Kỹ thuật gen trong sản Xuất vaccin DNA- Kỹ thuật gen trong sản Xuất DNA vaccin viờm gan B

o vệ môi trường chưa đồng loạt, môi trường đang kêu cứu, cũng như chính sự sống sự cân bằng các loài sinh vật trong hệ sinh thái. Hệ vi sinh vật gây bệnh cũng đồng thời trở nên phức tạp hơn. Ở đây trong phạm vi tiểu luận em muốn đề cập đến vấn đề khả năng chống chọi với các nguồn gây bệnh-Hệ thống miễn dịch của con người. Sự cố gắng vượt bậc của con người về khoa học trong những thế kỷ vừa qua đã giải quyết được rất nhiều vấn đề về sức khoẻ con người như sự phát triển ra vaccin và quá trình phát triển của vaccin, hay như hiện nay trong y học đã ứng dụng rất nhiều kỹ thuật hiện đại trong phòng , điều trị và chữa bệnh. Có rất nhiều bệnh hiểm nghèo đã được thanh toán (sởi, ho gà, uốn ván,…..). Đứng trước nhu cầu cần tạo ra một hành lang bảo vệ sức khoẻ cho cho mỗi người, không chỉ ngành Y, Dược. Mà còn các ngành kỹ thuật khác cũng đã rất nhiều phấn đấu và bước đầu có nhiều thành tựu có những thành tựu đáng kể như một ngành mới và rất nhiều triển vọng như công nghệ sinh học. Khi ở thế chủ động, con người sẽ phản tốt hơn do đã có sự chuẩn bị sẵn. Hệ thống miễn dịch của chúng ta cũng vậy, miễn dịch bẩm sinh đó là sự kết hợp hoạt động sinh học tuyệt vời trong cơ thể, nhưng có không ít nguồn gây bệnh mà hệ thống miễn dịch tự nhiên không kiểm soát được. Khi đó ta cần đưa mình vào thế chủ động-Miễn dịch chủ động. Con người đã luôn đặt mình vào thế chủ động, sự chủ động trong công tác bảo vệ sức khoẻ là vaccin. Ngày nay, miễn dịch học đã trở thành 1 ngành khoa học được phát triển cao và chiếm một vị trí đặc biệt quan trọng trong y học và sinh học. Kể từ khi có những phát kiến đầu tiên của Pasteur về vaccin, lịch sử miễn dịch học đã được dệt nên những phát minh to lớn mang dấu ấn thời đại, thúc đẩy sự phát triển nhanh chóng của nhiều lĩnh vực của sinh học và y học. Những phát minh về vaccin thế hệ mới là một điểm sáng, DNA vaccin là một ứng dụng của công nghệ DNA có nhiều ưu việt. MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI Xuất phát từ cách đặt vấn đề trên và kết hợp với yêu cầu của đề tài, em đã tiến hành tham khảo và tổng kết những vấn đề có liên quan đến việc nghiên cứu : “Kỹ thuật gen trong sản xuất vaccin DNA- Kỹ thuật gen trong sản xuất DNA vaccin viêm gan B”. PHẦN II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU I. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1. Miễn dịch Miễn dịch là trạng thái bảo vệ đặc biệt của cơ thể chống lại các yếu tố gây bệnh (VSV, độc tố VSV, các phân tử lạ,…..) khi chúng xâm nhập vào cơ thể. Tuỳ theo tính chất miễn dịch mà người ta chia ra miễn dịch bẩm sinh hay miễn dịch tiếp thu. a) Miễn dịch bẩm sinh (tự nhiên): Chủ yếu là miễn dịch không đặc hiệu có sẵn từ khi sinh ra mang tính di truyền trong các cá thể cùng loài. Nhiều loài động vật không mắc bệnh của người và ngược lại. - Ví dụ: Gà không mắc bệnh than trâu, bò không mắc bệnh giang mai và thương hàn của người. b) Miễn dịch tiếp thu: Miễn dịch tiếp thu Miễn dịch thụ động Miễn dịch chủ động Tự nhiên: - Truyền kháng thể ghép hoặc qua sữa mẹ Nhân tạo: aTruyền kháng huyết thanh Nhân tạo: - Tiêm vaccin hoặc truyền lympho bào hoặc lympho miễm dịch Tự nhiên: - Tiếp xúc ngẫu nhiên với kháng nguyên hoặc dị kháng nguyên 2. Vaccin. 