Kiểm tra tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của vi khuẩn E.coli và Salmonella SP phân lập từ phân lợn con ỉa phân trắng

Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………i BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI PHÙNG THỊ MINH KIỂM TRA TÍNH MẪN CẢM, TÍNH KHÁNG THUỐC CỦA VI KHUẨN E.COLI VÀ SALMONELLA SP PHÂN LẬP TỪ PHÂN LỢN CON ỈA PHÂN TRẮNG LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : Thú y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học : PGS. TS. BÙI THỊ THO HÀ NỘI - 2008 i LỜI CAM ĐOAN Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Phùng Thị Minh ii LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành cám ơn Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội, khoa Sau đại học, khoa Thú y đã quan tâm, tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tôi trong quá trình học tập và thực hiện đề tài. Tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới cô hướng dẫn khoa học PGS.TS. Bùi Thị Tho và các thầy trong bộ môn Nội – Chẩn – Dược - Độc chất đã tận tình giúp đỡ, hướng dẫn tôi trong quá trình nghiên cứu và xây dựng luận văn. Tôi xin chân thành cám ơn Đảng uỷ, Ban giám hiệu, Phòng Quản trị - Đời sống, Khoa Chăn nuôi – Thú y Trường Cao đẳng Nông Nghiệp và PTNT Bắc Bộ đã tạo điều kiện cho tôi trong quá trình học tập và hoàn thành luận văn này Tôi xin chân thành cám ơn bộ môn vi trùng-Trung tâm Chẩn đoán thú y Trung ương, tập thể cán bộ công nhân làm việc tại trại lợn Hoàng Liễn đã hướng dẫn, giúp đỡ và tạo điều kiện tốt nhất cho chúng tôi thực hiện đề tài. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân, bạn bè, những người luôn tạo điều kiện, động viên, giúp đỡ tôi trong quá trình học tập, nghiên cứu cũng như hoàn thành luận văn này. iii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt v Danh mục các bảng vi Danh mục biểu đồ vii 1. Đặt vấn đề i 1.1. Tính cấp thiết của đề tài 1 1.2. Mục đích của đề tài 2 2. Tổng quan tài liệu 3 2.1. Hệ vi sinh vật đường ruột 3 2.2. Bệnh lợn con phân trắng 9 2.3. Một số hiểu biết về kháng sinh 17 2.4. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn 19 3. Đối tượng - nội dung - phương pháp nghiên cứu 25 3.1. Đối tượng 26 3.2. Nội dung 26 3.3. Nguyên liệu 26 3.4. Phương pháp thí nghiệm 29 3.5. Phương pháp sử lý số liệu 34 4. Kết quả thảo luận 35 4.1. Xác định sự biến động về số lượng, số loại vi khuẩn hiếu khí trong phân lợn con theo mẹ ở trạng thái bình thường và bị bệnh LCPT 35 iv 4.1.1. Kết quả kiểm tra số lượng, tỷ lệ các loại vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn con theo mẹ ở trạng thái bình thường. 36 4.1.2. Kết quả kiểm tra số lượng, tỷ lệ các loại vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT 40 4.1.3. Sự biến động về số lượng, số loại vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong phân lợn con theo mẹ bình thường và bị bệnh LCPT 43 4.2. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli và Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 49 4.2.1. Kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập được từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 49 4.2.2. Kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thínghiệm 53 4.3. Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của các chủng E.coli và Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 56 4.3.1. Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của các chủng E.coli phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với thuốc thí nghiệm 57 4.3.2 . Kết quả kiểm tra tính kháng thuốc của các chủng Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm. 60 4.4. Kết quả điều trị thử nghiệm bệnh LCPT với các thuốc Colistin - 1200, Hamcoli – S, Genta – Tylodex, Kanamycin 10% 64 5. Kết luận - Đề nghị 70 5.1. Kết luận 70 5.2. Đề nghị 71 Tài liệu tham khảo 73 v vi DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết đầy đủ Dạng S Dạng Smouth Dạng R Dạng Rough DNA Deoxyribonucleic acid E. coli Escherichia coli Gr- Gram âm Gr+ Gram dương LCPT Lợn con phân trắng H High I Intermediate R Resistant vii DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1. Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn 34 4.1. Số lượng, tỷ lệ một số vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong phân lợn con theo mẹ ở trạng thái khoẻ mạnh bình thường 37 4.2. Số lượng, tỷ lệ một số vi khuẩn hiếu thường gặp trong phân lợn con khi bị bệnh LCPT. 41 4.3. Sự biến động của 4 loại vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT so với bình thường 44 4.4. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 51 4.5. Kết quả kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng Salmonell sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 55 4.6. Kết quả kiểm tra tính đơn kháng của các chủng E.coli phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 57 4.7. Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các chủng E.coli phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 60 4.8. Kết quả kiểm tra tính đơn kháng của các chủng Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 61 viii 4.9. Kết quả kiểm tra tính đa kháng của các chủng Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm. 63 4.10. Kết quả điều trị bệnh LCPT 66 ix DANH MỤC BIỂU ĐỒ STT Tên biểu đồ Trang 4.1. Sự biến động của 4 loại vi khuẩn hiếu khí thường gặp trong phân lợn con theo mẹ mắc bệnh LCPT so với bình thường. 46 4.2. Tỷ lệ mẫn cảm của của các chủng E.coli phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm. 52 4.3. Tỷ lệ mẫn cảm của các chủng Salmonella sp phân lập từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với các thuốc thí nghiệm 56 4.4. Tỷ lệ điều trị khỏi của 4 phác đồ điều trị 67 4.5. Thời gian điều trị khỏi của 4 phác đồ điều trị 68 4.6. Tỷ lệ tái phát sau khi điều trị khỏi ở 4 phác đò điều trị 64 1 1. ĐẶT VẤN ĐỀ 1.1. Tính cấp thiết của đề tài Hiện nay, chăn nuôi ngày càng chiếm vai trò quan trọng trong nền sản xuất Nông nghiệp, chăn nuôi lợn là ngành phát triển hơn cả. Tuy nhiên chăn nuôi lợn theo hướng công nghiệp cũng còn nhiều vấn đề nan giải mà nổi lên là tình hình dịch bệnh và nguyên tắc sử dụng thuốc trong điều trị bệnh tại các cơ sở chăn nuôi. Dịch bệnh luôn là mối quan tâm hàng đầu, quyết định sự thành công hay thất bại của mỗi trang trại. Trong chăn nuôi lợn sinh sản, hội chứng tiêu chảy (HCTC) là hiện tượng hay gặp nhất và đáng ngại nhất. Bệnh có thể gặp ở mọi nơi, mọi lúc trên tất cả các lứa tuổi của lợn, gây thiệt hại kinh tế đáng kể cho ngành chăn nuôi. Ở lợn con theo mẹ được gọi là bệnh lợn con phân trắng (LCPT). Để phòng, trị bệnh nói chung và LCPT nói riêng rất nhiều kháng sinh và thuốc hóa học trị liệu đã được đưa vào sử dụng. Tuy nhiên việc sử dụng lan tràn có phần lạm dụng thuốc trong điều trị bệnh tại các cơ sở chăn nuôi đã gây lên hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn. Hiện tượng kháng thuốc ngày càng có chiều hướng gia tăng, nó không chỉ gây thiệt hại về mặt kinh tế, làm giảm hiệu quả điều trị bệnh mà còn làm người chăn nuôi lúng túng trong việc chọn lựa kháng sinh phù hợp. