Kiểm định và khảo nghiệm vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt

. Thủ tướng chính phủ đã ra quyết định số 10/2008/QĐ-TTg ngày 16 tháng 01 năm 2008 phê duyệt chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020. Mục tiêu chung của chiến lược đến năm 2020, ngành chăn nuôi cơ bản chuyển sang phương thức trang trại, công nghiệp, đáp ứng phần lớn nhu cầu thực phẩm và đảm bảo chất lượng cho người tiêu dùng và xuất khẩu. Tỷ trọng chăn nuôi trong nông nghiệp đến năm 2020 đạt trên 42% trong đó năm 2010 đạt khoảng 32% và 38% vào năm 2015. Đảm bảo an toàn dịch bệnh và vệ sinh an toàn thực phẩm, khống chế có hiệu quả dịch bệnh trong chăn nuôi. Đối với chăn nuôi lợn quyết định cũng định hướng đến năm 2020 phát triển nhanh quy mô đàn lợn ngoại theo hướng trang trại, duy trì quy mô nhất định đối với chăn nuôi lợn lai, lợn đặc sản phù hợp với điều kiện chăn nuôi của nông hộ và của một số vùng. Tăng tổng đàn lợn bình quân 2% năm, đạt 35 triệu con trong đó đàn lợn ngoại nuôi trang trại công nghiệp chiếm 37%.[2 ] Tuy nhiên, trong những năm gần đây ngành chăn nuôi lợn gặp không ít khó khăn như: con giống, thức ăn…., và dịch bệnh gây thiệt hại lớn về kinh tế. Nguyên nhân do thực hiện công tác phòng bệnh chủ động bằng vacxin chua tốt. Các ổ dịch bệnh Lở mồm long móng, hội chứng PRRS, Phó thương hàn lợn … gây thiệt hại lớn trên đàn lợn là điều cảnh báo cho chúng ta về mối nguy hại của dịch bệnh trong chăn nuôi lợn. Phó thương hàn lợn là một trong các bệnh truyền nhiễm gây thiệt hại lớn trên đàn lợn, bệnh xảy ra hàng năm và chủ yếu xảy ra ở lợn từ 2- 4 tháng tuổi. Bệnh này đã được các nhà khoa học trong và ngoài nước nghiên cứu và có biện pháp phòng chống bằng cách tiêm vacxin phòng bệnh, tại Việt nam đã có nhiều loại vacxin phòng bệnh hiệu quả. Xí nghiệp thuốc Thú y Trung ương là đơn vị sản xuất và cung ứng nhiều loại vacxin trong đó có 2 loại vacxin phòng bệnh phó thương hàn lợn là vacxin Phó thương hàn lợn nhược độc đông khô và vacxin Phó thương hàn lợn vô hoạt đưa vào tiêm phòng đại trà bảo vệ đàn lợn Vacxin Phó thương hàn lợn vô hoạt là loại vacxin sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí tiên tiến đạt hiệu quả phòng bệnh rất cao. Tuy nhiên để khẳng định hiệu quả cũng như đánh giá được chất lượng của vacxin sản xuất theo công nghệ mới này chúng tôi tiến hành thực hiện đề tài: “ Kiểm định và khảo nghiệm vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt” Mục đích yêu cầu của đề tài Kiểm nghiệm các chỉ tiêu kỹ thuật của vacxin: an toàn, vô trùng, hiệu lực Xác định được độ dài miễn dịch của vacxin. Đánh giá được quy trình bảo quản vacxin Ứng dụng vacxin vào thực tế 1.3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Qua việc kiểm định và khảo nghiệm vacxin chúng tôi có thể đánh giá được hiệu quả phòng bệnh của vacxin đối với vật nuôi và xác định được độ dài miễn dịch để từ đó đưa ra được lịch tiêm phòng vacxin phó thương hàn lợn cho vật nuôi tốt nhất, nâng cao hiệu quả phòng bệnh phó thương hàn cho vật nuôi. Đánh giá sự tác động của quy trình bảo quản đến chất lượng của vacxin để đưa ra các khuyến cáo về cách bảo quản đảm bảo tốt chất lượng vacxin. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Đặc tính chung của vi khuẩn Salmonella 2.1.1 Hình thái chung Salmonella là một loại vi khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4–0,6 x 1–3 µm, không hình thành giáp mô và nha bào. Đa số các loài Salmonella đều có khả năng di động mạnh do có từ 8-12 lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum-pullorum) vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm thông thường, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu. Hình 2.1 Hình thái chung của vi khuẩn Salmonella (hình ảnh minh hoạ) 2.1.2 Tính chất nuôi cấy Salmonella vừa hiếu khí vừa kị khí không bắt buộc, dễ nuôi cấy, nhiệt độ thích hợp là 370C, nhưng có thể phát triển được từ 6–420C, pH thích hợp bằng 7,6, phát triển được từ pH 6–9. Salmonella gây bệnh ở gia súc, sinh trưởng tốt trong điều kiện hiếu khí, kém hơn trong điều kiện kỵ khí. Môi trường nước thịt: cấy sau vài giờ thấy đục nhẹ, sau 18h đục đều, nuôi lâu ở đáy ống nghiệm xuất hiện cặn, trên mặt môi trường có màng mỏng. Môi trường thạch thường: nuôi cấy trên thạch thường vi khuẩn mọc thành các khuẩn lạc tròn, trong sáng hoặc xám, nhẵn bóng, hơi lồi lên ở giữa, nhỏ và trắng hơn khuẩn lạc của E.coli (đường kính = 1–1,5mm). Ở một số loài như Salmonella paratyphi B, Salmonella choleraesuis cấy trên thạch pepton dày, sau 1–2 ngày khuẩn lạc hình thành một bờ chất dính, chất keo bao bọc. Trên thạch thỉnh thoảng thấy có khuẩn lạc dạng R nhám, mặt trong mờ. Salmonella abortus equi nuôi cấy từ cơ thể động vật sang thạch thường lần đầu tiên hình thành khuẩn lạc khô, hình hạt lỗ chỗ. 2.1.3 Cấu trúc kháng nguyên Để phân loại Salmonella, ngoài các đặc tính nuôi cấy, sinh vật, hóa học, cần nắm vững cấu trúc kháng nguyên, cấu trúc kháng nguyên của Salmonella hết sức phức tạp, bao gồm: Kháng nguyên thân O (Ohne Hauch) Kháng nguyên lông H (Hauch) Kháng nguyên vỏ bọc K (Kapsula) Kháng nguyên màng ngoài vi khuẩn (OMP) Kháng nguyên Pili (Fimbriae antigen) 2.1.3.1. Kháng nguyên O (Ohne Hauch) Kháng nguyên thân O nằm ở lớp màng ngoài của tế bào vi khuẩn. Tính chất đặc thù của kháng nguyên này được xác định bởi thành phần cấu trúc Lypopolysaccharide (LPS) bao gồm hai nhóm: - Nhóm Lypopolysaccharide nằm bên trong không mang tính đặc trưng của kháng nguyên mà có vai trò tạo ra sự khác biệt về hình thái khuẩn lạc từ dạng S (Smooth) sang dạng R (Rough) - Nhóm Lypopolysaccharide nằm ngoài quyết định tính kháng nguyên và đặc trưng cho từng chủng vi khuẩn. Khi thủy phân phân tử Lypopolysaccharide người ta thu được 5 loại đường là: heptose, 2-keto-3 dexyoctonate (KDO), glucose, galactose và glucosamine. Qua nghiên cứu người ta xác định kháng nguyên O có bản chất là các chuỗi đường nằm trên phân tử Lypopolysaccharide mà đơn vị cơ bản của nó là Oligosaccharide, đây là những đường đa (một phân tử Oligosaccharide được cấu tạo từ 2-10 phân tử đường đơn mongosaccharide). Trong quá trình nghiên cứu, các nhà khoa học đã tìm thấy kháng nguyên O của Salmonella có 65 yếu tố khác nhau. Một Salmonella có thể có một hoặc nhiều yếu tố đó. Mỗi yếu tố được đánh dấu bằng chữ số La mã hay số Ả Rập. Dựa vào sự khác nhau về cấu trúc kháng nguyên O của các Salmonella mà người ta chia chúng thành 34 nhóm khác nhau:A, B; C1; C2; C3; D1, D2, E1, E2, E3, E4, F, G1, G2, H. I, J, L, M, N, O, P, Q, R, S, T, U, V, W, X, Y, Z, 49, 50. Đặc tính của kháng nguyên O Kháng nguyên O của vi khuẩn Salmonella là kháng nguyên chịu nhiệt, ở nhiệt độ 1000C, kháng nguyên bị hủy sau 24 giờ. Kháng nguyên O có thể chịu được cồn 500 và axit HCL 1N trong 24 giờ, nhưng kháng nguyên O bị phá hủy bởi focmon 5% [16]. Kháng nguyên có tính độc: 1/20mg giết chết chuột nhắt trắng sau 24h. Chuỗi polysaccarit khi mất dần phân tử đường hay có sự thay đổi vị trí làm cho độc lực của vi khuẩn bị thay đổi. Kháng nguyên O liên hệ trực tiếp với hệ thống miễn dịch của cơ thể. Khi kháng nguyên O gặp kháng thể tương ứng sẽ xảy ra phản ứng ngưng kết, gọi là hiện tượng ngưng kết O. Thân vi khuẩn ngưng kết với nhau thành những hạt nhỏ, lắc khó tan. 2.1.3.2. Kháng nguyên H (Hauch) Có ở trên lông vi khuẩn, chỉ có ở các Salmonella có lông (trừ Salmonella pullorum gallinarium). Bản chất protein cấu trúc gần giống Miozin của cơ. Kháng nguyên H chia làm 2 pha [15]: Pha 1 có tính chất đặc hiệu, gồm 28 kháng nguyên lông được biểu thị bằng chữ mẫu Latin thường: a, b, c, d…z Pha 2 không có tính chất đặc hiệu, loại này có thể ngưng kết với loại khác. Pha 2 gồm có 6 loại được biểu thị bằng chữ số Ả Rập 1, 2, 3, 4, 5, 6. hay chữ Latin thường e, n, x… Đặc tính của kháng nguyên H Là kháng nguyên kém chịu nhiệt (60oC/1h), dễ bị tác động bởi cồn 500 bị phá huỷ. Đề kháng với focmon 5%o vẫn tồn tại. Khi kháng nguyên H gặp kháng thể H làm cho vi khuẩn ngưng kết lại: lông- kháng thể- lông biểu hiện như cụm bông nhỏ. Ngưng kết không bền, dễ tan khi lắc. ở vi khuẩn đường ruột kháng nguyên H không liên quan đến yếu tố độc lực, không có ý nghĩa tạo miễn dịch, chỉ có ý nghĩa trong quá trình phân loại. 2.1.3.3. Kháng nguyên K Có trong thành phần giáp mô, bản chất là polysaccarit, có nhiệm vụ hỗ trợ phản ứng ngưng kết với kháng nguyên O. Là hàng rào bảo vệ vi khuẩn chống lại tác động ngoại lai và sự thực bào làm tăng khả năng gây bệnh. Có 3 loại kháng nguyên K (Kauffman, 1972) là kháng nguyên 5, kháng nguyên Vi và kháng nguyên M (Mucoid antigen). Kháng nguyên (4-5-Antigen): kháng nguyên này không liên quan đến độc lực của vi khuẩn, kém chịu nhiệt hơn kháng nguyên O, bị HCl phá hủy, nhưng không bị phân hủy bởi cồn. Kháng nguyên Vi: kháng nguyên này phát hiện thấy ở hai loài Salmonella typhi và Salmonella paratyphi gây bệnh thương hàn cho người [4]. Đây là kháng nguyên độc, Felix và Pitt cho rằng kháng nguyên Vi chịu nhiệt tốt, có sức đề kháng cao với cồn và axit HCl. Kháng nguyên M (Mucoid antigen): là loại kháng nguyên của các dòng Mucoid có khuẩn lạc dạng nhầy. Theo Heys 1953, kháng nguyên K chính là Hexapolysaccharide vỏ bọc được xắp xếp giống các mạch thẳng của hỗn hợp cao phân tử dạng (-1-4, 2 deoxy-2-5 Acetyl Galactose). Kháng nguyên K thường thấy ở dạng type K1 , K2 , K3 , K5 , K12 , K13 (Orskr, 1977–1978 ) [31]. 2.1.3.4. Kháng nguyên vỏ bọc (Outer membrane Protein - OMP) Lớp màng ngoài của các chủng Salmonella chứa protein có độc tính. Thành phần này chiếm 50% toàn bộ kháng nguyên OMP. Theo Smith và Nikaido, 1978 OMP của Salmonella typhimurium có 4 loại protein. OMP là yếu tố đề kháng với men phân giải protein như trypsin làm cho vi khuẩn mất khả năng chống lại huyết thanh và bị hạn chế hoạt động hay bị phá hủy. 2.1.3.5 Kháng nguyên Pili (Fimbriae antigen) Bản chất của kháng nguyên Pili là protein. Trong một thời gian dài chức năng kháng nguyên Pili được xếp chung vào kháng nguyên K gây bệnh tiêu chảy cho đàn gia súc non, được ký hiệu K88, K99 ,… Đến nay đã phát hiện một số nhóm kháng nguyên Pili của Salmonella gây bệnh tiêu chảy cho người và động vật như CFA (Colonization Factor Antigen) I và II. Nghiên cứu các tính chất của kháng nguyên O, H, Vi, người ta đã xây dựng được bảng công thức kháng nguyên, đó là sơ đồ Kauffman-White. Hiện nay, người ta có khuynh hướng không đặt tên các chủng Salmonella nữa mà biểu thị chung bằng công thức kháng nguyên. Bảng 2.1. Định type huyết thanh học (serotyp) của vi khuẩn Salmonella (Theo Kauffman (1972)). Nhóm huyết thanh Serotyp Kháng nguyên O Kháng nguyên H Pha 1 Pha 2 Nhóm A S.paratyphi A 1, 2, 12 A /1, 5/ Nhóm B S.paratyphi B 1, 4, /5/, 12 B 1,2 S.abortus ovis 1, 4, 5, 12 C 1,6 S.saintpaul 1, 4, 12 E, h 1,2 S.agona 1, 4, 12 F, g, s - S.typhimurium 1, 4, /5/, 12 I 1,2 S.heidelberg 1, 4, /5/, 12 R 1,2 S.abortus equi 4, 12 - E,n,x Nhóm C1 S.paratyphi C 6, 7, /Vi/ C 1,5 S.cholerae suis 6, 7 C 1,5 S.cholerae suis var Kunzendorf 6, 7 - 1,5 S.typhisuis 6, 7 C 1,5 S.montervideo 6, 7, 14 G,m/p/, s /1,2,7/ S.thomson 6, 7, 14 K 1,5 S.virchow 6, 7 R 1,2 S.infantis 6, 7, 14 R 1,5 Nhóm D1 S.typhi 9, 12, /Vi/ D - S.enteritidis 1, 9, 12 G,m/p/, s /1,7/ S.dublin 1, 9, 12 G, p - S.panama 1, 9, 12 i, v 1,5 S.gallinarum 1, 9, 121, 133 - - S.pullorum 9, 12 - - 