2.1 Khái niệm Vaccin. Miễn dịch chủ động được tạo thành bởi kháng nguyên của các VSV hoặc độc tố của chúng khi được sử dụng-đó chính là vaccin. Một số vaccin sau lần tiêm đầu tiên gây ra đáp ứng, tuỳ thuộc vào khả năng đáp ứng miễn dịch nhanh hơn và ở mức độ cao hơn. Một số vaccin gây đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào, chẳng hạn như vaccin BBC, phòng bệnh lao. Sau khi tiêm đủ các mũi cơ bản, miến dịch sẽ duy trì ở mức cao trong nhiều tháng, nhiều năm và cho dù lượng kháng thể có thể giảm xuống nhưng cơ chế miễn dịch ở nhiều trường hợp vẫn rất nhạy cảm giúp cơ thể có thể đáp ứng rất nhanh khi tiếp xúc lại với mầm bệnh. Vaccin có thể được tạo từ vi khuẩn, virus hoặc độc tố của chúng hoặc được tái tổ hợp từ các kháng nguyên đặc hiệu (Ricombinant Vax) hoặc từ các gen tổng hợp nên kháng nguyên đặc hiệu (DNA vaccin) 2.2 Các vaccin được chế tạo từ vi khuẩn Các vaccin vi khuẩn bất hoạt là vaccin chứa toàn bộ vi sinh vật đã bị bất hoạt, như vaccin ho gà, vaccin thương hàn tiêm hoặc chỉ chứa các kháng nguyên đặc hiệu của vi khuẩn như vaccin chống phế cầu, não mô và Hemophilus influenza týp b. Một số vaccin bất hoạt có các tá chất làm tăng cường đáp ứng kháng thể. Đó là các tá chất như Phosphat hoặc hydroxyt nhóm trong của các vaccin hấp phụ chống bạch hầu-uốn ván. Vaccin sống giảm độc lực như vaccin BCG, thương hàn uống.Vaccin được chế tạo từ độc tố của vi khuẩn đã được làm giảm độc lực như vaccin bạch hầu, uốn ván,…… 2.3 Các vaccin được chế tạo từ virus: Các vaccin chứa toàn bộ virus: Vaccin bại liệt, vaccin chống viêm gan A, vaccin chứa các kháng nguyên đặc hiệu như vaccin cúm, vaccin viêm gan B,…. Vaccin virus sống giảm độc lực gồm các vaccin sởi, quai bị, thuỷ đậu, bại liệt (sabin), các vaccin này kích thích đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào tạo ra kháng thể lâu bền chỉ sau một liều dùng. Vaccin tái tổ hợp: với sự tiến bộ không ngừng của sinh học phân tử và các cải tiến liên tục nhằm tạo ra các vaccin an toàn,có hiệu quả cao. Các công ty sản xuất vaccin đã đổi mới công nghệ và sản xuất các vaccin tái tổ hợp chỉ lựa chọn các doạn gen có tính quyết định kháng nguyên cao, sau đó cấy vào vi sinh vật có khả năng tăng sinh nhanh và nhiều để sản xuất, các gen này tạo ra một vaccin tái tổ hợp có độ tinh khiết và tính sinh miễn dịch cao. Các vaccin tái tổ hợp đang được sử dụng phổ biến trên thtị trường là vaccin viêm gan B tái tổ hợp,….... 2.4 DNA vaccin Là một plasmid đơn bao gồm một Promotor, một trình tự cloning site cho gen quan tâm một đuôi PolyA được dùng như một trình tự kết thúc, một điểm Ori khởi đầu cho tái bản, một gen chỉ thị như là gen kháng ampicilin. DNA vaccin cũng có thể là một DNA trần hoặc là có vỏ nước hoặc là có vỏ là Lipid. 3. Công nghệ sản xuất DNA vaccin 3.1 DNA vaccin. DNA vaccin xuất hiện vào khoảng năm 1990 là một ứng dụng mới của công nghệ DNA. DNA vaccin là một plasmid kỹ thuật chứa những gen mã hoá protein cho những đáp ứng miễn dịch cần thiết. không giống như virus hay vi khuẩn sống DNA vaccin không lây nhiễm hoặc sao mã tạo virus mới không tổng hợp các protein khác ngoài những gen xác định trong plasmid. Vì vậy ưu điểm nổi bật của DNA vaccin là tính an toàn cao. Như đã nêu trên, cấu tạo DNA vaccin không đơn giản, nó gồm có: - 1 promotor. - Một trình tự cloning site phù hợp với các gen quan tâm. - Một đuôi Poly A làm trình tự kết thúc. - Một điểm Ori khởi đầu cho quá trình sao chép. - 1 gen chỉ thị như gen kháng ampicilin. Một điều thú vị khác ở DNA vaccin là không cần một phương thức đặc biệt để đưa plasmid vaccin vào cơ thể động vật nói chung và con người nói riêng, có thể miễn dịch với bệnh mà chỉ đơn giản bằng cách tiêm dung dịch muối trong đó có các plasmid lơ lửng trong dung dịch, và sự sản sinh của plasmid trong tế bào đích một cách dễ dàng, như nghiên cứu đầu năm 1994 các nhà nghiên cứu đã xác định có 5 cách cho sự sinh