với bờ biển dài hơn 3000 km, là nguồn cung cấp các loài rong biển phong phú và đa dạng, rong lục với trữ lượng rất lớn lên tới 152 loài, chủ yếu thuộc về các chi Ulva, Caulerpa, Chaetomorpha, Enteromorpha, trong đó chi Ulva gồm 69 loài với hai loài phổ biến nhất là Ulva reticulata và Ulva lactuca. Rong lục chi Ulva phân bố rộng và mọc tự nhiên ven biển, được đánh giá giàu ulvan là một loại sulfate polysaccharide có nhiều hoạt tính sinh học như chống đông máu, chống oxy hóa, hạ mỡ máu, chống ung thư, kháng nấm Do đó, việc sản xuất và ứng dụng các sản phẩm từ ulvan phục vụ cho mục đích chữa bệnh đang được chú ý. Ulvan là sulfate polysaccharide có trong rong lục chi Ulva và Enteromorpha. Cũng giống như các sulfate polysaccharide từ rong biển khác, ulvan có cấu trúc rất phức tạp, nó được cấu tạo bởi các thành phần chủ yếu là các đường rhamnose, xylose, các acid glucuronic, iduronic và nhóm sulfate. Thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của ulvan phụ thuộc rất lớn vào loài rong, thời điểm thu hái, vị trí địa lý nơi rong sinh trưởng và điều kiện chiết tách. Do cấu trúc của ulvan từ rong lục rất phức tạp làm cho việc nghiên cứu cấu trúc gặp nhiều khó khăn, do đó cản trở sự phát triển của các sản phẩm thuốc chữa bệnh. Mặt khác, đã có nhiều nghiên cứu cho 2 thấy có mối liên hệ chặt chẽ giữa cấu trúc hóa học, cấu trúc không gian với hoạt tính sinh học của polysaccharide, do vậy việc nghiên cứu một cách tổng thể cấu trúc của ulvan là rất cần thiết và đòi hỏi phải có sự kết hợp một cách hợp lý của nhiều phương pháp. Hiện nay, một hướng nghiên cứu đang được quan tâm là điều chế các dẫn xuất của hợp chất thiên nhiên với mục đích nghiên cứu ảnh hưởng của các yếu tố cấu trúc đến hoạt tính sinh học, từ đó có thể tạo ra các chất có hoạt tính sinh học cao hơn mẫu tự nhiên. Ở nước ta, polysaccharide chiết tách từ rong đỏ và rong nâu như carrageenan, alginate và fucoidan đã được nghiên cứu và thu được các kết quả tốt ứng dụng vào cuộc sống thì cho đến nay chưa có công bố nào về polysaccharide từ các loài thuộc ngành rong lục nói chung và ulvan từ chi Ulva nói riêng. Với các lý do nêu trên, chúng tôi chọn đề tài "Nghiên cứu cấu trúc của ulvan có hoạt tính sinh học từ rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata”, để nghiên cứu cấu trúc của ulvan-một polysaccharide có trong rong lục và tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan nhằm góp phần hoàn thiện hướng nghiên cứu về polysaccharide từ rong biển và mở rộng khả năng ứng dụng của nguồn rong biển Việt Nam. Mục tiêu nghiên cứu của luận án:  Xác định cấu trúc của các ulvan có hoạt tính sinh học chiết tách từ 2 loài rong lục Ulva lactuca và Ulva reticulata.  Tìm hiểu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan. Để đạt được mục tiêu đề ra, nội dung nghiên cứu của luận án gồm: 1. Thu thập 2 loài rong lục phổ biến nhất thuộc chi Ulva ở Việt Nam là Ulva reticulata và Ulva lactuca 2. Nghiên cứu thành phần hóa học và khảo sát hoạt tính sinh học của ulvan tách chiết từ 2 loài rong trên. 3. Nghiên cứu cấu trúc của các ulvan có hoạt tính tốt. 4. Nghiên cứu ảnh hưởng của sự biến tính hóa học (sulfate hóa và acetyl hóa) đến cấu trúc và hoạt tính sinh học của ulvan. 3 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN 1.1. Rong biển và sulfate polysaccharide từ rong biển Rong biển hay tảo bẹ hay cỏ biển là loài thực vật sinh sống ở biển, thuộc nhóm tảo biển. Rong biển có thế sống ở cả hai môi trường nước mặn và nước lợ, chúng mọc trên các rạn san hô hoặc trên các vách đá, hoặc có thể mọc dưới tầng nước sâu với điều kiện có ánh sáng mặt trời chiếu tới để quang hợp. 1.1.1. Phân loài rong biển Trên thế giới, các nhà khoa học đã xác định được khoảng 10 000 loài rong biển và chia thành 3 ngành có giá trị kinh tế cao dựa vào màu sắc của chúng, bao gồm: rong đỏ có khoảng 6500 loài; rong nâu với khoảng 1800 loài và rong lục khoảng 1500 loài [2, 3]. So với các nước vùng Đông Nam Á, nước ta thuộc vào nước có nguồn rong biển đa dạng và phong phú [4, 5]. Các khảo sát điều tra cho thấy số lượng các loài rong biển tại các vùng biển như sau: Phú Quốc có 108 loài; Trường Sa 66 loài; Vịnh Hạ Long 99 loài; Cồn Cỏ 48 loài; Bạch Long Vĩ 46 loài. Riêng vùng Nha Trang có 210 loài. Năm 2003, tác giả Đàm Đức Tiến, Trần Đình Toại và CS cho biết riêng vùng ven biển Bắc Bộ đã có 259 loài [6, 7]. Với tổng số gần 800 loài rong tìm thấy ở vùng biển Việt Nam, các nhà khoa học Việt Nam cùng thống nhất xếp chúng vào 3 ngành trong hệ thống phân loại 10 ngành của Gollerbakh năm 1977 [8]: + Ngành rong đỏ (Rhodophyta) + Ngành rong nâu (Phaeophyta) + Ngành rong lục (Chlorophyta) Rong nâu: Là loài rong thường có kích thước lớn, loại lớn thường dài khoảng 20 mét, loài trung bình dài từ 2-4 mét, các loài nhỏ hơn dài từ 30–60 cm [2, 3]. Chúng chứa sắc tố xanthophyll-fucoxanthin cùng với chlorophyll a và c nên cá thể của rong nâu đều thể hiện màu nâu lục đặc trưng. Rong nâu là loài rong phổ biến nhất với trữ lượng lớn, khoảng 1800 loài, thường sinh trưởng ở vùng biển đá, nước biển lạnh thuộc bán cầu Bắc, chúng không chỉ mọc trên đá mà còn trên các chân đập, cầu cảng, san hô, động vật thân mềm và ngay cả trên các loài rong khác. 4 Rong nâu phân bố nhiều nhất ở Nhật Bản, tiếp đến là Canada, Việt Nam, Hàn Quốc, Alaska, Ireland, Mỹ, Pháp, Ấn Độ. Trước đây, rong nâu được sử dụng để tách iodine và kalium. Trong thời gian gần đây, rong nâu được khai thác rộng rãi để chiết tách alginate và fucoidan. Hình 1.1 là ảnh của một số loài rong nâu. Sargassum microcystum Padina australis Hình 1.1. Hình ảnh về một số loài rong nâu Rong đỏ: Là loài rong có kích thước nhỏ hơn rong nâu, thường dài từ vài centimet đến hàng mét; tuy nhiên rong đỏ không luôn luôn có màu đỏ: thỉnh thoảng chúng có màu tím, thậm chí là nâu đỏ nhưng chúng vẫn được xếp vào ngành rong đỏ do những đặc tính khác như màu sắc của chúng là do các hạt sắc tố phycobilin tạo thành, phycobilin là sắc tố đặc trưng cho rong đỏ. Ngành rong đỏ có khoảng 6500 loài, gồm 400 chi thuộc nhiều họ. Phần lớn các loài rong đỏ sống ở biển, có cấu tạo từ nhiều tế bào, trừ một số ít thuộc dạng một tế bào hay quần thể. Rong đỏ có dạng hình trụ dẹp dài, phiến chia hoặc không chia nhánh, phần lớn chia nhánh kiểu một trục, một số ít theo kiểu hợp trục [2, 3, 9]. Hình 1.2 là ảnh của một số loài rong đỏ. Porphyra Vietnameusis Acanthophora spicifera Hình 1.2. Hình ảnh về một số loài rong đỏ 5 Rong đỏ phân bố nhiều ở Việt Nam, Nhật Bản, Hàn Quốc, Chile, Indonesia, Philippine tiếp đến là Thailand, Brazil, Pháp, Trung Quốc, Hawaii, Ấn Độ, Anh, Mỹ Trên thế giới, rong đỏ được sử dụng với khối lượng lớn để phục vụ cuộc sống con người, một số loài có hàm lượng cao về agar, carageenan, furcellaran được sử dụng để chế biến keo rong biển và làm phụ gia thực phẩm. Các loài rong đỏ được chia thành hai nhóm chính [8]: - Nhóm rong cho agar (Agarophit): Bao gồm các loại như Gelidium, Gracilaria và Acanthopeltis. - Nhóm rong cho carrageenan (Carrageenophit): Bao gồm các loại như Gigartina, Eucheuma, Chondrus, Iridaea và Furcellaria. Rong lục: Là loài rong có kích thước nhỏ giống như rong đỏ, chúng bao gồm cả những loài đơn bào và đa bào. Rong lục chứa chlorophylls cả hai dạng a và b. Trên thế giới, rong lục phân bố chủ yếu tập trung tại Philipine, tiếp theo là Hàn Quốc, Indonesia, Nhật Bản và ít hơn là ở Việt Nam với các loài như Ulva reticulata, Ulva lactuca, Caulerpa racemosa, Ngoài ra, rong lục còn phân bố rải rác ở các nước: Canada, Chile, Pháp, Israel, Italy, Malaysia, Achentina, Bangladesh [2, 10]. Hình 1.3 là ảnh của một số loài rong lục. Hình 1.3. Hình ảnh về một số loài rong lục 6 1.1.2. Thành phần dinh dưỡng và ứng dụng của rong biển Từ lâu con người đã khai thác rong biển làm nguyên liệu cho rất nhiều ngành công nghiệp như thực phẩm, dệt may, mỹ phẩm, dược phẩm. Rong còn được dùng để làm phân bón, cung cấp nhiều K, Ca, P cho đất... [11]. Rong biển được coi là loại thực phẩm có giá trị cao, cả góc độ ẩm thực và dinh dưỡng. Tại các nước trong vùng châu Á - Thái Bình Dương, rong biển được tiêu thụ nhiều nhất, chiếm 80% tổng sản lượng toàn cầu, châu Âu chỉ tiêu thụ 1%, rong biển được dùng nhiều để nấu súp, làm sushi, trộn salad [2, 3]. Thành phần hóa học của rong biển bao gồm lipid, protein, peptide, polysaccharide, carotenoid, các hợp chất phenolic, alkaloid... Trong đó, polysaccharide là thành phần chính của rong biển, được coi là nguồn đường vô tận của rong biển, được cho là rất có giá trị về mặt kinh tế và