Khảo sát tính thích nghi của cây Hoàng Lan [Cananga odorata (Lam.) Hook.f.et Thomson] tạo được từ các kỹ thuật nhân giống khác nhau tại tỉnh Bình Phước

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP. HỒ CHÍ MINH Trần Thị Thanh Phương KHẢO SÁT TÍNH THÍCH NGHI CỦA CÂY HOÀNG LAN [Cananga odorata (Lam.) Hook. f. et Thomson] TẠO ĐƯỢC TỪ CÁC KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG KHÁC NHAU TẠI TỈNH BÌNH PHƯỚC Chuyên ngành: Sinh Thái Học Mã số: 60 42 60 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Vương Đình Tuấn TS. Phạm Văn Ngọt Thành phố Hồ Chí Minh – 2010 LỜI CẢM ƠN Toâi xin chaân thaønh caûm ôn Thaày Vöông Ñình Tuaán, thaày Phaïm Vaên Ngotï ñaõ taän tình chæ baûo, giuùp ñôõ, ñoäng vieân vaø ñöa ra nhöõng yù kieâùn quyù baùu cho toâi trong quaù trình hoïc taäp, nghieân cöùu vaø thöïc hieän quyeån luaän vaên naøy. Quyù thaày coâ khoa sinh hoïc tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh ñaõ giuùp ñôõ toâi raát nhieàu trong quaù trình hoïc taäp. Quyù thaày coâ thuoäc boä moân thöïc vaät tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Thaønh Phoá Hoà Chí Minh ñaõ giuùp ñôõ toâi trong quaù trình thöïc hieän luaän vaên. Caùc coâ chuù, anh chò ôû Phaân Vieän Nghieân cöùu Khoa hoïc Laâm Nghieäp Nam Boä, Ñaøi Khiù töôïng Thuûy vaên Nam Boä, ñaõ coäng taùc, giuùp ñôõ toâi trong quaù trình thöïc hieän luaän vaên naøy. Taát caû caùc anh chò, baïn beø, ñoàng nghieäp vaø nhöõng ngöôøi thaân trong gia ñình ñaõ giuùp ñôõ, taïo ñieàu kieän cho toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy. DANH LỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4D : 2,4-dichlorophenoxy acetic acid. BA : 6-benzyl aminopurine. C : Số cành cấp I D : Đường kính thân GA3 : Acid gibberellic. H : Chiều cao cây IAA : Indole-3-acetic acid IBA : Indole 3-butyric acid. L: Số lượng lá trên cây MS : Murashige and Skoog’s NAA : 1-naphthylacetic acid. S : Diện tích lá TB : Trung bình WPM : Woody Plant Media   MỞ ĐẦU 1. Đặt vấn đề Cây Hoàng lan (Cananga odorata (Lam.) Hook. f. & Thomson) hay còn được gọi là Ngọc lan tây, thuộc họ Na (Annonaceae), là một trong các loài thực vật chứa tinh dầu phân bố ở Việt Nam, các nước Đông Nam Á, một số nước Châu Phi và Châu Mỹ. Hoa hoàng lan có chứa tinh dầu (ylang-ylang oil) được ưa chuộng trong công nghiệp hương liệu. Tinh dầu này từ lâu đã được sử dụng để điều chế nước hoa nổi tiếng Chanel No5. Và là nguyên liệu chính để sản xuất hầu hết các loại nước hoa đắt tiền [18], cũng như được dùng rộng rãi trong công nghiệp sản xuất nước hoa theo phong cách phương Đông [48]. Tinh dầu hoàng lan có mùi thơm hấp dẫn tạo hương vị đặc biệt nên còn được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và đồ uống. Ngoài ra, nó còn được dùng làm thuốc chữa bệnh cao huyệt áp, chữa chứng nhịp tim nhanh, sốt rét, bệnh đường ruột, viêm gan … [18] Cây hoàng lan là cây trồng có tiềm năng sinh lợi rất lớn. Cây trồng 2 năm tuổi bắt đầu ra hoa, đến 4 – 5 năm tuổi ra hoa rất nhiều và chu