Khóa luận Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus

ược gửi lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất tới thầy TS. Hà Viết Cường – Giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nơng nghiệp Việt Nam, Phĩ khoa Nơng học và Ths. Trần Thị Như Hoa - Phĩ giám đốc trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới đã trực tiếp hướng dẫn, tận tình chỉ bảo và tạo mọi điều kiện để tơi hồn thành báo cáo. Tơi xin gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới cán bộ cơng nhân viên thuộc Trung tâm nghiên cứu bệnh cây nhiệt đới – Trường Học viện nơng nghiệp Việt Nam, đã nhiệt tình giúp đỡ tơi trong suốt quá trình tơi thực tập tại Trung tâm. Đồng thời tơi cũng xin chân thành cảm ơn các Thầy giáo, Cơ giáo trong bộ mơn bệnh cây cũng như các Thầy cơ trong khoa Nơng học, Trường Học viện nơng nghiệp Việt Nam đã nhiệt tình dạy dỗ, chỉ bảo cho tơi trong suốt thời gian tơi học tập tại trường. Cuối cùng tơi xin được chân thành cảm ơn những người thân, gia đình, bạn bè đã hết lịng giúp đỡ, động viên tơi trong quá trình học tập cũng như hồn thành báo cáo này. Một lần nữa tơi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 31 tháng 7 năm 2014 Sinh viên Hà Văn Dũng MỤC LỤC DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT Ký hiệu Từ viết tắt A. tumefaciens Agrobacterium tumefaciens AS Acetosyringone ATP Adenosine triphosphate Bb Base pair CP Capsid protein CTAB Cetryl Ammonium Bromide ddNTP Dideoxynucleoside triphosphate DNA Deoxyribonucleic acid Dntp Deoxynucleoside triphosphate dsDNA Double strand DNA E.coli Escherichia coli EDTA Ethylene diamine tetra acetic acid ICTV International Committee on Taxonomy of Viruses IR Itergenic region Kb Kilo base LB Luria and Bertani ORF Open reading frame PCR Polymerase Chain Reaction RCA Rolling circle amplification RE Restriction enzyme Rep Replication protein RNA Ribonucleic acid Rnase Ribonuclease SDS Sodium Dodecyl Sulphate SsDNA Singe strand DNA TAE Tris – acetate – EDTA Taq Thermus aquatic Vir Virulence region β- ME Beta- Mercaptoethanol DANH MỤC BẢNG Bảng 3.4. Cây thí nghiệm 43 Bảng 3.3. Các mẫu ớt, cà tím thu thập (2013) 44 Bảng 3.1. Thang phân cấp bệnh 50 Bảng 3.6. Thí nghiệm lây nhiễm được thực hiện với các cơng thức 62 Bảng 4.1. Kết quả kiểm tra ELISA các mẫu ớt thu được tại Việt Nam giai đoạn 2012-2013 68 Bảng 4.2. Kết quả kiểm tra các mẫu ớt bằng PCR sử dụng cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1 71 Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giớng cà chua Hờng Lan (T20) 79 Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giớng ớt Hiểm Lai F1-207 80 Bảng 4.13. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A trên cây chỉ thị. 80 Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên giớng cà chua Hờng Lan (T20) 82 Bảng 5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên giớng ớt Hiểm Lai F1-207 82 Bảng 4.13. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên cây chỉ thị. 83 Bảng 7. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây cà tím nguồn bệnh 85 Bảng 8. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây ớt nguồn bệnh 85 Bảng 4.10. Cấp bệnh xoăn vàng lá của các giống ớt AVRDC 86 Bảng 4.3. Tĩm tắt các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm 88 Bảng 4.4. Hiệu quả xử lý sản phẩm RCA với các phương pháp chiết khác nhau 91 Bảng 4.5. Tối ưu hĩa điều kiện cho phản ứng cắt khơng hồn tồn sản phẩm RCA của PepYLCV 93 DANH MỤC HÌNH Hình 2.1. Hình thái của begomovirus 11 Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus 12 Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus 13 Hình 2.4. Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus 13 Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua 16 Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci 18 Hình 3.1. Sơ đồ tổ chức bộ gen DNA-A 28 Hình 4.32. Kết quả ELISA phát hiện ChiVMV 52 Hình 4.1. Triệu chứng của Begomovirus gây hại trên ớt tại Đà Nẵng 54 Hình 4.2. Kiểm tra PCR các mẫu đậu đỗ bằng cặp mồi cặp mồi BegoA – For1 và BegoA – Rev1 54 Bảng 4.1. Kết quả phục hồi 2 dịng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV 56 Hình 4.2. Dịng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV nuơi trong LB – lỏng 58 Hình4.6. Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mơ lá 60 Hình 4.3. Sơ đồ các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV sử dụng kỹ thuật RCA 70 Hình 4.4. Sơ đồ vector pCAMBIA2300 71 Hình 4.5.Điện di sản phẩm PCR kiểm tra plasmid sử dụng cặp mồi pCAMseqF1/R 72 Hình 4.11. Điện di sản phẩm khi mở vịng pCAMBIA 2300 bằng BamHI 72 Hình 4.8. Xử lý sản phẩm RCA mẫu VNP1500 bằng cách cắt hồn tồn với enzyme BamHI 10 u/µl 74 Hình 4.9.Cắt khơng triệt để sản phẩm RCA ở các điều kiện khác nhau 75 TĨM TẮT Trong nghiên cứu này chúng tơi tiến hành nghiên cứu tập trung chủ yếu về begomovirus đĩ là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV) gây bệnh xoăn vàng lá trên ớt và cà chua. Đánh giá đặc trưng sinh học bằng cách đánh giá tính gây bệnh thơng qua Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation), đờng thời chúng tơi tiến hành lây nhiễm PepYLCVNV thơng qua mơi giới truyền bệnh trung gian là bọ phấn.. Dựa trên mồi đặc hiệu và mồi chung, các phản ứng PCR đã được thực hiện trên một loạt các mẫu ớt thu tại miền Bắc và miền Trung Việt Nam nhằm phát hiện PepYLCV và begomovirrus khác. Lần đầu tiên phát hiện sự có mặt của begomovirrus trên ớt tại miền Bắc. Chúng tơi đã tiến hành xây dựng thành cơng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV, phân tích đặc trưng phân tử của của PepYLCVNV. ĐẶT VẤN ĐỀ Giới thiệu Chi Begomovirus là chi lớn nhất và quan trọng nhất trong họ Geminiviridae cả về số lượng lồi và bệnh do chúng gây ra với cây trồng. Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là tên gọi chung chỉ các virus thuộc chi Begomovirus cĩ phân virion (hạt virus) dạng hình cầu kép (hình chùy) và bộ gen DNA sợi vịng đơn, kích thước khoảng 2,7 kb, lan truyền trên đồng ruộng bằng bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn. Begomovirus cĩ thể cĩ bộ gen đơn (gồm một phân tử DNA-A) hoặc cĩ bộ gen kép (gồm hai phân tử DNA-A và DNA-B). Ở một số loại cây chỉ cần phân tử DNA-A đã gây triệu chứng điển hình, cịn ở một số loại cấy khác thì cần cĩ cả phân tử DNA-A và DNA-B mới gây ra triệu chứng bệnh. Begomovirus gây bệnh trên các loại cây đều cĩ các triệu chứng đặc trưng, điển hình là: cuốn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiễm sớm cịi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus chỉ cĩ thể được xác định dựa vào các phân tích phân tử Việt Nam được chứng minh là trung tâm đa dạng quan trọng của begomovirus. Mặc dù vậy số lượng begomovirus xác định trên thực vật của Việt Nam vẫn cịn ít chỉ gồm 19 lồi được phân lập từ nhiều lồi cây, trong đĩ cĩ nhiều cây dại. (Green, Tsai et al., 2001), (Ha, 2007). Trên cây họ cà, đã cĩ 6 begomovirus được phát hiện gây bệnh xoăn vàng lá cà chua tại Việt Nam. Tuy nhiên hiện vẫn chưa cĩ cơng bố nào cho thấy sự cĩ mặt của begomovirus trên ớt. Năm 2012, một loạt các mẫu ớt biểu hiện triệu chứng bệnh virus trên ớt đã được TTNC Bệnh cây Nhiệt đới (Trường ĐHNN Hà Nội) thu thập khắp cả nước. Các phân tích phân tử từ một mẫu virus phân lập đầu tiên từ ớt thu thập tại Đà Nẵng (mẫu VNP93) đã xác định được một lồi begomovirus