được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu nhiều nhất cho mục đích y học [3, 10]. Ngoài chức năng là làm vật liệu tạo nên thành tế tào, các polysaccharide giữ nhiều chức năng quan trọng khác đối với tế bào như trao đổi chất và bảo vệ tế bào do chúng có độ bền cơ học cao [12, 13]. Từ rong biển, người ta đã sản xuất ra rất nhiều loại sản phẩm mà tổng giá trị hàng năm được ước tính đạt cỡ 5,5-6,0 tỷ USD. Trong đó các polysaccharide đóng góp phần lớn giá trị của rong. Các sản phẩm mỹ phẩm, như kem bôi da, nước hoa (mỹ phẩm lỏng) mà trong nhãn của nó có chứa các cụm từ “marine extract”, “extract of alga”, “seaweed extract” hoặc tương tự, thường có nghĩa là nó chứa một trong số các hydrocolloid được chiết từ rong biển [14]. Các nghiên cứu về giá trị thành phần dinh dưỡng của rong biển [2, 11] cho thấy rong biển rất giàu dưỡng chất, ngoài thành phần đạm rất cao, rong biển còn chứa rất nhiều khoáng chất, các yếu tố vi lượng trong đó nổi bật là iodine (yếu tố vi lượng tối cần thiết cho tuyến giáp), các vitamin (A, E, C, B12 và B1) ...de này thể hiện hoạt tính hỗ trợ chống HIV-1 [87]. Hoạt tính chống virus HSV-1 của 11 sulfate polysaccharide tự nhiên từ 10 loài rong lục khác nhau cũng đã được nghiên cứu, kết quả chỉ ra rằng, tất cả các sulfate polysaccharide từ rong lục Enteromorpha compressa đều thể hiện hoạt tính chống virus HSV-1 mạnh với nồng độ IC50 (50% inhibitory concentrations) là 388,5 µg/mL [88, 89]. Một phân đoạn sulfate polysaccharide được phân lập từ rong lục Cornus racemosa có khả năng chống virus HSV-1 và HSV-2 trên tế bào Vero với IC50 ở 2,2- 4,2µg/mL nhưng không gây độc với tế bào vật chủ [90]. Các tác giả [91] cũng chỉ ra rằng khả năng chống virus của các sulfate polysaccharide phụ thuộc vào hàm lượng sulfate, vị trí nhóm sulfate, thành phần đường và khối lượng phân tử. 1.1.4.4.7. Hoạt tính kháng viêm và giảm đau Trên thế giới, các sulfate polysaccharide có nguồn gốc từ rong lục đã được biết đến để làm thuốc kháng viêm và giảm đau, ulvan phân lập từ rong Ulva lactuca là bằng chứng rõ ràng cho tính chất kháng viêm do tác dụng làm giảm phù nề ở chuột sau 4 ngày thí nghiệm, nghiên cứu này đã công bố ở tạp chí Mar. Drugs 2014 [38]. Ở một nghiên cứu khác cũng đã chỉ ra rằng, thành phần đường và sulfate cũng như cấu trúc của ulvan ảnh hưởng tới khả năng kháng viêm [92, 93]. 22 1.2. Các phương pháp nghiên cứu cấu trúc polysaccharide 1.2.1. Phương pháp sắc ký thẩm thấu gel GPC GPC (Gel Permeation Chromatography) là một kỹ thuật sắc ký để phân tách các phân tử kích thước lớn dựa trên sự rửa giải của chúng trên cột sắc ký. GPC có thể xác định một vài thông số cấu trúc quan trọng bao gồm khối lượng phân tử trung bình khối Mw, khối lượng phân tử trung bình số Mn, khối lượng phân tử trung bình Mz và đặc trưng cơ bản nhất của một polymer là sự phân bố khối lượng phân tử của nó (Mw/Mn). GPC được sử dụng để nghiên cứu các chất phân tử lớn như polymer tổng hợp hay các polymer tự nhiên như polysaccharide. Ngoài việc cung cấp thông tin về sự phân bố khối lượng phân tử, GPC cũng tách một hợp chất phân tử lớn phức tạp thành các thành phần của nó như polymer, oligomer, monomer và các chất phụ gia [94] 1.2.2. Phương pháp phổ hồng ngoại IR Phương pháp phổ hồng ngoại là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích cấu trúc các ionic polysaccharide nói riêng. Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử ionic polysaccharide [34, 95]. Phân tích phổ hồng ngoại cho thông tin về các dao động của các liên kết điển hình trong cấu trúc của phân tử polysaccharide: các băng sóng hấp thụ ở 820–850, 1220–1260 và 1640– 1650 cm 1 là đặc trưng cho dao động hóa trị của liên kết C–O–S của nhóm sulfate ở vị trí axial, liên kết S=O của nhóm sulfate, và liên kết COO- của acid uronic, tương ứng; các dải hấp thụ ở 3420–3450 và 1050–1070 cm 1 được gán cho dao động của liên kết O–H và C– O–C, tương ứng [96, 97]. Phổ IR đã được áp dụng thành công để phân tích các polysaccharide như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển. Mặc dù việc sử dụng phương pháp phổ hồng ngoại đặc biệt hiệu quả khi xác định vị trí của nhóm sulfate trong cấu trúc của polysaccharide nhưng chúng vẫn còn một số hạn chế nhất định, đó là không xác định được dạng hỗn hợp monosaccharide, vị trí liên kết của vòng glycoside cũng như sự khác nhau giữa hai đồng phân quang học D, L của các gốc đường. Bảng 1.2 cho thông tin về các nhóm đặc trưng của phổ IR trong phân tích polysaccharide [98, 99, 100]. 23 Bảng 1.2. Một số nhóm đặc trưng của phổ IR của polysaccharide từ rong biển Tần số (cm-1) Nhóm dao động Hình dạng Chất đặc trưng 3423 -OH hóa trị (có liên kết H) Rộng, rất mạnh Fucoidan, ulvan, carrageenan 2936 -CH hóa trị Nhọn, trung bình Fucoidan, ulvan, carrageenan 1630 COO- hóa trị của acid uronic Nhọn, rất mạnh Fucoidan, ulvan, carrageenan 1235 S=O Nhọn, mạnh Fucoidan, ulvan, carrageenan 1080 C-O-C hóa trị Nhọn, rất mạnh Fucoidan, ulvan, carrageenan 842 nhóm sulfate tại vị trí C-4 Nhọn, trung bình Fucoidan, ulvan, carrageenan 820 nhóm sulfate tại vị trí C-2 và/hoặc C-3 Vai, trung bình Fucoidan, ulvan, carrageenan 1.2.3. Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu trong nghiên cứu cấu trúc của polysaccharide, phổ NMR [101, 103] được thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TPP, DSS). Đặc trưng phổ 1H- và 13C-NMR của polysaccharide được thể hiện theo Hình 1.7. Phổ 1H-NMR của polysaccharide có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt của các tín hiệu các oligonucleotide, protein hay lipid) [12, 103]. Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide từ số các tín hiệu cộng hưởng proton anomer với độ chuyển dịch hóa học ở khoảng δ4,4-5,8 ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các tín hiệu cộng hưởng ở vùng anomeric cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích thành phần hoá học của polysaccharide có thể phù hợp với kết quả phân tích phổ 1H-NMR. Dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1H-1H NMR, các nhóm thế có thể được xác định hoặc dự đoán được sự có mặt của chúng. Tiếp theo, số lượng của các 24 monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ vào việc khảo sát vùng anomeric của phổ 2 chiều dị hạt nhân 1H-13C-HSQC [13, 104]. Hình 1.7. (a) Phổ 1H-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan; (b) Phổ 13C-NMR của hỗn hợp liên kết (13)(14)-β-D-glucan So với tín hiệu cộng hưởng từ phổ 1H-NMR, phổ 13C-NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng nó có lợi thế hơn so với phổ 1H-NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharide là do độ dịch chuyển hóa học (δ) trong phổ 13C-NMR được trải rộng trên thang đo (từ 0 ppm đến 200 ppm), nên đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo của các tín hiệu trên phổ 1H-NMR (thang đo chỉ từ 0-12 ppm). Thực vậy, trên phổ 1H-NMR, độ dịch chuyển hoá học của proton anomer (δ4,4 – 5,8 ppm) được tách biệt một cách không hoàn toàn rõ rệt khỏi các tín hiệu cộng hưởng ở các vị trí nonanomeric proton (δ3,2 – 4,5 ppm) trong khi đó, trên phổ 13C-NMR, độ dịch chuyển hóa học của các tín hiệu anomeric carbon (δ90–110 ppm) lại tách biệt rất rõ và không hề trùng chập với các tín hiệu cộng hưởng của các nonanomeric carbon 25 (δ60 – 85 ppm). Với polysaccharide có nhóm de-oxygen như nhóm –CH3, tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (δ15–20 ppm) [42, 96] Bảng 1.3. Độ chuyển dịch hoá học δ (ppm) từ cơ sở dữ liệu SUGABASE của dạng glucose và galactose [104] Monosac charide H-1 C-1 H-2 C-2 H-3 C-3 H-4 C-4 H-5 C-5 H-6a C-6 H-6b -D-Glc 5,11 0,30 97,5 4.5 3.520,06 72,51,0 3,760,10 73,80,4 3,410,05 70,70,6 3,740,10 72,90,5 3,640,16 61,40,4 3,780,08 -D-Glc 4,840,46 102,92,4 3,310,05 74,11,1 3,550,07 76,31,4 3,510,13 70,41,0 3,550,09 76,01,3 3,770,05 61,51,0 3,940,05 -D-Gal 5,160,35 99,13,1 3,890,12 68,91,3 3,930,16 70,21,7 4,120,19 68,61,9 4,110,29 71,02,0 3,730,07 61,70,8 3,730,04 -D-Gal 4,680,26 103,52,4 3,530,17 71,72,1 3,800,16 73,51,7 4,080,18 67,92,0 3,740,20 75,51,1 3,740,05 61,80,7 3,740,05 Độ chuyển dịch hóa học của các proton anomer và carbon anomer của mỗi monosaccharide đều được nhận biết riêng, phụ thuộc vào cấu hình  hay : tín hiệu - proton anomer sẽ xuất hiện tại vùng có độ chuyển dịch hóa học δ5–6 ppm trong khi đó với - proton anomer là tại vùng δ4–5 ppm; tín hiệu của - carbon anomer xuất hiện tại vùng δ95–100 ppm trong khi đó tín hiệu của hầu hết - carbon anomer xuất hiện tại vùng δ100-105 ppm. Với polysaccharide có chứa thành phần acid uronic, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại vùng δ170–180 ppm. Các tín hiệu của carbon bậc một có chứa nhóm hydroxyl như C-6 trong pyranose và C-5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng trường cao (δ60–64 ppm), trong khi đó độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C-2, 3, 4 trong pyranose và C-2, 3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 26 δ65–85 ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C-5 trong pyranose và C-4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển về phía trường yếu với δ5–10 ppm [105, 106, 107]. Trong phân tử polysaccharide, các vị trí được thế của monosaccharide được gọi là vị trí aglycon, tương ứng với nguyên tử C ở các vị trí không phải anomer của liên kết glycoside. Từ dữ liệu phổ NMR, vị trí liên kết được suy ra dựa trên sự tăng mạnh (> + 3ppm) về độ dịch chuyển hoá học của 13C so với độ dịch chuyển hoá học của các monosaccharide không thế. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharide được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính cần xác định thu được từ hai loại phổ HMBC và NOESY. Một cách tổng quát về độ chuyển dịch hóa học của polysaccharide theo Hình 1.8 Hình 1.8. Độ dịch chuyển hóa học của các nhóm trong phân tử polysaccharide 27 1.2.4. Phương pháp phổ khối lượng MS Cho đến tận những năm đầu của thập kỷ 80, việc làm thế nào để phân tích các hợp chất cao phân tử bằng phương pháp phổ khối và làm cho khối phổ trở thành detector mạnh trong kỹ thuật phân tích lỏng vẫn còn là một thách thức. Một thời gian dài, ðối với các polysaccharide, phương pháp khối phổ chỉ có thể được áp dụng sau khi đã có sự chuyển hoá hoá học. Trước hết, mẫu được thuỷ phân để tạo thành các mono hoặc disaccharide, sau đó các tiểu phân này cần được methyl hoá để có thể phân tích bằng GC/MS. Quá trình phân tích đòi hỏi nhiều thực nghiệm, tiêu tốn thời gian và hoá chất, trong khi kết quả thu được chỉ cho biết gián tiếp về các đơn phân hình thành nên mạch mà không cung cấp nhiều thông tin về trật tự liên kết, do các đơn phân đã được methyl hoá nên có thể thông tin về nhóm thế của đơn phân sẽ bị mất đi. Chính vì thế phương pháp phổ khối (MS) sử dụng kĩ thuật ion hoá thông thường và chùm electron không phát huy sức mạnh đối với các mẫu polysaccharide. Những vướng mắc về kĩ thuật ion hoá đối với các đại phân tử đã được giải quyết nhờ sự ra đời gần như đồng thời của 2 kĩ thuật: ion hóa phun mù điện ESI (Electro Spray Ionisation) và ion hóa khử hấp thụ nền laser MALDI (Matrix- Assited Laser Desorption Ionisation). Đây là bước nhảy vọt về mặt kĩ thuật đã đưa khối phổ thành một công cụ mạnh trong nghiên cứu các phân tử sinh học lớn, và nó đã được trao giải Nobel 2002 cùng với những thành tựu về cộng hưởng từ hạt nhân. Một ưu điểm của kĩ thuật ESI là đối với những phân tử lớn có nhiều trung tâm điện tích thì tỷ số khối lượng/điện tích trở nên đủ nhỏ để cho phép chất có thể được phân tích bằng các máy khối phổ thông thường. Cả hai phương pháp MALDI-TOF-MS và ESI–MS đều đưa ra các mảnh có số khối m/z tương đương nhau và cung cấp thông tin về cấu trúc polysaccharide, tuy nhiên phương pháp ESI–MS thì nhạy hơn với ion có m/z nhỏ còn với phương pháp MALDI-TOF-MS thì tốt hơn với ion có m/z lớn [108]. Theo các nghiên cứu [20, 109, 110] polysaccharide tự nhiên được thủy phân (enzym hóa) thu được hỗn hợp oligosaccharide và được kiểm tra bằng phổ khối MALDI-TOF-MS và phổ khối ESI–MS. Tuy nhiên hỗn hợp oligopolysaccharide thường phức tạp và các mảnh có khối lượng mol tương đương nhau, do vậy việc xác định cấu trúc hoàn chỉnh là rất khó, nhưng có thể khắc phục bằng cách sử dụng phổ khối nhiều lần để nghiên cứu cấu trúc một cách hoàn chỉnh. Các nghiên cứu gần đây 28 đưa các dữ liệu trên phổ khối của polysaccharide như: nhóm khử cuối trong oligosaccharide, các nhóm thay thế nhóm hydroxyl và vị trí liên kết glycoside của oligosaccharide hoặc gán cho các mảnh oligosaccharide đã được xác định. Tuy nhiên, quá trình biến tính hay phương pháp tạo dẫn xuất từ polysaccharide tự nhiên (khử, thủy phân) cần thực hiện cẩn thận để không bị ảnh hưởng đến cấu trúc polysaccharide và dẫn xuất (cấu trúc phụ thuộc vào quá trình khử, môi trường pH). Hiện nay, phương pháp phổ khối lượng với kỹ thuật Tandem – MS là công cụ rất hữu hiệu để phân tích cấu trúc chuỗi của polysaccharide [108], bằng cách sử dụng hai hay nhiều hơn số lần phân tích trên một mẫu đo. Lần đầu bằng cách sử dụng từ trường bắn phá chọn một ion muốn nghiên cứu từ hỗn hợp, sau đó xem chi tiết các phân mảnh của ion được chọn này. Cơ chế phân mảnh của cacbohydrate đã được Domon và Costello đề xuất [111]. Sự phân mảnh của các oligosaccharides được diễn ra chủ yếu ở các vị trí anomer hay ở các liên kết glycoside (Hình 1.10). Các ion mảnh tách ra được kí hiệu là Ai, Bi, Ci và Xj, Yj , Zj, trong đó i và j là vị trí liên kết của ion mảnh tách ra tính từ đầu không khử và đầu khử, tương ứng. Liên kết giữa carbon anomeric với oxy được đánh số vị trí là 0. O OH O H O H O H O O H O H O H O H O O H O H O H O H R A 1 B 1 C 1 X 1 Y 1 Z 1 B 2 C 2 Y 2 Z 2 Hình 1.9. Cơ chế phân mảnh của carbohydrate [111] Như vậy, sự phân mảnh của các oligosaccharide nhìn chung chủ yếu diễn ra ở các vị trí anomer hay ở các liên kết glycoside. 1.2.5. Phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ SAXS Hiện nay, các phương pháp tán xạ là rất hữu hiệu được các nhà khoa học ứng dụng hiệu quả để nghiên cứu cấu trúc không gian của phân tử chất tan trong dung 29 dịch [33, 112], nguyên tắc của các phương pháp này là dựa vào đường cong tán xạ, có thể biết được các thông số cấu trúc như trọng lượng, kích thước và hình dạng của phân tử chất tan. Các quá trình tán xạ đều tuân theo phương trình Bragg: =dsin Với  d và  là bước sóng của tia tới, kích thước của vật tán xạ và góc tán xạ. Như vậy, với góc tán xạ nhỏ thì có thể nghiên cứu được phân tử lớn. Đường tán xạ phản ánh sự phụ thuộc của cường độ tán xạ vào góc tán xạ. Hình 1.10. Sơ đồ nguyên lý của một máy đo SAXS Phương pháp SAXS [112, 113] với bước sóng nhỏ (λ = 0,154 nm) có thể đo được các kích thước của phân tử ở kích thước cỡ nano, là phương pháp rất hữu hiệu trong việc nghiên cứu kích thước, hình dạng của các chất ở kích thước nhỏ từ 1-100 nm trong dung dịch, dựa vào giá trị của bán kính từ hồi chuyển để xác định hình dạng của phân tử chất tan. Ví dụ: với phân tử chất tan có dạng hình trụ đường tán xạ biểu diễn bằng phương trình: I(q) = exp (-q2R2gc/2) Với Rgc là bán kính hồi chuyển của mặt cắt; I(q) là cường độ tán xạ và q là biên độ của vector tán xạ. Rgc được xác định bởi độ dốc của đường ln(q.I(q)) và q2 – được gọi là “Guinier plot”, với điều kiện qRgc<1. 30 1.3. Tình hình nghiên cứu trên thế giới và trong nước liên quan đến nội dung nghiên cứu của luận án. 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Hướng nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ rong biển đã và đang được các nhà khoa học trong nước quan tâm nghiên cứu cập nhật theo xu hướng của các nước tiên tiến trên thế giới, bao gồm: chiết tách, thử hoạt tính và biến tính để tìm các sản phẩm có hoạt tính cao hơn hay nghiên cứu mối quan hệ cấu trúc-hoạt tính. Nhóm nghiên cứu về vật liệu biển tại Viện Nghiên cứu & Ứng dụng công nghệ Nha Trang, với lợi thế địa lý gần vùng biển, là nơi tập trung nhiều loài rong biển đã có một số kết quả nghiên cứu về rong biển. Các nhà khoa học ở đây đã thu thập, phân loại, chiết tách và xác định cấu trúc nhiều loại polysaccharide từ rong biển có ứng dụng thực tế cao như agar, carrageenan, alginate hay fucoidan [18, 114-117]. Tác giả Bùi Minh Lý và CS [99] đã sử dụng các phương pháp phổ NMR và ESI-MS để nghiên cứu cấu trúc của fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum polycystum, kết quả cho thấy, cấu trúc bộ khung chính của fucoidan ở đây có dạng α-L-fucose liên kết với nhau qua liên kết 1-3 và nhóm thế sulfate nằm chủ yếu ở vị trí carbon C-2 và một phần ở vị trí carbon C-4. Tác giả Nguyễn Duy Nhứt [98] với luận án tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa” đã thành công trong việc xác định cấu trúc của 2 phân đoạn fucoidan có và không có hoạt tính kháng ung thư chiết tách từ rong nâu Sargassum swartzii và Sargassum polycystum, bước đầu đã đề xuất mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính kháng ung thư của fucoidan. Tác giả Nguyễn Duy Nhứt [98] với luận án tiến sĩ “Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của polysaccharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa” đã thành công trong việc xác định cấu trúc của 2 phân đoạn fucoidan có và không có hoạt tính kháng ung thư chiết tách từ rong nâu Sargassum swartzii và Sargassum polycystum, bước đầu đã đề xuất mối quan hệ cấu trúc – hoạt tính kháng ung thư của fucoidan. 