2.1.4 Cách đặt tên Salmonella Cách đặt tên Salmonella là vấn đề gây tranh cãi trong nhiều năm qua. Theo cách đặt tên mới nhất phản ánh được sự tiến bộ trong cách đặt tên thì giống Salmonella chia thành 2 loài là: Salmonella enteritica và Salmonella bongori. Salmonella enteritica lại được chia thành 6 loài phụ với những khác biệt về đặc tính sinh hóa và nó cũng tương ứng với các phần giống trước đó (Le Minor L. & Popoff M.Y, 1987 [28], Popoff M.Y, Bockemuhl J. & McWhorter-Murlin A, 1994 [32] và Popoff M.Y, 2001 [33]). Các loài phụ đó là: Cách phân loại cũ Cách phân loại hiện nay Loài phụ I = Loài phụ enteritica Loài phụ II = Loài phụ salamae Loài phụ IIIa = Loài phụ arizonae Loài phụ IIIb = Loài phụ diarizonae Loài phụ IV = Loài phụ houtenae Loài phụ VI = Loài phụ indica Đối với huyết thanh của Salmonella bongori thì biểu tượng V vẫn được duy trì để tránh nhầm lẫn với type huyết thanh của Salmonella enteritica. Các chủng Salmonella được phân loại theo tính đa dạng của lipopolysaccharide (LPS) kháng nguyên (O) và kháng nguyên lông (H) phù hợp với Sơ đồ Kauffman-White. Hiện nay, người ta đã phát hiện ra khoảng gần 2500 type huyết thanh khác nhau của Salmonella và con số này chắc chắn sẽ còn tăng nữa (Popoff M.Y, Bockemuhl J. & McWhorter-Murlin A, 1994 [32] và Popoff M.Y, 2001 [33]). Những type huyết thanh chung nhất gây bệnh trên người và có trong thực phẩm là phụ loài enteritica. Các type huyết thanh của các phụ loài khác thường gây bệnh cho động vật máu lạnh và có trong môi trường. Bên cạnh đó, một số type huyết thanh của S.arizonae và S.diarizonae cũng kết hợp gây bệnh trên gà tây và cừu. 2.1.5 Tính biến dị Trong khi nuôi cấy, Salmonella có thể bị biến dị về khuẩn lạc và kháng nguyên. Biến dị từ khuẩn lạc S thành dạng R: Vi khuẩn mới phân lập có khuẩn lạc dạng S (Smooth) có kháng nguyên O đặc hiệu của chủng. Qua một thời gian nuôi cấy, vi khuẩn phát sinh biến dị khuẩn lạc thành dạng R, lúc đó kháng nguyên O không còn đặc hiệu nữa. Biến dị kháng nguyên O thành H: dưới ảnh hưởng của một số hóa chất như axit phenic, vi khuẩn sẽ mất lông sinh biến dị: không có lông và vi khuẩn chỉ còn kháng nguyên O. 2.1.6 Đặc tính sinh hóa Chuyển hóa đường: Mỗi loài Salmonella có khả năng lên men một số đường nhất định và không đổi, môi trường để kiểm tra tính chất lên men đường thường là môi trường nước pepton cho thêm một loại đường với tỷ lệ 0,5% và chất chỉ thị màu như xanh bromotymon (bromothymol blue), tía bromocrezon hoặc đỏ phenol. Phần lớn các loài Salmonella lên men sinh hơi có glucoz, mannit, mantoz, levuloz, arabinoz. Một số loài cũng lên men các đường trên nhưng không sinh hơi: S.abortus equi, S.abortus bovis, S.abortus ovis, S.typhi suis, S.typhi, S.choleraesuis, S.enteritidis. Salmonella pullorum gallinarum không lên men mantoz. Salmonella cholerae suis không lên men arabinoz. Tất cả các Salmonella đều không lên men đường lactoz, saccaroz. Tất cả các Salmonella đều không mọc ở môi trường có bổ sung kali xyanua. Khoảng 96% Salmonella tiết ra enzym khử cacboxyn đối với lysin, octinin và acginin. Đa số các Salmonella đều không làm tan chảy gelatin, không phân giải urê, không sản sinh Indon, một số sử dụng được cacbon ở nguồn xitrat, phân giải xanhmetylen. Phản ứng MR, Catalaz dương tính (trừ Salmonella cholerae suis, Salmonella pullorum gallinarum có MR âm tính) Phản ứng H2S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A, Salmonella abortus equi, Salmonella typhi suis) Người ta thường dùng các môi trường đặc biệt như EMB, Kauffman, SS để phân lập Salmonella. Để phân biệt các chủng Salmonella người ta dựa vào sự khác nhau về đặc tính sinh hóa của chúng. Sự khác nhau này thể hiện qua Bảng 2.2 Bảng 2.2. Đặc tính sinh hóa của một số loài Salmonella Loài vi khuẩn Xyloz Arabinoz Trehaloz Inositon Mantoz Sinh H2S Sal.paratyphi - +H +H - +H - Sal.echotmuelleri +H +H +H +H +H + Sal.híchfeldii +H +H +H - +H + Sal.typhosa ± ± + - + + Sal.typhimurium +H +H +H +H +H + Sal.abortus equi +H +H - - +H ± Sal.abortus ovis +H +H - - +H ± Sal.cholerae suis +H - - - +H ± Sal.typhi suis +H +H +H - +H - Sal.enteritidis +H +H +H - +H + Sal.pullorum +H +H +H - ± + Sal.gallinarum + + + - + ± Sal.anatis +H +H + - +H + Chú thích: + = sinh axit, dương tính; H = sinh hơi - = âm tính; ± = thay đổi 2.1.7 Sức đề kháng của Salmonella Vi khuẩn Salmonella rất mẫn cảm với nhiệt độ và các chất sát trùng, các chất sát trùng thông thường cũng dễ phá hủy vi khuẩn hoàn toàn như: Phenon 5%, HgCl 1/500, Focmon 1/500 diệt vi khuẩn trong 15–20 phút. Nhưng đối với một số hóa chất như Cristal violet, lục malachit, natri hyposulfit, dixitrat, muối mật với những nồng độ vừa đủ gây độc cho E.coli thì không ảnh hưởng tới sự phát triển của Salmonella. Dựa vào tính chất này người ta chế tạo những môi trường chọn lọc để kìm hãm sự phát triển của E.coli và giúp cho Salmonella có thể phát triển dễ dàng [4]. Với nhiệt độ: vi khuẩn có sức đề kháng yếu, bị diệt sau 600C/1giờ hay 750C/5 phút. Ánh sáng mặt trời chiếu trực tiếp diệt vi khuẩn sau 5 giờ [6]. Salmonella có thể tồn tại vài năm trong môi trường thích hợp [40]. Vi khuẩn có thể tồn tại trong chất độn chuồng 30 tuần, trong phân vịt 28 tuần, trong máy ấp ở nhiệt độ phòng tới 5 năm. Vi khuẩn có thể sống trong đất ở độ sâu 5m trong vòng 2 tháng và có thể tồn tại trong máng gỗ 108 ngày (Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng, 1986 [6]). Salmonella có thể sống trong thịt ướp muối (nồng độ khoảng 29%) được 4-8 tháng ở nhiệt độ từ 6–12oC [4]. 2.1.8 Các yếu tố gây bệnh của salmonella 2.1.8.1 Các yếu tố không phải độc tố * Kháng nguyên O và K Chúng ta biết rằng chất lượng, thành phần hóa học, cấu trúc của kháng nguyên O đều ảnh hưởng đến độc lực của vi khuẩn Salmonella. Ví dụ vi khuẩn Salmonella typhimurium nếu thay đổi thành phần kháng nguyên O từ công thức 1.4.12 sang 1.9.12, thì vi khuẩn từ dạng có độc chuyển sang dạng không có độc (Valtonen, 1977 [42]). Kháng nguyên O là yếu tố giúp vi khuẩn chống lại khả năng phòng vệ của vật chủ, giúp vi khuẩn phát triển trong tế bào tổ chức, chống lại sự thực bào của đại thực bào (Morris và cộng sự, 1976 [30]). Tương tự kháng nguyên O, kháng nguyên K cũng có ý nghĩa về mặt độc lực vì nó tham gia bảo vệ vi khuẩn trước các yếu tố phòng vệ của cơ thể và chống lại quá trình thực bào. * Kháng nguyên H Tuy kháng nguyên H không có ý nghĩa trong việc tạo ra miễn dịch phòng bệnh, không quyết định yếu tố độc lực, nhưng kháng nguyên H có vai trò bảo vệ vi khuẩn không bị tiêu diệt trong quá trình thực bào. Chúng còn giúp vi khuẩn nhân lên trong các tế bào gan, thận, kể cả tế bào dại thực bào (Tonita,1982; Weinstein D.L và cộng sự, 1984 [43]). * Yếu tố bám dính Bám dính là một khái niệm chỉ mối quan hệ của sự liên kết vững chắc, thuận nghịch giữa bề mặt vi khuẩn và tế bào ký chủ. Tất cả các cấu trúc thể hiện chức năng bám dính được gọi là yếu tố bám dính (Jonnes, Freter, 1976). Sự bám dính của vi khuẩn gây bệnh trên nhung mao của niêm mạc ruột (tế bào Eptitel) là bước đầu tiên và cơ bản cho việc gây bệnh của phần lớn các loài vi khuẩn gây bệnh. Jones (1977) đã chỉ ra rằng: cấu trúc bề mặt của vi khuẩn và kháng nguyên nói chung được coi như là yếu tố bám dính, có thể làm trung gian hoặc giúp đỡ việc bám dính của một số vi khuẩn vào tế bào của động vật cảm nhiễm (trích theo Nguyễn Quang Tuyên, 1995 [12]). Fimbriae được xác định là một yếu tố bám dính của vi khuẩn đường ruột nói chung và của Salmonella nói riêng (Evan và cộng sự 1975, Jones 1977). Đó là một dạng protein phân cực có cấu trúc bậc 1 bao gồm nhiều đơn vị xác định, có thể quan sát bằng kính hiển vi điện tử. Fimbriae của Salmonella có trọng lượng phân tử từ 8000–28000 dalton (1 dalton = 10-27 gr). Trong thành phần cấu tạo, có tới gần 50% là các a.amin không phân cực. (Muller K.H, Trust T.J, Kay W, 1989) . Nhiệm vụ quan trọng của Fimbriae là thực hiện bước đầu tiên của quá trình gây bệnh, tạo điều kiện xâm nhập của Salmonella vào hệ tiêu hóa và phân tán vi khuẩn vào môi trường (Katsube, 1978; Tanaka, 1972). Trong công trình nghiên cứu của Tanaka cho thấy: khi gây nhiễm qua đường miệng, các giống Salmonella có yếu tố bám dính cho chuột đã quan sát được Salmonella có trong đường tiêu hóa, đồng thời tìm thấy những vi khuẩn này trong gan, lách và hạch lympho. Vào ngày thứ 7 sau gây nhiễm đã phát hiện được kháng thể O và H trong huyết thanh con vật với hiệu giá ngưng kết bằng 1/10–1/40. Ngược lại, khi gây nhiễm bằng các chủng Salmonella không có yếu tố bám dính, Salmonella chỉ khu trú cục bộ và vận chuyển qua ống tiêu hóa, không thể tìm thấy vi khuẩn trong hạch, lách và gan; cũng không xác định được sự có mặt của kháng thể O và H trong huyết thanh chuột gây nhiễm (Lê Văn Tạo, 1986 [10]). Như thế, khả năng bám dính của vi khuẩn lên tế bào biểu mô ruột đến nay đã được khẳng định là yếu tố gây bệnh quan trọng, nó giúp cho vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể vật chủ và gây bệnh. * Khả năng xâm nhập và nhân lên Nhờ yếu tố này vi khuẩn mới xuyên qua được lớp màng nhày của ruột xâm nhập vào tế bào biểu mô. Khả năng xâm nhập vào tế bào Eukaryota và vào lớp mucosa đường ruột là đặc tính của một số chủng Salmonella cường độc. Vi khuẩn Salmonella có 13 protein giúp vi khuẩn xâm nhập. Các biến chủng của Salmonella không có khả năng xâm nhập vào tế bào, thường là các chủng không có độc lực. Theo Finlay B.B và cộng sự, 1988 [27], vi khuẩn xâm nhập vào trong tế bào Eukaryota là bước cần thiết tạo khả năng độc lực. Đây là quá trình tổng hợp gồm nhiều quá trình tham gia. Trên bề mặt tế bào thấy xuất hiện nhiều loại protein do vi khuẩn sản sinh ra cần cho quá trình xâm nhập và vai trò độc lực. Theo những nghiên cứu mới đây, trong môi trường nuôi cấy ở 370C, có 5 loại protein do vi khuẩn tạo ra. Một trong số đó là SOP E (Salmonella Outer Protein), là một loại protein phân tiết kết hợp với protein xâm nhập SOP E nằm trên PMW3 trong đoạn AND MEI1 của plasmid. Phân tử protein SOP E là chuỗi polypeptide gồm 240 axit amin có khối lượng 26.705 Dal. Sau khi xâm nhập được vào vào trong tế bào, vi khuẩn Salmonella tiếp tục xuyên bào (transcytose) qua mặt đối diện của tế bào (Findlay B.B, 1988 [27]), thời gian đồi hỏi cho quá trình xuyên bào tối thiểu là 4 giờ. Khả năng sống sót và nhân lên của vi khuẩn Salmonella trong tế bào Eukaryota phụ thuộc vào các chất dinh dưỡng khác nhau chứa trong tế bào vật chủ. Quá trình sinh tổng hợp purine của vi khuẩn biến dị, có thể xuất hiện các chủng nhược độc. Các chủng Salmonella biến dị thì có độc lực thấp, thường được dùng để chế tạo vacxin. * Khả năng tổng hợp sắt của vi khuẩn Salmonella Đây là khả năng quan trọng của vi khuẩn Salmonella. Tuy khả năng này không phải là độc lực nhưng nó là yếu tố làm suy yếu khả năng chống đỡ của vật chủ do thiếu sắt và đồng thời giúp vi khuẩn tăng nhanh về số lượng. Vi khuẩn Salmonella có phản ứng với sự thay đổi cơ chế chu chuyển sắt (Iron transfermechanism) khi quá trình tổng hợp sắt bị ức chế, chúng sẽ chuyển toàn bộ protein mang điều phối sắt (Iron Regulation outer membrane Protein - IRP) lên bề mặt của vi khuẩn làm cho khả năng hấp thu sắt tăng cường một cách tích cực. 2.1.8.2 Các yếu tố độc tố Từ những năm 1961 đã xuất hiện nhiều công trình nghiên cứu về độc tố của vi khuẩn