sản plasmid influenza virus trong cơ thể động vật: bơm qua mũi họng, tiêm vào bắp, ven, dưới da, hoặc bằng bắn gen. Tất cả các kỹ thuật đó đều được đáp ứng miễn dịch. Thêm vào đó sự triển khai có hiệu quả của plasmid làm cho DNA vaccin có lợi thế là kích thích cả miễn dịch của kháng thể trung gian (có liên quan đến B-lymphocytes) và tế bào miễn dịch trung gian (liên quan đến T-lymphocytes). Bởi vì DNA của vaccin mã hoá protein và giải phóng khỏi tế bào, thể thực bào tiếp nhận cho sự sản sinh kháng thể của tế bào B-lymphocytes. Cùng lúc, một số protein gắn vào bề mặt của tế bào đích và kích thích sự đáp ứng của tế bào T-lymphocytes. Và sau đó, khi mầm bệnh xuất hiện những kháng thể và T-lymphocytes đã sẵn sàng sử dụng để trung hoà protein của mầm bệnh và tiêu diệt mầm bệnh. DNA đã được thử nghiệm bảo vệ chống lại chuỗi influenza Salmonella typhi, sự truyền nhiễm HIV,……. 3.2 Công nghệ sản xuất. 3.2.1 Thiết kế DNA nguồn a) Mục đích của thiết kế DNA nguồn là tạo được : - DNA tạo kháng nguyên - Promotor - Trình tự kết thúc - Gen chỉ thị (resistant-marker gen: ampicilin) bằng cách tách chiết và tổng hợp nhân tạo (nếu gen đã biết trình tự). b) Cách tiến hành: P Phân lập và tách chiết DNA tổng số từ Vi sinh vật + Nuôi cấy trong môi trường lỏng ở điều kiện thích hợp để vi khuẩn phát triển ở pha lỏng (pha này phải đảm bảo 1ml có 106-108 tế bào). + Lấy 100ml: ly tâm với vận tốc 5000 vòng/phút, trong 10 phút, để lấy cặn tế bào. + Phá vỡ màng tế bào: - Để cặn VSV ở nhiệt độ -850C trong 30 phút -Nghiền tế bào trong N2 lỏng -860C (làm cứng tế bào dễ nghiền) + EDTA (Etylen Diamin Tetracaetic Acid) hấp thụ các iôn Mg2+ làm vỡ thành tế bào, đồng thời ức chế các enzym nucleaza. Hoặc - Đun sôi 15 phút - Ủ cặn tế bào với enzyl lysozyme để phân huỷ màng tế bào + Loại bỏ protein và RNA -Ủ dung dịch đã phá màng tế bào với dung dịch RNase, protease ở nhiệt độ 370C khoảng 1-2 giờ. - Để tách protein ta thêm vào hỗn hợp một dung dịch có tỷ lệ: isoamyl:ancohol:clorophoc = 2:4:1. -Kết tủa protein bằng cách ly tâm siêu tốc trong máy ly tâm lạnh +Thu DNA -Hoà trong cồn tuyệt đối ở nhiệt độ 0-40C. -Ủ trong 30 phút ở 40C kết tủa DNA -Ly tâm lạnh 12000-14000 vòng/phút trong 10 phút. -Bỏ dịch trong lấy kết tủa. -Rửa kết tủa DNA trong cồn 700. -Ly tâm lại sẽ thu được DNA có thể sử dụng ngay hoặc cho thêm nước khử ion giữ ở -200C có thể sử dụng trong 1-2 tháng P Phân lập và tách chiết mRNA từ VSV Quy trình tương tự như DNA, nhưng khi sau khi loại protein khỏi dịch thì ủ với enzym DNase để loại DNA Tách bằng sắc ký ái lực trên cột oligoT-cellulose. Do cấu trúc của phân tử mRNAcó đuôi Poly A: - Sử dụng các viên bi từ có gắn oligoT trên bề mặt. - Khi mRNA bám vào bề mặt các viên bi từ do liên kết bổ xung với oligoT - Ly tâm thu được các viên bi và tách được riêng mRNA 3.2.2 Kiểm tra độ tinh sạch của các mẫu DNA, RNA thu được a) Xác định độ tinh sạch và hàm lưọng bằng quang phổ từ ngoại P Xác định hàm lượng + Do DNA hấp thụ tia tử ngoại ở bước sóng = 260nm đo được các chỉ số khúc xạ. + Dựa vào chỉ số khúc xạ để tính hàm lượng DNA và RNA trong 1ml mẫu. Ví dụ chỉ số OD260nm=1 ta có kết quả: - DNA mạch kép có 50mg/ml. - DNA mạch đơn có 33mg/ml. - RNA có 40mg/ml Nên một cách tổng quát ta có: CDNA kép=50 Ađộ pha loãng CRNA =50Ađộ pha loãng P Xác định độ tinh sạch + Xác định DNA hấp thụ ánh sáng mạnh nhất ở = 260nm + Protein hấp thụ ở 260-280nm. Do vậy ta có tỷ lệ Trong đó: y là độ tinh sạch -Nếu y có giá trị từ 1.8-2.0 thì mẫu tinh sạch -Nếu mẫu chưa tinh sạch thì tủa lại protein hoặc DNA b) Kiểm tra độ tinh sạch bằng phương pháp điện di. P Nguyên tắc của phương pháp điện di + Acidnucleic là phân tử tích điện âm, trong điện trường có điện thế cường độ thích hợp, các phân tử RNA, DNA di chuyển về phía cực dương của điện trường. + Dùng tách chiết và tinh sạch DNA. + Chọn đoạn DNA tương ứng với gen cần: thực hiện phản ứng cắt với các RE để cắt nhỏ DNA thành nhiều đoạn. + Chạy điện di, sau đó dựa vào: khối lượng phân tử để tách lấy đoạn gen cần thiết (đối chiếu với thang DNA chuẩn). Có những phương pháp điện di trong nghiên cứu DNA, là điện di trên gel agar, polyacrylamid. 