Kiểm nghiệm và khảo nghiệm Vacxin H5N1 của Trung Quốc trên vịt

o khác. Tôi xin cam đoan rằng mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện luận văn này đ1 đ−ợc cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đ1 đ−ợc chỉ rõ. Tác giả Vũ Thị Mỹ Hạnh i 3 Lời cảm ơn Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới: - TS. Tô Long Thành, ng−ời h−ớng dẫn khoa học trực tiếp đ1 đóng góp nhiều ý kiến quan trọng từ những b−ớc nghiên cứu ban đầu đến quá trình thực hiện viết luận văn. - PGS.TS. Tr−ơng Quang, các thầy cô trong bộ môn Vi sinh vật - Truyền nhiễm - Bệnh lý cùng toàn thể các thầy cô giáo Khoa Thú y và Khoa Sau Đại học, Tr−ờng ĐHNNI Hà Nội đ1 tạo điều kiện và đóng góp nhiều ý kiến quý báu cho tôi hoàn thành luận văn này. - Ban l1nh đạo Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung −ơng I và các bạn đồng nghiệp đ1 giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. - Ban l1nh đạo cùng tập thể cán bộ công nhân viên Trung tâm Chẩn đoán Thú y Trung −ơng đ1 tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong thời gian thực tập. - Cảm ơn các nhà khoa học trong ngành, các đồng nghiệp, bè bạn và ng−ời thân đ1 động viên giúp đỡ tôi trong quá trình công tác và học tập. Tác giả Vũ Thị Mỹ Hạnh ii 4 Mục lục Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục các chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình ix 1. Mở đầu 1 1.1 Đặt vấn đề 1 1.2 Mục tiêu đề tài 2 2. Tổng quan tài liệu 3 2.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm 3 2.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm 3 2.1.2 Bệnh cúm gia cầm trên thế giới và châu á 4 2.1.3 Tóm tắt tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam 6 2.2 Virus học bệnh cúm gia cầm 7 2.2.1 Cấu trúc chung của virus 7 2.2.2 Quá trình nhân lên của virus 11 2.2.3 Tính đa dạng của kháng nguyên 12 2.2.4 Sức đề kháng của virus 14 2.2.5 Độc lực của virus 14 2.2.6 Nuôi cấy và l−u giữ virus cúm gia cầm 15 2.3 Miễn dịch chống bệnh cúm gia cầm 15 2.3.1 Miễn dịch tự nhiên 16 2.3.2 Miễn dịch đặc hiệu 17 iii 5 2.4 Dịch tễ học của bệnh cúm gia cầm 21 2.4.1 Động vật cảm nhiễm 21 2.4.2 Động vật mang virus 22 2.4.3 Sự truyền lây 23 2.4.4 Mùa vụ phát bệnh 25 2.5 Triệu chứng 25 2.6 Bệnh tích 26 2.7 Chẩn đoán 26 2.8 Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới và khuyến cáo của tổ chức dịch tễ thế giới 27 2.8.1 Vacxin truyền thống 28 2.8.2 Vacxin tái tổ hợp 30 2.8.3 Chiến l−ợc DIVA 31 2.8.4 Yêu cầu cần đạt đ−ợc với vacxin phòng bệnh cúm gia cầm 31 2.8.5 Tình hình sử dụng vacxin cúm gia cầm trên thế giới 32 2.8.6 Khuyến cáo của OIE về việc sử dụng vacxin phòng chống cúm gia cầm 34 3. Nội dung, nguyên liệu và ph−ơng pháp nghiên cứu 36 3.1 Nội dung nghiên cứu 36 3.1.1 Kiểm nghiệm vacxin cúm gia cầm H5N1 của Trung Quốc 36 3.1.2 Khảo nghiệm vacxin cúm gia cầm H5N1 của Trung Quốc ngoài thực địa 36 3.2 Nguyên liệu dùng trong nghiên cứu 36 3.2.1 Động vật thí nghiệm 36 3.2.2 Vacxin 36 3.2.3 Các trang thiết bị và cơ sở vật chất 36 iv 6 3.3 Ph−ơng pháp nghiên cứu 36 3.4 Bố trí thí nghiệm 43 4. Kết quả và thảo luận 47 4.1 Kết quả kiểm nghiệm vacxin cúm H5n1 của Trung Quốc trong 2 năm 2006-2007 47 4.1.1 Kết quả kiểm tra vô trùng 47 4.1.2 Kết quả kiểm tra an toàn 48 4.1.3 Kết quả kiểm tra hiệu lực 50 4.2 Kết quả khảo nghiệm vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc trên vịt ngoài thực địa 52 4.2.1 Kết quả khảo nghiệm vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc trên vịt tại 2 trại thuộc tỉnh Bắc Ninh 53 4.2.2 Kết quả giám sát sau tiêm phòng vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc trên vịt ở một số trại giống trung −ơng và địa ph−ơng 70 5. kết luận 81 Tài liệu tham khảo 83 v 7 Danh mục các chữ viết tắt AI Avian Influenza FAO Food and Agriculture Organization GMT Geometic Mean Title HA Haemagglutination Assay HI Haemagglutination Inhibition Assay HPAI Highly Pathogenic Avian Influenza KN Kháng nguyên KT Kháng thể LPAI Lowly Pathogenic Avian Influenza OIE Office International edes Epizooties RNA Ribonucleic acid RT-PCR Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction vi 8 Danh mục bảng Bảng 4.1 Tổng hợp kết quả kiểm tra vô trùng vacxin H5N1 của Trung Quốc trong 2 năm 2006-2007 48 Bảng 4.2 Tổng hợp kết quả kiểm tra an toàn vacxin H5N1 của Trung Quốc trong 2 năm 2006-2007 49 Bảng 4.3 Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc trong 2 năm 2006-2007 50 Bảng 4.4 Kết quả giám sát sự cảm nhiễm và sự l−u hành của virus cúm H5N1 trên đàn vịt khảo nghiệm 55 Bảng 4.5 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 3 tuần sau tiêm vacxin lần thứ nhất 56 Bảng 4.6 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 5 tuần sau tiêm vacxin lần thứ nhất 59 Bảng 4.7 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 7 tuần sau tiêm vacxin lần thứ nhất 61 Bảng 4.8 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 9 tuần sau tiêm vacxin lần thứ nhất 64 Bảng 4.9 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 11 tuần sau tiêm vacxin lần thứ nhất 66 Bảng 4.10 Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể trung bình trong huyết thanh vịt đ−ợc tiêm vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc 68 vii 9 Bảng 4.11 Kết quả xác định sự có mặt của virus H5 trong dịch ngoáy ổ nhớp của vịt tr−ớc và sau khi tiêm vacxin 71 Bảng 4.12 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 1-2 tháng sau tiêm vacxin năm 2006 73 Bảng 4.13 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 3-4 tháng sau tiêm vacxin năm 2006 75 Bảng 4.14 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 1-2 tháng sau tiêm vacxin năm 2007 77 Bảng 4.15 Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt sau tiêm vacxin trong 2 năm 2006-2007 79 viii 10 Danh mục hình Hình 2.1 Cấu trúc virus cúm d−ới kính hiển vi điện tử 8 Hình 2.2 Cấu trúc virus H5N1 9 Hình 2.3 Các kiểu đột biến 13 Hình 2.4 Đ−ờng truyền lây của virus cúm 24 Hình 4.1 Biến động hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của gà đ−ợc tiêm vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc trong 2 năm 2006- 2007 52 Hình 4.2 Diễn biến hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 3 tuần sau tiêm vacxin mũi 1 57 Hình 4.3 Diễn biến hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 5 tuẫn sau tiêm vacxin mũi 1 58 Hình 4.4 Diễn biến hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 7 tuần sau tiêm vacxin mũi 1 62 Hình 4.5 Diễn biến hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 9 tuần sau tiêm vacxin mũi 1 63 Hình 4.6 Diễn biến hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của vịt tại thời điểm 11 tuần sau tiêm mũi 1 65 Hình 4.7 Biến động tỷ lệ bảo hộ của vịt tại các thời điểm sau tiêm vacxin H5N1 của Trung Quốc ở 2 trại tại tỉnh Bắc Ninh 69 Hình 4.8 Biến động hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của vịt ở thời điểm 1-2 tháng và 3-4 tháng sau tiêm vacxin H5N1 của Trung Quốc trong 2 năm 2006-2007 80 ix 1 1. Mở ĐầU 1.1 Đặt vấn đề Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc độ lây lan rất nhanh với tỷ lệ gây chết cao trong đàn gia cầm nhiễm bệnh. Bệnh xảy ra ở khắp nơi trên thế giới và gây thiệt hại về mặt kinh tế, có ảnh h−ởng lớn đến chính trị, x1 hội,... Vì vậy, bệnh cúm gia cầm đ−ợc Tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) xếp vào bảng A các bệnh truyền nhiễm cực kỳ nguy hiểm. H5N1 là 1 type phụ (subtype) của virus cúm A, có khả năng lây truyền mạnh. Không những thế ng−ời ta đ1 thấy bệnh cúm gia cầm do H5N1 có thể lây từ gà sang ng−ời, thậm chí gây tử vong. Số ng−ời chết do nhiễm cúm gia cầm H5N1 lại ngày một tăng khiến cộng đồng quốc tế lo ngại về nguy cơ xảy ra đại dịch cúm ở ng−ời. Các chuyên gia nghiên cứu virus và bệnh gia cầm đ1 đánh giá “vịt nuôi có thể là mối đe dọa bệnh cúm gia cầm mới”. Các tổ chức quốc tế nh− FAO, OIE và WHO đ1 đồng loạt cảnh báo về vai trò của vịt nuôi đối với việc tàng trữ và truyền lây virus cúm gia cầm. Hiện tại, vịt không những là con vật tàng trữ “thầm lặng” ủối với virus cúm H5N1 mà còn có thể gây bệnh thể ủộc lực cao và rất có khả năng gây biến chủng thành virus gây bệnh cho ng−ời. Trung Quốc là n−ớc có tổng đàn gia cầm lớn nhất thế giới, với 4,5 tỷ gà, khoảng 660 triệu con vịt và khoảng 228 triệu con ngỗng. Chính vì vậy, Trung Quốc không thể sử dụng duy nhất biện pháp tiêu huỷ để dập tắt dịch cúm gia cầm, nhất là đối với thuỷ cầm tại vùng đầm lầy, sông n−ớc. ðể phòng chống virus cúm gia cầm H5N1, Bộ Nông nghiệp Trung Quốc ủ1 cho phép l−u hành và sử dụng 3 loại vacxin trên toàn quốc: vacxin vô hoạt virus cúm gia cầm thể độc lực cao H5N2, vacxin vô hoạt cúm gia cầm H5N1 tái tổ hợp và vacxin tái tổ hợp virus sống đậu gà H5N1. Bộ Nông 2 nghiệp Trung Quốc cũng đ1 giám sát và đánh giá các loại vacxin này từ cuối năm 2004. Vacxin vô hoạt virus H5N1 tái tổ hợp thậm chí có tác dụng tốt hơn vacxin H5N2 bởi vì thời gian phòng hộ của nó đối với gà dài hơn và đặc biệt nó có hiệu quả tạo miễn dịch đối với thủy cầm. Vacxin có thể làm dừng sự lây lan của virus. Hiện nay, vacxin này đ−ợc sử dụng rộng r1i cho thủy cầm ở những vùng nhiều sông n−ớc của phía Nam Trung Quốc. Khi dịch xảy ra, Việt Nam đ1 tiến hành hàng loạt biện pháp nh− tiêu huỷ đàn gia cầm, cấm l−u thông, tiêu thụ gia cầm và sản phẩm gia cầm nhiễm bệnh, kiểm soát giết mổ và dùng các biện pháp an toàn sinh học để phòng chống bệnh. Những biện pháp này cũng đ1 cho những kết quả nhất định, nh−ng rất tốn kém mà ch−a khống chế đ−ợc bệnh một cách có hiệu quả. Theo kinh nghiệm Trung Quốc có thể lấy việc sử dụng vacxin làm một biện pháp hỗ trợ tích cực trong việc phòng và hạn chế bệnh cúm gia cầm. Song n−ớc ta lại ch−a sản xuất đ−ợc vacxin nên Cục Thú y xem việc nhập vacxin từ Trung Quốc là một giải pháp cấp bách cho việc phòng chống cúm gia cầm tại các địa ph−ơng trong n−ớc từ các năm 2005-2006 và tiếp tục thực hiện cho đến năm 2008. Vì vậy chúng thực hiện đề tài: “Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vacxin H5N1 của Trung Quốc trên vịt” nhằm đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của vịt để có những đề xuất chính xác và tham vấn với l1nh đạo trong việc chỉ đạo phòng và hạn chế bệnh dịch cúm gia cầm ở n−ớc ta trong giai đoạn hiện nay. 1.2 Mục tiêu đề tài - Đánh giá hiệu lực của vacxin trên qui mô phòng thí nghiệm. - Đánh giá khả năng đáp ứng miễn dịch của đàn vịt đ−ợc tiêm vacxin tại các thời điểm sau khi tiêm ngoài thực địa. 3 2. Tổng quan tài liệu 2.1 Giới thiệu chung về bệnh cúm gia cầm 2.1.1 Lịch sử bệnh cúm gia cầm Vào năm 1878, Porroncito (Italy) là ng−ời đầu tiên mô tả bệnh cúm gia cầm (Avian Influenza - AI) với tên gọi bệnh “Dịch tả gia cầm” (Fowl plague) [44]. Bệnh đ−ợc xem là một bệnh quan trọng và nguy hiểm. Đến năm 1901, Centanni và Savunozzi mới xác định đ−ợc căn nguyên là một tác nhân qua lọc (filterable agent) [70]. Sau