đường ruột. Taylor và Willkins [41] đã nghiên cứu độc tố của Salmonella và Shigella qua thí nghiệm phân đoạn ruột non thỏ. Smith và cộng sự, 1967 nghiên cứu độc tố chịu nhiệt của Salmonella cho thấy, tác động của độc tố này làm nước trong cơ thể tập trung vào ruột non sau 18 – 24 giờ. Sakazaki và cộng sự (1974) đã nghiên cứu về cơ chế gây bệnh của độc tố Salmonella trong các đoạn ruột non của thỏ. Koupal, Deibel, 1975 đã nghiên cứu về đặc điểm và khu trú của độc tố đường ruột do Salmonella sản sinh. Sandefur, Peterson, 1977[35] đã nghiên cứu về sự trung hòa độc tố Salmonella do Choleraeantitoxin trong tế bào trứng của chuột hamster Trung Quốc. Sedlock Deibel, 1978[37]; Sedlock và cộng sự 1978[36] đã nghiên cứu chế tạo và sử dụng độc tố Salmonella tinh khiết. Dean và cộng sự, 1972 [24] đã tiến hành các mô hình xác định độc tố của vi khuẩn đường ruột trên chuột bạch và thỏ. Theo Peterson, 1977 độc tố đường ruột của Salmonella sản sinh ra có hai thành phần: độc tố thẩm xuất nhanh và độc tố thẩm xuất chậm. Độc tố thẩm xuất nhanh của Salmonella có cấu trúc và hoạt tính giống với độc tố chịu nhiệt ST (Stabletoixin) của E. coli. Độc tố này có trọng lượng phân tử hơn 90000 dal, chịu được nhiệt độ 1000C trong 4 giờ nhưng bị phá hủy nhanh khi hấp cao áp và bền vững ở nhiệt độ thấp, thậm chí có thể bảo quản ở nhiệt độ -200C. Cấu trúc phân tử bao gồm polysaccarit và một số polypeptit. Cơ chế gây bệnh của độc tố này là giúp Salmonella xâm nhập vào tế bào biểu mô của ruột. Độc tố chịu nhiệt thực hiện khả năng thẩm xuất nhanh sau 1–2 giờ và có thể kéo dài 48 giờ. Độc tố thẩm xuất chậm có cấu trúc thành phần giống độc tố không chịu nhiệt của E.coli cho nên thường gọi nó là độc tố không chịu nhiệt của Salmonella LT (Labiletoxin), nó bị phá hủy ở 700C /30 phút và 560C /4 giờ, điểm đẳng diện bằng 4. Cấu trúc gồm 3 chuỗi polypeptit và một số hợp chất khác. Trọng lượng phân tử 44.000- 50.000 thậm chí đến 70.000 dal. LT của Salmonella làm thay đổi quá trình trao đổi nước và chất điện giải, dẫn đến rút nước từ cơ thể vào ruột non, gây tiêu chảy. LT thực hiện chức năng thẩm xuất chậm từ 18-24 giờ, có thể kéo dài tới 36–48 giờ. Ăn phải vật chứa Salmonella là con đường nhiễm chủ yếu đối với Salmonella sp. Động vật bị nhiễm, động vật mang bệnh làm rơi vãi Salmonella theo phân là nguồn lây nhiễm Salmonella trong đàn và giữa các đàn. Nhiều loài Salmonella như Salmonella typhimurium, Salmonella enteritidis, Salmonella derby, Salmonella agona đã được phân lập từ thức ăn, loài gậm nhấm và môi trường (Bean N.H, Griffin P.M, 1990[22]; Altekruse S.F, 1990[21]; D’Aoust J.Y, Sewell A, Jean A, 1990 [23]; Durand A.M, Giesecke W.H, Barnard M.L, Van- Der-Walt M.L, Steyn H.C, 1990[25]. Tuy nhiên, Salmonella cholerasuis rất hiếm khi được phân từ thức ăn. Vì thế, lợn bị nhiễm bệnh hoặc các vật ô nhiễm vi khuẩn (trừ thức ăn) chắc chắn là nguồn lây nhiễm chủ yếu nhất. Những lợn khỏe mang trùng là phương tiện thông thường để vi khuẩn xâm nhập vào đàn (John R. Cole, Jr. Đại học Georgia; Jerome C. Nietfeld, Đại học bang Kansas; Kent J. Schwart, Đại học bang Iowa, 1996 [12]). Ở đàn lợn bị tiêu chảy cấp tính do Salmonella cholerasuis, có thể thải ra hàng triệu vi khuẩn trong 1 gram phân. Cũng như các lây nhiễm Salmonella khác, các ổ dịch Salmonella choleraesuis thường liên quan đến các nhân tố stress như nhốt lẫn, quá chật, vận chuyển, khí hậu khắc nghiệt, thay đổi thức ăn, ký sinh trùng và các bệnh xảy ra cùng một lúc. 2.1.9 Đặc tính sinh hóa của vi khuẩn S.choleraesuis Salmonella choleraesuis còn có tên khác là Bacillus cholerae suis, Bacterium cholerae suis, Bacillus suipestifer typ American và biến chủng của nó là Salmonella suipertifer chủng Kunzendorf. Vi khuẩn được phân lập lần đầu tiên trên lợn và năm 1885 do Salmon và Smith. 2.1.9.1 Đặc điểm hình thái S.choleraesuis là một loại vi khuẩn hình gậy ngắn, hai đầu tròn, kích thước 0,4–0,6 x 1–3µm, không hình thành giáp mô và nha bào. Có khả năng di động mạnh do có từ 8 -12 lông xung quanh thân. Vi khuẩn dễ nhuộm với các thuốc nhuộm thông thường, Gram âm, khi nhuộm vi khuẩn bắt màu đều toàn thân hoặc hơi đậm ở hai đầu. Hình 2.2: Vi khuẩn Salmonella bắt màu Gram âm khi nhuộm Gram (hình ảnh minh hoạ) 2.1.9.2 Đặc tính nuôi cấy Trên thạch: sau khi nuôi cấy 24 giờ, để ở nhiệt độ phòng thí nghiệm (25–30oC) từ 1 đến 2 ngày sau, hình thành một bờ chất dính lầy nhầy ở xung quanh. Trên mặt thạch thỉnh thoảng xuất hiện khuẩn lạc R nhám, mặt không bóng, không đều, mờ. Hìnhh 2.3. Khuẩn lạc S. choleraesuis trên thạch máu 24 giờ (hình ảnh minh hoạ) 2.1.9.3 Đặc tính sinh hoá Chuyển hoá đường: vi khuẩn lên men sinh hơi glucoz, levuloz, galactoz, mannoz, xyloz, mantoz, mannit, dechtrin, dunxit, ramnoz. Các phản ứng sinh hoá khác: +Indon : - + H2S : + + VP : - + MR : - + Khử nitrat thành nitrit 2.1.9.4 Cấu trúc kháng nguyên Salmonella cholerae suis thuộc nhóm C trong bảng phân loại Salmonella của Kauffman có công thức kháng nguyên như sau: S . VI, VII : c–1,5 Biến chủng Salmonella cholerae suis chủng Kunzendorf không có kháng nguyên lông pha 1 (pha đặc hiệu) : S . VI, VII : - 1,5 2.1.10 Phân lập và giám định Salmonella 2.1.10.1 Phân lập Salmonella Nếu bệnh phẩm là phân hay huyễn dịch phủ tạng đều cần phải cấy vào môi trường tăng sinh. Cấy nhiều bệnh phẩm vào môi trường Muller Kauffman (tốt nhất là pha bệnh phẩm vào dung dịch nước đệm pepton thành nồng độ 1/10 rồi nuôi trước tăng sinh ở 370C/16-20 giờ, sau đó lấy 1ml cấy vào ống 10ml Muller Kauffman ở 370C/24 giờ. Sau đó cấy chuyển sang các môi trường phân lập. Tiến hành phân lập vi khuẩn Salmonella theo sơ đồ sau: VP MR Kligler Endo (Khuẩn lạc vàng) Macconkey (Khuẩn lạc không màu Hình thái Gram Đặc tính sinh hóa Định type Beilliant Green (khuẩn lạc đỏ) Sinh H2S Gia súc bình thường Phân Gia súc tiêu chảy Muller Kauffman và Istrati (Khuẩn lạc thuần khiết dạng S màu xanh) Đếm số khuẩn lạc E.M.B (Khuẩn lạc đỏ hồng) Môi trường SS (Khuẩn lạc trắng) Hình thái nuôi cấy Khuẩn lạc thuần khiết Giữ trên thạch máu Tính chất sinh học Nước thịt Thạch thường Di động Lactoza Glucoza Galacto Saccaroza Hình 2.4 Sơ đồ phân lập và giám định Salmonella (theo Carter G.R, 1995) Vi khuẩn có thể mọc trên rất nhiều loại môi trường lỏng và thạch. Nếu bệnh phẩm là phân hoặc huyễn dịch phủ tạng đều cần phải cấy vào môi trường tăng sinh để giúp Salmonella có thể mọc tốt. Môi trường tăng sinh cho Salmonella là môi trường Muller Kauffman. Công thức như sau: Nước thịt Martine : 90 ml Canxi Cacbonat : 5 g Dung dịch natri thiosulfat 50% : 10 ml Dung dịch Iod-iodua : 2 ml Dung dịch lục sáng (Vert brilliant) Hoặc lục malaxit (Vert malachite) : 1ml Mật bò : 5ml Trong môi trường này natri hyposulfat (thiosulfat) kết hợp với thionat Iod và Iodua kali sinh ra natri tetrathionat giúp Salmonella phát triển và kìm hãm E.coli; Iod kìm hãm các tạp khuẩn, lục sáng ức chế sự phát triển của vi khuẩn Gram dương và E.coli. Chế môi trường bằng cách trộn các thành phần của môi trường với nhau, lắc đều cho tan, lọc vô trùng, nếu không lọc vô trùng thì phải pha chế thật vô trùng, sau pha chế, để tủ ấm 48 giờ, nếu vô trùng đem đóng 10ml/ống. Cấy phân hoặc bệnh phẩm vào môi trường Muller Kauffman (tốt nhất pha bệnh phẩm vào dung dịch nước đệm pepton thành nồng độ 1/10 rồi nuôi cấy trước tăng sinh ở 30oC từ 16–20 giờ, sau đó lấy 1 ml cấy vào ống 10ml môi trường Muller Kauffman). Nếu sau 24 giờ vi khuẩn mọc tốt thì đem cấy chuyển sang các môi trường chọn lọc khác như môi trường Vinson Blai, SS (Salmonella-Shigella), Macconcay, Kristensen, E.M.B để có những khuẩn lạc riêng biệt. * Môi trường Vinson Blai Trong ._.môi trường Vinson Blai, Salmonella lên men glocoz biến Sulfit thành sulfua, sử dụng sulfua sinh H2S làm cho khuẩn lạc của Salmonella có màu đen. Xitrat bismut kết hợp với sulfit natri thành một hỗn hợp ngăn cản sự phát triển của E.coli và giúp Salmonella mọc tốt, bismut trở thành tự do có màu óng ánh kim loại. Lục sáng ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn Gram dương. Khuẩn lạc của Salmonella nhỏ, khô, đen, dẹt, khi mọc riêng từng khuẩn lạc có ánh bạc kim loại (khi cấy vào môi trường Winson Blai phải nuôi ở nhiệt độ 37oC/48 giờ thì Salmonella mới mọc tốt). * Môi trường SS (Salmonella-Shigella) Trong môi trường SS, muối mật có natri dezoxicolat hoặc natri torocolat ngăn cản sự phát triển của E.coli, Proteus và vi khuẩn Gram dương. Lục sáng ngăn cản sự phát triển của vi khuẩn Gram dương. Khuẩn lạc của E.coli có màu đỏ, khuẩn lạc của Proteus có màu đen. Khuẩn lạc của Salmonella và Shigella trong, trắng, hoặc không màu. * Môi trường Macconcay (Mark conkey) Các vi khuẩn lên men lactoz hình thành khuẩn lạc màu đỏ, những vi khuẩn không lên men lactoz hình thành khuẩn lạc không màu. * Môi trường Kristensen Trong môi trường Kristensen, lục sáng kiềm chế vi khuẩn Gram dương và làm cho vi khuẩn Proteus không lan rộng, khuẩn lạc có màu vàng. Khuẩn lạc E.coli có màu xanh lá mạ, khuẩn lạc Salmonella có màu đỏ (pH=7–7,2). * Môi trường E.M.B (Eosin–Methylen–Blue) Trong môi trường E.M.B, xanh methylen có tác dụng hạn chế sự sinh trưởng của vi khuẩn Gram dương. E.coli lên men đường lactoz, sinh axit có khuẩn lạc màu đen tím có dung quang vàng (axit tạo thành kết hợp hai màu xanh methylen và eosin thành màu đen tím), vi khuẩn không lên men lactoz không làm đổi màu môi trường, khuẩn lạc của những vi khuẩn này có màu đỏ hồng của môi trường. * Môi trường Endo Trong môi trường Endo, Salmonella phát triển hình thành những khuẩn lạc màu vàng, E.coli lên men lactoz sinh axit phát triển thành những khuẩn lạc màu đỏ. * Môi trường thạch sắt ba đường TSA (Triple–Sugar-Agar) Môi trường có màu đỏ. Người ta sử dụng môi trường này để xác định những khuẩn lạc trong thạch Macconcay. Sau khi cấy vi khuẩn, để ở tủ ấm từ 24–48 giờ. Mỗi loại khuẩn lạc tạo ra những màu khác nhau: Bảng 2.3. Phân biệt một số vi khuẩn trên môi trường TSA Tên vi khuẩn Màu sắc khuẩn lạc Bact.alkaligenes Đỏ E.coli Vàng E.freudii Vàng, đen Proteus vulgaris Vàng, đen Salmonella Đỏ, vàng, đen Hafnici Đỏ, đen, vàng Proteus mirabilis Đỏ, đen, vàng * Môi trường thạch hai đường Kligler (KIA) Môi trường hấp xong có màu vàng, nguội có màu đỏ. Môi trường này dùng để cấy vi khuẩn nghi là Salmonella trên các môi trường phân lập. Khi cấy, dùng que cấy chích sâu, sau đó để tủ ấm 370C/24 giờ. Nếu vi khuẩn sinh H2S thì sẽ hình thành sulfua sắt màu đen làm cho vùng giữa thạch đứng và thạch nghiêng có màu đen. Nếu vi khuẩn chuyển hóa môi trường có sinh hơi sẽ thấy có các bọt khí xuất hiện trong thạch. Có thể giám định được một số vi khuẩn một cách dễ dàng trên môi trường Kligler như sau: Bảng 2.4. Phân biệt Salmonella và E.coli trên môi trường Kligler Tên vi khuẩn Thạch đứng Thạch nghiêng Sinh hơi H2S S.typhi Vàng Đỏ - + S.paratyphi A Vàng Đỏ - - S.paratyphi B Vàng Đỏ + ++ E.coli Vàng Vàng + - 2.1.10.2 Giám định Salmonella Với Salmonella phải làm phản ứng sinh hoá trước, sau đó mới làm phản ứng huyết thanh vì Salmonella có rất nhiều loại và biến chủng nên rất khó hướng ngay vào một chủng nào. * Phản ứng sinh hoá Dùng khuẩn lạc điển hình trên môi trường phân lập (SS, EMB…) Cấy vào thạch mềm kiểm tra di động. Kiểm tra phản ứng chuyển hoá đường. Phản ứng sinh Indol, MR, VP, H2S… Thử nghiệm này dùng để phân biệt