31 Tác giả Thành Thị Thu Thủy và CS [113] đã nghiên cứu cấu trúc của fucoidan từ rong nâu Turbinaria ornate thu thập ở Nha Trang – Việt Nam bằng phương pháp phổ khố lượng với kỹ thuật ion hóa phun mù điện (ESI-MS) và kỹ thuật tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), đây là cách tiếp cận mới trong việc nghiên cứu cấu trúc polysaccharide nói chung, fucoidan nói riêng, bằng cách này cấu trúc phức tạp của fuocidan đã được làm sáng tỏ. Các phương pháp ESI-MS và SAXS cũng đã được tác giả và CS dùng để nghiên cứu cấu trúc của các fucoidan khác từ rong nâu Sargassum crasifolium và Padina austrasis, trong nghiên cứu này hoạt tính tăng cường hệ miễn dịch đường ruột của fucoidan cũng đã được công bố [119]. Khi nghiên cứu cấu trúc của fucoidan có hàm lượng sulfate cao được phân lập từ rong nâu Sargassum polycystum bằng sắc ký trao đổi ion, tác giả Bilan, và CS [99, 120] bằng phương pháp NMR và ESI-MS đã chỉ ra rằng, sự phân bố các mảnh galactose dọc theo mạch chính dường như khá phức tạp, ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc không gian và hoạt tính sinh học của polysaccharide. Tác giả Trần Vĩnh Thiện [121] với luận án tiến sĩ “Điều chế, khảo sát cấu trúc và tính chất của alginate và oligosaccharide tách từ rong mơ khu vực Bắc Hải Vân và ứng dụng của chúng” đã thành công trong việc khảo sát chi tiết ảnh hưởng của các yếu tố đến tỷ lệ tách và khối lượng phân tử trung bình của alginate từ rong mơ khu vực Bắc Hải Vân theo quy trình acid, cũng như cấu trúc của các alginate thu được. Tác giả Hồ Đức Cường [100] đã bảo vệ thành công luận án tiến sỹ hóa học năm 2014 với đề tài “Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii của Việt Nam”, tác giả đã thành công trong việc xác định cấu trúc hóa học bằng các phương pháp phổ như IR, NMR, MS và cấu trúc không gian bằng phương pháp LS, SAXS của fucoidan và alginate chiết tách từ rong nâu Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii, 2 focuidan nghiên cứu có tác dụng hạ mỡ máu trên mô hình động vật béo phì. Tác giả Phạm Đức Thịnh [118] với luận án tiến sỹ hóa học “Nghiên cứu phân tích cấu trúc, thành phần và hoạt tính của fucoidan từ rong biển Việt Nam” đã 32 phân tích được thành phần hóa học của fucoidan từ 8 loài rong nâu phổ biến nhất ở Việt Nam S. oligocystum, S. denticapum, S. swartzii, S. polycystum, S. mcclurei, Padina australis và Turbiaria ornata; tác giả đã thành công trong việc sử dụng các phương pháp phổ IR, NMR cùng với việc kết hợp 2 kỹ thuật MALDI-TOF/MS/MS và ESI-MS/MS để nghiên cứu cấu trúc của các mẫu fucoidan trong luận án. Ở Việt Nam, các nghiên cứu về rong lục đã được một số nhà khoa học tiến hành. Tuy nhiên các nghiên cứu hầu hết mới chỉ tập trung vào việc phân loại, đánh giá trữ lượng, điều kiện sinh thái, khai thác rong [6, 7, 9, 122]. Kết quả nghiên cứu cho thấy: tại 10 đảo thuộc quần đảo Trường Sa, các nhà khoa học đã xác định được 255 loài rong biển, trong đó, rong Lục có 69 loài chiếm 27,0%; vùng triều ven biển một số tỉnh (Quảng Ninh, Thái Bình, Nam Định, Thanh Hóa, Nghệ An và Quảng Bình) phát hiện được 45 loài rong biển, trong đó rong Lục (Chlorophyta) có 16 loài chiếm 35,5%. Tác giả Đặng Diễm Hồng và CS [123] đã nghiên cứu các thành phần dinh dưỡng của một số loài rong trong đó có rong lục Ulva reticulata. Kết quả chỉ ra rằng, các loài rong biển nghiên cứu rất giàu protein, lipid (đặc biệt là các acid béo), các vitamin và các nguyên tố đa lượng và vi lượng. Trong nghiên cứu này, tác động sinh lý học của dịch chiết từ rong lục Ulva reticulata lên sự chuyển hóa acid béo ở gan cũng được kiểm tra trên chuột. Nhóm nghiên cứu này cũng nghiên cứu hoạt tính kháng viêm và giảm đau trên động vật của dịch chiết methanol từ một số loài rong biển sinh trưởng ở biển Việt Nam, trong đó có loài rong lục Ulva reticulata với liều 500 mg/kg trọng lượng cơ thể. Kết quả cho thấy dịch chiết của rong lục này thể hiện tác động làm giảm đau và kháng viêm mà không có tác động độc tính nào kể cả ở liều cao, kết quả này củng cố thêm sự khẳng định rằng có thể sử dụng rong biển này làm nguồn nguyên liệu sản xuất thuốc điều trị kháng viêm [124]. Cho đến nay, chưa có một công bố nào về qui trình chiết tách, thành phần, cấu trúc hóa học, hoạt tính sinh học của polysaccharide từ các loài thuộc ngành rong lục nói chung và chi Ulva nói riêng. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Trên thế giới, các polysaccharide từ rong biển như carrageenan từ rong đỏ, fucoidan từ rong nâu và ulvan từ rong lục cùng được quan tâm nghiên cứu, 33 trong đó ulvan từ rong lục đã được các nhà khoa học quan tâm nghiên cứu từ những năm 1950. Thời gian đầu, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc chiết tách và xác định thành phần đường trong ulvan từ các loài rong lục khác nhau. Brading [125] và Percival [126] đã xác định sulfate, rhamnose, xylose, và acid glucuronic là các thành phần hóa học có trong ulvan. Tuy nhiên, phải đến năm 1997, Quemener và CS [40], nhờ vào phương pháp cắt mạch hóa học kèm enzym, mới phát hiện ra acid iduronic cũng là một đơn vị đường trong ulvan. Các tác giả cũng khẳng định rằng, thành phần đường, tỉ lệ đường đơn, hàm lượng sulfate trong ulvan phụ thuộc rất nhiều vào loài rong, vị trí địa lý nơi rong thu hái và thời điểm thu hái. Ảnh hưởng của việc xử lý rong tươi (như làm khô trong không khí, trong tủ đông lạnh, giữ trong dung môi và hỗn hợp dung môi hữu cơ) đến hiệu suất chiết, tính chất hóa lý và lưu biến của ulvan từ rong lục Ulva rotundata đã được Robic và Lahaye nghiên cứu [71]. Nhiều phương pháp khác nhau đã được sử dụng để chiết tách ulvan từ rong lục dựa vào tính tan được trong nước của nó. Các phương pháp chiết tách ulvan từ rong lục được các nhà khoa học trên thế giới quan tâm nghiên cứu gồm chiết bằng dung môi nước [1, 14, 127-130], acid [96, 131]và kiềm [13, 47, 49]; trong đó, phương pháp chiết bằng dung môi nước được sử dụng nhiều nhất. Hela Y và CS [131] đã nghiên cứu ảnh hưởng của điều kiện chiết tách đến hiệu suất chiết và tinh chế ulvan từ rong lục Ulva lactuca bằng dung môi acid. Kết quả chỉ ra rằng các yếu tố như pH, thời gian chiết và nhiệt độ chiết đều ảnh hưởng đến hiệu suất chiết tách và độ tinh khiết của ulvan. Các nghiên cứu của Lahaye [13] và Robic [47, 49] đã chiết ulvan bằng cách đun bột rong khô trong dung dịch natri oxalate ở nhiệt độ khoảng 80º-90ºC, sau đó kết tủa bằng methanol thu được ulvan. Kết quả cho thấy, hàm lượng của ulvan là khoảng 8%-29% trọng lượng của rong khô, tùy thuộc vào loài rong, vị trí thu mẫu và phương pháp chiết tách. Những kết quả nghiên cứu về ảnh hưởng của các điều kiện chiết tách như dung môi (acid, nồng độ dung dịch natri oxalate, nước), nhiệt độ và thời gian chiết đến hiệu suất chiết tách, thành phần và tỉ lệ các đường trong ulvan, khối lượng phân tử và phân bố khối lượng phân tử, cấu trúc ulvan cho thấy có sự phụ thuộc rất lớn của các yếu tố này vào phương pháp chiết tách. 34 Tác giả Lerio và CS đã chiết tách ulvan từ rong lục Ulva rigida bằng dung môi acid, thu được ulvan có thành phần chủ yếu được tạo thành từ các disaccharide bao gồm GlcA và Rha sulfate. Trong nghiên cứu này, các tác giả cũng đã chứng minh rằng, nhóm sulfate có trong thành phần phân tử ulvan từ rong lục Ulva rigida đóng vai trò quan trọng, quyết định đến hoạt tính chống khối u của phân tử ulvan. Thí nghiệm cho thấy tác động chống khối u của ulvan giảm đáng kể sau khi các ulvan bị khử sulfate [57]. Qi và CS đã có nhiều công trình nghiên cứu [83, 84] về ulvan từ rong lục Ulva pertusa và những dẫn xuất của chúng, ví dụ như các acetylate ulvan (AUs) và các ulvan có hàm lượng sulfate cao (HUs), để đánh giá hoạt tính hạ mỡ máu. Hoạt tính hạ mỡ máu có sự khác nhau rõ ràng giữa ulvan tự nhiên và các dẫn xuất của chúng đã được quan sát. Costa, Alves và CS [127] đã chiết tách ulvan từ rong lục Ulva lactuca bằng dung môi nước, mẫu ulvan thu được được đo khối lượng phân tử, xác định thành phần hóa học và phân tích cấu trúc bằng phương pháp phổ NMR. Kết quả cho thấy, mẫu ulvan thu được được tạo thành bởi các thành phần chính là rhamnose (22,4%), acid glucuronic (22,5%), xylose (3,7%), acid iduronic (3,1%) và glucose (1,0%); hàm lượng sulfate trong phân tử ulvan cũng rất cao (32,2%); khối lượng phân tử của ulvan chiết tách được là rất cao (790 000 g/mol). Cấu