Khóa luận Xây dựng quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO Giáo viên hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: Th.s. NGUYỄN PHƯỚC ĐỊNH LÊ HỮU BẢO TRÂN MSSV: 12D720401175 Lớp: ĐH DƯỢC 7B Cần Thơ, năm 2017 LỜI CÁM ƠN Qua 5 năm học tập và rèn luyện tại trường ĐH Tây Đô, dưới sự chỉ bảo và giảng dạy nhiệt tình của quý thầy cô, đặc biệt là quý thầy cô khoa Dược-Điều dưỡng đã truyền đạt cho em những kiến thức về lý thuyết và thực hành để em có thể hoàn thành khóa luận tốt nghiệp. Chính vì thế, một trong những yếu tố không nhỏ tạo nên “sản phẩm trí tuệ” này là sự hướng dẫn, giúp đỡ tận tình của giáo viên hướng dẫn và các thầy cô. Bên cạnh đó còn có sự ủng hộ của gia đình và bạn bè mà em mới có thể hoàn thành khóa luận một cách thuận lợi nhất. Trước hết, em xin gửi lời cảm ơn chân thành đến Ths. Nguyễn Phước Định, người trực tiếp hướng dẫn em trong quá trình làm luận văn. Không chỉ gợi ý và hướng dẫn em trong quá trình tìm hiểu, đọc tài liệu và lựa chọn đề tài, thầy còn tận tình chỉ bảo em những kĩ năng phân tích, khai thác tài liệu để có được những lập luận phù hợp với nội dung của khóa luận. Hơn nữa, thầy còn rất nhiệt tình trong việc đốc thúc quá trình viết khóa luận, đọc và đưa ra những nhận xét, góp ý để em có thể hoàn thành luận văn một cách tốt nhất. Bên cạnh đó, em cũng xin gửi đến các thầy cô giáo đang hoạt động, giảng dạy tại phòng Kiểm Nghiệm lòng biết ơn sâu sắc về những kiến thức và kĩ năng mà các thầy cô đã truyền đạt, chỉ em thêm những kiến thức em còn thiếu sót, cũng như đóng góp thêm ý kiến cho việc hoàn thành khóa luận. Cần Thơ, tháng 6 năm 2017 Sinh viên Lê Hữu Bảo Trân TÓM TẮT Hai hóa chất bảo vệ thực vật phổ biến nhất là imidacloprid và azoxystrobin được nhiều nông dân tin dùng vì hai loại này có hiệu quả cao trong việc ngăn ngừa sâu bệnh và nấm mốc gây hại, nên imidacloprid và azoxystrobin được chọn trong nghiên cứu này. Điều này đặt ra yêu cầu cần có phuơng pháp phân tích chính xác và đơn giản xác định hai hoạt chất trên. Nghiên cứu đã xây dựng và thẩm định được quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC). Kết quả nghiên đã lựa chọn được với điều kiện sắc ký trong đó cột sắc ký RP- C18 (250 x 4,6mm, 5µm), pha động gồm acetonitril –nước với tỷ lệ (55%: 45%), tốc độ dòng 1ml/phút và phát hiện ở bước sóng 250 nm. Cả hai chất đã tách được hoàn toàn trong thời gian 15 phút. Giới hạn định lượng của imidacloprid và azoxystrobin lần lượt là 0,0048 ppm và 0,048 ppm. Diện tích pic và nồng độ có mối tương quan tuyến tính với hệ số tương quan của imidacloprid là 0,9978 và của azoxystrobin là 0,997. Phương pháp có độ đúng nằm trong khoảng 98-102% và độ lặp lại tốt với RSD < 2%. Vì vậy quy trình có thể sử dụng để định lượng nhanh imidacloprid và azoxystrobin từ đó xác định dư lượng của hai chất này trong dược liệu. Từ khóa: imidacloprid, azoxystrobin, định lượng, HPLC. i MỤC LỤC LỜI CÁM ƠN TÓM TẮT MỤC LỤC .......................................................................................................................i CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU ................................................................................................. 1 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ ...................................................................................................... 1 1.2. MỤC TIÊU ........................................................................................................... 1 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ...................................................................... 2 2.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU ................................................. 2 2.1.1. Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật ............................................................... 2 2.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật ................................................................. 2 2.1.3. Imidacloprid ................................................................................................... 3 2.1.3.1. Khái niệm ................................................................................................ 3 2.1.3.2. Cấu tạo ..................................................................................................... 3 2.1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học ..................................................................... 3 2.1.3.4. Độc tính của Imidacloprid ....................................................................... 4 2.1.3.5. Cơ chế tác động của imidacloprid ........................................................... 4 2.1.4. Azoxystrobin .................................................................................................. 5 2.1.4.1. Khái niệm ................................................................................................ 5 2.1.4.2. Cấu tạo ..................................................................................................... 5 2.1.4.3. Tính chất vật lý và hóa học ..................................................................... 5 2.1.4.4. Độc tính của azoxystrobin ....................................................................... 5 2.1.4.5. Cơ chế tác động ....................................................................................... 6 2.1.5. Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin .......... 6 2.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................... 6 2.1.6.1. Một số phương pháp định lượng imidacloprid bằng phương pháp HPLC .... 6 2.1.6.2. Các phương pháp định lượng azoxysrobin bằng phương pháp HPLC ... 8 2.1.6.3. Phương pháp định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và azoxystrobin. ........................................................................................................ 8 ii 2.2. TỔNG QUAN VỀ PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO ....... 9 2.2.1. Khái niệm ....................................................................................................... 9 2.2.2. Phân loại ......................................................................................................... 9 2.2.3. Nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC ........................................................ 9 2.2.3.1. Bình đựng dung môi .............................................................................. 10 2.2.3.2. Bộ phận khử khí .................................................................................... 10 2.2.3.3. Bơm cao áp ............................................................................................ 11 2.2.3.4. Bộ phận tiêm mẫu .................................................................................. 11 2.2.3.5. Cột sắc ký .............................................................................................. 11 2.2.3.6. Đầu dò ................................................................................................... 11 2.2.3.7. Bộ phận ghi tín hiệu .............................................................................. 11 2.2.3.8. Thiết bị in dữ liệu .................................................................................. 12 2.2.4. Nguyên tắc của quá trình sắc kí trong cột .................................................... 