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn thực sự là mối đe dọa sức khỏe cộng đồng bởi vi có những vi khuẩn kháng thuốc của vật nuôi sẽ truyền khả năng kháng thuốc cho các vi khuẩn sang gây bệnh nguy hiểm trên người thông qua nhiều con đường khác nhau. Như vậy vấn đề dùng thuốc gì, dùng như thế nào để giúp cho cơ sở và người chăn nuôi vừa có hiệu quả kinh tế, vừa cải thiện được tính kháng thuốc của vi khuẩn gây bệnh đang được người chăn nuôi và cả xã hội quan tâm. Góp phần kết hợp lý thuyết với thực tiễn sản xuất để hạn chế được sự 2 kháng thuốc của vi khuẩn, dưới sự hướng dẫn của PGS.TS Bùi Thị Tho chúng tôi đã tiến hành thực hiện đề tài: “ Kiểm tra tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của vi khuẩn E.coli và Salmonella sp phân lập từ phân lợn con ỉa phân trắng” 1.2. Mục đích của đề tài - Từ kết quả nghiên cứu sẽ giúp trại lợn Hoàng Liễn có cơ sở khoa học lựa chọn kháng sinh có tính mẫn cảm cao với hai loại vi khuẩn E.coli và Salmonella để điều trị bệnh lợn con phân trắng tại trại. 1.3. Địa điểm thực hiện đề tài - Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - Độc chất, Khoa Thú Y, Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội. - Phòng vi khuẩn học thuộc Trung tâm chẩn đoán Quốc gia - Trang trại chăn nuôi lợn siêu nạc Hoàng Liễn – Vũ Thư – Thái Bình. 3 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Hệ vi sinh vật đường ruột 2.1.1. Những nghiên cứu về hệ vi sinh vật đường ruột Đó là một chỉnh thể hữu cơ có sự tồn tại của các yếu tố: môi trường, hệ vi sinh vật và mối quan hệ giữa chúng. Ở trạng thái sinh lý bình thường của con vật, hệ vi sinh vật đường ruột có sự cân bằng. Điều này có được là nhờ sự tương tác giữa vi sinh vật và môi trường đường tiêu hoá, giữa các vi sinh vật trong khu hệ vi sinh vật đường ruột với nhau. Theo Lê Khắc Thận (1974)[20] những vi khuẩn dường ruột giữ chức năng nhất định trong quá trình tiêu hoá và có vai trò sinh lý quan trọng đối với cơ thể. Ở trạng thái sinh lý hệ vi sinh vật đường tiêu hoá và cơ thể luôn ở trạng thái cân bằng, sự cân bằng này là cần thiết đối với cơ thể Nhưng khi có sự tác động của các yếu tố bên ngoài vào cơ thể làm cho trạng thái cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột bị phá vỡ, vi sinh vật có hại hoặc vi sinh vật gây bệnh sẽ tăng cường độc lực sinh ra tiêu chảy. Như vậy loạn khuẩn thể hiện sự biến động về số lượng và chất lượng của các nhóm vi khuẩn. Có thể một loài nào đó tăng về số lượng hoặc tăng về độc lực, cũng có thể có sự đột biến hay sự bội nhiễm của vi khuẩn. 2.1.2. Họ vi khuẩn đường ruột Họ vi khuẩn đường ruột là một họ lớn, bao gồm các trực khuẩn gram âm, sống ở ống tiêu hoá của người và động vật. Chúng có thể gây bệnh hoặc không gây bệnh. Chúng có chung một đặc tính: không có oxydaza, hiếu khí 4 hoặc kỵ khí tuỳ tiện, có thể mọc ở các môi trường dinh dưỡng thông thường, có khả năng khử Nitrat thành Nitrit, lên men sinh axit, có hoặc không sinh hơi một số loại đường. Hệ vi khuẩn đường ruột bao gồm hai nhóm vi khuẩn lớn. - Nhóm vi khuẩn vãng lai: chúng xâm nhập vào cơ thể qua thức ăn nước uống bao gồm: Staphylococcus, Streptococus, Bacillus subtilis.... - Nhóm vi khuẩn thường trú: Nhóm vi khuẩn này thích ứng với môi trường của đường tiêu hoá, trở thành vi khuẩn bắt buộc gồm: Escherichia coli, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Proteus... Đoàn Thị Kim Dung (2004) [2] khi nghiên cứu biến động về số loại và số lượng vi khuẩn hiếu khí ở phân lợn tiêu chảy đã kết luận: bình thường ở lợn giai đoạn 1 đến 21 ngày tuổi trong phân có 5 loại vi khuẩn, số lượng vi khuẩn là 261,25x106 vi khuẩn /1 gram phân. Lợn từ 22 đến 60 ngày tuổi trong phân có 6 loại vi khuẩn, số lượng vi khuẩn là 237,99x106 vi khuẩn /1 gram phân. Như vậy họ vi khuẩn đường ruột có vai trò nhất định trong quá trình gây ra hội chứng tiêu chảy ở gia súc nói chung và ở lợn nói riêng. Nhiều tác giả, nhiều công trình nghiên cứu khoa học đưa ra kết luận nguyên nhân gây ra tiêu chảy có vai trò quan trọng của vi khuẩn E.coli và Salmonella sp. 2.1.2.1 Một số hiểu biết về vi khuẩn E.coli Trong các vi khuẩn đường ruột, E.coli là loại phổ biến nhất và thường xuất hiện sớm ở đường ruột người và động vật sơ sinh (sau khi đẻ 2 giờ). Theo Nguyễn Như Thanh (1974)[18], bình thường E.coli cư trú ở phần sau của ruột, ít khi có mặt ở dạ dày hay phía trước của ruột non. Chỉ khi nào sức đề kháng của vật chủ yếu đi, E.coli mới phát triển mạnh về số lượng và tăng cường độc lực, gây bệnh cho vật chủ. E.coli là loại trực khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, có lông, di động, không hình thành nha bào, bắt màu gram (-) thường thẫm ở hai đầu, ở giữa 5 nhạt. Trong cơ thể, vi khuẩn có hình cầu trực khuẩn, đứng riêng rẽ, đôi khi xếp thành chuỗi ngắn. E.coli là trực khuẩn hiếu khí hay yếm khí tuỳ tiện, dễ dàng nuôi cấy ở môi trường thông thường, nhiệt độ thích hợp là 37oC, pH thích hợp 7,2- 7,4; có thể phát triển được từ 5,5 - 8. Môi trường nước thịt: E.coli phát triển tốt, môi trường rất đục, có cặn màu tro nhạt lắng xuống đáy, đôi khi có màng màu xám nhạt trên mặt môi trường, môi trường có mùi phân thối. Môi trường thạch thường: nuôi cấy ở 37oC sau 24 giờ hình thành những khuẩn lạc tròn, ướt, không trong suốt, màu tro trắng nhạt, hơi lồi, đường kính 2 - 3mm. Nuôi lâu khuẩn lạc trở thành gần như nâu nhạt và mọc rộng ra. Môi trường MacConkey: E.coli hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu hồng cánh sen. Môi trường Bririlliant Green Agar: khuẩn lạc E.coli dạng S, màu vàng chanh. Môi trường thạch máu: vi khuẩn E.coli có thể gây dung huyết. Các chủng E.coli đều lên men sinh hơi mạnh các loại đường fructose, glucose, galactose, levulose, lactose. Tuy nhiên cũng có một vài chủng E.coli không lên men đường lactose. Các phản ứng sinh hoá: Indol (+); MR(+); VP(-); H2S (-). Khử nitrat thành nitrit. Vi khuẩn E.coli có cấu trúc kháng nguyên rất phức tạp, bao gồm kháng nguyên thân O, kháng nguyên lông H, kháng nguyên K và kháng nguyên bám dính F. Kháng nguyên F (Fimbriae hay Pilus): chức năng của kháng nguyên này là giúp vi khuẩn bám giữ vào giá thể (màng nhầy của đường tiêu hoá) hay còn gọi là bám dính. 6 Vi khuẩn E.coli gây bệnh bởi tổng hợp nhiều yếu tố, có yếu tố là độc tố và có yếu tố không phải là độc tố. Khả năng bám dính và khả năng tạo Colicin V và khả năng sản sinh độc tố. - Khả năng bám dính: đây là yếu tố gây bệnh đặc biệt quan trọng, giúp vi khuẩn thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh. E.coli gây bệnh, bám dính lên niêm mạc ruột non nhờ một hay nhiều yếu tố bám dính. Có 4 loại yếu tố bám dính đặc biệt quan trọng là: F4 (K88), F5 (K99), F6 (K987p), F41. - Khả năng tạo Colicin V: Colicin V là một chất kháng khuẩn có khả năng ức chế hoặc tiêu diệt các loại vi khuẩn khác. E.coli sản sinh Colicin V thông qua Plasmid Col. Theo Brown V (1981)[33], trong hầu hết các chủng E.coli gây bệnh đều có một loại Plasmid có chứa gen sản xuất ColicinV. - Khả năng sản sinh độc tố: E.coli có 2 loại độc: ngoại độc tố và nội độc tố. Sản sinh độc tố được xem như là một khả năng đặc biệt quan trọng của E.coli. Cũng giống như khả năng bám dính, khả năng sản sinh độc tố là một nhân tố gây bệnh của vi khuẩn E.coli. 2.1.2.2. Một số hiểu biết vềvi khuẩn Salmonella sp Vi khuẩn Salmonella sp là trực khuẩn ngắn, kích thước 0,4–0,6 x 1-3 µ, không hình thành giáp mô và nha bào. Đa số các loài Salmonella đều có khả năng di động mạnh do có khoảng 7-12 lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum-pullorum). Vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm thông thường, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở 2 đầu. Salmonella sp vừa hiếu khí vừa kỵ khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy, 7 nhiệt độ thích hợp 