đó, phải đến năm 1955 Schafer mới xác định đ−ợc bệnh là do virus cúm type A thông qua kháng nguyên bề mặt H7N1 và H7N7 gây chết nhiều gà, gà tây và các loài chim khác [2], [10], [11], [26], [78]. Năm 1963, virus cúm type A đ−ợc phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú dẫn nhập virus vào đàn gà. Cuối thập kỷ 60, phân type H1N1 thấy ở lợn và có liên quan tới những ổ dịch ở gà tây với biểu hiện triệu chứng đặc tr−ng ở đ−ờng hô hấp và giảm đẻ. Từ sau khi phát hiện virus cúm type A, các nhà khoa học đ1 tăng c−ờng nghiên cứu và thấy virus cúm có ở nhiều loài chim hoang d1 và gia cầm nuôi ở những vùng khác nhau trên thế giới [3]. Bệnh cũng đ−ợc Beard C.W [37] mô tả khá kỹ ở Mỹ vào năm 1971 qua đợt dịch cúm khá lớn ở gà tây. Các tác giả cho biết bệnh dịch nghiêm trọng nhất xảy ra đối với gia cầm là do những chủng gây bệnh có độc lực cao thuộc phân type H5 và H7, nh− ở Scotland năm 1959 là H5N1, ở Mỹ năm 1983-1984 là H5N2. Những công trình nghiên cứu có hệ thống về bệnh này cũng lần l−ợt đ−ợc công bố ở Australia (1975), ở Anh (1979) và ở Mỹ (1983-1984). Các năm tiếp theo bệnh đ−ợc phát hiện ở Nam Mỹ, Bắc Mỹ rồi Nam Phi, Trung Cận Đông, châu Âu, Liên hiệp Anh và Liên Xô cũ [10], [11]. Ngoài ra, 4 Alexander cũng đ1 thống kê đ−ợc các ổ dịch cúm gia cầm lớn ở: Australia (1975-1985), Anh (1979), Mỹ và Ireland (1983-1984), Mehico (1994) [34], [35], [36]. Đặc biệt ở Hồng Kông năm 1997, virus không chỉ gây bệnh cho gia cầm mà còn lây nhiễm và gây tử vong cho ng−ời [27], [28]. Dịch cúm gia cầm liên tục bùng nổ khắp các châu lục trên thế giới, đ1 thúc đẩy các hiệp hội chăn nuôi gia cầm và các nhà khoa học tổ chức hội thảo chuyên đề về bệnh cúm gia cầm (Hội thảo lần đầu tiên đ−ợc tổ chức vào năm 1981 tại Beltsville MD, lần thứ 2 tại Athen năm 1986, lần 3 tại Madison WI vào năm 1992, lần thứ 4 và thứ 5 tại Athen vào các năm 1997 và 2003 [74]. Từ đó đến nay, trong các hội thảo về dịch tễ, bệnh cúm gia cầm luôn là một trong những nội dung đ−ợc coi trọng. Virus có mặt ở hầu hết các loài lông vũ, từ gia cầm đến các loài hoang d1, động vật có vú nh− cá voi [51], hải cẩu, hổ, chồn [64], cầy h−ơng [32], và cả con ng−ời [2], [10], [11], [49], [50]. 2.1.2 Bệnh cúm gia cầm trên thế giới và châu á Virus cúm gia cầm có mặt khắp nơi gây dịch bệnh ở nhiều n−ớc trên thế giới. Năm 1878 tại Italy, vụ dịch xảy ra và đ−ợc ghi nhận lần đầu ở gia cầm với tỷ lệ chết cao đ−ợc gọi là “Dịch tả gia cầm”. Đến năm 1901, Centanni và Savunozzi đ1 xác định đ−ợc nguyên nhân gây ra bệnh là virus [70]. Tuy nhiên đến năm 1955 ng−ời ta mới chứng minh đ−ợc virus gây bệnh dịch tả gia cầm là virus cúm type A (H7N1 và H7N7) [10], [44], [74]. Trong những năm 20 của thế kỷ tr−ớc, bệnh đ1 xuất hiện tại Mỹ, châu Phi và vùng Viễn Đông. Năm 1959, bệnh xảy ra trên đàn gà ở Scotland do virus cúm type A H5 [10], [74]. 5 Năm 1963, virus cúm type A đ−ợc phân lập từ gà tây ở Bắc Mỹ do loài thuỷ cầm di trú dẫn nhập virus vào đàn gà. Cuối thập kỷ 60, subtype H1N1 thấy ở lợn và có liên quan tới sự tái tổ hợp gen của virus cúm gia cầm [74]. Năm 1977 ở Minesota đ1 phát hiện dịch ở gà tây do chủng H7N7. Năm 1983-1984 ở Mỹ, dịch cúm gia cầm xảy ra do chủng virus H5N2 [20]. Năm 1986, ở Australia dịch cúm gà xảy ra tại bang Victoria do chủng H5N2. Năm 1997, ở Hồng Kông dịch cúm gà xảy ra do virus cúm type A subtype H5N1. Toàn bộ gia cầm của l1nh thổ này đ1 bị tiêu diệt vì bệnh đ1 gây tử vong cho con ng−ời [9]. Nh− vậy, đây là lần đầu tiên virus cúm gia cầm đ1 v−ợt “rào cản về loài” để lây cho ng−ời ở Hồng Kông làm cho 18 ng−ời nhiễm bệnh, trong đó có 6 ng−ời chết [25]. Năm 2003, tại Hà Lan dịch cúm gia cầm xảy ra với quy mô lớn do chủng H7N7 gây ra [20]. Từ đầu tháng 12 năm 2003, dịch xuất hiện đầu tiên ở Hàn Quốc sau đó dịch đ1 xảy ra ở nhiều n−ớc khác với những diễn biến phức tạp [21]. Trong tháng 2/2004, một số n−ớc đ1 tuyên bố khống chế đ−ợc dịch, song cũng có một số n−ớc lại tái phát lần thứ 2, 3 nh− Thái Lan, Campuchia, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Đây là lần đầu tiên trong lịch sử bệnh cúm gia cầm xảy ra nhanh, trên diện rộng và diễn biến phức tạp ở các n−ớc châu á [27]. Đến cuối tháng 2 năm 2004 đ1 có 11 n−ớc và vùng l1nh thổ công bố dịch là: Hàn Quốc, Nhật Bản, Thái Lan, Lào, Campuchia, Việt Nam, Indonexia, Trung Quốc, Hồng Kông, Đài Loan và Pakistan. Chủng virus độc lực cao gây bệnh đ1 đ−ợc phân lập và định type là H5N1 là chủ yếu, ngoài ra còn H5N2 ở Đài Loan và H7N3, H9N2 ở Pakistan, H7 ở Cộng hoà Dân chủ Nhân dân Triều Tiên. Tại một số n−ớc khác nh− Nam Phi phân lập đ−ợc H6 và 6 H5N2, Ai Cập là H10N7, Canada là H7N3, Hoa Kỳ là H7N2. Trong đợt dịch cúm này có khoảng 120 triệu gia cầm bao gồm: gà, gà tây, gà sao, gà lôi, vịt, ngan, ngỗng, cút, bồ câu, và một số loài chim hoang d1 đ1 bị nhiễm bệnh và nằm trong vùng dịch phải tiêu huỷ. Hàng trăm ng−ời bị lây nhiễm bệnh, trong đó có trên 20 ng−ời bị chết [3]. Năm 2005, Dịch cúm gia cầm H5N1 đ1 xảy ra ở Myanmar, Kazăctan, Nga, Rumani, Ukraina và H7 xảy ra ở Bình Nh−ỡng [27], [30]. Nh−ng cho đến năm 2006 và đầu năm 2007, nhiều quốc gia và vùng l1nh thổ trên thế giới đ1 có báo cáo về các ổ dịch cúm H5N1 ở gia cầm, đặc biệt là tại Indonexia, dịch cúm tấn công làm chết nhiều gia cầm và ng−ời. Các quốc gia khác có ngành chăn nuôi tiên tiến nh−: Hàn Quốc, Nhật Bản và một số quốc gia ở châu Âu nh−: Nga, Hungari, Rumani, Anh,… cũng đều ghi nhận có các ổ dịch ở gia cầm. Năm 2006 cũng là năm ghi nhận nhiều ổ dịch cúm trên gia cầm tại một số quốc gia châu Phi, nơi đ−ợc cho là virus cúm gia cầm có nguy cơ biến đổi và gây đại dịch cúm ở ng−ời. 2.1.3 Tóm tắt tình hình bệnh cúm gia cầm ở Việt Nam Dịch cúm gia cầm lần đầu tiên xuất hiện tại Việt Nam từ cuối tháng 12/2003 đến 15/12/2005 dịch cúm gia cầm đ1 hoàn toàn đ−ợc khống chế. Về diễn biến dịch, có thể chia ra làm 4 đợt dịch chính: - Đợt 1: Từ tháng 12/2003 đến hết tháng 3/2004, dịch xảy ra ở 2.574 x1, ph−ờng, 381 huyện, quận, thị x1 thuộc 57 tỉnh. - Đợt 2: Từ tháng 4/2004 đến tháng 11/2004, dịch phát ra rải rác với quy mô nhỏ ở các hộ gia đình chăn nuôi gia cầm; bệnh xuất hiện ở 46 x1, ph−ờng tại 32 huyện, quận, thị x1 thuộc 17 tỉnh. Thời gian cao điểm nhất là tháng 7 sau đó giảm dần, đến tháng 11 cả n−ớc chỉ có 1 điểm phát dịch. - Đợt 3: Từ tháng 12/2004 đến tháng 5/2005, dịch đ1 xuất hiện ở 670 x1 của 182 huyện thuộc 36 tỉnh, thành phố. 7 - Đợt 4: Từ tháng 10/2005 đến 15/12/2005, dịch đ1 xuất hiện ở 305 x1, ph−ờng của 108 quận, huyện thuộc 24 tỉnh, thành phố. Kể từ 15/12/2005 đến 5/12/2006, trong gần 1 năm toàn quốc không ghi nhận thêm ổ dịch cúm gia cầm nào. Sau đó đến ngày 6/12/2006 dịch lại tiếp tục bùng phát ở một số khu vực: - Tại 8 tỉnh khu vực Đồng bằng sông Cửu Long: Ngày 6/12/2006, dịch cúm gia cầm bắt đầu tái phát tại ấp Rạch Lùm B, x1 Khánh H−ng, huyện Trần Văn Thời tỉnh Cà Mau. Sau đó, dịch lây lan ra 80 x1, ph−ờng, thị trấn của 37 huyện thuộc 8 tỉnh, thành phố là Cà Mau, Bạc Liêu, Hậu Giang, Cần Thơ, Trà Vinh, Vĩnh Long, Kiên Giang và Sóc Trăng. Đến ngày 22/1/2007 dịch đ1 đ−ợc khống chế và dập tắt. - Tại Hải D−ơng: Ngày 14/2/2007, dịch cúm gia cầm phát ra tại một trang trại chăn nuôi gà ở x1 Đoan Tùng, huyện Thanh Miện (Thanh Miện là huyện không phát sinh dịch trong 2 năm 2005 và 2006). Đây là trang trại lần đầu tiên chăn nuôi gà và tự mua gà về nuôi gia công để bán. - Vĩnh Long: Ngày 25/2/2007, dịch cúm gia cầm đ1 xảy ra tại x1 Thới Hoà huyện Trà Ôn tỉnh Vĩnh Long ở đàn vịt 800 con 45 ngày tuổi, ch−a đ−ợc tiêm phòng vacxin, đây là đàn vịt chạy đồng đ−ợc chuyển từ Sóc Trăng đến. Kết quả xét nghiệm d−ơng tính với virus cúm H5N1. - Tại Hà Tây: Ngày 26/2/2007, dịch cúm gia cầm xảy ra tại một hộ chăn nuôi gà ở x1 Canh Nậu, huyện Thạch Thất. Đàn gà 550 con, khoảng 1-2 tháng tuổi, giống L−ơng Ph−ợng, ch−a đ−ợc tiêm phòng vacxin. 2.2 Virus học bệnh cúm gia cầm 2.2.1 Cấu trúc chung của virus Virus cúm gia cầm là một thành viên của họ Orthomyxoviridae. Họ này bao gồm có 4 nhóm virus: - Nhóm virus cúm A: Gây bệnh cho mọi loài chim, một số động vật có vú và con ng−ời. 8 - Nhóm virus cúm B: Chỉ gây bệnh cho ng−ời. - Nhóm virus cúm C: Gây bệnh cho ng−ời và lợn. - Nhóm Thogotovirus. Virus thuộc họ Orthomyxoviridae có đặc tính cấu trúc chung là hệ gen chứa axit Ribonucleic (ARN) một sợi, có cấu trúc là sợi âm đ−ợc ký hiệu là ss (-)ARN (Negative Single Stranded ARN). Sợi âm ARN của hệ gen có độ dài từ 10.000-15.000 nucleotit (tùy loại virus), mặc dù nối với nhau thành 1 sợi ARN liên tục, nh−ng hệ gen lại chia thành 6-8 phân đoạn (segment), mỗi phân đoạn là một gen chịu trách nhiệm m1 hoá cho mỗi loại protein của virus [17], [67]. Hình 2.1 Cấu trúc virus cúm d−ới kính hiển vi điện tử Hạt virus (virion) có cấu trúc hình khối, đôi khi có dạng hình khối kéo dài, đ−ờng kính khoảng 80-120 nm. Vỏ virus có bản chất protein, có nguồn gốc từ nguồn tế bào mà virus đ1 gây nhiễm, bao gồm một số protein đ−ợc glycosyl hóa (glycoprotein) và một số protein dạng trần không đ−ợc glycosyl hóa (non glycosylated protein). 9 Protein bề mặt có cấu trúc từ các loại glycoprotein, đó là những gai, mấu có độ dài 10-14 nm, đ−ờng kính 4-6 nm. Nucleocapsid bao bọc lấy nhân virus là tập hợp của nhiều protein phân đoạn, cấu trúc đối xứng xoắn, kích th−ớc 130-150 nm, tạo vòm (loop) ở giới hạn cuối của mỗi phân đoạn và liên kết với nhau qua cầu nối các peptit. Phân tử l−ợng của hạt virus vào khoảng 250 triệu dalton. 2.2.1.1 Hình thái và cấu trúc Hình 2.2 Cấu trúc virus H5N1 Vỏ bọc của virus là glycoprotein có các kháng nguyên bề mặt nh−: loại protein gây ng−ng kết hồng cầu có tên gọi là Haemagglutinin (HA) và loại protein có chức năng là một loại enzym phá hủy thụ thể của virus có tên gọi là Neuraminidae (NA). Chúng là các glycoprotein riêng biệt [60]. Hạt virion có cấu trúc là axit Ribonucleic, là một sợi đơn, có độ dài 13.500 nucleotit chứa 8 phân đoạn kế tiếp nhau m1 hóa cho 10 loại protein khác nhau của virus: HA, NA, NP, M1, M2, PB1, PB2, PA, NS1, NS2. Đoạn ARN có trọng l−ợng nhỏ nhất mang mật m1 cho 2 loại không có cấu trúc protein là NS1 và NS2, chúng dễ dàng tách đ−ợc ở các tế bào bị nhiễm. Tất cả 8 đoạn của sợi ARN có thể tách và phân biệt dễ dàng qua ph−ơng pháp điện di [67]. 