Khóa luận Khảo sát tỉ lệ phân bố và tình trạng đề kháng kháng sinh của vi khuẩn staphylococcus ở một số tỉnh thuộc khu vực phía nam

C CÔNG NGHỆ TP. HỒ CHÍ MINH KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KHẢO SÁT TỈ LỆ PHÂN BỐ VÀ TÌNH TRẠNG ĐỀ KHÁNG KHÁNG SINH CỦA VI KHUẨN STAPHYLOCOCCUS Ở MỘT SỐ TỈNH THUỘC KHU VỰC PHÍA NAM Ngành: CÔNG NGHỆ SINH HỌC- THỰC PHẨM -MÔI TRƢỜNG Chuyên ngành: VI SINH THỰC PHẨM Giảng viên hƣớng dẫn :TH.S DIỆP THẾ TÀI Sinh viên thực hiện :NGUYỄN THỊ NGỌC HƢƠNG MSSV: 1311100988 Lớp: 13DSH01 TP. Hồ Chí Minh, 2017 Đồ án tốt nghiệp LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi và đƣợc sự hƣớng dẫn khoa học của Ths. Diệp Thế Tài. Các nội dung nghiên cứu, kết quả trong đề tài này là trung thực và chƣa công bố dƣới bất kỳ hình thức nào trƣớc đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá đƣợc chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi rõ trong phần tài liệu tham khảo. TP. Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 I Đồ án tốt nghiệp LỜI CẢM ƠN Đầu tiên, cho phép tôi đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS. Diệp Thế Tài ngƣời đã nhiệt tình hƣớng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài của mình. Tôi cũng gửi lời cảm ơn tới tất cả nhân viên thuộc phòng Vi khuẩn 1 – Vi khuẩn Đƣờng ruột, Khoa Vi sinh Miễn dịch, Viện Pasteur thành phố Hồ Chí Minh đã giúp đỡ và tạo điều kiện cho tôi thực hiện tốt công việc của mình trong suốt thời gian qua. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới Ban Giám hiệu Trƣờng Đại học Công Nghệ TP.HCM cùng toàn thể Thầy, Cô khoa Công Nghệ Sinh Học đã truyền dạy kiến thức chuyên ngành để tôi có đủ khả năng hoàn thành đề tài. Đặc biệt, tôi xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình tôi vì đã luôn luôn là hậu phƣơng vững chắc giúp đỡ và động viên tôi không từ bỏ việc học của mình. Xin cảm ơn tới tất cả các bạn học lớp 13DSH01, những ngƣời đã cùng tôi vƣợt qua thời gian học tập và sinh sống tại thành phố Hồ Chí Minh. Xin chân thành cảm ơn! Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 09 tháng 08 năm 2017 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Ngọc Hƣơng II Đồ án tốt nghiệp MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN ...................................................................................................... I LỜI CẢM ƠN .......................................................................................................... II MỤC LỤC ............................................................................................................... III DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ....................................................................... VI DANH MỤC CÁC BẢNG .................................................................................... VII DANH MỤC BIỂU ĐỒ ....................................................................................... VIII DANH MỤC HÌNH ẢNH ...................................................................................... IX MỞ ĐẦU .................................................................................................................... 1 1. Đặt vấn đề ....................................................................................................................... 1 2. Tình hình nghiên cứu ..................................................................................................... 2 3. Câu hỏi nghiên cứu ........................................................................................................ 3 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU .................................................................. 5 1.