trúc của phân tử sulfate polysaccharide từ rong lục Ulva lactuca được tạo thành chủ yếu bởi disaccharide acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng A3s: [→4)-β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S-(1→] và một lượng nhỏ của acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng B3s: [→4)-α-L-IdoA- (1→4)-α-L-Rha3S-(1→]. Wenjun Mao và CS [128, 132] đã thu thập và chiết tách ulvan từ Ulva conglobuta ở 3 vị trí địa lí khác nhau là Quingdao, Yantai và Rizhao bằng dung môi nước và khảo sát hoạt tính chống đông tụ máu của chúng. Kết quả nghiên cứu cho thấy ulvan tách từ rong biển ở vùng biển Quingdao có hàm lượng sulfate cao nhất và có hoạt tính chống đông tụ máu tốt nhất. Masakuni Tako và CS [96] đã thành công trong việc xác định cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa thu thập ở vùng biển Okinawa – Nhật Bản, bằng các phương pháp phổ IR và NMR. Tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi liên 35 kết glycoside có dạng sau: α-D-GlcA hoặc α-L-IdoA-[(1→3)-α-L-Rha-(1→4)-α- L-Rha, (1→4)-α-L-Rha-(1→4)-α-L-Rha-(1→4)-α-L-Rha-(1→4)-β-D-Xyl. Sự phân nhánh ở các chuỗi liên kết thường xảy ra ở vị trí C-2 của liên kết (1→4)-α- L-Rha là β-D-GlcA; tác giả cũng khẳng định nhóm sulfate nằm ở vị trí C-3 và C- 2 của rhamnose; ở vị trí C-3 của xylose, chuỗi liên kết trong cấu trúc của ulvan có dạng như ở Hình 1.11 dưới đây. Hình 1.11. Cấu trúc hóa học của ulvan từ rong lục Ulva pertusa Tác giả Qi và CS đã sử dụng dung môi nước để chiết tách ulvan từ rong lục Ulva pertusa, sau đó điều chế các dẫn xuất của ulvan tự nhiên này bằng cách acetyl hóa và benzoyl hóa với khối lượng phân tử khác nhau, sau đó thử hoạt tính chống oxy hóa trên mô hình thí nghiệm in vitro. Kết quả cho thấy, những mẫu ulvan bị acetyl hóa và benzoyl hóa thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao hơn mẫu ulvan tự nhiên, điều này đã chứng minh rằng khi thay đổi cấu trúc hóa học ulvan tự nhiên thì hoạt tính chống oxy hóa sẽ tăng lên; khối lượng phân tử ulvan cũng ảnh hưởng đáng kể tới hoạt tính chống oxy hóa của chúng, ulvan với khối lượng phân tử thấp có hoạt tính cao hơn ulvan có khối lượng phân tử cao. Trong những nghiên cứu khác, các tác giả trên cũng đã điều chế các dẫn xuất sufate của ulvan tự nhiên với các hàm lượng sulfate khác nhau, kết quả thử hoạt tính cho thấy: các mẫu có hàm lượng sulfate khác nhau thể hiện hoạt tính chống oxy hóa khác nhau, ulvan với hàm lượng sulfate cao hơn ulvan tự nhiên thể hiện hoạt tính chống oxy hóa cao hơn [63-65, 133]. Hoạt tính gây độc tế bào cũng đã được Qi nghiên cứu trên chuột với các ulvan từ rong lục Ulva pertusa, kết quả cho thấy, chúng thể hiện khả năng gây độc tế bào rất tốt [134]. Lahaye, Robic và các CS là nhóm nghiên cứu rất mạnh về cấu trúc của ulvan trên thế giới hiện nay. Phương pháp chủ yếu mà các tác giả sử dụng để 36 nghiên cứu cấu trúc ulvan là phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân. Các công trình của nhóm nghiên cứu này cho thấy rằng cấu trúc ulvan rất phức tạp và phụ thuộc nhiều vào loài rong nghiên cứu [97, 105, 106]. Các tác giả cũng đã quan tâm đến các sulfate đường hiếm như 3-sulfate rhamnose và 2-sulfate xylose trong ulvan và cho rằng: Rhamnose, thành phần chủ yếu của ulvan, được sử dụng như là tiền chất để tổng hợp các hợp chất thơm tạo tiền đề cho khả năng ứng dụng rhamnose trong lĩnh vực công nghiệp dược phẩm. Ulvan là sulfate polysaccharide có điện tích cao, tan được trong nước và được tạo bởi các thành phần chủ yếu là rhamnose, acid glucuronic, acid iduronic, xylose và nhóm sulfate để tạo thành mạch polymer sinh học với disaccharide chính là acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng A (β-D-GlcA-(1→4)-α-L-Rha3S →1) và acid 3-sulfate ulvanobiuronic dạng B (α-L-IdoA-(1→4)-α-L-Rha3S →1) (Hình 1.5) [38]. Lahaye, Robic và các CS [105, 107] đã nghiên cứu cấu trúc của ulvan từ rong lục Ulva rigida bằng cách thủy phân tạo oligosaccharide và desulfate hóa. Cấu trúc hóa học và chuỗi đường của những oligomer này được xác định bằng phổ NMR. Tác giả đã khẳng định rằng các chuỗi liên kết glycoside có dạng sau: α-L-Rha-(1→4)-D-Xyl, β-D-GlcA-(1→2)-α-L-Rha-(1→4)-D-Xyl, β-D-GlcA- (1→4)-α-L-Rha3S, β-D-GlcA-(1→4)-[β-D-GlcA-(1→2)]-α-L-Rha-(1→4)-D-Xyl và β-D-GlcA-(1→4)-[β-D-GlcA-(1→2)]-α-L-Rha. Sự phân nhánh ở các chuỗi liên kết thường xảy ra ở vị trí carbon C-2 của liên kết (1→4)-α-L-Rha là β-D- GlcA; tác giả cũng khẳng định lại rằng nhóm sulfate nằm ở vị trí carbon C-3 của rhamnose. Các nghiên cứu sau đó cho thấy các liên kết glycoside và vị trí sulfate này trong cấu trúc ulvan là phổ biến cho các loài Ulva khác nhau. You S.G và CS [135] đã chiết tách ulvan từ rong lục Ulva pertusa ở biển Hàn Quốc bằng dung môi nước,...he coast of Viet Nam. Asean J. on Science and Technology for Development, 25(2), 395-403. 37. Mou H.; Jiang X. and Guan H. (2003). A k-carrageenan derived oligosaccharide prepared by enzymatic degradation containing anti-tumor activity. J. Appl. Phycol., 15, 297-303. 117 38. Lingchong Wang, Xiangyu Wang, Hao Wu and Rui Liu (2014). Overview on Biological Activities and Molecular Characteristics of Sulfated Polysaccharides from Marine Green Algae in Recent Years. Mar. Drugs., 12, 4984-5020. 39. Tabarsa, M.; Lee, S.J.; You, S.; (2012). Structural analysis of immunostimulating sulfated polysaccharides from Ulva pertusa. Carbohydr. Res., 361, 141–147. 40. Quemener, B.; Lahaye, M.; Bobin Dubigeon, C. (1997). Sugar determination in ulvans by a chemical-enzymatic method coupled to high performance anion exchange chromatography. J. Appl. Phycol., 9, 179-188. 41. Chattopadhyay, K.; Mandal, P.; Lerouge, P.; Driouich, A.; Ghosal, P.; Ray, B.; (2007). Sulphated polysaccharides from Indian samples of Enteromorpha compressa (Ulvales, Chlorophyta): Isolation and structural features. Food Chem., 104, 928–935. 42. Ray, B. (2006). Polysaccharides from Enteromorpha compressa: Isolation, purification and structural features. Carbohydr. Polym., 66, 408–416. 43. Lahaye M.; Jegou J.; and Buleon A. (1994). Chemical characteristics of insoluble glucans from the cell-wall of the marine green alga Ulva lactuca (L) Thuret. Carbohydr. Res., 262, 115-125. 44. Ray, B.; Lahaye, M. (1995). Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva rigida (Ulvales, Chlorophyta): Extraction and chemical composition. Carbohydr. Res., 274, 251–261. 45. Paradossi, G.; Cavalieri, F.; Pissoferrato, L.; Liquori, A.M.A. (1999). Physico- chemical study on the polysaccharide ulvan from hot water extraction of the macroalga Ulva. Int. J. Biol. Macromol., 25, 309–315. 46. Paradossi, G.; Cavalieri, F.; Chiessi, E.A. (2002). Conformational study on the algal polysaccharide ulvan. Macromolecules, 35, 6404–6411. 47. Robic, A.; Gaillard, C.; Sassi, J.F.; Lerat, Y.; Lahaye, M. (2009). Ultrastructure of ulvan: A polysaccharide from green seaweeds. Biopolymers, 91, 652–664. 118 48. Dobrynin A.V. (2008). Theory and simulations of charged polymers: From solution properties to polymeric nanomaterials. Current Opinion in Colloid & Interface Science, 13, 376–388. 49. Robic A.; Sassi J.-F.; Lahaye M. (2008). Impact of stabilization treatments of the green seaweed Ulva rotundata (Chlorophyta) on the extraction yield, the physico-chemical and rheological properties of ulvan. Carbohydrate Polymers, 74, 344–352 50. Sun, H.H.; Mao, W.J.; Fang, F.; Li, H.Y. (2007). Polysaccharides from marine green seaweed Ulva species and their characteristics. Agro Food Ind. Hi-Tech., 18, 28–29. 51. Haug, A., Nilsson, N. H., Romming, C., Schaumburg, K., Vialle, J. & Anthonsen, T. (1976). The influence of borate and calcium on the gel formation of a sulfated polysaccharide from Ulva lactuca. Acta Chem Scand B., 30, 562–566. 52. Wijesekara, I.; Pangestuti, R.; Kim, S.K. (2011). Biological activities and potential health benefits of sulfated polysaccharides derived from marine algae. Carbohydr. Polym., 84, 14–21. 53. Qi, H.M.; Zhang, Q.B.; Zhao, T.T.; Hu, R.G.; Zhang, K.; Li, Z. (2006). In vitro antioxidant activity of acetylated and benzoylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta). Bioorg. Med. Chem. Lett., 16, 2441–2445. 54. Godard, M.; Decorde, K.; Ventura, E.; Soteras, G.; Baccou, J.C.; Cristol, J.P.; Rouanet, J.M. (2009). Polysaccharides from the green alga Ulva rigida improve the antioxidant status and prevent fatty streak lesions in the high cholesterol fed hamster, an animal model of nutritionally-induced atherosclerosis. Food Chem., 115, 176–180. 