37oC, nhưng có thể phát triển được từ 6- 42oC, pH thích hợp bằng 7,6, phát triển được ở pH từ 6-9. Salmonella sp gây bệnh ở gia súc sinh trưởng tốt trong điều kiện hiếu khí, kém hơn ở điều kiện kỵ khí. Môi trường nước thịt: cấy vài giờ đã đục nhẹ, sau 18h đục đều, nuôi lâu ở đáy ống nghiệm có cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng. Môi trường thạch thường: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa, nhỏ và trắng hơn khuẩn lạc của E. coli. Môi trường thạch máu: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, màu xám, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên . Môi trường thạch Mac Conkey: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, trong suốt không màu, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên. Môi trường thạch DHL: vi khuẩn mọc thành khuẩn lạc tròn, ở giữa đen hoặc trong suốt không màu, trơn bóng, ở giữa hơi lồi lên. Salmonella sp có khả năng : - Chuyển hoá đường: Phần lớn các loài Salmonella lên men có sinh hơi glucoz, mannit, mantoz, galactoz, levuloz, arabinoz. Tất cả các loài Salmonella không lên men lactoz, saccaroz. - Các phản ứng sinh hoá khác: Indol: -. H2S: +. Enzym khử Cacboxyn: 96% Salmonella tiết ra enzym khử Cacboxyn đối với Lysine, Ornithine, Arginine. Oxydaza: -. Catalaza: +. Trong nước thường Salmonella tồn tại một tuần, trong nước đá có thể sống 2-3 tháng. Với nhiệt độ: Vi khuẩn có sức đề kháng yếu: 50oC bị diệt sau 1h, 70oC 8 trong 20 phút, 100 o c trong 15 phút. Các chất sát trùng thông thường: các chất sát trùng thông thường cũng dễ phá huỷ vi khuẩn hoàn toàn: phenol 5%, HgCl 1/500, Formol 1/500 diệt vi khuẩn trong 15- 2 0 phút. Nhưng đối với một số hoá chất như Cristal violet, lục malachit, dixitrat, muối mật với những nồng độ vừa đủ gây độc cho E. coli thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của Salmonella. Salmonella sp có thể sống trong thịt ướp muối (nồng độ muối 29%) được 4- 8 tháng ở nhiệt độ 6-12oC. Salmonella sp có 2 loại độc tố: nội độc tố và ngoại độc tố. Nội độc tố của Salmonella sp rất mạnh, với liều thích hợp tiêm tĩnh mạch, vi khuẩn giết chết chuột bạch, chuột lang trong vòng 48h với bệnh tích đặc trưng ruột non sung huyết, mảng payer phù nề, đôi khi hoại tử. Độc tố ở ruột gây độc thần kinh, gây hôn mê, co giật. Nội độc tố có 2 loại: gây sung huyết và mụn loét. Ngoại độc tố: chỉ phát hiện được khi lấy vi khuẩn có độc tính cao cho vào túi colodion rồi đặt vào ổ bụng chuột lang để nuôi, sau 4 ngày lấy ra, rồi lạị cấy truyền như vậy từ 5-10 lần, sau cùng đem lọc, nước lọc này có khả năng gây bệnh cho động vật thí nghiệm. Ngoại độc tố chỉ hình thành trong điều kiện invivo và trong nuôi cấy kỵ khí. Ngoại độc tố tác động vào thần kinh và ruột, ngoại độc tố có thể chế thành giải độc tố bằng cách cho thêm 5% formol để ở 37oC trong 20 ngày. Ở vi khuẩn Salmonella sp cần phân biệt 4 loại kháng nguyên là: * Kháng nguyên O (O – Antigen): Kháng nguyên O của Salmonella rất phức tạp, hiện nay người ta tìm thấy 65 yếu tố khác nhau. Một Salmonella có thể có một hoặc nhiều yếu tố trong số các yếu tố đó. Mỗi yếu tố người ta đánh bằng các số la mã hay số Ả rập 9 Do sự khác nhau giữa các loài Salmonella về cấu trúc kháng nguyên O nên ta đã chia Salmonella thành 34 nhóm: A; B; C1; C2; C3; D1; D2; E1; E2; E3; E4; F; G1; G2; H; I; J; L: M; N; O; P; Q; R; S; T; U; V; W; X; Y; Z; 49; 50 Mỗi nhóm vi khuẩn có kháng nguyên O cấu tạo bởi một số thành phần nhất định được ký hiệu bằng số la mã * Kháng nguyên H (H – Antigen): Kháng nguyên H chỉ có ở các Salmonella có lông. Các loài Salmonella đều có lông chỉ trừ Salmonella gallinarum – pullorum Kháng nguyên H chia làm 2 pha - Pha 1 có tính chất đặc hiệu gồm có 28 kháng nguyên lông được biểu thị bằng mẫu la tinh thường a, b, c, d, f, h....z - Pha 2 không có tính đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với loại khác đôi khi thành phần này có thể gặp ở Escherichia Pha 2 gồm 6 loại được biểu thị bằng chữ số ả rập 1, 2, 3, 4, 5, 6 hay chữ số la tinh thường e, n, x.... * Kháng nguyên K (K - Antigen): Kháng nguyên K của Salmonella không phức tạp, có một kháng nguyên vỏ đã biết là kháng nguyên vi. Bản chất của kháng nguyên vi là một phức hợp Gluxit – lipit – polypeptit gần giống như kháng nguyên O, kháng nguyên vi không tham gia vào quá trình gây bệnh Trong đó kháng nguyên có ý nghĩa quan trọng trong chẩn đoán là kháng nguyên thân (0 – Antigen) và kháng nguyên (H – Antigen). 2.2. Bệnh lợn con phân trắng Bệnh lợn con phân trắng là một trong những bệnh ỉa chảy phổ biến ở lợn con từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi. Do nhiều nguyên nhân tác động vào cơ thể con vật gây rối loạn tiêu hoá và tiết dịch nên trong sữa thành phần cazenin không tiêu được bị thải ra ngoài làm phân có màu trắng. Bệnh xảy ra phổ biến 10 ở các trang trại chăn nuôi tập trung ở nước ta và nhiều nước trên thế giới, đã gây ra những tổn thất kinh tế nghiêm trọng cho ngành chăn nuôi lợn, nhất là chăn nuôi lợn nái sinh sản (Lê Hồng Mận, Xuân Giao (2007) [8]). 2.2.1. Diễn biến bệnh Bệnh được chú ý theo dõi từ khoảng năm 1959, tại các cơ sở chăn nuôi tập trung. Ở nước ta bệnh xuất hiện nhiều trong các trại chăn nuôi lợn nái sinh sản tập trung trên khắp mọi miền từ Bắc chí Nam. Bệnh có thể xảy ra quanh năm, thường phát mạnh từ đông sang hè. Đặc biệt khi thời tiết thay đổi đột ngột (từ oi bức chuyển sang mưa rào, từ khô ẩm chuyển sang rét ẩm), bệnh phát ra hàng loạt. Sau những trận mưa to gió lớn, khí hậu thay đổi đột ngột, tỷ lệ mắc bệnh đến 100%. Tỉ lệ tử vong 10% - 20%, lợn con sau khi khỏi bệnh còi cọc chậm lớn tiêu tốn thức ăn nhiều và rất dễ nhiễm các bệnh khác. 2.2.2. Các tác nhân gây bệnh Trong lịch sử nghiên cứu về bệnh LCPT, nhiều tác giả đã dày công nghiên cứu, tìm hiểu nguyên nhân gây bệnh LCPT kết quả cho thấy nguyên nhân gây bệnh rất phức tạp. Tuy nhiên bệnh LCPT chỉ là một hiện tượng bệnh lý ở đường tiêu hoá, có liên quan đến rất nhiều các yếu tố, có yếu tố là nguyên nhân nguyên phát, có yếu tố là nguyên nhân thứ phát. Song cho dù bất cứ nguyên nhân nào dẫn đến tiêu chảy thì hậu quả của nó cũng gây ra viêm nhiễm, tổn thương thực thể đường tiêu hoá và cuối cùng là nhiễm trùng. Qua nhiều nghiên cứu cho thấy, bệnh LCPT do các nguyên nhân sau: 2.2.2.1. Do vi sinh vật - Do vi khuẩn Khi nghiên cứu về nguyên nhân gây bệnh LCPT nhiều tác giả đã kết luận rằng trong bất cứ trường hợp nào của bệnh cũng có vai trò tác động của 11 vi khuẩn. Trong đường ruột gia súc nói chung và lợn nói riêng, có rất nhiều loài vi sinh vật sinh sống. Vi sinh vật tồn tại dưới dạng một hệ sinh thái. Hệ sinh thái vi sinh vật đường ruột ở trạng thái cân bằng động theo hướng có lợi cho cơ thể vật chủ. Hoạt động sinh lý của gia súc diễn ra bình thường khi hệ sinh thái đường ruột ở trạng thái cân bằng. Sự cân bằng này là do sự ổn định giữa môi trường đường tiêu hoá và các nhóm vi sinh vật có mặt trong đường tiêu hoá của cơ thể vật nuôi. Dưới tác động của các yếu tố gây bệnh, trạng thái cân bằng này bị phá vỡ dẫn đến hiện tượng loạn khuẩn và hậu quả là lợn bị tiêu chảy. Nhiều tác giả nghiên cứu về hội chứng tiêu chảy đã chứng minh rằng khi gặp điều kiện thuận lợi, nhiều vi khuẩn ở đường tiêu hoá sẽ tăng độc tính, phát triển với số lượng lớn trở thành có hại và gây bệnh. Trương Quang (2005) [15] cho rằng do một tác nhân nào đó, trạng thái cân bằng của khu hệ vi sinh vật đường ruột bị phá vỡ, tất cả hay chỉ một loại vi