kỳ khai thác có thể đến 50 năm. Mỗi cây cho khoảng 20kg hoa/năm. Một kg tinh dầu hoàng lan có giá trị từ 81 – 97 đô la Mỹ [18]. Trên các trang web, 1 lọ 10 ml tinh dầu Ylang Ylang giá khoảng 10 -20USA [49]. Cây hoàng lan được trồng với quy mô lớn ở nhiều nước như : Philippinnes, Indonesia, quần đảo Camoros, Réunion, tỉnh Quảng Đông (Trung Quốc), đảo Madagasca , các nước Châu Phi…, và trở thành cây có tinh dầu đem lại nguồn lợi đáng kể. Ở Indonesia, diện tích trồng hoàng lan lên đến 160.000 ha với sản lượng tinh dầu hàng năm khoảng 120 tấn [18]. Tại Việt Nam, cây Hoàng lan thường được trồng rãi rác ở các công viên, trường học, nhà dân để lấy bóng mát hoặc làm cảnh, chưa được tập trung thành diện tích lớn. Nước ta có điều kiện sinh thái phù hợp cho sự sinh trưởng, phát triển của cây hoàng lan, hoàn toàn có thể trồng với quy mô lớn, nhằm cải thiện thu nhập của người dân. Tuy nhiên, hiện những nghiên cứu về giống, kỹ thuật gieo trồng, kỹ thuật thu hái và chế biến hoàng lan hầu như chưa được nghiên cứu ở Việt Nam. Để góp phần đưa cây hoàng lan – một cây có giá trị kinh tế cao – được trồng rộng rãi ở Việt Nam, đề tài “Khảo sát tính thích nghi của cây hoàng lan [Cananga odorata (Lam.) Hook. f. et Thomson] tạo được từ các kỹ thuật nhân giống khác nhau tại Thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước” được tiến hành. 2. Mục tiêu nghiên cứu ‐ Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính cây hoàng lan bằng biện pháp nuôi cấy invitro và giâm cành. ‐ Khảo sát tính thích nghi của cây Hoàng lan trên nền đất tỉnh Bình Phước. ‐ So sánh sự sinh trưởng của cây giống tạo từ hạt và cành giâm sau giai đoạn vườn ươm. 3. Nội dung nghiên cứu ‐ Nghiên cứu kỹ thuật nhân giống vô tính hoàng lan bằng giâm cành và nuôi cấy invitro: o Giâm cành hoàng lan : Sử dụng hóa chất kích thích là IBA và thuốc thương phẩm. o Nuôi cấy invitro hoàng lan : Khảo sát khử trùng chồi, tạo chồi, vươn chồi và tạo rễ. ‐ Theo dõi sinh trưởng của cây hoàng lan tạo từ hạt và cành giâm trồng ở huyện Bình Long, tỉnh Bình Phước. 4. Phạm vi nghiên cứu ‐ Nghiên cứu nồng độ IBA thích hợp cho sự hình thành rễ của các đoạn cành và đoạn thân cây hoàng lan. ‐ Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy invitro hoàng lan như: nồng độ chất khử trùng, nồng độ chất điều hòa sinh trưởng (BA, NAA) trong tạo chồi, nồng độ GA3 trong vươn chồi, nồng độ IBA trong tạo rễ. ‐ So sánh sự sinh trưởng của cây hoàng lan tạo từ hạt và cành giâm trồng tại huyện Bình long, tỉnh Bình Phước trong 4 tháng. 5. Thời gian tiến hành thí nghiệm Từ tháng 06/2009 đến tháng 9/2010.  Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Một số đặc điểm sinh học, sinh thái của Hoàng lan Cây hoàng lan có vị trí phân loại như sau: Giới (Kingdom) : Plantae Phân giới (Subkingdom) : Tracheobionta Siêu ngành (Superdivision) : Spermatophyta Ngành (Division) : Magnoliophyta Lớp (Class) : Magnoliopsida Phân lớp (Subclass) : Magnoliidae Bộ (Order) : Magnoliales Họ (Family) : Annonaceae Giống/Chi (Genus) : Cananga (DC.) Hook. f. et Thomson Loài (Species) : Cananga odorata (Lam.) Hook. f. et Thomson [50] Bảng 1. Tên gọi cây hoàng lan ở các quốc gia trên thế giới STT Quốc gia Tên địa phương 1 Cambodia chhke sreng [52] 2 Chuuk pwanang, pwuur, pwalang [51] 3 Cook Islands, Niue, Tahiti moto‘oi, mata‘oi, mato‘oi [51] 4 English ylang ylang, perfume tree, cananga [51] 5 Fiji makosoi, mokohoi, makasui, mokosoi [51] 6 French canang odorant [51] 7 Guam, CNMI ilang-ilang, alang-ilang [51 8 Hawai‘i Lanalana [51] 9 Indonesia kenanga (Javanese) [51] 10 Kosrae ilahnglahng, ilanlang [51] 11 Malaysia Chenanga [52] 12 Marquesas–Nukuhiva, Niue Motoi [51] 13 Marquesas–Fatuhiva Mutuis [51] 14 Marshall Islands Ilanilan [51] 15 Nauru derangerang, derangirang [51] 16 Palau chiráng, irang [51] 17 Philipine cananga, ilang-ilang [52] 18 Pohnpei ilangilang, lengileng, alangilang, pur-n-wai, pwurenwai, seir en wai [51] 19 Puluwat Atoll Pwalang [51] 20 Samoa moso‘oi [51] 21 Society Islands moto‘I [51] 22 Solomon Islands: Kwara‘ae sa‘o [51] 23 Tonga Mohokoi [51] Đặc điểm sinh học : Cây gỗ cao 10 - 15m, đường kính 30 - 50cm. Thân tròn, cành thường đâm ngang, dễ gãy. Vỏ màu xám tro nhạt, nhẵn. Gỗ màu vàng nhạt, mềm. Tán lá hình trụ. Lá đơn mọc cách, xếp thành hai hàng trên một cành nhỏ, dể rụng. Phiến lá mềm, mỏng; hình trái xoan hay hình trứng, hơi lệch, hơi gợn sóng; gốc lá tròn, đầu thuôn; hai mặt nhẵn dài 15 - 20cm. Cây hoàng lan ra hoa quanh năm. Hoa có màu vàng hay vàng lục, mọc thành từng cụm trên những nhánh ngắn không có lá; cánh hoa dài, hình tam giác. Cánh tràng 6 xếp thành hai vòng, dài và lượn sóng, đầu thuôn hẹp, thường cuộn ra phía ngoài. Nhị đực nhiều, bao phấn hướng trong, trung đới hình nón, lá noãn 8 - 10, vòi dài, dầu nhụy có lông tơ. Khi còn non, hoa có màu xanh, khi chín hoa có màu vàng. Quả còn non màu xanh, hình trứng ngược, kích cỡ 15 – 25mm x 8 – 10mm, nhẵn, không có lông, vỏ quả dày khoảng 2mm. Mỗi quả có 10 -12 hạt, dẹt. [1] Đặc điểm sinh thái : Cây ưa sáng, mọc nhanh, phát triển mạnh mẽ ở miền cận nhiệt đới, nơi có lượng mưa hàng năm khoảng (650-)1500-2000(-4000) mm và nhiệt độ trung bình hàng năm từ 21- 270C. Ở Java, hoàng lan sinh trưởng thành cụm ở rừng mưa ẩm thường xanh và ở rừng tếch. Còn ở New Guinea, nó mọc ở độ cao 850m [52]. Phân bố : Cây có nguồn gốc ở Đông Nam Á, được du nhập vào Trung Quốc, Ấn Độ, Châu Phi và Châu Mỹ [52]. Thành phần hóa học. Tinh dầu Hoàng lan chứa 0,3 – 25% [2], bao gồm: ethyl anthranilate (p- Cresyl methyl ether), benzyl acetate, methyl benzoate, methyl salicylate, cinnamyl acetate, -linalool, , geranyl acetate, farnesyl acetate and muurolol, p-cresol, eugenol, isoeugenol, benzyl salicylate [53]. Giá trị : Gỗ hoàng lan nhẹ, màu vàng nhạt, thớ mịn, dùng để tiện khắc, làm văn phòng phẩm, dễ gia công chế biến, nhưng kém chịu đựng, dễ nứt nẻ, mối mọt, chủ yếu làm củi. Hoa rất thơm và chứa tinh dầu (ylang –ylang oil), được dùng để sản xuất nước hoa theo phong cách phương Đông, đặc biệt