55. Zhang, H.J.; Mao, W.J.; Fang, F.; Li, H.Y.; Sun, H.H.; Chen, Y.; Qi, X.H. (2008). Chemical characteristics and anticoagulant activities of a sulfated polysaccharide and its fragments from Monostroma latissimum. Carbohydrate Polymers, 71, 428–434. 56. Kaeffer B.; Benard C.; Lahaye M.; Blottiere H. M. and Cherbut C (1999). Biological Properties of Ulvan, a New Source of Green Seaweed Sulfated 119 Polysaccharides, on Cultured Normal and Cancerous Colonic Epithelial Cells. Planta Med., 65, 527-531. 57. Leiro, J.M.; Castro, R.; Arranz, J.A.; Lamas, J. (2007). Immunomodulating activities of acidic sulphated polysaccharides obtained from the seaweed Ulva rigida C. Agardh. Int. Immunopharmacol., 7, 879–888. 58. Pengzhan, Y.; Ning, L.; Xiguang, L.; Gefei, Z.; Quanbin, Z.; Pengcheng, L. (2003). Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta). Pharmacol. Res. Offic. J. Ital. Pharmacol. Soc., 48, 543–549. 59. Yu, P.Z.; Zhang, Q.B.; Li, N.; Xu, Z.H.; Wang, Y.M.; Li, Z.E. (2003). Polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta) and preliminary studies on their antihyperlipidemia activity. J. Appl. Phycol., 15, 21–27. 60. Yu, P.Z.; Li, N.; Liu, X.G.; Zhou, G.F.; Zhang, Q.B.; Li, P.C. (2003). Antihyperlipidemic effects of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa (Chlorophyta). Pharmacol.Res., 48, 543– 549. 61. Song, H.; Zhang, Q.; Zhang, Z.; Wang, J. (2010). In vitro antioxidant activity of polysaccharides extracted from Bryopsis plumosa. Carbohydrate Polymers, 80, 1057–1061. 62. Zhang, Z.; Wang, F.; Wang, X.; Liu, X.; Hou, Y.; Zhang, Q. (2010). Extraction of the polysaccharides from five algae and their potential antioxidant activity in vitro. Carbohydrate Polymers, 82, 118–121. 63. Qi, H.M.; Zhang, Q.B.; Zhao, T.T.; Chen, R.; Zhang, H.; Niu, X.Z.; Li, Z. (2005). Antioxidant activity of different sulfate content derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta) in vitro. Int. J. Biol. Macromol., 37, 195–199. 64. Qi, H.M.; Zhang, Q.B.; Zhao, T.T.; Hu, R.G.; Zhang, K.; Li, Z. (2006). In vitro antioxidant activity of acetylated and benzoylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta). Bioorg. Med. Chem. Lett., 16, 2441–2445. 120 65. Qi, H.M.; Zhao, T.T.; Zhang, Q.B.; Li, Z.; Zhao, Z.Q.; Xing, R. (2005). Antioxidant activity of different molecular weight sulfated polysaccharides from Ulva pertusa Kjellm (Chlorophyta). J. Appl.Phycol., 17, 527–534. 66. Shao, P.; Chen, M.; Pei, Y.; Sun, P. (2013). In intro antioxidant activities of different sulfated polysaccharides from chlorophytan seaweeds Ulva fasciata. Int. J. Biol. Macromol., 59, 295–300. 67. Shonima Govindan M, JiJi Thomas and G Muraleedhara Kurup (2012). In vitro antioxidant and antitumor activity of Polysaccharide isolated from Ulva fasciata. Int J Pharm Bio Sci July., 3(3), 238 – 246. 68. Mezghani, S.; Bourguiba, I.; Hfaiedh, I.; Amri, M. (2013). Antioxidant potential of Ulva rigida extracts: protection of heLa cells against H2O2 cytotoxicity. Biol. Bull., 225, 1–7. 69. Matsubara, K.; Matsuura, Y.; Bacic, A.; Liao, M.L.; Hori, K.; Miyazawa, K. (2001). Anticoagulant properties of a sulfated galactan preparation from a marine green alga, Codium cylindricum. Int. J.Biol. Macromol., 28, 395–399. 70. Shanmugam, M.; Mody, K.H.; Siddhanta, A.K. (2001). Blood anticoagulant sulphated polysaccharides of the marine green algae Codium dwarkense (Boergs.) and C. tomentosum (Huds.) Stackh. Indian J. Exp. Biol., 39, 365– 370. 71. Robic, A.; Rondeau-Mouro, C.; Sassi, J.F.; Lerat, Y.; Lahaye, M. (2009). Structure and interactions of ulvan in the cell wall of the marine green algae Ulva rotundata (Ulvales, Chlorophyceae). Carbohydr. Polym., 77, 206–216. 72. Gurgel Rodrigues, J.A.; Lino de Queiroz, I.N.; Gomes Quindere, A.L.; Vairo, B.C.; Souza Mourao, P.A.; Barros Benevides, N.M. (2011). An antithrombin- dependent sulfated polysaccharide isolated from the green alga Caulerpa cupressoides has in vivo anti- and prothrombotic effects. Cienc. Rural., 41, 634–639. 73. Qi, X.; Mao, W.; Chen, Y.; Chen, Y.; Zhao, C.; Li, N.; Wang, C. (2013). Chemical characteristics and anticoagulant activities of two sulfated polysaccharides from Enteromorpha linza (Chlorophyta). J. Ocean Univ. China., 12, 175–182. 121 74. Qi, X.; Mao, W.; Gao, Y.; Chen, Y.; Chen, Y.; Zhao, C.; Li, N.; Wang, C.; Yan, M.; Lin, C.; et al (2012). Chemical characteristic of an anticoagulant- active sulfated polysaccharide from Enteromorpha clathrata. Carbohydrate Polymers, 90, 1804–1810. 75. Gurgel Rodrigues, J.A.; Oliveira Vanderlei, E.D.S.; Bessa, E.F.; Magalhaes, F.D.A.; Monteiro de Paula, R.C.; Lima, V.; Barros Benevides, N.M. (2011). Anticoagulant activity of a sulfated polysaccharide isolated from the green seaweed Caulerpa cupressoides. Braz. Arch. Biol. Technol., 54, 691–700. 76. Mao, W.J.; Fang, F.; Li, H.Y.; Qi, X.H.; Sun, H.H.; Chen, Y.; Guo, S.D. (2008). Heparinoid-active two sulfated polysaccharides isolated from marine green algae Monostroma nitidum. Carbohydrate Polymers, 74, 834–839. 77. Maeda, R.; Ida, T.; Inara, H.; Sakamoto, T. (2012). Immunostimulatory activity of polysaccharides isolated from Caulerpa lentillifera on macrophage cells. Biosci. Biotechnol. Biochem., 76, 501–505. 78. Shao, P.; Chen, X.; Sun, P. (2013). In vitro antioxidant and antitumor activities of different sulfated polysaccharides isolated from three algae. Int. J. Biol. Macromol., 62, 155–161. 79. Ahmed, O.M. and Ahmed, R.R. (2014). Anti-proliferative and apoptotic efficacies of ulvan polysaccharides against different types of carcinoma cells In Vitro and In Vivo. Cancer Science & Therapy, 6(6), 202-208. 80. Gurgel Rodrigues, J.A.; Oliveira Vanderlei, E.D.S.; Silva, L.M.; de Araujo, I.W.; de Queiroz, I.N.; de Paula, G.A.; Abreu, T.M.; Ribeiro, N.A.; Bezerra, M.M.; Chaves, H.V.; et al (2012). Antinociceptive and anti-inflammatory activities of a sulfated polysaccharide isolated from the green seaweed Caulerpa cupressoides. Pharmacol. Rep., 64, 282–292. 81. Kim, J.K.; Cho, M.L.; Karnjanapratum, S.; Shin, I.S.; You, S.G. (2011). In vitro and in vivo immunomodulatory activity of sulfated polysaccharides from Enteromorpha prolifera. Int. J. Biol.Macromol., 49, 1051–1058. 82. Hassan, S.; Abd El-Twab, S.; Hetta, M.; Mahmoud, B. (2011). Improvement of lipid profile and antioxidant of hypercholesterolemic albino rats by polysaccharides extracted from the green alga Ulva lactuca Linnaeus. Saudi J. Biologic. Sci., 18, 333–340. 122 83. Qi, H.; Huang, L.; Liu, X.; Liu, D.; Zhang, Q.; Liu, S. (2012). Antihyperlipidemic activity of high sulfate content derivative of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Chlorophyta). Carbohydr.Polym., 87, 1637–1640. 84. Qi, H.; Liu, X.; Zhang, J.; Duan, Y.; Wang, X.; Zhang, Q. (2012). Synthesis and antihyperlipidemic activity of acetylated derivative of ulvan from Ulva pertusa. Int. J. Biol. Macromol., 50, 270–272. 85. Sathivel, A.; Raghavendran, H.R.B.; Srinivasan, P.; Devaki, T. (2008). Anti- peroxidative and anti-hyperlipidemic nature of Ulva lactuca crude polysaccharide on D-Galactosamine induced hepatitis in rats. Food Chem. Toxicol., 46, 3262–3267. 86. Komatsu, T.; Kido, N.; Sugiyama, T.; Yokochi, T. (2013). Antiviral activity of acidic polysaccharides from Coccomyxa gloeobotrydiformi, a green alga, against an in vitro human influenza A virus infection. Immunopharmacol. Immunotoxicol, 35, 1–7. 87. Lee, J.B.; Hayashi, K.; Hayashi, T.; Sankawa, U.; Maeda, M. (1999). Antiviral activities against HSV-1, HCMV, and HIV-1 of rhamnan sulfate from Monostroma latissimum. Planta Med., 65, 439–441. 88. Lee, J.B.; Hayashi, K.; Maeda, M.; Hayashi, T. (2004). Antiherpetic activities of sulfated polysaccharides from green algae. Planta Med., 70, 813–817. 89. Lee, J.B.; Koizumi, S.; Hayashi, K.; Hayashi, T. (2010). Structure of rhamnan sulfate from the green alga Monostroma nitidum and its anti-herpetic effect. Carbohydrate Polymers, 81, 572–577. 90. Ghosh, P.; Adhikari, U.; Ghosal, P.K.; Pujol, C.A.; Carlucci, M.J.; Damonte, E.B.; Ray, B. (2004). In vitro anti-herpetic activity of sulfated polysaccharide fractions from Caulerpa racemosa. Phytochemistry, 65, 3151–3157. 91. Pujol, C.A.; Ray, S.; Ray, B.; Damonte, E.B. (2012). Antiviral activity against dengue virus of diverse classes of algal sulfated polysaccharides. Int. J. Biol. Macromol., 51, 412–416. 