mới và virus này được đặt tên là Pepper yellow leaf curl Vietnam virus (PepYLCVNV). Các nghiên cứu sơ bộ tại TT NCBC NĐ cũng cho thấy virus này cũng nhiễm tự nhiên cả trên cây cà chua bị bệnh xoăn vang lá. Việc lần đầu tiên phát hiện được một begomovirus gây hại tự nhiên trên ớt ở Việt Nam cĩ ý nghĩa quan trọng cả về mặt khoa học và thực tiễn vì cây cây ớt cũng như cây cà chua là các cây trồng quan trọng của Việt Nam. Do PepYLCVNV là một virus mới nên phân bố cũng như đặc điểm sinh học, đặc biệt là phổ ký chủ của virus vẫn chưa được nghiên cứu. Dựa trên cơ sở khoa học và thực tiễn trên, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “Phát hiện và đánh giá tính gây bệnh của Pepper yellow leaf curl Việt Nam virus” Mục tiêu và yêu cầu của đề tài Mục tiêu Xác định sự cĩ mặt của PepLCVNV trên các mẫu ớt và cà chua thu thập tại miền Bắc và đánh giá tính gây bệnh của virus. Yêu cầu Điều tra bệnh cuốn lá ớt tại một số điểm trồng ớt chính thuộc Hà Nội, Hưng Yên. Thu thập mẫu bệnh trên ớt với triệu chứng cuốn lá điển hình Phát hiện PepYLCVNV bằng PCR dùng mồi đặc hiệu trên các mẫu ớt và cà chua thu thập trong nghiên cứu này và thu thập từ trước. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kỹ thuật agroinoculation trên cà chua, ớt và một số cây chỉ thị Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng vector bọ phấn. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Tầm quan trọng của ớt và cà chua Cây ớt là mợt loại quả của cây cây thuợc chi Capsicum của họ Cà (Solanaceae). Ớt cĩ nguồn gốc từ châu Mỹ, ngày nay nĩ được trồng khắp nơi trên thế giới và được sử dụng làm gia vị, rau, và thuốc. Hiện nay, Ấn Đợ là nước sản xuất ớt lớn nhất thế giới với khoảng 1 triệu tấn mỗi năm, nơi chỉ riêng Chợ Guntur (lớn nhất châu Á) cĩ 1 triệu bao ớt. Ở Việt Nam, ớt là mợt gia vị thường xuyên có mặt trong các bữa ăn, ngoài ra ớt còn có rất nhiều cơng dụng như: cải thiện hệ tiêu hóa, giảm cân, chữa bệnh ung thư, ngừa tai biến mạch, tăng sức đề kháng. Cà chua (S.lycopersicum) cĩ nguồn gốc từ Nam Mỹ, nĩ được người Tây Ban Nha lan truyền tới Pilippine, Đơng Nam Á và tồn bộ Châu Á, cuối cùng là Châu Âu. Cà chua là lồi trái cây vườn phổ biến nhất ở Hoa Kỳ. Khoảng 150 triệu tấn cà chua đã được sản xuất ra trên Thế giới trong năm 2009. Trung Quốc là nước sản xuất cà chua lớn nhất, chiếm khoảng một phần tư sản lượng tồn cầu, tiếp theo là Hoa Kỳ và Ấn Độ. Các khu vực chế biến tại California chiếm 90% lượng sản xuất ở Mỹ và 35% lượng sản xuất thế giới (Hartz, Miyao et al., 1997). Cũng như ớt, ở nước ta cà chua là mợt gia vị hay có trong mỡi bữa ăn, bởi cà chua là mợt thực rất giàu : Nước (chiếm 93 đến 95 % ), giàu nguyên tố khống,và vitamine A, C, và E. Cà chua chín chứa nhiều sắc tố trong nhĩm của caroténọdes, như β-carotène cho một hoạt chất tiền vitamine A rất có lợi cho sức khỏe. Đặc điểm chung của Begomovirus Trong bốn chi của họ Geminiviradae, chi Begomovirus (được đặt tên từ Bean golden mosaic virus) là chi quan trọng nhất, cả về số lượng lồi (198 lồi vào năm 2010, website ICTV) cũng như các bệnh mà chúng gây ra trên cây trồng. Tất cả các begomovirus (tên gọi chỉ các virus thuộc chi Begomovirus) đều khơng truyền qua hạt giống nhưng lan truyền ngồi tự nhiên nhờ bọ phấn (Bemisia tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn (Fauquet and Stanley, 2005). Đặc điểm hình thái Đặc điểm hình thái chung của các Begomovirus đều cĩ cấu trúc phân tử (virion) tương tự nhau bao gồm 2 hình cầu 20 mặt (icosahedron), mỗi mặt là 1 tam giác đều với số đơn vị tam giác (T) trên mỗi mặt bằng 1, nối với nhau để tạo ra phân tử hình cầu đa diện kép (gemini). Do nối với nhau nên 2 hình cầu này khơng hồn thiện dẫn tới trên mỗi hình cầu chỉ cĩ 55 tiểu phần protein (protein vỏ) được xắp xếp thành 11 đơn vị hình thái, mỗi đơn vị gồm 5 tiểu phần protein (pentameric capsomer). Kết quả là tồn bộ phân tử cĩ 110 tiểu phần và 22 đơn vị hình thái (Gafni and Yedidya, 2003), (Zhang, Cheng et al., 2001). Hình 2.1 Hình thái của begomovirus (Nguồn ảnh: www.ncbi.nlm.nih.gov) Cấu trúc genome của Begomovirus Begomovirus là virus thực vật cĩ bộ gen DNA sợi vịng đơn cĩ kích thước khoảng 2,6- 2,8 kb. Chúng hoặc cĩ bộ gen kép (bipartite) gồm 2 phân tử DNA gọi là DNA-A và DNA-B hoặc cĩ bộ gen đơn (monopartite) tương đương DNA-A (Ha, 2007) Hình 2.2. Cấu trúc phân tử DNA-A, DNA-B của begomovirus (Nguồn ảnh: www.expasy.ch) Cấu trúc của phân tử DNA-A Cấu trúc của một DNA-A điển hình gồm 6 ORF (Open Reading Frame) được sắp xếp theo hai chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ (chiều virus) cĩ hai gen AV1 và AV2. Gen AV1(CP) mã hĩa vỏ protein cĩ chức năng chính là tạo vỏ phân tử virus, lan truyền Begomovirus qua vector, vận chuyển bộ gen virus vào và ra khỏi nhân tế bào ký chủ và vận chuyển bộ gen giữa các tế bào. Gen AV2 mã hĩa Protein cĩ chức năng cảm ứng triệu chứng, di chuyển hệ thống và tích lũy DNA của virus. Trên chiều ngược kim đồng hồ (chiều sợi tương đồng virus) gồm cĩ 4 ORF: AC1, AC2, AC3, AC4. Trong đĩ, gen AC1 mã hĩa protein tái sinh (Rep protein) cĩ chức năng chính là cắt- nối bộ gen virus trong quá trình tái sinh và tương tác với protein của ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC2 (TrAP- Transcriptional Activator Protein) mã hĩa Protein hoạt hĩa phiên mã cĩ chức năng ức chế phản ứng phịng thủ của cây. Gen AC3 mã hĩa protein tăng cường tái sinh (REn- Replication Enhancer) cĩ chức năng tương tác với prote ký chủ điều khiển chu kỳ tế bào. Gen AC4 mã hĩa protein cĩ chức năng liên quan tới phổ ký chủ, phát triển triệu chứng, ức chế hoạt động câm gen của tế bào ký chủ (Ha, 2007). Hình 2.3. Cấu trúc phân tử DNA-A của Begomovirus ( Cấu trúc của phân tử DNA-B. DNA-B của các Begomovirus kép chỉ chứa 2 ORF và cũng được sắp xếp theo 2 chiều ngược nhau. Trên chiều kim đồng hồ chứa gen BV1, trên chiều ngược kim đồng hồ chứa gen BC1. BV1 là một protein con thoi: (NSP- Nuclear shuttle protein) cĩ chức năng chính là vận chuyển bộ gen virus vào, ra khỏi nhân tế bào, tuy vậy nĩ khơng liên quan đến việc nhập nhân của virus trong lúc xâm nhiễm, chức năng này được kiểm sốt bởi CP. BC1 là một protein vận chuyển : (MP- Movement protein) cĩ chức năng vận chuyển bộ gen virus giữa các tế bào ký chủ. BV1 (NSP) DNA-B ~2.7kb CR CR=Common Region BC1 (MPB) Hình 2.4: Cấu trúc phân tử DNA-B của Begomovirus (Ha, Coombs et al., 2008). Đặc điểm của vùng IR Vùng IR (Intergenic region) là vùng liên gen khơng mã hĩa, nằm giữa 2 vùng gen mã hĩa ngược chiều nhau, cĩ cả trên DNA-A và DNA-B. Vùng này cĩ chứa nguồn gốc tái sinh (ori- origin of replication) gồm các chuỗi lặp đảo (iteron) cần thiết cho sự nhận biết và gắn kết protein Rep và 1 cấu trúc thân- thịng lọng (stem-loop) cĩ chứa chuỗi TAATATTAC giống nhau ở tất cả các begomovirus. Vị trí T7 – C8 của chuỗi này là nơi protein Rep cắt và nối bộ gen Begomovirus trong quá trình tái sinh. Đối với begomovirus cĩ bộ gen kép cĩ chứa 1 chuỗi bảo thủ cao (khoảng 150 nucleotide) giữa 2 phân tử gọi là vùng chung CR (Common Region). Vùng CR cĩ vai trị quan trọng trong quá trình tái sinh của DNA-B bởi chuỗi ori- nguồn gốc tái sinh nằm trên vùng này. Tuy nhiên, với số gen ít ỏi của mình, DNA-B khơng thể tự tái sinh trong tế bào ký chủ mà cần cĩ sự nhận biết và cắt- nối của protein Rep được mã hĩa trên DNA-A (Ha, 2008) Phân loại các Begomovirus Begomovirus