khuẩn nào đó sinh sản quá nhiều sẽ gây nên hiện tượng loạn khuẩn. Loạn khuẩn là nguyên nhân chủ yếu gây bệnh ở đường tiêu hoá, đặc biệt là gây ỉa chảy. Thực tế vi khuẩn E.coli cư trú ở ruột già và phần cuối ruột non, khi gặp điều kiện thuận lợi sẽ nhân lên với số lượng lớn ở lớp sâu tế bào thành ruột, đi vào máu đến các nội tạng. Trong máu, nhờ cấu trúc kháng nguyên O và khả năng dung huyết vi khuẩn chống lại các yếu tố phòng vệ không đặc hiệu. Tại các cơ quan nội tạng vi khuẩn này tiếp tục phát triển và sự cư trú của chúng làm con vật rơi vào trạng thái bệnh lý. Đoàn Thị Kim Dung (2004)[2] cho biết khi lợn bị tiêu chảy số loại vi khuẩn và tổng số vi khuẩn hiếu khí trong một gram phân tăng lên rất nhiều so với lợn ở trạng thái bình thường. Khi phân lập tác giả cho rằng các vi khuẩn 12 đóng vai trò quan trọng trong hội chứng tiêu chảy như: E.coli, Salmonella sp Tô Thị Phượng (2006)[13] khi nghiên cứu sự biến động của Salmonella và E.coli ở lợn qua các lứa tuổi cho thấy. 100% các mẫu phân đều phân lập được vi khuẩn E.coli dù lợn tiêu chảy hay không tiêu chảy. Đối với vi khuẩn Salmonella tỷ lệ phân lập phụ thuộc vào từng lứa tuổi, lợn từ 1- 21 ngày tuổi 81,35% mẫu phân phân lập được vi khuẩn Salmonellasp, lợn từ 22 - 60 ngày tuổi 85,71% mẫu phân có nhiễm Salmonella sp. - Do virus Đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu và kết luận một số virus như: Rota - virus, TGE, Enterovirus, Parvovirus, Adenovirus có vai trò nhất định gây hội chứng tiêu chảy ở lợn. Sự xuất hiện của virus đã làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hoá, suy giảm sức đề kháng của cơ thể và gây ỉa chảy thể cấp tính. - Do ký sinh trùng. Ký sinh trùng trong đường tiêu hoá là một trong những nguyên nhân gây hội chứng ỉa chảy. Khi ký sinh trong đường tiêu hoá ngoài việc chúng cướp đoạt chất dinh dưỡng của vật chủ, tiết độc tố đầu độc cơ thể vật chủ, chúng còn gây tác động cơ giới làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hoá và là cơ hội khởi đầu cho một quá trình nhiễm trùng. Có rất nhiều loại ký sinh trùng đường ruột tác động gây ra hội chứng ỉa chảy như sán lá ruột lợn, giun đũa lợn. Theo Phạm Văn Khuê, Phan Lục (1996)[6] sán lá ruột lợn và giun đũa lợn ký sinh trong đường tiêu hoá, chúng làm tổn thương niêm mạc đường tiêu hoá, gây viêm ruột ỉa chảy. - Nguyên nhân khác: + Do thời tiết. Khi điều kiện thời tiết thay đổi đột ngột như: quá nóng, quá lạnh, mưa gió, ẩm độ đều tác động đến tình trạng sức khoẻ của lợn đặc biệt là lợn con. Vì ở lợn con theo mẹ, cấu tạo chức năng sinh lý của các cơ quan chưa hoàn 13 thiện, nên khả năng miễn dịch và phòng vệ của cơ thể chưa tốt. Vì thế mà lợn con là đối tượng chịu nhiều tác động của điều kiện ngoại cảnh. + Do kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng. Vấn đề chăm sóc nuôi dưỡng có vai trò hết sức quan trọng. Việc thực hiện đúng quy trình kỹ thuật chăm sóc nuôi dưỡng sẽ đem lại sức khoẻ và tăng trưởng cho lợn. Khi thức ăn chăn nuôi không đảm bảo, chuồng trại không hợp lý, kỹ thuật chăm sóc không phù hợp là nguyên nhân làm cho sức đề kháng của lợn giảm, tăng nguy cơ mắc bệnh. Theo Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1996)[4] khi lợn bị bệnh LCPT có liên quan đến trạng thái stress như: thời tiết lạnh ẩm hoặc nóng ẩm đột ngột, thức ăn cho lợn mẹ thay đổi bất thường về lượng đạm và chất béo, chất khoáng và vitamin. Hệ thống dạ dày - ruột đặc biệt mẫn cảm với stress. Ngay ở giai đoạn báo động của quá trình stress, nhu động ruột tăng, thậm chí gây ỉa chảy cấp tính. Nếu tác nhân stress tác động với cường độ mạnh, kéo dài thì chắc chắn xảy ra viêm dạ dày - ruột. Tiếp theo quá trình viêm của dạ dày bởi stress, các vi khuẩn có trong đường tiêu hoá đã làm bệnh trầm trọng hơn, tổn thương nặng hơn. Các tác nhân stress sẽ tạo điều kiện “ mở đường” cho vi khuẩn phát triển, nhất là E.coli. 2.2.3. Cơ chế gây bệnh Vi khuẩn bằng cách trực tiếp hay gián tiếp xâm nhập vào đường ruột của lợn. Trong ruột, khi có đủ các điều kiện thuận lợi vi khuẩn nhân lên với số lượng lớn, sản sinh yếu tố kháng khuẩn. Yếu tố này tiêu diệt hoặc hạn chế sự phát triển của các vi khuẩn đường ruột khác, đặc biệt các vi khuẩn có lợi (Bacillus.subtylis, các vi khuẩn Lactic). Vi khuẩn E.coli... trở thành vi khuẩn có số lượng lớn trong đường ruột. Khi có số lượng lớn chiếm ưu thế vi khuẩn tràn lên ruột non. 14 Ở ruột non, nhờ kháng nguyên bám dính vi khuẩn bám dính vào lớp tế bào biểu mô nhung mao ruột, nhờ yếu tố xâm nhập vi khuẩn xâm nhập vào trong lớp tế bào biểu mô. Từ đó vi khuẩn phát triển và nhân lên lần thứ nhất làm phá huỷ lớp tế bào này gây ra viêm ruột. Cũng tại đây vi khuẩn sản sinh độc tố đường ruột. Độc tố đường ruột tác động vào quá trình trao đổi muối - nước làm cho nước và chất điện giải không được hấp thu từ ruột vào cơ thể. Nước được tập trung nhiều ở ruột cùng với khí do vi khuẩn trong ruột lên men làm cho ruột căng ra. Sức căng của ruột và quá trình viêm ruột kích thích vào hệ thần kinh thực vật ở ruột tạo nên những cơn nhu động ruột đẩy nước và phân ra ngoài, gây nên tiêu chảy. 2.2.4. Triệu chứng - bệnh tích v Triệu chứng của bệnh: Nói chung lợn con mắc bệnh thường không sốt, phân lỏng, màu trắng như vôi, lầy nhầy, tanh khắm, có khi lẫn máu, lợn bệnh hay bị nôn và luôn ở trạng thái khát nước. Bệnh có thể diễn ra theo hai thể: thể gây chết nhanh và thể kéo dài. • Thể gây chết nhanh: Những lợn con từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi thường mắc thể này. Sau 1-2 ngày đi ra phân trắng, lợn gầy sút nhanh, lợn bú kém, rồi bỏ bú hẳn, ủ rũ, đi đứng siêu vẹo. Niêm mạc mắt nhợt nhạt, bốn chân lạnh, có con hay đứng riêng một chỗ và thở nhanh. Trạng thái phân chuyển từ ỉa nát rồi đến loãng. Số lần đi ỉa tăng từ 1 - 2 lần trong ngày lên tới 4 - 6 lần. Màu phân từ xanh đen biến thành màu xám (màu tro bếp) rồi màu trắng đục, trắng hơi vàng. Mùi tanh, khắm. Phân dính vào đít, đuôi. Bệnh thường kéo dài 2 - 4 ngày. Trước lúc chết có hiện tượng suy nhược, co giật hoặc run run. Tỷ lệ chết có thể 50 - 80% số con ốm. 15 • Thể kéo dài Thường xảy ra ở lợn 20 ngày tuổi trở lên. Bệnh có thể kéo dài 7- 10 ngày. Lợn vẫn bú, sau bú kém dần, phân màu trắng đục, phân hơi vàng. Có con mắt có dử. Niêm mạc nhợt nhạt. Nếu không khỏi thì lợn bị suy nhược, rồi chết sau hàng tuần bị bệnh. v Bệnh tích: Khi lợn chết, xác gầy, phần thân sau bê bết phân. Mổ khám bệnh tích thấy dạ dày giãn rộng, ở đường cong lớn các bờ bị nhồi máu, dạ dày chứa đầy sữa đông vón, không tiêu, màu trắng hoặc màu xám trắng. Ruột non căng phồng chứa đầy hơi với những đám xuất huyết ở thành ruột. Nhìn từ ngoài vào thấy niêm mạc ruột non bị tróc làm cho thành ruột mỏng ra. Hệ thống lâm ba ruột tụ huyết. Các cơ quan nội tạng khác: tim, gan, thận, phổi ít biến đổi. 2.2.5. Phòng và trị bệnh Ngay từ những ổ bệnh đầu tiên phát sinh trong các cơ sở chăn nuôi tập trung, người ta nghĩ đến những phương pháp phòng bệnh (vệ sinh chuồng trại, chống lạnh, ẩm, nuôi dưỡng tốt mẹ và con, bổ sung các thành phần dinh dưỡng còn thiếu vào khẩu phần). Sử dụng nhiều loại thuốc kháng sinh, thảo mộc vào điều trị bệnh. 2.2.5.1. Phòng bệnh - Dùng chế phẩm sinh học Đó là dùng các vi khuẩn có lợi để phòng trị bệnh. Các nhóm vi khuẩn thường dùng là Bacillus subtilis, Colibacterium, Lactobacillus…Các vi khuẩn này khi được đưa vào đường tiêu hoá của lợn sẽ có vai trò cải thiện tiêu hoá thức ăn, lập lại cân bằng hệ vi sinh vật đường ruột, ức chế và