Khóa luận So sánh và chọn lọc các quy trình pcr phát hiện vi khuẩn corynebacterium diptheriae gây bệnh bạch hầu

HỌN LỌC CÁC QUY TRÌNH PCR PHÁT HIỆN VI KHUẨN CORYNEBACTERIUM DIPTHERIAE GÂY BỆNH BẠCH HẦU Ngành học: Công Nghệ Sinh Học Giảng viên hƣớng dẫn: THS.PHAN VĂN THÀNH BS.HỒ NGUYỄN LỘC THÙY Sinh viên thực hiện: NGUYỄN ĐỖ KHÁNH NHƢ MSSV: 1311100546 Lớp: 13DSH03 TP. Hồ Chí Minh, 2017 LỜI CAM ĐOAN Khóa luận tốt nghiệp là công trình nghiên cứu của bản thân tôi dƣới sự hƣớng dẫn khoa học của THS. Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy (Chuyên viên nghiên cứu phòng Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, viện Pasteur TP Hồ Chí Minh) Các số liệu, kết quả nêu trong khóa luận là trung thực và chƣa từng đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Tôi xin chịu trách nhiệm về khóa luận tốt nghiệp của mình. TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ i LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, con xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến ba mẹ, ngƣời đã nuôi nấng dạy dỗ con trong 22 năm qua, cảm ơn anh chị trong gia đình đã định hƣớng và ủng hộ con đƣờng học tập của em. Em xin cảm ơn Thạc sĩ Võ Thị Trang Đài, Thạc sĩ Phạm Thị Hoan đã tận tâm chỉ dạy và truyền đạt kiến thức cho em trong suốt quá trình thực hiện khóa luận. Đặc biệt, em xin gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất đến Thạc sĩ Phan Văn Thành và Bác sĩ Hồ Nguyễn Lộc Thùy ngƣời luôn nhiệt tình giúp đỡ em, luôn định hƣớng và cung cấp những kiến thức bổ ích cho chúng em, ngƣời trực tiếp hƣớng dẫn em thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp này. Đồng thời, xin cảm ơn đến chị Nguyễn Hoàng Vân Anh, anh Nguyễn Gia Kỳ, bạn Phạm Trần Diệu Huyền, Trƣơng Khánh Duy, Lê Thị Thùy Trang, Hồ Thị Thu Trang đã hổ trợ mình thực hiện tốt khóa luận tốt nghiệp, cảm ơn tất cả các bạn trên phòng thí nghiệm đã giúp đỡ mình trong suốt quá trình làm thí nghiệm. Em xin chân thành cảm ơn ! TP.HCM, ngày 26 tháng 07 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Đỗ Khánh Nhƣ ii MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT .................................................................................... v DANH MỤC HÌNH ẢNH ........................................................................................... vi DANH MỤC CÁC BẢNG ......................................................................................... vii Phần I: MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 Phần II: TỔNG QUAN TÀI LIỆU................................................................................. 3 2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu .................................................................................... 3 2.1.1 Tác nhân gây bệnh ......................................................................................... 3 2.1.2 Cơ chế gây bệnh ............................................................................................. 4 2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới ............................................................ 5 2.1.5 Biện pháp phòng bệnh ............................................................................... 8 2.2 Corynebacterium Diphtheriae ............................................................................ 10 2.2.1Hình thái và cấu trúc ..................................................................................... 10 2.2.2Tính chất nuôi cấy ......................................................................................... 11 2.2.3Đặc điểm sinh hóa ......................................................................................... 