12 2.2.5. Sắc ký phân bố hiệu năng cao ...................................................................... 12 2.2.6. Các thông số đặc trưng trong HPLC ............................................................ 13 2.2.6.1. Thời gian lưu tR .................................................................................... 13 2.2.6.2. Hệ số phân bố K .................................................................................... 14 2.2.6.3. Hệ số dung lượng K’ ............................................................................. 14 2.2.6.4. Hệ số tách α ........................................................................................... 15 2.2.6.5. Số đĩa lý thuyết ...................................................................................... 15 2.2.6.6. Độ phân giải RS .................................................................................... 15 2.2.6.7. Các hệ số liên quan tới đối xứng của pic sắc ký ................................... 16 2.2.7. Phương pháp chọn điều kiện sắc ký ............................................................. 16 2.2.7.1. Lựa chọn pha tĩnh .................................................................................. 17 2.2.7.2. Lựa chọn pha động ................................................................................ 17 2.2.8. Các bước tiến hành sắc ký............................................................................ 19 2.2.8.1. Chuẩn bị dụng cụ và máy móc .............................................................. 19 2.2.8.2. Chuẩn bị dung môi pha động ................................................................ 19 iii 2.2.8.3. Chuẩn bị mẫu đo HPLC ........................................................................ 19 2.2.8.4. Cách vận hành thiết bị ........................................................................... 20 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................................... 21 3.1. HÓA CHẤT VÀ DỤNG CỤ .............................................................................. 21 3.1.1. Hóa chất ....................................................................................................... 21 3.1.1.1. Chất chuẩn ............................................................................................. 21 3.1.1.2. Dung môi ............................................................................................... 21 3.1.2. Dụng cụ - Thiết bị ........................................................................................ 21 3.1.2.1 Thiết bị.................................................................................................... 21 3.1.2.2. Dụng cụ ................................................................................................. 22 3.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ............................................................................... 22 3.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................................................................... 23 3.3.1. Chuẩn bị dung dịch ...................................................................................... 23 3.3.2. Khảo sát điều kiện tối ưu cho hệ thống sắc ký............................................. 23 3.3.2.1. Chọn cột................................................................................................. 23 3.3.2.2. Chọn bước sóng cho detector ................................................................ 23 3.3.2.3. Khảo sát bước sóng trên thiết bị HPLC................................................. 23 3.3.2.4. Khảo sát thành phần pha động .............................................................. 24 3.3.2.5. Khảo sát tốc độ dòng ............................................................................. 25 3.3.3. Thẩm định phương pháp .............................................................................. 25 3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống ........................................................................... 25 3.3.3.2. Tính đặc hiệu ......................................................................................... 26 3.3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ........... 27 3.3.3.4. Tính tuyến tính ...................................................................................... 27 3.3.3.5. Độ chính xác .......................................................................................... 28 3.3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) ................................................................... 28 3.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả ....................................................... 29 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................. 30 iv 4.1. CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ ... 30 4.1.1. Chuẩn bị dung dịch ...................................................................................... 30 4.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký .............................................................. 30 4.1.2.1. Đặt bước sóng cho detector ................................................................... 30 4.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động .............................................................. 31 4.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng .............................................................................. 35 4.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN ............................................................... 35 4.2.1. Thẩm định quy trình ..................................................................................... 35 4.2.1.1. Tính phù hơp hệ thống .......................................................................... 35 4.2.1.2 Tính đặc hiệu .......................................................................................... 38 4.2.1.3. Xác định LOD và LOQ của thiết bị ...................................................... 39 4.2.1.4. Tính tuyến tính ...................................................................................... 40 4.2.1.5. Độ chính xác .......................................................................................... 43 4.2.1.6. Độ đúng ................................................................................................. 45 4.3. THẢO LUẬN ..................................................................................................... 47 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT ................................................................. 48 5.1. KẾT LUẬN ......................................................................................................... 48 5.2. ĐỀ XUẤT ........................................................................................................... 49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ........................................................................................... 