92. Margret, R.J.; Kumaresan, S.; Ravikumar, S. (2009). A preliminary study on the anti-inflammatory activity of methanol extract of Ulva lactuca in rat. J. Environ. Biol., 30, 899–902. 123 93. Pires, C.L.; Rodrigues, S.D.; Bristot, D.; Gaeta, H.H.; Toyama, D.d.O.; Lobo Farias, W.R.; Toyama, M.H. (2013). Sulfated polysaccharide extracted of the green algae Caulerpa racemosa increase the enzymatic activity and paw edema induced by sPLA2 from Crotalus durissus terrificus venom. Rev. Bra. Farm. Braz. J. Pharm., 23, 635–643. 94. Pusey P. N. (1974). In Photon Correlation and Light Beating Spectroscopy, (H. Z. Cummings and E. R. Pike, eds.). Plenum Press, New York, 387-428. 95. Robic A.D.; Bertrand J.F.; Sassi Y.; Lerat M.; Lahaye J. (2009). Determination of the chemical composition of ulvan, a cell wall polysaccharide from Ulva spp. (Ulvales, Chlorophyta) by FT-IR and chemometrics. J. Appl. Phycol., 21, 451-456. 96. Masakuni Tako, Makie Tamanaha, Yoshiyuki Tamashiro, Shuntoku Uechi (2015). Structure of Ulvan Isolated from the Edible Green Seaweed, Ulva pertusa. Advances in Bioscience and Biotechnology, 6, 645-655 97. Lahaye Marc, Brunel Magali, Bonnin Estelle (1997). Fine chemical structure analysis of oligosaccharides produced by an ulvan-lyase degradation of the water-soluble cell-wall polysaccharides from Ulva sp. (Ulvales, Chlorophyta). Carbohydrate Research, 304, 325-333. 98. Nguyễn Duy Nhứt (2008). Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của polysacharide từ một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa. Luận án tiến sĩ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 99. Bùi Minh Lý, Thành Thị Thu Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Bilan M.I. và Usov A.I. (2012). Nghiên cứu cấu trúc của Fucoidan tách chiết từ tảo nâu Sargassum Polycystumn. Tạp chí hóa học, 50(4A), 215 – 218. 100. Hồ Đức Cường (2014). Nghiên cứu cấu trúc và khảo sát hoạt tính sinh học của fucoidan và alginate từ hai loài rong nâu Sargassum henslowianum và Sargassum swartzii của Việt Nam. Luận án Tiến sĩ Hóa học – Trường Đại học Bách khoa Hà Nội. 101. Nguyễn Đình Triệu (2001). Các phương pháp phân tích Vật lý và Hóa lý. Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật. 102. Steve W . Cui (2005). Food Carbohydrate: Chemistry, Physical Properties and Applications, CRC Press. 124 103. Edwin D. Becker (1969). High Resolution NMR. Theory and Chemical Applications. Academic press, INC. 104. Sanders J.K.M.; Constable E.C.; Hunter B.K. and Pearce C.M (1995). Modern NMR spectroscopy. Oxford University Press, 78-79. 105. Lahaye M. and Ray B. (1996). Cell-wall polysaccharides from the marine green alga Ulva rigida (Ulvales, Chlorophyta) - NMR analysis of ulvan oligosaccharides. Carbohydrate Research, 283, 161-173. 106. Lahaye M.; Inizan F.; Vigouroux J. (1998). NMR analysis of the chemical structure of ulvan and of ulvan-boron complex formation. Carbohydrate Polymers, 36, 239-249. 107. Lahaye Marc (1998). NMR spectroscopic characterisation of oligosaccharides from two Ulva rigida ulvan samples (Ulvales, Chlorophyta) degraded by a lyase. Carbohydrate Research, 314, 1–12. 108. Dell, A.; Reason, A. J.; Khoo, K.; Panico, M.; McDowell, R. A.; and Morris, H.R. (1994). Mass spectrometry of carbohydrate-containing biopolymers. Methods in Enzymology, 230, 108–132. 109. Tissot B.; Salpin J.-Y.; Martinez M.; Gaigeot M.P. and Daniel R. (2006). Differentiation of the fucoidan sulfated L-fucose isomers constituents by CE- ESIMS and molecular modeling. Carbohydrate Research, 341(5), 598– 609. 110. Nanditha Billa, Dylan Hubin-Barrows, Tylor Lahren, Lawrence P. Burkhard, (2014). Evaluation of micro-colorimetric lipid determination method with samples prepared using sonication and accelerated solvent extraction methods. Talanta, 119, 620–622. 111. Domon, B.; & Costello, C. E. (1988). A systematic nomenclature for carbohydrate fragmentations in FAB-MS/MS spectra of glycoconjugates. Glycoconjugate Journal, 5(4), 397–409 112. Yoshi aki Yuguchi, Bui Minh Ly, Bui Van Nguyen, Tran Thi Thanh Van and Thanh Thi Thu Thuy (2016). Study on Branched Structure Physiological Activity Relationship of Fucoidan. Chemistry Letter, 45(7), 840–842. 113. Thanh T.T.T.; Tran T.T.V.; Yuguchi Y.; Bui M.L. and Nguyen T.T. (2013). Structure of Fucoidan from Brown Seaweed Turbinaria ornata as Studied by 125 Electrospray Ionization Mass Spectrometry (ESIMS) and Small Angle X-ray Scattering (SAXS) Techniques. Mar. Drugs., 11, 2431-2443. 114. Ngô Đăng Nghĩa (1999). Nghiên cứu tối ưu hóa quy trình công nghệ sản xuất alginate từ rong mơ Việt Nam và ứng dụng vào một số lĩnh vực sản xuất. Luận án tiến sĩ - Đại học Thủy Sản Nha Trang. 115. Nguyễn Kim Đức (1991). Biến động hàm lượng acid alginic và chất lượng natri alginate của loài rong mơ (Sargassum) vùng biển Ḥn Chồng-Nha Trang. Tuyển tập Nghiên cứu biển, Viện Nghiên cứu biển, VII, 208-216 116. Nguyễn Duy Nhứt, Bùi Minh Lý, Nguyễn Mạnh Cường, Trần Văn Sung (2007). Phân lập và đặc điểm của fucoidan từ 5 loài rong mơ Miền Trung. Tạp chí Hóa học, 45(3), 339-345. 117. Thành Thị Thu Thủy, Trần Thị Thanh Thủy, Trần Thị Thanh Vân, Nguyễn Tiến Tài, Đặng Vũ Lương, Chu Đình Kính (2011). Isolation and structure of alginate extracted from brown seaweed Sargassum swartzii collected at Nha Trang. Hội nghị khoa học và công nghệ biển toàn quốc lần thứ 5, 142-143. 118. Phạm Đức Thịnh (2015). Nghiên cứu phân tích thành phần, cấu trúc hóa học của fucoidan có hoạt tính sinh học từ một số loài rong nâu ở Vịnh Nha Trang. Luận án Tiến sĩ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 119. Yoshiaki Yuguchi, Van Thi Thanh Tran, Ly Minh Bui, Shizuka Takebe, Shiho Suzuki, Nobukazu Nakajima, Shinichi Kitamura, Thuy Thi Thu Thanh (2016). Primary structure, conformation in aqueous solution, and intestinal immunomodulating activity of fucoidan from two brown seaweed species Sargassum crassifolium and Padina australis. Carbohydrate Polymers, 147, 69–78. 120. Thanh T.T.T.; Bui M.L.; Tran T.T.V.; Ngo V.Q.; Ho C.T.; Yue Z.; Carole S.D.; Bilan M.I.; Usov A.I. (2015). Anti-HIV activity of fucoidans from three brown seaweed species. Carbohydrate Polymers, 115, 122–128. 121. Trần Vĩnh Thiện (2009). Điều chế khảo sát cấu trúc và tính chất của alginate và oligosaccharide tách từ rong biển khu vực Bắc Hải Vân và ứng dụng của chúng. Luận án Tiến sĩ Hóa học – Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 126 122. Đặng Ngọc Thanh (chủ biên) và nhiều tác giả (2003). Biển Đông Sinh vật và sinh thái Biển, Tập IV. Nhà xuất bản Đại học Quốc Gia Hà Nội. 123. Dang Diem Hong, Hoang Minh Hien, Pham Ngoc Son (2007). Use of Vietnamese seaweed for functional food, medicine and biofertilizer. Journal Applied Phycology, 19(6), 817-826. 124. Dang Diem Hong, Hoang Minh Hien, Hoang Thi Lan Anh (2011). Studies on the Analgesic and Anti-inflammatory Activities of Sargassum swartzii (Turner) C. Agardh (Phaeophyta) and Ulva reticulata Forsskal (Chlorophyta) in Experiment Animal Models. African Journal of Biotechnology, 10(12), 2308- 2313. 125. Brading, J. E.; Georg-Plant, M.T; Hardy, D. (1954). The polysaccharide from the alga Ulva lactuca. Purification, hydrolysis, and methylation of the polysaccharide. J. Chem. Soc., 319-324. 126. Percival, E.; Wold, J. K. (1963). The acid polysaccharide from the green seaweed Ulva lactuca. Part II. The site of the ester sulphate. J. Chem. Soc., 5459-5468. 127. Costa C.; Alves A.; Pinto P.R.; Sousa R.A.; Silva E.A.; Reis, R.L.; Rodrigues A.E. (2012). Characterization of ulvan extracts to assess the effect of different steps in the extraction procedure. Carbohydrate Polymers, 88, 537–546. 128. Wenjun Mao, Xiaoxue Zang, Yi Li, Huijuan Zhang (2006). Sulfated polysaccharides from marine green algae Ulva conglobata and their anticoagulant activity. Journal of Applied Phycology, 18(1), 9-14. 129. Dalia F. Abd Elmegeed, Doa A. Gharee, Muhammed Elsayed and Muhammad El-Saadani (2014). Phytochemical constituents and bioscreening activities of green algae (Ulva lactuca). International Journal of Agricultural Policy and Research, 2(11), 373-378. 130. Quanbin Zhang, Zhongshan Zhang, FengWang, Xiaomei Wanga, Xiaolei Liud, Yun Houb, (2010). Extraction of the polysaccharides from ve algae and their potential antioxidant activity in vitro. Carbohydrate Polymers, 82, 118–121. 131. Hela Yaich, Haikel Garna, Souhail Besbes, Jean-Paul Barthélemy, Michel Paquot, Christophe Blecker, Hamadi Attia (2014). Impact of extraction 127 procedures on the chemical, rheological and textural properties of ulvan from Ulva lactuca of Tunisia coast. Food Hydrocolloids, 40, 53-63. 