các loại vi khuẩn trong Enterobacteriaceae Bảng 2.6. Thử nghiệm IMVIc của một số vi khuẩn đường ruột Loại vi khuẩn I (indol) MR (Methyl rouge) VP (Voges prosskauer) Ic (Xitric) S.cholerae suis - - - + E.coli + + - Klebsiella - ± - ± Proteus vulgaris + + - ± Aerobacter (Aerogenes) - - + + Căn cứ vào đặc tính sinh hoá khác nhau mà phân biệt các loại và các biến chủng của Salmonella. * Phản ứng huyết thanh ngưng kết Do Salmonella có cấu tạo kháng nguyên phức tạp, mỗi loại kháng nguyên lại có nhiều phần tử nên phải có kháng huyết thanh của từng phần tử một. Phải có kháng huyết thanh O cho từng loài Salmonella, cho từng nhóm, phải có kháng huyết thanh O nhiều hoá trị cho các liên kết nhóm A-E, F-I. Phải có kháng huyết thanh riêng với pha đặc hiệu và pha không đặc hiệu. Trước hết lấy khuẩn lạc trên mặt thạch làm phản ứng ngưng kết với kháng huyết thanh liên nhóm A-E (98% chủng Salmonella gây bệnh ở người và động vật thuộc nhóm này.) Nếu phản ứng (+), làm tiếp với kháng huyết thanh từng nhóm trong liên nhóm, cuối cùng làm phản ứng với kháng huyết thanh của typ nghi ngờ. Phản ứng dương tính: tìm ra được typ Salmonella gây bệnh. 2.1.11 Một số phương pháp chẩn đoán huyết thanh học thông thường 2.1.11.1 Phương pháp ngưng kết nhanh trên phiến kính Phương pháp này dùng để xác định kháng nguyên vỏ. Đây là một phương pháp chẩn đoán thường qui phòng thí nghiệm. Dựa vào kỹ thuật của Namioka và Murata (1961). Trộn đều 0,02 ml huyết thanh với 0,02 kháng nguyên nhuộm tím crystal đa hóa trị. Từng mảng ngưng kết sẽ xuất hiện trong vòng 2 phút, sau đó đọc kết quả. Các thành phần dùng trong phản ứng cần được để ở nhiệt độ 40C và trước khi sử dụng cần đưa trở lại nhiệt độ phòng. Phản ứng này nên tránh tạp nhiễm và có ý nghĩa hơn nếu ly tâm mẫu huyết thanh rồi đưa đi bảo quản và sử dụng dần trong thời gian nghiên cứu. Nếu nghi là phản ứng dương tính giả, chúng ta có thể làm phản ứng lại với huyết thanh nghi đã được diệt bổ thể ở nhiệt độ 560C/30 phút. 2.1.11.2 Phản ứng toàn huyết Phản ứng này cung cấp cho chúng ta một kết quả nhanh đối với bệnh thương hàn gà và phản ứng này thường được dùng nhiều ở các trang trại. Độ nhạy của phản ứng là không cao thường cho kết quả âm tính giả, dương tính giả. 2.1.11.3 Phản ứng ELISA để chẩn đoán Salmonella enteritidis Có 2 hệ thống cơ bản được dùng chủ yếu để phát hiện IgG (IgY) đặc biệt dùng với S.enteritidis đó là: ELISA gián tiếp và ELISA “dạng bánh sandwich” cạnh tranh. ELISA gián tiếp liên quan đến việc sử dụng một kháng nguyên nhận dạng phủ trên các giếng của đĩa 1 microlitre. Sau khi bổ sung chất tạo khối nhằm làm giảm các kết nối không đặc hiệu thì đưa các mẫu vào giếng. Đặc biệt, các kháng thể gắn ở trong mẫu được nhận biết bởi liên kết kháng thể/enzim. Chúng ta có thể sử dụng rất nhiều kháng nguyên như LPS, lông, SEF 14 fimbriae, các protein màng ngoài và các kháng nguyên tế bào thô hơn. ELISA cạnh tranh dạng sandwich dùng một chất đặc biệt đó là một kháng thể đơn dòng (MAb) hoặc một kháng thể đa dòng để làm kháng nguyên phủ trong các giếng. Sau đó cho kháng nguyên thô vào. Mẫu được cho vào sau đó nhờ kháng thể liên kết, kháng thể này không gắn kết với kháng nguyên nếu mẫu không chứa những kháng thể đặc hiệu. Thời gian làm phản ứng sẽ ngắn hơn khi ta bổ sung đồng thời mẫu và kháng thể liên kết cùng lúc. Kháng thể đơn dòng được dùng cho LPS, lông còn SEF 14 dùng cho S.enteritidis. Đối với cả 2 hệ thống này đều có ưu điểm và nhược điểm. ELISA gián tiếp đơn giản hơn và hóa chất có thể dùng cho tất cả các serotypp của gà, gà tây, vịt và động vật có vú. ELISA cạnh tranh thì có thể áp dụng với tất cả các loài động vật và nhìn chung là có độ đặc hiệu cao hơn ELISA gián tiếp. Tuy nhiên, hóa chất thì không rẻ đối với tất cả các serotyp. Ngoài ra cũng có những vấn đề đó là sự giống nhau về cấu trúc và nó là nguyên nhân làm giảm độ nhạy hơn so với ELISA gián tiếp. Trên thực tế, cả 2 hệ thống này đều có tạo ra phản ứng dương tính giả. Cả hai loại ELISA này đều sử dụng được với huyết thanh, lòng đỏ trứng, hoặc máu khô lấy lại từ các đĩa lọc. Ở Đan Mạch, sử dụng nhiều phản ứng ELISA hỗn hợp (meat-juice ELISA) để phát hiện Salmonella nhiễm trên lợn. ELISA này chứa kháng nguyên LPS ‘O’ 1, 4, 5, 6, 7 và 12 từ S.typhimurium và S.choleraesuis. Về mặt huyết thanh học thì những kháng nguyên này làm tăng khả năng phát hiện lên 95% đối với các nhóm huyết thanh salmonella trong đàn lợn ở Đan Mạch. Huyết thanh được dùng để theo dõi những đàn gà hậu bị và gà đẻ trứng. Trong khi đó, lợn trong các lò mổ thì thường dùng nước mô (meat juice) lấy ra khi 10g mô cơ đóng băng được làm tan chảy. Sự khác nhau giữa các ELISA có thể do việc nhiễm các serotyp của Salmonella từ các nhóm huyết thanh khác nhau...Đôi khi chúng ta còn thấy phản ứng chéo xảy ra giữa nhóm B và D và các serotyp khác. Tuy nhiên, thường thì phản ứng kháng thể mạnh hơn khi LPS từ những serotyp tương đồng với nhau được sử dụng trong phản ứng ELISA. 2.1.11.4 Phương pháp PCR (Polymeraza Chain Reaction) Phương pháp PCR làm tăng một số lượng rất nhỏ AND có trong bệnh phẩm tới mức phát hiện được và cho phép phát hiện chính xác một trình tự gen nào đó. Phương pháp này cũng đang được nghiên cứu dùng để chẩn đoán bệnh do Salmonella gây ra. 2.2. Bệnh do Salmonella và biện pháp phòng trị bệnh 2.2.1 Bệnh do salmonella Bệnh do Salmonella gây ra (Salmonellosis) là bệnh truyền lây giữa người và động vật do 2 loài Salmonella (Salmonella enteritica và S. bongori). Đây là vi khuẩn đường ruột, nhưng chúng ta có thể tìm thấy ở môi trường bên ngoài như từ chất thải chuồng nuôi, các dụng cụ chăn nuôi,…. thường thấy nhiều nhất ở các khu chăn nuôi tập trung. Tất cả các loài vật nuôi ở mọi lứa tuổi đều có thể nhiễm bệnh, trong đó gia súc non, gia súc có thai là mẫn cảm nhất. Bệnh có các triệu chứng lâm sàng đặc trưng như ỉa chảy có lẫn máu kèm theo là sốt. Tuy nhiên, có hàng loạt các dấu hiệu lâm sàng khác như: viêm khớp, hoại tử, sảy thai… Có những động vật như gà và lợn khi mắc bệnh lại không có biểu hiện lâm sàng nào (Tổ chức Y tế thế giới, WrayC và Wray A 2000) [45]. Vì vậy, đây được coi là nhân tố làm phát tán mầm bệnh trong gia súc, gia cầm và gây ngộ độc thực phẩm ở người. Qua điều tra cho thấy: bệnh do Salmonella gây ra có ở hầu khắp các quốc gia trên thế giới. Bò sữa ở Newziland nhiễm 13%-15%, ở bò vỗ béo là 4%.ở Hà lan, 25% lợn khoẻ nhiễm Salmonella; ở Mỹ là 10-13%. Theo những nghiên cứu thực tế của Mỹ thì ở trong các trang trại chăn nuôi trâu bò sự có mặt là 16%. Ở Việt nam, theo điều tra của Nguyễn Quang Tuyên 1994[13] trên đàn trâu bò, Salmonella là nguyên nhân chủ yếu gây tiêu chảy ở bê nghé Bắc Thái với tỷ lệ nhiễm là 33,3% có 4,76% bê khoẻ mang Salmonella, tỷ lệ bê mắc tiêu chảy và chết do salmonella là 60%, ở lợn là 60% (Cù Hữu Phú, Vũ Bình Minh, 1999) [6]. Về phân lập và xác định serotyp theo Lê Văn Tạo và Nguyễn Thị Vui (1994) [11] từ 50 mẫu bệnh phẩm ở lợn đã phân lập được 16 chủng Salmonella trong đó có 8 chủng Salmonella cholerea suis, 2 chủng S. enteriditis, 1 chủng S.typhimurium. Theo Trần Xuân Hạnh có 6 serotyp có tỷ lệ nhiễm cao nhất S.cholerae suis với 35,9% thấp nhất là S.newport 7,69%[5] 2.2.2. Phòng và trị bệnh 2.2.2.1. Phòng bệnh và khống chế bệnh * Vệ sinh và quản lý Vấn đề quan trọng là loại trừ các điều kiện có lợi cho mầm bệnh phát triển và tiếp xúc với lợn bệnh và lợn mang trùng là nguồn lây lan bệnh nên các biện pháp vệ sinh phòng dịch như cách ly, xử lý những đàn lợn mắc bệnh rất quan trọng. Xây dựng chuồng trại đảm bảo vệ sinh và thuận tiện. Cụ thể: - Thực hiện chặt chẽ quy trình vệ sinh chuồng trại, định kì tiêu độc khử trùng… - Loại trừ các yếu tố làm giảm sức đề kháng của lợn như thời tiết khí hậu, vận chuyển - Đảm bảo đúng mật độ nuôi ở từng lứa tuổi và giai đoạn sinh lí của vật nuôi. - Tránh thay đổi thức ăn đột ngột, phải lựa chọn thức ăn đảm bảo dinh dưỡng. Do nhiều yếu tố tác động nên những con bệnh tiềm ẩn phát bệnh và trở thành nguồn lây lan cho đàn như nhốt qúa trật trội, stress do vận chuyển, loại thức ăn có nhiều Salmonella (bột thịt) cho nên thường xuyên quan tâm vấn đề này. * Tiêm phòng vacxin Tuân thủ quy trình tiêm vacxin phòng bệnh Phó thương hàn cho đàn lợn. Hiện nay trên thị trường có các loại vacxin phòng bệnh phó thương hàn như: vacxin phó thương hàn nhược độc đông khô, vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt keo phèn do Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương sản xuất… Ngoài ra cũng cần tăng cường khâu chăm sóc nuôi dưỡng nhằm tăng cường sức đề kháng cho đàn lợn. 2.2.2.2. Trị bệnh Có thể dùng một trong các loại kháng sinh đặc trị sau: Vime Sone: 1ml/5-10kg thể trọng, tiêm bắp, 1lần/ngày, liên tục 5–7 ngày. Vimetryl 100: 1ml/7-15kg thể trọng, tiêm bắp, 1lần/ngày, liên tục 5–7 ngày. Vimefloro F.D.P: 1ml/5-10kg thể trọng, tiêm bắp, 1lần/ngày, liên tục 5–7 ngày. Có thể kết hợp thêm Septryl 240 khi sử dụng 1 trong 3 loại trên với liều 1ml/15-20kg thể trọng. Urotropin 1ml/5-10kg, ngày 1–2 lần . Canlamin 1ml/5kg thể trọng, ngày 1 lần hoặc B.Complex fortified 1ml/10kg thể trọng, 1lần/tuần. Bổ sung men tiêu hóa, lợn sẽ mau hồi phục sau bệnh. 2.3. Bệnh Phó thương hàn lợn Là bệnh truyền nhiễm xảy ra chủ yếu ở lợn 2- 4 tháng tuổi. Bệnh do trực khuẩn Salmonella cholereasuis chủng Kunsendorf (thể cấp tính) và Salmonella typhi suis chủng Vondagsen (thể mạn tính). Đây là vi khuẩn đường ruột tác động chủ yếu trên đường tiêu hoá gây ra các triệu chứng và bệnh tích như viêm ruột, dạ dày, lách sưng to và dai. Bệnh xảy ra ở khắp nơi, tạo thành những ổ dịch lẻ tẻ, thường gặp ở những vùng chăn nuôi có điều kiện vệ sinh kém đặc biệt là vùng sản xuất lợn giống. Ở nước ta chứng viêm ruột tiêu chảy do Salmonella rất dễ xảy ra trên lợn, bệnh lưu hành ở tất cả các tỉnh trong cả nước và gây thiệt hại lớn cho ngành chăn nuôi. Theo Nguyễn Thị Nội và cộng sự 1989[7] khi điều tra tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột ở một số trại chăn nuôi cho thấy: 82-100% số lợn nhiễm vi khuẩn Salmonella và trên lợn khoẻ cũng mang vi khuẩn này với một tỷ lệ nhất định. Theo Vũ Bình Minh và Cù Hữu Phú, 1999 [6], phân lập vi khuẩn từ phân lợn tiêu chảy thông báo: tỷ lệ xuất hiện vi khuẩn Salmonella trung bình là 80%, biến động trong khoảng 73%-85%. Theo Phùng Quốc Chướng, 1995 [1], điều tra tình hình nhiễm Salmonella của lợn vùng Tây Nguyên cho thấy: bình thường, lợn 2-4 tháng tuổi nhiễm 32,66%; lợn 4-8 tháng tuổi nhiễm 14,70% và lợn nái nhiễm 18,35%, ở lợn bị tiêu chảy vi khuẩn Salmonella trong cơ thể tăng rõ rệt ở ruột 80%, lách 20%. Tình trạng nhiễm Salmonella thay đổi theo sự tiến triển của bệnh: tiêu chảy 1-3 ngày nhiễm 60%, 8-12 ngày nhiễm 100%. Trong trường hợp lợn con mắc bệnh phân trắng, tỷ lệ nhiễm Salmonella có thể lên tới 25%. Tác giả nhận xét : vi khuẩn Salmonella có thể tìm thấy ở mọi lứa tuổi lợn, xong chủ yếu là lợn 2-4 tháng tuổi. Trong cơ thể lợn, vi khuẩn có nhiều nhất ở cơ quan tiêu hóa và đường bài xuất chính ra bên ngoài là đường tiêu hóa. Cũng chính từ đó, Salmonella lại nhiễm vào thức ăn, nước uống để trở lại đường tiêu hóa. 2.3.1 Cơ chế sinh bệnh Thời kì nung bệnh từ 3-6 ngày, có khi kéo dài đến tuần lễ hay một tháng tuỳ thuộc vào số lượng vi khuẩn xâm nhập vào, độc lực của vi khuẩn và sức đề kháng của cơ thể. S.cholerae suis vào cơ thể theo đường tiêu hoá vào hầu, ruột. Vi khuẩn sinh sản và chui qua niêm mạc dạ dày gây thuỷ thủng hoại tử cục bộ xuất huyết gây viêm ruột, viêm dạ dày sau đó vi khuẩn xâm nhập vào các tổ chức lâm ba gây phản ứng hạch viêm, sưng hạch và từ đó vào máu gây bại huyết. Ở những con vật qua khỏi bệnh vi khuẩn có khuynh hướng khu trú ở một số phủ tạng như gan đặc biệt ở hạch lâm ba. Nội độc tố đóng vai trò rất lớn trong quá trình gây bệnh. Nội độc tố ảnh hưởng đến plasma, khả năng đông máu, phản ứng viêm xảy ra đầu tiên, kích thích tiểu cầu và tấn công bạch cầu, sốt và trúng độc máu cũng ảnh hưởng trực tiếp do nội độc tố. 2.3.2 Cách lây lan Bệnh phó thương hàn lợn là bệnh ở đường tiêu hóa nên đường lây truyền chủ yếu của bệnh là qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn. Khi lợn ăn phải thức ăn, nước uống có vi khuẩn thì sẽ nhiễm khuẩn và có khả năng phát bệnh. Bệnh này chủ yếu gặp ở lợn con từ 2-4 tháng tuổi. Đặc biệt bệnh có thể lây nhiễm sang người và các động vật nuôi khác như gia cầm, cừu,… 2.3.3 Triệu chứng * Thể cấp tính Khi lợn mắc bệnh thể cấp tính thì có triệu chứng như sốt cao từ 40–410C, chót tai lạnh, kém ăn, táo bón phân lọn, có màu đen, màng nhày bao quanh phân. Lợn con có thể có triệu chứng tiêu chảy phân có màu vàng, sệt lẫn máu và rất hôi thối. Con vật thường nằm co trên 4 chân, bụng nổi gai ốc, lông dựng. Con vật cũng có các triệu chứng khác như thở khó và nhanh, tim đập yếu. Trên da xuất huyết thành từng nốt đỏ ửng rồi chuyển sang tím xanh ở tai, bụng, mặt trong đùi. Tốc độ lây lan trong chuồng chậm, tốc độ gây chết chậm, nhưng bệnh làm heo mất sức suy kiệt, còi cọc. Sau 1-2 tuần con vật suy kiệt dần, tiêu chảy nặng và có thể chết. Lợn nái mang thai mắc bệnh có thể bị sẩy thai. * Thể mãn tính Lúc đầu con vật không có triệu chứng điển hình, con vật biếng ăn, gầy yếu, xanh xao, tới bữa chỉ liếm láp chứ không ăn, uống nước nhiều và trên da có những mảng đỏ hoặc tím bầm. Lợn bị táo bón, đi phân thường phải rặn nhiều, thể mãn tính thường xảy ra ở lợn lớn. Lợn nái mang thai bị bệnh có thể sẩy thai, hoặc nếu sinh ra lợn con cũng gầy yếu. Hình 2.5 Lợn mắc bệnh Phó thương hàn 2.3.4 Bệnh tích Khi mổ khám kiểm tra bệnh tích của lợn mắc bệnh phó thương hàn, chúng ta thường thấy các biểu hiện bệnh tích đặc trưng ở đường tiêu hóa như: niêm mạc ruột già hoại tử, bong từng mảng, van hồi manh tràng có các vết loét, có bờ và có hình cúc áo. Hình 2.6 Các tổn thương ở ruột già của lợn mắc bệnh Phó thương hàn 2.3.5 Chẩn đoán bệnh * Dựa vào bệnh tích đặc trưng Dựa vào các bệnh tích như: lợn bị ỉa chảy kéo dài, gầy yếu và bị suy nhược dần, niêm mạc ruột già hoại tử, có các vết loét hình cúc áo ở van hồi manh tràng. * Chẩn đoán vi khuẩn học Lấy máu hoặc phủ tạng của lợn nghi mắc bệnh phó thương hàn lợn làm tiêu bản, nhuộm Gram để xem hình thái vi khuẩn. Lấy mẫu bệnh phẩm và nuôi cấy trên các môi trường đặc biệt để phâm biệt Salmonella và E.coli. Sau đó nuôi cấy trên môi trường phân lập và giám định bằng các phản ứng sinh hóa. Tiêm động vật: dùng chuột bạch, sau 7-10 ngày khi con vật chết tiến hành mổ khám kiểm tra bệnh tích. * Chẩn đoán huyết thanh học Các phản ứng thường được dùng để kiểm tra Salmonella là: Phản ứng ngưng kết trong ống nghiệm TA (Tubo Agglutination test). Phản ứng toàn huyết (Whole Blood test). Phản ứng ngưng kết huyết thanh nhanh (Rapid Serum test). Phản ứng vi ngưng kết (Micro Agglutination test). * Ngoài ra cũng có thể làm các phản ứng khác như PCR, ELISA,…để tìm ra vi khuẩn gây bệnh. 2.4. Một số hiểu biết đại cương về vacxin 2.4.1. Định nghĩa Vacxin là một chế phẩm sinh học trong đó chứa chính mầm bệnh hoặc kháng nguyên của mầm bệnh gây ra một bệnh truyền nhiễm nào đó cần phòng (nếu là mầm bệnh thì phải được giết hoặc làm nhược độc bởi các yếu tố vật lý, hóa học và sinh vật học). Khi sử dụng cho động vật, vacxin tạo ra một đáp ứng miễn dịch chủ động giúp động vật chống lại được sự xâm nhiễm của mầm bệnh tương ứng 2.4.2. Đặc tính cơ bản của một vacxin Một vacxin phải đảm bảo 4 đặc tính cơ bản: -Tính sinh miễn dịch: đó là khả năng gây ra đáp ứng miễn dịch dịch thể hay tế bào hoặc cả hai.Nó phụ thuộc vào tính lạ của kháng nguyên hoặc đường đưa kháng nguyên và cơ địa của mỗi cá thể động vật. -Tính kháng nguyên hay tính sinh kháng thể: một vacxin khi đưa vào cơ thể phải có khả năng kích thích cơ thể sinh ra kháng thể. -Tính hiệu lực: nói lên khả năng bảo hộ động vật sau khi tiêm vacxin -Tính an toàn: sau khi sản xuất vacxin cần được kiểm tra chặt chẽ bởi cơ quan kiểm định nhà nước vể mặt vô trùng, vô độc, thuần khiết 2.4.3. Các loại vacxin * Vacxin chết hay bất hoạt: là vi sinh vật độc hại được giết bằng hoá chất hoặc nhiệt, có tính ổn dịnh an toàn nhưng hiệu lực kém, thời gian miễn dịch ngắn. * Vacxin nhược độc: là các vi sinh vật được nuôi cấy ở điều kiện đặc biệt nhằm làm giảm độc lực của chúng. vacxin này tạo thời gian miễn dịch dài ổn định nhưng cần thận trọng khi bảo quản và sử dụng * Vacxin thế hệ mới: vacxin tái tổ hợp, DNA…. 2.4.4. Nguyên lý Vacxin tạo ra trong cơ thể sống một đáp ứng miễn dịch. Hệ thống miễn dịch của cơ thể hoạt động, sinh ra kháng thể dịch thể đặc hiệu hoặc kháng thể tế bào chống lại những nhóm quyết định kháng nguyên của yếu tố gây bệnh, cơ thể sử dụng vacxin xuất hiện trạng thái miễn dịch thu được chủ động nhân tạo có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của yếu tố gây bệnh tương ứng. 2.4.5. Một số điều cần chú ý khi sử dụng vacxin Để có được hiệu quả như mong muốn sau khi tiêm phòng vacxin thì việc sử dụng vacxin đúng nguyên tắc luôn là điều kiện tiên quyết. Sử dụng vacxin sai nguyên tắc không những không mang lại được hiệu quả phòng bệnh mà còn dẫn đến nhiều nguy cơ khác như làm giảm khả năng đề kháng của vật nuôi, thậm chí gây ra những tai biến đáng tiếc. Vì vậy trong quá trình sử dụng vacxin cần tuân thủ các nguyên tắc sau đây: *Tiêm phòng vacxin trên phạm vi hợp lý, đạt tỷ lệ cao Việc xác định chính xác và hợp lý phạm vi tiêm phòng của vacxin là vô cùng quan trọng và cần thiết, nó đảm bảo tính tiết kiệm trong sử dụng vacxin, đồng thời lại đáp ứng được yêu cầu phòng bệnh. Để làm được điều này thì công tác điều tra về dịch tễ học cần được chú trọng. Thông qua các thông tin về dịch tễ học và bản đồ dịch tễ học các nhà hoạch định kế hoạch tiêm phòng có thể xác định một cách chính xác các typ vi khuẩn, virus đã từng gây bệnh trong khu vực định tiêm là gì, phạm vi dịch xảy ra ở mức độ rộng hay hẹp, lần cuối cùng dịch xảy ra tại địa phương đó là khi nào... từ đó đưa ra kế hoạch nhập chủng loại và số lượng vacxin hợp lý phục vụ cho công tác tiêm phòng tại địa phương. Cần phải tiêm phòng các ổ dịch cũ, những vùng hàng năm có dịch đe dọa, những vùng hai bên đường giao thông trọng yếu, quanh các chợ, xí nghiệp chế biến thú sản, vùng biên giới … Khi có dịch xảy ra phải tiêm chống dịch trong ổ dịch và các vùng xung quanh (vùng bị dịch uy hiếp). Đối với những con nghi lây trong ổ dịch ngoài việc nhanh chóng cách ly để theo dõi có thể tiêm huyết thanh cùng một lúc với vacxin để tạo miễn dịch nhanh chóng nhưng phải tiêm ở hai nơi khác nhau và chỉ ứng dụng với vacxin chết. Đối với gia súc khác loài nhưng có thụ cảm với cùng bệnh thì cũng cần được tiêm vacxin. Để đáp ứng được yêu cầu phòng bệnh thì tiêm phòng cần đạt tỷ lệ càng cao càng tốt, nói chung phải đạt tỷ lệ 80% các vụng bị uy hiếp phải đạt tỷ lệ 90-95%. *Tiêm phòng vacxin đúng đối tượng Vacxin là thuốc phòng bệnh cho động vật khỏe, chưa mắc bệnh. Nếu trong cơ thể động vật đã mang sẵn mầm bệnh nhưng chưa phát ra thì sau khi được tiêm kháng nguyên cùng loại với mầm bệnh có trong cơ thể thì bệnh phát ra sớm hơn, nặng hơn. Trường hợp ngoại lệ có thể dùng vacxin mà động vật đã nhiễm mầm bệnh. Ví dụ: sử dụng vacxin chống bệnh dại cho người đã bị chó dại cắn, trường hợp này vacxin đã tạo ra kháng thể chống virus dại trước khi virus dại lên não và tiêu diệt vius dại. Ở bệnh dịch tả lợn việc tiêm thẳng vacxin vào ổ dịch sẽ có tác dụng loại trừ nhanh con mắc bệnh nặng, còn những con mắc bệnh nhẹ hoặc chưa mắc bệnh sẽ tạo được miễn dịch. Bình thường không dùng vacxin cho động vật quá non và thận trọng với động vật có thai. Ở động vật non, các cơ quan đảm nhận chức năng miễn dịch bảo vệ cơ thể chưa hoàn chỉnh nên đáp ứng miễn dịch với vacxin còn yếu, không những thế động vật non còn có một lượng kháng thể thụ động do mẹ truyền cho, những kháng thể đó có thể ngăn cản vacxin phát huy tác dụng. Nếu không có dịch đe dọa thì chỉ nên dùng vacxin cho súc vật từ 2-7 tuần tuổi, dùng vacxin càng muộn càng tốt. Khi có dịch đe dọa buộc phải tiêm phòng sớm cho động vật non nhưng sau đó cần tiêm bổ sung. Ở động vật mang thai, trạng thái sinh lý có nhiều thay đổi nên dùng vacxin dễ gây ra những phản ứng mạnh và làm sảy thai. Một lý do nữa khiến chúng ta không nên sử dụng vacxin trong thời kỳ gia súc cái mang thai là bào thai sẽ nhầm lẫn kháng nguyên đưa vào là thành phần của bản thân nó do đó khi sinh ra nó sẽ không sinh được miễn dịch ngay cả khi tiêm phòng bằng loại vacxin đó (hiện tượng dung nạp miễn dịch). Đặc biệt không sử dụng vacxin uống cho súc vật mang thai nhất là vacxin nhược độc. *Tiêm phòng đúng thời gian, đúng quy cách, đạt tỷ lệ cao *Tiêm đúng thời gian Phần lớn các bệnh truyền nhiễm thường xảy ra hoặc phát triển rầm rộ vào một thời gian nhất định trong năm như bệnh tụ huyết trùng vật nuôi thường xảy ra vào mùa mưa.Vì vậy để phòng một bệnh truyền nhiễm nào đó cần tiêm phòng vacxin trước mùa bệnh xảy ra một khoảng thời gian đủ cho cơ thể tạo được miễn dịch phòng vệ chắc chắn (thường là 2-3 tuần). Vì vậy mùa tiêm phòng của nước ta thường là tháng 3, tháng 4 và tháng 9, tháng 10 hàng năm. Sau khi tiêm phòng vacxin, cơ thể chỉ được bảo hộ đối với bệnh đã tiêm phòng trong khoảng thời gian nhất định, khoảng thời gian đó phụ thuộc vào từng loại vacxin (thường từ 3-12 tháng). Hết thời gian đó cơ thể lại cảm nhiễm với mầm bệnh vì vậy cần tiêm nhắc lại kịp thời để tạo khả năng bảo hộ liên tục. *Tiêm đúng liều và đúng đường Tiêm đúng liều: phải tiêm đủ liều vacxin cho động vật theo khuyến cáo của nhà sản xuất ghi trên nhãn mác hoặc trong bản hướng dẫn kèm theo vacxin. Nếu tiêm quá liều sẽ tạo ức chế đáp ứng miễn dịch đối với cơ thể, hiệu giá kháng thể đặc hiệu tạo ra sẽ thấp, hoạt động của miễn dịch tế bào sẽ hạn chế, lãng phí vacxin, chi phí tiêm phòng tăng. Ngược lại nếu tiêm liều thấp hơn liều quy định, sẽ không đủ lượng kháng nguyên kích thích cơ thể đáp ứng miễn dịch, hiệu giá kháng thể đặc hiệu và hoạt động miễn dịch của tế bào đều thấp, không tạo được khả năng phòng vệ cho cơ thể. Đưa vacxin đúng đường quy định: đường xâm nhập thích hợp của từng loại mầm bệnh vào cơ thể để gây bệnh lại rất khác nhau do đó đối với mỗi loại vacxin sẽ có một đường đưa vào nhất định. Các đường đưa vacxin phổ biến hiện nay là tiêm bắp, tiêm dưới da, nhỏ mắt, mũi, khí dung... Khả năng đáp ứng miễn dịch của các cơ quan có thẩm quyền miễn dịch trong hệ thống miễn dịch của cơ thể đối với vacxin đưa vào cơ thể bằng các đường khác nhau cũng khác nhau. Vì vậy trong quá trình nghiên cứu chế tạo vacxin các nhà nghiên cứu đã chú ý lựa chọn đường đưa tối ưu vào cơ thể cho từng loại vacxin. Do đó khi sử dụng vacxin tiêm phòng cho động vật