10 - 3 phân đoạn lớn đầu tiên m1 hóa cho 3 loại protein PB1, PB2 và PA (RNA Polymerase). Các protein này có vai trò làm enzym tổng hợp axit ribonucleic nguyên liệu cho hệ gen và các ARN thông tin tổng hợp protein của virus [38]. - Phân đoạn 4 m1 hóa cho protein Haemagglutinin (HA) là một protein bề mặt cắm gốc vào bên trong, có chức năng bám dính vào thụ thể của tế bào, có khả năng gây ng−ng kết hồng cầu, có khả năng hợp nhất vỏ virus với màng tế bào nhiễm và tham gia vào phản ứng trung hòa virus [39]. HA là polypeptit gồm 2 chuỗi HA1 và HA2 nối với nhau bằng đoạn oligopeptit ngắn, thuộc loại hình mô type riêng đặc tr−ng cho các subtype H (H1-H16) trong tái tổ hợp tạo nên biến chủng [39], [41]. Mô type của chuỗi oligopeptit này chứa một số axit amin cơ bản làm khung, thay đổi đặc hiệu theo từng loại hình subtype H. Sự thay đổi thành phần của chuỗi nối quyết định độc lực của virus thuộc biến chủng mới [17], [39], [54], [77]. - Phân đoạn 5 m1 hóa cho protein Nucleoprotein (NP) một loại protein đ−ợc phosphoryl hóa, có biểu hiện tính kháng nguyên đặc hiệu theo nhóm (Group - Specific), tồn tại trong hạt virion trong dạng liên kết với mỗi phân đoạn ARN nên loại NP còn đ−ợc gọi là Ribonucleo protein [17], [40]. - Protein enzim Neuraminidae (NA) do phân đoạn 6 m1 hóa, có chức năng là một enzim phân cắt HA sau khi virus vào bên trong tế bào nhiễm [42]. - Phân đoạn 7 m1 hóa cho 2 tiểu phần protein đệm (Matrix protein) M1 và M2 là protein màng không đ−ợc glycosyl hóa, có vai trò làm đệm bao bọc lấy ARN hệ gen. M2 là một Tetramer có chức năng tạo khe H+ giúp cởi bỏ virus sau khi xâm nhập vào tế bào cảm nhiễm. M1 có chức năng tham gia vào quá trình tổng hợp và nảy mầm của virus [53]. - Phân đoạn 8 có độ dài ổn định (890 nucleotit) m1 hóa cho 2 tiểu phần protein cấu trúc NS1 và NS2 có chức năng chuyển ARN từ nhân ra kết hợp với M1, kích thích phiên m1, chống interferon [65]. 11 2.2.1.2 Thành phần hóa học của virus ARN của virus chiếm 0,8%-1,1%; protein chiếm 70%-75%; lipit chiếm 20%-24%; hydratcacbon chiếm 5%-8% khối l−ợng hạt virus. Lipit tập trung ở màng virus và chủ yếu là lipit có gốc phospho, số còn lại là cholesterol, glucolipit và một ít hydrocacbon gồm các loại men galactose, ribose, fructose, glucosamin. Thành phần protein chính của virus chủ yếu là glycoprotein [22]. 2.2.2 Quá trình nhân lên của virus Fener và cộng sự [46], Kingsbury [62] đ1 mô tả quá trình sinh sản của virus. Quá trình đó đ−ợc tóm tắt nh− sau: Virus xâm nhập vào tế bào nhờ chức năng của protein HA thông qua hiện t−ợng ẩm bào (endocytosis) qua cơ chế trung gian tiếp hợp thụ thể. Thụ thể liên kết tế bào của virus cúm có bản chất là axit sialic cắm sâu vào glycoprotein hay glycolipit của vỏ virus. Trong khoang ẩm bào, khi nồng độ pH đ−ợc điều hòa để giảm xuống mức thấp sẽ xảy ra quá trình hợp nhất màng tế bào và virus. Sự hợp nhất này phụ thuộc vào sự cắt rời protein HA nhờ enzim peptidase và enzim protease của tế bào. Lúc này nucleocapsid của virus đi vào trong nguyên sinh chất rồi vào trong nhân tế bào, chuẩn bị thực hiện quá trình tổng hợp ARN nguyên liệu hệ gen cho các virion mới. Hệ thống enzim sao chép của virus ngay lập tức tạo nên các ARN thông tin. Các phân đoạn ARN hệ gen đ−ợc m1 hóa ở 10-13 nucleotit đầu 5’ với nguyên liệu m1 hóa lấy từ ARN tế bào, nhờ vào hoạt tính enzim PB2 của virus. ARN thông tin của virus sao chép trong nhân đ−ợc chuyển vận ra nguyên sinh chất, đ−ợc riboxom trợ giúp tổng hợp nên protein cấu trúc và protein nguyên liệu. Protein H, N, M2 ở lại trong nguyên sinh chất, đ−ợc vận chuyển xuyên qua hệ thống võng mạc nội mô (RE) và hệ golgi sau đó đ−ợc cắm lên màng tế bào nhiễm. Protein NS1, NP, M1 đ−ợc chuyển vận vào nhân để bao bọc đệm lấy nguyên liệu ARN hệ gen mới đ−ợc tổng hợp [17], [61]. Song song với quá trình sao chép ARN thông tin và tổng hợp protein 12 cấu trúc, protein nguyên liệu, virus tiến hành tổng hợp nguyên liệu di truyền là các sợi ARN mới. Từ sợi ARN âm đơn của virus ban đầu, một sợi d−ơng ARN toàn vẹn đ−ợc tạo ra theo cơ chế bổ sung, sợi d−ơng mới này lại làm khuôn để tổng hợp nên sợi âm ARN mới làm nguyên liệu. Các sợi âm ARN mới, một số vừa làm nguyên liệu để lắp ráp virion mới, số khác lại làm khuôn để tổng hợp ARN theo cơ chế nh− với sợi ARN của virus đầu tiên. Các sợi ARN hệ gen đ−ợc tạo ra là một sợi hoàn chỉnh về độ dài và đ−ợc các protein đệm (NS1, M1, NP) bao gói tạo nên ribonucleocapsid (nucleoriboprotein) ngay trong nhân tế bào nhiễm, sau đó đ−ợc chuyển vận ra nguyên sinh chất rồi đ−ợc chuyển vận đến vị trí màng tế bào có sự biến đổi đặc hiệu với virus. Sự kết hợp cuối cùng của tổ hợp nucleoriboprotein với các protein cấu trúc (HA, NA, M2) tạo nên các hạt virus hoàn chỉnh mới và đ−ợc giải phóng ra khỏi tế bào nhiễm theo hình thức nảy chồi [62]. Thực sự, chúng ta vẫn ch−a hiểu biết rõ ràng virus cúm gia cầm giết chết tế bào vật chủ nh− thế nào. Theo Hinshaw [52] thì các tế bào trong môi tr−ờng nuôi cấy bị phá hủy theo ph−ơng thức apoptosis. 2.2.3 Tính đa dạng của kháng nguyên Một đặc tính quan trọng là virus cúm có khả năng gây ng−ng kết hồng cầu của nhiều loài động vật. Đó là sự kết hợp giữa mấu lồi kháng nguyên HA trên bề mặt của virus cúm với thụ thể có trên bề mặt hồng cầu, làm cho hồng cầu ng−ng kết với nhau tạo thành mạng ng−ng kết thông qua cầu nối virus, gọi là phản ứng ng−ng kết hồng cầu HA (Heamagglutination test). Kháng thể đặc hiệu của kháng nguyên HA có khả năng trung hòa các loại virus t−ơng ứng, chúng là kháng thể trung hòa có khả năng triệt tiêu virus gây bệnh. Nó có thể phong tỏa sự ng−ng kết bằng cách kết hợp với kháng nguyên HA. Do vậy thụ thể của hồng cầu không bám vào đ−ợc để liên kết tạo thành mạng ng−ng kết. Ng−ời ta gọi phản ứng đặc hiệu KN-KT có hồng cầu tham gia là phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu HI (Heamagglutination 13 Inhibition test) Sự phức tạp trong diễn biến kháng nguyên của virus cúm là chúng th−ờng có đột biến gen dẫn đến sự biến đổi liên tục về tính kháng nguyên [55], [59]. Có 2 khả năng đột biến của virus cúm đó là: Hình 2.3 Các kiểu đột biến Đột biến điểm (Drift): A/Wuhan/95(H3N2)
A/Sydney/96(H3N2). Đột biến do tái tổ hợp di truyền (Shift):(H2N2)
A/Hongkong/68 H3N2). * Đột biến điểm (còn gọi là đột biến ngẫu nhiên hoặc hiện t−ợng trôi tr−ợt hoặc lệch lạc về kháng nguyên - antigenic drift) là kiểu đột biến xảy ra th−ờng xuyên, đặc biệt là đối với kháng nguyên H và kháng nguyên N tạo ra những sự thay đổi nhỏ về trình tự nucleotit của gen m1 hóa. Kết quả là tạo ra các phân type cúm hoàn toàn mới. Ví nh− quá trình dập dịch không triệt để, virus vẫn tồn tại trong đàn gia cầm và biến đổi. Gia cầm và các động vật khác (kể cả ng−ời) có thể mắc các virus cúm biến dị này với hậu quả khó l−ờng. Cũng chính nhờ sự biến đổi này mà virus cúm A tạo nên 16 biến thể gen HA (H1-H16) và 9 kháng nguyên N (N1-N9) [11], [72]. * Đột biến do tái tổ hợp di truyền (còn gọi là đột biến thay đổi bản chất kháng nguyên - antigenic shift). Đột biến này là sự tái tổ hợp di truyền xảy ra định kỳ trong đó có sự sắp xếp lại các nucleotit do sự trộn lẫn 2 bộ gen của virus cúm khác nhau. Điều đó đ1 tạo nên những sai khác cơ bản về bộ gen của virus đời con so với virus bố mẹ. Khi nhiều virus khác nhau cùng xâm nhiễm vào một tế bào chủ, các thế hệ virus đ−ợc sinh ra sau có thể đ−ợc sinh ra từ sự tái tổ hợp của các gen bố mẹ xuất phát từ nhiều virus khác nhau. Vì vậy do 14 kiểu gen của virus cúm type A gồm 8 đoạn gen nên từ 2 virus bố mẹ có thể xuất hiện 256 tổ hợp của các virus thế hệ sau [9]. 2.2.4 Sức đề kháng của virus Virus cúm gia cầm có sức đề kháng yếu và bị “chết” dễ dàng ở môi tr−ờng bên ngoài nếu nh− không đ−ợc bảo vệ bằng các chất hữu cơ có trong n−ớc bọt hoặc phân. Virus rất nhạy cảm với nhiệt độ và một số chất sát trùng thông th−ờng: ở nhiệt độ 56-60oC chỉ trong vài phút là virus mất độc tính. ở 4oC, virus có thể “sống” ít nhất là 35 ngày trong các chất hữu cơ và khoảng 23 ngày trong thân thịt đông lạnh. Ng−ời ta đ1 phân lập đ−ợc virus từ n−ớc ao, hồ là nơi các loài thủy cầm sinh sống. Nếu nguồn n−ớc không đ−ợc xử lý, nó sẽ là nguyên nhân lây nhiễm cho gia cầm khi gia cầm uống phải n−ớc từ nguồn n−ớc đó. Tro._.ng phủ tạng gà, virus tồn tại 24-39 ngày, ánh nắng chiếu trực tiếp sống đ−ợc 40 giờ còn chiếu th−ờng thì sống 15 ngày [9]. 2.2.5 Độc lực của virus Để đánh giá độc lực của virus cúm ng−ời ta sử dụng ph−ơng pháp gây bệnh cho gà 3-6 tuần tuổi bằng cách tiêm vào tĩnh mạch 0,2 ml n−ớc trứng đ1 đ−ợc gây nhiễm virus với tỷ lệ pha lo1ng 1/10, sau đó đánh giá mức độ bệnh của gà để cho điểm (chỉ số IVPI). Điểm tối đa là 3 điểm và đó là virus có độ độc lực cao nhất. Theo qui định của tổ chức dịch tễ thế giới (OIE) [68], bất cứ virus cúm nào có chỉ số IVPI > 1,2 trên gà 6 tuần tuổi, hoặc bất kỳ virus cúm nào thuộc subtype H5 hoặc H7 có trình tự acid amin trùng với trình tự acid amin của chủng độc lực cao là thuộc loại HPAI (Highly Pathogenic Avian Influenza). Căn cứ vào độc lực, các nhà khoa học đ1 thống nhất chia virus cúm gồm 3 loại: Virus có độc lực cao: Sau 10 ngày tiêm tĩnh mạch cho gà, virus phải làm chết 75-100% gà thực nghiệm. Sau khi phân lập từ gà bệnh, virus phát triển tốt và gây bệnh tích tế bào trong môi tr−ờng nuôi cấy tế bào không có 15 Trypsin. Đối với chủng H5 và H7 độc lực thấp, nếu mọc tốt trên môi tr−ờng tế bào không có trypsin, trình tự acid amin trùng với trình tự acid amin của đoạn H chủng độc lực cao thì đ−ợc xác định là chủng độc lực cao Loại virus có độc lực trung bình: Là những chủng virus gây dịch cúm gà với triệu chứng lâm sàng rõ rệt nh−ng gây chết không quá 15% số gà bị nhiễm bệnh tự nhiên hoặc không quá 20% số gà mẫn cảm thực nghiệm. Loại virus có độc lực thấp (nh−ợc độc): Là những virus phát triển tốt trong cơ thể gà, có thể gây ra dịch cúm nh−ng không có triệu chứng lâm sàng rõ rệt và không tạo ra bệnh tích đại thể, không làm chết gà. Trong thực tế ng−ời ta chia virus cúm gia cầm làm 2 loại: Loại virus có độc lực thấp - LPAI (Lowly Pathogenic Avian Influenza) và loại virus có độc lực cao - HPAI (Highly Pathogenic Avian Influenza). Các vụ dịch lớn đều do virus HPAI gây ra th−ờng là virus có kháng nguyên H5, H7 và H9. Riêng H5 và H7 thông th−ờng bắt nguồn từ virus độc lực thấp, sau quá trình lây truyền ở gà và chim cút thì độc lực tăng lên rất nhanh và gây ra các vụ dịch lớn. 2.2.6 Nuôi cấy và l−u giữ virus cúm gia cầm Virus cúm gà phát triển tốt trong phôi gà 9-11 ngày tuổi. Trong n−ớc phôi đó ng−ời ta thấy tập trung khá nhiều virus và có thể l−u giữ chúng sống đ−ợc trong n−ớc phôi vài tuần ở điều kiện 4oC. Khả năng tồn tại của virus rất cao nếu bảo quản n−ớc phôi đó ở - 70oC hoặc cho đông khô [22]. Virus cúm gà cũng phát triển tốt trong môi tr−ờng tế bào xơ phôi gà CEF (Chicken Embryo Fibroblast) và tế bào dòng có nguồn gốc thận chó MDCK (Madin Darby Canine Kidney cells) với điều kiện môi tr−ờng nuôi cấy tế bào không chứa Trypsin [22]. 