3.2.3 Chọn vector tách dòng (cloning vector) a) Mục đích: Chọn vector tách dòng (cloning vector) phù hợp với DNA nguồn về: + Kích thước + Thành phần + Promotor + Cloning site b) Cách tiến hành: P Khái niệm vector tách dòng. - Là những phân tử DNA có kích thước nhỏ (<10kbp) - Có khả năng tự tái bản độc lập, không phụ thuộc vào sự phân chia của hệ gen của tế bào. - Có khả năng cho gắn các đoạn DNA khác (có vị trí Cloning site) - Có những đặc điểm dễ nhận biết như mang gen tạo màu hoặc gen kháng sinh). -Được sử dụng để khuyếch đại số lượng bản sao của 1 gen hoặc trìng tự DNA nhất định, chuyển các gen ngoại lai vào tế bào hoặc sản xuất 1 lượng lớn protein từ các gen tách dòng. P Tách dòng gen(cloning). Là quá trình gài một gen hoặc DNA nào đó vào vector tách dòng, chuyển vào tế bào vật chủ để các vector đó tự nhân trong tế bào chủ, làm cho trong tế bào chủ có hàng nghìn vector tách dòng. Tế bào chủ phân chia tạo nên các dòng tế bào mang gen đã được cài gọi là tách dòng gen. P Các loại vector được sử dụng tách dòng. 4 Vector là Plasmid. + Mang đầy đủ đặc điểm của vector tách dòng. + Hiện nay thường sử dụng plasmid thế hệ 3 là vector đã được cải tiến có nhiều lợi thế như: - Có kích thước nhỏ - Có gen chỉ thị (kháng sinh, giới tính) - Có polycloning site: trình tự này cho phép nhiều RE có vị trí cắt đặc hiệu. - Cho phépcài đoạn DNA có kích thước 10 Kbp 4 Vector là Phage-Phage M13, Phage +Đã cải biến di truyền: - Cắt bớt gen không cần thiết - Cài thêm gen chỉ thị. - Thêm vị trí cắt cloning site. Cài DNA tái tổ hợp có sẵn trình tự gen vừa là gen chỉ thị vừa là gen có nhiều điểm cắt đặc hiệu. - Xâm nhập vào tế bào vật chủ nhanh và khả tái bản rất mạnh. - Cho phép cài đoạn DNA 30 Kbp. 4Vector là Cosmid. + Là vector lai từ một plasmid với trìh tự cos của phage . + Trình tự cos điều khiển đóng gói DNA của phage vào phần đầu của phage. + Cho phép cài gắn đoạn DNA có kích thước 40 Kbp. + Chỉ sử dụng cài ở sinh vật bậc thấp. 4Vector là Phagemid. +Là vector lai chủ yếu là phage và một vài gen đặc trưng của plasmid. Gồm có: - Điểm khởi đầu tái bản Ori. - Promotor. - Cloning site. - Các gen chỉ thị. + Cho phép cài đoạn DNA có kích thước 20 Kbp. 4Vector là NST nhân tạo của Vi Khuẩn (BAC). -Cài được những đoạn DNA có kích thước từ 300 Kbp trở lên. -Có thể nhân dòng tốt trong vi khuẩn. 4Vector là Ti-plasmid. 3.2.4 Tạo vector tái tổ hợp. a) DNA tái tổ hợp DNA tái tổ hợp là các đọan , các phân tử DNA đã được biến đổi về cấu trúc : sự biến đổi này có thể là sự cắt bớt ,thêm ,thay thế từ các phân tử DNA cùng nguồn hoặc khác nguồn. Vector mang DNA tái tổ hợp gọi là vector tái tổ hợp Các bước thiết lập DNA tái tổ hợp (DNA recombinant technology ) b) Tạo DNA nguồn Chọn vector tách dòng và chọn RE -Vector : phải có đặc điểm cấu trúc và kích thước phù hợp với tế bào chủ , đoạn DNA chèn vào dể đảm bảo tách dòng hiệu quả vì mỗi loại vector cho phép mang được một đoạn DNA với kích thước nhất định và chỉ được biểu hiện ở những té bào chủ thích hợp, đồng thời vector đó còn đảm bảo cho đoạn DNA đó tới và được ở tế bào