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus ........................................................................ 5 1.1.1. Tình hình phân bố của Staphylococcus aureus ................................................. 5 1.1.1.1. Trên thế giới ................................................................................................... 5 1.1.1.2 Tại Việt Nam................................................................................................... 6 1.2 Đặc điểm và phân loại tụ cầu khuẩn (Staphylococcus aureus) ................................. 6 1.2.1 Giới thiệu ................................................................................................................................. 6 1.2.2 Phân loại tụ cầu vàng ........................................................................................................... 7 1.2.3 Đặc điểm sinh học ................................................................................................................ 7 1.2.3.1 Hình thể và tính chất bắt màu của Stphylococcus aureus ..................... 7 1.2.3.2 Nuôi cấy................................................................................................. 9 1.2.4 Điều kiện tăng trƣởng và sự phân bố ........................................................................... 10 1.2.5. Đặc điểm sinh hóa ............................................................................................................. 11 1.2.6. Khả năng đề kháng ............................................................................................................ 11 1.2.7. Tình hình đề kháng kháng sinh của vi khuẩn Staphylococcus trên thế giới và tại Việt Nam ....................................................................................................................................... 12 1.2.7.1. Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus trên thế giới................. 12 III Đồ án tốt nghiệp 1.2.7.2. Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus tại Việt Nam ............... 13 1.2.8. Khả năng gây bệnh của S.aureus .................................................................................. 15 1.2.9 Các yếu tố độc lực của Staphylococcus aureus ........................................................ 16 1.2.10. Phòng và điều trị bệnh ................................................................................................... 17 1.2.10.1. Phòng bệnh ....................................................................................... 17 1.2.10.2. Điều trị .............................................................................................. 17 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................... 18 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu ........................................................................... 18 2.2. Vật liệu thí nghiệm.................................................................................................... 18 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ....................................................................................... 18 2.2.2. Dụng cụ và thiết bị ............................................................................................ 18 2.2.2.1. Dụng cụ ........................................................................................................ 18 2.2.2.2. Thiết bị ......................................................................................................... 18 2.2.3. Hóa chất và môi trƣờng .................................................................................... 19 2.3. Phƣơng pháp tiến hành ............................................................................................. 