2.3 Miễn dịch chống bệnh cúm gia cầm Hệ thống miễn dịch đóng vai trò quyết định trong phòng chống bệnh của loài chim. Tổ chức và hoạt động của hệ miễn dịch của loài chim nói chung và gia cầm nói riêng hoàn toàn t−ơng tự nh− ở động vật có vú. 16 Miễn dịch là trạng thái đặc biệt của cơ thể không mắc phải tác động có hại của yếu tố gây bệnh, trong khi đó các cơ thể cùng loài hoặc khác loài lại bị tác động trong điều kiện sống nh− nhau [1]. Cũng nh− miễn dịch chống lại các bệnh khác, miễn dịch chống bệnh cúm bao gồm 2 loại là miễn dịch tự nhiên và miễn dịch không đặc hiệu. 2.3.1 Miễn dịch tự nhiên Gia cầm cũng nh− các vật chất sống khác có cơ chế phòng chống tự nhiên [56]. Những hàng rào vật lý nh− da hoặc hệ lông nhầy bình th−ờng ngăn cản tác nhân gây bệnh vào cơ thể. Đối với mầm bệnh lần đầu xâm nhập vào cơ thể, sự phòng thủ đầu tiên của ký chủ sẽ do cơ chế miễn dịch tự nhiên nh− các tế bào thực bào, bổ thể và các tế bào diệt tự nhiên (NK) quyết định. Các tế bào tham gia quá trình thực bào bao gồm: - Tiểu thực bào, quan trọng nhất là bạch cầu đa nhân trung tính chiếm 60-70% tổng số bạch cầu ở máu ngoại vi, nó thực bào những phân tử nhỏ và vi khuẩn ngoài tế bào. - Đại thực bào là các tế bào lớn có khả năng thựcbào, khi đ−ợc hoạt hóa nó sẽ nhận biết và loại bỏ các vật lạ, ngoài ra nó còn giữ vai trò quan trọng trong sự trình diện kháng nguyên tới tế bào T và kích thích tế bào T sản sinh ra IL-1. Đại thực bào còn tiết ra Interferon có hoạt tính kháng virus, lysozyme và các yếu tố khác có tác dụng kích thích phản ứng viêm. Các bổ thể là phần quan trọng và nhạy cảm của hệ phòng thủ chống lại mầm bệnh hiện diện trong huyết t−ơng của gia cầm. Bổ thể có tác dụng làm tan màng vi khuẩn, làm tăng khả năng thực bào của đại thực bào, opsonin hóa. Bổ thể còn có vai trò nhất định trong cơ chế đáp ứng miễn dịch đặc hiệu [56], [71]. Interferon (IFN): Do nhiều loại tế bào tiết ra nh−ng nhiều nhất là tế bào diệt tự nhiên (NK). Khi Interferon đ−ợc sản sinh ra, nó gắn vào tế bào bên cạnh và cảm ứng tế bào đó sản sinh ra protein kháng virus (antivirus protein - 17 AVP), làm cho virus xâm nhập vào trong tế bào nh−ng không nhân lên đ−ợc [71]. Những tế bào diệt tự nhiên của gia cầm là tế bào lympho hạt lớn và gây nên sự phá hủy của tế bào đích gắn kháng thể. ở gia cầm, tế bào diệt tự nhiên có thể tái tạo ở nhiều nơi nh− lách, máu và ruột, là một phần của hệ thống phòng vệ [56]. 2.3.2 Miễn dịch đặc hiệu Miễn dịch đặc hiệu là trạng thái miễn dịch xuất hiện khi cơ thể đ1 tiếp xúc với kháng nguyên và có phản ứng sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại chúng. Kháng thể đặc hiệu có thể là dịch thể hoặc có thể là tế bào, đó là các lympho T mẫn cảm. Vì vậy ng−ời ta chia miễn dịch đặc hiệu ra làm 2 loại: Miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. 2.3.2.1 Miễn dịch dịch thể Do các tế bào lympho B đảm nhiệm. Các lympho bào bắt nguồn từ tế bào nguồn ở tuỷ x−ơng đi tới túi Fabricius. ở đây, chúng đ−ợc biệt hoá để trở thành các lympho B, sau đó di tản đến các cơ quan lympho ngoại biên. Các tế bào lympho B khu trú ở các tâm điểm mầm và vùng tuỷ của lách, hạch lâm ba. Trong hạch lâm ba, các tế bào lympho B có thể gặp một kháng nguyên và nhận biết kháng nguyên đó bởi các kháng thể có trên bề mặt của chúng. Tế bào B có thể nhận dạng kháng nguyên khi nó t−ơng tác với globulin miễn dịch nhô ra trên bề mặt tế bào [56]. Sau khi đ1 nhận biết kháng nguyên và đ−ợc kích thích bởi các cytokines do tế bào T tiết ra, các tế bào lympho B đ−ợc biệt hoá thành t−ơng bào (plasma) để sản sinh kháng thể [56]. Chúng tiết ra các loại globulin miễn dịch (Ig) gồm có 3 lớp chính là IgM, IgG, IgA trong đó IgG của gia cầm lớn hơn của động vật có vú nên th−ờng đ−ợc gọi là IgY. Đáp ứng của kháng thể khi gặp kháng nguyên lần đầu tiên đ−ợc gọi là đáp ứng tiên phát (sơ cấp). Sau khi xuất hiện vài ngày, hàm l−ợng kháng thể 18 trong máu tăng và các kháng thể đầu tiên chủ yếu là IgM. Đáp ứng tiên phát cũng có thể có IgG nh−ng với hàm l−ợng thấp. Kháng thể dịch thể chỉ có tác dụng với virus khi nó còn ở ngoài tế bào, lớp IgM và IgG kết hợp với virus với sự tham gia của bổ thể làm tiêu diệt virus. 2 lớp kháng thể này còn ngăn virus không cho kết hợp với thụ thể trên bề mặt tế bào vật chủ, ngăn cản sự hoà màng giữa vỏ virus và màng tế bào. Kháng thể dịch thể có thể hiện diện trong các loại dịch trong cơ thể nh−ng th−ờng đ−ợc xác định (định l−ợng) trong huyết thanh. Gia cầm có 3 lớp Ig chính đó là IgA, IgG và IgM. - IgA là Ig quan trọng nhất trong miễn dịch thuộc màng nhầy và tập trung nhiều nhất ở các bề mặt nhày. IgA bảo vệ màng nhày chống lại các mầm bệnh đặc biệt là virus bằng cách trung hoà và ngăn cản sự liên kết của chúng với các điểm tiếp nhận trên bề mặt tế bào đích, không cho virus xâm nhập vào trong. - IgG của gia cầm lớn hơn của động vật có vú, th−ờng đ−ợc gọi là IgY. IgY có thể là tiền chất tổ tiên của IgE và IgG của động vật có vú. - IgM đ−ợc tìm thấy trên bề mặt của hầu hết các tế bào B và là kháng thể đ−ợc sản xuất ra đầu tiên trong phản ứng miễn dịch sơ cấp. Sau đó các tế bào chuyển sang sản xuất IgG hoặc IgA (sự chuyển lớp). Khả năng gắn kết kháng nguyên của các kháng thể không thay đổi trong hoặc sau khi chuyển lớp. Các cytokin IL-4, TGF-β, IFN-γ kích thích tế bào B trải qua sự chuyển lớp [56]. Một đáp ứng miễn dịch điển hình của gia cầm bắt đầu bằng sự sản xuất ra IgM, sau vài lần đáp ứng miễn dịch chuyển sang sản xuất IgY. IgG là kháng thể chính sinh ra trong miễn dịch thứ phát và chiếm −u thế trong máu gia cầm. Kháng thể IgM có thể phát hiện ở gia cầm chỉ sau khi bị nhiễm 5 ngày trong khi kháng thể IgG chỉ đ−ợc phát hiện ở 7 đến 9 ngày sau khi bị nhiễm. Kháng thể IgA d−ờng nh− rất yếu [75]. 19 Vịt th−ờng có đáp ứng miễn dịch yếu và thiếu kháng thể kháng kháng nguyên HA cả trong tr−ờng hợp nhiễm tự nhiên và gây bệnh thực nghiệm. Nếu chúng ta so sánh mức độ đáp ứng miễn dịch đối với virus cúm gia cầm ở các loài gia cầm thì chúng đ−ợc sắp xếp nh− sau: Gà >>Gà lôi >>Gà tây >Chim cút > Vịt [75]. Kết quả nghiên cứu của Tian cùng các cộng sự [76] cho thấy vacxin cúm gia cầm H5N1 vô hoạt nhũ dầu có thể bảo hộ cho vịt chống lại virus. Có một số ý kiến cho rằng tế bào B sử dụng Ig bề mặt để gắn với kháng nguyên [71]. Mỗi tế bào B chỉ sản xuất ra một kiểu chuỗi nặng hay chuỗi nhẹ và t−ơng hợp với một loại kháng nguyên xác định. Nh− thế, đối với kháng nguyên để bắt đầu sản xuất kháng thể và mở rộng việc nhân lên, kháng nguyên phải phản ứng với tế bào B có thể hiện điểm tiếp nhận Ig t−ơng đồng [71]. 2.3.2.2 Miễn dịch qua trung gian tế bào Quá trình đáp ứng miễn dịch đặc hiệu qua trung gian tế bào do tế bào lympho T đảm nhiệm. Các lympho bào bắt nguồn từ tuỷ x−ơng di chuyển đến tuyến ức, tại đó chúng đ−ợc huấn luyện, biệt hoá thành tiền lympho T, rồi thành lympho T ch−a chín, rồi thành lympho T chín. Từ tuyến ức chúng di tản đến các cơ quan lympho ngoại vi nh− các hạch lâm ba, các mảng payers ở ruột hoặc tới lách. Khi đại thực bào đ−a thông tin đến các lympho T, chúng tiếp nhận và biệt hoá trở thành nguyên bào lympho T rồi thành tế bào mẫn cảm với kháng nguyên có chức năng nh− một kháng thể đặc hiệu và gọi là kháng thể tế bào. Các tế bào lympho T thực hiện 2 chức năng quan trọng: - Chức năng hỗ trợ: Do các lympho T có dấu ấn CD4 đảm nhiệm (TH). Chức năng này giúp đỡ các tế bào lympho B phát triển thành t−ơng bào để sản xuất kháng thể; giúp các tế bào TCD8 trở thành tế bào TC gây độc, tế bào TC đ−ợc hoạt hoá và tiêu diệt tế bào đích; thực hiện phản ứng quá mẫn muộn; sản 20 xuất ra các cytokines có tác dụng điều khiển sự phát triển của các dòng tế bào bạch cầu và các tế bào mầm của hệ thống tạo máu; sản xuất các cytokines có tác dụng hoạt hoá các tế bào đại thực bào; thúc đẩy quá trình sản xuất các phân tử glycoprotein MHC trên các tế bào trình diện kháng nguyên. Đa số các tế bào T hỗ trợ thể hiện dấu ấn CD4 nhận biết kháng nguyên đ−ợc trình diện trên bề mặt của các tế bào trình diện kháng nguyên với các phân tử MHC lớp II. Chức năng này do 2 tiểu quần thể TH đảm trách. TH1 tham gia phản ứng quá mẫn muộn, sản xuất IL-2 và interferon γ, TH2 hỗ trợ tế bào B và sản xuất chủ yếu IL-4, IL-5. - Chức năng thực hiện: Do các lympho T mang dấu ấn CD8 đảm nhiệm, có 2 loại: + Lympho T gây độc (TC): Gây độc đối với tế bào bị nhiễm virus, tế bào ung th− và mảnh ghép dị loài. Chúng có khả năng nhận biết các mảnh peptit của kháng nguyên của tế bào đích gắn với các phân tử MHC lớp I. + Lympho T ức chế (TS): Chúng triệt thoái quá trình sản xuất imunoglobulin của tế bào B và triệt thoái hoặc ức chế các phản ứng quá mẫn muộn và miễn dịch tế bào. * Những yếu tố ảnh h−ởng đến sự hình thành kháng thể Sự hình thành kháng thể và quá trình đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố nh− trạng thái sức khoẻ của cơ thể, điều kiện ngoại cảnh, sự chăm sóc nuôi d−ỡng,... nh−ng quan trọng hơn cả là phụ thuộc vào bản chất kháng nguyên [57]. Các yếu tố ảnh h−ởng đến sự hình thành kháng thể chính là: - Bản chất kháng nguyên: Kháng nguyên có bản chất là protein và có tính kháng nguyên cao sẽ kích thích sinh kháng thể tốt. - Đ−ờng xâm nhập của kháng nguyên: Tốt nhất là d−ới da và trong bắp thịt. 21 - Liều l−ợng kháng nguyên: Khi đ−a vào một l−ợng vừa đủ sẽ kích thích cơ thể sản sinh miễn dịch ở mức tối đa mà không gây ức chế và tê liệt miễn dịch. - Số lần đ−a kháng nguyên vào cơ thể: Tiêm nhắc lại vacxin có tác dụng tốt, kháng thể sinh ra nhiều hơn và đ−ợc duy trì trong thời gian lâu hơn. - Chất bổ trợ: Chất bổ trợ cho vào khi chế vacxin với mục đích giữ và duy trì l−ợng kháng nguyên lâu trong cơ thể nhờ đó tạo kích thích liên tục, đều đặn các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch tạo ra kháng thể ở mức cao và duy trì đ−ợc lâu hơn. Những chất bổ trợ th−ờng dùng là keo phèn, nhũ t−ơng, dầu khoáng, dầu thực vật, saponin. 2.4 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm Virus cúm gia cầm phân bố trên khắp thế giới, trong các loài gia cầm, d1 cầm và động vật có vú. Các loài gia cầm nh− gà, vịt, ngỗng, gà tây, gà Nhật, chim cút và chim trĩ đều là những vật chủ tự nhiên của virus cúm gia cầm. Hiện nay vẫn ch−a rõ nguồn bệnh tàng trữ chính xác ở đâu và ng−ời ta giả thiết do gia cầm tiếp xúc trực tiếp hay gián tiếp với thuỷ cầm di c−. Sự phân bố và l−u hành của virus cúm khó xác định chính xác và chịu ảnh h−ởng bởi cả loài vật nuôi, hoang d1, tập quán chăn nuôi gia cầm, đ−ờng di trú của d1 cầm, mùa vụ và hệ thống báo cáo dịch bệnh, ph−ơng pháp nghiên cứu [9], [28]. Virus lây lan rất nhanh, từ đàn gia cầm này sang đàn gia cầm khác qua tiếp xúc trực tiếp. Virus đ−ợc bài thải theo phân và các dịch tiết từ mũi và mắt. Hiện nay, vai trò của vịt nh− một vật tàng trữ mầm bệnh tự nhiên ở một số vùng châu á đ1 đ−ợc xác nhận và đây là trở ngại rất lớn trong công cuộc phòng chống và tiêu diệt bệnh cúm gia cầm [28]. 2.4.1 Động vật cảm nhiễm 22 Tất cả các loài chim thuần d−ỡng (gia cầm) hoặc hoang d1 (đặc biệt là loài thuỷ cầm di c−) đều mẫn cảm với virus. Bệnh th−ờng phát hiện khi lây nhiễm cho gia cầm (gà, vịt, gà tây, chim cút). Phần lớn các loài gia cầm non đều mẫn cảm với virus cúm type A [44]. Virus cúm của loài chim có thể gây bệnh cho các loài động vật có vú (lợn, ngựa,...) và cả con ng−ời. Virus cúm type A phân bố trong hầu hết tất cả các loài chim và động vật có vú từ loài sống trên cạn đến loài sống d−ới n−ớc (cả voi, hải cẩu,...). Lợn mắc bệnh cúm th−ờng do subtype H1N1, H3N3. Vịt nuôi cũng bị nhiễm virus cúm nh−ng ít phát hiện do vịt có sức đề kháng với virus gây bệnh kể cả chúng có độc lực cao gây bệnh nặng cho gà, gà tây [74]. Tuy nhiên, năm 1961 ở Nam Phi đ1 phân lập đ−ợc virus cúm type A (H5N1) gây bệnh cho cả gà và vịt [3], [10]. 