12 Phần III: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU ...................................... 16 3.1 Vật liệu nghiên cứu ............................................................................................. 16 3.1.1Dụng cụ cần thiết .......................................................................................... 16 3.1.3 Đối tượng nghiên cứu ................................................................................... 18 3.2 Phương pháp nghiên cứu .................................................................................... 19 3.2.3 Khảo sát nồng độ của mồi trong phản ứng Real time PCR ......................... 21 3.2.4 Khảo sát nồng độ của mẫu dò trong phản ứng Realtime PCR .................... 22 3.2.5 Khảo sát độ nhạy ( ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng Realtime PCR . 22 3.2.6 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR và Realtime PCR ................... 23 PHẦN IV: KẾT QUẢ .................................................................................................. 24 4.1 Khảo sát độ nhạy (ngưỡng phát hiện dưới) của phản ứng PCR: ...................... 24 4.2 Khảo sát độ đặc hiệu của phản ứng PCR: ........................................................ 25 4.3 Khảo sát nồng độ mồi trong phản ứng Realtime PCR ....................................... 26 4.4 Khảo sát nồng độ mẫu dò quy trình Realtime PCR ............................................ 27 4.5 Khảo sát độ đặc hiệu quy trình Realtime PCR ................................................... 27 iii 4.6 Khảo sát độ nhạy quy trình Realtime PCR ......................................................... 28 PHẦN V: KẾT LUẬN ................................................................................................ 31 Phần VI: TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................ 32 PHẦN VII: PHỤ LỤC ................................................................................................. 34 iv DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT AE Elution buffer AL Lysis buffer AW1 Wash buffer 1 AW2 Wash buffer 2 DNA Deoxyribose Nucleic Acid EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtBr Ethidium Bromide PCR Polymerase Chain Reaction RT-PCR Real Time - Polymerase Chain Reaction TBE Tris-Borate EDTA µL Microlitter µM Micromole v DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái) ................................................................................................................... 11 Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 ....... 14 Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 ....... 15 Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới ..................................................... 15 Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015........................ 16 Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dƣơngC.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI) ................................. 18 Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public health image library-PHLI) ....................................................................................... 18 Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI) ........... 19 Hình 2.8: Thử nghiệm Elek ...................................................................................... 21 Hình 4.1: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi DT1, DT2 .................................................................................................................. 32 Hình 4.2: Kết quả điện di sản phẩm PCR, quy trình sử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 không bổ sung MgCl2 ................................................................................................................................................ 32 Hình 4.3: Kết quả điện di độ nhạy của mồi trong phản ứng PCR xử dụng cặp mồi Tox1, Tox2 có bổ sung MgCl2 ........................................................................................................................... 33 Hình 4.4, 4.5, 4.6: Kết quả điện di trên gel, thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu cuả mồi DT1, DT2 .................................................................................................................. 33 Hình 4.8: Kết quả khảo sát nồng độ mồi trong Realtime PCR ................................ 34 Hình 4.9: Kết quả khảo sát nồng độ mẫu dò trong Realtime PCR .......................... 35 Hình 4.10: Kết quả khảo sát độ đặc hiệu. trong Realtime PCR ............................... 35 Hình 4.11: Kết quả khảo sát độ nhạy trong Realtime PCR ...................................... 36 Hình 4.12: Kết quả chạy Realtime-PCR trên mẫu. trong Realtime PCR ................ 36 vi DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu ................... 19 Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype ...................................................... 20 Bảng 3.1: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng PCR ........... 25 Bảng 3.2: Các cặp mồi và đầu dò đƣợc dùng để thực hiện phản ứng Realtime PCR ................................................................................................................................. 26 Bảng 3.3: Các chủng vi khuẩn trong thí nghiệm kiểm tra độ đặc hiệu .................. 26 Bảng 3.4: Thành phần phản ứng cho cặp mồi DT1, DT2 ...................................... 28 Bảng 3.5: Thành phần phản ứng cho cặp mồi Tox1, Tox2 .................................... 28 Bảng 3.6: Chu trình nhiệt cho cặp mồi DT1, DT2 ................................................. 29 Bảng 3.7: Chu trình nhiệt cho cặp mồi Tox1, Tox2 ............................................... 29 Bảng 3.8: Chu trính nhiệt của phản ứng Realtime PCR ......................................... 30 Bảng 3.9: Thành phẩn phản ứng của phản ứng Realtime PCR .............................. 30 Bảng 4.1: Kết quả chạy trên 39 mẫu ..................................................................... 37 vii CHƢƠNG 1: MỞ ĐẦU Bệnh bạch hầu do khuẩn C. Diphtheriae gây ra. Biểu hiện lâm sàng thông thƣờng nhất là nhiễm trùng khu trú ở niêm mạc hô hấp, với đặc điểm là màng giả xuất hiện ở nơi nhiễm trùng. Một số vi trùng có thể tạo ra độc tố, do đó nếu nhiễm độc tố, bệnh có thể diễn tiến nặng với nhiều biến chứng nhƣ viêm cơ tim, viêm dây thần kinh, viêm thận... trong đó biến chứng tim gây tử vong rất cao. Trong thế chiến thứ II ở Na Uy, chỉ trong vòng 2 năm sau khi Đức xâm lƣợc số trƣờng hợp nhiễm bệnh tăng lên đến 50000 ca [3]. Ở Việt Nam, thời kỳ chƣa thực hiện tiêm vắc xin bạch hầu trong Chƣơng trình tiêm chủng mở rộng (TCMR) thì bệnh bạch hầu thƣờng xảy ra và gây dịch ở hầu hết các tỉnh, đặc biệt là ở các thành phố có mật độ dân cƣ cao. Do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm 2000. Nhƣng đến năm 2015 ở tỉnh Quảng Nam dịch lại xuất hiện, phát hiện 2 ca dƣơng tính với vi khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 trong vụ dịch Bình Phƣớc phát hiện 5 ca trong đó có 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn [15]. Phƣơng pháp nuôi cấy đang là “ Tiêu chuẩn vàng” trong phòng thí nghiệm tuy nhiên phƣơng pháp này tốn nhiều thời gian do không phải lúc nào các sinh vật sống cũng còn trong mẫu bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển và bảo quản mẫu. Để phân biệt các chủng bạch hầu sinh độc tố và không sinh độc tố bằng các phƣơng pháp nuôi cấy truyền thống là rất khó, vì C.diphtheriae và C.ulcerans giống nhau đến 95% axit amin và nucleotic . Thử nghiệm Elek cũng là một trong những phƣơng pháp phát hiện đƣợc độc tố bạch hầu. Nhƣng vì tình hình bệnh ngày càng ít đi và các sinh hóa phẩm dùng cho thử nghiệm này chỉ sử dụng riêng biệt mà lại không tận dụng đƣợc nhiều nên thử nghiệm này hiện nay ít đƣợc dùng đến hơn [13]. Sự phát triển của sinh học phân tử - phƣơng pháp PCR giúp ích rất nhiều trong việc nghiên cứu, chữa trị cũng nhƣ kiểm soát bệnh bạch hầu. Ƣu điểm của phƣơng pháp PCR là có thể phát hiện chính xác chủng bạch hầu sinh độc tố chỉ trong thời gian ngắn, độ đặc hiệu cao. Để đáp ứng nhanh nhu cầu phát hiện, chẩn đoán và chữa trị, Real time – PCR ra đời rút ngắn hơn nữa thời gian xét nghiệm bệnh do chỉ thực 1 hiện một phản ứng cho ra kết quả chính xác vi khuẩn gây bệnh và loại bỏ đƣợc bƣớc điện di sản phẩm của PCR chuẩn. Realtime-PCR sử dụng mẫu dò giúp đọc đƣợc kết quả chính xác ngay sau khi phản ứng kết thúc. Trên cơ sở đó, đề tài “ So sánh và chọn lọc các quy trình PCR phát hiện vi khuẩn C.diphtheriae gây bệnh bạch hầu ” đƣợc thực hiện nhằm khảo sát chọn lọc ra phƣơng pháp PCR phù hợp với điều kiện nghiên cứu của phòng xét nghiệm Vi khuẩn hô hấp, khoa Vi sinh miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh. 2 CHƢƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Sơ lược về bệnh Bạch hầu Hình 1.1: Theodor Albrecht Edwin Klebs1883 (bên phải), Friedrich Loeffler1884 (bên trái) 2.1.1 Tác nhân gây bệnh Tác nhân gây bệnh C. diphtheriae, đƣợc Klebs tìm thấy và Loeffler phân lập. C. diphtheriae là trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, không có vỏ, không có lông và không có nha bào, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ 1-8µm, có những hạt nhiễm sắc khi nhuộm bằng phƣơng pháp đặt biệt nhƣ Albert hoặc Neisser.Vi khuẩn dễ dàng mọc trên huyết thanh đông, mọc thành những khuẩn lạc sau 12- 18 giờ, vƣợt nhanh sự phát triển của các loại vi khuẩn kèm theo. Dựa trên hình thái học của cụm vi trùng trên thạch tellurite, dựa vào phản ứng lên men và khả năng tán huyết, vi khuẩn Bạch hầu đƣợc chia làm 4 biotype: mitis, intermedius, gravis và belfanti [1]. 3 Sức đề kháng của vi khuẩn ở ngoài cơ thể rất lớn. Trên các đồ vật, trực khuẩn bạch hầu sống vài ngày, trong những điều kiện thuận lợi (đƣợc chất nhày trong họng bảo vệ) vi khuẩn sống đƣợc vài tuần. Trên đồ vải vi khuẩn sống đƣợc 40-50 ngày,trên cát sống đƣợc đến 100 ngày, trên các đồ chơi bằng gỗ chúng sống đƣợc 3 tháng, trên quản bút mà học sinh ngậm vào miệng đã phát hiện thấy trực khuẩn bạch hầu sau 15 ngày [1]. Tác nhân gây bệnh bạch hầu rất nhạy cảm với bất kì yếu tố hóa lý nào, ánh sáng mặt trời giết chúng sau vài giờ, ánh sáng khuếch tán giết trong vài ngày. Ở nhiệt độ 60oC chúng chết sau 10 phút, dƣới tác dụng của dung dịch clorua thủy ngân 1% hoặc phenol 5% chúng chết sau 1 phút [1]. 2.1.2 Cơ chế gây bệnh Ngƣời là nguồn bệnh duy nhất của vi khuẩn Bạch hầu. Bệnh lây lan chủ yếu qua tiếp xúc thân mật giữa bệnh nhân hoặc ngƣời mang vi trùng qua các chất tiết đƣờng hô hấp hoặc qua các chất dịch ở sang thƣơng ngoài da có chứa vi trùng gây bệnh, và trong rất ít trƣờng hợp bệnh có thể lây qua đồ chơi của trẻ em [4]. Cơ chế gây bệnh của vi khuẩn phụ thuộc khả năng xâm nhập vào hệ thống đƣờng hô hấp trên hoặc qua da và khả năng sinh ngoại độc tố bạch hầu. Trong đó khả năng sinh ngoại độc tố đóng vai trò quan trọng trong quá trình gây bệnh [4]. Tại họng, độc tố vi khuẩn giải phóng gây phản ứng viêm nhiễm dẫn đến hình thành các giả mạc. Các giả mạc bao gồm khối sợi huyết, bạch cầu, hồng cầu, các tế bào biểu mô bị hoại tử ở đƣờng hô hấp và vi khuẩn. Giả mạc có thể ở tại chỗ (amidan, họng, mũi) hoặc lan rộng xuống thanh, khí phế quản gây tắc nghẽn khí đạo, phù nề mô mềm. Màng giả gây bít tắc chính là nguyên nhân thƣờng gây tử vong nhất ở ngƣời lớn và trẻ em. Hiện tƣợng mang vi trùng ở vùng cổ họng là nguồn truyền lây nhiễm quan trọng để duy trì và lan truyền bệnh trong cộng đồng [5]. 