đích - RE: phải chọn RE có thể cắt được ở trình tự gen cần đồng thời có thể cắt được ở trên vector tách dòng để có thể khớp đoạn DNA đó với vector tách dòng . c)Tạo vector tái tổ hợp : Tách lấy đoạn gen quan tâm(DNA insert): - Dùng các enzyme cắt (RE restriction enzyme) đặc hiệu để thu được đoạn DNA cần quan tâm. - Trộn DNA nguồn với vector tách dòng trong điều kiện thích hợp và có enzym cắt đặc hiệu , khi đó RE sẽ nhận biết trình tự cần cắt ở phân tử DNA nguồn và cắt vector tạo thành vòng mở, trong điều kiện cần thiết cho sự kết nối các gen đã cắt với vòng vector mở, trong đó có thể phải dùng E ligase nối hoặc các adapter phù hợp . 3.2.5 Biến nạp nhân tạo vector tái tổ hợp vào tế bào chủ a) Mục đích: Biến nạp và kiểm tra sự có mặt có hoặc không các gen đã thiết kế và gắn vào vector b) Cách tiến hành: Do đặc tính của vector tách dòng , khi được tiếp xúc với tế bào chủ ,vector tách dòng có khả năng xâm nhập vào tế bào chủ và tất nhiên mang theo DNA tái tổ hợp , thực hiện quá trình biến nạp. Vì vậy thực hiện biến nạp nhân tạo bằng cách tạo điều kiện tiếp xúc giữa plasmid tái tổ hợp với tế bào chủ Các vector tách dòng được nhân lên trong tế bào chủ với số lượng rất lớn. Có thể dùng tế bào E.coli làm tế bào chủ. Nuôi cấy E.coli trong môi trường có bổ xung chloramphenicol, số lượng plasmid trung bình trong một tế bào từ 20 plasmid tăng lên 3500-4000 trong vòng 12 giờ. Có thể dùng kỹ thuật PCR nhân vector tách dòng. Dùng các plasmid này chính là DNA vaccin. Khi đưa DNA vaccin vào cơ thể, DNA của vaccin sẽ sử dụng bộ máy di truyền của tế bào đích tổng hợp các protein quyết định kháng nguyên sẽ gây đáp ứng miễn dịch sinh kháng thể. 3.2.6 Sàng lọc và kiểm tra sự biểu hiện gen. + Sau thời gian thích hợp để RE cắt, và phản ứng nối xảy ra, trong hỗn hợp có DNA nguồn chưa cắt , DNA nguồn đã cắt nhưng chưa nối và DNA nguồn đã cắt, đã nối . + Để kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA quan tâm có trong vector tách dòng chưa hay chính là kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp ta có thể sử dụng phương pháp điện di trên thang DNA chuẩn + Thang DNA chuẩn được xây dựng trên cở sở khối lượng phân tử của các thành phần : - DNA nguồn chưa cắt - DNA nguồn đã cắt nhưng chưa nối tức là đoạn DNA càn chèn vào trong plasmid, có khối lượng phân tử xác định - DNA còn lại tức là những đoạn DNA cũng được cắt ra đồng thời nhưng không sử dụng cho mục đích tách dòng có thể có nhiều đoạn cùng được cắt ra với khối lượng khác nhau - DNA của plasmid có khối lượng phân tử xác định. - DNA của plasmid tái tổ hợp có khối lượng phân tử xác định là tổng của khối lượng phân tử đoạn DNA cần tách dòng với khối lượng lượng của plasmid Như vậy thang DNA chuẩn chỉ cần 4 mốc xác định (tức là không cần xây dựng thang DNA cho những đoạn DNA không quan tâm với nhiều phân lớp khối lượng ) + Cũng có thể kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp bằng cách dùng vector biểu hiện -Vector biểu hiện là một vector tách dòng nhưng khác ở chỗ, vector này có promotor mạnh đa năng cho phép gắn vào bất cứ gen nào cũng biểu hiện gen đó. Promotor này là CaM của virus gây khảm súp lơ : CaMV + Nhân plasmid tái tổ hợp nhờ kĩ thuật PCR, chuyển các plasmid vào tế bào chủ để được nhân lên với số lượng lớn đây là mục đích của quá trình sản xuất . 