2.4.2 Động vật mang virus Virus cúm đ1 phân lập đ−ợc ở hầu hết từ các loài chim hoang d1 nh− vịt, thiên nga, hải cẩu, vẹt, mòng biển, diều hâu, chim sẻ,... Tuy nhiên, tần suất và số l−ợng virus phân lập ở loài thuỷ cầm đều cao hơn ở các loài khác. Kết quả điều tra thuỷ cầm di trú ở Bắc Mỹ cho thấy trên 60% chim non mang virus do tập hợp đàn tr−ớc khi di trú [56], [74]. Trong các loài thuỷ cầm di trú thì vịt trời có tỷ lệ nhiễm virus cao hơn các nhóm khác. Qua những kết quả điều tra về sự phân bố rộng của virus cúm type A ở chim hoang d1 và đặc biệt là vịt trời đ1 cho thấy sự kết hợp các kháng nguyên bề mặt H và N của các subtype virus cúm type A diễn ra ở chim hoang d1. Những virus này không gây độc đối với vật chủ, chúng đ−ợc nhân lên ở đ−ờng ruột khiến cho các loài này mang virus và là nguồn reo rắc virus cho các loài khác đặc biệt là gia cầm [74]. Cuối tháng 10/2005, FAO, OIE và WHO đ1 l−u ý các n−ớc đ1 trải qua dịch cúm gia cầm H5N1 rằng vịt nuôi có thể đóng vai trò quan trọng trong 23 việc làm lây lan chủng virus cúm gia cầm H5N1 thể độc lực cao cho các gia cầm khoẻ và rất có thể lây truyền virus trực tiếp cho ng−ời vì vật nuôi nhiễm virus, gà bệnh và gà có biểu hiện ốm bài thải một l−ợng virus xấp xỉ nhau nh−ng vịt nuôi không thể hiện các triệu chứng lâm sàng bệnh lý. Vịt có thể là con vật tàng trữ “thầm lặng” đối với virus cúm H5N1 gây bệnh thể độc lực cao cho gà. Vịt có thể bị nhiễm virus và bài thải virus trong một thời gian dài nh−ng nó lại không thể hiện ra các triệu chứng lâm sàng có thể nhận biết đ−ợc [63]. Điều này đặc biệt có ý nghĩa ở vùng nông thôn, nơi có tập quán chăn nuôi vịt thả rông, các loài gia cầm th−ờng đ−ợc nhốt chung và đặc biệt là chúng dùng chung một nguồn n−ớc. Trên thực tế, trong cùng một khu vực có thể có một số đàn gia cầm bị nhiễm virus và phát bệnh còn một số đàn lại không phát bệnh mà chỉ có huyết thanh d−ơng tính. Hiện t−ợng này xảy ra do virus bài thải ra từ vịt rất dễ bị thay đổi tính kháng nguyên. Những đàn có huyết thanh d−ơng tính đ1 nhiễm virus H5N1 không c−ờng độc thải ra từ vịt bệnh hoặc vịt nhiễm loại virus H5N1 không độc. Hiện tại, FAO và OIE đang phối hợp với nhau đánh giá vai trò của vịt nuôi nhằm đ−a ra các chiến l−ợc lâu dài với mục đích không chế các ổ dịch cúm gia cầm ở châu á [28]. Khi nghiên cứu sự l−u hành của virus cúm gia cầm ở khu vực đồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long, tác giả Nguyễn Tiến Dũng và cộng sự (2005) đ1 phát hiện thấy vịt nuôi là con vật mang trùng và gây bệnh trong khu vực đồng bằng sông Hồng và sông Cửu Long; chính đàn vịt thuần hoá là nơi l−u giữ virus cúm gia cầm và gây ra dịch địa ph−ơng sau khi đợt dịch lần thứ nhất kết thúc [13], [14] . 2.4.3 Sự truyền lây Khi gia cầm bị nhiễm virus cúm, virus đ−ợc nhân lên trong đ−ờng hô hấp và đ−ờng tiêu hoá. Sự truyền lây của bệnh đ−ợc thực hiện theo hai ph−ơng thức: 24 - Lây trực tiếp do con vật mẫn cảm tiếp xúc với con vật mắc bệnh thông qua các hạt khi dung đ−ợc bài tiết từ đ−ờng hô hấp hoặc qua phân, thức ăn và n−ớc uống bị nhiễm bệnh. Theo các tổ chức FAO và WHO thì con ng−ời có nguy cơ lây nhiễm virus cúm gia cầm cao nhất là do tiếp xúc trực tiếp với gia cầm bị bệnh trong quá trình bắt và giết mổ [15]. - Lây gián tiếp qua các hạt khí dung trong không khí với khoảng cách gần hoặc những dụng cụ chứa virus do gia cầm mắc bệnh bài thải qua phân hoặc lây qua chim, thú, thức ăn, n−ớc uống, lồng nhốt, quần áo, xe vận chuyển,... Đây là ph−ơng thức lây truyền chủ yếu [44]. Nh− vậy, virus cúm dễ dàng truyền tới vùng khác do con ng−ời, ph−ơng tiện vận chuyển, dụng cụ và thức ăn chăn nuôi. Bệnh chủ yếu truyền ngang (do tiếp xúc), ch−a có bằng chứng nào cho thấy bệnh có thể truyền dọc (qua phôi thai) vì những phôi bị nhiễm virus th−ờng chết mà không phát triển đ−ợc [22]. Hình 2.4 Đ−ờng truyền lây của virus cúm Đối với gia cầm nuôi, nguồn dịch đầu tiên th−ờng thấy là: Từ các loài gia cầm nuôi khác nhau trong cùng một trang trại hoặc các trang trại khác liền kề nh− vịt lây sang gà; từ gia cầm nhập khẩu; từ chim di trú, đặc biệt thuỷ cầm đ−ợc coi là đối t−ợng chính dẫn nhập virus vào vào quần thể đàn gia cầm nuôi; 25 từ ng−ời và các động vật có vú khác, phần lớn các ổ dịch cúm gia cầm gần đây đ1 có sự lây lan thứ cấp thông qua con ng−ời [2], [9]. 2.4.4 Mùa vụ phát bệnh Bệnh cúm gia cầm xảy ra quanh năm nh−ng th−ờng tập trung vào vụ đông xuân từ tháng 10 năm tr−ớc đến tháng 2 năm sau. Khi có những biến đổi bất lợi về điều kiện thời tiết nh− nhiệt độ lạnh, độ ẩm cao, thời tiết có những thay đổi đột ngột làm giảm sức đề kháng tự nhiên của con vật. Mặt khác thời điểm này có mật độ chăn nuôi cao nhất trong năm, các hoạt động vận chuyển, giết mổ gia cầm diễn ra cao nhất trong năm cũng là điều kiện thuận lợi để dịch bệnh phát sinh lây lan [6]. 2.5 Triệu chứng Các biểu hiện lâm sàng của bệnh cúm rất khác nhau, nó phụ thuộc vào nhiều yếu tố nh−: chủng virus bị nhiễm, loài cảm nhiễm, tuổi, giới tính, liều gây nhiễm, điều kiện môi tr−ờng, chế độ nuôi d−ỡng, tình trạng miễn dịch của vật chủ tr−ớc khi bị nhiễm virus [33]. Bệnh gây ra do các chủng virus cúm khác nhau tạo sự đa dạng trong các thể bệnh, từ không có hoặc rất ít dấu hiệu lâm sàng nh−ng gây chết đột ngột, tỷ lệ tử vong cao đến bệnh nhẹ hoặc ẩn tính. Triệu chứng điển hình của bệnh cúm gia cầm: Chết đột ngột, tỷ lệ tử vong cao có khi lên đến 100% trong vài ngày. Có các biểu hiện của đ−ờng hô hấp nh− ho, hắt hơi, thở khò khè, viêm xoang, chảy nhiều n−ớc mắt. S−ng, phù đầu và mặt. Xuất huyết d−ới da, tím tái đặc biệt ở mào, xuất huyết ở chân. Gà đứng tụm với nhau, lông xù. Gà mái giảm đẻ, tăng số lần ấp. Tiêu chảy. Rối loạn thần kinh. Trong một số tr−ờng hợp, bệnh bùng phát nhanh, tr−ớc và sau khi gia cầm bị chết không có biểu hiện lâm sàng. Vịt và các loài thuỷ cầm khác bị nhiễm virus cúm ít khi biểu hiện triệu chứng ngay cả với các chủng gây bệnh HPAI ở gà nh−ng phát bệnh thì viêm xoang, viêm đ−ờng hô hấp, viêm mắt, tỷ lệ tử vong cao [63]. 26 Gia cầm bị nhiễm các chủng virus có độc lực yếu hơn cũng có những triệu chứng t−ơng tự nh−ng mức độ nhẹ hơn và tỷ lệ chết thấp hơn, nh−ng khi có các vi khuẩn cộng nhiễm với virus cúm gia cầm bị tác động bởi yếu tố bất lợi của môi tr−ờng thì các biểu hiện trầm trọng hơn và tỷ lệ tử vong cũng cao hơn. Các loài chim hoang d1 bị nhiễm virus cúm th−ờng không có triệu chứng rõ ràng [33]. 2.6 Bệnh tích Bệnh tích đại thể biến đổi theo lâm sàng của bệnh [23], từ viêm nhẹ đ−ờng hô hấp, viêm xoang cata, viêm xoang bụng, viêm ruột cata đến tụ huyết, xuất huyết da, gan, thận, tim, lách, phổi, ruột, yếm, mào và chân. Bệnh tích vi thể do HPAI gây ra khác nhau tuỳ theo độc lực của virus và loài mắc bệnh. Bệnh tích vi thể ở gà giò nặng hơn ở gà đẻ. Bệnh ở thể nặng thấy s−ng, phù, tụ huyết, xuất huyết, có các nốt hoại tử ở các cơ quan nội tạng. Hoại tử cơ tim th−ờng thấy trong các gia cầm mắc bệnh do chủng virus có độc lực cao H5N1. Một số chủng virus gây ra các triệu chứng thần kinh thì thấy vành mạch s−ng và hoại tử các tế bào thần kinh. Nhìn chung ở các loài có vú, bệnh tích không biến đổi nhiều ở các cơ quan nội tạng [44]. 2.7 Chẩn đoán Chẩn đoán xác định bệnh do nhiễm virus cúm A chủ yếu là phải phân lập và định danh virus kết hợp với triệu chứng lâm sàng, mổ khám bệnh tích và dịch tễ học của bệnh. Ng−ời ta có thể sử dụng nhiều ph−ơng pháp để chẩn đoán xác định bệnh do nhiễm virus cúm A. * Phân lập virus Bệnh phẩm có thể là dịch ngoáy hầu họng, dịch ổ nhớp hoặc các tổ chức phổi, khí quản, n1o, gan, lách, tim. Mẫu sau khi lấy đ−ợc bảo quản trong 27 dung dịch PBS ở 4oC và phải tiến hành phân lập trong vòng 48 giờ, nếu muốn bảo quản dài hơn phải giữ ở -70oC. Ph−ơng pháp phân lập virus th−ờng sử dụng là tiêm truyền qua phôi trứng 9-11 ngày hoặc môi tr−ờng tế bào dòng thận chó MDCK. Mẫu thu đ−ợc kiểm tra bằng phản ứng HA để xác định virus. * Định danh virus Để định danh virus phân lập đ−ợc có thể dùng phản ứng HI, NI hoặc dùng phản ứng RT-PCR với các cặp mồi chuẩn để xác định kháng nguyên H và N. Để xác định kháng thể cúm trong huyết thanh có thể dùng phản ứng ngăn trở ng−ng kết hồng cầu HI, ELISA, phản ứng khuyếch tán trong thạch (AGP). 2.8 Tình hình sử dụng vacxin trên thế giới và Khuyến cáo của tổ chức dịch tễ thế giới Để khống chế dịch cúm gia cầm, chúng ta đ1 áp dụng hàng loạt các biện pháp nh− giết huỷ đàn gia cầm nhiễm bệnh, thực hiện kiểm dịch vận chuyển, kiểm soát giết mổ và vệ sinh khử trùng tiêu độc. Tuy nhiên dịch cúm gia cầm vẫn liên tiếp xảy ra, tr−ớc tình hình đó ngày 14/7/2005 Bộ Nông nghiệp và PTNT đ1 ban hành quyết định số 1715 QĐ/BNN-TY ban hành Quy định tạm thời về sử dụng vacxin cúm gia cầm. Phòng hộ bệnh cúm gia cầm là kết quả của đáp ứng miễn dịch chống lại protein Haemagglutinin (HA) mà hiện nay đ1 xác định đ−ợc 16 subtype khác nhau từ H1-H16 và ở mức độ nào đó chống lại protein Neuraminidae (NA) mà đ1 xác định đ−ợc 9 subtype từ N1-N9. Các đáp ứng miễn dịch kháng lại protein bên trong nh− Nucleoprotein (NP) và protein Matrix (M) của virus đ1 đ−ợc chứng minh là không đủ để tạo phòng hộ trên thực địa. Vì vậy không có một vacxin nào chung cho tất cả các virus cúm gia cầm. Trong thực tế, sự phòng hộ đ−ợc tạo ra nhờ các subtype Haemagglutinin có trong vacxin [30]. 