nên đưa theo đường khuyến cáo của nhà sản xuất. Đường thường tiêm vacxin là tiêm dưới da, nhất là vacxin có chất bổ trợ và tiêm với liều lượng lớn (vacxin keo phèn, vacxin tụ huyết trùng, vacxin đóng dấu lợn). Có loại phải tiêm đúng dưới da để tránh phản ứng (vacxin nhược độc nhiệt thán, nhược độc dịch tả trâu bò, dịch tả lợn qua thỏ…) nếu tiêm liều lượng nhỏ thì có thể tiêm bắp thịt. Một số vacxin có thể sử dụng cho uống, nhỏ mắt, nhỏ mũi… *Kỹ thuật sử dụng vacxin Khả năng tạo miễn dịch của vacxin phụ thuộc rất nhiều vào việc sử dụng vacxin có đúng kĩ thuật hay không. Kỹ thuật sử dụng vacxin bao gồm kỹ thuật bảo quản vacxin và đường đưa vacxin. Điều kiện bảo quản vacxin phải đảm bảo, vacxin phải để nơi râm mát tránh ánh sáng trực tiếp. Nhiệt độ thích hợp cho việc bảo quản vacxin là 2 - 40C. Đặc biệt vacxin nhược độc chế từ virus phải được bảo quản ở -150C. Trước khi sử dụng phải kiểm tra thật kỹ, nếu thấy vacxin chuyển màu quá hạn sử dụng phải huỷ bỏ. Vacxin phải đạt mức độ bảo hộ lớn hơn hoặc bằng 70%. Nơi tiêm phải sát trùng, dụng cụ tiêm phải tiêu độc, liều lượng tiêm phải đảm bảo. Khi dùng vacxin nhược độc nhất là loại có nha bào thì không làm vương vãi vacxin. Súc vật được tiêm là những con khoẻ mạnh, không tiêm vacxin cho những con đang nung bệnh, những con quá gầy yếu, quá non, con mới đẻ, những con mới phẫu thuật chưa lành, những con có nhiều ký sinh trùng, sau khi tiêm cần nuôi dưỡng, chăm sóc tốt. *Phối hợp các loại vacxin Trước kia người ta sử dụng vacxin nhược độc chế từ vi sinh vật sống đã làm mất hoạt lực, vacxin nhược độc được chế từ vi sinh vật bị làm chết đi bằng các tác nhân lý hóa (nhiệt độ, hóa chất…). Mỗi loại vacxin chỉ mang một mầm bệnh và do đó nó chỉ có tác dụng phòng một bệnh duy nhất, đó chính là vacxin đơn giá. Ngày nay, việc phối hợp nhiều loại kháng nguyên trong cùng một chế phẩm vacxin để phòng bệnh cho vật nuôi và cả cho người ngày càng được nghiên cứu và sử dụng một cách rộng rãi. Trong cùng một chế phẩm vacxin có thể chứa tới hai loại kháng nguyên (vacxin nhị giá) ví dụ vacxin tụ dấu 3/2 phòng đồng thời hai bệnh đỏ là tụ huyết trùng lợn và đóng dấu lợn, thậm chí ba hay nhiều loại kháng nguyên khác nhau (vacxin tứ liên dịch tả lợn, phó thương hàn, tụ huyết trùng, đóng dấu lợn) và chúng được gọi bằng tên chung là vacxin đa giá. * Yêu cầu của một vacxin Để đáp ứng được yêu cầu phòng bệnh, một loại vacxin phải đáp ứng được những yêu cầu tối thiểu sau đây: - Vacxin phải chứa các kháng nguyên và các kháng nguyên đó phải được hệ thống miễn dịch coi là mục tiêu cần tấn công. - Các kháng nguyên trong vacxin phải kích thích sinh đáp ứng miễn dịch phòng hộ, nghĩa là kháng nguyên không kích thích sinh các đáp ứng miễn dịch không phòng hộ. Sự phòng hộ phải đạt được khi cơ thể tiếp xúc với mầm bệnh và lý tưởng nhất sự phòng hộ này phải kéo dài. - Vacxin phải kích thích đáp ứng miễn dịch mạnh và tốt nhất là không cần chất bổ trợ. - Vacxin kích thích sinh đáp ứng miễn dịch tốt mà không cần dùng nhắc lại (bổ sung) và tốt nhất là đường dùng vacxin đơn giản. - Vacxin phải an toàn: an toàn là tiêu chuẩn đánh giá khi sử dụng vacxin trên chính đối tượng được hưởng. Tức là vacxin không gây nên bệnh, các phản ứng có hại, hoặc gây chết ở con vật được dùng vacxin. - Vacxin phải vô trùng tức là vacxin chỉ chứa duy nhất một hay một vài loại kháng nguyên được dùng làm vacxin mà không bị nhiễm tạp các loại khác. - Về mặt thực hành: giá một liều vacxin phải thấp, ổn định về mặt sinh học, dễ sử dụng, ít tác dụng phụ. 3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Nội dung 3.1.1 Sản xuất thử nghiệm 5 lô vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt bằng công nghệ lên men sục khí. Kiểm nghiệm vacxin phó thương hàn lợn. Xác định độ dài miễn dịch. Đánh giá qui trình bảo quản vacxin. Ứng dụng vacxin trên diện rộng. 3.2 Đối tượng nghiên cứu Vacxin Phó thương hàn lợn vô hoạt 3.3 Địa điểm nghiên cứu Đề tài được thực hiện tại Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương: Sản xuất._.ợp 15 15 100 25 22 Theo kết quả bảng trên cho thấy có 22/25 con chuột ở lô tiêm vacxin còn sống (chiếm 72% tổng số chuột được tiêm), trong đó có 3 lô vacxin 1,2,4 là vẫn có miễn dịch ở mức 80% và 2 lô vacxin 3, 5 là ở mức 60% chứng tỏ ở thời điểm này độ miễn dịch của động vật đối với bệnh bắt đầu giảm (tỷ lệ bảo hộ của vacxin giảm). Từ kết quả trên chúng tôi khuyến nghị với người chăn nuôi nên tiêm nhắc lại cho lợn sau 6 tháng 0 20 40 60 80 100 120 21 ngày 90 ngày 135 ngày 180 ngày Thời gian Tỷ lệ bảo hộ (%) Lô 1 Lô 2 Lô 3 Lô 4 Lô 5 Hình 4.2: Đường biểu diễn độ dài miễn dịch của 5 lô vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt 4.4. Xác định thời gian bảo quản của vacxin Bất kì một sản phẩm nào đó muốn đảm bảo chất lượng cũng cần phải có điều kiện bảo quản nghiêm ngặt. Nếu không đảm bảo về điều kiện bảo quản có thể ảnh hưởng đến chất lượng vacxin cụ thể là hiệu lực vacxin, có thể làm giảm hiệu lực hoặc mất hiệu lực vacxin. Đối với vacxin cần bảo quản ở nhiệt độ 2-80C. Kết quả của chỉ tiêu này cho thấy thời hạn sử dụng của vacxin đó có nghĩa là thời hạn sử dụng vacxin đó khi tiêm cho động vật vẫn còn khả năng kích thích cơ thể sản sinh miễn dịch cho động vật chống lại bệnh do vi khuẩn đó gây ra. Đây cũng là cơ sở để đánh giá chất lượng giống vi khuẩn khi đưa vào sản xuất để chế tạo vacxin. Tại Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương, chúng tôi tiến hành các đề tài nghiên cứu thường xuyên tại đơn vị. Trong đó chúng tôi có tiến hành đánh giá các chỉ tiêu của vacxin phó thương hàn lợn sau khi sản xuất ở thởi điểm 6, 9, 12 tháng và 18 tháng (thời điểm hết hạn vacxin) trong điều kiện bảo quản vacxin tại kho của Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương (t0 2 – 80C) Mẫu được sử dụng là vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt (mẫu lưu các lô Sal 3, Sal4 và Sal5 sản xuất tháng…năm 2007) Tiến hành lấy mẫu kiểm tra (chọn ngẫu nhiên trong kho sản phẩm). Sau khi lấy mẫu tiến hành kiểm tra các chỉ tiêu: vô trùng, an toàn và hiệu lực. Phương pháp kiểm tra các chỉ tiêu trên là phương pháp thường quy sử dụng theo TCN. Kết quả thu được như sau: 4.4.1 Kết quả kiểm tra vô trùng của 3 lô vacxin PTH lợn vô hoạt sau các thời điểm 6,9,12,18 tháng Bảng 4.17: Kết quả kiểm tra vô trùng vacxin sau các thời điểm 6, 9, 12, 18 tháng Thời Gian Số mẫu kiểm tra Lô vacxin Môi trường Sal 3 (2007) Sal 4 (2007) Sal 5 (2007) Ghi chú 6 tháng 5 Thạch máu - - - Đạt vô trùng Thạch thường - - - Nước thịt ống - - - Yếm khí - - - Lọ nước thịt 50ml - - - Thạch nấm - - - 9 tháng 5 Thạch máu - - - Đạt vô trùng Thạch thường - - - Nước thịt ống - - - Yếm khí - - - Lọ nước thịt 50ml - - - Thạch nấm - - 12 tháng 5 Thạch máu - - - Đạt vô trùng Thạch thường - - - Nước thịt ống - - - Yếm khí - - - Lọ nước thịt 50ml - - - Thạch nấm - - 18 tháng 5 Thạch máu - - - Đạt vô trùng Thạch thường - - - Nước thịt ống - - - Yếm khí - - - Lọ nước thịt 50ml - - - Thạch nấm - - - Theo kết quả trên cho thấy vi khuẩn đều không mọc trên các môi trường kiểm tra. Như vậy, cả 3 lô vacxin được bảo quản tại kho của Xí nghiệp thuốc thú y Trung ương ở nhiệt độ 2-80C sau các thời gian 6, 9, 12, 18 tháng đều đạt tiêu chuẩn vô trùng. 4.4.2 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin PTH lợn trong thời gian bảo quản 6,9,12,18 tháng Ngoài tiêu chuẩn kĩ thuật là vô trùng chúng tôi còn tiến hành kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin, để kiểm tra chỉ tiêu an toàn chúng tôi sử dụng liều 1MLD (250.000.000 VK) và thu được kết quả như sau: Bảng 4.18 Kết quả kiểm tra chỉ tiêu an toàn của vacxin PTH lợn trong thời gian bảo quản Thời gian Lô vacxin Sal 3 (2007) Sal 4 (2007) Sal 5 (2007) 6 tháng Số chuột tiêm 3 3 3 Liều tiêm ml/con) 0,6 0,6 0,6 Vị trí tiêm Dưới da Dưới da Dưới da Tỷ lệ sống % 100 100 100 Đánh giá An toàn An toàn An toàn 9 tháng Số chuột tiêm 3 3 3 Liều tiêm ml/con) 0,6 0,6 0,6 Vị trí tiêm Dưới da Dưới da Dưới da Tỷ lệ sống % 100 100 100 Đánh giá An toàn An toàn An toàn 12 tháng Số chuột tiêm 3 3 3 Liều tiêm ml/con) 0,6 0,6 0,6 Vị trí tiêm Dưới da Dưới da Dưới da Tỷ lệ sống % 100 100 100 Đánh giá An toàn An toàn An toàn 18 tháng Số chuột tiêm 3 3 3 Liều tiêm ml/con) 0,6 0,6 0,6 Vị trí tiêm Dưới da Dưới da Dưới da Tỷ lệ sống % 100 100 100 Đánh giá An toàn An toàn An toàn Nhìn vào bảng trên chúng ta có thể thấy 100% động vật thí nghiệm đều còn sống, không có con nào bị chết, tất cả đều khoẻ mạnh, ăn uống hoạt động bình thường, chỗ tiêm không viêm sưng sau 3 ngày không tìm thấy tác động cơ học chứng tỏ vacxin vẫn đạt chỉ tiêu an toàn. 4.4.3 Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin PTH lợn vô hoạt sau 6 tháng bảo quản Để kết luận xem điều kiện bảo quản vacxin ở nhiệt độ 2-80C có đảm bảo không chúng tôi tiếp tục kiểm tra chỉ tiêu hiệu lực vacxin ở các thời điểm 6, 9, 12, 18 tháng của vacxin. Kết quả như sau: Bảng 4.19: Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin PTH lợn vô hoạt sau 6 tháng bảo quản bằng phương pháp công cường độc trên động vật thí nghiệm Lô vacxin Lô đối chứng Lô thí nghiệm Đánh giá tỷ lệ bảo hộ (%) Số chuột đối chứng(con) Chết/tiêm Số chuột thí nghiệm(con) Sống/tiêm Con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Sal 3 3 3 100 5 5 100 100 Sal 4 3 3 100 5 4 80 80 Sal 5 3 3 100 5 5 100 100 Kết luận: qua bảng trên cho thấy tỷ lệ bảo hộ của cả 2/3 lô vacxin là 100%, 1 lô là 80% chứng tỏ hiệu lực vacxin cao. 4.4.4 Kết quả kiểm tra hiệu lực sau 9 tháng bảo quản Ở thời điểm 9 tháng chúng tôi thu được kết quả: Bảng 4.20: Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin PTH lợn vô hoạt sau 9 tháng bảo quản bằng phương pháp công cường độc trên động vật thí nghiệm Lô vacxin Lô đối chứng Lô thí nghiệm Đánh giá TL bảo hộ (%) Số chuột đối chứng(con) Chết/tiêm Số chuột thí nghiệm(con) Sống/tiêm con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Sal 3 3 3 100 5 5 100 100 Sal 4 3 3 100 5 4 80 80 Sal 5 3 3 100 5 5 100 100 T.hợp 9 9 100 15 14 Tb=93,33 Kết luận: sau 9 tháng bảo quản ở điều kiện 2- 80C hiệu lực vacxin vẫn đạt với tỷ lệ bảo hộ cao 93,33%. 