50 PHỤ LỤC v DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu, chữ viết tắt Từ nguyên (nghĩa tiếng Việt) ACN : Acetonitrile As : Hệ số đối xứng DĐVN : Dược điển Việt Nam HPLC : High Performance Liquid Chromatography (Sắc ký lỏng hiệu năng cao) LC50 : Lethal concentration (Nồng độ gây chết 50% ) LD50 : Lethal dose (Liều gây chết 50%) LOD : Limit of quantitation (Giới hạn định lượng) LOQ : Limit of detection (Giới hạn phát hiện) PDA : Photo Diode Array (Dãy diod quang) ppm : Part per million (phần triệu) Rs : Resolution (Độ phân giải) RSD : Relative Standard Deviation (Độ lệch chuẩn tương đối) SD : Standard Deviation (Độ lệch chuẩn) Speak : Diện tích pic sắc kí UV : Tử ngoại Vis : Khả kiến vi DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid ............................................................................... 3 Hình 2.2. Cấu trúc của azoxystrobin ............................................................................... 5 Hình 2.3. Sơ đồ cấu tạo hệ thống HPLC ......................................................................... 9 Hình 2.4. Sắc ký đồ thời gian lưu của chất A và chất B................................................ 14 Hình 4.1. Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile. ................ 31 Hình 4.2. Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%). .............................................................. 32 Hình 4.3. Sắc ký đồ ACN/ Nước (95%:5%). ................................................................ 32 Hình 4.4. Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%) ............................................................... 33 Hình 4.5. Sắc ký đồ ACN/ Nước (60%:40%). .............................................................. 33 Hình 4.6. Sắc ký đồ ACN/ Nước (55%:45%). .............................................................. 34 Hình 4.7. Sắc ký đồ ACN/ Nước (50%:50%). .............................................................. 34 Hình 4.8. Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống ......................................... 36 Hình 4.9. Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin ................ 38 Hình 4.10. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm .................... 39 Hình 4.11. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm .................. 39 Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid ... 42 Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin .. 42 vii DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid .................................................... 4 Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin ................................................... 6 Bảng 2.3. Lực rửa giải của một số dung môi ................................................................ 18 Bảng 3.1. Danh mục dung môi tinh khiết chuyên dùng cho HPLC .............................. 21 Bảng 3.2. Danh mục máy móc - thiết bị phục vụ cho đề tài nghiên cứu ...................... 21 Bảng 3.3. Tỷ lệ thành phần pha động của acetonitril và nước ...................................... 24 Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid............................ 36 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin .................................. 37 Bảng 4.3. Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin trước khi tiêm vào hệ thống HPLC ............................................................................... 40 Bảng 4.4: Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn ........... 41 Bảng 4.5: Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn ........... 41 Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid .............................. 43 Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin .................................. 43 Bảng 4.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid .............................. 44 Bảng 4.9. Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid ...................................... 44 Bảng 4.10. Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin .................................... 45 Bảng 4.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid ........... 45 Bảng 4.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin ................... 46 Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và azoxystrobin................................................................................................................... 48 1 CHƯƠNG 1. MỞ ĐẦU 1.1. ĐẶT VẤN ĐỀ Trong nông nghiệp, có nhiều mối nguy làm ảnh hưởng xấu đến năng suất và chất lượng nông sản như sâu bệnh, cỏ dại, chuột, mối mọt, nấm... Vì vậy hóa chất bảo vệ thực vật đóng vai trò quan trọng để phòng và loại trừ các loại dịch bệnh cho các sản phẩm nông nghiệp. Hiện nay, khi trồng hầu hết các loại dược liệu cần phải sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật nhằm tăng năng suất và chất lượng dược liệu. Gần đây một trong những phương pháp phổ biến nhất là việc sử dụng imidacloprid và azoxystrobin là hai loại phổ biến nhất trong nông nghiệp để ngăn ngừa sâu bệnh, côn trùng, nấm mốc ảnh hưởng đến cây trồng. Các công trình nghiên cứu nước ngoài đã thành công trong việc định lượng imidacloprid hoặc azoxystrobin với nhiều loại hóa chất bảo vệ thực vật khác bằng các phương pháp như: quang phổ UV- VIS, sắc ký khí ghép đầu dò khối phổ, sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC)Trong đó HPLC là phương pháp thường được sử dụng nhất do phương pháp này rất phổ biến, thuận lợi, đỡ tốn kém và cho độ chính xác cao hơn so với các phương pháp khác. Ngày nay cùng với sự phát triển của khoa học kỹ thuật, nhiều kỹ thuật phân tích mới và hiện đại đã được áp dụng vào việc phân tích, xác định hàm lượng của chúng nhằm kiểm soát chất lượng của các sản phẩm, đảm bảo an toàn và sức khỏe của người sử dụng. Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) là một trong những phương pháp phân tích hiện đại, chính xác và nhanh chóng để phân tích hàm lượng của các loại hóa chất bảo vệ thực vật đang được nghiên cứu và ứng dụng trong thực tế. Trong nghiên cứu này định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và azoxystrobin từ đó có thể xác định dư lượng của hai chất này trong lá, rễ từ dược liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu nâng cao (HPLC). Vì vậy đề tài “Xây dựng quy trình định lượng đồng thời chuẩn imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao” được thực hiện với mong muốn tìm ra một phương pháp nhanh, hiệu quả và phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng thí nghiệm. 1.2. MỤC TIÊU Nghiên cứu này được thực hiện chủ yếu với hai mục tiêu sau:  Xây dựng điều kiện phân tích đông thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC sử dụng detector UV-VIS.  Thẩm định quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin. 2 CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. TỔNG QUAN VỀ CÁC CHẤT NGHIÊN CỨU 2.1.1. Khái niệm hóa chất bảo vệ thực vật Hóa chất bảo vệ thực vật là bất kì hợp chất hay hỗn hợp được dùng với mục đích ngăn ngừa, tiêu diệt hoặc kiểm soát các tác nhân gây hại, bao gồm vật chủ trung gian truyền bệnh của con người hoặc động vật, các bộ phận không mong muốn của thực vật hoặc động vật gây hại hoặc ảnh hưởng đến các quá trình sản xuất, chế biến, bảo quản, vận chuyển, mua bán thực phẩm, nông sản, gỗ và sản phẩm từ gỗ, thức ăn chăn nuôi, hoặc hợp chất được phân tán lên động vật để kiểm soát côn trùng, nhện hay các đối tượng khác trong hoặc trên cơ thể chúng. Hóa chất bảo vệ thực vật còn được dùng làm tác nhân điều hòa sinh trưởng thực vật, chất làm rụng lá, chất làm khô cây, tác nhân làm thưa quả hoặc ngăn chặn rụng quả sớm. Cũng có thể dùng hóa chất bảo vệ thực vật cho cây trồng trước cũng như sau khi thu hoạch để bảo vệ sản phẩm không bị hỏng trong quá trình bảo quản và vận chuyển (Trần Cao Sơn, 2015). 