28 Trên thực tế cho thấy, mặc dù đ1 áp dụng nhiều biện pháp tích cực nh− tiêu huỷ đàn gia cầm bị bệnh và các đàn xung quanh, vệ sinh tiêu độc, hạn chế di chuyển, kiểm soát giết mổ,... nh−ng chúng ta vẫn ch−a hoàn toàn khống chế đ−ợc dịch bệnh. Theo kinh nghiệm của một số n−ớc nh− Italy, Mehico, đặc khu Hồng Kông (Trung Quốc) [8], [29] thì việc tiêm phòng là biện pháp hỗ trợ tích cực để ngăn chặn, khống chế để đi đến thanh toán dịch cúm gia cầm, đảm bảo an toàn vệ sinh thực phẩm, bảo vệ sức khoẻ của con ng−ời. Biện pháp tiêm phòng bằng vacxin có 2 lợi thế cơ bản đó là: - Vacxin làm giảm sự cảm nhiễm của bệnh đối với gia cầm đ1 đ−ợc tiêm phòng. - Giảm đáng kể l−ợng virus bài thải ra môi tr−ờng bên ngoài ở gia cầm đ1 đ−ợc tiêm phòng. Nh− vậy, virus ô nhiễm môi tr−ờng ít đi, giảm nguy cơ lây lan sang các đàn gia cầm khác, giảm nguy cơ gây ô nhiễm cho con ng−ời và giảm cơ hội cho virus biến chủng tạo thành chủng virus cúm mới ở ng−ời. * Vacxin đ−ợc sử dụng đúng sẽ đạt đ−ợc một số mục đích: - Bảo hộ cho con vật không xuất hiện các triệu chứng lâm sàng và chết. - Giảm bài thải virus c−ờng độc nếu gia cầm bị nhiễm virus đó > 1000 lần so với gia cầm không đ−ợc tiêm, ngừng hẳn sự bài thải virus vào ngày 13- 18 sau khi tiêm [2], [7], [8]. - Phòng đ−ợc sự lây lan virus c−ờng độc do tiếp xúc. - Phòng hộ chống lại công c−ờng độc bằng virus thực địa dù liều gây nhiễm cao hay thấp. - Phòng hộ chống lại virus luôn thay đổi. - Tăng sức đề kháng của gà chống lại virus cúm gia cầm [18], [30]. * Các loại vacxin phòng bệnh hiện nay: Hiện nay trên thế giới có các loại vacxin phòng bệnh cúm gia cầm nh−: 2.8.1 Vacxin truyền thống 29 Vacxin cúm gia cầm đ−ợc nuôi cấy trong phôi gà, sau đó đ−ợc vô hoạt bằng hoá chất. Kháng nguyên virus sau khi vô hoạt đ−ợc bổ sung chất bổ trợ nhũ dầu để tăng khả năng đáp ứng miễn dịch. Sự t−ơng đồng giữa kháng nguyên trong vacxin và kháng nguyên của virus môi tr−ờng có cùng subtype H (heamagglutinin t−ơng đồng) sẽ quyết định hiệu lực của vacxin [73]. Việc sử dụng các vacxin vô hoạt đ1 đạt đ−ợc những hiệu quả về ph−ơng diện sinh học và kinh tế ở một số n−ớc. - Vacxin vô hoạt đồng chủng: Ví dụ nh− vacxin H5N1 của Weiker (Trung Quốc). Những loại vacxin này ban đầu đ−ợc sản xuất nh− các vacxin tự phát sinh, có nghĩa là vacxin chứa cùng những virus cúm gà giống nh− chủng gây bệnh trên thực địa. Các loại vacxin này đ−ợc sử dụng rộng r1i ở Mehico và Pakistan trong những trận dịch cúm gà [48]. Hiệu lực của những vacxin này trong việc ngăn ngừa bệnh và giảm l−ợng virus thải ra môi tr−ờng đ1 đ−ợc chứng minh thông qua các nghiên cứu trên thực địa và các thử nghiệm. Nh−ợc điểm của loại vacxin này là không thể phân biệt gia cầm đ−ợc tiêm chủng với gia cầm tiếp xúc với mầm bệnh trên thực địa trừ khi có những con ch−a đ−ợc tiêm chủng đ−ợc nhốt ở trong chuồng. - Vacxin vô hoạt dị chủng: Ví dụ nh− vacxin vô hoạt H5N2 của Intervet (Hà Lan) và của Weiker (Trung Quốc). Những vacxin này đ−ợc sản xuất t−ơng tự nh− vacxin vô hoạt đồng chủng. Điểm khác biệt là các chủng virus sử dụng trong vacxin có kháng nguyên H giống chủng virus trên thực địa, nh−ng có Neuraminidase (kháng nguyên N) dị chủng. Sau khi tiếp xúc với virus trên thực địa, bảo hộ lâm sàng và giảm thải trừ virus ra ngoài môi tr−ờng đ−ợc đảm bảo bằng phản ứng miễn dịch sản sinh 30 bởi kháng nguyên nhóm H đồng chủng, trong khi kháng thể chống Neuraminidase sản sinh bởi virus thực địa có thể sử dụng nh− chất đánh dấu sự lây nhiễm trên thực địa [58]. Khi so sánh hai loại vacxin đồng chủng và dị chủng nh− trên sẽ thấy mức độ bảo hộ lâm sàng và việc giảm thải trừ virus ra môi tr−ờng bên ngoài của vacxin đồng chủng đ−ợc cải thiện hơn do khối l−ợng kháng nguyên trong vacxin cao hơn. Đối với vacxin dị chủng, mức độ bảo hộ không chặt chẽ với mức độ đồng chủng giữa gen ng−ng kết tố hồng cầu trong vacxin và chủng trên thực địa. Đây là một −u điểm lớn cho phép thành lập ngân hàng vacxin bởi giống gốc có thể chứa một chủng phân lập cùng dòng sẵn có tr−ớc khi có dịch mà không chứa virus có mặt trên thực địa. 2.8.2 Vacxin tái tổ hợp Ví dụ nh− vacxin sống virus tái tổ hợp H5 Trovac của Merial (Liên doanh Pháp-Mỹ) và H5N1 của Weiker (Trung Quốc). Một vài loại vacxin tái tổ hợp phối hợp virus đậu gà chứa kháng nguyên H5 đ1, đang đ−ợc nghiên cứu và phát triển và một vacxin gần đây đ1 đ−ợc cấp phép ở Mehico [48]. Một số thí nghiệm cho thấy có thể phối hợp virus đậu gà với kháng nguyên H7 [73]. Một số virus khác có thể phối hợp với kháng nguyên H5 hoặc H7 nh− vacxin sử dụng virus viêm thanh khí quản truyền nhiễm (ILTV). Một −u diểm của vacxin tái tổ hợp hoặc của vacxin chứa kháng nguyên H là sẽ không xảy ra phản ứng đối với phản ứng miễn dịch ng−ng kết kép trên thạch. Chính vì vậy các điều tra huyết thanh học khó có thể thực hiện đ−ợc đối với loại vacxin này. Vacxin tái tổ hợp cho phép phân biệt giữa động vật nhiễm bệnh và động vật tiêm chủng vacxin bởi vì chúng không sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên Nucleoprotein phổ biến ở tất cả các virus cúm gà. Chỉ những động vật nhiễm bệnh trên thực địa mới tạo ra kháng thể nhóm A (nucleoprotein) và 31 phát hiện ra kháng thể này qua phản ứng kết tủa ng−ng kết trên thạch hoặc phản ứng ELISA. Việc sử dụng các vacxin này cũng đ−ợc giới hạn với những loài mà virus đích sẽ nhân lên hoặc sẽ chỉ đ−ợc giới hạn trong đàn gà có huyết thanh âm tính với virus đích. Ví dụ, ILTV sẽ không nhân lên ở gà tây và gà tây đặc biệt quan trọng trong vấn đề dịch tễ của bệnh cúm gà, việc sử dụng vacxin đ−ợc hạn chế ở vùng không có gà tây. 2.8.3 Chiến l−ợc DIVA Lựa chọn vacxin t−ơng đồng không hoàn toàn cho phép áp dụng chiến._.ng còn 73,33%. 4.2.2 Kết quả giám sát sau tiêm phòng vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc trên vịt ở một số trại giống Trung −ơng và địa ph−ơng Cho đến nay công tác tiêm phòng theo Dự án sử dụng vacxin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm giai đoạn II 2007-2008 do Bộ Nông nghiệp và PTNT phê duyệt đ1 đ−ợc thực hiện ở hầu khắp các tỉnh, thành phố trong dự án. Công tác giám sát sau tiêm phòng là một trong những nội dung quan trọng của dự án. Mục đích chính của ch−ơng trình giám sát sau tiêm phòng bao gồm: Theo dõi kiểm soát hiệu quả của vacxin dựa trên việc đánh giá mức độ đáp ứng miễn dịch của gia cầm đ−ợc tiêm phòng; Kiểm tra giám sát kết quả tiêm phòng vacxin của các địa ph−ơng; giám sát l−u hành virus và giám sát lâm sàng. 4.2.2.1 Kết quả kiểm tra sự có mặt của virus H5 trong đàn vịt tr−ớc và sau khi tiêm vacxin Mẫu dịch ngoáy ổ nhớp đ−ợc lấy đồng thời với những lần lấy mẫu huyết thanh để xác định xem virus H5 có l−u hành trong đàn vịt hay không trong suốt thời gian tiến hành thí nghiệm. Sự có mặt của virus đ−ợc xác định bằng phản ứng RT-PCR. Kết quả đ−ợc trình bày trong bảng 4.11. Qua bảng 4.11, chúng tôi thấy toàn bộ số mẫu dịch ngoáy ổ nhớp trong đàn vịt từ thời điểm bắt đầu làm thí nghiệm đến hết thời gian thí nghiệm, toàn bộ lô vịt thí nghiệm và lô vịt đối chứng đều không có sự l−u hành của virus cúm H5. 71 B ản g 4. 11 . K ết q u ả xá c đ ịn h s ự c ó m ặt c ủ a vi ru s H 5 tr on g d ịc h n go áy ổ n h ớp c ủ a vị t tr − ớc v à sa u k h i ti êm v ac xi n N ăm 2 00 6 N ăm 2 00 7 L ô th í n gh iệ m L ô đ ối c h ứ n g L ô th í n gh iệ m L ô đ ối c h ứ n g T h ời đ iể m lấ y m ẫu Đ ịa đ iể m S ố m ẫu k iể m t ra S ố m ẫu (+ ) S ố m ẫu k iể m t ra S ố m ẫu (+ ) S ố m ẫu k iể m t ra S ố m ẫu (+ ) S ố m ẫu k iể m t ra S ố m ẫu (+ ) B ắc N in h 33 1 0 30 0 32 0 0 30 0 B ắc G ia ng 55 5 0 30 0 35 0 0 30 0 T T N C G C C ẩm B ìn h 25 0 0 30 0 12 0 0 30 0 0 T T N C V ịt Đ ại X uy ên 25 0 0 30 0 12 5 0 30 0 B ắc N in h 53 7 0 30 0 30 0 30 0 B ắc G ia ng 53 4 0 30 0 50 0 30 0 T T N C G C C ẩm B ìn h 10 3 0 30 0 60 0 30 0 1- 2 th án g T T N C V ịt Đ ại X uy ên 63 0 30 0 60 0 30 0 B ắc N in h 60 0 0 30 0 45 0 30 0 B ắc G ia ng 60 0 0 30 0 50 0 30 0 T T N C G C C ẩm B ìn h 30 0 30 0 60 0 30 0 3- 4 th án g T T N C V ịt Đ ại X uy ên 62 0 30 0 60 0 30 0 72 4.2.2.2 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh vịt tr−ớc khi tiêm vacxin Để đánh giá tình trạng miễn dịch chống virus H5 của đàn vịt tr−ớc khi tiêm vacxin, chúng tôi đ1 tiến hành lấy mẫu huyết thanh kiểm tra hiệu giá kháng thể bằng phản ứng HI. Kết quả cho thấy toàn bộ mẫu huyết thanh kiểm tra đều âm tính, không có kháng thể kháng virus H5. Thực hiện theo h−ớng dẫn giám sát sau tiêm phòng vacxin cúm năm 2006 theo công văn số 1361/CTY-DT ngày 02/11/2005, công văn h−ớng dẫn giám sát bổ sung số 674/CTY-DT ngày 31/5/2006. Trung tâm Chẩn đoán Thú y tiến hành lấy mẫu giám sát tại 4 tỉnh nội và ngoại thành Hà Nội cùng với 05 Trung tâm giống gia cầm Trung −ơng quản lý. 4.2.2.3 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh vịt tại thời điểm 1-2 tháng sau tiêm vacxin năm 2006 Vịt đ−ợc tiêm d−ới da với liều 1 ml/con, sau 1-2 tháng tiến hành lấy máu chắt huyết thanh kiểm tra hiệu giá kháng thể. Kết quả đ−ợc trình bày trong bảng 4.12. Qua bảng 4.12, chúng tôi có nhận xét: - Tại tỉnh Bắc Ninh, có 324/431 mẫu d−ơng tính, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 4,22 log2, tỷ lệ bảo hộ là 68,91%. - Tại tỉnh Bắc Giang, tổng số mẫu kiểm tra là 350 mẫu, có 12 mẫu d−ơng tính, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 2,98 log2, tỷ lệ bảo hộ là 47,43%. - Tại TTNCGC Cẩm Bình có 55/103 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 41,75%, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 2,51 log2. - Tại TTNC Vịt Đại Xuyên có 57/63d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 85,71%, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 4,83 log2. 73 B ản g 4. 12 . K ết q u ả k iể m t ra h iệ u g iá k h án g th ể k h án g k h án g n gu yê n H 5 tr on g h u yế t th an h c ủ a vị t tạ i th ời đ iể m 1 -2 t h án g sa u t iê m v ac xi n n ăm 2 00 6 Đ ịa đ iể m B ắc N in h B ắc G ia n g T T N C G C C ẩm B ìn h T T N C V ịt Đ ại X u yê n C h ỉ ti êu S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % 0 10 7 24 ,8 3 13 1 37 ,4 3 48 46 ,6 0 6 9, 52 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 27 6, 26 53 15 ,1 4 12 11 ,6 5 3 4, 76 4 54 12 ,5 3 56 16 ,0 0 15 14 ,5 6 11 17 ,4 6 5 67 15 ,5 5 31 8, 86 11 10 ,6 8 22 34 ,9 2 6 75 17 ,4 0 49 14 ,0 0 11 10 ,6 8 9 14 ,2 9 7 73 16 ,9 4 28 8, 00 6 5, 83 9 14 ,2 9 H iệ u gi á H I (l og 2) 8 28 6, 50 2 0, 57 0 0 3 4, 76 Số m ẫu ( + ) 32 4 21 9 55 57 T ổn g số m ẫu 43 1 35 0 10 3 63 H iệ u gi á kh án g th ể tr un g bì nh ( lo g 2 ) 4, 22 2, 98 2, 51 4, 83 T ỷ lệ b ảo h ộ (% ) 68 ,9 1 47 ,4 3 41 ,7 5 85 ,7 1 74 Trong điều kiện thí nghiệm, mẫu huyết thanh đạt bảo hộ đối với vacxin cúm gia cầm của Trung Quốc là trên 6 log2 nh−ng trong điều kiện tiêm đại trà, mẫu huyết thanh đạt khả năng bảo hộ đối với gà và vịt là 4 log2. Nh− vậy, tại thời điểm này toàn bộ số vịt ở Bắc Ninh và TTNC Vịt Đại Xuyên đều có khả năng bảo hộ. Còn ở Bắc Giang và TTNCGC Cẩm Bình không có khả năng bảo hộ. 4.2.2.4 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh vịt tại thời điểm 3-4 tháng sau tiêm vacxin năm 2006 Tại thời điểm 3-4 tháng, tiến hành lấy mẫu máu, chắt huyết thanh làm phản ứng HI kiểm tra hiệu giá kháng thể. Kết quả đ−ợc trình bày trong bảng 4.13. Qua bảng 4.13, cho thấy: - Tại tỉnh Bắc Ninh, có 94/175 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 49,14%, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 3,37 log2. - Tại tỉnh Bắc Giang, có 21/120 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 5,83%, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 0,6 log2. - Tại TTNCGC Cẩm Bình có 19/30 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 60%, hiệu giá kháng thể trung bình 3,03 log2. - Tại TTNC Vịt Đại Xuyên có 88/122 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 59,84%, hiệu giá kháng thể trung bình là 3,58 log2. 75 B ản g 4. 