là nước hoa nổi tiếng Chanel No5. Mùi hoàng lan được pha trôn khá tốt với mùi cây cỏ, hoa quả và gỗ, để dùng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và đồ uống. Tinh dầu hoàng lan tạo cho cơ thể một cảm giác thoải mái, tâm trí thanh thản và được coi là một loại thuốc làm dịu đi sự mệt mỏi của cơ thể. Tinh dầu này giúp điều tiết các chất bã nhờn ở da, làm giảm huyết áp, làm giảm sự căng cơ, và có tác dụng kích thích hung phấn tình dục, dùng chữa chứng nhịp tim nhanh, bệnh sốt rét, bệnh đường ruột, viêm gan…[18] 1.2. Tình hình nghiên cứu cây hoàng lan trên thế giới và ở Việt Nam 1.2.1. Trên thế giới Hình 1. Cây và quả hoàng lan ở Giồng trôm – Bến Tre Thông tin đầu tiên về Hoàng lan được biết từ John Ray (1628-1705), nhà phân loại học người Anh, đã mô tả cây với tên Arbor saguisen. Hoàng lan cũng đã được ghi chép lại bởi nhiều nhà khoa học khác với các tên như Borga cananga, Unona odorata. Theo Oyen và cộng sự (1999) thì cây hoàng lan ưa điều kiện nóng ẩm ở các khu vực thấp trong vùng nhiệt đới, với nhiệt độ trung bình năm 21 – 27oC, lượng mưa hàng năm khoảng 1500 – 2000mm. Cây sinh trưởng tốt trên các vùng đất màu mỡ, đất nham thạch, quang đãng, nhiều ánh sáng, đất hơi chua đến hơi kiềm (pH : 4,5 – 8). Manner và Elevitch (2006) đã miêu tả đặc điểm hình thái, phân bố, công dụng của cây Hoàng lan. Cây hoàng lan sinh trưởng nhanh khi gặp điều kiện thuận lợi và có thể đạt 2m trong 1 năm. Cây thường phân bố ở những vùng đất thấp hoặc rừng tái sinh có độ cao 800 – 1200m so với mực nước biển. Những vùng này thường có lượng mưa lớn bình quân 700 – 5000mm/năm và có nhiều ánh sáng. Độ pH thích hợp cho cây thường trung tính hơi ngả acid yếu. Đất nhiễm mặn với nộng độ muối cao không phù hợp cho trồng hoàng lan. Cây có thể chịu được nhiệt độ thấp nhất từ 10 – 18oC, nhiệt độ cao nhất là 28 – 35oC. Nhiệt độ thích hợp trung bình cho sinh trưởng của hoàng lan là 18 – 28oC. Các loại đất cát, sét chứa nhiều mùn hoặc đất sét, hay đỏ bazan có nguồn gốc từ nham thạch, đất cát màu mỡ có nhiều mùn đều thích hợp để trồng hoàng lan. Cây 1,5 – 2 năm tuổi thì bắt đầu ra hoa, mỗi cây trưởng thành có thể cho 20 – 100kg hoa trong 1 năm. Hoàng lan được nhân giống chủ yếu bằng hạt. Hạt được gieo trong các túi bầu đất đến khi có 6 – 10 lá thì đem trồng ra đất. Mật độ trồng hoàng lan thường là 6 x 6m [57]. Tuy nhiên, ở đảo Pohnpei thuộc liên bang Micronesia (đảo quốc ở Thái Bình Dương) người ta trồng hoàng lan với mật độ 4 x 4m [18]. Hoang và cộng sự (1986) thuộc Đại học Philippines đã nghiên cứu nhân giống ilang-ilang [Cananga odorata (Lamk.) Hook.f. và Thomson] bằng hạt và giâm cành. Kết quả khi nghiên cứu nảy mầm cho thấy, ngâm hạt trong nước ấm 60oC trong 24 giờ là cách xử lý tốt nhất, và cho tỷ lệ nảy mầm khá cao (92%). Nhân giống bằng giâm cành chỉ thành công khi lấy mẫu từ những cây con. Cành giâm lấy từ ngọn của cây con cho tỷ lệ sống cao (98%) và tỷ lệ ra rễ cũng cao (92%), số rễ cũng nhiều hơn, rễ dài hơn so với cành giâm ở vị trí