4. Một số ứng dụng của công nghệ sản xuất vaccin DNA_DNA vaccin HBV. 4.1 Những hiểu biết về virus viêm gan B (HBV) 4.1.1 Hình thể và cấu trúc virus viêm gan B a) Hình thể -Hạt HBV hoàn chỉnh có hình cầu nhỏ, đường kính 42 nm. -Gồm 3 lớp vỏ: lớp ngoài dày khoảng 7nm, lớp vỏ capxid hình hộp đường kính 27-28nm và lõi chứa bộ gen virus. Hình 1: Mô hình các hạt virus viêm gan B, HBs hình ống và HBs=20nm hình cầu RT-transcriptaza phiên mã ngược; TP: protein kết thúc (Albin C, Robinson W.S., J.Virol.34, 1980, 207-302). b) Cấu trúc DNA-lõi virus + Bộ gen của HBV là một mạch DNA vòng, kích thước 3200bp. Cấu trúc mạch kép không hoàn toàn: - Mạch dài là mạch mã hoá (mạch âm) khoảng 3.182 NuRNA. - Mạch ngắn: là mạch dương dài 50-80% chiều dài mạch âm. + Bộ gen có 4 gen, nhưng vùng gen S được quan tâm vì đây là vùng gen mã hoá cho quyết định kháng nguyên bề mặt của HBV: HBsAg (Hepatits Bsurface Antigen) -Gen S: mã hoá cho các chuỗi polypeptid chính trung bình và dài của bao ngoài. Gen S có 3 đơn vị mã khởi điểm (Start codon) khác nhau ở các nucleotid: 2.848, 3.172 và 155. Vì vậy có 3 vùng gen khác nhau là PreS1, PreS2 và S. - Vùng S và PreS2 có chiều dài cố định - Vùng PreS2 có chiều dài thay đổi tuỳ từng phân typ khác nhau. + Đoạn gen S tổng hợp protein S (Small) dài 226 aa. Đây là protein chủ yếu vì nó chiếm đa số. Vùng gen S có ít nhất 5 quyết định kháng nguyên (antigenic determinant) HBsAg + Đoạn gen S và PreS2 tổng hợp protein M (Medium) có 281 aa. Vùng PreS2 có vai trò giúp virus bám dính và xâm nhập vào trong tế bào gan. 4.1.2 Kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg) HBsAg là kháng nguyên bề mặt của HBV, xuất hiện sớm trước khi có triệu chứng lâm sàng, tăng cao đần và biến mất sau 4-8 tuần kể từ khi có triệu chứng. Nếu sau 6 tháng mà vẫn còn HBsAg thì có nguy cơ thành người mang HBsAg mãn tính. Sự hiện diện của HBsAg trong huyết thanh chứng tỏ có DNA của virus trong tế bào gan Hình 2: Quá trình xâm nhiễm của HBV. 4.2 Kỹ thuật gen trong sản xuất DNA vaccin HBV. Căn cứ vào những hiểu biết về HBV và kỹ thuật DNA đã có những thế vaccin trước mang nhiều đặc điểm tốt như vaccin viêm gan B sản xuất từ huyết tương người nhiễm HBV, vaccin viêm gan B tái tổ hợp DNA mà tế bào nhận là tế bào nấm men Sacchramyces Cerevisiae và tế bào buồng trứng của chuột nhắt vàng Trung Quốc. Trong tiểu luận này em muốn áp dụng công nghệ DNA vào việc sản xuất vaccin DNA có một số điểm như sau: Kỹ thuật như đã trình bày ở phần công nghệ sản xuất DNA vaccin (như dã trình bày ở mục 3.2).Trong đó: +DNA nguồn: gồm vùng gen PreS2 và gen S đã phân lập và tách chiết. +Dùng một vector tách dòng là một vector plasmid +Dùng tế bào nhận là E.coli. Nuôi cấy E.coli trong môi trường có bổ sung Chloramphenicol, số lượng plasmid trung bình từ 20 plasmid tăng lên 3500-4000 plasmid trong vòng 12 giờ. Vaccin có chứa vùng tiền -S2+S có tính miễn dịch cao hơn ở các đối tượng có đáp ứng miễn dịch và những người không có đáp ứng do nguồn gốc di truyền. 4.3 Đánh giá về DNA vaccin. + Là một ứng dụng hiện đại của công nghệ DNA. + Có tính khả thi + Có khả năng áp dụng với nhiều đối tượng. Tương lai sẽ là một thế hệ vaccin rẻ tiền, đáp ứng miễn dịch cao. + Phương thức đưa vào cơ thể đơn giản (như đã trình bày phần 3.1) Chỉ chứa DNA mã hoá phần quyết định định phần kháng nguyên nên rất an toàn. Tính an toàn và hiệu quả là đặc điểm nổi bật của DNA vaccin. Hình 3: Đáp ứng miễn dịch của tế bào Lympho với kháng nguyên của vaccin. 