13 . K ết q u ả k iể m t ra h iệ u g iá k h án g th ể k h án g k h án g n gu yê n H 5 tr on g h u yế t th an h c ủ a vị t tạ i th ời đ iể m 3 -4 t h án g sa u t iê m v ac xi n n ăm 2 00 6 Đ ịa đ iể m B ắc N in h B ắc G ia n g T T N C G C C ẩm B ìn h T T N C V ịt Đ ại X u yê n C h ỉ ti êu S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % 0 81 46 ,2 9 99 82 ,5 0 11 36 ,6 7 34 27 ,8 7 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 8 4, 57 14 11 ,6 7 1 3, 33 15 12 ,3 0 4 11 6, 29 5 4, 17 7 23 ,3 3 17 13 ,9 3 5 8 4, 57 2 1, 67 6 20 ,0 0 24 19 ,6 7 6 17 9, 71 0 0 5 16 ,6 7 20 16 ,3 9 7 21 12 ,0 0 0 0 0 0 12 9, 84 H iệ u gi á H I (l og 2) 8 29 16 ,5 7 0 0 0 0 0 0 Số m ẫu ( + ) 94 21 19 88 T ổn g số m ẫu 17 5 12 0 30 12 2 H iệ u gi á kh án g th ể tr un g bì nh ( lo g 2 ) 3, 37 0, 6 3, 03 3, 58 T ỷ lệ b ảo h ộ (% ) 49 ,1 4 5, 83 60 ,0 0 59 ,8 4 76 4.2.2.5 Kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng virus H5 trong huyết thanh vịt tại thời điểm 1-2 tháng sau tiêm vacxin năm 2007 Kết quả theo dõi hiệu giá kháng thể kháng virus H5 trong huyết thanh vịt tại thời điểm 1-2 tháng sau tiêm của năm 2007 ở 2 tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang và 2 trại giống trung −ơng là TTNCGC Cẩm Bình và TTNC Vịt Đại Xuyên. thu đ−ợc, chúng tôi trình bày trong bảng 4.14. Kết quả bảng 4.14 cho thấy: - Tại Bắc Ninh: 226/270 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 78,52%, hiệu giá kháng thể trung bình là 4,27 log2. - Tại Bắc Giang: có 31/180 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 8,89%, hiệu giá kháng thể trung bình là 0,66 log2. - Tại TTNGC Cẩm Bình có 19/30 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 40%, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 2,77 log2. - Tại TTNC Vịt Đại Xuyên có 29/30 mẫu d−ơng tính, tỷ lệ bảo hộ là 93,33%, hiệu giá kháng thể trung bình là 6,17 log2. 77 B ản g 4. 14 . K ết q u ả k iể m t ra h iệ u g iá k h án g th ể k h án g k h án g n gu yê n H 5 tr on g h u yế t th an h c ủ a vị t tạ i th ời đ iể m 1 -2 t h án g sa u t iê m v ac xi n n ăm 2 00 7 Đ ịa đ iể m B ắc N in h B ắc G ia n g T T N C G C C ẩm B ìn h T T N C V ịt Đ ại X u yê n C h ỉ ti êu S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % S ố m ẫu T ỷ lệ % 0 44 16 ,3 3 14 9 82 ,7 8 0 0 0 0 1 0 0 0 0 0 0 0 0 2 0 0 0 0 0 0 0 0 3 14 5, 19 15 8, 33 7 23 ,3 3 1 3, 33 4 34 12 ,5 9 12 6, 67 3 10 ,0 0 1 3, 33 5 41 15 ,1 9 1 0, 56 5 16 ,6 7 5 16 ,6 7 6 53 19 ,6 3 1 0, 56 3 10 ,0 0 6 20 ,0 0 7 40 14 ,8 1 2 1, 11 1 3, 33 11 36 ,6 7 H iệ u gi á H I (l og 2) 8 44 16 ,3 0 0 0 0 0 5 16 ,6 7 Số m ẫu ( + ) 22 6 31 19 29 T ổn g số m ẫu 27 0 18 0 30 30 H iệ u gi á kh án g th ể tr un g bì nh ( lo g 2 ) 4, 27 0, 66 2, 77 6, 17 T ỷ lệ b ảo h ộ% 78 ,5 2 8, 89 40 ,0 0 93 ,3 3 78 4.2.2.6 Kết quả giám sát sau tiêm phòng cúm trong ch−ơng trình nhà n−ớc năm 2006-2007 tại 2 tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang và 2 trại giống Trung −ơng: TTNCGC Cẩm Bình, TTNC Vịt Đại Xuyên. Kết quả kiểm tra giám sát sau tiêm phòng cúm trong 2 năm 2006, 2007, tại 2 tỉnh Bắc Ninh, Bắc Giang và 2 Trung tâm giống gia cầm Trung −ơng là TTNCGC Cẩm Bình và TTNC Vịt Đại Xuyên đ−ợc trình bày trong bảng 4.15. Bảng 4.15 cho thấy: năm 2006, mẫu đ−ợc lấy 2 lần vào 2 thời điểm 1-2 tháng sau tiêm và 3-4 tháng sau tiêm, năm 2007 mẫu đ−ợc lấy 1 lần vào thời điểm 1-2 tháng sau tiêm. Trong đó: - Năm 2006, tại Bắc Ninh, ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm hiệu giá kháng thể trung bình đạt 4,22 log2, tỷ lệ bảo hộ là 68,91%. ở thời đỉểm 3-4 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể tăng lên 3,37 log2, tỷ lệ bảo hộ đạt 49,14%. Năm 2007, ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể đạt 4,27 log2, tỷ lệ bảo hộ đạt 78,52%. Qua kết quả này cho thấy tỷ lệ vịt ở Bắc Ninh có khả năng đáp ứng miễn dịch cao. - Tại Bắc Giang, năm 2006 ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 2,98 log2, tỷ lệ bảo hộ là 47,43%. Tại thời điểm 3-4 tháng sau tiêm thì hiệu giá kháng thể trung bình giảm còn 0,6 log2, tỷ lệ bảo hộ là 5,83%. Năm 2007, ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 0,66 log2, tỷ lệ bảo hộ là 8,89%. Nh− vậy chúng tôi thấy tại tỉnh Bắc Giang, đàn vịt không có khả năng đáp ứng miễn dịch, có thể do qui mô chăn nuôi, điều kiện chăm sóc nuôi d−ỡng sau tiêm phòng ở đây thực hiện ch−a tốt, tiêm không đúng vị trí. - Tại TTNCGC Cẩm Bình, năm 2006 ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 2,51 log2, tỷ lệ bảo hộ là 41,75%. Tại thời điểm 3-4 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình giảm xuống 3,03 log2, tỷ lệ bảo hộ là 60%. Năm 2007, ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể đạt 2,77 log2, tỷ lệ bảo hộ là 40%. 79 Bảng 4.15. Tổng hợp kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng kháng nguyên H5 trong huyết thanh của vịt sau tiêm vacxin trong 2 năm 2006-2007 Chỉ tiêu Năm Thời điểm sau tiêm Địa điểm TS mẫu kiểm tra TSmẫu (+) HGKTTB (log2) Tỷ lệ bảo hộ (%) Bắc Ninh 431 324 4,22 68,91 Bắc Giang 350 219 2,98 47,43 TTNCGC Cẩm Bình 103 55 2,51 41,75 1 - 2 tháng TTNC Vịt Đại Xuyên 63 57 4,83 85,71 Bắc Ninh 175 94 3,37 49,41 Bắc Giang 120 21 0,6 5,83 TTNCGC Cẩm Bình 30 19 3,03 60,00 2006 3 - 4 tháng TTNC Vịt Đại Xuyên 122 88 3,58 59,84 Bắc Ninh 270 226 4,27 78,52 Bắc Giang 180 31 0,66 8,89 TTNCGC Cẩm Bình 30 19 2,77 40,00 2007 1 - 2 tháng TTNC Vịt Đại Xuyên 30 29 6,17 93,33 Ghi chú: TS: Tổng số HGKTTB: Hiệu giá kháng thể trung bình 80 - Tại TTNC Vịt Đại Xuyên, năm 2006 ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 4,83 log2, tỷ lệ bảo hộ là 85,71%. Tại thời điểm 3-4 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình giảm xuống còn 3,58 log2, tỷ lệ bảo hộ đạt 59,84%. Tại thời điểm 1-2 tháng sau tiêm năm 2007, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 6,17 log2, tỷ lệ bảo hộ là 93,33%. Nh− vậy chúng tôi thấy tại TTNC Vịt Đại Xuyên, đàn vịt có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt có thể do đội ngũ thú y có kỹ thuật tốt, đ−ợc tập huấn đầy đủ, bảo quản vacxin đúng qui trình và chế độ chăm sóc nuôi d−ỡng gia cầm sau tiêm phòng đ−ợc thực hiện tốt. Biến động hiệu giá kháng thể trong 2 năm 2006-2007 đ−ợc thể hiện trong hình 4.8 2,98 2,51 4,22 4,83 0,6 3,37 3,03 3,58 6,17 4,27 0,66 2,77 0 1 2 3 4 5 6 7 Bắc Ninh Bắc Giang TTNCGC Cẩm Bình TTNC Vịt Đại Xuyên H iệ u gi á kh án g th ể tr un g bì nh ( lo g2 ) 1-2 tháng năm 2006 3-4 tháng năm 2006 1-2 tháng năm 2007 Hình 4.8 Biến động hiệu giá kháng thể trong huyết thanh của vịt ở thời điểm 1-2 tháng và 3-4 tháng sau tiêm vacxin H5N1 của Trung Quốc trong 2 năm 2006-2007 81 5. Kết Luận và đề nghị 5.1 kết luận Trên cơ sở những kết quả thu đ−ợc trong quá trình kiểm nghiệm và khảo nghiệm vacxin H5N1 của Trung Quốc trên vịt, chúng tôi có một số kết luận sau : 5.1.1 Kết quả kiểm nghiệm vacxin H5N1 của Trung Quốc trong 2 năm 2006-2007 Kết quả kiểm nghiệm 2 năm cho thấy: - Tất cả các lô vacxin H5N1 của Trung Quốc nhập vào Việt Nam đều đạt tiêu chuẩn về chỉ tiêu vô trùng theo Tiêu chuẩn ngành - Bộ Nông nghiệp và PTNT. - Tất cả các lô vacxin H5N1 của Trung Quốc nhập vào Việt Nam đều đạt tiêu chuẩn về an toàn và hiệu lực theo hồ sơ sản xuất và tiêu chuẩn của OIE. 5.1.2 Kết quả khảo nghiệm vacxin H5N1 của Trung Quốc ngoài thực địa Kết quả giám sát vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc trên vịt ở 2 trại tại tỉnh Bắc Ninh Huyết thanh vịt của 2 trại tại tỉnh Bắc Ninh đều đạt đ−ợc hiệu giá kháng thể trung bình cao nhất từ 5,47-5,97 log2 tại thời điểm 7 tuần sau tiêm mũi 1 rồi giảm dần đến thời điểm 11 tuần sau tiêm hiệu giá kháng thể trung bình của vịt ở 2 trại còn 4,17-4,33 log2. Kết quả giám sát sau tiêm phòng vacxin cúm H5N1 của Trung Quốc trên vịt ở một số trại giống trung −ơng và địa ph−ơng - Tại Bắc Ninh, trong 2 năm 2006-2007, ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm hiệu giá kháng thể trung bình đạt 4,22-4,27 log2. ở thời đỉểm 3-4 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể giảm còn 3,37 log2. 82 - Tại Bắc Giang, năm 2006 ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 2,98 log2. Tại thời điểm 3-4 tháng sau tiêm thì hiệu giá kháng thể trung bình giảm còn 0,6 log2. Năm 2007, ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 0,66 log2. - Tại TTNCGC Cẩm Bình, trong 2 năm 2006-2007, ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình dao động rong khoảng 2,51-2,77 log2. Tại thời điểm 3-4 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình tăng lên 3,03 log2. - Tại TTNC Vịt Đại Xuyên, ở thời điểm 1-2 tháng sau tiêm của năm 2006 và 2007, hiệu giá kháng thể trung bình đạt 4,83-6,17 log2. Tại thời điểm 3-4 tháng sau tiêm, hiệu giá kháng thể trung bình giảm xuống còn 3,58 log2. 5.2 Đề nghị - Tiếp tục sử dụng vacxin H5N1 nhập của Trung Quốc cho gia cầm (gà, vịt,...) để phòng chống bệnh cúm gia cầm. - Cần khảo nghiệm thêm về độ dài miễn dịch của vịt đ−ợc tiêm phòng vacxin H5N1 để đ−a ra qui trình tiêm phòng cho phù hợp và đạt hiệu quả cao. - Do thời gian có hạn và số l−ợng mẫu ch−a nhiều nên cần khảo nghiệm vacxin trên nhiều địa ph−ơng để có số liệu sát với tình hình thực tế hơn. 83 Tài liệu tham khảo I. Tài liệu tiếng việt 1. Vũ Triệu An (1998), Miễn dịch hoc, NXB Y học, Hà Nội. 2. Bùi Quang Anh, Văn Đăng Kỳ (2004), “Bệnh cúm gia cầm: l−u hành bệnh, chẩn đoán và kiểm soát dịch bệnh”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(3), tr. 69-75. 3. Bùi Quang Anh (2005), Báo cáo về dịch cúm gia cầm tại hội nghị kiểm soát dịch cúm gia cầm khu vực châu á do FAO, OIE tổ chức tại Thành phố Hồ Chí Minh từ 23 - 25 tháng 2 năm 2005. 4. Bộ Nông nghiệp và CNTP (1994), Qui trình kỹ thuật kiểm nghiệm vaccine dùng trong thú y, NXB Nông nghiệp. 5. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2004), H−ớng dẫn Biện pháp phòng chống bệnh cúm gia cầm trên đàn vịt có phản ứng có huyết thanh d−ơng tính, Hà Nội. 6. Bộ Nông nghiệp và PTNT (2005), Dự án sử dụng vacxin nhằm khống chế và thanh toán bệnh cúm gia cầm thể độc lực cao H5N1, Hà Nội. 7. Breytenbach J.H (2003), “Tiêm chủng, một phần của chiến l−ợc khống chế bệnh cúm gà”, (Nguyễn Thị Mến, Bùi Văn Đông dịch), Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(2), tr. 72-78. 8. Caroline Yuen (2004), “Đánh giá tiêm chủng vacxin cúm gà H5 năm 2003 tại Hồng Kông”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(2), tr. 79-80. 9. Trần Hữu Cổn, Bùi Quang Anh (2004), Bệnh cúm ở gia cầm và biện pháp phòng chống, NXB Nông nghiệp, Hà Nội. 10. Cục thú y (2004), Bệnh cúm gia cầm và biện pháp phòng chống, NXBNN, Hà Nội. 84 11. Cục thú y (2005), Sổ tay h−ớng dẫn phòng chống bệnh cúm gia cầm và bệnh cúm trên ng−ời, Hà Nội. 12. Tr−ơng Văn Dung và cộng sự (2005), Báo cáo kết quả thử nghiệm vaccine phòng bệnh cúm gia cầm, Viện Thú y, Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn. 13. Nguyễn Tiến Dũng, Đỗ Quý Ph−ơng, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Bùi Nghĩa V−ợng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Thuý Duyên (2005), “Giám sát bệnh cúm gia cầm tại Thái Bình”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XII(2), tr. 6-12. 