132. Mao, W.; Zang, X.; Li, Y.; Zhang, H. (2006). Sulfated polysaccharides from marine green algae Ulva conglobata and their anticoagulant activity. J. Appl. Phycol., 18, 9–14. 133. Qi, H.; Liu, X.; Ma, J.; Zhang, Q.; Li, Z. (2010). In intro antioxidant activity of acetylated derivatives of polysaccharide extracted from Ulva pertusa (Cholorophta). J. Med. Plants Res., 4, 2445–2451. 134. Qi, H.; Liu, X.; Wang, K.; Liu, D.; Huang, L.; Liu, S.; Zhang, Q. (2013). Subchronic toxicity study of ulvan from Ulva pertusa (Chlorophyta) in Wistar rats. Food Chem Toxicol., 62, 573–578. 135. You, S.G.; Tabarsa, M.; Han, J.H.; Kim, C.Y. (2012). Molecular characteristics and immunomodulatory activities of water-soluble sulfated polysaccharides from Ulva pertusa. Journal of Medicinal Food, 15(2), 135– 144. 136. Hanaa H.; Baky A.El.; Baz K.F.El and Batory G. S.El. (2009). Potential biological properties of sulfated polysaccharides extracted from macroalgae Ulva lactuca L. Academic Journal of Cancer Research, 2(1), 1-11. 137. AOAC International (1996). Official Methods of Analysis of the Association of Official Analytical Chemists. 16th edition, Gaithersburg, USA. 138. Blig, EB.; Dyer, W.J. (1959). A rapid method of total lipid extraction and purification. Can. J. Biochem., 37, 911-917. 139. Michel Dubois, Gilles K.A, Hamilton J.K, Rebers P.A, and Fred Smith, (1956). Colorimetric Method for Determination of Sugars and Related Substances. Anal. Chem., 28, 350-356. 140. Fujiwara-Arasaki T.; Mino N.; Kuroda M. (1984). The protein value in human nutrition of edible marine algae in Japan. Hydrobiologia, 116-117(1), 513- 516 141. Tang Yu-Qing, Kaiser Mahmood, Ruqyia Shehzadi, Muhammad Furqan Ashraf (2016). Ulva Lactuca and Its Polysaccharides: Food and Biomedical Aspects. Journal of Biology, Agriculture and Healthcare, 6(1), 140-151. 128 142. Monks A.; Scudiero D.; Skehan P.; Shoemake R.; Paull K.; Vistica D.; Hose C.; Langley J.; Cronise P.; Campbell H.; Mayo J.; Boyd M. (1991). Feasibility of a high-flux anticancer drug screen using a diverse panel of cultured human tumor cell lines. Journal of National Cancer Institute, 83(11), 757-766. 143. Anderson, L.O.; Barrowcliffe, T.W.; Holmer, E.; Johnson, E.A.; and Sims, G.E.C. (1976). Anticoagulant properties of heparin fractionated by affinity chromatography on matrix-bound antithrombin-3 and by gel-filtration. Thromb. Res., 9, 575–580. 144. Vanden B.D.A. and Vlietinck A.J. (1991). Methods in plant Biochemistry: Screening Methods for Antibacterial and Antiviral Agents from Higher Plants. Academic Press, London., 6, 47-69. 145. Prieto, P.; Pineda, M.; Anguilar, M. (1999). Spectrophotometric quantitation of antioxidant capacity through the formation of a Phosphomolybdenum Complex: Specific application to the determination of Vitamin E. Anal. Biochem., 269, 337-341 146. Zhu, Q.Y.; Hackman, R.M.; Ensunsa, J.L.; Holt, R.R.; Keen, C.L. (2002). Antioxidative activities of oolong tea. J. Agric Food Chem., 50, 6929–6934. 147. Phạm Thành Hổ (2006). Di truyền học, NXB Giáo dục. 148. Dodgson K.S. (1961). Determination of inorganic sulphate in studies on the enzymic and non-enzymic hydrolysis of carbohydrate and other sulphate esters. Biochem J., 78, 312-319. 149. Bitter, T.; Muir H.M. (1962). A Modified Uronic Acid Carbazole Reaction. Anal Biochem., 4, 330-334. 150. Bilan, M.I.; Vinogradova, E.V.; Shashkov, A.S.; Usov, A.I. (2007). Structure of a highly pyruvylated galactan sulfate from the pacific green alga Codium yezoense (Bryopsidales, Chlorophyta). Carbohydrate Research, 342, 586–596. 151. Thanh Thi Thu Thuy (2002). Structure of sulfated polysaccharide in aquarius solution. Doctoral Thesis. 152. Lihong Fan, Lan Jiang, Yongmei Xu, Yue Zhou, Yuan Shen, Weiguo Xie, Zhongheng Long, Jinping Zhou (2011). Synthesis and anticoagulant activity of sodium alginate sulfates. Carbohydrate Polymers, 83(4), 1797–1803. 129 153. Xiao-xiao Liu, Zhen-jiang Wan, Lin Shi, Xiao-xia Lu (2011). Preparation and antiherpetic activities of chemically modified polysaccharides from Polygonatum cyrtonema Hua. Carbohydrate Polymers, 83, 737–742. 154. Zhang Zhongshan, Wang Xiaomei, Yu Shuchi, Yin Li, Zhao Mingxing, Han Zhiping (2011). Synthesized oversulfated and acetylated derivatives of polysaccharide extractedfrom Enteromorpha linza and their potential antioxidant activity. International Journal of Biological Macromolecules, 49, 1012– 1015. 155. Luis A. Bello-Pérez, Edith Agama-Acevedo, Paul B. Zamudio-Flores, Guadalupe Mendez-Montealvo, Sandra L. Rodriguez-Ambriz (2010). Effect of low and high acetylation degree in the morphological, physicochemical and structural characteristics of barley starch. Food Science and Technology, 43, 1434-1440. 156. Ciancia, M.; Alberghina, J.; Ximena Arata, P.; Benavides, H.; Leliaert, F.; Verbruggen, H.; Manuel Estevez, J. (2012). Characterization of cell wall polysaccharides of the coencocytic green seaweed Byropsis plumose (Bropsidaceae, Chlorophyta) from the Argentine cost. J. Phycol., 48, 326–335. 157. Ciancia, M; Quintana, I; Vizcarguenaga, M.I.; Kasulin, L.; de Dios, A.; Estevez, J.M.; Cerezo, A.S. (2007). Polysaccharides from the green seaweeds Codium fragile and C. vermilara with controversial effects on hemostasis. Int. J. Biol. Macromol., 41, 641–649. 158. Yaich H, Garna H, Besbes S, Barthélemy J P, Paquot M, Blecker C, Attia H. (2014). Impact of extraction procedures on the chemical, rheological and textural properties of ulvan from Ulva lactuca of Tunisia coast. Food Hydrocolloids, 40, 53-63. 159. Wang, X.; Zhang, Z.; Yao, Z.; Zhao, M.; Qi, H. (2013). Sulfation, anticoagulant and antioxidant activities of polysaccharide from green algae Enteromorpha linza. Int. J. Biol. Macromol., 58, 225–230. 160. Camila F. B., Jorge A. G., Paulo A. S. M., Hugo V. (2007). Conformation of sulfated galactan and sulfated fucan in aqueous solutions. Implications to their anticoagulant activities. Journal of Molecular Graphics and Modelling, 6, 391-399. 130 161. Melo F.R, Pereira M.S, Foguel D, Mour P.A. (2004). Antithrombin-mediated anticoagulant activity of sulfated polysaccharides different mechanisms for heparin and sulfated galactans. J Biol Chem., 279, 20824–20835. 162. Santos Pereira Costa, M.S.; Costa, L.S.; Cordeiro, S.L.; Almeida-Lima, J.; Dantas-Santos, N.; Magalhaes, K.D.; Sabry, D.A.; Lopes Albuquerque, I.R.; Pereira, M.R.; et al (2012). Evaluating the possible anticoagulant and antioxidant effects of sulfated polysaccharides from the tropical green alga Caulerpa cupressoides var. flabellata. J. Appl. Phycol., 24, 1159–1167. 163. Mao, W.; Li, H.; Li, Y.; Zhang, H.; Qi, X.; Sun, H.; Chen, Y.; Guo, S. (2009). Chemical characteristic and anticoagulant activity of the sulfated polysaccharide isolated from Monostroma latissimum (Chlorophyta). Int. J. Biol. Macromol., 44, 70–74. 164. Debye, P. (1915). Scattering from non-crystalline substances. Annalen der Physik, 46, 809-823. 131 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Sắc ký đồ GC-FID phân tích thành phần đường của UR-N Phụ lục 2. Sắc ký đồ GC-FID phân tích thành phần đường của UL-H Phụ lục 3. Sắc ký đồ GC-FID phân tích thành phần đường của UL-N Phụ lục 4. Sắc ký đồ GC-FID phân tích thành phần đường của UL-K Phụ lục 5. Phổ 1H-NMR của UR-H Phụ lục 6. Phổ 13C-NMR của UR-H Phụ lục 7. Phổ COSY-NMR của UR-H Phụ lục 8. Phổ HMBC-NMR của UR-H Phụ lục 9. Phổ HSQC-NMR của UR-H Phụ lục 10. Phổ ESI-MS của UR-H Phụ lục 11. Phổ ESI-MS/MS ion mảnh [RhaSO3] - với m/z 243 của UR-H Phụ lục 12. Phổ COSY-NMR của UR-N Phụ lục 13. Phổ HSQC-NMR của UR-H Phụ lục 14. Phổ HMBC-NMR của UR-N Phụ lục 15. Phổ ESI-MS của UR-N Phụ lục 16. Phổ ESI-MS/MS ion mảnh [RhaSO3] - với m/z 243 của UR-N Phụ lục 17. Phổ 1H-NMR của UL-N Phụ lục 18. Phổ 13C-NMR của UL-N Phụ lục 19. Phổ COSY-NMR của UL-N Phụ lục 20. Phổ HSQC-NMR của UL-N Phụ lục 21. Phổ HMBC-NMR của UL-N Phụ lục 22. Phổ ESI-MS của UL-N Phụ lục 23. Phổ ESI-MS/MS ion mảnh [RhaSO3] - với m/z 243 của UL-N Phụ lục 24. Sắc ký đồ GPC của UL-H Phụ lục 25. Phổ COSY-NMR của UL-H Phụ lục 26. Phổ HSQC-NMR của UL-H Phụ lục 27. Phổ HMBC-NMR của UL-H Phụ lục 28. Phổ 13C-NMR của UR-S3 Phụ lục 29. Phổ COSY-NMR của UR-S Phụ lục 30. Phổ 1H-NMR của UR-Ac Phụ lục 31. Phổ 13C-NMR của UR-Ac Phụ lục 32. Hình ảnh thể hiện sự ức chế các dòng tế bào ung thư a) HepG2, b) MCF7 và c) Hela của ulvan UL-N với các nồng độ khác nhau.