2.1.2. Phân loại hóa chất bảo vệ thực vật Các hóa chất bảo vệ thực vật được phân loại theo ba nhóm chính sau: - Thuốc trừ sâu: là một loại chất được sử dụng để chống côn trùng. Chúng bao gồm các thuốc diệt trứng và thuốc diệt ấu trùng để diệt trứng và ấu trùng của côn trùng như: imidacloprid, dichlopropene, methyl isocyanate, chloropicrin, methyl bromide. Một số chất khác như: aldicarb, dazomet và metham natri, hoạt động chủ yếu qua tiếp xúc. Gần như tất cả các loại thuốc trừ sâu đều có nguy cơ làm thay đổi lớn các hệ sinh thái; nhiều loại thuốc trừ sâu độc hại với con người; và các loại khác tích tụ trong chuỗi thức ăn (Saed Mousa Diab Ali, 2012). - Thuốc diệt cỏ: Thuốc diệt cỏ kiểu Hormon như 2,4,5-T; 2,4-D;là những chất không hiện diện trong đất nhưng có độc tính cao đối với thực vật và thấp đối với động vật có vú. Các chất thuộc nhóm này ít ảnh hưởng trực tiếp đến môi trường nhưng lại hòa tan hoàn toàn trong nước và trong các mạch nước ngầm. Các loại thuốc diệt cỏ ảnh hưởng trực tiếp trên thân, lá bao gồm: dintrophenols, xianophenols, pentachlorophenol và Paraquat (Saed Mousa Diab Ali, 2012). - Thuốc trừ nấm: là những chất độc có nguồn gốc từ tự nhiên hay hóa chất tổng hợp được dùng để bảo vệ cây trồng và nông sản, chống lại sự phá hoại của nấm mốc, vi khuẩn ảnh hưởng đến năng suất của cây trồng Nhiều loại thuốc trừ nấm khác nhau được sử dụng, với các hóa chất có cấu trúc khác nhau. Hầu hết đều có độc tính tương đối thấp, ngoại trừ các chất thuộc nhóm carbamat như benomyl. Độc tính của thuốc trừ nấm ảnh hưởng lớn đến môi trường nhất là đối với hệ vi sinh vật trong đất nhưng ảnh hưởng này chỉ trong thời gian ngắn (Saed Mousa Diab Ali, 2012). 3 Trong nghiên cứu này hai chất hóa chất bảo vệ thực vật khảo sát đó là imidacloprid và azoxystrobin. Theo các tài liệu trong và ngoài nước đã phân loại imidacloprid thuộc nhóm thuốc trừ sâu và azoxystrobin thuộc nhóm thuốc trừ nấm. Dựa vào tính chất và đặc điểm của từng nhóm từ đó chọn ra phương pháp nghiên cứu phù hợp. 2.1.3. Imidacloprid 2.1.3.1. Khái niệm Imidacloprid là một trong những loại hoạt chất có phổ được sử dụng rộng rãi nhất. Nó được dùng để trừ hầu hết các loại sâu hại trong nông nghiệp, lâm nghiệp, trừ mối,.Do có độ độc bởi vòng Pyridin có gắn với nguyên tử Clo và dị vòng Azo 5 cạnh, có độ độc cao với côn trùng, diệt trừ sâu, bướm, rầy, rệp(Sacramento, 2002). 2.1.3.2. Cấu tạo[31] Hình 2.1. Cấu trúc của imidacloprid - Tên chung quốc tế: imidacloprid - Công thức phân tử: C9H10ClN5O2 - Khối lượng phân tử: 255,662 g/mol - Danh pháp IUPAC: N-[1-[(6-chloropyridin-3-yl)methyl]-4,5- dihydroimidazol-2-yl]nitramide - Loại HCBVTV: thuốc trừ sâu - Nhóm: Neonicotinoid 2.1.3.3. Tính chất vật lý và hóa học (Sprivastava, 2004) - Dạng bột tinh thể màu hoặc bột màu be, có mùi đặc trưng nhẹ - Tỷ trọng: 1.54 g/cm3 - Nhiệt độ nóng chảy ở 144oC - Áp suất hơi: 1.00 x 10-7 mm Hg (20oC) - Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo - Độ tan trong nước: 0,61 g/l (20oC) - Thời gian bán hủy: Trên 30 ngày (25oC ở pH 7) - Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: nước, dchloromethane, isopropanol, toluene ở nhiệt độ 20oC 4 - 0.Phân hủy ở pH khoảng 5-11, khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc 2.1.3.4. Độc tính của Imidacloprid (Raihanah, 2016) Theo một số tài liệu nghiên cứu của các tác giả nước ngoài, imidacloprid gây độc với động vật ở một liều nhất định, cụ thể trong bảng sau: Bảng 2.1: Thông tin về độc tính cấp của imidacloprid Động vật thí nghiệm Đường dùng Kết quả Chuột miệng LD50 tương đương 130 mg/kg da LD50 > 5000 mg/kg và gây kích ứng da nhẹ hít LC50 > 5,33 mg/l tiêu hóa Nuốt một lượng lớn có thể gây nôn mửa, tiêu chảy, đau bụng, lơ mơ, trầm cảm, chuột rút, run rẩy và rối loạn hô hấp. mắt Gây kích ứng mắt Trong các trường hợp đã được khảo sát về độc tính của Imidacloprid ở người ngộ độc cấp thường có các dấu hiệu bao gồm buồn ngủ, chóng mặt, nôn mửa, không tỉnh táo và sốt. Các trường hợp ngộ độc này phụ thuộc vào hàm lượng imidacloprid có trong chế độ ăn uống (Spivastava, 2004).  Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người có chứa imidacloprid là 0,06 mg/kg một ngày (Spivastava, 2004). 2.1.3.5. Cơ chế tác động của imidacloprid (Spivastava, 2004) Imidacloprid thuộc nhóm Neonicotinoid là nhóm hóa chất bảo vệ thực vật gây kích thích thần kinh có cấu trúc tương tự nicotin. Cơ chế gây độc là do các sản phẩm này này gắn với các receptor của acetylcholin, gây độc thần kinh trung ương. Imidacloprid có độc tính cao với côn trùng vì nó gắn kết tốt hơn với các thụ thể của tế bào thần kinh của côn trùng. Đường tiếp xúc qua da có độc tính thấp, có thể gây đỏ và ngứa mắt nhẹ. Chưa có các bằng chứng về gây ngộ độc cấp tính trên người. Các nghiên cứu cũng cho thấy các chất này phân hủy nhanh trong đường tiêu hóa và loại trừ qua phân, nước tiểu trong vòng 48 giờ. 5 2.1.4. Azoxystrobin (Bursic Vojislava and Lazic Sanja, 2012) 2.1.4.1. Khái niệm Azoxystrobin là một loại thuốc diệt nấm phổ rộng có hoạt tính chống lại một số bệnh trên nhiều cây ăn quả và cây cảnh nhằm mục đích ngăn ngừa các bệnh ở lúa, nấm mốc, rụng lá gây hại ảnh hưởng đến năng suất trồng trọt. 2.1.4.2. Cấu tạo Hình 2.2. Cấu trúc của azoxystrobin - Tên chung quốc tế: Azoxystrobin - Công thức phân tử: C22H17N3O5 - Khối lượng phân tử: 403,4 g/mol - Danh pháp IUPAC: Methyl (E)-2-[2-[6-(2-cyanophenoxy)pyrimidin-4- yl]oxyphenyl]-3-methoxyprop-2-enoate. - Loại HCBVTV: thuốc trừ nấm - Nhóm: methoxyacrylates 2.1.4.3. Tính chất vật lý và hóa học (Rao Nageswara, 2012) - Dạng bột tinh thể màu trắng - Nhiệt độ nóng chảy ở 116 oC - Tỷ trọng: 1.25 g/cm3 (ở 25 ºC) - Độ ổn định: ổn định trong điều kiện bảo quản được khuyến cáo - Độ hòa tan: Tan trong các dung môi như: hexane, methanol, toluen, acetone, ethyl acetat, acetonitril, dichloromethane, nước ở nhiệt độ 20oC. - Phân hủy khi đun nóng ở nhiệt độ cao, sinh ra khí độc nitrogen oxide (N2O) 2.1.4.4. Độc tính của azoxystrobin (Sh.A.Ashorkr, 2006) Theo tác giả T.Nageswara Rao và cộng sự năm 2012 đã khảo sát độc tính của azoxystrobin qua các thí nghiệm trên các động vật thí nghiệm như bảng sau: 6 Bảng 2.2. Thông tin về độc tính cấp của azoxystrobin Động vật thí nghiệm Đường dùng Kết quả Chuột đực uống LD50 > 2000 mg / kg. Không có tác dụng phụ Chuột đực và cái da LD50 > 2000 mg / kg Không có tác dụng phụ Chuột đực và cái hít LC50 tương đương 0,38 mg /l trong không khí Thỏ đực da Không gây kích ứng trên da Thỏ đực và cái mắt Không gây kích ứng trên da  Liều dùng cho phép mỗi ngày (ADI) trong khẩu phần ăn hằng ngày ở người có chứa azoxystrobin khoảng 0-0,2 mg/ kg một ngày (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012). 