4.4.5 Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin PTH lợn vô hoạt sau 12 tháng bảo quản Sau 12 tháng bảo quản tiến hành kiểm tra hiệu lực chúng tôi có kết quả như sau Bảng 4.21 Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin PTH lợn vô hoạt sau 12 tháng bảo quản bằng phương pháp công cường độc trên động vật thí nghiệm Lô vacxin Lô đối chứng Lô thí nghiệm Đánh giá TL bảo hộ (%) Số chuột đối chứng(con) Chết/tiêm Số chuột thí nghiệm(con) Sống/tiêm con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Sal 3 3 3 100 5 5 100 100 Sal 4 3 3 100 5 4 80 80 Sal 5 3 3 100 5 4 80 80 T.hợp 9 9 100 15 13 Tb= 80,66 Căn cứ kết quả ta thấy: ở thời điểm sau 12 tháng vacxin được bảo quản thì hiệu lực của vacxin vẫn đạt cao 80,66%(2/3 lô có hiệu lực 80%) với hiệu lực này vacxin hoàn toàn đủ tiêu chuẩn và có khả năng bảo hộ cho động vật. 4.4.6 Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin PTH lợn vô hoạt sau 18 tháng bảo quản bằng phương pháp công cường độc trên động vật thí nghiệm Chúng tôi tiến hành kiểm tra hiệu lực vacxin ở thời điểm hết hạn của Vacxin (18 tháng) và có kết quả là: Bảng 4.22 Kết quả kiểm tra hiệu lực vacxin PTH lợn vô hoạt sau 18 tháng bảo quản bằng phương pháp công cường độc trên động vật thí nghiệm Lô vacxin Lô đối chứng Lô thí nghiệm Đánh giá TL bảo hộ (%) Số chuột đối chứng(con) Chết/tiêm Số chuột thí nghiệm(con) Sống/tiêm con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Sal 3 3 3 100 5 4 80 80 Sal 4 3 3 100 5 4 80 80 Sal 5 3 3 100 5 3 60 60 T.hợp 9 9 100 15 11 Tb=73,3 Nhìn vào kết quả bảng trên chúng ta có thể thấy: hiệu lực vacxin của cả 3 lô vacxin đã bắt đầu giảm trong đó có 1/3 lô tỷ lệ bảo hộ chỉ còn 60% và 2/3 lô vacxin có tỷ lệ bảo hộ là 80% nhưng vẫn còn khả năng bảo hộ trung bình là 73,3%. Theo quy định của cục Thú y (quy trình kĩ thuật kiểm nghiệm dùng trong thú y thì 50% số động vật miễn dịch sống sót, động vật đối chiếu chết hết thì lô vacxin đó vẫn đạt chỉ tiêu hiệu lực. Như vậy, các kết quả trên vẫn đạt mức cho phép đảm bảo hiệu lực vacxin. Từ các kết quả trên cho thấy vacxin duy trì được tỷ lệ bảo hộ cho động vật đạt được ít nhất sau 18 tháng bảo quản ở điều kiện nhiệt độ 2-80C. Điều này sẽ giúp cho cơ quan sản xuất định được hạn sử dụng cho vacxin để từ đó đề ra kế hoạch sản xuất đáp ứng cho thị trường và người sử dụng có thể chủ động tiêm phòng để tránh sử dụng những sản phẩm quá hạn sử dụng làm ảnh hưởng đến khả năng bảo hộ cho động vật.Có như vậy công tác phòng dịch bệnh mới tốt được. 4.5. Kết quả ứng dụng vacxin trên diện rộng 4.5.1 Kết quả xác định chỉ tiêu an toàn của 5 lô vacxin PTH lợn vô hoạt khi ứng dụng vào thực tế sản xuất trên địa bàn huyện Đan Phượng- Hà Nội Để khẳng định vacxin phó thương hàn lợn có tính an toàn tuyệt đối, chúng tôi đã tiến hành tiêm thử nghiệm vacxin trên thực địa.Trong điều kiện thực tế vừa xác định các phản ứng không mong muốn bao gồm cả tỷ lệ chết mà những vấn đề này không thể quan sát được trong quá trình sản xuất. Các thí nghiệm được thực hiện trên bản động vật với một số lượng lớn động vật mẫn cảm, thí nghiệm được tiến hành với 5 lô vacxin PTH lợn vô hoạt thử nghiệm. Phương pháp tiến hành là sử dụng vacxin theo liều lượng chỉ dẫn và theo dõi các phản ứng nếu có. Cụ thể chúng tôi tiến hành tiêm an toàn vacxin tại Huyện Đan Phượng – thành phố Hà Nội (thời gian từ 5/6/2009 – 5/8/2009). Kết quả như sau: Bảng 4.23 Kết quả xác định chỉ tiêu an toàn của 5 lô vacxin PTH lợn vô hoạt thử nghiệm trên địa bàn huyện Đan Phượng- Hà Nội Lô vacxin phó thương hàn lợn Số lợn được tiêm Số lợn bị phản ứng Tỷ lệ (%) Đánh giá Sal 1 275 0 100 An toàn Sal 2 261 0 100 An toàn Sal 3 311 0 100 An toàn Sal 4 296 0 100 An toàn Sal 5 289 0 100 An toàn Tổng hợp 1.432 0 100 An toàn Sau khi tiến hành kiểm tra an toàn vacxin tại Phòng kiểm nghiệm vacxin của Xí nghiệp, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra an toàn vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt trên thực địa tại 6 xã thuộc Huyện Đan Phượng với số lợn được tiêm là 1.432 con. Kết quả là 100% lợn được tiêm phòng bằng vacxin phó thương hàn lợn đều không có phản ứng có hại nào gây sốt, ỉa chảy, ốm, chết,... Vậy vacxin phó thương hàn lợn là an toàn tuyệt đối. 4.5.2. Xác định hiệu lực của vacxin PTH lợn vô hoạt bằng phương pháp thử nghiệm lâm sàng trên diện rộng tại huyện Đan Phượng- Hà nội Chúng tôi đã tiến hành tiêm vacxin trên lợn tại 6 xã tại huyện Đan Phượng, kết hợp với trạm thú y huyện theo dõi lợn và thu thập số liệu trong thời gian 6 tháng. Kết quả như sau: Bảng 4.24: Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt trên đàn lợn nuôi tại Xã Đồng Tháp – Huyện Đan Phượng Chỉ tiêu Thôn Số lợn theo dõi Lợn tiêm phòng Lợn không tiêm Lợn chết nghi bị PTH Đánh giá bảo hộ Con Tỷ lệ (%) Con Tỷ lệ (%) Đã tiêm phòng Chưa tiêm phòng Con Tỷ lệ (%) Con Tỷ lệ (%) Bãi Thuỵ 190 130 68.42 60 31.58 0 0 0 0 Tốt Bãi Tháp 260 60 23.08 200 76.92 0 0 13 5 Tốt Đồng Vân 200 50 25 150 75 0 0 14 7 Tốt Đại Thần 210 50 23.80 160 76.20 0 0 13 6.19 Tốt Thọ Vực 130 60 46.15 70 54.85 0 0 2 1.53 Tốt T.hợp 990 350 35.35 640 64.65 0 0 42 4.24 Tốt Như vậy số lợn chết nghi do mắc PTH chủ yếu tập trung ở thôn Bãi Tháp nơi có số lợn nuôi nhiều nhưng tỷ lệ tiêm phòng thấp. Cụ thể thôn Bãi Thuỵ tiêm phòng tốt nên không có lợn chết nghi do PTH trong khi đó thôn Bãi Tháp tỷ lệ chết lên đến 5% Bảng 4.25: Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt trên đàn lợn nuôi tại Xã Thọ An – Huyện Đan Phượng Chỉ tiêu Thôn Số lợn theo dõi Lợn tiêm phòng Lợn không tiêm Lợn chết nghi bị PTH Đánh giá bảo hộ con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Đã tiêm phòng Chưa tiêm phòng Con Tỷ lệ % Con Tỷ lệ % Đông Hải 295 250 84.74 45 15.26 0 0 1 0.34 Tốt Tây Sơn 362 162 44.75 200 55.25 1 0.6 11 3.04 Tốt Bắc Hạ 345 320 92.75 25 7.25 0 0 0 0 Tốt Vạn Vĩ 310 190 61.29 120 38.71 0 0 4 1.29 Tốt T.hợp 1312 922 70.88 390 29.72 1 0.6 16 1.22 Tốt Theo kết quả bảng trên cho thấy: Trên toàn xã Thọ An có 4 thôn tiêm phòng vacxin PTH lợn vô hoạt trung bình là 70,88%, tỷ lệ chết là 1,22% trong đó có thôn Tây Sơn có tỷ lệ tiêm phòng là thấp nhất dưới 50% (có 44.75%) thì có số lợn chết nghi chết do Phó Thương hàn lợn là lớn nhất (11con) chiếm 3,04%. Trong khi đó tại thôn Bắc Hạ có tỷ lệ tiêm phòng cao (92.75%) thì không có lợn nào bị chết. Điều này chứng tỏ rằng ở thôn nào có tỷ lệ tiêm phòng vacxin cao thì số lợn nghi chết do Salmonella gây ra. Chúng tôi cũng thu thập số liệu của xã Thọ Xuân (do Trạm thú y Đan Phượng cung cấp) và có kết quả được trình bày ở bảng sau: Bảng 4.26: Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt trên đàn lợn nuôi tại Xã Thọ Xuân – Huyện Đan Phượng Chỉ tiêu Thôn Số lợn theo dõi Lợn tiêm phòng Lợn không tiêm Lợn chết nghi bị PTH Đánh giá bảo hộ con Tỷ lệ (%) Con Tỷ lệ (%) Đã tiêm phòng Chưa tiêm phòng con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Hoà Bình 170 150 88.23 20 11.77 0 0 0 0 Tốt Chiến Thắng 135 120 88.88 15 11.12 0 0 0 0 Tốt Quyết Tiến 394 238 60.4 156 39.6 0 0 3 0.76 Tốt Thống Nhất 400 186 46.5 214 53.5 0 0 5 1.25 Tốt T.hợp 1099 694 71.01 405 28.99 0 0 0.73 Tốt Xã Thọ Xuân có 4 thôn với tổng số lợn là 1.099 con, trong đó xã Quyết Tiến có số lợn nhiều nhất nhưng tỷ lệ tiêm phòng chỉ có 60,40% và có 3 trường hợp lợn nghi chết do Sal gây ra. Trong khi đó Xã Hòa Bình và xã Chiến Thắng có tỷ lệ tiêm phòng trên 80% (88,23%, 88,88%) thì không có lợn nghi chết do Sal gây ra. Xã Thống Nhất là xã có tỷ lệ tiêm phòng thấp nhất 46,5% nên đã có 5 trường hợp lợn nghi chết do PTH gây ra. Bảng4.27: Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt trên đàn lợn nuôi tại Xã Tân Lập – Huyện Đan Phượng Chỉ tiêu Thôn Số lợn theo dõi Lợn tiêm phòng Lợn không tiêm Lợn chết nghi bị PTH Đánh giá bảo hộ con Tỷ lệ (%) Con Tỷ lệ (%) Đã tiêm phòng Chưa tiêm phòng Con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Hạ Hội 525 310 59.04 215 40.96 0 0 7 1.33 Tốt Hạnh Đàn 455 260 57.14 195 42.86 1 0.2 6 1.32 Tốt Đan Hội 386 351 90.93 35 9.07 0 0 0 0 Tốt Ngọc Kiệu 336 271 80.65 65 19.35 0 0 1 0.3 Tốt T.hợp 1702 1192 71.94 510 28.06 1 14 Tốt Qua bảng trên cho thấy có 2/4 thôn tỷ lệ tiêm phòng thấp (59,04%, 57,14%) đó là thôn Hạ Hội và Hạnh Đàn. Hai thôn này có 13 trường hợp lợn nghi chết do sal gây ra. Trong 4 thôn chỉ có thôn Đan Hội không có trường hợp lợn chết (tỷ lệ tiêm phòng là 90,93%) và thôn Ngọc Kiệu có 1 trường hợp lợn chết Để có thể khẳng định hơn về khả năng bảo hộ của vacxxin Phó thương hàn lợn vô hoạt chúng tôi tiếp tục theo dõi và thu thập số liệu tại các xã Trung Châu, Tân Hội. Xã Tân Hội có 4 thôn thì chỉ có 1/4 thôn có tỷ lệ tiêm phòng cao trên 90% và không có trường hợp lợn nào chết, còn các thôn còn lại thì tỷ lệ tiêm phòng đạt trên 60% và vẫn có lợn nghi chết do Sal gây ra (tỷ lệ chết trên 2%). Kết quả này cũng đã cho thấy khẳng định thêm rằng ở thôn nào có tỷ lệ tiêm phòng cao thì số lợn nghi chết do Sal gây ra ít hoặc không có. Kết quả được thể hiện qua bảng dưới đây (Bảng 4.28): Bảng 4.28: Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt trên đàn lợn nuôi tại Xã Tân Hội – Huyện Đan Phượng Chỉ tiêu Thôn Số lợn theo dõi Lợn tiêm phòng Lợn không tiêm Lợn chết nghi bị PTH Đánh giá bảo hộ con Tỷ lệ (%) Con Tỷ lệ (%) Đã tiêm phòng Chưa tiêm phòng Con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Thượng Hội 230 150 65.21 80 34.79 0 0 5 Tốt Phan Long 200 126 63 74 37 0 0 5 Tốt Vĩnh Kỳ 313 218 69.64 95 30.36 0 0 3 Tốt Thuý Hội 251 231 92.03 20 7.97 0 0 0 Tốt T.hợp 994 725 269 0 0 13 Tốt Bảng 4.29: Đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt trên đàn lợn nuôi tại Xã Trung Châu – Huyện Đan Phượng Chỉ tiêu Thôn Số lợn theo dõi Lợn tiêm phòng Lợn không tiêm Lợn chết nghi bị PTH Đánh giá bảo hộ con Tỷ lệ (%) Con Tỷ lệ (%) Đã tiêm phòng Chưa tiêm phòng con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Hưu Trưng 360 345 95.83 15 4.17 0 0 0 0 Tốt Vân Môn 263 217 90.79 46 9.21 0 0 0 0 Tốt Phương Vinh 375 321 85.6 54 14.4 0 0 1 0.27 Tốt Chu Phan 315 243 77.14 72 22.86 0 0 2 0.63 Tốt Lại Yên 341 254 74.48 87 25.52 0 0 3 0.88 Tốt Phương Tiến 320 261 81.56 59 18.44 0 0 1 0.31 Tốt T.hợp 2031 1641 84.23 390 15.77 0 0 7 0.34 Tốt Nhìn vào bảng trên có thể thấy tại Trung Châu có tỷ lệ tiêm phòng cao trung bình trên 80% (84,23%), xã có tỷ lệ tiêm phòng thấp nhất cũng trên 74,48% (thôn Lại Yên). Tổng số lợn nghi chết do Sal gây ra chỉ có 7 trường hợp. Tỷ lệ tiêm phòng cao nhất là thôn Hưu Trưng với 95,83%. Kết quả theo dõi đánh giá khả năng bảo hộ của vacxin Phó thương hàn lợn vô hoạt tại xã Trung Châu cũng tương đồng với các xã Đồng Tháp, Thọ Xuân, Thọ An, Tân Lập, Tân Hội. Từ những kết quả trên chúng tôi có bảng tổng hợp về việc tiêm phòng vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt như sau: Bảng4.30: Tổng hợp kết quả xác định hiệu lực vacxin PTH lợn vô hoạt bằng phương pháp thử nghiệm lâm sàng trên diện rộng tại huyện Đan Phượng- Hà Nội Chỉ tiêu Địa điểm thử nghiệm(Xã) Số lợn theo dõi(con) Lợn tiêm phòng Lợn chết nghi bị PTH Đánh giá bảo hộ vacxin con Tỷ lệ (%) Đã tiêm phòng Chưa tiêm phòng Con Tỷ lệ (%) con Tỷ lệ (%) Đồng Tháp 990 350 35.35 0 0 42 4.24 Tốt Thọ An 1312 922 70.27 1 0.6 16 1.22 Tốt Thọ Xuân 1099 694 63.15 0 0 8 0.73 Tốt Trung Châu 4031 1641 40.71 0 0 7 0.17 Tốt Tân Lập 1702 1192 70.04 1 0.08 14 0.82 Tốt Tân Hội 994 725 72.94 0 0 13 1.31 Tốt Tổng số 10128 5524 54.54 Tốt Qua bảng tổng hợp trên cho thấy các xã có tỷ lệ tiêm phòng vacxin cao thì hầu như không có lợn nghi chết do PTH trong khi đó các xã không tiêm thì có lợn nghi chết do PTH xảy ra lẻ tẻ. Kết luận: - Cần tiêm phòng đầy đủ, đúng quy trình. - Nơi nào tiêm phòng vacxin PTH lợn vô hoạt tốt khả năng bảo hộ của đàn lợn tốt, vacxin PTH lợn vô hoạt có hiệu lực tốt khi sử dụng tại thực địa. Qua các kết quả trên, chúng ta có thể khẳng định được rằng vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí đạt tiêu chuẩn về vô trùng, an toàn, hiệu lực theo tiêu chuẩn của Cục thú y ban hành. Vì vậy vacxin phó thương hàn lợn vô hoạt sản xuất bằng công nghệ lên men sục khí hoàn toàn đủ tiêu chuẩn xuất xưởng. 