14. Nguyễn Tiến Dũng, Đào Thanh Vân, Bùi Ngọc Anh, Kenjiro Inui, Bùi Nghĩa V−ợng, Nguyễn Thế Vinh, Nguyễn Bá Thành, Phạm Thị Kim Dung (2005), “Giám sát tình trạng nhiễm virus cúm gia cầm tại đồng bằng sông Cửu Long cuối năm 2004”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XII(2), tr. 13-18 15. Lệ Hà (2005), Việt Nam thử nghiệm sản xuất vắc xin phòng cúm H5N1, 16. Ninh Văn Hiểu (2006), Tình hình dịch cúm gia cầm và kết quả tiêm vacxin H5N2, H5N1 của Trung Quốc để phòng bệnh cho gà, vịt trên địa bàn tỉnh Nam Định, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 17. Lê Thanh Hoà (2004), Họ Orthomyxoviridae và nhóm virus cúm A gây bệnh cúm trên gà và ng−ời, Viện khoa học công nghệ, Hà Nội. 18. Ilaria Capua, Stefano Marangon (2004), “Sử dụng tiêm chủng vacxin nh− một biện pháp khống chế bệnh cúm gà”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XI(2), tr. 59-71. 19. Đào Yến Khanh (2005), Kiểm nghiệm và khảo nghiệm vaccine cúm gia cầm ngoại nhập, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 85 20. Phạm Sĩ Lăng (2004), Hội thảo một số biện pháp khôi phục đàn gia cầm sau dập dịch, Hà Nội. 21. Phạm Sỹ Lăng (2004), “Diễn biến bệnh cúm gia cầm ở châu á và các hoạt động phòng chống bệnh”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XI(3), tr. 91-94. 22. Lê Văn Năm (2004), “Bệnh cúm gà”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XI(1), tr. 81-86. 23. Lê Văn Năm (2004), “Kết quả khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể bệnh cúm gia cầm ở một số cơ sở chăn nuôi các tỉnh phía Bắc”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XI(3), tr. 86-90. 24. D− Đình Quân (2006), Khảo sát đáp ứng miễn dịch của ngan, vịt với vacxin cúm gia cầm trên thực địa, Luận án thạc sĩ nông nghiệp, Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 25. Nguyễn Hoài Tao, Nguyễn Tuấn Anh, “Một số thông tin về dịch cúm gia cầm”, Chăn nuôi, số 3 - 2004, tr. 23. 26. Tô Long Thành (2004), “Bệnh cúm gia cầm ở ng−ời và vấn đề phòng chống”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XI(3), tr. 76-83. 27. Tô Long Thành (2004), “Thông tin cập nhật về tái xuất hiện bệnh cúm gia cầm tại các n−ớc châu á”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XI(4), tr. 87- 93. 28. Tô Long Thành (2005), “Một số thông tin mới về bệnh cúm gia cầm”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XII(1), tr. 84-91. 29. Tô Long Thành (2005), “Kinh nghiệm phòng chống dịch cúm gia cầm và sử dụng vacxin cúm gia cầm tại Trung Quốc”, Tạp chí Khoa học kỹ thuật Thú y, XII(3), tr. 87-90. 30. Tô Long Thành (2006), “Thông tin cập nhật về bệnh cúm gia cầm và vacxin phòng chống”, Tạp chí Khoa học Kỹ thuật Thú y, XIII(1), tr. 66-76. 86 31. Trần Thị Thu (2006), Đánh giá hiệu quả sử dụng vaccine trong ch−ơng trình phòng chống dịch cúm gia cầm H5N1 của tỉnh Bắc Ninh, Luận văn thạc sĩ nông nghiệp, Tr−ờng Đại học Nông nghiệp I, Hà Nội. 32. V−ờn quốc gia Cúc Ph−ơng: Cúm gia cầm giết chết 3 cầy h−ơng (theo TTXVN-2005), II. Tài liệu tiếng Anh 33. Alexander D.J., G. Parsons and R.J. Manvell (1986), “Experimental assessment of the pathogenicity of eight Avian Influenza A viruses of H5 subtype for chickens, turkeys, ducks and quail”, Avian Patho, 15:647-662. 34. Alexander D.J. (1993), “Orthomyxovirus Infections”, Virial Infections of Vertebrates, Volume 3: Virial Infections of Birds, Elserviers, Amsterdam, the Netherlands, 287-316. 35. Alexander D.J. (1996), “Highly Pathogenic Avian Influenza (fowl plague)”, OIE Manual of standards for diagnostic tests and vaccines. List A and B diseases of mammals, birds and bees, 3rd ed. pp.155-160. 36. Alexander D.J. (2001), “Ecology of Avian Influenza in domestic bird” (p. 25-33) in B. Dodet and M. Vicari (ed), Emergence and control of zoonotic ortho and paramyxovirus disease, Jonh Libbey Eurotext, Paris, France. 37. Beard C.W., Schnitzlein W.M. & Tripathy D.N. (1991), “Protection of chickens against highly pathogenic avian influenza virus (H5N2) by recombinant fowlpox viruses”, Avian Dis., 35, pp.356–359. 38. Biswas. S. K and D. P. Nayak (1996), “Influenza virus polymerase basic protein 1 interacts with influenza virus polymerase basic protein 2 at multiple sites”, J. Virology 70: 6716-6722. 39. Bosch. F. X, M. Orlich, H. D. Klenk and R. Rott (1979), “The structure of the hemagglutinin, a determinant for the pathogenicity of influenza 87 viruses”, Virology 95: 197-207. 40. Buckler White and B. R. Muphy (1998), “Nucleotide sequence analysis of the nucleoprotein gene of an avian and a human influenza virus strain identifies two classes of nucleoproteins”, Virology 155: 345-355. 41. Capua I., Maragon S., Dalla Pozza M., Santucci U. (2000), “Vaccination for Avian Influenza in Italy”, Vet. Rec., 147, 751. 42. Castrucci. M. R and Y. Kawaoka (1993), “Biologic importance of neuramidase stalk length in influenza A virus”, J. Virology, 67: 759-764. 43. Council of the European Communities (1992), “Council Directive 92/40/EEC of 19th May 1992 introducing Community measures for the control of avian influenza”, Official Journal of Eropean Communities, L167, 1-15. 44. Easterday B. C. , Virginia S, Hinshaw, David A, Halvorson (1997), “Influenza”, Diseases of Poultry, 10th edition, Iowa State University Press, Ame, pp. 538-606. 45. European Union (EU) Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare (SCAHAW) (2003), Food Safety: Diagnostic Techniques and Vaccines for Foot and Mouth Disease, Classical Swine Fever, Avian Influenza and some other important OIE List A Diseases, Report of the Scientific Committee on Animal Health and Animal Welfare. 46. Fener, F.m P. A. Murphy, M. J Studdert, D. O. White (eds) (1987), Veterinary Virology, Academic Press, Orlando, FL, pp. 473-484. 47. Food and Agriculture Organization of the United (FAO) (2004), FAO, OIE & WHO Technical consultation on the Control of Avian Influenza, Animal health special report. 48. Garcia-Garcia J., Rodriguez V.H. & Hernandez M.A. (1998), 88 “Experimental studies in field trials with recombinant fowlpox vaccine in broilers in Mexico”, Proceedings of the Fourth International Symposium on Avian Influenza, Athens, Georgia, USA, pp. 245–252. 49. Hinshaw, V. S., R. G. Webster, B. C. Easterday and W. J. Bean (1981), “Replication of avian influenza A viruses in mammals”, Infect Immun, 34:345-361. 50. Hinshaw, V. S. and R. G. Webster (1982), “The natural history of influenza A viruses”, Basic and Applied influenza research, CRC Press, Inc., Bocaraton, Fl, pp 79-104. 51. Hinshaw, V. S., W. J. Bean, J. Geraci, P. Fiorelli, G. Early and R. G. Webster (1986), “Characterization of two influenza viruses from a pilot Whale”, J. Virol, 58:655-656. 52. Hinshaw, V. S., C. W. Olsen, N. Dybdahlsissoko, D. Evans (1994), “Appotosis: A mechanism of cell killing by influenza A and B viruses”, J. Virol, 68:3667-3673. 53. Holsinger, L. J, D. Nichani, L. H. Pinto and R. A. Lamb (1994), “Influeza A virus M2 ion chanel protein: a structurefunction analysis”, J. Virology, 68: 1551-1563. 54. Horimoto T and Kawaoka Y (1995), “Direct reverse transcriptase PCR to determine virulence potential of influenza A viruses in birds”, J. Clin Microbiol, 33(3): 748-751. 55. Horimoto T and Kawaoka Y (2001), “Pandemic threat posed by avian influenza viruses”, Clind Microbiol Rev, 14(1): 129-149. 56. Ian Tizard (1982), An introduction to veterinary immunology, Second edition, W. B. Saunders company. 57. International Association for Biologicals (2005), Control of Infectious Animal Diseases by Vaccination- Development in Biologicals, Vol. 119, Karger, Buenos Aires, Argentina. 89 58. Intervet International B. V. (2002), Nobilisđ IA inac, Intervet, Holland. 59. Ito, T and Y. Kawaoka (1998), Avian influenza, Blackwell Sciences Ltd, Oxford, United Kingdom. 60. Kawaoka (1988), “Is the gene pool of influenza viruses in shorebirds and gulls different from that in wild ducks”, Virology, 179:759-767. 61. Kingrbuy (1985), “Protective immunity against avian influenza induced by a fowlpox virus recombinant”, Virology, Raven press NewYork, 1157-1178. 62. Kingsbury, D (1985), “Orthomyxo and paramyxoviruses and their replication”, Virology, Raven Press, NewYork, pp. 1157-1178. 63. Kishida N, Sakoda Y, Isoda N, Matsuda K, Eto M, Sunaga Y, Umemura T, Kida H (2005), “Pathogenicity of H5 influenza viruses for ducks”, Arch Virol, 2005 Jul; 150(7):1383-92. 64. Klingeborn. B, Englund, L, R. Rott, N. Juntti and G. Rockborn (1985), “An Avian influenza A virus killing a mammalian species - the Mink”, Arch Virol, 86:347-351. 65. Luong. G and Palese. P (1992), “Genetic analysis of influenza virus”, Curr Opinion Gen Develop 2: 77-81. 66. Mowat N., Rweyemamu M. (1997), Vaccine Manual- The production and quality control of veterinary vaccines for use in developing countries, FAO animal production and health series N.35, FAO, Rome. 67. Muphy. B. R and R. G Webter (1996), Orthomyxoviruses, Lippincott- Raven Pblishers, Philadenphia, Pa. 68. Office International des Epizooties (OIE) (1992), Manual of Standards for Diagnostic Tests and Vaccines, Second Edition, Paris, France. 69. Pastoret P. P., Blancou J., Vannier P. & Verschueren C. (1997), Veterinary Vaccinology, Elsevier Science B.V. 70. Stubbs, E. L (1965), “Fowl Plague”, Diseases of Poultry, 5th edition, lowa 90 State University Press. Ame, pp. 813-822. 71. Suarez, D. L., Schultz, C. S. (2000), “Immunology of avian influenza virus: a review”, Dev. Comp. Immunol, 24 (2-3), 269-283. 72. Suarez. D. L, M. L. Perdue, N. Cox, T.Rowe, C. Bender, J. Huang, and D. E.. Swayne (1998), “Comparisons of highly virulent H5N1 influenza A viruses isolated from humans and chickens from Hong Kong”, J. Virology, 72: 6678-6688. 73. Swayne D.E . (2003), “Vaccines for list A poultry diseases; emphasis on avian influenza”, Dev. Biol., 114 , pp. 201–212. 74. Swayne, D. E., Suarez, D. L. (Eds) (2003), “Proceeding of the fifth International Syposium on Avian Influenza”, Avian Diseases (Special isues), Carter Comp., Richmond, USA. 75. Terrence M. Tumpey (2004), Animal Influenza Diagnosis and Surveillance, Hokkaido University, August 18-23, 2004. 76. Tian G, Zhang S, Li Y, Bu Z, Liu P, Zhou J, Li C, Shi J, Yu K, Chen H (2005), “Protective efficacy in chickens, geese and ducks of an H5N1 - inactivated vaccine developed by reverse genetics”, Virology, 2005 Oct. 10; 341(1):153-62. 77. Vey. M, M. Orlich, S. Adle, H. D. Klenk, R. Rott and W.Garten (1992), “Heamagglutinin activation of pathogenic avian influenza viruses of serotype H7 requyres the protease recognition motif R-X-K/R-R”, Virology, 188:408-413. 78. WHO Expert committee (1980), “A revision of the system of nomen clature for Influenza virus: a WHO memorandum”, Bull. WHO, 58, pp. 585-591. ._.