4 Độc tố ức chế quá trình tổng hợp protein của tế bào chủ, gây ảnh hƣởng lên tất cả toàn tế bào cơ thể nhƣng tác động chủ yếu trên cơ tim, trên thần kinh và trên thận. Liều độc tố nhỏ hơn 0.1mg/kg có thể gây chết với các động vật nhạy cảm [5]. 2.1.3Tình hình bệnh bạch hầu trên thế giới Theo một số tác giả Mỹ (Youmans và cộng sự 1975) bệnh thƣờng xảy ra ở phía nam Hoa Kỳ, tại đây số đông ngƣời dân sống trong điều kiện thiếu vệ sinh và cơ sở vật chất. Môi trƣờng sống không đủ vệ sinh tạo điều kiện thuận lợi cho các bệnh về hô hấp phát triển, ngƣời dân đa phần không đƣợc dùng vắc xin. Bệnh cũng thƣờng xảy ra ở nơi có khí hậu ẩm ƣớt dễ dàng cho sự phát triển bạch hầu da [3]. Thời kỳ tiền vắc xin, bạch hầu là một căn bệnh giết ngƣời hàng đầu trên thế giới. Trong những năm 1940-1950, việc áp dụng phổ cập tiêm chủng cho trẻ em ở trẻ sơ sinh đã đƣợc loại bỏ hầu hết các bệnh bạch hầu ở đa số các nƣớc công nghiệp hóa. Ở các nƣớc đang phát triển, mức tiêm chủng cao của trẻ sơ sinh với ba liều vắc xin bệnh đậu mùa - bạch hầu (DTP) đã đạt đƣợc sau khi thực hiện Chƣơng trình Mở rộng Chƣơng trình Tiêm chủng Tổ chức Y tế Thế giới (WHO) vào những năm 1970 [12]. Tại Belarus, Estonia, Latvia, Lithuania, Nga và Ukraine, tỷ lệ mắc bệnh bạch hầu ở ngƣời nhỏ hơn 15 tuổi dao động từ 64% đến 82%. Ngƣời lớn 40-49 tuổi có tỷ lệ mắc bệnh và tử vong rất cao, ở một số quốc gia, nhóm tuổi này chiếm gần một nửa số ngƣời chết. Trẻ em và thanh thiếu niên ở độ tuổi đi học cũng có tỷ lệ mắc bệnh cao, đặc biệt là ở Liên bang Nga. Tuy nhiên, những nhóm tuổi này có tỉ lệ tử vong thấp, số bệnh nhân tử vong xảy ra chủ yếu ở trẻ em không đƣợc tiêm vắc xin đầy đủ. Tại Moldova, các nƣớc thuộc khu vực Caucasus (Armenia, Azerbaijan và Georgia), Trung Á (Kyrgyzstan, Tajikistan, Turkmenistan và Uzbekistan) và Kazakhstan, tỷ lệ ngƣời lớn bị bệnh dao động từ 38% đến 59% [12]. 5 Năm 1990, dịch bệnh bạch hầu đã tái hiện ở Liên Bang Nga, phần lớn là ở ngƣời lớn. Trong giai đoạn 1991-1993, đại dịch lan rộng nhanh chóng, vào cuối năm 1994, do sự bất cập trong các biện pháp y tế cộng đồng, tất cả các Quốc gia Mới độc lập (NIS) và các quốc gia Baltic của Liên bang Cộng hòa Xã hội Chủ nghĩa Liên Xô (Liên Xô cũ) đều xảy ra dịch. Dịch bệnh đạt đỉnh điểm vào năm 1994-1995, với tỷ lệ hàng năm là 17 ca / 100.000 dân và tỷ lệ mắc bệnh cao nhất là 73 ca / 100.000 dân ở Tajikistan năm 1995. Từ năm 1990 đến năm 1998, 1157.000 trƣờng hợp và 5000 trƣờng hợp tử vong đƣợc công bố ở các quốc gia thuộc Liên Xô cũ, chiếm 180% số ca tử vong do bệnh bạch hầu ở ngƣời. Ba phần tƣ các trƣờng hợp đƣợc công bố từ Liên bang Nga. Đây là vụ dịch bệnh bạch hầu lớn nhất kể từ những năm 1950, bắt đầu thời kỳ tiêm chủng bạch hầu mở rộng [12]. Từ năm 1980 đến năm 2011 ở Mỹ đã xảy ra 55 ca. Năm 1990 dịch xảy ra ở Liên xô cũ gây tổn thất nghiêm trọng về ngƣời. Năm 1994 bệnh xảy ra ở 15 quốc gia độc lập từ Liên Xô có 157.000 ca mắc và hơn 5,000 ca tử vong, nguyên nhân dẫn đến hậu quả này là do điều kiện sống của ngƣời dân không đƣợc bảo đảm, vắc xin chƣa đƣợc phổ cập rộng rãi [12]. Diphtheria - United States 1940-1980 Hình 2.1: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1940-1980 