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ KẾT LUẬN Đã sản xuất được 5 lô vacxin Phó thương hàn lợn vô hoạt theo công nghệ lên men sục khí. Kiểm định được các chỉ tiêu kĩ thuật của vacxin: vô trùng, an toàn và hiệu lực đạt yêu cầu. Xác định độ dài miễn dịch của vacxin sau khi tiêm: đã thực hiện kiểm tra ở các điểm 21 ngày, 3 tháng, 4,5 tháng và 6 tháng bằng phương pháp công cường độc thay thế trên chuột lang thí nghiệm thấy: Ở thời điểm 4,5 tháng vacxin vẫn đạt tỷ lệ bảo hộ đạt 100%. Ở thời điểm 6 tháng tỷ lệ bảo hộ bắt đầu giảm 2/5 lô vacxin có tỷ lệ bảo hộ còn 60% nhưng 3/5 lô vacxin vẫn đạt tỷ lệ bảo hộ là 80%. Để duy trì được sức miễn dịch chắc chắn trên đàn lợn nên sử dụng vacxin 2 lần trong một năm. Bảo quản ở nhiệt độ 2-8 0C - Sau 12 tháng bảo quản chất lượng vacxin vẫn đạt các tiêu chuẩn về vô trùng, an toàn và hiệu lực. Nhưng ở 18 tháng hiệu lực vacxin đã giảm (thời điểm hết hạn sử dụng theo chỉ dẫn của nhà sản xuất. Vì vậy không sử dụng vacxin bảo quản ở giai đoạn này. 5. Thực hiện thử nghiệm vacxin trên diện rộng: Kết quả 5524 lợn được tiêm phòng tại huyện Đan Phượng, thành phố Hà Nội, bước đầu xác định vacxin an toàn và có khả năng bảo hộ cao trong thực tế sản xuất. ĐỀ NGHỊ Đề nghị đưa vacxin vào thực tế sản xuất để phòng bệnh Phó thương hàn lợn TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Phùng Quốc Chướng (1995), Tình hình nhiễm Salmonella ở lợn vùng Tây Nguyên và khả năng phòng trị, Luận án PTS KH Nông Nghiệp, Hà Nội 2. Bộ Nông Nghiệp và Phát triển nông thôn: chiến lược phát triển chăn nuôi đến năm 2020, NXBNN, Hà Nội 2008, tr6-9. 3. Cục Thú y (1994), Quy trình kỹ thuật kiểm nghiệm vacxin dùng trong thú y, NXBNN, Hà Nội 1994, tr7-10, 45-46. 4. Đào Trọng Đạt, Phan Thanh Phượng (1986), Bệnh gia súc non tập II, NXB NN, Hà Nội, trang 67 – 91. 5. Trần Xuân Hạnh (1995), “Phân lập và giám định vi khuẩn Salmonella trên lợn 2 – 4 tháng tuổi”, Nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm – Tạp chí khoa học công nghệ và quản lý kinh tế, số 6 năm 1995, Hà Nội 1995, trang 240 6. Vũ Bình Minh, Cù Hữu Phú (1999), Kết quả phân lập vi khuẩn E.coli và Salmonella ở lơn mắc bệnh tiêu chảy, xác định một số đặc tính sinh vật hóa học của các chủng vi khuẩn phân lập được, Khoa học kỹ thuật thú y, tập 6, số 3 – 1999 – Hội thú y Việt Nam, Hà Nội. 7. Nguyễn Thị Nội, Nguyễn Ngọc Nhiên, Cù Hữu Phú, Nguyễn Thị Sở, Trần Thị Thu Hà (1989), “Kết quả điều tra về tình hình nhiễm vi khuẩn đường ruột tại một số cơ sở chăn nuôi lợn”, Kết quả nghiên cứu khoa học và kỹ thuật thú y 1985-1989, NXB Nông nghiệp, Hà Nội 1989, Tr 50-53. 8. Nguyễn Vĩnh Phước, Hồ Đình Chúc, Nguyễn Văn Hanh, Đặng Thế Huynh (1978), Giáo trình bệnh truyền nhiễm gia súc, NXBNN, Hà Nội 9. Phan Thanh Phượng,Trần Thị Hạnh, Phạm Thị Ngọc, Ngô Hoàng Hưng (1996), “Nghiên cứu xác định vai trò của vi khuẩn yếm khí Clostridium ferfringers trong hội chứng tiêu chảy của lợn”, Nông nghiệp công nghiệp thực phẩm, số 12, năm 1996, Tr495-496. 10. Lê Văn Tạo (1986), Nghiên cứu các tác nhân gây bệnh của vi trùng Salmonella Typhymurium. Bản dịch luận án PTS, Kosice 1986. 11. Lê Văn Tạo, Nguyễn Thị Vui (1994), “Phân lập định typ vi khuẩn Salmonella gây bệnh cho lợn”, Nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm – Tạp chí khoa học công nghệ và quản lý kinh tế, số 11 năm 1994, Hà Nội 1994, trang 430 – 431 12. Nguyễn Quang Tuyên (1995), Nghiên cứu đặc tính của một số chủng Salmonella gây bệnh tiêu chảy ở bê, nghé và biện pháp phòng trị. Luận án PTS KH Nông nghiệp – Viện Thú y quốc gia, Hà Nội 1995. 13. Nguyễn Quang Tuyên, Đoàn Thị Băng Tâm (1994), “Vai trò của vi khuẩn Salmonella trong rối loạn tiêu hóa của bê nghé tại Bắc Thái”, Khoa học kỹ thuật thú y, tập I, số 4 năm 1994, Hội thú y Việt Nam-Hà Nội. 14. Nguyễn Quang Tuyên, Đoàn Thị Băng Tâm (1995), “Kết quả điều tra bệnh do Salmonella gây ra ở trâu bò tại một số vùng Miền Bắc Việt Nam”, Nông nghiệp, công nghiệp thực phẩm – Tạp chí khoa học công nghệ và quản lý kinh tế, số 6 năm 1995, Hà Nội 1995, trang 239 15. Nguyễn Như Thanh (2001), Vi sinh vật thú y, NXBNN, Hà Nội, trang 84 16. Nguyễn Như Thanh, Nguyễn Bá Hiên, Trần Thị Lan Hương (1997), Vi sinh vật thú y, NXBNN, Hà Nội, trang 63-64, 67, 72, 77, 79. 17. John R. Cole, Jr. Đại học Georgia; Jerome C. Nietfeld, Đại học bang Kansas; Kent J. Schwart, Đại học bang Iowa (1996), “Salmonella Choleraeuis ở lợn”, Cẩm nang chăn nuôi lợn công nghiệp, Hà Nội, Tr 835-838. 18. Nguyễn Như Thanh (1974), Giáo trình thực tập Vi sinh vật thú y, Hà Nội, tr56-57. 19. Thuốc vacxin thú y () 20 Nguyễn Tuấn Hùng, 2007, luận văn Thạc sỹ nông nghiệp:” Nghiên cứu và hoàn thiện vacxin PTH lợn vô hoạt bằng công nghệ lên men sục khí” Tiếng Anh 21. Altekruse S.F (1990), Salmonella enteritidis update, Foreign-Anim-Dis-Res-U-S-Dep-Agric-Anim-Plant-Health-Insp-Serv-Vet-Serv-Emergency-Programs. Hyattsville, Md The Programs, Fall 1990 (18-3) p. 6-7 22. Bean N.H, Griffin P.M (1990), Foodborne disease outbreaks in the United States, 1973-1987: Pathogens, vehicles and trends, J-Food-Prot. Ames, Iowwa: International Association of Milk, Food and Envirnmental Sanitarians, Sept 1990.v.53 (9) p.804 – 817. charts. 23. D’Aoust J.Y, Sewell A, Jean A (1990), Limited sensitivity of short (6h) selective enrichment for detection of foodborne Salmonella. J-Food-Prot. Ames, Iowwa: International Association of Milk, Food and Envirnmental Sanitarians, July 1990.v.53 (7) p.562-565, 625. 24. Dean A.G, Ching Y.C, Williams and Harden L.B (1972), “Test for E.coli Enterotoxin using infant mice”, J.Infect, Dis 125, 1972. p. 407 – 411 25. Durand A.M, Giesecke W.H, Barnard M/L, Van-Der-Walt M.L, Steyn H.C (1990), “Salmonella isolated from feeds and feed ingredients during the period 1982 – 1988: Animal and public health implication”, Onderstepoort- J - Vet-Res. Pretoria: South Africa Department of Agriculture and Water supply, V.v57 (3) p. 175-181 26. Finlay B.B; Fallow S (1989), “Virulence factor associated with Salmonella spacies.” Micrological sciences, Vol 6. No.11. 27. Finlay B.B; Falkow S. (1988), “Biochim 1988 in press. Virulence factors associated with Salmonella spacies” Mocrilogical Sciences,Vol.5. No (11) 28. Le Minor L. & Popoff M.Y (1987), Request for an opinion Designation of Salmonella enterica sp. nov. nom. rev, as the type and only species of the genus Salmonella, Int. J. Syst. Bacteriol, 37, 465-468. 29. MacllroyS. George (2000), “The relationship beTrung ươngeen feed and Salmonella contamination”, Service Bulletin of Arrbor Acres Farm, No.11 jun 1, p.17 – 19 30. Morris I.A, Way C, Sojka W.J (1976), “The effect of T and B lymphocyte depletion on the protection of mice vaccinated with a gel Emutant of Salmonella typhimurium”, Bristh J. of Exp, Path 57, p354 – 360. 31. Orskov I.F, Jann B and Jann K (1977), “Serology chemistry and genetic of O and K antigen of E.coli”, Bacteriological Review, Vol 41, p . 667 – 710. 32. Popoff M.Y., Bockemuhl J. & McWhorter-Murlin A (1994), Supplement 1993 (No. 37) to the Kauffmann-White scheme, World Health Organization Collaborating Centre for Reference and Research on Salmonella, Unite des Enterobacteries, U389 INSERM, Institute Pasteur,2Paris. Res. Microbiol, 145, 711-716. 33. Popoff 3.Y (2001), Antigenic Formulas of the Salmonella Serovars, World 4ealth Organization Collaborating Centre for Reference and Researc5 on Salmonella, Pasteur Institute, Paris, France. 34. Radostit O.M; Blood D.C and Gay C.C (1994), Vetarinary medicine. A Textbook of the Diseases of cattle, sheep, pig, goat and horses, Paston press L.td, London, Norfolk, eighth Edition. 35. Sandefur P.D, Peterson J.W (1977), Neutralization of Salmonella Toxin-induced elongation of chinese- hamster-ovary cell choleranti Toxin, Ibid,Vol 15,p.982-988 36. Sedlock D.M, Koupal B.N, Deibel R.H (1978), Production and partial purification of Salmonella eteroToxin, J.Immun, Vol 20, p.375-380. 37. Sedlock D.M, Deibel R.H (1978), Dectection of Salmonella typhimurium EnteroToxin using rabbit iieal loops, Can.J.Microbiol, Vol 24, p.268-273. 38. Shane S. M, Gyimah J.e, Harrington K.S, Snider T.G.III (1985), “Etiology and pathogenesis of necrotic enteritis, Vet-Res-Commun”, Amsterdam Elsevier Science Publishers B.V, Sept 1985. v. 9 (4) p.269-287. 39. Smith B.P, Reina, Guerra M, Stocker B.A.D (1989), Aromatic, dependent Salmonella typhimurium as modified vacxin for calves, Am J. Vet. Res 45 (11):2231, 2235. 40. Snoeyenbos G.H (1991), Pullorum disease, Disease of poultry, Edition, p. 74 – 81, 84. 41. Taylor, Wilkins (1961), The effects of Salmonella and Shigella on the ligated loops of rabbits gut, India J.Med.Res, Vol 49, p.554. 42. Valtonen M.V (1977), Role of Phogocytosis in mouse virulence of Salmonella typhimurium recombimant with O antigen. 6,7 or 4,12, Infect Immune (18), p.574. 43. Weinstein D.L, Carsiotis M, Lissner CH.R.Orien AD (1984), “Flagalla help Salmonella typhimurim survive within murine macrophages”, Infection and Immmun, 18, p.574. 44. World Health Organization (WHO) Regional Office for Europe (2000). WHO Surveillance Programme for Control of Foodborne Infections and Intoxications in Europe. Seventh Report on Surveillance of Foodborne Disease in Europe 1993-1998. Institute for Health Protection of Consumers and Veterinary Medicine BGVV. FAO/WHO Collaborating Centre for Training and Research in Food Hygiene and Zoonoses, P.O. Box 33 00 13, 14191 Berlin, Germany. 45. Wray C. & Wray A, eds (2000), Salmonella in Domestic Animals, CAB International, Wallingford, Oxon, UK. MỤC LỤC Trang Lời cam đoan. i Lời cảm ơn. ii Mục lục. iii Danh mục các chữ viết tắt. vii Danh mục các bảng. viii Danh mục các hình. x BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI ----------eêf---------- LÊ THỊ TUYẾT LAN KIỂM ĐỊNH VÀ KHẢO NGHIỆM VACXIN PHÓ THƯƠNG HÀN LỢN VÔ HOẠT LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành : THÚ Y Mã số : 60.62.50 Người hướng dẫn khoa học: TS. NGUYỄN BÁ HIÊN HÀ NỘI – 2009 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các kết quả, số liệu nêu trong bản luận văn này là hoàn toàn trung thực và chưa được bảo vệ một học vị nào khác. Tôi xin cam đoan rằng các thông tin trích dẫn trong luận văn đều đã được chỉ rõ nguồn gốc. Tác giả luận văn Lê Thị tuyết Lan Lời cảm ơn Để hoàn thành luận văn này, ngoài sự cố gắng của bản thân tôi còn nhận được sự giúp đỡ tận tình của nhiều cá nhân và tập thể. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Bá Hiên- Trưởng bộ môn Vi sinh vật, Truyền nhiễm – Khoa Thú y Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, người đã tận tình giúp đỡ tôi trong suốt qua trình nghiên cứu và hoàn thành luận văn này. Tôi cũng xin bày tỏ lòng biết ơn tới trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội; Viện Đào tạo sau Đại học; Khoa Thú y; Bộ môn Vi sinh vật, Truyền nhiễm- Khoa Thú y; Phòng kiểm nghiệm vacxin Vi trùng, Tổ Vi trùng 2- Xí nghiệp thuốc thú y TW đã tạo mọi điều kiện thuận lợi giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cúu. Tôi xin cảm ơn tới gia đình, bạn bè và đồng nghiệp đã giúp đỡ, động viên tôi trong suốt quá trình thực hiện luận văn tốt nghiệp. Hà Nội, ngày tháng năm Tác giả Lê Thị Tuyết Lan DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT Sal: Salmonella PTH: Phó thương hàn MLD: Minimum Lethal Dose ( liều gây chết tối thiểu) TCN: tiêu chuẩn ngành TK: thuần khiết VK: Vi khuẩn TL: tỷ lệ CĐ: cường độc DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1 Nhuộm gram vi khuẩn Salmonella 2.2 4.1 Đường biểu diễn độ dài miễn dịch ._.