được chia làm hai nhĩm chính là nhĩm Tân thế giới (New world) bao gồm Châu Mỹ và nhĩm Cựu thế giới (Old world) là khu vực Đơng bán cầu bao gồm châu Âu, châu Phi, châu Á (Padidam, Stanley et al., 1999), (Rybicki, 1994) Các begomovirus của hai nhĩm tân thế giới và cựu thế giới được phân biệt nhau bởi đặc điểm bộ gen. Tất cả các begomovirus ở cụm Tân thế giới đều cĩ bộ gen kép, trong khi đĩ các begomovirus ở cụm Cựu thế giới cĩ cả bộ gen đơn và kép, thêm vào đĩ tất cả các begomovirus của cụm Cựu thế giới cĩ thêm một gen AV2 trên DNA-A, gen này khơng tồn tại ở các virus của cụm Tân thế giới (Rybicki et al., 1994; Stanley et al., 2005). Begomovirus ở cụm Tân thế giới cĩ chuỗi PWRsmaGT ở đầu N trong vỏ protein (CP) mã hĩa bởi gen AV1, chuỗi này khơng cĩ mặt ở begomovirus của cụm Cựu thế giới (Harrison and Robinson, 2005) Rybicki (1994) dự đốn rằng bọ phấn di chuyển từ Châu Á sang châu Mỹ cĩ thể đã mang tổ tiên virus của cụm Tân thế giới mà chúng ta quan sát thấy ngày nay. Các virus này sau đĩ tiến hĩa theo một hướng khác với các virus ở cụm Cựu thế giới. Tái sinh của Begomovirus Begomovirus tái sinh theo cơ chế vịng lăn (rolling circular mechanism). Cơ chế vịng lăn cĩ thể được chia làm 2 pha và được thực hiện trong nhân tế bào ký chủ (Gutierrez, Ramirez-Parra et al., 2004), (Picĩ, Díez et al., 1996). Pha tổng hợp sợi DNA vịng đơn (bộ gen cĩ mặt trong phân tử virus) thành sợi DNA vịng kép khi bộ gen virus được chuyển vào nhân tế bào. Như vậy sợi kép sẽ gồm một sợi virus và một sợi tương đồng virus. Pha này vẫn chưa được hiểu rõ. (2) Pha tái sinh theo cơ chế vịng lăn: Protein Rep (sau khi được tổng hợp) sẽ cắt sợi virus tại chuỗi bảo tồn TATATTAC. Nhờ vật liệu cũng như enzyme DNA polymearase của tế bào, sợi virus được tổng hợp liên tục trên sợi tương đồng virus. Protein Rep lại tiếp tục cắt sợi virus mới được tổng hợp tại chuỗi TATATTAC (cũng vừa mới được tổng hơp) thành một sợi virus hồn chỉnh dưới dạng sợi đơn mạch thẳng. Protein Rep sau đĩ sẽ nối 2 đầu của mạch thẳng để tạo ra bộ gen virus sợi đơn mạch vịng hồn chỉnh. Triệu chứng bệnh do Begomovirus Do virus phải dựa hồn tồn vào vật chất của tế bào ký chủ để sinh sản, nên ở cây non và phần non của cây là nơi virus sinh sản rất mạnh. Ở các cây, tế bào già cỗi, quá trình này sẽ chậ m lại hay hầu như ngừng hẳn. Vì vậy điều kiện ngoại cảnh như: nhiệt độ quá cao, quá thấp, độ pH của mơi trường, ánh sáng, chế độ dinh dưỡng, chăm sĩc cũng cĩ ảnh hưởng đến quá trình biểu hiện triệu chứng của bệnh do các begomovirus. Tuy nhiên, thơng thường triệu chứng xuất hiện sau 2-4 tuần nhiễm bệnh và phát triển đầy đủ trong vịng 2 tháng (Pico et al., 1996). Một chất được nhiều nhà khoa học xác nhận cĩ bản chất protein tan là interferon cĩ thể đã được sản sinh ra ở tế bào ký chủ khi virus xâm nhập. Với nồng độ thấp khoảng một phần triệu gram đã cĩ khả năng ức chế sinh sản của virus. Chính vì những lý do trên bệnh virus khơng gây được tác hại huỷ diệt ngay mà thường gây thối hố. Sự huỷ diệt chỉ xảy ra khi điều kiện mơi trường và cây bệnh thuận lợi cho virus sinh sản và lây nhiễm, như trong các trận dịch của bệnh lúa vàng lụi ở nước ta những năm 1960. (Nguyễn Thị Hà Uyên, 2012) Triệu chứng sớm nhất là lá cong xuống dưới vào phía bên trong. Về sau, lá khơng cĩ hình dạng, nhỏ hẹp, biến vàng từ mép và chĩt lá lan vào giữa gân; lá cuốn cong lên phía trên thành hình thuyền; lá non biến vàng mạnh, giịn và nhỏ hẹp. Cuống lá cĩ thể xoắn vặn. Cây lùn cịi cọc, mọc nhiều cành nhánh nhỏ, đốt thân ngắn. Cây nhiễm sớm thường khơng ra quả do hoa bị rụng (Picĩ, Díez et al., 1996). Bệnh thường xuất hiện vào các vụ cĩ thời tiết nĩng như hè thu và xuân hè. Hình 2.5. Triệu chứng do Begomovirus gây ra trên ớt và cà chua (httpwww.avrdc.org) Mơi giới truyền bệnh và sự lan truyền Tất cả các begomovirus lan truyền ngồi tự nhiên nhờ bọ phấn (B. tabaci) theo kiểu bền vững tuần hồn (persistant- circulant). Bọ phấn Bemisa tabaci Gennadius (1989) thuợc họ rầy phấn (Aleyrodidae), bợ cánh đều (Homotera). Cho đến nay trên thế giới có hai loài bọ phấn được cơng nhận đó là: Bemisia tabaci và Bemisia argentifolii, loài Bemisia argentifolii được tìm thấy nhiều ở Hoa kỳ, Nhật, Pháp, Colombia, Israel, Ai Cập, Trung Quớc, Sự khác nhau giữa hai loài bọ phấn này là B. argentifolii ăn tạp, mắn đẻ hơn, gây rới loạn đợc tớ cho cây trờng. Theo Navot và cợng sự (1991), bọ phấn Bemisia tabaci hoàn thành mợt vòng đời khoảng 20 – 30 ngày ở điều kiện thích hợp. Trung bình có khoảng 11 – 15 lứa/năm. Bọ phấn phát triển mạnh trong điều kiện khơ và nóng, mưa nhiều làm giảm mật đợ bọ phấn, chúng thường chích hút và bay vào buởi sáng, buởi chiều mát. Để tránh ánh sáng mặt trời bọ phấn núp vào mặt dưới của lá, điều này phù hợp với phân bớ chủ yếu ở khí hậu nhiệt đới và cận nhiệt đới. Chưa cĩ bằng chứng chứng minh begomovirus nhân lên trong cơ thể bọ phấn. Bọ phấn dùng vịi chọc vào mơ mạch dẫn để hút dịch cây từ mạch phloem. Virus được hút qua vịi, tới diều, thấm qua màng ruột vào xoang cơ thể, đạt tới tuyến nước bọt và cuối cùng vào ống nước bọt. Chúng hút dịch cây trong khoảng 15 – 30 phút và tiềm ẩn trong cơ thể chúng là 8-24 giờ (thời gian để virus nâng cao nờng đợ trong bọ phấn) là chúng có khả năng truyền bệnh, khoảng thời gian để chúng truyền ngắn nhất là 15 phút (EPPO/CABI, 1996). Thời gian chích hút của bọ phấn dài hơn thời gian truyền dịch virus sang cây khỏe và thời gian tiềm ẩn là 21 giờ. Bọ phấn hút dịch cây ở giai đoạn sâu non và ngay sau khi hóa trưởng thành chúng có thể truyền nhiễm bệnh virus theo hệ thớng và khơng truyền lại cho đời sau. Có thể phát hiện thấy virus ở bất kì giai đoạn phát triển nàocủa bọ phấn từ giai đoạn trứng (Ghanim and Czosnek, 2000). Triệu chứng xuất hiện trên cây con khi bị xâm nhiễm từ 2 – 5 tuần. Virus khơng truyền qua chứng bọ phấn. Hình 2.6. Bọ phấn Bemisia tabaci Thiệt hại kinh tế do Begomovirus gây ra Nhiều bệnh nghiêm trọng trên cây trồng đã được xác định là do begomovirus gây ra như bệnh bệnh xoăn vàng lá (ngọn) cà chua, một bệnh được xem là bệnh virus nguy hiểm nhất trên cà chua khắp thế giới (Moriones and Navas-Castillo, 2000).Các bệnh nguy hiểm tương tự là bệnh khảm lá sắn, bệnh cuốn lá bơng (Briddon, 2003). Trong đĩ gây thiệt hại lớn nhất là bệnh xoăn vàng lá ngọn cà chua. Bệnh xoăn vàng lá cà chua gây thiệt hại lớn cả về năng suất và chất lượng. Bệnh đã trở thành bệnh virus quan trọng nhất trên cây cà chua khắp Thế Giới, đặc biệt vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới (Picĩ, Díez et al., 1996). Phịng chống Cho đến nay vẫn chưa có loài thuớc hóa học nào phòng trừ được trực tiếp bệnh do virus gây ra. Phịng trừ begomovirus chủ yếu dựa vào 2 chiến lược chính là phịng chống vector và tạo cây kháng bệnh. Phịng chống vector: (Kheyr-Pour, Bendahmane et al., 1991) cho biết, trên thế giới có khoảng 500 loài cây là ký chủ của bọ phấn, chúng có mặt quanh năm trên đờng ruợng. Đây là nguyên nhân khiến cho việc phòng trừ bọ phấn gặp nhiều khó khăn. (Murugan and Uthamasamy, 2001) nghiên cứu đặt bẫy dính bọ phấn theo dõi mặt đợ bọ phấn trên cánh đờng bơng ở Coimbatace (Ấn Đợ) cho thấy: từ tháng 9 đến tháng 3 năm sau lượng mưa thấp, nhiệt đợ cao, cường đợ ánh sáng lớn với ẩm đợ trung bình tạo điều kiện cho bọ phấn sinh sơi nảy nở nhanh chóng nên mật đợ bọ phấn cao, từ tháng 5 đến tháng 8 mưa nhiều nên mật đợ bọ phấn