khống chế vi sinh vật có hại. - Phòng trị bằng nguyên tố vi lượng Lợn con bú sữa mẹ thường thiếu sắt vì sữa mẹ không cung cấp đủ cho 16 lợn con. Do đó lợn con thường rối loạn tiêu hoá và dẫn đến tiêu chảy. Vì vậy, lợn con cần được tiêm bổ sung Dextran sắt để phòng bệnh thiế._.u máu và nâng cao sức đề kháng cho lợn con. - Cải thiện các điều kiện nuôi dưỡng lợn nái và lợn con Nuôi dưỡng lợn nái đúng khẩu phần quy định bao gồm đủ lượng đạm, bột đường, vitamin khoáng đa lượng và vi lượng, chất béo vừa đủ…sẽ đảm bảo cho thai phát triển tốt và lợn con sau khi sinh có sức đề kháng với bệnh. Chú ý cho lợn con ăn thức ăn bổ sung sớm sau 1 tháng tuổi, trong đó có bổ sung các loại khoáng vi lượng, sulfat đồng, sulfat coban… Giữ gìn chuồng trại sạch sẽ kín ấm vào mùa đông , mát mẻ vào mùa hè…Đặc biệt chú ý đến nhiệt độ, độ ẩm chuồng nuôi khi lợn con bị bệnh. 2.2.5.2. Điều trị bệnh Khi bệnh phát ra ở đàn lợn thì phải khẩn trương điều trị với những biện pháp thích hợp và chăm sóc chu đáo đàn lợn. Một số kháng sinh sau đây thường được sử dụng riêng rẽ hoặc phối hợp để điều trị như: Tetracyclin, Neomycin, Biomycin, Gentamycin.. Dùng một số kháng sinh có nguồn gốc thảo mộc cũng có thể điều trị bệnh lợn con phân trắng. - Viên Tô mộc dùng theo công thức sau: Tô mộc 500g và Ngũ bột tử 300g, hai thứ sắc đặc trộn lẫn vào thức ăn cho 100 lợn con ăn. - Palmatin: chiết xuất từ cây Hoàng đằng, dùng dạng viên với liều 50mg/lợn con. Có thể dùng các loại thuốc như: Becberin, hay dùng các loại cây có hợp chất tannin cao như: búp Sim, búp ổi, quả Hồng xiêm, vỏ quả và vỏ thân cây Lựu, cây Liêu đông… Thực tế cho thấy hiệu quả điều trị của các thuốc trên ngày càng giảm dần ở hầu hết các địa phương nói chung và trại Hoàng Liễn nói riêng. Làm 17 cho các nhà chăn nuôi rất khó khăn trong việc lựa chọn thuốc điều trị. 2.3. Một số hiểu biết về kháng sinh 2.3.1. Khái niệm Kháng sinh là thuật ngữ Việt Nam phiên âm từ danh từ Hán Việt (kháng sinh tố). Danh pháp quốc tế là antibiotic. Danh từ này trước kia chỉ một nhóm chất hữu cơ có cấu tạo hoá học phức tạp, phần lớn trong số đó lúc đầu do xạ khuẩn, vi khuẩn và nấm sản sinh ra. Với nồng độ thấp đã có tác dụng (cả invitro và invivo) ức chế hay tiêu diệt sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật gây bệnh nhưng không hay ít gây độc cho người, gia súc, gia cầm. Ngày nay, khái niệm kháng sinh có rộng hơn, nó còn bao gồm cả những chất có nguồn gốc từ thực vật thượng đẳng – Phytoncid, và những kháng sinh khác do con người tổng hợp lên, dựa vào cấu trúc hoá học của các chất tự nhiên. Các thuốc này không chỉ tác dụng với vi khuẩn mà còn tác dụng chống đơn bào kí sinh. Ngoài ra cũng còn có những chất hoá dược có tác dụng giống như kháng sinh hay bắt chước kháng sinh (antibiomimeties). Một số thuốc hóa học trị liệu có cơ chế tác dụng như kháng sinh gồm: các dẫn xuất của Sunfamid, 5- nitroimmidazol, nhóm Quinolon, nhóm dẫn xuất nitrofuran… 2.3.2. Phân loại kháng sinh Theo Hoàng Tích Huyền (1993)[5], Bùi Thị Tho (2003)[23]. Có nhiều cách phân loại kháng sinh, tuỳ theo mục đích nghiên cứu và cách sử dụng thuốc. Để tiện cho việc chọn thuốc trong nghiên cứu và trong điều trị, kháng sinh được chia theo những nhóm sau: • Nhóm β – lactamim gồm: + Penecillin tự nhiên: Penecillin G, Penecillin O, Penecillin V… + Penecillin bán tổng hợp: Oxacillin, Ampicillin, Amoxicillin… 18 + Các Cephalosporin: Cephalosporin thiên nhiên và bán tổng hợp hay tổng hợp như Cephalothin, Cephaloridin, Cephacetril, Cephapirin… • Nhóm Aminoglucozid – AG gồm: Streptomycinva Gentamicin, Neomycin, Kanamycin… • Nhóm Phenicol gồm: Chloramphenicol, Thiamphenicol… • Nhóm Tetracyclin gồm: Tetracyclin, Oxytetracyclin… • Nhóm Macrolid và đồng loại: Erythomycin, Oleandomycin, Lincomycin, Clindamycin, Rifamycin, Tylosin, Spiramycin… • Nhóm Polypeptid gồm: Colistin, Polymycin… • Nhóm kháng sinh chống nấm và virus • Nhóm thuốc hoá học trị liệu có cơ chế tác dụng giống kháng sinh: + Nhóm Quinolon: - Quinolon kinh điển gồm các acid nalonic, oxolinic, piromidic và flumequin. - Quinolon mới (Fluoroquinolon): Pefloxacin, Rosoxacin, Ciprofloxacin, Norfloxacin, Ofloxacin, Enrofloxacin… + Nhóm 5-Nitro - Imidazol: gồm 3 dẫn xuất uống hay tiêm: Metronidazol (Flagyl), Ornidazol, Tinidazol. + Nhóm Sulfamid (Sulfonamid): - Các Sulfamid chính: Sulfisomidin, Sulfathiazol, sulfafurazol… + Nhóm Nitrofuran và các dẫn xuất: Nitrofurantoin, Furazolidon, Nifuratel, Nitrofuran… Để thuận tiện cho việc sử dụng và phối hợp kháng sinh, trong lâm sàng người ta có thể chia kháng sinh ra làm 2 nhóm: nhóm diệt khuẩn và nhóm kìm khuẩn. • Nhóm diệt khuẩn: Các kháng sinh thuộc nhóm này bao gồm: Penicillin, Cephalosporin, Polymycin, Aminoglycosid, Trimethoprim – Sulfamethoxazol. 19 • Nhóm có tác dụng kìm khuẩn: Tetracyclin, Chloramphenicol, Macrolid, Trimethoprim, Erythromycin, Sulfamid. 2.3.3. Cơ chế tác động của thuốc kháng sinh Mỗi loại thuốc tuỳ thuộc vào nguồn gốc, cấu trúc hóa học, tính chất lý, hóa mà chúng có các cơ chế tác dụng lên vi khuẩn gây bệnh khác nhau. Tuỳ theo tác dụng chọn lọc của từng thuốc mà người ta chia ra các cơ chế tác dụng sau: - Kháng sinh ức chế tổng hợp màng vách tế bào vi khuẩn - Kháng sinh ức chế tổng hợp Protein của vi khuẩn - Kháng sinh ức chế quá trình tổng hợp Nucleotid Hiện nay có khoảng 30 chất có tác dụng phá huỷ sự trao đổi RNA và 20 chất phá huỷ sự trao đổi DNA như Actinomycin, Mitomycin, Novobiocin… 2.4. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Các nghiên cứu về tính kháng thuốc của vi khuẩn phân lập từ lợn, mèo Luca Guardabassi (2004)[39] cho biết: các nghiên cứu đã chỉ ra nhiều vi khuẩn E.coli, Staphylococcus intermedius, Enterococci, Salmonella sp. typhimurium phân lập từ lợn xuất hiện sự đa kháng với nhiều loại kháng sinh thường được sử dụng. Nhóm Fluoroquinolon mới được sử dụng rộng rãi ở những năm gần đây nhưng cũng đã xuất hiện nhiều vi khuẩn có xu hướng kháng với thuốc: Pseudomonas, Staphylococcus intermedius, E.coli, Streptococcus phân lập từ lợn bị viêm đường tiết niệu và bị viêm ruột. Nghiên cứu tính kháng thuốc của các vi khuẩn phân lập ở người và động vật, một số tác giả Luca Guardabassi (2004){39}, CJ Teale (2002){32} cho biết: với các chủng phân lập ở người, có 56% chủng kháng với Ampicillin, 38% kháng với SXT, 34% kháng với Chloramphenicol, 34% kháng với AMC. Với các chủng 20 phân lập từ gia súc, gia cầm có 71% chủng kháng với Streptomycin, 63% chủng kháng với Tetracyclin, 20% kháng với Gentamycin, 16% kháng với SXT và Ampicillin. Còn các chủng phân lập từ lợn, mèo thì cho thấy tỷ lệ kháng thuốc khá cao, có 82% chủng kháng Sulfamethoxazole/ Trimethoprime, 76% chủng kháng với Streptomycin, 67% kháng với Tetracycline. Việc sử dụng rộng rãi các loại kháng sinh điều trị, kích thích sinh trưởng, bảo quản thực vật, xử lý môi trường nước đã tạo ra nhiều giống vi khuẩn có khả năng kháng thuốc mang plasmid có chứa gen kháng thuốc tồn tại trong cơ thể động vật cũng như môi trường sống. Do vậy ngày nay, mọi thuốc kháng sinh đi vào thị trường đều nhanh chóng bị đánh bại bởi những gen đề kháng mới mà chúng xuất hiện ngẫu nhiên do những đột biến ở vi khuẩn (Nguyễn Phước Tương (2002)[27]. 