thấp hơn. Mặc dù NAA (naphthalene acetic acid), IBA (indole butyric acid) và Hormex (chất kích thích ra rễ thương phẩm) cho thấy không có ảnh hưởng xấu đến tỷ lệ sống của cành giâm, nhưng IBA có hiệu quả tác động nhiều nhất đến sự hình thành rễ [60]. Molabayabas và cộng sự (1995), cũng thuộc trường đại học Philipines, đã thực hiện nuôi cấy invitro ilang-ilang từ chồi ngọn cây con. Mẫu cấy được rửa, sau đó vô trùng bằng NaOCl với nồng độ 0,3%. Các nghiệm thức được cho là môi trường thích hợp cho sự hình thành mô sẹo, được thực hiện trên môi trường MS hoặc WPM chứa 1 – 2mg/l BAP kết hợp 0,1 – 0,5mg/l NAA. Sự biệt hóa số lượng lớn chồi và mầm được ghi nhận trong môi trường MS chứa 2mg/l BAP với NAA từ 0,1 – 0,2mg/l. Mầm chồi đã biệt hóa sinh trưởng bình thường khi được cấy trên môi trường WPM có BAP riêng rẽ hoặc kết hợp với 0,1mg/l và 0,5 mg/l NAA; trong khi trên môi trường MS thì tạo ra những dạng không bình thường. Trong môi trường WPM và MS có bổ sung kinetin hoặc NAA riêng rẽ thì ít có hoặc không có tác dụng lên sự hình thành mô sẹo và chồi. Tuy nhiên, nếu bổ sung 15% nước dừa vào môi trường WPM và BAP từ 1 – 10mg/l, ghi nhận thúc đẩy tạo sẹo, làm giảm sự hình thành chồi. Chồi đã được biệt hóa sinh trưởng bình thường khi được cấy chuyền sang môi trường WPM có 2mg/l BAP, trong khi đó, trên môi trường MS có cùng chất điều hòa sinh trưởng, các chồi này hình thành nên những kết cấu giống protocorn trên bề mặt lá. Môi trường WPM có hiệu quả hơn môi trường MS trong sự cảm ứng tạo rễ. Sự hình thành nhiều rễ và tốt hơn trên môi trường WPM có 0,5mg/l IBA. Cây con tái sinh từ mô sẹo chồi ngọn có thể sinh trưởng dưới điều kiện bình thường [60]. Năm 2008, một số nhà khoa học của Philippine, như Lindain, Reglos, Guzman và Cedo, đã thực hiện nuôi cấy invitro hoàng lan, đồng thời, khảo sát lượng sản phẩm tinh dầu trong mô sẹo tạo được từ cánh hoa. Tác giả sử dụng các nguồn vật liệu khác nhau (chồi ngọn, chồi nách, lá non, noãn và cánh hoa) nhằm khảo sát khả năng biệt hóa chồi thông qua mô sẹo ( con đường gián tiếp). Khử trùng mẫu cấy bằng 3 chất khử trùng : alcohol 70%, thuốc diệt nấm và NaOCl. Nhúng nhanh mẫu cấy vào alcohol 70%, hoặc thời gian tối đa là 30s, sau đó chuyển qua lắc trong thuốc diệt nấm trong 20 phút với các nồng độ khác nhau đối với từng nguồn vật liệu khác nhau. Cuối cùng là sử dụng NaOCl với nồng độ khác nhau nhưng ở khoảng thời gian là 10 phút. Cảm ứng tạo mô sẹo mẫu cấy đã vô trùng trong môi trường có BA 2mg/l kết hợp với NAA 0,2 mg/l, cho tỉ lệ mô sẹo tốt và mô sẹo này có khả năng cho ra chồi. Tuy nhiên với mỗi loại vật liệu khác nhau thì màu sắc mô sẹo, tốc độ tăng trưởng của mô sẹo có khác nhau. Mô sẹo được tạo từ cánh hoa cho ra muộn hơn so với các nguồn vật liệu khác. Mô sẹo từ bầu nhụy cái cho sự tăng trưởng nhanh nhất, trong khi mô sẹo từ chồi ngọn và chồi nách thì chậm nhất. Mầm chồi được tạo từ mô sẹo chồi ngọn, chồi nách và lá sau 15 – 16 tuần cấy chuyển trên môi trường MS có 0,2mg/l NAA +2mg/l BAP. Các mầm này được vươn cao trên môi trường WPM có 2mg/l BAP. Trong khảo sát ảnh hưởng của môi trường lên sự tạo mô sẹo và biệt hóa chồi thì WPM tạo được ưu thế hơn do ti lệ hóa nâu thấp, tỉ lệ tạo chồi cao, tỉ lệ cây bị thủy tinh hóa thấp, điều này có thể là do nồng độ của Nitrate trong WPM thấp hơn trong MS. Tái sinh rễ được tạo trên môi trường ½ WPM có 0,5mg/l IBA [56]. 