19 2.3.1. Kỹ thuật nuôi cấy và phân lập ............................................................................... 19 2.3.1.1. Mẫu nƣớc ............................................................................................ 19 2.3.1.2. Mẫu thực phẩm ............................................................................................ 19 2.3.1.3 Mẫu phân ....................................................................................................... 20 2.3.2 Quan sát hình thái ............................................................................................................... 20 2.3.3 Kỹ thuật multiplex PCR ......................................................................................... 20 2.3.4. Kỹ thuật kháng sinh đồ theo phƣơng pháp Kirby-Bauer .................................... 23 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ......................................................... 27 3.1. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, mẫu nƣớc và mẫu bệnh phẩm ................................................................................................. 27 3.1.1 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc S.aureus .................................................................. 27 3.1.2. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trƣờng và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phƣớc, TP.Hồ Chí Minh. ............................................................................................................. 28 IV Đồ án tốt nghiệp 3.1.3. So sánh kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus tại 5 tỉnh thành theo từng loại mẫu ................................................................................................................... 30 3.2. Kết quả định danh vi khuẩn S.aureus ...................................................................... 30 3.3 Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus từ các loại mẫu thực phẩm, môi trƣờng và mẫu bệnh phẩm ở 5 tỉnh An Giang, Sóc Trăng, Bến Tre, Bình Phƣớc, TP.Hồ Chí Minh. ................................................................................................................................ 31 3.4. Tỉ lệ S.aureus kháng Methicilline (MRSA) ............................................................ 35 CHƢƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .............................................................. 36 4.1 Kết luận ....................................................................................................................... 36 4.2 Kiến nghị .................................................................................................................... 37 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 38 V Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT BHI Brain Heart Infusion BP Baird Paker Agar MH Mueller Hinton Agar LB Luria-Bertani TBE Tris-borate-EDTA VRSA Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus MRSA Methicillin-resistant Staphylococcus aureus S.aureus Staphylococcus Aureus PCR Polymerase Chain Reaction FOX Cefoxitin CN Gentamicin CIP Cipro VA Vancomycine NA Clindamycin AZM Azithromycin DO Doxycicline VI Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1. Trình tự các cặp mồi đƣợc sử dụng cho phản ứng PCR ........................... 21 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR đa mồi cơ sở phát hiện vi khuẩn S.aureus .... 22 Bảng 2.3. Chu trình nhiệt cơ sở của các mồi ............................................................ 22 Bảng 2.4. Bảng tiêu chuẩn đánh giá kết quả đƣờng kính vô khuẩn đối với Staphylococcus aureus theo CLSI năm 2017. ........................................................... 