thấp, đỉnh cao của mật đợ bọ phấn khoảng tháng 11 đến tháng 1 năm sau. Từ đặc điểm đó, nhiều kỹ thuật phịng trừ bọ phấn được áp dụng tùy điều kiện: + Dùng giống kháng bọ phấn. + Dùng thuốc hĩa học. + Trồng cây trong nhà lưới, nhà kính. + Dùng bẫy hấp dẫn màu vàng hoặc bề mặt phản xạ (chỉ áp dụng cĩ hiệu quả trong điều kiện nhà lưới) . Tạo giống kháng virus: Tính kháng begomovirus cĩ thể được tạo ra nhờ 2 cơ chế: Tính kháng từ cây và tính kháng từ tác nhân gây bệnh (PRD). Những năm gần đây, cùng với tiến bợ khoa học kĩ thuật các nhà khoa học đã tạo ra các giớng ớt có khả năng chớng lại sự xâm nhiễm, tái tở hợp của virus trong tế bào cây. Trung tâm nghiên cứu và phát triển rau châu Á (AVRDC) đã lai tạo ra những dòng ớt có tính kháng rất cao với bọ phấn Bemisia tabaci cũng như kháng bệnh do begomovirus gây ra. Ở nước ta đang có dự án thí nghiệm nghiên cứu tính kháng bệnh virus (begomovirus) củ 34 giớng ớt có nguờn gớc từ AVRDC (trung tâm rau màu thế giới) tại Đờng Tháp bước đầu đã cho những kết quả rất khả quan, đây đều là các giống kháng chuyển gen dùng gen kháng từ cây. Một số begomovirus hại cà chua Hiện nay có tới hơn 50 begomovirus phân lập từ cà chua (có từ tomato ở đầu tên virus) đã được cơng bớ trên thế giới (Fauquet, Briddon et al., 2008). Trên cây cà chua, các begomovirus tạo triệu chứng giớng nhau, điểm hình là cuớn lá (cong lại hình thìa); mép lá (đặc biệt ở lá non) biến vàng; lá nhỏ hẹp; cây nhiểm sớm còi cọc với tỷ lệ đậu quả rất thấp. Danh tính virus gây bệnh chỉ có thể biết được dựa vào các phân tích phân tử (Moriones & Navas-Castillo, 2000). Tại Việt Nam, bệnh xoăn vàng lá được xem là bệnh virus quan trọng nhất trên cà chua với tỉ lệ nhiễm bệnh trên các ruợng trờng cà chua thường rất cao, có khi tới 100%. Bệnh đã được phát hiện thấy trên cà chua từ những năm 80. Mợt sớ nghiên cứu về tạo huyết thanh chuẩn đoán, lây nhiễm nhân tạo đã được thực hiện trong thời gian này nhưng bản chất thực sự của virus vẫn chưa rõ. Gần đây dựa vào các phân tích phân tử, có ít nhất 3 loài begomovirus được phát hiện gây ra bệnh xoăn vàng lá cà chua ở Việt Nam. Loài thứ nhất là Tomato leaf curl Việt Nam virus (ToLCVNV) được phân phập từ cây cà chua bị bệnh xoăn vàng ngọn ở miền Bắc vào năm 2001 (Green et al., 2001), Loài thứ hai là Tomato yellow leaf curl Kanchanaburi virus (TYLCKaV), được phân lập đầu tiên ở tỉnh Kanchanaburi (Thái Lan) vào năm 2002 (Green et al., 2002) và được phát hiện trên cây cà chua ở Việt Nam vào năm 2005 (mã sớ Genbank của mẫu Việt Nam là DQ169054, -55). Năm 2007, từ mợt mẫu cà chua bị bênh xoăn vàng ngọn thu thập tại Hà Nợi, cùng với ToLCVV, mợt loài begomovirus thứ ba cũng đã được phân lập. Loài này được đặt tên là Tomato yellow leaf curl Việt Nam virus (ToYLCKaV) (Hà et al., 2008). Trong sớ 3 virus trên có 2 virus được phân lập trên mẫu cà chua gây bệnh xoăn vàng lá ở miền Bắc là ToLCVNV và TYLCVNV. Một số begomovirus hại ớt Theo (Green and Kim, 1991) có khoảng 35 loài virus khác nhau gây hại trên ớt ở các vùng trờng trên thế giới đã được phát hiện thì có 12 loài gây hại trên ớt ở Châu Á Thái Bình Dương. Cho đến năm 2001 thì có đến 65 loài virus khác nhau đã được phát hiện trong đó có những loài thuợc chi Begomovirus (AVRDC, 2001). Theo kết quả nghiên cứu của (Green and Kim, 1991), triệu chứng cuớn lá ớt trờng ở Banthra lan truyền qua bọ phấn Bemissia tabaci là do Chilli Leaf Curl Virus (ChiLCV) gây ra. Sớ lượng các loài virus mới gây hại trên ớt ngọt và ớt cay ngày càng được phát hiện. Đã có hơn 9 loài virus thuợc chi begomovirus gây hại trên các cây trờng khác ở Trung Quớc và Đài Loan Ở nước ta, tại miền Bắc, Nguyễn Thị Thu Ngọc (2009) đã phát hiện được sự cĩ mặt của begomovirus cụ thể là 2 virus Tomato yellow leaf curl virus (TYLCVNV) và Tomato leaf curl Vietnam virus (ToLCVV) trên ớt. Tuy nhiên hiện tại ở Việt Nam lại chưa cĩ nhiều nghiên cứu về xác định thành phần bệnh virus hại ớt nĩi chung và Begomovirus hại ớt nĩi riêng. Trên ớt triệu chứng do begomovirus gây ra gồm cĩ: biến vàng, cuốn lá, khảm lá,...Triệu chứng của Pepper leaf curl virus gây ra: gây hại là non, lá biến dạng, bị cuốn mép. Kỹ thuật chẩn đốn bằng PCR Giới thiệu: PCR là một trong các phát minh quan trọng nhất của thế kỷ 20 trong sinh học phân tử. PCR là kỹ thuật đơn giản nhưng được sử dụng trong hầu hết các nghiên cứu CNSH (Hà Viết Cường, 2010), đặc biệt là trong lĩnh vực chẩn đốn bệnh virus. Ngồi các kỹ thuật chẩn đốn thơng thường bằng mắt, chỉ thị, kháng nguyên- kháng thể thì PCR là kỹ thuật chẩn đốn cho kết quả chính xác và hiệu quả nhất. Trên thực tế những lồi tác nhân gây bệnh trong cùng 1 chi hay 1 họ sẽ gây ra những triệu chứng tương tự nhau, khĩ phân biệt. PCR giúp phân biệt chính xác đến lồi nhờ vào mồi đặc hiệu, được thiết kế trên vùng bảo thủ của gen. Nguyên lý: PCR là phản ứng sinh tổng hợp DNA, gồm nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm 3 bước: Biến tính: Hỗn hợp phản ứng được dặt ở nhiệt độ cao (92-940C) trong khoảng thời gian ngắn (20-60 giây). Ở nhiệt độ này, khuơn DNA dạng sợi kép tách thành sợi đơn. Gắn mồi: Hỗn hợp phản ứng được đặt ở nhiệt độ gắn mồi trong thời gian ngắn (35 giây). Nhiệt độ gắn mồi được tính tốn tùy thuộc đặc điểm mồi, thường trong khoảng 40-600C, ở nhiệt độ này mồi được gắn vào sợi khuơn ở vị trí đặc hiệu. Tổng hợp sản phẩm PCR: hỗn hợp phản ứng được tăng tới nhiệt độ tối ưu cho phản ứng tổng hợp chuỗi, tùy thuộc DNA polymerase chịu nhiệt. Kỹ thuật RCA (Rolling circle amplication) Gần đây, một phương pháp nhân bản DNA mới dùng kỹ thuật RCA (Rolling Circle Amplification) đã được sử dụng để nhân các bộ gen DNA dạng mạch vịng. Kỹ thuật RCA dùng enzyme DNA polymerase của thực khuẩn thể Φ29, một enzyme cĩ hoạt tính chuyển mạch (strand-displacement) rất cao, và mồi hexamer để nhân các phân tử DNA mạch vịng thành các multimer mạch thẳng (gồm nhiều bộ gen virus liên tiếp) (Hình 2.10) Sản phẩm RCA sẽ được cắt bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp và được dịng hĩa trong các vector dịng hĩa thơng thường. Đây là kỹ thuật hiện đang rất thơng dụng trong nghiên cứu các virus cĩ bộ gen DNA mạch vịng kể cả các begomovirus và vệ tinh ((Inoue-Nagata, Albuquerque et al., 2004), (Haible, Kober et al., 2006), (Knierim and Maiss, 2007)). Hình 2.7. Cơ chế tái bản các phân tử DNA mạch vịng bằng kỹ thuật RCA (Rolling Circle Amplification) dùng hexamer và Φ29 polymerase DNA (Fujii, Kitaoka et al., 2006) Kỹ thuật RCA đã được ứng dụng để thiết kế các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus.Sản phẩm RCA dạng multimers được cắt đơn bằng enzyme cắt giới hạn thích hợp trong điều kiện khơng triệt để để tạo ra nhiều sản phẩm monomer (1 bộ gen), dimer (2 bộ gen) và multimer (nhiều bộ gen). Chỉ các sản phẩm dimer được tinh chiết khỏi gel agarose và nối vào vector nhị nguyễn.Bằng cách đơn giản này, các cấu trúc xâm nhiễm của begomovirus cĩ thể được tạo ra khá nhanh chĩng. (Inoue-Nagata, Albuquerque et al., 2004), (Knierim and Maiss, 2007), (Ferreira, Lemos et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008), (Wu, Lai et al., 2008), (Wyant, Gotthardt et al., 2011). Kĩ thuật Agroinoculation Kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A.tumerfaciens được gọi là agroinoculation.Agroinoculation là kỹ thuật chuyển cấu trúc xâm nhiễm vào tế bào cây nhờ vi khuẩn A. tumerfaciens. Agrobacterium