2.1.4.5. Cơ chế tác động (T.Nageswara Rao và cộng sự, 2012). Azoxystrobin là một chất diệt nấm phổ rộng thuộc nhóm methocyacrylate. Được bắt nguồn từ các strobilurin tự nhiên xảy ra. Nó hoạt động với chất diệt nấm bằng cách ức chế ty thể trong nấm. Chúng tạo thành một lớp bảo vệ trên bề mặt thực vật và ức chế sự phát triển của bào tử nấm. 2.1.5. Các loại hóa chất bảo vệ thực vật chứa imidacloprid và azoxystrobin - Danh mục thuốc có chứa imidacloprid: Confidor 100 SL, Actador 100WP, Javidan 100 WP, Anvado 100WP, Conphai 10WP, Kola 700WO, Abamix 1,45SP, Aba- plus 100EC[32] - Danh mục thuốc có chứa azoxystrobin: Amistar Top 250 SC, Amistar Top 325 SC, Mi stop 350 SC, Ohho 3255SC, Neoamistagold 360SC, 400SC, 450SC, 500SC, Ammisdotop 400SC, Dovatop 4...); D: nước - Thời gian: 0 – 20 phút, 55%C: 45%D. - Nồng độ chất phân tích: 50 µg/ml. - Tốc độ dòng: 0,5 ml/phút; 0,8 ml/phút; 1 ml/phút; 1,2 ml/phút; 1,5ml/phút - Detector: UV- Vis đặt ở bước sóng λ = 250 nm. - Thể tích vòng mẫu: 20 μl 3.3.3. Thẩm định phương pháp (ICH, 1996)  Định nghĩa: Thẩm định quy trình phân tích là quá trình thiết lập bằng thực nghiệm các thông số đặc trưng của phương pháp để chứng minh quy trình phân tích đó có phù hợp và có đáp ứng yêu cầu phân tích dự kiến. Khi tiến hành thử nghiệm các sai số mắc phải là rất nhỏ và chấp nhận được (Bộ y tế, 2009)  Mục đích: - Giúp thực hiện các chỉ tiêu kiểm nghiệm trong tiêu chuẩn kiểm nghiệm. - Là công việc bắt buộc có tính chất định kỳ nhằm đảm bảo phương pháp phân tích là phù hợp và kết quả phân tích đạt độ tin cậy trong suốt quá trình phân tích. - Để đưa vào chuyên luận Dược điển hoặc tiêu chuẩn cơ sở (Bộ y tế, 2009) 3.3.3.1 Tính phù hợp hệ thống Tiến hành sắc ký với hỗn hợp chứa mẫu chuẩn imidacloprid và azoxystrobin với nồng độ khoảng 50 ppm, tiến hành sắc ký 6 lần. 26 Tính phù hợp hệ thống được xác định dựa trên các thông số đặc trưng của sắc ký như: diện tích peak (S), thời gian lưu (tR), độ phân giải (RS), hệ số đối xứng (AS), số đĩa lý thuyết (N) là những thông số thường được dùng để đánh giá độ ổn định của hệ thống khi tiêm lặp lại 6 lần. Yêu cầu: - Số đĩa lý thuyết ≥ 2000. - Giá trị RSD của thời gian lưu ≤ 1,0% và của diện tích peak phải ≤ 2,0% (với phép thử định lượng). Trường hợp giá trị RSD > 2%, phải có sự giải thích phù hợp. - Hệ số đối xứng của peak chính phải trong khoảng 0,8 - 1,5 (0,8 ≤ AS ≤ 1,5). - Độ phân giải giữa peak chính và peak phụ phải lớn hơn 1,5 (RS ≥ 1,5).  Các thông số khác của píc phải đáp ứng yêu cầu chung của phương pháp HPLC quy định trong Dược điển và quy định cụ thể trong quy trình phân tích thẩm định. 3.3.3.2. Tính đặc hiệu  Khảo sát tính đặc hiệu trên mẫu chuẩn Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích:  Mẫu trắng: dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.  Mẫu chuẩn: dung dịch chứa chất chuẩn imidacloprid dung dịch chứa chất chuẩn azoxystrobin dung dịch chứa hỗn hợp hai chất chuẩn. Yêu cầu: - Sắc ký đồ hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin phải cho peak có thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu trên sắc ký đồ của riêng tưng chất chuẩn. - Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện píc ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng pic phải ≤ 1,0%, so với đáp ứng của pic mẫu chuẩn. Để quy trình định lượng có ý nghĩa trong ứng dụng thực tế ta nên thực hiện khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu giả định.  Khảo sát tính đặc hiệu trên mẫu giả định Tiến hành sắc ký các loại mẫu sau đây theo quy trình phân tích  Mẫu trắng: dung môi pha động/dung môi hòa tan mẫu hay pha loãng mẫu.  Mẫu chuẩn: dung dịch chứa chất chuẩn imidacloprid dung dịch chứa chất chuẩn azoxystrobin dung dịch chứa hỗn hợp hai chất chuẩn.  Mẫu giả định: dịch chiết dược liệu (không có chất cần phân tích) đã được cho thêm chất chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin 27  Ghi lại sắc ký đồ. Xác định thời gian lưu của hoạt chất cần phân tích; độ tinh khiết của peak hoạt chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu giả định. Yêu cầu: - Sắc ký đồ trong dung dịch mẫu giả định cho peak có thời gian lưu khác nhau không có ý nghĩa thống kê với peak của chất chuẩn trong sắc ký đồ các mẫu chuẩn. Trên sắc ký đồ mẫu giả định: peak của các chất cần phân tích phải tách nhau hoàn toàn. - Sắc ký đồ của mẫu trắng, dung dịch mẫu nền không xuất hiện peak ở trong khoảng thời gian lưu tương ứng với thời gian lưu của chất chuẩn. Nếu có đáp ứng peak phải ≤ 1,0%, so với đáp ứng của peak mẫu chuẩn. - Peak của chất cần phân tích trong sắc ký đồ mẫu giả định phải tinh khiết. 3.3.3.3. Xác định giới hạn phát hiện LOD và giới hạn định lượng LOQ Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng.  Giới hạn phát hiện (LOD) là giá trị nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu của đường nền.  Giới hạn định lượng (LOQ) được xem là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được với tín hiệu phân tích có nghĩa định lượng so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền. Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: - Pha loãng từ 5 - 7 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp imdacloprid và azoxystrobin nồng độ 10 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng (chứa dung môi pha động). - Tiêm vào thiết bị HPLC và ghi kết quả.  Sắc ký đồ nào thể hiện chiều cao peak khoảng gấp 3 lần đường nền thì nồng độ của mẫu chuẩn đó chính là giới hạn phát hiện LOD của thiết bị.  Giới hạn định lượng được suy ra từ công thức: 10 LOQ = × LOD 3 3.3.3.4. Tính tuyến tính Khoảng nồng độ tuyến tính là một thông số quan trọng của quy trình phân tích. Một chất chỉ có thể định lượng tốt theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn khi nồng độ của chất phân tích nằm trong khoảng tuyến tính. - Khảo sát khoảng tuyến tính từ 20-160% của nồng độ đo. Tiến hành pha 5 dung dịch (ứng với 5 nồng độ 40%, 80%, 100%, 120%, 160%), thực hiện tiêm 3 lần cho mỗi mẫu. - Tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 3.3.2 28 - Ghi lại sắc ký đồ và xác định diện tích peak trung bình của mỗi mẫu. Dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 vẽ đồ thị biểu diễn và thiết lập phương trình hồi quy của diện tích pic theo nồng độ. Yêu cầu: Hệ số tương quan (r) phải ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995). Trường hợp r < 0,997 phải có sự giải thích phù hợp. 3.3.3.5. Độ chính xác Độ chính xác của phương pháp thể hiện ở độ lặp lại và độ chính xác trung gian.  Độ lặp lại của phép đo Đô ̣lăp̣ laị của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp lại 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin (có nồng độ nằm trong khoảng tuyến tính) vào hệ thống sắc ký với điều kiện tối ưu đã được khảo sát ở mục 3.3.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký S peak và thời gian lưu tR.  Yêu cầu: Với phép thử định lượng: Giá trị RSD ≤ 2,0%. Các trường hợp giá trị RSD trên 2%, cần phải có sự giải thích phù hợp.  Độ chính xác trung gian Tiến hành như độ lặp lại và làm trong 3 ngày khác nhau cùng với điều kiện và người thực hiện. Yêu cầu: Gía trị RSD từ 6 mẫu chuẩn trong một ngày và 6 mẫu chuẩn trong ngày khác đều có RSD ≤ 2,0%. 3.3.3.6. Độ đúng (tỷ lệ hồi phục %) Thực hiện ở ba mức nồng độ 80%, 100% và 120% của nồng độ đo. Mỗi mức pha ba dung dịch, mỗi dung dịch tiến hành sắc ký một lần. Tính diện tích peak và dựa vào phương trình hồi quy suy ra nồng độ tìm thấy. So với nồng độ khi pha sẽ tính ra tỷ lệ phục hồi. Xác định độ đúng của phương pháp theo công thức tính tỷ lệ phục hồi: % 100t s M R M   Trong đó: - Ms: Nồng độ khi pha (g/ml) - Mt: Nồng độ tìm thấy (g/ml) từ phương trình hồi quy của đường tuyến tính Yêu cầu: - Tỷ lệ thu hồi ở mỗi mức nồng độ: 98,0% – 102% cho quy trình phân tích định lượng. 