6 Hình 2.2: Số liệu thống kê tình hình bệnh Bạch hầu ở Mỹ từ năm 1980-2010 ( . Hình 2.3: Tình hình bệnh Bạch hầu trên thế giới. 7 2.1.4 Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam Trƣớc khi có chƣơng trình tiêm chủng, bệnh bạch hầu là bệnh của trẻ em, thỉnh thoảng gây dịch lẻ tẻ, do thực hiện tốt việc tiêm vắc xin bạch hầu nên tỷ lệ mắc bạch hầu ở Việt Nam đã giảm dần từ 3,95/100.000 dân năm 1985 xuống 0,14/100.000 dân năm 2000 [15]. Đến năm 2015 bạch hầu lại xuất hiện ở Quảng Nam trong đó phát hiện hai ca dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae. Năm 2016 dịch xảy ra ở Bình Phƣớc 5 ca đƣợc xác định, 1 ca tiếp xúc dƣơng tính với khuẩn C.diphtheriae. 40 30 20 Số ca BH 10 Số ca 0 chết Hình 2.4: Tình hình bệnh bạch hầu ở Việt Nam từ năm 2005-2015 2.1.5 Biện pháp phòng bệnh Đối với ngƣời nhiễm bệnh: Bệnh xảy ra chủ yếu của trẻ nhỏ. Lứa tuổi càng tăng sự nhạy cảm với bệnh càng giảm. Bệnh có thể xảy ra ở mọi lứa tuổi nếu thiếu miễn dịch bạch hầu [3]. Nguy hiểm nhất là bệnh đe dọa các trẻ em nhỏ tuổi (từ 1 đến - 4 tuổi). Nhất thiết phải cách ly ở bệnh viện, ở cách li riêng biệt, khi xác định chuẩn đoán bằng xét nghiệm, nhân viên phải đeo khẩu trang, trang bị bảo hộ an toàn. Nếu điều trị sớm và đúng cách thì tỉ lệ tử vong rất thấp. Phải dùng 8 huyết thanh chống bạch hầu ngay từ ngày đầu tiên của bệnh (trƣớc ngày thứ 6). Những ngƣời mang vi khuẩn không sinh độc tố có thể trở lại tập thể và sinh hoạt nhƣ bình thƣờng. Bắt buộc phải khử trùng trong thời kì phát bệnh và thời kì khỏi bệnh, năng rửa cổ họng cho ngƣời bệnh. Trƣớc đây, ngƣời ta dùng nhiều loại thuốc (huyết thanh khô giải độc tố, trypallavis, sulfamide) nhƣng không mang lại kết quả tốt, trẻ em vẫn mang vi khuẩn hàng tháng. Hiện nay ngƣời ta dùng penicillin hoặc tyrotricin cho kết quả tốt hơn. Chất tyrotrixin không tan trong nƣớc, cho nên thƣờng dùng với nƣớc, trong glycerine hoặc trộn tyrotrixin bột với natri bitmutbazic [6]. Phải khử trùng buồng và đồ vật bằng cloramin 0.5% trong 1 giờ, khử trùng bát đũa bằng cloramin 1% và đồ vải bằng cloramin 5% trong một giờ rƣỡi.( Ramon, 1944). Đối với ngƣời tiếp xúc với ca bị nhiễm bệnh: Tất cả những ngƣời tiếp xúc với ngƣời bệnh đều phải xét nghiệm 2 lần cách nhau 2 ngày, lấy bệnh phẩm trƣớc khi dùng thuốc súc miệng. Nếu xét nghiệm có kết quả dƣơng tính (có trực khuẩn bạch hầu sinh độc tố) thì phải theo dõi ít nhất là 7 ngày kể từ khi đƣa ngƣời vào bệnh viện [6]. Tiêm ngừa phòng bệnh Phải tiêm chủng đúng độ tuổi quy định và tiêm mũi nhắc lại cho trẻ em. Ngày nay ngƣời ta tiêm giải độc tố bạch hầu hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – ho gà hoặc vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – thƣơng hàn, hay là vắc xin phối hợp bạch hầu – uốn ván – ho gà. Trong chƣơng trình tiêm chủng mở rộng, chúng ta sử dụng vắc xin tam liên DPT có kết quả rất tốt, đến năm 2000 tỷ lệ mắc chỉ còn 0.14/100000 dân. 9 2.2 Corynebacterium Diphtheriae Phân loại khoa học Giới (regnum) Bacteria Ngành (phylum) Actinobacteria Bộ (ordo) Actinomycetales Họ (familia) Corynebacteriaceae Chi (genus) Corynebacterium Loài (species) C. diphtheriae 2.2.1Hình thái và cấu trúc C.diphtheriae là trực khuẩn Gram dƣơng, đƣờng kính từ 0.3 -0.8µm, dài từ 1-8µm, mảnh , cong hoặc hình chùy, không di động, không sinh bào tử, không có vỏ, không có nha bào. Hình 2.5: Mô phỏng vi khuẩn Gram dƣơng C.diphtheriae khi dùng kĩ thuật nhuộm Xanh methylene. (Nguồn: public health image library-PHLI) Nhuộm Gram C.diphtheriae có hình trực khuẩn bắt màu Gram dƣơng, hình hơi cong, có một đầu nhỏ xếp thành hình chữ V, T, Y hay nhƣ hình hàng rào. Khi nhuộm Albert vi khuẩn có hình