1.2.2. Ở Việt Nam Một số tài liệu miêu tả về hình thái, đặc điểm phân bố, đặc điểm sinh học về cây hoàng lan của Phạm Hoàng Hộ, Võ Văn Chi, Trần Hợp mang tính đại cương. Việc nghiên cứu nhân giống và khảo sát sinh trưởng cây hoàng lan hiện còn khá mới. Nguyễn Thị Minh Nguyệt (2002) đã khảo sát quá trình phát triển, già chín và nảy mầm ở Hoàng lan [6]. Trương Mai Hồng và cộng sự (2004) đã nghiên cứu sự phát triển và già chin của hạt hoàng lan (Cananga odorata (Lamk.) Hook.f. et Thoms) từ cây hoàng lan 10 tuổi, được trồng ở trường Đại học Nông lâm Tp. Hồ Chí Minh, cho biết : Hạt hoàng lan là loại hạt tỏ ra khó nảy mầm, hạt có miên trạng đáng kể. Khi thu hoạch hạt từ những quả già chín (84 ngày sau hoa nở) gieo ngay trên giấy thấm thì có 1% hạt nảy mầm; thu hạt từ quả chín nâu đen (98 ngày sau hoa nở, ẩm độ hạt 25%) gieo ngay trên giấy thấm thì tỷ lệ nảy mầm chỉ đạt 17%. Khi rút khô độ ẩm hạt còn 10%, 7,4% và 4,7% thì tỷ lệ nảy mầm của hạt tăng tương ứng là 26%, 31% và 51%. Khi phơi nắng hạt trong 3 ngày thì tỷ lệ nảy mầm là 27%. Kết quả nghiên cứu cho thấy hạt hoàng lan không có bản chất tồn trữ chính thống (ưa khô).[19] Phạm Văn Ngọt và cộng sự (2009) đã thực hiện nghiên cứu khả năng nảy mầm và sinh trưởng của cây hoàng lan trồng ở huyện Giồng Trôm - Bến Tre, đã cho thấy, hạt hoàng lan ngâm trong dung dịch GA3 (0,3 – 0,7ppm) trong 1 giờ cho tỷ lệ nẩy mầm trên 47% cao hơn so với đối chứng chỉ có 42,67%. Sinh trưởng của cây con ở giai đoạn vườn ươm ở các chế độ bón phân N,P,K khác nhau, đã ghi nhận tỷ lệ sống của cây hoàng lan con sau 5 tháng ở các nghiệm thức bón nitơ và phosphor là 100%, ở nghiệm thức bón kali nồng độ 1,5% là 77.8%, nồng độ 2% là 60%. Sinh trưởng của cây con ở các nồng độ nitơ khác nhau đều tốt hơn so với đối chứng, và tốt nhất ở nồng độ 2%. Ở nồng độ 3% và 4% P2O5, cây sinh trưởng tốt hơn các nghiệm thức còn lại. Bón phân kali tỏ ra không hiệu quả đối với sự sinh trưởng của cây. Quan sát sinh trưởng của cây con hoàng lan trồng ở huyện Giồng Trôm - Bến Tre, cho thấy cây con có 6 – 7 lá ươm trong túi bầu sau 1 năm trồng có chiều cao 221,77 – 250,67cm, đường kính thân đạt 4,90 – 6,29cm. Cây hoàng lan trồng thuần loại sinh trưởng tốt hơn cây trồng xen với chuối và vườn dừa. Hoàng lan trồng xen trong vườn dừa ở giai đoạn 1 năm có sinh trưởng kém nhất. Sau 1 năm tiến hành cắt ngọn, các cây hoàng lan trồng thuần loại sinh trưởng tốt nhất, có đường kính thân cây từ 9,24 – 9,54cm. Những cây trồng trong vườn dừa có đường kính thân cây từ 8,22 – 8,62cm không thua kém những cây hoàng lan trồng xen với chuối. Sau 1,5 năm trồng, cây hoàng lan bắt đầu ra hoa [18]. 