26 Bảng 3.1. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở Thành phố Hồ Chí Minh .......................................................................................................................... 28 Bảng 3.2. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh An Giang ........ 28 Bảng 3.3. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Bến Tre........... 29 Bảng 3.4. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Bình Phƣớc .... 29 Bảng 3.5. Kết quả nuôi cấy, phân lập và định danh S.aureus ở tỉnh Sóc Trăng ....... 29 Bảng 3.6. Kết quả nuôi cấy và phân lập vi khuẩn S.aureus tại khu vực phía Nam theo từng loại mẫu. .................................................................................................... 30 Bảng 3.7. Kết quả kháng sinh đồ của S.aureus (n = 17) ........................................... 32 VII Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC SƠ ĐỒ BIỂU ĐỒ Sơ đồ 1.1. quy trình PCR .......................................................................................... 21 Sơ đồ 2.2. Quy trình thực hiện kháng sinh đồ S.aureus ............................................ 24 Biểu đồ 3.1. Tỉ lệ đề kháng đa kháng sinh của S.aureus (n= 15) ............................. 32 Biểu đồ 3.2. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu bệnh phẩm (n= 6) 33 Biểu đồ 3.3. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu nƣớc ..................... 34 Biểu đồ 3.4. Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong mẫu thực phẩm ............ 34 VIII Đồ án tốt nghiệp DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1. Hình thái Staphylococcus aureus ................................................................ 8 Hình 1.2. Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dƣơng dƣới kính hiển vi ................... 8 Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên hai môi trƣờng nuôi cấy ..................... 10 Hình 2.1. Cách đọc kết quả kháng sinh đồ ................................................................ 25 Hình 3.1. Khuẩn lạc vi khuẩn S.aureus trên môi trƣờng BP .................................... 27 Hình 3.2 Đặc điểm hình thái vi khuẩn S.aureus ....................................................... 27 Hình 3.3 Kết quả điện di phát hiện ........................................................................... 31 Hình 3.4. Kết quả kháng sinh đồ từ mẫu thực phẩm (005EQA.82BR) và mẫu bệnh phẩm (GS17.018P.AG) ............................................................................................. 31 IX Đồ án tốt nghiệp MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Vi khuẩn gây bệnh là một trong những nguyên nhân hàng đầu lấy đi sinh mạng của rất nhiều ngƣời trên thế giới. Nhƣng ngày nay, việc con ngƣời sản xuất thành công thuốc kháng sinh đƣợc xem là bƣớc tiến vĩ đại của ngành y học. Các bệnh nhiễm khuẩn trên ngƣời hiện nay đều có thể điều trị bằng kháng sinh. Ban đầu, dƣới tác dụng của một liệu trình kháng sinh, đa số vi khuẩn bị giết chết nhƣng sẽ có một số ít tồn tại và phát triển theo nguyên lý chọn lọc tự nhiên của Darwin. Vi khuẩn sẽ kháng thuốc bằng cách sản sinh ra enzyme mới phù hợp để phân huỷ kháng thể. Nếu chúng ta lạm dụng kháng sinh dùng với mục đích dự phòng hoặc dùng không đủ liều lƣợng, số ngày qui định sẽ dẫn đến vi khuẩn không bị tiêu diệt ngày càng nhiều và trở nên kháng thuốc rất nguy hiểm. Tình hình đề kháng kháng sinh của S.aureus đã trở thành một vấn đề thời sự của y tế thế giới. Tại Việt Nam: vấn đề này cũng không ngoại lệ, các bệnh nhiễm khuẩn vẫn luôn đƣợc đặt vào mối quan tâm hàng đầu của ngành y tế và hiện nay đã có nhiều nghiên cứu khoa học cảnh báo về tình trạng