dài, thân bắt màu xanh nhạt, có 2-3 hạt màu đỏ tím, 2 đầu to hơn bắt màu xanh đậm. 10 Hình 2.6: Hình dạng vi khuẩn khi dùng kĩ thuật nhuộm Albert (Nguồn: public health image library-PHLI) 2.2.2Tính chất nuôi cấy Trực khuẩn Bạch hầu ƣa các môi trƣờng có máu, huyết thanh đông và pepton, thích hợp với pH trung tính hoặc hơi kiềm, nhiệt độ môi trƣờng là 370C vì vậy các môi trƣờng nuôi cấy và phân lập phải có đủ các điều kiện trên. Trên môi trƣờng thạch máu thƣờng, khuẩn lạc mọc sau sau 24h, nhỏ, màu trắng, có thể quan sát đƣợc tan huyết. Môi trƣờng chọn lọc cho C.diphtheriae là môi trƣờng thạch máu có tellurite ở 35-370C/24-48 giờ. Khuẩn lạc nhỏ li ti, bắt màu xám đen. C.diphtheriae mọc sau 12-18 giờ trên môi trƣờng huyết thanh đông Loffle, ở điều kiện 370C (một số vi khuẩn khác mọc chậm hơn). Khuẩn lạc nhỏ, trơn, hơi đục, đƣờng kính 1-2 mm, dễ tan trong nƣớc muối đẳng trƣơng Hình 2.7: Hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng BA (bên phải), hình dạng khuẩn lạc trên môi trƣờng HA (bên trái). (Nguồn: public health image library-PHLI) 11 2.2.3Đặc điểm sinh hóa Cần phân biệt bạch hầu với giả bạch hầu, dựa vào sự lên men hai loại đƣờng glucose và sacarose, khả năng làm tan hồng cầu cừu [5]. Bảng 2.1: Phản ứng sinh hóa của vi khuẩn bạch hầu và giả bạch hầu Chủng vi khuẩn Glucose Sacarose Tan hồng cầu cừu C.diptheriae + - +hoặc- C.hoffmanni + + - C.cutis - - - Bảng 2.2: Khả năng tan huyết của các biotype C.diphtheriae Tan máu tế bào Tan máu tế bào Tính chất lên men hồng cầu bò hồng cầu thỏ đƣờng Gravis - + + Intermedius - - - Mitis + + - 2.2.4 Độc tố vi khuẩn C.diphtheriae chủ yếu sinh ngoại độc tố, gồm có 2 phần: A là độc tố, B là phần gắn vào các thụ cảm trên tế bào. Sau khi B bám vào tế bào, quá trình phân giải protein xẩy ra giúp cho phần A xâm nhập vào tế bào, tại đó ức chế quá trình tổng hợp chuỗi acid amin của protein. Độc tố bạch hầu ức chế sự tổng hợp protein ở tất cả các tế bào có nhân điển hình bằng việc gắn ADP vào yếu tố kéo dài 2 (EF-2) làm cho các ribosom sẽ dịch xuống bộ ba tiếp theo để đọc mã trên RNA thông tin. Độc tố này đƣợc mã hóa bởi phage ly giải, phage này tích hợp vào trong DNA của vi khuẩn. Độc tố là một protein [6]. Các chủng vi khuẩn đều sinh độc tố (ngoại độc tố), có trọng lƣợng phân tử 62kDa. Việc sản sinh độc tố phụ thuộc vào sự có mặt của thực khuẩn thể gây ly giải mang gen mã hóa độc tố (tox +). Nó tác động lên tế bào vật chủ giải phóng gen độc tố và sản sinh độc tố. Sự sản sinh độc tố tăng khi cơ thể vật chủ thiếu yếu tố sắt. 12 Chủng vi khuẩn không có thể thực khuẩn sẽ không sản sinh độc tố do vậy không có khả năng gây bệnh. Chúng có thể trở thành chủng có độc tố khi bị nhiễm trùng với thể thực khuẩn có độc tố ly giải. Xác định độc tố vi khuẩn bằng cách tiêm truyền chuột lang, làm phản ứng trung hòa hoặc làm phản ứng Elek [5]. Thử nghiệm này dựa trên sự khuếch tán kép của độc tố bạch hầu và kháng độc tố trong môi trƣờng thạch. Giấy lọc vô trùng ngâm tẩm chất kháng độc tố bạch hầu đƣợc đặc trong môi trƣờng nuôi cấy. Cấy các chủng nghi bạch hầu theo đƣờng thẳng vuông góc 90 ° với dải kháng độc. Toxigenic C.diphtheriae đƣợc phát hiện bởi vì độc tố tiết ra từ khu vực tăng trƣởng, phản ứng với chất chống độc để tạo thành các dòng precipitin Hình 2.8: Thử nghiệm Elek Vi khuẩn nhạy cảm với penicillin nhƣng độc tố gây ra các triệu chứng lâm sàng không bị bất hoặt bởi kháng sinh. Điều trị và phòng bệnh đều phụ thuộc vào việc trung hòa độc tố. Nếu trên lâm sàng có triệu chứng của bạch hầu, cần dùng kháng độc tố. Bạch hầu là bệnh cấp tính, đòi hỏi xử lý sớm và nhanh kể trƣớc khi có xét nghiệm [6]. 