tumerfaciens là vi khuẩn đất, gram (-), được sử dụng như các vector tự nhiên để mang các gen ngoại lai vào mơ và tế bào thực ...riệu chứng biểu hiện sau 1 tuần, 2 tuần, 3 tuần và 4 tuần. + Phản ứng PCR (cho cả DNA-A và DNA-B) trên tất cả cây thí nghiệm. Kiểm tra các mẫu bằng phản ứng ELISA Việc áp dụng những thành tựu khoa học kĩ thuật hiện đại đã trở nên cần thiết và hữu hiệu trong việc chuẩn đoán các bệnh nguy hiểm trên cây trờng. Mợt trong những phương pháp hiệu quả, chính xác được áp dụng phở biến trên thế giới là phương pháp Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Ngày nay, nhiều dạng khác nhau của ELISA đang được sử dụng thường xuyên. Trong điều kiện Việt Nam hiện nay, phương pháp ELISA đặc biệt có ý nghĩa trong chuẩn đoán bệnh hại cây trờng do vi sinh vật gây ra. Năm 1969, khi Arrameas liên kết mợt kháng thể IgG với mợt Enzyme và chứng minh rằng, kháng thể liên kết Enzyme này vừa duy trì tính đặc hiệu miễn dịch của kháng thể vừa duy trì tính hoạt đợng của Enzyme. Năm 1977, Clarck và Adams lần đầu tiên ứng dụng phương pháp ELISA để chuẩn đoán các cây nhiễm bệnh virus thực vật. Thơng thường sự kết hợp giữa kháng nguyên kháng thể khơng thể nhận biết được bằng mắt thường, kỹ thuật ELISA đã lợi dụng các đặc tính hấp phụ tự nhiên của protein lên polyetylen để gắn kháng nguyên hoặc kháng thể lên giá rồi cho kháng nguyên hoặc kháng thể tương ứng cĩ đánh dấu enzyme vào tạo phản ứng. Sau khi loại bỏ chất đánh dấu khơng kết hợp, cho thêm vào hỗn dịch chất đệm màu. Nhờ hoạt tính xúc tác của enzyme làm giải phĩng ơxy nguyên tử (O) từ H2O2 để ơxy hĩa chất hiện màu làm thay đổi màu của hỗn dịch. Như vậy kỹ thuật ELISA gồm 3 thành phần tham gia phản ứng: kháng nguyên, kháng thể và chất hiện màu qua hai bước: + Phản ứng miễn dịch học: Sự kết hợp kháng nguyên với kháng thể. + Phản ứng hĩa học: Nhờ hoạt tính của enzyme để giải phĩng ơxy nguyên tử (O) và chính ơxy nguyên tử này (O) đã ơxy hĩa chất chỉ thị màu. Chất chỉ thị thay đổi màu đã chứng minh sự hiện diện của enzyme và đồng thời cĩ sự kết hợp giữa kháng nguyên và kháng thể. Hiện nay, có hai phương pháp ELISA đang được ứng dụng rợng dãi là phương pháp Double Antibody Sandwich (DAS – ELISA), phương pháp này gọi là phương pháp ELISA trực tiếp. Phương pháp thứ hai là Indirect ELISA gọi là phương pháp ELISA gián tiếp. Nhược điểm cơ bản của ELISA gián tiếp là bước cố định kháng nguyên khơng cĩ tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa, vì vậy trường hợp kháng thể (cĩ nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. DAS ELISA đã hạn chế được nhược điểm trên. Trong nghiên cứu này chúng tơi sử dụng phương pháp DAS – ELISA. Phương pháp DAS – ELISA được sử dụng dưới dạng kĩ thuật ELISA kẹp kép kháng thể. DAS – ELISA được Clarck và Adams mơ tả vào năm 1977, DAS – ELISA trực tiếp sử dụng kháng thể đặc hiệu virus để vừa bẫy virus vừa phát hiện virus đã bẫy được (kháng thể liên kết men sẽ tập hợp đặc hiệu với virus được bẫy). Có các bước sau: Phương pháp kiểm tra virus bằng ELISA trực tiếp dựa theo tài liệu mơ tả của (Green, 1991) và Vũ Triệu Mân (2003), cĩ các bước sau: Bước 1: Cố định IgG đặc hiệu virus vào bản Elisa (Ủ kháng thể) Hịa tan IgG vào dung dịch Coating buffer với tỷ lệ 1µl/ 1ml dung dịch Coating buffer. Cho 100 µl dung dịch IgG hịa tan ở trên vào mỗi giếng của bản Elisa và đậy nắp lại. Gĩi bản Elisa trong tờ khăn giấy cĩ thấm nước để giữ ẩm, gĩi kín lại trong túi nilon và ủ ở 37oC trong 4 giờ hoặc ủ ở 4oC qua một đêm. Sau khi ủ, đem bản ELISA đi rửa (trước khi rửa vảy mạnh bản ELISA để loại hết nước ở trong bản ELISA) 3 lần bằng đệm PBS – T (Phosphate buffer saline-Tween), mỗi lần cách nhau 3 – 4 phút. Mỗi lần rửa bản ELISA đều vảy mạnh để loại hết đệm PBS – T ra khỏi các giếng và úp ngược trên khăn thấm, sau đĩ mới tiến hành nhỏ đệm PBS – T mới vào để rửa tiếp. Bước 2: Tạo dung dịch mẫu và Cố định dịch cây vào bản Elisa Dùng kéo cắt nhuyễn khoảng 0.1g mẫu lá cho vào cối sứ (hoặc ống eppendorf) nghiền thật nhuyễn trong dung dịch nitơ lỏng, thêm vào 1000 µl dung dịch 1X PBS-T. Dịch mẫu được cho vào mỗi giếng là 100 µl/giếng. Gĩi bản Elisa trong tờ khăn giấy cĩ thấm nước để giữ ẩm, và bọc kín lại trong túi nilon. Sau đĩ ủ ở 37oC trong 4 giờ hoặc ủ ở 4oC qua một đêm. Sau khi ủ, bản Elisa được tiếp tục rửa bằng dung dịch đệm rửa 1X PBS-T như ở bước 1. Bước 3: Cố định IgG liên kết enzyme vào bản Elisa Hịa tan IgG liên kết Biotin và Avidin liên kết alkaline phosphatase trong dung dịch 1X PBS-T với tỷ lệ: 1µl IgG-Biotin /1µl avidin-alkaline phosphatase/1ml PBS –T. Cho dung dịch vừa hịa tan vào các giếng của bản Elisa với lượng 100 µl/giếng. Gĩi bản Elisa trong tờ khăn giấy cĩ thấm nước để giữ ẩm, gĩi kín lại trong túi nilon, tiếp tục ủ ở 37oC trong 4 giờ hoặc ủ ở 4oC qua một đêm và rửa bản Elisa bằng dung dịch đệm rửa 1X PBS-T như ở bước 1. Bước 4: Cố định chất nền và đánh giá kết quả Hịa tan chất nền (Phosphate substrate) với dung dịch đệm Diethanolamine ( Subtrate buffer) theo tỷ lệ 1mg/ 1ml (tương ứng : 4 viên Phosphatase subtrate + 20 ml dung dịch S. buffer). Cho vào mỗi giếng của bản Elisa 100 µl dung dịch vừa hồ tan. Ủ bản Elisa ở nhiệt độ phịng sau 20 phút, sau đĩ đọc kết quả bằng máy đọc Elisa ở bước sĩng 405 nm. Sau đĩ đánh giá kết quả bằng mắt thường và đo trị số ELISA (OD) ở bước sĩng 405 nm. + Mẫu dương tính với bệnh nếu: (Giá trị Blank data đọc được qua máy của mỗi giếng) – (2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn) ≥ 0,1 + Mẫu âm tính với bệnh nếu: (Giá trị Blank data đọc được qua máy của mỗi giếng) – ( 2 × trị số trung bình giá trị ở giếng đối chứng âm + độ lệch chuẩn) < 0,1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng kĩ thuật agroinoculation sử dụng cấu trúc xâm nhiễm VNP93 Cà chua và ớt là những cây trồng quan trọng trong nền nơng nghiệp hiện nay của nước ta. Trong đó, cây ớt được coi là mợt trong năm loại cây trờng chủ lực trong chương trình chọn tạo giớng rau của Bợ nơng nghiệp và phát triển nơng thơn trong giai đoạn 2006 – 2010. Vì vậy việc phát hiện virus PepYLCVNV gây hại trên cà chua và cây ớt rất cĩ ý nghĩa trong thực tiễn cũng như nghiên cứu khoa học. Đây là lồi virus mới được phát hiện tại Việt Nam nên trên thế giới cũng như ở Việt Nam chưa cĩ nhiều tài liệu cũng như cơng trình nghiên cứu về lồi virus PepYLCVNV này. Mục tiêu của phần nghiên cứu này là tìm ra phương pháp lây nhiễm nhân tạo PepYLCVNV nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumerfaciens (Agroinoculation) cĩ hiệu quả nhất. Dựa trên phương pháp lây nhiễm hiệu quả, tính gây bệnh của virus, đặc điểm sinh học của virus cĩ thể được đánh giá dễ dàng, từ đĩ đưa ra các biện pháp phịng trừ lồi virus này đạt hiệu quả cao. Chúng tơi sử dụng phương pháp tiêm trực tiếp vi khuẩn vào mơ cây (Kheyr-Pour, Bendahmane et al., 1991) để thực hiện kĩ thuật lây nhiễm này. Đây là phương pháp tiêm trực tiếp dung dịch vi khuẩn chứa các cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV vào mơ lá và chồi nách của cây, cây ở giai đoạn 3-4 lá thật. Chuẩn bị nguồn vi khuẩn A. tumerfaciens mang cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B vào tế bào khả biến A. Tumerfaciens Cấu trúc xâm nhiễm của cả thành phần, DNA-A và DNA-B, của PepYLCVNV đã được xây dựng từ trước trên vector chuyển gen thực vật là pCAMBIA2300. Cả 2 cấu trúc xâm nhiễm này đã