này. Sở dĩ S.aureus đƣợc quan tâm nhiều nhƣ vậy bởi vì vi khuẩn này là tác nhân gây bệnh nguy hiểm đứng đầu danh sách các tác nhân thƣờng gặp nhất trong các bệnh viện. Chúng gây ra nhiều ca nhiễm trùng trầm trọng cho ngƣời nhƣ: viêm da mãn tính, viêm xƣơng khớp, áp-xe ở các vị trí sâu, nhiễm trùng vết thƣơng, viêm phổi, viêm màng tim, viêm cơ tim, viêm màng nãoS.aureus có khả năng kháng kháng sinh rất nhanh, kéo dài thời gian nằm viện, tăng chi phí và làm tăng tỉ lệ tử vong. Với tình hình kháng kháng sinh ngày càng gia tăng nhanh thì trong tƣơng lai gần có thể dẫn đến tình trạng không còn đủ kháng sinh cho việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và loài ngƣời sẽ trở lại thời kỳ không có kháng sinh. Các nghiên cứu tại Viện Pasteur Nha Trang và Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh (TP.HCM) từ năm 2006 đến năm 2011 cũng cho thấy S.aureus ngày càng đề kháng với nhiều loại kháng sinh và tỉ lệ MRSA cũng ngày càng gia tăng. 1 Đồ án tốt nghiệp Vì thế việc xác định kháng sinh đặc hiệu cho từng loại vi khuẩn là điều cần thiết để hỗ trợ cho bác sĩ trong việc điều trị các bệnh nhiễm khuẩn và việc sử dụng đúng kháng sinh trong điều trị sẽ rút ngắn đƣợc thời gian điều trị, làm giảm thiểu đáng kể về chi phí, vật chất và tinh thần của ngƣời bệnh, đồng thời cũng hạn chế tỉ lệ S.aureus kháng kháng sinh trong cộng đồng. Vì vậy, chúng tôi tiến hành nghiên cứu tỉ lệ phân bố của vi khuẩn Staphylococcus và tình trạng đề kháng kháng sinh của chúng ở một số tỉnh thuộc khu vực phía nam. Kết quả nghiên cứu nhằm góp phần cung cấp cho các bác sĩ lâm sàng mức độ đề kháng kháng sinh của vi khuẩn. Từ đó, đề ra hƣớng chuẩn đoán và điều trị thích hợp, rút ngắn thời gian điều trị và sử dụng kháng sinh đạt hiệu quả nhất. 2. Tình hình nghiên cứu Năm 1945, Alexander Fleming ngƣời tìm ra penicillin, đã cảnh báo rằng việc lạm dụng kháng sinh có thể dẫn đến tình trạng chọn lọc tự nhiên ở vi khuẩn. Năm 1946 báo cáo từ một bệnh viện có 14% chủng staphylococcus đề kháng với penicillin, đến cuối thập kỷ này tỉ lệ chủng staphylococcus kháng thuốc tăng lên đến 59% ở bệnh viện này. Vài năm sau đó, con ngƣời chống lại S. aureus đề kháng bằng cách tìm ra kháng sinh mới là nhóm methicillin. Nhƣng đến năm 1961, S.aureus lại đề kháng methicillin để đƣợc gọi tên MRSA (Methicillin-resistant Staphylococcus aureus).Tuy nhiên vào năm 1961 tại Anh, và tình trạng đề kháng này bắt đầu ngày càng gia tăng, đến năm 1993 có 51 ca tử vong liên quan đến MRSA, năm 2005 có 1.629 ca tử vong, năm 2006 có 1.652 ca tử vong, tỷ lệ tử vong liên quan đến MRSA chiếm đến 50% . Khi đó, muốn chống lại MRSA phải dùng vancomycin là kháng sinh quý hiếm, dự trữ sau cùng. Đến năm 1997, tai họa lại đến là vì MRSA đề kháng đƣợc cả vancomycin VRSA(Vancomycin-resistant Staphylococcus aureus). Hiện nay, tên MRSA, VRSA đƣợc xem là nỗi kinh hoàng của giới chức y tế. Chỉ riêng MRSA hằng năm gây chết khoảng 20.000 ngƣời ở Mỹ, vƣợt xa HIV/AIDS. 2 Đồ án tốt nghiệp Từ tháng 8/2012- tháng 8/2013, một nghiên cứu tại phòng Vi sinh bệnh phẩm, khoa LAM Viện Pasteur Thành phố Hồ Chí Minh với 143 chủng S.aureus về tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong 4.299 bệnh phẩm, cho thấy: S.aureus chiếm 23,6% (n=143), đa số đƣợc phân lập từ bệnh phẩm mủ (36,3%), dịch âm đạo (18,9%), nƣớc tiểu (11,9%) và phân (10,5%) (n=143). Qua kết quả từ kháng sinh đồ, tỉ lệ đề của S.aureus với các KS là 93,7% với Penicilline G, 65,0% với Erythromycine, 60,8% với Kanamycine, 58% với Clindamycine. Tỉ lệ MRSA là 39,2% và MSSA là 60,8%. Với sự phát triển mạnh mẽ của khoa học con ngƣời đã tao ra nhiều loại kháng sinh mới để điều trị các chủng vi khuẩn khác cùng với chủng vi khuẩn kháng thuốc. Nhƣng thời gian dùng diễn ra