29 - RSD tỷ lệ phục hồi ở mỗi mức nồng độ phải ≤ 2,0 % ở mỗi mức nồng độ Trường hợp nằm ngoài khoảng này, phải có sự giải thích phù hợp. 3.3.4. Phương pháp xử lý và đánh giá kết quả Theo lý thuyết sắc ký lỏng, trong một điều kiện sắc ký xác định đã chọn, thì thời gian lưu của chất là đại lượng đặc trưng để định tính (phát hiện) các chất. Còn chiều cao và diện tích peak sắc ký có liên quan chặt chẽ đến nồng độ của chất. Trong một vùng nồng độ nhất định và không lớn, thì chúng ta có mối quan hệ tuyến tính như sau: Hi = k1 . Ci = f(C) (1) Si = k2 . Ci = f(C) (2) Trong đó: Hi và Si là chiều cao và diện tích của peak sắc ký của cấu tử i. Ci là nồng độ của cấu tử i với thời gian lưu tRi. k1, k2 là các hằng số thực nghiệm phụ thuộc vào các điều kiện sắc ký cũng như bản chất pha tĩnh. Dựa trên (1) và (2) ta có thể xác định nồng độ các chất phân tích theo phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn. Giá trị trung bình: 1 1 n i i x x n    Độ lệch chuẩn:   2 1 1 1 n i x x SD n      Độ lệch chuẩn tương đối:  % .100 s RSD x  30 Chương 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. CHUẨN BỊ MẪU NGHIÊN CỨU VÀ LỰA CHỌN ĐIỀU KIỆN SẮC KÝ 4.1.1. Chuẩn bị dung dịch  Chuẩn bị dung môi pha mẫu Các chất được khảo sát đều tan tốt trong acetonitril nên tôi lựa chọn dung môi pha mẫu là acetonitril và đây cũng là thành phần chính trong pha động.  Chuẩn bị dung dịch gốc và dung dịch mẫu chuẩn Dung dịch mẫu chuẩn gốc: - Cân chính xác lượng chất chuẩn tương ứng với 10 mg, cho vào bình định mức 25 ml. - Thêm khoảng 10 ml acetonitril, đánh siêu âm 10 phút, để nguội, thêm acetonitril đến vạch, lắc kĩ. Làm đồng thời với cả hai chất chuẩn imidacloprid và azoxystrobin. Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 400 ppm. - Dung dịch này được pha loãng tới nồng độ thích hợp để khảo sát và xây dựng dãy dung dịch chuẩn. Dung dịch mẫu chuẩn đơn: - Hút chính xác 6 ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức dung tích 50 ml, thêm acetonitrile tới vạch và lắc kĩ. - Dung dịch thu được đem lọc qua màng 0,45 µm trước khi đem chạy sắc ký. Dung dịch chuẩn đơn này có nồng độ chất chuẩn 50 ppm. - Làm đồng thời với imidacloprid và azoxystrobin. Dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp: - Hút 1 ml dung dịch chuân gốc imidacloprid và hút 5 ml dung dịch chuẩn gốc azoxystrobin vào bình định mức dung tích 50 ml. - Thêm acetonitril tới vạch và lắc kĩ. - Lọc qua màng lọc 0,45 µm trước khi đem chạy sắc ký. Dung dịch thu được là hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin có nồng độ 50 ppm. 4.1.2 Khảo sát điều kiện phân tích sắc ký Sau khi tiến hành các thí nghiệm khảo sát theo mục 3.3.2, ta thu được kết quả như sau: 4.1.2.1. Đặt bước sóng cho detector Bước sóng λ của detector là một yếu tố quan trọng, ảnh hưởng đến độ nhạy của phương pháp. Vì thế ta phải nghiên cứu, khảo sát sao cho tín hiệu của chất phân tích tại bước sóng λ là tốt nhất. Tiến hành quét phổ ở nồng độ từ 200-400 nm có kết quả như hình sau: 31 Hình 4.1: Phổ hấp thụ của azoxystrobin và imidacloprid trong acetonitrile. Từ hình 4.1 cho thấy azoxystrobin có độ hấp thu cực đại tại bước sóng 207 nm, imidacloprid có hấp thụ cực đại tại bước sóng 270 nm. Hai phổ này có độ hấp thu giao nhau tại bước sóng 250 nm. Vì vậy tôi chọn bước sóng 250 nm để định lượng đồng thời hai chất này. 4.1.2.2. Khảo sát thành phần pha động Để khảo sát thành phần pha động, tiến hành chạy chương trình sắc kí như mục 3.3.2 đã trình bày với sự thay đổi thành phần pha động. Dung dịch chất chuẩn hỗn hợp của imidacloprid và azoxystrobin được pha loãng từ dung dịch gốc 400 ppm. Thành phần dung môi pha động được chọn để khảo sát là acetonitril và nước với các tỉ lệ thể tích khác nhau. Tiến hành khảo sát thành phần pha động như mục 3.3.2.4. Kết quả được thể hiện trong các hình như sau: nm. 200.00 250.00 300.00 350.00 400.00 A bs . 1.500 1.000 0.500 0.000 -0.500 imidacloprid azoxystrobin 32 Hình 4.2. Sắc ký đồ ACN/ Nước (90%:10%). Hình 4.3. Sắc ký đồ ACN/ Nước (95%:5%). 33 Hình 4.4. Sắc ký đồ ACN/ Nước (85%:15%) Hình 4.5. Sắc ký đồ ACN/ Nước (60%:40%). 34 Hình 4.6. Sắc ký đồ ACN/ Nước (55%:45%). Hình 4.7. Sắc ký đồ ACN/ Nước (50%:50%). Dựa vào hình 4.2; 3.3; 4.4; 4.5; 4.6; 4.7, ta thấy rằng thành phần pha động ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số lưu, hệ số tách và hệ số đối xứng của peak. Tỷ lệ ACN càng lớn (80%-95%) thì hai chất không tách nhau, cả hai peak càng dính nhau, pic không sắc nét, thời gian rửa giải lâu hơn. Ngược lại, tỷ lệ ACN càng thấp, hai peak tách nhau rõ ràng, peak đẹp, cân đối, hiện tượng kéo đuôi giảm dần. Ngoài ra khi tỷ lệ nước càng cao thì peak imidacloprid càng không đẹp, hệ số kéo đuôi tăng. Vì vậy ta chọn thành phần pha động là hỗn hợp dung môi ACN và nước cất có tỷ lệ gần bằng nhau (55%:45%) cho những nghiên cứu tiếp theo. 35 4.1.2.3 Khảo sát tốc độ dòng Sự ảnh hưởng của tốc độ dòng đến quá trình sắc ký được khảo sát bằng cách tiến hành chạy sắc kí hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin với các tốc độ khác nhau: o 0,5 ml/phút. o 0,8 ml/phút. o 1 ml /phút o 1,2 ml/phút o 1,5 ml/phút Các điều kiện còn lại của quá trình sắc kí không đổi, cụ thể như sau: - Cột tách: RP – 18, 5µm, 250 x 4,6 mm. - Thể tích vòng mẫu: 20 µl. - Nồng độ chất phân tích: 50 ppm - Detector UV-Vis: 250 nm. - Pha động: pha động đã khảo sát ở 3.3.2.4. Tiến hành khảo sát theo mục 3.3.2.5. Theo kết quả được khảo sát qua các lần tiêm ta thấy rằng, tốc độ dòng ảnh hưởng lớn đến thời gian lưu, hệ số tách. - Tốc độ dòng từ 0,6 – 0,8 ml/phút cho thấy thời gian lưu tăng dần, peak chưa đẹp và không có sự cân đối, tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần. - Tốc độ dòng 1 ml/phút cho thấy thời gian lưu giảm dần, peak rõ đẹp, hai peak tách nhau hoàn toàn, hệ số tách giảm dần, áp suất ổn định. - Tốc độ dòng lớn (> 1 ml/phút) sẽ làm hao tốn dung môi và tăng áp suất cột tách, nhưng tốc độ quá nhỏ sẽ kéo dài thời gian phân tích và làm doãng peak gây ra hiện tượng kéo đuôi.  Do đó, ta chọn tốc độ dòng là 1 ml/phút để tiến hành định lượng azoxystrobin và imidacloprid. 4.2. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ĐỒNG THỜI HAI CHẤT IMIDACLOPRID VÀ AZOXYSTROBIN 4.2.1. Thẩm định quy trình 4.2.1.1. Tính phù hơp hệ thống Pha dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid nồng độ 50 ppm. Tiến hành sắc ký lặp lại 6 lần. 36 Hình 4.8: Kết quả sắc kí đồ khảo sát tính phù hợp hệ thống Bảng 4.1. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống của imidacloprid Số lần tiêm mẫu tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs imi K’ N 1 3,954 626144 1,140 0,941 0,00 39194,789 2 3,949 634100 1,126 0,955 0,00 39100,101 3 3,969 638942 1,138 0,967 0,00 39103,700 4 3,947 642210 1,156 0,942 0,00 38679,280 5 3,974 643648 1,162 0,951 0,00 39004,980 6 3,960 660550 1,128 0,960 0,00 38243,829 Trung bình 3,957 640932 1,142 0,953 0,00 38887,780 %RSD 0,309 1,797 1,282 0,011 0,00 0,933 SD 0,012 11517 0,015 0,0101 0,00 362,722 37 Bảng 4.2. Kết quả khảo sát tính phù hợp hệ thống azoxystrobin Số lần tiêm mẫu tR (phút) Speak (µAU x giây) As Rs azo K’ N 1 12,058 1805578 1,013 2,012 2,056 76407,704 2 12,081 1814130 1,009 2,212 2,059 75540,833 3 12,165 1824734 1,007 2,411 2,065 75960,530 4 12,072 1832351 1,021 2,254 2,059 76049,748 5 12,215 1835474 1,014 2,211 2,074 76593,872 6 12,144 1828874 0,999 2,231 2,067 73276,171 Trung bình 12,122 1823524 1,010 1,889 2,063 75638,143 %RSD 0,513 0,631 0,731 21,12 0,315 1,605 SD 0,012 11498 0,0073 0,399 0.0065 1213,992 Kết quả ở hai bảng 4.1 và 4.2 cho thấy giá trị độ lệch chuẩn tương đối của thời gian lưu (tR), diện tích peak (S), số đĩa lý thuyết đều không quá 2%, hệ số đối xứng (AS) nằm trong khoảng 0,8-1,5, độ phân giải (RS) lớn hơn 1,5, nên khẳng định rằng hệ thống có tính phù hợp, có thể tiếp tục tiến hành những bước đánh giá tiếp theo với điều kiện sắc kí tương tự. 38 4.2.1.2 Tính đặc hiệu Hình 4.9: Sắc kí đồ đánh giá độ đặc hiệu với imidacloprid và azoxystrobin Kết quả khảo sát khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu chuẩn cho thấy: - Sắc ký đồ pha động và dung môi pha mẫu không xuất hiện pic nào tại thời gian lưu của imidacloprid và azoxystrobin trong trong sắc ký đồ của imidacloprid và sắc ký đồ của azoxystrobin. - Trong sắc ký đồ dung dịch chuẩn của hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin: Xuất hiện hai peak có thời gian lưu tương ứng với thời thời gian lưu của pic sắc ký đồ riêng của imidacloprid và pic azoxystrobin. Ngoài peak imidacloprid và azoxystrobin chỉ có 1 peak lạ có thời gian lưu ở 2,606 phút trong sắc kí đồ hỗn hợp chuẩn và sắc ký đồ riêng từng chất imidacloprid và azoxystrobin giống như peak xuất hiện trong sắc ký đồ mẫu trắng, chứng tỏ peak lạ này là của mẫu trắng. Peak imidacloprid và azoxystrobin tách nhau hoàn toàn. Kết quả khảo sát độ đặc hiệu trên mẫu tự tạo cho thấy: Đối với dung dịch chuẩn, trên sắc ký đồ xuất hiện hai peak imidacloprid và azoxystrobin rõ rang ở tại thời gian lưu 3,959 phút và 12,210 phút. - Đối với sắc ký đồ trên mẫu trắng, trên sắc ký đồ không có peak nào xuất hiện 39 tương ứng tại thời gian lưu của imidacloprid và azoxystrobin - Đối với mẫu giả định, sắc ký đồ cho hai peak tương ứng với peak của imidacloprid và azoxystrobin trên sắc ký đồ của dung dịch chuẩn về thời gian lưu. Từ kết quả trên, có thể khẳng định quy trình phân tích có tính đặc hiệu. 4.2.1.3. Xác định LOD và LOQ của thiết bị Trong một quy trình phân tích bất kỳ, giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) là hai thông số quan trọng. Để xác định LOD và LOQ của thiết bị, ta tiến hành như sau: pha loãng từ 5 – 7 lần mẫu chuẩn chứa hỗn hợp imdacloprid và azoxystrobin nồng độ 10 ppm và chuẩn bị một mẫu trắng (chứa dung môi pha động) Sau đó tiêm vào thiết bị HPLC. Đến khi nào chiều cao peak = 3 lần chiều cao đường nền thì lấy đó là LOD Hình 4.10: Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,048 ppm Hình 4.11. Hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin ở nồng độ 0,0048 ppm Kết quả từ hình 4.10 và 4.11 cho thấy khi nồng độ azoxystrobin là 0,048 ppm và imidacloprid là 0,0048 ppm thì chiều cao = 3 lần đường nền. Do đó: - LOD của azoxystrobin là 0,048 ppm 40 - LOD của imidacloprid là 0,0048 ppm. Từ đó suy ra: - LOQ của azoxystrobin = 10 3 LOD = 10 3 x 0,048 = 0,16 ppm. - LOQ của imidacloprid = 10 3 LOD = 10 3 x 0,0048 = 0,016 ppm. 4.2.1.4. Tính tuyến tính Khoảng tuyến tính của imidacloprid và azoxystrobin được khảo sát bằng cách pha một dãy dung dịch chuẩn khoảng từ 0,4-1,6 ppm có nồng độ tăng dần như sau: 0,4 ppm; 0,8 ppm; 1 ppm; 1,2 ppm; 1,6 ppm ứng với 40%, 80%, 100%, 120%, 160%. Tiến hành pha dãy chuẩn như sau: - Pha loãng dung dịch chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin gốc có nồng độ 2 ppm thành 50 ml có nồng độ 1,6 ppm: hút chính xác 40 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 50 ml, định mức bằng acetonitril cho đến vạch. - Pha dãy chuẩn từ dung dịch 1,6 ppm vừa thu được ở trên: hút chính xác Vx ml cho vào bình định mức 10 ml và định mức bằng acetonitril. Cụ thể như sau: Bảng 4.3: Cách pha loãng dung dịch mẫu chuẩn hỗn hợp imidacloprid và azoxystrobin trước khi tiêm vào hệ thống HPLC C(ppm) 0,4 0,8 1 1,2 1,6 Vx ml 2,5 5 6,25 7,5 10 Vacetonitrile Định mức đến vạch Sau đó, tiêm vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu đã khảo sát với chương trình sắc kí sau: - Cột tách: RP – 18, 250 x 4,6 mm, kích thước hạt 5µm - Pha động: kênh C: ACN 55%; kênh D: Nước: 45% - Tốc độ pha động: 1 ml/phút. - Detector UV-Vis: λ = 250 nm. - Thể tích vòng mẫu: 20 µl. Từ các giá trị diện tích pic S thu được, xây dựng phương trình hồi quy giữa diện tích pic S và nồng độ C của mỗi dãy chuẩn. Kết quả khảo sát khoảng tuyến tính được chỉ ra trong bàng, bảng, hình và hình, ghi giá trị và dùng phần mềm Microsoft Excel 2003 xây dựng đường hồi quy. 41 Bảng 4.4. Diện tích peak ứng với từng nồng độ imidacloprid trong dãy chuẩn Imidacloprid C (ppm) Speak 0,4 81789 0,8 152152 1 226200 1,2 291980 1,6 368627 Bảng 4.5. Diện tích peak ứng với từng nồng độ azoxystrobin trong dãy chuẩn azoxystrobin C (ppm) Speak 0,4 185609 0,8 357070 1 506195 1,2 670685 1,6 870305 42 Hình 4.12. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của imidacloprid Hình 4.13. Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc diện tích peak vào nồng độ của azoxystrobin Dựa vào kết quả khảo sát, ta có các phương trình hồi quy sau được biểu diễn trong hình 4.12, 4.13 và Bảng 4.4 và 4.5. 43 Bảng 4.6. Phương trình hồi quy của azoxystrobin và imidacloprid Chất phân tích Phương trình hồi quy Hệ số tương quan R2 Khoảng nồng độ tuyến tính (ppm) imidacloprid Y=74105x R2=0,9978 0,4-1,6 azoxystrobin Y=171865x R2=0,997 0,4-1,6 Nhận xét: Qua các kết quả phân tích và thống kê ta thấy, tỷ lệ diện tích peak sắc ký và nồng độ phụ thuộc tuyến tính với nhau một cách chặt chẽ với hệ số tương quan cao đạt yêu cầu ở mục 3.3.3.4. Khoảng nồng độ tuyến tính rộng đối với cả hai chất azoxystrobin và imidacloprid từ 0,4 – 1,6 ppm. Do đó, ta có thể sử dụng các phương pháp đường chuẩn hay thêm chuẩn để định lượng azoxystrobin và imidacloprid trong mẫu thử ở khoảng tuyến tính đã khảo sát. 4.2.1.5. Độ chính xác  Độ lặp lại của phép đo Độ lặp lại của hệ thống sắc ký được khảo sát bằng cách tiêm lặp 6 lần cùng một mẫu chuẩn hỗn hợp azoxystrobin và imidacloprid vào hệ thống HPLC với điều kiện tối ưu ở mục 3.3.2. Kết quả được đánh giá thông qua độ lệch chuẩn (SD), độ lệch chuẩn tương đối (RSD) của diện tích peak sắc ký Speak và thời gian lưu tR. Bảng 4.7. Độ lặp lại của hệ thống HPLC với mẫu azoxystrobin TT Thời gian lưu của azoxystrobin Diện tích peak của azoxystrobin Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê 1 12,081 Gía trị trung bình Xtb=12,162 Độ lệch chuẩn SD=0,088 Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%)=0,72% 6472807 Giá trị trung bình 2 12,077 6535964 Xtb=6495348.67 3 12,132 6475974 Độ lệch chuẩn 4 12,167 6419486 SD=60348.26 5 12,205 6475006 Độ lệch chuẩn tương đối 6 12,311 6592855 RSD(%)=0,92% 44 Bảng 4.8. Độ lặp lại của hệ thống HPLC đối với mẫu imidaclopid TT Thời gian lưu của imidacloprid Diện tích peak của imidacloprid Thời gian lưu Các thông số thống kê Diện tích Các thông số thống kê 1 3,959 Gía trị trung bình Xtb=3,959 Độ lệch chuẩn SD=0,0188 Độ lệch chuẩn tương đối RSD(%)=0,47% 2375675 Gía trị trung bình 2 3,964 2360311 Xtb=2383429,5 3 3,971 2339617 Độ lệch chuẩn 4 3,966 2375992 SD=34611,11 5 3,973 2419586 Độ lệch chuẩn tương đối 6 3,922 2429396 RSD(%)=1,45% Theo kết quả khảo sát ta thấy hệ thống sắc ký lỏng có độ lặp lại tốt. Đối với phép định lượng, độ lệch chuẩn tương đối của diện tích pic là 0,92 % và 1,45 % ứng với azoxystrobin và imidacloprid đạt yêu cầu mục 3.3.3.5. Quy trình phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thử.  