được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumefaciens từ 2013. Tuy nhiên, trong quá trình bảo quản, nguồn AT-VNP93-5-8-1 (DNA-B) cĩ lẫn AT-VNP93-5-4-11 (DNA-A). Do vậy, chúng tơi đã chuẩn bị dịng vi khuẩn mới bằng cách biến nạp lại cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A và DNA-B vào tế bào A. tumerfaciens khả biến. Dịng plasmid mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A (VNP93-5-4) và DNA-B (VNP93-5-8) được biến nạp vào tế bào khả biến A. tumefaciens theo phương pháp đơng – tan như mơ tả trong phần vật liệu và phương pháp. Vi khuẩn biến nạp được cấy trải riêng rẽ từng cấu trúc xâm nhiễm trên 2 đĩa mơi trường LB agar chứa 3 kháng sinh (rifampycin, kanamycin và streptomycin) ủ ở 28oC. Quan sat sau 2 ngày ủ thấy số lượng khuẩn lạc nhiều, cĩ đặc điểm hình thái giống A.tumerfaciens. Chúng tơi chọn mỗi đĩa 5 khuẩn lạc đem nuơi trong mơi trường LB lỏng chứ 3 kháng sinh (rifampycin, kanamycin và streptomycin). Vi khuẩn nuơi qua đêm ở điều kiện lắc 20 rmp và nhiệt độ dưới 280C. Dịch vi khuẩn được kiểm tra Multiplex – PCR với các cặp mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/B-F1 và VNP93-A-F1/B-F1. Chu trình và phương pháp kiểm tra Multiplex – PCR đã trình bày trên phần phương pháp. Kết quả kiểm tra PCR (Bảng 4.1 và Hình 4.1) cho thấy trong 10 dịng vì khuẩn được kiểm tra PCR thấy cĩ 5 dịng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A và 5 dịng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B. Vì 5 dịng vi khuẩn được biến nạp từ cấu trúc VNP93-5-4 và 5 dịng vi khuẩn được biến nạp từ cấu trúc VNP93-5-8 nên chúng được trộn lẫn 5 dịng vi khuẩn của từng cấu trúc vào nhau và được ký hiệu là AT-VNP93-5-4 và AT-VNP93-5-8. Hai dịng này được bảo quản ở -80oC trong glycerol 15% và được dùng cho các nghiên cứu tiếp theo. Bảng 4.1: Kết quả PCR 10 dịng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV STT DNA Dịng A.Tumefaciens biến nạp PCR DNA-A DNA-B 1 DNA-A AT-VNP93-5-4-1 + – 2 DNA-A AT-VNP93-5-4-2 + – 3 DNA-A AT-VNP93-5-4-3 + – 4 DNA-A AT-VNP93-5-4-4 + – 5 DNA-A AT-VNP93-5-4-5 + – 6 DNA-B AT-VNP93-5-8-1 – + 7 DNA-B AT-VNP93-5-8-2 – + 8 DNA-B AT-VNP93-5-8-3 – + 9 DNA-B AT-VNP93-5-8-4 – + 10 DNA-B AT-VNP93-5-8-5 – + Hình 4.1. Kiểm tra PCR các dịng A.Tumefaciens được biến nạp với cấu trúc xâm nhiễm DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV MàVNP93-5-4-1à VNP93-5-4-2à VNP93-5-4-3à VNP93-5-4-4à VNP93-5-4-5à VNP93-5-8-1à VNP93-5-8-2à VNP93-5-8-3à VNP93-5-8-4à VNP93-5-8-5 (ladder 100bp) Phục hồi các dịng vi khuẩn A. tumefaciens mang 2 cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV Lấy cặp dịng vi khuẩn AT-VNP93-5-4 (mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A) và AT-VNP93-5-4 (mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-B) bảo quản ở -80oC để làm nguồn lây nhiễm. Hai dịng này sau khi phục hồi được bảo quản ngắn hạn trong nước cất vơ trùng ở điều kiện 4oC cho các nghiên cứu lây nhiễm trong quá trình thực tập. Hai dịng vi khuẩn trên được cấy zic zắc trên mơi trường LB – agar cĩ bổ sung thêm ba loại kháng sinh Streptomycin, Rifamycin, Kanamycin. Nuơi vi khuẩn trong điều kiện nhiệt độ dưới 280C và đánh giá kết quả sau 2 - 3 ngày. Sau 2 ngày thì vi khuẩn bắt đầu mọc, đến ngày thứ 3 nhìn chung các dịng vi khuẩn nuơi cấy trên mơi trường LB – agar, cĩ khuẩn lạc mọc đều và đẹp, khuẩn lạc hình trịn, màu trắng sữa, rìa nhẵn, bề mặt khuẩn lạc ướt (Hình ảnh 4.2). Khuẩn lạc đặc trưng cho dịng vi khuẩn Agrobacterium. Tổng số 2/2 dịng vi khuẩn đã được phục hồi (Bảng 4.2). Bảng 4.2. Kết quả phục hồi 2 dịng vi khuẩn mang cấu trúc xâm nhiêm của PepYLCVNV STT DNA Dịng vi khuẩn Số khuẩn lạc mọc trên LB- agar 1 DNA-A AT-VNP93-5-4-11 ~200 2 DNA-B AT-VNP93-5-8-1 ~150 Hình 4.2. Hình ảnh khuẩn lạc trên mơi trường LB–Agar sau 3 ngày nuơi cấy Nhân sinh khối dịng vi khuẩn A.Tumerfaciens trong mơi trường LB- lỏng Chọn cặp dịng vi khuẩn VNP93-5-4 và VNP-5-8 nuơi nhân sinh khối để tiến hành lây nhiễm. Sau khi đã phục hồi các dịng vi khuẩn A.tumerfacins chứa cấu trúc xâm nhiễm, các khuẩn lạc được đem nuơi lắc trong mơi trường LB – lỏng cĩ chứa 3 loại kháng sinh (Streptomycin, Rifamycin, Kanamycin), với mục đích nhân sinh khối các dịng vi khuẩn cho lây nhiễm. Vi khuẩn nuơi qua đêm ở điều kiện lắc 250 rmp và nhiệt độ dưới 280C. Kết quả cho thấy tất cả các khuẩn lạc đều phát triển tốt trong mơi trường LB – lỏng, các lọ dung dịch vi khuẩn cĩ vẩn đục ( Hình ảnh 4.2). Hình 4.2: Dịng vi khuẩn A.tumerfaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm PepYLCVNV nuơi trong LB – lỏng Kết quả đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng phương pháp Agroinoculation Các dịng vi khuẩn A.tumerfaciens cĩ chứa cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV chứa bộ gen (DNA-A và DNA-B ) riêng rẽ, đã được nuơi trong mơi trường LB – lỏng. Dịch vi khuẩn thu được sau khi nuơi lỏng, lắc được mang đi li tâm lấy cặn vi khuẩn và hịa tan cặn vi khuẩn bằng đệm MgCl2 cùng với 1 µl/ml acetonringone 0.1M giúp kích thích sự phát triển của vi khuẩn trong tế bào ký chủ. Sau đĩ dịch vi khuẩn được sử dụng để lây nhiễm bằng cách tiêm trực tiếp vào mơ lá khi cây ở giai đoạn có 3-4 lá thật. Cây thí nghiệm là cà chua mẫn cảm giống Hờng Lan T20, ớt Hiểm Lai F1-207, và các giớng chỉ thị: thuốc lào (N. glutinosa), thuốc lá (N. tabacum) cv. K326, thuốc lá (N. tabacum) cv. Samsum, thuốc lá cảnh (Nicotiana benthamiana), hoa ngũ sắc (Ageratum conyzoides). Trên cùng 1 cây thí nghiệm, chúng tơi đã sử dụng 2 phương pháp để đưa vi khuẩn vào trong cây. Các phương pháp lây nhiễm được trình bày ở bảng 4.2.3. Bảng 4.3. Các phương pháp lây nhiễm nhân tạo sử dụng A. tumerfaciens (Agroinoculation) STT Tên phương pháp Mơ tả phương pháp 1 Tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào nách lá Là phương pháp lây nhiễm khi cây được 3-4 lá mầm, dịch vi khuẩn được tiêm trực tiếp nách lá bằng xi lanh y tế loại 1 mL nhỏ. 2 Tiêm trực tiếp dịch khuẩn vào mơ lá Là phương pháp lây nhiễm khi cây được 3-4 lá mầm, dùng xy lanh y tế loại 1 mL nhỏ nhưng tháo kim và bơm dịch vi khuẩn vào mặt dưới của lá để vi khuẩn cĩ thể xâm nhập vào mơ qua khí khổng. Các cơng thức thí nghiệm bao gồm: Chỉ lây nhiễm một mình dịng VNP93-A Lây nhiễm hỗn hợp 2 dịng vi khuẩn: VNP93-A và VNP93-B Đới chứng: tiêm acetosyrigone 10 mM Một cơng thức thực hiện trên 5 cây, mỗi cây được tiêm trực tiếp 3 mũi tại 3 nách lá tính từ ngọn xuống, tiếp theo được bơm 3 vết trên 3 lá khác với ba lá đã được tiêm vào nách. Vì nhiệt độ tối thích cho vi khuẩn A. tumefeciens chuyển gien là 28oC – 30oC nên cây thí nghiệm được chuyển vào phịng điều hịa nhiệt độ ở 28oC trước, sau và trong suốt quá trình lây nhiễm nhân tạo để tạo điệu kiện cho vi khuẩn hoạt động thuận lợi. Sau đĩ cây thí nghiệm được chuyển ra nhà lưới và đề đảm bảo cho cây sạch bọ phấn (mơi giới truyền Begomovirus) tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng thuốc trừ cơn trùng chích hút với mật đợ phun 2 tuần/lần. Thí nghiệm lây nhiễm agroinoculation được minh họa ở Hình 4.6. Hình4.3. Phương pháp tiêm trực tiếp dịch vi khuẩn vào mơ lá Tính gây bệnh của DNA-A (lây nhiễm bằng agroinoculation) PepYLCVNV là một begomovirus cĩ bộ gen kép (cĩ cả DNA-A và DNA-B). Tuy nhiên, nhiều begomovirus có bộ gien đơn đã được chứng minh là cĩ thể tạo ra triệu chứng điển hình mà khơng cần sự cĩ mặt của DNA-B chẳng hạn như