không dài lại xuất hiện những vi khuẩn kháng lại những kháng sinh mới sử dụng, con ngƣời đã trở nên thất thế trong việc chạy đua với sự biến đổi của vi khuẩn. Kháng kháng sinh đã thực sự trở thành mối đe dọa với con ngƣời và nó xảy ra nhƣ một hiện tƣợng tất yếu của quy luật tƣơng sinh tƣơng khắc trong tự nhiên. Thực tế ngày càng nhiều các nhiễm khuẩn bệnh viện gây ra do Tụ cầu, các nhiễm khuẩn này xảy ra ở mọi lứa tuổi, nhiều khoa phòng và đơn vị điều trị. 3. Câu hỏi nghiên cứu Tỉ lệ phân bố của S.aureus ở một số tỉnh thuộc khu vực phía nam là bao nhiêu? Tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus phân lập đƣợc ở khu vực phía nam là bao nhiêu ? 4. Mục tiêu nghiên cứu Mục tiêu tổng quát: Xác định tỉ lệ phân bố và tỉ lệ đề kháng kháng sinh của S.aureus trong các mẫu nƣớc, thực phẩm, bệnh phẩm ở khu vực phía nam từ tháng 12/2016 đến tháng 06/2017. Mục tiêu cụ thể:  Xác định tỉ lệ phân bố của S.aureus trong các mẫu môi trƣờng, thực phẩm, bệnh phẩm ở 5 tỉnh thành Bến Tre, Bình Phƣớc, Sóc Trăng, An Giang, TP.HCM. 3 Đồ án tốt nghiệp  Xác định tỉ lệ đề kháng 7 loại kháng sinh của S.aureus trong các loại mẫu môi trƣờng, thực phẩm, bệnh phẩm ở 5 tỉnh thành Bến Tre, Bình Phƣớc, Sóc Trăng, An Giang, TP.HCM.  Xác định tỉ lệ S.aureus kháng Methicillin (MRSA) trong các loại mẫu môi trƣờng, thực phẩm, bệnh phẩm ở 5 tỉnh thành Bến Tre, Bình Phƣớc, Sóc Trăng, An Giang, TP.HCM. 4 Đồ án tốt nghiệp CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Tụ cầu khuẩn Staphylococcus aureus 1.1.1. Tình hình phân bố của Staphylococcus aureus 1.1.1.1. Trên thế giới Năm 1878, Robert Koch phát hiện Staphylococcus aureus sau khi thực hiện phân lập từ mủ ung nhọt. Năm 1880 Louis Paster cũng đã thực hiên tiến hành phân lập và nghiên cứu về Staphylococcus aureus. Ngày 09/04/1880 bác sĩ ngƣời Scotland Alexander Ogston đã trình bày tại hội nghị lần thứ 9 hội phẫu thuật Đức một báo cáo khoa học, trong đó ông sử dụng khái niệm tụ cầu khuẩn (staphylococcus) và trình bày tƣơng đối đầy đủ vai trò của vi khuẩn này trong các bệnh lý sinh mủ lâm sàng. Đến năm 1881 Ogston đã thành công trong việc gây bệnh thực nghiệm, đây là tiền đề cho những nghiên cứu về S.aureus sau này. Đến năm 1884 Rosenbach đã thực hiện một loạt các nghiên cứu tỉ mỉ hơn về vi khuẩn này. Và ông đã đặt tên cho vi khuẩn này là Staphylococcus aureus. Năm 1926 Julius von Daranyi là ngƣời đầu tiên phát hiện mối tƣơng quan giữa sự hiện diện hoạt động men coagulase huyết tƣơng của vi khuẩn với khả năng gây bệnh của nó. Tuy nhiên mãi đến năm 1948 phát hiện này mới đƣợc chấp nhận rộng rãi. Từ năm 1988 đến 1992, S. aureus gây ra 5,1% trong số các vụ ngộ độc ở Châu Âu (G.Normanno và ctv, 2005). Từ năm 1988 đén 1996, ở Đức xảy ra nhiều vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu gây ra và vào năm 2000 lại xảy ra một vụ dịch làm 297 ngƣời bị ngộ độc cũng do tác nhân là tụ cầu (Viktoria Atanassovavà ctv, 2001). Từ năm 1986 đến năm1995, ở Đài Loan vi khuẩn S. aureus chiếm 30% trong số các vụ dịch. Vào tháng 6 năm 2000, vụ ngộ độc thực phẩm do tụ cầu tại một trƣờng trung học ở Taichung County làm 10 trong số 356 học sinh có biểu hiện ngộ độc 2-3 giờ sau khiăn sáng (H.-L. Wei và C.-S. Chiou, 2002) . 5 Đồ án tốt nghiệp Tại Brazil, vào tháng 2 và tháng 5 năm 1999 đã xảy ra hai vụ dịch làm 378 ngƣời bị ngộ độc do dùng phomai và sữa tƣơi có nhiễm tụcầu (L. Simeaxo do Carmo và ctv, 2002). Tại Pháp, năm 1997 ngƣời ta tìm thấy S. Aureus là tác nhân gây ra 569 trong tổng số 1142 vụ ngộ độc thực phẩm (J.P. Rosec và O.Gigaud, 2002). Ở Nhật, từ năm 1994 đến năm 1998 số trƣờng hợp ngộ độc do tụ cầu chiếm 3,1-11,9% tổng số các vụ ngộ độc thực phẩm do vi khuẩn. Ngày 17/6/1999, 21 trong số 53 công nhân sau khi ăn trƣa tại căn tin công ty ở Shizuoka Prefecter thì có biểu hiện bệnh,trong đó có 8 trƣờng hợp phải nhập viện (Norinaga Miwa và ctv, 2000). 