2.4.1 Khái niệm Trong quá trình đấu tranh giữa con người và bệnh tật, loài người đã tìm ra vũ khí sắc bén: Kháng sinh và các thuốc hoá học trị liệu, để khống chế và tiêu diệt các bệnh nhiễm khuẩn. Nhưng trên thực tế do lạm dụng, sử dụng kháng sinh quá mức dẫn đến vi khuẩn gây bệnh đã xuất hiện thêm vũ khí bảo vệ mới đó là hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn. Hiện tượng kháng thuốc phát sinh do vi khuẩn tiếp xúc nhiều lần với các thuốc hoá học trị liệu hoặc do truyền từ vi khuẩn đề kháng sang vi khuẩn mẫn cảm. Ngày nay các nhà vi khuẩn học trên thế giới đã công nhận rằng sự kháng thuốc cũng là một trong những yếu tố gây bệnh quan trọng của vi khuẩn. Theo Jacob A.E (1997)[39], đã nghiên cứu các plasmid độc có tính di truyền cũng như khả năng truyền ngang các yếu tố này của E.coli. Trong đó ông có nói nhiều đến các Plasmid kháng thuốc. Các yếu tố kháng thuốc được tạo ra dưới ảnh hưởng của thiên nhiên và bàn tay con người tác động 21 Theo Nguyễn Phước Tương (2002)[27]. Sức đề kháng với kháng sinh của vi khuẩn là do đột biến ngẫu nhiên trong nhiễm sắc thể, nhờ đó chúng sống sót qua sự tấn công của kháng sinh và cuối cùng tạo nên một quần thể mới kháng với loại kháng sinh đó. Như vậy trong thế giới sinh vật nói chung, vi sinh vật gây bệnh nói riêng, muốn sinh trưởng, phát triển và bảo toàn nòi giống buộc chúng phải phát sinh biến dị, đột biến để thích nghi với môi trường sống mới. Theo Nguyễn Thị Thuận (1981)[25] vi khuẩn phân chia tế bào mỗi lần 40 phút, như vậy cứ 22 giờ mỗi tế bào đột biến sẽ có 109 đời con. Qua một ngày một đêm, đời con của tế bào đột biến đã tăng lên rất nhiều và tạo ra một dòng vi khuẩn mới. Nhờ phương pháp đánh dấu các nhà khoa học đã chứng minh sự xuất hiện đột biến tự nhiên ở vi khuẩn đã làm thay đổi đặc tính thích nghi của chúng, mà hoàn toàn không đòi hỏi chúng phải tiếp xúc với các yếu tố cần thiết cho sự xuất hiện các đặc tính ấy. Cũng nhờ phương pháp này, đã giải thích sự xuất hiện hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn một phần cũng tuân theo quy luật biến đổi ngẫu nhiên khách quan không phụ thuộc vào việc tế bào có tiếp xúc với các chất kháng sinh hay không. Hiện nay trên thế giới nói chung và Việt Nam nói riêng có rất nhiều công trình nghiên cứu về tính kháng thuốc và tính đột biến của vi khuẩn. Đây là một vấn đề lớn đã và sẽ tập trung được sự chú ý của nhiều nhà khoa học. 2.4.2. Phân loại kháng thuốc Dựa vào nguồn gốc hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn được chia thành hai loại: v Kháng thuốc tự nhiên Bản thân vi khuẩn bình thường đã có sẵn những men hay một chất x nào đó có khả năng chống lại tác dụng của kháng sinh hoặc có thể loại vi khuẩn đó không có vị trí công kích, điểm tác dụng của kháng sinh. 22 Ví dụ: các vi khuẩn Gram (-) không chịu tác dụng của Penecillin. v Kháng thuốc thu được: Vi khuẩn thu được những yếu tố kháng thuốc trong quá trình sống do sự đột biến ngẫu nhiên hoặc do tiếp xúc (Nicholas F. N. 1987). Khi có được các yếu tố kháng thuốc như Plasmid, factor R hay episome nó có khả năng truyền ngang các yếu tố kháng này giữa các chủng của cùng loài và giữa các loài với nhau. Kháng thuốc thu được chia làm hai loại: * Đột biến kháng: là sự đột biến xuất hiện dưới ảnh hưởng của tác nhân chọn lọc. Ở đây tác nhân gây đột biến là các thuốc hoá học trị liệu. Các tác nhân này đã gây nên những biến đổi ở bộ máy di truyền của tế bào vi khuẩn. * Kháng thuốc lây lan: hiện tượng kháng thuốc này do các đơn vị di truyền plasmid tạo nên. Các plasmid nằm ngoài nhiễm sắc thể, trong tế bào chất và có thể truyền từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác. 2.4.3. Cơ chế kháng thuốc của vi khuẩn Sự nảy sinh khả năng kháng thuốc của vi khuẩn là rất nhanh và ở diện rộng. Trước đây, điều này chỉ được giải thích bằng một cơ chế cổ truyền đó là: khả năng kháng thuốc của vi khuẩn có được do các biến đổi ở hệ gen của chúng. Sự gia tăng về tần số gen kháng thuốc gây ra do chọn lọc rồi di truyền theo chiều dọc (vertical transfer) từ bố mẹ di truyền cho con cái. Trong thực tế khả năng kháng thuốc của vi khuẩn chủ yếu do khả năng truyền các gen kháng thuốc theo chiều ngang (horizontal transfer) giữa các vi khuẩn với nhau trong cùng một thế hệ hoặc giữa những loài vi khuẩn khác họ với nhau. Theo Clower R.C [34], Cohen S.N [35]…có ba phương thức để vi khuẩn có thể truyền kháng theo chiều ngang: - Sự biến nạp hay chuyển nạp (Transformation): - Tải nạp (Transduction): 23 - Sự tiếp hợp (Conjugation): Có hai đặc trưng của Plasmid kháng thuốc đã giúp chúng hình thành sự kháng thuốc và gieo rắc tính kháng thuốc trong tự nhiên đó là: khả năng tiếp hợp của plasmid và sự có mặt của transposoms (các nhân tố chuyển hoán) trong bộ gen của Plasmid. Các gen kháng thuốc nằm trên các plasmid hay các nhân tố chuyển hoán làm lan rộng các gen kháng thuốc giữa các vi khuẩn. Trong ba phương thức kể trên thì phương thức sinh sản tiếp hợp là quan trọng nhất. Qúa trình này bao gồm quá trình truyền các phiên bản của Plasmid từ tế bào này sang tế bào khác. Vai trò quan trọng của sự sinh sản tiếp hợp là có nhiều gen quan trọng tham gia vào quá trình kháng thuốc kháng sinh nằm trong plasmid. Plasmid mang một hay nhiều gen kháng thuốc kháng sinh gọi là nhân tố R. Đáng chú ý là các vi khuẩn này thể hiện tính đa kháng với nhiều loại thuốc và được chuyển từ vi khuẩn này sang vi khuẩn khác kể cả E.coli qua sự tiếp xúc tế bào đơn giản. Một số Plasmid R cho tính kháng với 8 loại kháng sinh, một số khác cho tính kháng với các kim loại nặng. Một số Plasmid có phổ chủ rộng và có thể được chuyển giữa một số giống vi khuẩn khác nhau. .Điều này có ý nghĩa quan trọng cho sự phổ biến của chúng. 2.4.4. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn E.coli Yếu tố quy định khả năng kháng kháng sinh của E.coli nằm trong plasmid. Các plasmid có trong tế bào vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột nói chung và E.coli nói riêng có khả năng tồn tại, nhân lên và chuyển giao giữa các chủng vi khuẩn. Do vậy, nó có vai trò hết sức quan trọng trong việc gieo rắc tính kháng thuốc. Sử dụng một loại thuốc hoá học trị liệu nào điều trị E.coli trong một thời gian dài thì vi khuẩn sẽ có khả năng kháng không chỉ thuốc đó mà cả các thuốc khác nữa (Bùi Thị Tho (2006)[24]). Các nhà khoa học Liên Xô cũng đã xác nhận: “Các nhân tố R không những có thể truyền sang nhiều loài E.coli khác nhau mà còn có khả năng 24 truyền cho phẩy khuẩn tả, trực khuẩn nhiệt thán, proteus, vi khuẩn dịch hạch – Pasteurella”, phát hiện được việc truyền các plasmid kháng thuốc ở E.coli còn do các mảnh thực khuẩn thể đảm nhiệm. Các nhà khoa học khác Cohen S.N (1980)[35], Clowes R (1973)[34], Smith H.R (1984)[40] đã tổng kết một cách tương đối đầy đủ cơ chế hình thành kháng thuốc là do khả năng di truyền, cách lan truyền yếu tố kháng giữa vi khuẩn cùng dòng, giữa các vi khuẩn gram (-), gram (+), giữa các vi khuẩn gram (+) với gram (-) hay ngược lại. Trong quá trình làm thí nghiệm tìm hiểu bản chất của sự lan truyền tính kháng đa thuốc giữa các dòng vi khuẩn đều thấy rằng E.coli có khả năng cho và nhận sức kháng cao hơn Salmonella sp. Cụ thể là E.coli 73%, Salmonella sp chỉ có 47%. Từ các kết quả đã nghiên cứu trong nhiều năm, Smith H.W (1967)[40] và cộng sự đã đi đến kết luận: "Các chủng E.coli là nguồn chủ yếu về tính kháng kháng sinh lan truyền trong các chủng vi khuẩn có ở đường tiêu hoá của người và gia súc". Phạm Khắc Hiếu, Bùi Thị Tho (1996)[4], khi nghiên cứu tính mẫn cảm và tính kháng thuốc của E.coli phân lập từ phân của lợn con bị bệnh PTLC đã công bố kết quả: 40% E.coli kháng Streptomycin, 50% kháng Sulfamid, 12% kháng Chlotetracyclin và có 2,2 % kháng Chloramphenicol. Về hiện tượng đa kháng, các tác giả cũng cho biết đã có 17,5% E.coli đa kháng với hai loại thuốc Streptomycin và Sulffamid; 6,5% E.coli đa kháng với ba loại thuốc Streptomycin, sulffamid và Chlotetracyclin. 