Độ chính xác trung gian Bảng 4.9. Độ chính xác trung gian đối với mẫu imidacloprid Số lần đo Diện tích peak (μAU*giây) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Kết quả 1 2367836 2341037 2352453 2 2301897 2401004 2390451 3 2401211 2390312 2385421 4 2315012 2352789 2410207 5 2342202 2321107 2331652 6 2296789 2321775 2314473 Trung bình 2337491 2354671 2364109 2352090 RSD 1,75% 1,44% 1,57% 1,59% 45 Bảng 4.10. Độ chính xác trung gian đối với mẫu azoxystrobin Số lần đo Diện tích peak (μAU*giây) Ngày 1 Ngày 2 Ngày 3 Kết quả 1 6399178 6417754 6475441 2 6400153 6438765 6390435 3 6403347 6443221 6485421 4 6421182 6432119 6410379 5 6501122 6421277 6478553 6 6467781 6456423 6455763 Trung bình 6432127 6432927 6449332 6438128 RSD 0,66% 0,23% 0,61% 0,5% Kết quả thu được theo bảng 4.9 và bảng 4.10 cho thấy quy trình phân tích có độ chính xác cao (RSD của diện tích peak ≤ 2%). Nhận xét: quy trình định lượng đồng thời hai chất imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, miền giá trị rộng và độ chính xác cao, do đó quy trình phân tích ổn định và có thể áp dụng để phân tích mẫu thử. 4.2.1.6. Độ đúng Bảng 4.11. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với mẫu Imidacloprid Mức nồng độ đo (%) Imidacloprid Diện tích pic (µAU x giây) Nồng độ đo ở các mức (µg/ml) Nồng độ (µg/ml) tính từ phương trình hồi quy Tỷ lệ hồi phục % 80% 2050270 200 199,50 101,00 2082793 200 203,46 98,29 2054821 200 200,06 99,97 46 100% 2455806 250 248,79 101,00 2505612 250 254,83 98,12 2502276 250 254,13 98,25 120% 2927766 300 306.12 98,00 2865312 300 298,53 100,30 2887210 300 301,20 99,60 Bảng 4.12. Kết quả khảo sát độ đúng của phương pháp với azoxystrobin Mức nồng độ đo (%) Azoxystrobin Diện tích pic (µAU x giây) Nồng độ đo ở các mức (µg/ml) Nồng độ (µg/ml) tính từ phương trình hồi quy Tỷ lệ hồi phục % 80% 4860132 200 202,03 98,98 4788941 200 201,51 99,25 4888295 200 203,50 98,28 100% 5804669 250 250,52 99,79 5898400 250 259,31 98,41 5870421 250 253,89 98,46 120% 6779319 300 300,51 99,82 6698359 300 296,36 101,22 6700758 300 296,48 101,48 Nhận xét: tỷ lệ phục hồi ở 3 mức nồng độ trong bảng 4.9 và bảng 4.10 của imidacloprid và azoxystrobin nằm trong khoảng 98-102% nên phương pháp đạt yêu cầu về độ đúng.  Như vậy quy trình định lượng imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC có tính đặc hiệu, khoảng tuyến tính rộng, độ chính xác và độ đúng đạt yêu cầu. 47 4.3. THẢO LUẬN  Về phương pháp HPLC: Tuy có một số nhược điểm như trang thiết bị giá thành cao, dung môi hóa chất đắt tiền nhưng phương pháp HPLC có nhiều ưu điểm vượt trội hơn hẳn so với các phương pháp phân tích khác đặc biệt là khi có nhiều thành phần phân tích trong cùng một mẫu. Một số ưu điểm như: - Tính chọn lọc cao: tách riêng biệt chất cần phân tích khỏi các chất khác có trong cùng một mẫu cho kết quả có độ chính xác cao. - Có thể định tính, định lượng đồng thời nhiều thành phần trong hỗn hợp mà không cần tách riêng biệt các chất. - Tiết kiệm thời gian, dung môi, hóa chất và ít bị sai số. Vì vậy HPLC đã và đang được sử dụng phổ biến trên thế giới và cả ở Việt Nam. Trong dược điển các nước và cả ở Việt Nam phương pháp HPLC ngày càng được sử dụng nhiều. Do đó phương pháp đuợc trình bày ở đây có khả năng áp dụng rộng rãi trong thực tế.  Về quy trình định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC Quy trình đã xây dựng cho phép định lượng được đồng thời được cả hai hoạt chất imidacloprid và azoxystrobin. Bằng việc sử dụng chung một quy trình phân tích có thể định lượng được cả hai hóa chất bảo vệ thực vật trong rất nhiều các chế phẩm tương ứng đang lưu hành trên trị trường. Điều này giúp tiết kiệm được thời gian, công sức, dung môi hóa chất và chi phí. Imidacloprid và azoxystrobin là hai trong số các hóa chất bảo vệ thực vật được sử dụng nhiều trong nông, lâm nghiệp với xu hướng ngày càng tăng. Trong một số tài liệu tham khảo đã có định lượng đơn chất nhưng chưa có phương pháp định lượng đồng thời hỗn hợp hai chất này. Đặc biệt, trong DĐVN IV đã có chuyên luận nhưng còn ít về phương pháp định lượng các hoạt chất cũng như chế phẩm chứa hai hoạt chất này. Do đó quy trình định lượng mà tôi đã xây dựng có tính thực tế và ứng dụng cao, có thể áp dụng rộng rãi. 48 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1. KẾT LUẬN Kết quả đề tài “Định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC)” cho những kết luận sau: Chọn được điều kiện phù hợp để tách và xác định đồng thời imidacloprid và azoxystrobin trong một số chế phẩm thuốc hóa chất bảo vệ thực vật bằng máy sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV-Vis. Với điều kiện sắc ký: - Cột tách: RP – 18; 250 x4,6 mm; kích thước hạt 5 µm - Pha động: acetonitril: nước (55%:45%) - Tốc độ dòng: 1 ml/phút - Thể tích vòng mẫu: 20 µl - Bước sóng: 250 nm Với chương trình chạy như trên cho kết quả như sau: Các peak tách tốt, thời gian lưu ổn định và không có hiện tượng kéo đuôi. Qua các bước khảo sát thẩm định phương pháp cho thấy phương pháp đã xây dựng phuơng pháp có độ lặp lại với RSD diện tích peak của imidacloprid là 1,45% và RSD của diện tích peak của azoxystrobin là 0,92% và có độ chính xác trung gian cao với RSD ≤ 2%. Phương pháp có sự phụ thuộc tuyến tính của đáp ứng với nồng độ chất phân tích với hệ số tương quan hồi quy ≥ 0,997 (hay R2 ≥ 0,995) đạt yêu cầu định lượng. Độ đúng (độ phục hồi) nằm trong khoảng 98-102% nên quy trình đạt yêu cầu phân tích định lượng. Bảng 5.1: Giá trị LOD, LQD và khoảng tuyến tính cho 2 chất imidacloprid và azoxystrobin Tên chất imidacloprid azoxystrobin LOD (ppm) 0,0048 0,048 LOQ (ppm) 0,0016 0,016 Phương trình hồi quy Y=74105x Y=171865x Hệ số tương quan R2=0,9978 R2=0,997 Khoảng tuyến tính 0,4-1,6 0,4-1,6  Phương pháp có thể áp dụng dễ dàng với các phòng thí nghiệm, các cơ sở có trang bị máy sắc ký lỏng hiệu năng cao và nhân lực đủ trình độ vì các hóa chất, dung 49 môi dễ kiếm, quy trình làm đơn giản, dễ thực hiện. 5.2. ĐỀ XUẤT Như vậy, với kết quả thu được, ta thấy phương pháp HPLC có độ nhạy cao, độ lặp lại tốt, thích hợp cho việc định lượng đồng thời imidacloprid và azoxystrobin bằng phương pháp HPLC từ đó có thể xác định dư lượng của imdacloprid và azoxystrobin trong dược liệu. Ngoài ra cần phải thay đổi hai vấn đề sau:  Thay đổi tỷ lệ dung môi để rút ngắn thời gian và tránh làm hao tốn dung môi  Thay đổi một số dung môi khác hoặc kết hợp với hệ đệm để có hệ dung môi tối ưu hơn. Hi vọng những nghiên cứu trên có thể đóng góp phần nào vào việc ứng dụng phương pháp RP - HPLC nói riêng và phương pháp HPLC nói chung để xác định các hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu nhằm hạn chế sự tồn dư những chất này trong lương thực, thực phẩm và trong dược liệu để đảm bảo sức khỏe cho người dân tránh các bệnh do các hóa chất bảo vệ thực vật gây ra. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT 1. Bộ Y tế (2009), Hướng dẫn của ASEAN về thẩm định quy trình phân tích, Phụ lục 7 –Thông tư 22/2009/TT-BYT Quy định về đăng ký thuốc 2. Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ (2014). Thẩm định quy trình phân tích. Trường Đại học Y Dược Cần Thơ. 3. Đoàn Hạnh Dung (2014). Xác định dư lượng một số hóa chất bảo vệ thực vật trong dược liệu khô. Khóa luận tốt nghiệp dược sĩ. Trường Đại học Dược Hà Nội. 4. Lê Thị Hường Hoa (2013). Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện và xác định hàm lượng một số chất bị cấm sử dụng trong mỹ phẩm. Luận án tiến sĩ dược học, Trường Đại học