1.1.1.2 Tại Việt Nam Theo đánh giá của tổ chức ý tế thế giới, hàng năm Việt Nam có khoảng trên 3 triệu ca ngộ độc thực phẩm, gây tổn hại trên 200 triệu USD. Trong những năm gần đây số vụ ngộ độc thực phẩm ở nƣớc ta ngày càng gia tăng. Năm 2000 có 213vụ ngộ độc thực phẩm với 4233 ngƣời mắc 59 ngƣời tử vong (Bùi Thế Hiền, Tô ThịThu và cộng sự, 2003). Theo số liệu từ cục Quản lý chất lƣợng vệ sinh an toàn thực phẩm, trong những vụ dịch đƣợc tổng kết từ năm 1997 đến 2002 thì ngộ độc thực phẩm do tác nhân vi sinh vật chiếm tỷ lệ cao từ 40-45% trong các loại gây ngộ độc, trong số đó có nhiều vụ đƣợc xác định tác nhân là Staphylococcus aureus. Từ năm 2002 đến 2004 theo số liệu của trung tâm y tế dự phòng đã có 77 vụ ngộ độc thực phẩm mà phần lớn nguyên nhân là do thức ăn bị nhiễm khuẩn, chiếm 66%(Nguyễn Lý Hƣơng và ctv, 2005). Từ dữ liệu của Cục vệ sinh an toàn thực phẩm thì năm 2005 số vụ ngộ độc thực phẩm ở nƣớc ta là 141 vụ, làm 4291 ngƣời bị ngộ độc, trong đó có 73 vụ (51,8%) là do vi sinh vật gây ra. Từ tháng 1/2006 đến tháng 3/2006, có 18 vụ ngộ độc thực phẩm,trong đó vi sinh vật gây ra 5 vụ (27,8%). 1.2 Đặc điểm và phân loại tụ cầu khuẩn (Staphylococcus aureus) 1.2.1 Giới thiệu S.aureus (hay còn gọi là Tụ cầu vàng) có dạng hình cầu, đƣờng kính 0,5 – 1,5µm, không di động, không sinh nha bào. Trên phiến phết nhuộm Gram: vi khuẩn 6 Đồ án tốt nghiệp có thể đứng riêng lẻ, từng đôi, bốn con hoặc xếp thành hình chùm nho, bắt màu Gram dƣơng, nhƣng đôi khi chúng bắt màu Gram âm trong những lứa cấy già. S.aureus thuộc nhóm tụ cầu có men coagulase nên trên môi trƣờng thạch máu gây tiêu huyết, trên môi trƣờng đặc mọc khuẩn lạc màu trắng sứ hoặc trắng ngà hoặc màu vàng. S.aureus phân bố khắp nơi trong tự nhiên nhƣ đất, nƣớc, không khí. Quần thể tụ cầu khuẩn phổ biến có thể sống trên cơ thể của ngƣời. Rất nhiều ngƣời khỏe mạnh có mang S.aureus nhƣng không bị nhiễm bệnh, chúng đƣợc gọi là “tạo khóm”. Khi những vi khuẩn này gây bệnh thì ngƣời bị bệnh đƣợc gọi là “nhiễm” S.aureus. Trong đa số trƣờng hợp, S.aureus không gây ra vấn đề gì hoặc chỉ gây nhiễm khuẩn nhẹ nhƣ nổi mụn mủ hoặc bóng nƣớc. Nhƣng trong một số trƣờng hợp, S.aureus có thể gây nhiễm khuẩn trầm trọng hơn. Tỷ lệ ngƣời mang vi khuẩn tụ cầu vàng trên da hoặc niêm mạc vào khoảng từ 10 đến 90%. Các khu vực cƣ trú thƣờng gặp của tụ cầu vàng là tiền đình mũi, tóc, nách và nếp hậu môn. Đây là nguồn lây chéo trong các đơn vị hồi sức, đặc biệt là ở các bệnh nhân suy giảm miễn dịch nhƣ đái tháo đƣờng, bệnh nhân AIDS hoặc xơ gan. Chủng vi khuẩn nguy hiểm trong các khu vực này là tụ cầu vàng đề kháng với methicillin. 1.2.2 Phân loại tụ cầu vàng Phân loại của vi khuẩn Staphylococcus Aureus nhƣ sau: Giới: Prokaryote Phân loại: Firmicute Lớp: Firmibacteria Họ: Micrococceae Giống: Staphylococcus 1.2.3 Đặc điểm sinh học 1.2.3.1 Hình thể và tính chất bắt màu của Stphylococcus aureus Staphylococcus aureus thuộc giống Staphylococcus, do đó mang những tính chất chung của Staphylococcus.Tụ cầu vàng là những vi khuẩn hình cầu có đƣờng 7 Đồ án tốt nghiệp kính 0,8 - 1μm đứng tụ lại với nhau thành từng đám nhƣ chùm nho; đôi khi có thể đứng riêng rẽ hoặc thành từng đôi hay từng chuỗi ngắn. Tụ cầu thƣờng không có vỏ, không có lông, không di động, không sinh nha bào, bắt màu Gram dƣơng. Hình 1.1. Hình thái Staphylococcus aureus (Nguồn: www.impe-qn.org.vn) Hình 1.2. Tụ cầu Staphylococcus aureus gram dƣơng dƣới kính hiển vi 8 Đồ án tốt nghiệp 1.2.3.2 Nuôi cấy Tụ cầu vàng thuộc loại vi khuẩn hô hấp hiếu khí kỵ khí tuỳ nghi, phát triển dễ dàng trên các môi trƣờng nuôi cấy thông thƣờng. Tụ cầu vàng có khả năng phát triển đƣợc ở khoảng nhiệt độ dao động từ 10 - 45 o C và môi trƣờng có nồng độ muối cao tới 10%. Trong môi trƣờng canh thang sau 5 - 6 giờ vi khuẩn đã phát triển mạnh và làm đục đều môi trƣờng, để lâu đáy có lắng cặn. Hầu hết các dòng S. aureus đều tạo sắc tố vàng, nhƣng các sắc tố này ít thấy khi quá trình nuôi cấy còn non mà thƣờng thấy rõ sau 1-2 ngày nuôi cấy ở nhiệt độ phòng. Sắc tố đƣợc tạo ra nhiều hơn trong môi trƣờng có hiện diện lactose hay các nguồn hidrocacbon khác mà vi sinh vật này có thể bẻ gãy và sử dụng (Collin C.H và cs, 1995). Trên môi trƣờng BP (Baird Parker), khuẩn lạc đặc trƣng của S. aureus có màu đen nhánh, bóng, lồi, đƣờng kính 1-1,5 mm, quanh khuẩn lạc có vòng sáng rộng 2-5 mm (do khả năng khử potassium tellurite và khả năng thủy phân lòng đỏ trứng của lethinase) (Rosamund M B. và cs, 1995; Mary K. S. và cs, 2002). Trên môi trƣờng MSA (Manitol salt agar) hay còn gọi là môi trƣờng Chapman, khuẩn lạc tròn, bờ đều và lồi, màu vàng nhạt đến vàng đậm và làm vàng môi trƣờng xung quanh khuẩn lạc (do lên men đƣờng manitol) (Mary K. S. và cs, 2002). Một số dòng S. aureus có khả năng gây tan máu trên môi trƣờng thạch máu, vòng tan máu phụ thuộc vào từng chủng nhƣng chúng đều có vòng tan máu hẹp hơn so với đƣờng kính khuẩn lạc.  Khuẩn lạc tụ cầu vàng dạng S, kích thƣớc khoảng 1 – 2mm, tan máu hoàn toàn, có màu vàng.  Khuẩn lạc tụ cầu khác: dạng S, kích thƣớc khoảng 1 – 2mm, có màu trắng và thƣờng không gây tan máu. 9 Đồ án tốt nghiệp Môi trƣờng Bair- Paker Môi trƣờng Chapman Hình 1.3. Hình thái khuẩn lạc S.aureus trên hai môi trƣờng nuôi cấy 1.2.4 Điều kiện tăng trưởng và sự phân bố Nhu cầu dinh dƣỡng cho sự phát triển của Staphylococcus aureus thay đổi tùy thuộc vào từng dòng. S. aureus có khả năng phát triển trong khoảng nhiệt độ rất rộng, từ 7-48 o C, với nhiệt độ cực thuận là 30-45 o C; khoảng pH 4,2-9,3, với độ pH cực thuận là 7-7,5; và trong môi trƣờng chứa trên 10% NaCl. Tụ cầu bền vững khi có nồng độ đƣờng cao, nhƣng bị ức chế bởi nồng độ 60%; nồng độ từ 33 - 55%, tụ cầu vẫn phát triển. Ngoài ra, chúng còn có khả năng bám dính tốt trên nhiều loại tế bào và máy móc thiết bị giúp gia tăng tính kháng của tụ cầu với sự sấy khô và lọc thấm. Chính nhờ những đặc điểm trên giúp S. aureus có sự phân bố rộng, chủ yếu đƣợc phân lập từ da, màng nhày, tóc và mũi của ngƣời và động vật máu nóng. S. aureus đƣợc cho là vi khuẩn khá mạnh có thể sống tốt bên ngoài kí chủ. Vi khuẩn này còn có mặt trong không khí, bụi và trong nƣớc dù chúng thiếu tính di động và rất nhạy với thuốc kháng sinh và chất diệt khuẩn. Tuy nhiên, S. aureus cũng khá nhạy với nhiệt độ, bị diệt ở 60 o C từ 2-50 phút tùy từng loại thực phẩm và là vi sinh vật cạnh tranh yếu, dễ bị các vi sinh vật khác ức chế (Bremer P.J và cs, 2004). Có 10 - 50% dân số vẫn sống khỏe mạnh dù mang S. aureus (Bremer P.J và cs, 2004). Tuy nhiên khả năng nhiễm vào thực phẩm và gây bệnh của S. aureus cũng 10 Đồ án tốt nghiệp rất lớn do chúng phân bố ở khắp nơi và có khả năng sinh độc tố. Tụ cầu nhiễm thực phẩm vào chủ yếu qua con đƣờng chế biến có các công đoạn tiếp xúc trực tiếp với ngƣời. Sự hiện diện với mật độ cao của S. aureus trong thực phẩm cho thấy điều 12 kiện vệ sinh của quá trình chế biến kém, kiểm soát nhiệt độ trong các công đoạn chế biến không tốt. Tuy nhiên, điều đó không đủ bằng chứng để cho rằng thực phẩm đó sẽ gây độc, điều đó chỉ xảy ra khi S. aureus đƣợc phân lập tạo độc tố. Ngƣợc lại, chỉ với một lƣợng nhỏ S. aureus tạo độc tố cũng có thể gây ngộ độc (Reginald W. B. và cs, 2001). 1.2.5. Đặc điểm sinh hóa Phát triễn tốt ở môi trƣờng tổng hợp, đặc biệt ở môi trƣờng thạch máu hoặc huyết thanh. Sinh beta hemolysis trong môi trƣờng thạch máu. Phản