2.4.5. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella sp Cũng giống như các vi khuẩn thuộc họ vi khuẩn đường ruột khác, Salmonella sp có các gen kháng thuốc nằm trong plasmid, chúng có thể tồn tại, nhân lên và phát tán rộng rãi trong quần thể vi sinh vật. Hiện tượng kháng thuốc của vi khuẩn Salmonella sp đã thu hút sự nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trong và ngoài nước. Bochna (1979)[31] nghiên cứu tác dụng của thuốc kháng sinh đã cho 25 biết: khi điều trị cho gia súc bằng một số thuốc thấy thuốc này bị vi khuẩn kháng lại. Griggs (1994)[38] nhận xét rằng: việc sử dụng thường xuyên một số loại kháng sinh phòng và trị bệnh gia súc, gia cầm dẫn tới làm tăng khả năng kháng kháng sinh của nhiều chủng vi khuẩn. Theo Gibb (1991)[37]: có nhiều chủng Salmonella sp gây bệnh Salmonellosis ở người được phân lập tại nhiều nước, một hay nhiều loại xác định có mang đặc tính kháng kháng sinh. Nghiên cứu của Dean (1982)[36] cho thấy khả năng kháng lại các kim loại nặng như Ag, As, Hg của vi khuẩn đường ruột, trong đó có vi khuẩn Salmonella sp. Theo nhiều nghiên cứu chủng Salmonella sp cho đến nay kháng lại 4 loại kháng sinh là Ampicillin, Streptomycin, Dehydrochlotetracylin và Sulfamid, chỉ còn kháng sinh thuộc nhóm polypeptide trong đó có Polymicin B vẫn còn tác dụng invitro với tất cả các chủng phân lập được trong các ca bệnh. Trong báo cáo về tình trạng kháng thuốc có ghi nhận tại một số nước Châu Âu, Luca Guardabassi (2004)[39] cho biết: Các chủng đa kháng Salmonella sp DT 104 thường kháng với ít nhất 5 loại kháng sinh bao gồm: Ampicillin, Chloramphenicol, Streptomycin, Sulfonamid và Tetracyllin. Cũng theo tác giả trong số 80 con lợn tiêu chảy phân lập được Salmonella sp có 14% kháng Amoxycillin/Clavulanic Acid (AMC), 6% kháng Sulphamethoxazol- Trimethoprim (SXT). Theo Bùi Thị Tho (1996)[22] có 44,45% số chủng Salmonella sp kháng lại Chloramphenicol, 44,45% kháng lại Ampicillin, 63,64% kháng lại Streptomycin, 72,73% kháng Sulfonamid và chưa có chủng nào kháng Furazolidon. 3. ĐỐI TƯỢNG - NỘI DUNG - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 26 3.1. Đối tượng * Đối tượng nguyên cứu của đề tài là lợn con theo mẹ từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi bị bệnh LCPT được nuôi tại trại Hoàng Liễn - Vũ Thư - Thái Bình Lợn nghiên cứu được chia thành 3 nhóm: - Nhóm I: lợn con từ sơ sinh đến 7 ngày tuổi. - Nhóm II: lợn con từ 8 ngày tuổi đến 14 ngày tuổi. - Nhóm III: lợn con từ 15 ngày tuổi đến 21 ngày tuổi. Lợn thí nghiệm đều được chọn từ những lợn mẹ đã được tiêm các loại vacxin phòng bệnh do virus theo quy trình chuẩn. 3.2. Nội dung 3.2.1. Xác định sự biến động của hệ vi sinh vật hiếu khí ở đường tiêu hoá của lợn con từ sơ sinh đến 21 ngày tuổi để thấy rõ vai trò của E.coli và Salmonella sp trong bệnh LCPT 3.2.2. Kiểm tra tính mẫn cảm của các chủng E.coli và Salmonella sp phân lập được từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với một số thuốc thí nghiệm 3.2.3. Kiểm tra tính kháng thuốc của các chủng E.coli và Salmonella sp phân lập được từ phân lợn con theo mẹ bị bệnh LCPT với một số thuốc thí nghiệm 3.2.4. Xác định hiệu quả điều trị của một số thuốc sau khi làm kháng sinh đồ trong điều trị bệnh LCPT tại trại 3.3. Nguyên liệu 3.3.1. Các môi trường phổ thông tự chế trong phòng thí nghiệm - Môi trường nước thịt: Dùng để nuôi cấy vi khuẩn. - Môi trường thạch thường: Dùng để kiểm tra hình thái khuẩn lạc, 27 đếm tổng số vi khuẩn. 3.3.2. Môi trường chuyên dụng Dùng để phân lập, giám định vi khuẩn. Gồm các môi trường chế sẵn của hãng Oxoid. - Môi trường MacConkey Agar: dùng để phân lập và giám định vi khuẩn E.coli. Tính chất của khuẩn lạc: E.coli có màu đỏ cánh sen, không có dịch nhầy. Các Enterococcus (như Streptococcus trong phân) cho khuẩn lạc đỏ, tròn, nhỏ liti. Staphylococcus cho khuẩn lạc màu hồng thẫm, đục. - Môi trường Brilliant Green Agar: đây là môi trường dùng để phân lập và giám định Salmonella sp. Tính chất của khuẩn lạc: Salmonella cho khuẩn lạc màu hồng, môi trường xung quanh màu đỏ sáng. E.coli có màu vàng chanh. Các loài Proteus, một số chủng cho khuẩn lạc màu đỏ. - Môi trường Chapman: đây là môi trường phân lập và giám định Staphylococcus sp. Tính chất của khuẩn lạc: Staphylococcus cho khuẩn lạc màu vàng sáng hoặc màu ngà dạng S, tròn, bóng. - Môi trường Edwards (Edwards Agar Base): dùng để phân lập và giám định Streptococcus sp. Tính chất khuẩn lạc: khuẩn lạc Streptococcus nhỏ, trong, dạng S. Một số khuẩn lạc khác màu hơi đen. 3.3.3. Giấy tẩm kháng sinh: được bảo quản lạnh - Do hãng Oxiod của Anh sản xuất bao gồm các loại: Amoxicillin, Enrofloxacin, Gentamycin, Kanamycin, Neomycin, Norfloxacin, Sulfamethoxazole – Trimethoprim, Tetracyclin, Penicillin. 28 3.3.4. Các kháng sinh được sử dụng trong đề tài - Nhóm β - Lactamin. Gồm có: Amoxycillin, Clavulanic Hoạt phổ kháng sinh của các thuốc thuộc nhóm β - Lactamin tương đối rộng. Có tác dụng trên cả vi khuẩn gram (-),gram (+). Tác dụng điều trị bệnh nhiễm khuẩn trên da, đường ruột - Nhóm Aminoglycosid gồm có: Kanamycin, gentamycin, Neomycin... Các Amynoglycosid có tác dụng tương đối rộng, chủ yếu với vi khuẩn Gram (-) như cầu trực khuẩn, cầu khuẩn. Điều trị bệnh đường tiêu hoá, viêm vú, viêm đường sinh dục... - Nhóm Dapeptid gồm có: Colistin. Điều trị các bệnh do Salmonella, viêm vú bò... Các kháng sinh trên có trong thành phần của các biệt dược sau * Hamcoli - S: + Amoxycillin trihydrate 2000 mg + Colistin sulfate 5.000UI + Dexamethazole acetate 5mg + Tá dược vừa đủ 20ml * Colistin – 1200 là thuốc uống có thành phần là: + Colistin sulphat 120.000.000UI + Tá dược vừa đủ 100g * Genta – Tyloex có thành phần là: + Gentamycin sp. + Tylosin tartate + Dexamethazole acetate * Kanamycin 10% là thuốc tiêm có thành phần là: + Kanamycin sulphat BP 10.000mg + Dung môi và dược chất BQ vừa đủ 100ml 3.3.4. Dụng cụ thí nghiệm: 29 - Tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, nồi hấp, buồng cấy, cân điện tử, đĩa lồng, ống nghiệm, đèn cồn, bếp điện, bình tam giác các loại, ống đong, giấy đo pH… - Hoá chất: dung dịch NaOH 10%, muối tinh, pepton, cồn sát trùng 70%. 