đối với TYLCSV (Kheyr-Pour et al., 1991) và Tobacco yellow leaf curl Yunnan virus (TYLCYNV) (Xie et al., 2006) trên cà chua. Mặt khác, mợt sớ nghiên cứu tại TTBCND (Chi, 2013) đã kết luận chỉ cần DNA-A cũng có có thể gây bệnh trên cà chua. Chính vì vậy, chúng tơi tiến hành lặp lại các thí nghiệm nhằm nghiên cứu chính xác tính gây bệnh của chỉ DNA-A của PepYLCVNV trên cà chua bởi vì DNA-A của virus này đã được phát hiện trên ruợng trờng cà chua ở gần ruợng trờng ớt đã, nơi đã phát hiện ra virus này. Ngoài ra, chúng tơi cũng nghiên cứu tính gây bệnh này trên cây ớt, thuớc lá và trên cây họ ageratum (mợt loài cây ký chủ phụ phở biến đới với begomovirus ngoài tự nhiên). Thí nghiệm 1: Lây nhiễm trên dòng cà chua Hờng Lan (T20). Chúng tơi tiến hành lặp lại 4 lần, triệu chứng mỡi lần lây được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau khi lây. Sau một tháng lây nhiễm, trong cả 4 lần thực hiện lây khơng cĩ cây nào biểu hiện triệu chứng nhiễm bệnh. Để kiểm tra khả năng nhiễm ẩn (cây nhiễm virus nhưng khơng biểu hiện triệu chứng), sau 50 ngày lây nhiễm chúng tơi tiến hành PCR để kiểm tra sự cĩ mặt DNA-A của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/R1. Bảng 4.4. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giớng cà chua Hờng Lan (T20) STT Ngày lây nhiễm Số cây lây Sớ cây có triệu chứng Sớ cây PCR dương/ sớ cây kiểm tra 1 8/3/2014 15 0 3/5 2 12/4/2014 15 0 5/5 3 24/4/2014 12 0 2/5 4 10/5/2014 12 0 4/5 Hình 4.4. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên cà chua Hồng Lan (T20). Từ trái qua phải tương ứng. Kết quả cho thấy rằng qua 4 lần thí nghiệm chúng tơi khơng nhận thấy triệu chứng trên các cây lây nhiễm tuy nhiên khi kiểm tra bằng PCR thì vẫn thấy sự có mặt của virus chứng tỏ được tính hiệu quả của cấu trúc xâm nhiễm=> câu hỏi vì sao. Thí nghiệm 2: Lây nhiễm trên ớt: Chúng tơi tiến hành thí nghiệm này trên giớng ớt mẫn cảm Hiểm Lai F1-207. Tiến hành lặp lại 3 lần, theo dõi tuần 1, 2, 3, 4 sau lây. Quan sát tại tuần 4 sau khi tiêm cho thấy, cả 3 lần tiêm khơng có cây nào biêu hiện triệu chứng, sau 4 tuần lây nhiễm, chúng tơi tiến hành PCR để kiểm tra sự cĩ mặt DNA-A của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng mồi đặc hiệu VNP93-A-F1/R1 (Bảng 5, hình 4.5). Bảng 4.5. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A giớng ớt Hiểm Lai F1-207 STT Ngày lây nhiễm Số cây lây Sớ cây có triệu chứng Sớ cây PCR dương/ sớ cây kiểm tra 1 12/4/2014 15 0 2 24/4/2014 12 0 3 10/5/2014 12 0 Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng Hình 4.5. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên ớt Hiểm Lai F1-207. Từ trái qua phải tương ứng. Thí nghiệm 3: Lây nhiễn trên cây chỉ thị: Trong thí nghiệm này chúng tơi tiến hành lây nhiễn trên 3 giống thuốc lá (N. benthamaiana, N. tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. K326), thuớc lào N.Glutinosa và hoa ngủ sắc (Ageratum conyzoides). Tiến hành lặp lại 3 lần, triệu chứng được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau lây đờng thời các cây lây nhiễm được kiểm tra lại bằng PCR sau 4 tuần lây nhiễm. Kết quả được trình bày ở bảng 4.6 và hình 4.6 Bảng 4.6. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm chỉ DNA-A trên cây chỉ thị. Cây Lần lây nhiễn thứ 1 Lần lây nhiễn thứ 2 Lần lây nhiễn thứ 3 Triệu chứng PCR (+) Triệu chứng PCR (+) Triệu chứng PCR (+) Nicotiana benthamiana 0/6 6/6 0/6 3/6 0/6 4/6 N. tabacum cv. K326 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 N. tabacum cv. Samsun 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 N. glutinosa 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Ageratum conyzoides 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng Hình 4.6. PCR phát hiện DNA-A của PepYLCVNV trên cây Nicotiana benthamiana (lây nhiễm lần 1) Mà Cây 1à Cây 2à Cây 3à Cây 4à Cây 5à Cây 6(ladder 1kb) Kết quả: ???? Kết luận chung: Qua 3 thí nghiệm lây nhiễm phân tử DNA-A trên ớt, cà chua và cây chỉ thị, chúng tơi khơng nhận thấy triệu chứng trên các cây lây nhiễm tuy nhiên khi kiểm tra bằng PCR thì vẫn thấy sự có mặt của virus. Điều đó chứng tỏ tính hiệu quả của cấu trúc xâm nhiễm. Giả thuyết, mợt mình phân tử DNA-A khơng thể gây bệnh được mặc dù vẫn có quá trình tái sinh của phân tử DNA-A trong cây, có thể đới với virus này thì cần sự có mặt của cả 2 phân tử DNA-A và DNA-B mới có thể hình thành được triệu chứng. Chính vì thế mà chúng tới tiến hành thí nghiệm tiếp theo liên quan đến tính gây bệnh của PepYLCVV bằng cách lây nhiễm đờng thời DNA-A và DNA-B. Tính gây bệnh của cả DNA-A & DNA-B (lây nhiễm bằng agroinoculation) Giớng như kiểm tra tính gây bệnh trên phân tử DNA-A, chúng tơi tiến hành kiểm tra tính gây bệnh của cả DNA-A và DNA-B với 3 thí nghiệm 1, 2, 3 lần lượt trên cây cà chua, cây ớt và cây chỉ thị, chỉ khác khi kiểm tra PCR ngoài sử dụng mời đặc hiệu VNP93-A-F1/A-R1, chúng tơi cịn sử dụng thêm mời VNP93-B-F1/B-R1. Thí nghiệm 1: Lây nhiễm trên dòng cà chua Hờng Lan (T20). Tiến hành lặp lại 4 lần, triệu chứng mỡi lần lây được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau khi lây lây đờng thời các cây lây nhiễm sau 4 tuần lây được kiểm tra lại bằng PCR. Kết quả được trình bày ở bảng 4.7 và hình 4.7. Bảng 4.7. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên giớng cà chua Hờng Lan (T20) STT Ngày lây nhiễm Số cây lây Sớ cây có triệu chứng Sớ cây PCR dương/ sớ cây kiểm tra DNA-A DNA-B 1 8/3/2014 15 0 2 12/4/2014 15 0 3 24/4/2014 12 0 4 10/5/2014 12 0 Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng Hình 4.7. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên cà chua Hồng Lan (T20) . Từ trái qua phải tương ứng. Thí nghiệm 2: Lây nhiễm trên ớt: Lây trên giớng ớt mẫn cảm Hiểm Lai F1-207. Tiến hành lặp lại 3 lần, theo dõi tuần 1, 2, 3, 4 sau lây lây đờng thời các cây lây nhiễm được kiểm tra lại bằng PCR sau 4 tuần lây nhiễm. Kết quả được trình bày ở bảng 5. Bảng 4.8. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên giớng ớt Hiểm Lai F1-207 STT Ngày lây nhiễm Số cây lây Sớ cây có triệu chứng Sớ cây PCR dương/ sớ cây kiểm tra DNA-A DNA-B 1 12/4/2014 15 0 2 24/4/2014 12 0 3 10/5/2014 12 0 Ghi chú: PCR (+): Phản ứng PCR dương. Hình 4.8. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên ớt Hiểm Lai F1-207 . Từ trái qua phải tương ứng. Thí nghiệm 3: Lây nhiễm trên cây 3 giống thuốc lá (N. benthamaiana, N. tabacum cv. Samsun, N. tabacum cv. K326), thuớc lào N.Glutinosa và hoa ngủ sắc (Ageratum conyzoides). Tiến hành lặp lại 3 lần, triệu chứng được theo dõi sau 1, 2, 3, 4 tuần sau lây đờng thời sau 4 tuần lây nhiễm, chúng tơi tiến hành PCR để kiểm tra sự cĩ mặt DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên các cây lây sử dụng cặp mồi VNP93-A-F1/R1, VNP93-B-F1/R1. Kết quả được trình bày ở bảng 4.9, hình 4.9 Bảng 4.9. Tính gây bệnh của PepYLCV khi lây nhiễm của cả DNA-A và DNA-B trên cây chỉ thị. Cây Lần lây nhiễn thứ 1 Lần lây nhiễn thứ 2 Lần lây nhiễn thứ 3 Triệu chứng PCR (+) Triệu chứng PCR (+) Triệu chứng PCR (+) DNA-A DNA-B DNA-A DNA-B DNA-A DNA-B Nicotiana benthamiana 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 N. tabacum cv. K326 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 N. tabacum cv. Samsun 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 N. glutinosa 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Ageratum