5. Một số thành tựu của kỹ thuật gen. Công nghệ DNA đã dược ứng dụng trong y học như sản xuất: Insulin, Hocmon sinh trưởng, Interferon, các loại vaccin thế hệ mới,……. Một số thành tựu đã đạt được trong quá trình sản xuất vaccin: 5.1 Vaccin tái tổ hợp từ nấm men: Vaccin tái tổ hợp có được bằng cách cloning HBV với týp huyết thanh adw2 trên tế bào nấm men (Sacchramyces Cerevisiae) đã thử nghiệm thực địa lâm sàng trong 3 năm từ 1984 và đến năm 1989 đã phân phối được 4.5 triệu liều. Hơn 90% lượng kháng sing được sản xuất bởi vaccin tái tổ hợp là kháng thể “a” đặc hiệu và có khả năng bảo vệ giống như vaccin làm từ huyết tương người. Một nhóm người Thái Lan đã tiêm Engerix B (3 liều ở các tháng0, 1 và 6) cho 40 trẻ sơ sinh từ 28 đến 37 tuần tuổi thai và nặng 2000 gam hoặc nhẹ hơn, tỷ lệ đáp ứng miễn dịch tháng thứ 9 là 88%, không có ảnh hưởng rõ rệt do tuổi thai, trọng lượng hoặc sự có mặt của bất kỳ điều kiện bệnh lý nào trong thời gian tiêm nhiễm miễn dịch . Một nghiên cứu của Canada nhằm so sánh tính miễn dịch của 2 loại vaccin tái tổ hợp, Recombivax-HB với liều 10 và Engerix-B với liều 20. Tỷ lệ miễn dchj là 89% và 100%; GMT rất dao động ở từng người song 2 hoặc 3 lần cao hơn khi tiêm Engerix-B có lẽ do sự về liều tiêm, tuy nhiên không có sự khác biệt đáng kể về tính miễn dịch. 5.2 Vaccin táitổ hợp từ nấm men có chứa vùng tiền-S. Sau khi làm thử nghiệm trên súc vật thí nghiệm, một vaccin tái tổ hợp có chứa vùng tiền –S2 + S đã được phát triển ở Mỹ. Những thành phần mới của vaccin phải làm cho vaccin có tính miễn dịch cao hơn ở các đối tượng có đáp ứng miễn dịch do nguồn gốc di truyền. Loại vaccin mới này (tiền –S2 + S) được thử nghiệm so sánh với Recombivax do một nhóm nghiên cứu ở Mỹ thực hiện; vaccin đã được tiêm cho 104 nam thanh niên với 3 mũi vào các tháng 0, 1 và 6 với liều tiêm 12, 24 và 48. Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch là 100% sau 3 mũi tiêm. Ở tháng thứ 7, GTM của những người được tiêm vaccin tiền –S2 + S là 2-4 lần cao hơn so với vaccin khác và không có mối liên quan nào với các liều tiêm. Anti-pre-S2 có mặt trong 91% sau liều thứ 3 với hiệu giá tương đối cao. 5.3 Các vaccin tái tổ hợp sản xuất trên tế bào động vật. Các vaccin cũng đã được phát triển dựa trên những nguyên lý tương tự: Sinh sản ra các kháng thể kháng S và pre-S2. Vaccin của Pasteur Merieux sản xuất cũng được tiêm cho 482 người thanh niên với 4 liều khác nhau (2, 5, 10 và 20). Vaccin này gây đáp ứng miễn dịch tương tự như vaccin làm từ huyết tương, mặc dù liều 2 và 5 cho sự đáp ứng miễn dịchthấp hơn, mặt khác việc sản sinh ra các kháng thể kháng Pre-S2 cao hơn đáng kể và nhanh hơn so với vaccin huyết tương. Cuối cùng thì không có sự xuất hiện của kháng thể kháng albumin và gan chứng tỏ vaccin an toàn. Viện vaccin Pasteur đã tiến hành nghiên cứu ở Dakar so với vaccin huyết tương của họ, Hevac B có chứa 1-2% protein pre-S2 và vaccin tái tổ hợp mới của họ sản xuất trên tế bào trứng chuột đất vàng Trung Quốc, Genhevac B có chứa 20% protein pre-S2; 220 trẻ em Senegal được tiêm 3 liều 5 Hevac hoặc 20 Genhevac. Tỷ lệ đáp ứng miễn dịch là 100% với GMT là 3864 và 2845 mIU/ml. Kháng thể kháng pre-S2 xuất hiện ở 63.8% và 98.3% trẻ nhỏ với GMT cao hơn đối với Genhevac (1295 so với 119 mIU/ml). Kháng thể kháng nguyên “a” đặc hiệu có 84.2% và 98.4% trẻ. Cũng chính vaccin này đã được sử dụng một cách thành công dể tiêm chủng cho trẻ em ở Polynesia Pháop, một vùng dịch lưu hành cao, lịch tiêm 0, 1 và 6 cho tỷ lệ đáp ứng miễn dịch là 100% và GMT-1253mIU/ml. Kết quả tương tự cũng thu được ở Pháp trên trẻ sơ sinh của các bà mẹ HBsAg dương tính hoặc anti-HBc dương tính. Sau 3 mũi tiêm liều 20 Genhevac, tỷ lệ đáp ứng miễn dịch là 100% đối với anti-HBs và kháng thể pre-S2; hơn 90% trẻ có anti-HBs với hiệu giá cao hơn 1000mIU/ml chứng tỏ sự miễn dịch sẽ kéo dài. Một vaccin tái tổ hợp khác do một phòng thí nghiệm của Mỹ nghiên cứu cũng trên chuột đất vàng Trung Quốc có chứa 3 loại protein bề mặt S, pre-S1. Thực địa lâm sàng tiến hành tại