13 2.3 Phương pháp PCR và Realtime PCR trong nghiên cứu phát hiện bệnh bạch hầu Phát hiện bệnh bạch hầu phụ thuộc vào việc nuôi cấy C.diphtheriae và thực hiện thử nghiệm Elek để xác định độc tính là chủ yếu. Tuy nhiên, do quá trình bảo quản và vận chuyển số lƣợng vi khuẩn còn sống không phải lúc nào cũng có trong mẫu bệnh phẩm hoặc thƣờng nằm dƣới mức giới hạn phát hiện. Do đó các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn phát hiện ra gen độc tố bạch hầu đang là phƣơng pháp phổ biến nhất trong việc chẩn đoán phân tử bệnh bạch hầu [8]. PCR chuẩn phát hiện đƣợc C.diphtheriae dù tỉ lệ còn sống của vi khuẩn trong bệnh phẩm sau quá trình vận chuyển là rất ít. Các nghiên cứu trƣớc đó không đánh giá độ nhạy của PCR, một thời gian sau đó họ mới bắt đầu đánh giá độ nhạy của phƣơng pháp này sau khi vận chuyển và lƣu trữ các mẫu lâm sàng trong silica gel một thời gian dài (7-14 tháng). Ở Indonesia một nghiên cứu cho thấy rằng khi bảo quản và vận chuyển mẫu bệnh phẩm trong túi silica gel, 11 trong số 17 bệnh nhân đƣợc chẩn đoán lâm sàng đã đƣợc chẩn đoán bằng bạch hầu cổ họng dƣơng tính với C.diphtheriae sau khi chúng đƣợc bảo quản ở nhiệt độ phòng trong 2 tuần [10]. Tỉ lệ tử vong do nhiễm trùng gây ra chủ yếu là do độc tố bạch hầu, vì vậy ngƣời dùng cặp mồi DT1 Fw 5’- CGGGGATGGTGCTTCGCG-3’, DT2 Rev 5’- CGCGATTGGAAGCGGGGT-3’ trong phản ứng PCR để phát hiện gen độc tố. Nhƣng độc tố bạch hầu ở C.ulcerans và C.diphtheriae giống nhau đến 95% ở nucleotide và acid amin nên PCR chuẩn phải lặp lại đến 2 lần để phân biệt đƣợc 2 chủng vi khuẩn này [14]. So sánh giới hạn phát hiện giữa Realtime PCR và các xét nghiệm PCR thƣờng, các thử nghiệm Realtime PCR phát hiện đƣợc các nồng độ DNA thấp hơn so với các xét nghiệm PCR tiêu chuẩn. Với sự xuất hiện của công nghệ khuếch đại gen dò huỳnh quang mới, phƣơng pháp này đã có thể cải thiện đáng kể hơn phƣơng pháp PCR chuẩn. Mƣời lăm DNA chiết xuất từ các mẫu bệnh phẩm đƣợc thu thập từ năm 1997 đến năm 1998, đƣợc lƣu trữ 14 ở -70 ° C kể từ thời điểm thu thập ban đầu (24 đến 36 tháng), đƣợc xác định là dƣơng tính theo PCR chuẩn (bốn là dƣơng tính yếu) Một hoặc cả hai tiểu đơn vị tox khi đƣợc kiểm tra tại thời điểm thu mẫu. Hai năm sau, trong nghiên cứu này, PCR chuẩn đƣợc lặp lại trên 15 chiết xuất này, và gen độc tố đƣợc phát hiện chỉ trong hai mẫu. Khi phân tích bằng Realtime PCR, 13 trong số 15 mẫu dƣơng tính đối với một hoặc cả hai tiểu đơn vị của gen độc tố [8]. Trong phƣơng pháp pha loãng Realtime PCR phát hiện thấy gen độc tố chỉ với 2 CFU nhạy hơn rất nhiều so với 1.500 CFU đƣợc phát hiện bởi PCR chuẩn. Bằng cách này, Realtime PCR có độ nhạy cảm gấp 10 lần so với các kết quả PCR truyền thống đƣợc báo cáo trong nghiên cứu của Nakao và Popovic [8]. Real time PCR cho phép xác định độc tính trong mẫu bệnh phẩm khi PCR tiêu chuẩn tỏ ra không thích hợp. Realtime PCR có độ nhạy cao hơn, cụ thể, nhanh chóng và làm giảm nhu cầu sử dụng PCR. Các nghiên cứu trƣơc chỉ ra rằng, mặc dù nhiều mẫu lâm sàng chỉ chứa một lƣợng nhỏ DNA nhƣng Realtime PCR có thể phát hiện đƣợc độc tố khi có tới hai đến ba bản sao của gen mục tiêu. Tuy nhiên, một lợi thế lớn của phƣơng pháp này là loại bỏ đƣợc bƣớc điện di, chụp hình kết quả điện di và dễ dàng đọc đƣợc kết quả sau khi phản ứng kết thúc. Realtime PCR là sự cải tiến đáng kể so với các xét nghiệm PCR chuẩn hiện có để phát hiện độc tố. Do đó có thể cung cấp những kiên thức dịch tễ học quan trọng để phát hiện nhanh chóng các trƣờng hợp nhiễm bệnh trong nƣớc và nhập cƣ cũng nhƣ kiểm soát đƣợc tình hình cấp bách của bệnh bạch hầu trên toàn thế giới [8]. 15 CHƢƠNG 3: PHƢƠNG PHÁP VÀ VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu nghiên cứu 3.1.1Dụng cụ cần thiết - Kính