conyzoides 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 0/6 Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng Hình 4.9. PCR phát hiện DNA-A và DNA-B của PepYLCVNV trên các cây chỉ thị . Từ trái qua phải tương ứng. Kết quả lây nhiễm trên cũng gợi ý là agroinoculation cĩ thể phù hợp để đánh giá tính gây bệnh nhưng khơng phù hợp để đánh giá tính kháng khi tỷ lệ nhiễm cao là yêu cầu bắt buộc. Kết luận Như vậy, từ 2 thí nghiệm đánh giá tính gây bệnh của chỉ phân tử DNA-A và của cả phân tử DNA-A và DNA-B. Chúng tơi nhận thấy rằng, việc đánh giá tính gây bệnh trên ớt bằng agroinoculation chưa đem lại hiệu quả do khơng quan sát thấy triệu chứng nhưng khi chúng tơi tiến hành kiểm tra PCR thì đều phản ứng (+) chứng tỏ sự tái sinh của virus vẫn xảy ra. Nguyên nhân của việc khơng hình thành triệu chứng có thể do: Thí nghiệm tiến hành trong mơi trường khơng thích hợp. Giớng cây có khả năng kháng bệnh. Clone có thể vỡ khung dẫn đến khơng tương tác nên cây khơng biểu hiện triệu chứng mặc dù trong cây virus vẫn tái sinh. Đánh giá tính gây bệnh của PepYLCVNV bằng lây nhiễm nhân tạo dùng bọ phấn Do PeYLCVV được phát hiện đầu tiên ở cây cà chua và ớt tại Đà Nẵng, đờng thời gần đây chúng tơi phát hiện thấy virus này trên ruợng ớt và cà tím tại Đờng Tháp. Vậy mợt câu hỏi đặt ra là liệu nguồn bệnh PepYLCVNV từ trên cà chua cĩ lây sang được cây ớt hay khơng và ngược lại, và liệu PepYLCVNV cĩ lan truyền nhờ bọ phấn nhờ các begomovirus khác. Với những mục đích đĩ, chúng tơi đã tiến hành thí nghiệm thử khả năng lan truyền của PepYLCVNV trên cây ớt và cà tím bằng cơn trùng mơi giới là bọ phấn (B. tabaci) trên hai nguồn bệnh khác nhau trên cây cà tím và cây ớt, sau khi lây 2 ngày tất cả cây thí nghiệm được xử lý bằng thuốc trừ cơn trùng chích hút và 20 ngày sau lây tiến hành thu mẫu lá đem kiểm tra bằng phản ứng PCR. Nguồn bệnh chúng tơi sử dụng trong thí nghiệm là cây cà tím và cây ớt nhiễm PepYLCVNV, được chạy PCR trước khi lây nhiễm, để đảm bảo rằng cây cà tím và cây ớt dây nguồn chắc chắn nhiễm PepYLCVNV. Kết quả thu được thể hiện ở bảng 4.10 và 4.11. Hình 4.10. Kết quả điện di chạy PCR trên cà tím với mồi VNP93-A-F1/R1, VNP93-B-F1/R1 M à VNP1500 à VNP1501 đới chứng âm à VNP1500-1 à VNP1500-2 à VNP1500-3 à VNP1500 Hình 4.11. Kết quả điện di chạy PCR trên ớt với mồi VNP93-A-F1/R1, VNP93-B-F1/R1 M à VNP1500 à VNP1500 à VNP1500 à VNP1500 Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây cà tím nguờn bệnh Bảng 4.10. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây cà tím nguồn bệnh STT Cây thí nghiệm Số cây lây Số cây cĩ triệu chứng Tỷ lệ bệnh (%) Triệu chứng sau lây (4 tuần) PCR DNA-A DNA-B 1 Cà chua T20 10 10 100 Xoăn vàng ngọn + + 2 Cà tím 10 10 100 Khảm vàng + + 3 Ớt (hiểm lai F1) 10 10 100 Khảm nhăn + + Ghi chú: Phản ứng PCR dương (+); Phản ứng PCR âm (-); ĐC: Đối chứng Lây nhiễm PepYLCVNV bằng cây ớt nguờn bệnh Bảng 4.11. Kết quả lây nhiễm PepYLCV bằng bọ phấn trên cây ớt nguồn bệnh STT Cây thí nghiệm Số cây lây Số cây cĩ triệu chứng Tỷ lệ bệnh (%) Triệu chứng sau lây (4 tuần) PCR DNA-A DNA-B 1 Cà chua T20 10 10 100 Xoăn vàng ngọn + - 2 Cà tím 10 0 0 Khơng có triệu chứng - - 3 Ớt (hiểm lai F1) 10 10 100 Khảm nhăn + - Ghi chú : Phản ứng PCR dương (+) ; Phản ứng PCR âm (-) ; ĐC : Đối chứng Như vậy, qua 2 thí nghiệm trên chúng tơi nhận thấy rằng đới với virus trên cây ớt ở Cao Lãnh-Đờng Tháp có khả năng lây nhiễm trên cà chua nhưng khơng có khả năng gây bệnh trên cà tím, ngược lại đới với begomovirus gây bệnh trên cà tím ở Thanh Bình-Đờng Tháp (triệu chứng khảm vàng điển hình) lại hoàn toàn có thể lây nhiễm sang ớt và cà chua. Dường như, 2 begomovirus gây bệnh trên cà tím và ớt thu được tại Đờng Tháp là 2 loài khác nhau. Đánh giá tính kháng của PepYLCVNV trên tập đồn giống ớt của AVRDC Đánh giá dựa vào cấp bệnh Mức độ biểu hiện triệu chứng cũng là tiêu chí quan trọng đánh giá tính kháng. Chúng tơi đánh giá dựa trên số liệu đánh giá được từ 2 lần điều tra ngày 6/5 và 11/6 năm 2014. Kết quả được trình bày ở Bảng 4.10 và Hình 4.13. Bảng 4.12. Cấp bệnh xoăn vàng lá của các giống ớt AVRDC STT Giống Ngày 6/5/2014 Ngày 21/5/2014 n Số cây bị bệnh Cấp bệnh (TB) Cấp bệnh (SE) n Số cây bị bệnh Cấp bệnh (TB) Cấp bệnh (SE) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 Chú thích: n : tổng số cây điều tra; TB : trung bình; SE (standard eror) : sai số chuẩn ; (-) khơng tính được SE, S : nhiễm ; R : kháng Nhận xét: ???? Thiết kế cấu trúc xâm nhiễm của PepYLVNV Mục đích và phương pháp Việc lây nhiễm bằng Agroinoculation trên cà chua, ớt, và cây chỉ thị khơng biểu hiện triệu chứng nhưng kiểm tra PCR đều mang phản ứng PCR dương (+). Cùng với đó chúng tơi sử dụng cây cà tím, ớt nguờn mang từ Đà Nẵng về đem lây cho ớt, cà chua, cà tím bằng bọ phấn đều xuất hiện biểu hiện bệnh. Điều đó dẫn tới giải thuyết: clone có thể vỡ khung dẫn đến khơng biểu hiện được triệu chứng mặc dù trong cây virus vẫn tái sinh. Chính vì vậy chúng tơi tiến hành xây dựng lại cấu trúc xân nhiễm để đánh giá chính xác khả năng gây bệnh, đặc trưng sinh học của virus này. Mục tiêu của phần nghiên cứu này là ứng dụng kỹ thuật RCA (Rolling circle amplification) để phân lập và xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của các phân tử DNA-A và DNA-B để phục vụ việc đánh giá tính gây bệnh, đặc trưng sinh học cũng như sẽ dùng cấu trúc xâm nhiễm này để giải trình tự tồn bộ bộ gen virus để đánh giá đặc trưng phân tử của virus này. Cấu trúc xâm nhiễm bao gồm bộ gen virus DNA-A,DNA-B được thiết kế chứa 2 stem-loop để phục vụ việc tái sinh bộ gen hồn chỉnh của virus và được nối vào 1 vị trí nằm giữa bờ trái và bờ phải của 1 vector nhị nguyên. Sau đĩ được chuyển vào E.coli để nhân dịng là chọn lọc cấu trúc của DNA-A và DNA-B và tiếp theo đĩ cấu trúc xâm nhiễm sẽ được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. Tumerfaciens để tiến hành đánh giá tính gây bệnh sử dụng kỹ thuật Agroinoculation. Trong nghiên cứu này, chúng tơi tiến hành nhân bộ gen DNA virus dưới dạng các multimer bằng kỹ thuật RCA. Sản phẩm RCA sau đĩ được cắt khơng triệt để bằng enzyme cắt giới hạn để thu dạng dimer của phân tử DNA. Các phân tử dimer này, cĩ kích thước ~ 5,4 kb, được nối vào vector nhị nguyên pCAMBIA-2300. Cuối cùng chuyển vector tái tổ hợp này vào vi khuẩn E.coli và vi khuẩn A. Tumerfacien. Hình 4.12. Sơ đồ các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV sử dụng kỹ thuật RCA Bảng 4.12. Tĩm tắt các bước xây dựng cấu trúc xâm nhiễm Bước chuẩn bị Quá trình chuẩn bị Chuẩn bị vector pCAMBIA2300 Biến nạp pCAMBIA2300 vào E.coli XL1-Blue sau đĩ minipreps thu nguồn pCAMBIA2300 (kiểm tra lại bằng mồi đặc hiệu vector) Mở vịng vector bằng BamHI Desphosphoryl pCAMBIA2300 bằng Alkaline photphase và tinh sạch Phản ứng RCA Phản ứng RCA sử dụng exo-hexamer primer và Phi 29 polymerase Thu dimer của bộ gen PepYLCVNV Cắt khơng hồn tồn sản phẩm RCA bằng enzyme BamHI sau đĩ điện di,thơi gel thu sản phẩm kích thước 5,4kb Cấu trúc xâm nhiễm của PepYLCVNV Nối dimer thu được với vector pCAMBIA đã mở vịng và dephosphoryl hĩa Biến nạp vào E.coli XL1-Blue Chọn dịng mang cấu trúc xâm nhiễm của DNA-A, DNA-B Biến nạp cấu trúc xâm nhiễm vào Agrobacterium để tiến hành Agroinoculation và giải trình tự để đánh giá đặc trưng phân tử Chuẩn bị vector pCAMBIA2300 Vector nhị nguyên được sử dụng để làm cấu trúc xâm nhiễm l