Singapore trên người lớn cho thấy 100% có đáp ứng miễn dịch và GMT là 2687mIU/ml sau 3 liều 10 chứng tỏ có sự đáp ứng miễn dịch kéo dài. 5.4 Phối hợp hai loại vaccin. Không có sự phản đối nào khi dùng 2 loại vaccin huyết tương và tái tổ hợp nối tiếp nhau như nghiên cứu ở Đài Loan đã chứng minh: 2 nhóm 54 học sinh đã được tiêm 3 liều vaccin huyết tương lúc còn nhỏ được tiêm một liều nhắc lại hoặc là vaccin huyết tương, hoặc là vaccin tái tổ hợp. GMT tăng từ 281 lên 19952mIU/mlcđối với vaccin huyyét tương, và từ 195 lên 51289mIU/ml đối với vaccin tái tổ hợp, sự khác nhau về hiệu giá có thể giải thích do sự khác biệt về liều tiêm (5 và 20). PHẦN III KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Sức khoẻ luôn luôn là một vấn đề được quan tâm hàng đầu trong mọi ngành nghè nói chung và y học nói riêng. Song để đạt được hiểu quả cao hơn nữa đáp ứng được nhu cầu được bảo vệ hơn nữa về mặt sức khoẻ của con người, cần có sự phát triển đi trước của các ngành mũi nhọn có tính chất quyết định như công nghệ sinh học cụ thể là công nghệ sinh học phân tử, vi sinh,…..Công nghệ tin học,….. Với mong muốn được tiếp cận hơn nữa với khoa học hiện đại để được thực sự làm được một việc gì đó có ích, em mong được trở thành một tế bào khoẻ mạnh có nhiều đặc trưng tốt đóng góp một phần nhỏ vào sự vững mạnh của cơ thể lớn-sự đi lên của xã hội. Trong thời gian làm tiểu luận em đã học hỏi được nhiều bổ ích, do kiến thức và thời gian có hạn bài viết không tránh được sai sót, mong được sự giúp đỡ, chỉ bảo và tạo điều kiện của thầy để em có thể làm tiểu luận hoàn thiện hơn nữa. Em xin cảm ơn thầy đã tạo điều kiện cho chúng em tìm hiểu, sự hiểu biết và có niềm say mê học hỏi lĩnh vực này. Em sẽ cố gắng đầu tư thời gian thích đáng để mở rộng hiểu biết hướng tới chân trời khoa học còn đang rộng mở. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. DNA technology I.Eđwanr Alcamo 2. Gene Cloning an introduction-T.A.Brown 3. Cơ sở di truyền phân tử và kỹ thuật gen-ĐHBK HN. Tiến sĩ Khuất Hữu Thanh. 4. Vi sinh vật học-Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phan Văn Ty 5. Bệnh viêm gan B và vaccin dự phòng-Tiến sĩ Trịnh Quân Huấn. 6. Viêm gen do virus-Ngô Thu Vân. 7. Di truyền học đại cương-N.P.Đubinin, người dịch Phan Cự Nhân. 8. Di truyền học-Phạm Thành Hổ. MỤC LỤC PHẦN I: MỞ ĐẦU 1 ĐẶT VẤN ĐỀ. 1 MỤC ĐÍCH ĐỀ TÀI 2 PHẦN II: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 I. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2 1. Miễn dịch 3 2. Vaccin. 4 2.1 Khái niệm Vaccin. 4 2.2 Các vaccin được chế tạo từ vi khuẩn 4 2.3 Các vaccin được chế tạo từ virus 4 2.4 DNA vaccin 5 3. Công nghệ sản xuất DNA vaccin 5 3.1 DNA vaccin. 5 3.2 Công nghệ sản xuất. 6 3.2.1 Thiết kế DNA nguồn 6 3.2.2 Kiểm tra độ tinh sạch của các mẫu DNA, RNA thu được 8 3.2.3 Chọn vector tách dòng (cloning vector) 9 3.2.4 Tạo vector tái tổ hợp. 11 3.2.5 Biến nạp nhân tạo vector tái tổ hợp vào tế bào chủ 11 3.2.6 Sàng lọc và kiểm tra sự biểu hiện gen 12 4. Một số ứng dụng của công nghệ sản xuất vaccin DNA_DNA vaccin HBV. 13 4.1 Những hiểu biết về virus viêm gan B (HBV) 13 4.1.1 Hình thể và cấu trúc virus viêm gan B 13 4.1.2 Kháng nguyên bề mặt HBV (HBsAg) 15 4.2 Kỹ thuật gen trong sản xuất DNA vaccin HBV. 15 4.3 Đánh giá về DNA vaccin. 16 5. Một số thành tựu của kỹ thuật gen. 18 5.1 Vaccin tái tổ hợp từ nấm men: 18 5.2 Vaccin táitổ hợp từ nấm men có chứa vùng tiền-S. 18 5.3 Các vaccin tái tổ hợp sản xuất trên tế bào động vật. 19 5.4 Phối hợp hai loại vaccin. 20 PHẦN III: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 21 TÀI LIỆU THAM KHẢO 22 ._.