3.4. Phương pháp thí nghiệm 3.4.1. Phương pháp lấy mẫu: - Mẫu được lấy trực tiếp ở hậu môn hoặc lấy ngay sau khi lợn mới thải. - Mẫu phân lấy được bảo quản trong lọ thuỷ tinh vô trùng có nắp được bảo quản lạnh ngay ở nhiệt độ 4oC. 3.4.2. Phương pháp nuôi cấy xác định số lượng vi khuẩn/ gram phân: * Chuẩn bị: - Mẫu phân với lượng >5 gam. - Ống nghiệm định lượng 20 ml vô trùng. * Phương pháp xử lí mẫu Mẫu lấy về cấy chuyển ngay vào môi trường nước thịt, đặt trong tủ ấm 37 o C/24 h . Sau đó dùng que cấy vô trùng để chuyển sang các loại môi trường phân lập * Phương pháp nuôi cấy: Cân 1 gam phân cho vào ống nghiệm vô trùng nghiền nát với 9 ml nước sinh lí ta được nồng độ pha loãng 10-1, dùng syringe vô trùng trộn đều nhiều lần. sau đó hút 1 ml dung dịch này sang ống thứ 2 đựng 9 ml nước sinh lí vô trùng, trộn đều, tiếp tục làm như vậy đến nồng độ pha loãng thích hợp để nuôi cấy Cách nuôi cấy: Dùng syringe vô trùng hút 0,1ml dịch pha loãng ở các nồng độ đã chọn vào một đĩa môi trường. Mỗi nồng độ ở mỗi môi trường cấy trên 3 đĩa lồng. Cấy bằng phương pháp làng đều dịch pha loãng trên bề mặt thạch. Sau đó để các đĩa thạch vào tủ ấm 37oC/24h 30 * Xác định số lượng: Chúng tôi sử dụng phương pháp Koch: ở mỗi nồng độ chuẩn cho từng loại phân, rồi cấy ra 3 đĩa thạch đếm số lượng khuẩn lạc (CFU) trong 3 đĩa thạch rồi lấy trung bình. Số lượng CFU tương đương với số lượng vi khuẩn. * Tính kết quả: nếu tiến hành pha loãng mẫu ở nồng độ x và cấy 0,1 ml mẫu pha loãng vào môi trường, để tủ ấm nuôi cấy sau 24h thì khi đó số lượng vi khuẩn (X) trong 1 gam phân được tính theo công thức: X = 10.a.b Trong đó X: tổng số vi khuẩn có trong một gam phân. a: là tổng số khuẩn lạc trung bình trên 1 đĩa thạch Petri. b: nồng độ pha loãng 10-x 3.4.3. Phương pháp xác định số loại, số lượng vi khuẩn có trong mẫu phân: Sau khi nuôi cấy vi khuẩn trên môi trường thạch thường để trong tủ ấm 37 o C/18 - 24 giờ, đếm tổng số khuẩn lạc. Đồng thời từ nồng độ thích hợp nuôi cấy trên các môi trường chuyên dụng xác địnácố loại,số lượng từng loại khuẩn lạc. v Môi trường thạch thường: + E.coli: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, ướt, màu tro hay trắng nhạt, hơi lồi. + Salmonella sp: khuẩn lạc dạng S, có thể dạng R, tròn, trong hoặc hơi xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa. + Staphylococcus sp: khuẩn lạc dạng S, tròn bóng, rìa gọn, mặt lồi, có màu vàng. + Streptococcus sp: khuẩn lạc dạng S, nhỏ, màu hơi xám, bóng… v Môi trường thạch MacConkey: + E.coli: hình thành những khuẩn lạc dạng S, màu hồng cánh sen. + Salmonella sp: khuẩn lạc tròn, trong không màu, nhẵn bóng, hơi 31 lồi ở giữa. v Môi trường thạch Birrilliant Green Agar: + E.coli: khuẩn lạc E.coli dạng S, màu vàng chanh. + Salmonella sp: khuẩn lạc dạng S, màu hồng nhạt. v Môi trường Chapman: + Staphylococcus sp: khuẩn lạc to, rìa gọn, nếu là tụ cầu gây bệnh làm môi trường biến màu vàng, nếu là tụ cầu không gây bệnh: môi trường màu đỏ. v Môi trường Edwards Medium: + Streptococcus sp: vi khuẩn mọc tốt, khuẩn lạc nhỏ, mịn, ướt, mặt hơi lồi, trong sáng. Từ môi trường chuyên dụng chúng tôi tiến hành “bắt” khuẩn lạc điển hình của E.coli và Salmonella sp cấy chuyển vào môi trường nước thịt để làm kháng sinh đồ. 32 Sơ đồ bố trí thí nghiệm: Kháng sinh đồ Lợn con khoẻ mạnh bình thường Mẫu phân Lợn con mắc bệnh phân trắng lợn con Thạch thường Đếm tổng số khuẩn lạc CFU Các môi trường chuyên dụng đếm số lượng vi khuẩn Chapman (Staphylococcus sp) Edwards (Streptococcus sp) Brilliant Green Agar (E.coli và Salmonella sp) MacConkey (E.coli và Salmonella sp) Giữ giống Khuẩn lạc thuần khiết Nước thịt (37 o C/18- 24h) Pha loãng đến nồng độ 10x 33 3.4.4. Phương pháp kiểm tra tính mẫn cảm, tính kháng thuốc của E.coli và Salmonella sp phân lập từ phân lợn theo mẹ bị bệnh LCPT với một số thuốc kháng sinh và hoá học trị liệu bằng Tiến hành làm kháng sinh đồ dựa theo nguyên lý của Kirby – Bauer. a) Chuẩn bị: Môi trường thạch thường pH = 7,2± 0,2 được đổ vào các đĩa petri với lượng 20 ml, độ dày 4mm. Giấy tẩm kháng sinh: khi sử dụng để ở nhiệt độ phòng. Canh trùng nuôi ở 37oC/18 - 24 giờ. Buồng cấy vô trùng, khử trùng bằng đèn tử ngoại (UV). b) Cách tiến hành: Vi khuẩn gây bệnh sau khi phân lập thuần khiết được dàn đều trên mặt thạch. Đợi 3 – 5 phút cho ráo mặt thạch. Đặt các khoanh giấy kháng sinh lên bề măth thạch bằng một pink kẹp vô trùng. Không dịch chuyển khoanh giấy khi nó đã tiếp xúc với mặt thạch. Dùng đầu pink ấn nhẹ khoanh giấy để đảm bảo khoanh giấy tiếp xúc hoàn toàn với mặt thạch. Các khoanh giấy đặt cạnh nhau ít nhất 24mm tương đương 6 khoanh trên đĩa đường kính 90mm. Đợi 15 phút đặt voà tủ ấm 37oC/ 16 – 18h c) Đánh giá: Để đánh giá tính mẫn cảm, tính kháng thuốc dựa vào kết quả đo đường kính vòng . Nếu cạnh của vòng ức chế không rõ nét thì phải đọc đường kính lớn nhất, nhỏ nhất rồi cộng chia trung bình. Đường kính của vòng vô khuẩn được tính ra mm và được đánh giá: Mẫn cảm cao (H), mẫn cảm trung bình (I), hay kháng (R). Nếu khuẩn lạc mọc trong vòng ức chế rõ ràng thì phải nuôi cấy, phân lập lại. 34 Bảng 3.1 Đánh giá đường kính vòng vô khuẩn Đường kính vòng vô khuẩn (mm) STT Tên kháng sinh Kí hiệu mã hoá Lượng kháng sinh (àg) R (≤) I H(≥) 1 Amoxycillin/ Clavulanic acid AMC 20/10 13 14-17 18 2 Colistin sulphate CL 10 8 9-10 11 3 Enrofloxacin ENR 20 16 17-19 20 4 Gentamycin GM 10 12 13-14 15 5 Kanamycin K 30 13 14-17 18 6 Neomycin N 30 12 13-16 17 7 Norfloxacin NOR 10 12 13-16 17 8 Sulfamethoxazol – Trimethoprim SXT 23,75/1,25 10 11-15 16 9 Tetracyclin TE 30 14 15-18 19 10 Penecillin * P 10UI 11 12-21 22 Nguồn: Oxoid từ NCCLS (1990) M2 A4 (1982). Ghi chú: H (High): mẫn cảm cao I (Intermediate): mẫn cảm trung bình R (Resistant): kháng Penecillin*: đối chứng âm để kiểm tra lại kết quả phân lập. 3.5. Phương pháp sử lý số liệu Xử lý số liệu theo phương pháp thống kê sinh học và sử dụng phần mềm tin học Excel. 35 4. KẾT QUẢ THẢO LUẬN 4.1. Xác định sự biến động về số lượng, số loại vi khuẩn hiếu khí trong phân lợn con theo mẹ ở trạng thái bình thường và bị bệnh LCPT Trong đường tiêu hoá của lợn có nhiều loại vi khuẩn, chúng phong phú cả về chủng loại, số lượng. Ở trạng thái sinh lý, các vi khuẩn tồn tại thể cân bằng và tương đối ổn định, chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình tiêu hoá và hấp thu dinh dưỡng. Bên cạnh đó nó còn có tác dụng bảo vệ cơ thể khỏi sự xâm nhiễm của các vi khuẩn lạ và vi khuẩn gây bệnh bằng việc tiết ra các chất ức chế cũng như cạnh tranh về dinh dưỡng làm cho các vi khuẩn này không tăng trưởng được, không gây bệnh. Khi có bất kỳ một tác động nào đó như các tác nhân có hại nhiệt độ, độ ẩm, gió mùa, thay đổi thành phần thức ăn, vi khuẩn gây bệnh xâm nhập vào đường tiêu hoá.... đã làm phá vỡ sự cân bằng trong hệ vi khuẩn cư trú thường xuyên ở đường tiêu hoá. Từ đó các loài vi khuẩn hoặc chỉ một loài vi khuẩn loài nào đó sản sinh mạnh lên dẫn tới loạn khuẩn đường ruột. Các vi khuẩn gây bệnh tăng lên về số lượng, tăng cường độc lực và gây tiêu chảy, phân trắng ở lợn con. Khi lợn bị bệnh LCPT, số lượng vi khuẩn trong đường ruột tăng đột biến, số lượng và thành phần của các vi khuẩn thay đổi không giống nhau giữa các độ tuổi, giữa các thể bệnh. Để thấy rõ sự biến động này, cũng như xác định xem vi khuẩn nào là nguyên nhân chính gây nên tượng loạn khuẩn trong đường ruột của lợn bị bệnh LCPT, chúng tôi tiến hành thí nghiệm xác định tổng số vi khuẩn hiếu khí, định lượng từng loại vi khuẩn riêng biệt có mặt trong phân lợn bị bệnh LCPT. Do điều kiện thực tập có nhiều hạn chế, nên chúng tôi chỉ tiến hành phân lập và đếm tổng số lượng của bốn loại vi khuẩn hiếu khí điển hình (theo nhiều nghiên cứu đã khẳng định chúng là tác nhân gây lên hiện tượng tiêu chảy ở người và động vật). Trước hết, để có cơ sở so sánh, chúng tôi tiến hành xác định số lượng và các loại vi khuẩn hiếu 36 khí có mặt trong phân lợn con bình thường. 4.1.1. Kết quả kiểm tra số lượng, tỷ lệ các loại vi khuẩn hiếu khí có trong phân lợn con theo mẹ ở trạng thái bình thường. Trong hệ tiêu hoá của bất cứ loài động vật nào đều có một khu hệ vi sinh vật đường ruột vô cùng phong phú cả về số lượng và chủng loại. Theo Tô Thị Phượng (2006)[13] khi nghiên cứu biến động của Salmonell sp và E.coli ở lợn qua các lứa tuôi thấy, có 100% các mẫu phân có vi khuẩn E.coli, 41,165% các mẫu phân có vi khuẩn Salmonella sp. Sau khi nuôi cấy trên các môi trường thông thường và môi trường chuyên dụng chúng tôi đã xác định được tổng số ._.