1.3. Nghiên cứu về giâm cành Mọi tế bào thực vật sống đều có khả năng tái tạo lại một cây hoàn chỉnh. Khả năng này phụ thuộc vào hai đặc tính cơ bản của tế bào thực vật đó là tính toàn thể (totipotency) và sự phản biệt hóa (dedifferentiation). Trong nhân giống bằng giâm cành, chỉ cần điều khiển sự hình thành rễ mới (rễ bất định), vì chồi đã có sẵn. Các yếu tố có ảnh hưởng tới quá trình này như : tình trạng sinh lý của cây mẹ, tuổi của cành giâm, vị trí cành giâm (chồi ngọn, chồi bên), điều kiện môi trường (nước, nhiệt độ, ánh sáng …). Cành mẹ mang các dưỡng chất (các glucids, khoáng chất…) ảnh hưởng đến sự ra rễ của cành giâm. Cành giâm lấy ở giai đoạn trẻ dễ tái sinh hơn cây đã ở pha sinh trưởng già. Từ gốc đến chồi ngọn 1 cây hay 1 cành có sự phân bố các thành phần hóa học khác nhau, nên phản ứng ra rễ khác nhau. Để tránh cho cành mẹ bị stress nước, nên lấy hom vào buổi sáng khi cây ở trạng thái trương nước. Một số chất điều hoà sinh trưởng tỏ ra có ảnh hưởng tích cực đến sự phát sinh rễ bất định. Trong số đó, auxin có tác dụng nhất đến sự ra rễ của cành giâm. - Auxin: Vào những năm 30 và sau đó, người ta phát hiện ra chất auxin, là một hợp chất có tác dụng kích thích sinh trưởng của thân, thúc đẩy sự hình thành rễ, như: o Acid indol acetic (IAA) là auxin có bản chất tự nhiên, có tác dụng thúc đẩy hình thành rễ bất định [43][44][45]. o Acid indol butyric (IBA) và acid naphtyl acetic (NAA) là auxin tổng hợp có tác dụng kích thích sự ra rễ của cành giâm mạnh hơn IAA [42] [46]. Auxin có vai trò tích cực đối với sự ra rễ bất định và xác định sự phát động của các tế bào đầu tiên phụ thuộc vào lượng auxin nội sinh cũng như auxin xử lý ngoại sinh [37]. Ứng dụng các chất điều hoà sinh trưởng thực vật trong giâm cành : Để xúc tiến sự hình thành rễ bất định, việc xử lý các chất điều hoà sinh trưởng là cần thiết. Các nhóm chất auxin có tác dụng kích thích sự ra rễ rất rõ rệt. Xử lý hỗn hợp các chất ra rễ tỏ ra có tác dung cao hơn xử lý riêng rẽ. Thí dụ, hỗn hợp IBA và α-NAA có tỷ lệ 1/1 tỏ ra có hiệu quả tạo rễ rất rộng rãi cho nhiều loài cây và cao hơn so với việc sử dụng riêng rẽ từng chất [34]. 1.4. Nghiên cứu về nuôi cấy invitro Chồi ngọn sau khi vô trùng, được nuôi cấy trên môi trường thích hợp, sẽ phát triển thành một hay nhiều chồi. Sau đó, chồi tiếp tục phát triển vươn cao, ra lá và rễ trở thành một cây hoàn chỉnh. Cây con được chuyển ra đất để sinh trưởng phát triển bình thường [12]. Theo Lindain và các cộng sự (2008) đã nuôi cấy in-vitro Ilang-Ilang để xác định phản ứng của những mẫu cấy khác nhau (chồi ngọn, chồi nách, lá non bầu noãn và cánh hoa) với 2 loại môi trường MS (Murashige và Skoog), WPM (Woody Plant Medium). Mô sẹo từ chồi ngọn, chồi nách và lá non có khả năng biệt hóa tạo chồi. Với hai nguồn vật liệu còn lại thì không cho chồi mặc dù cùng trong điều kiện nuôi cấy như nhau. Điều này chứng tỏ nguồn gốc vật liệu đóng vai trò quan trọng trong tái sinh [56]. Một số chất điều hòa sinh trưởng thường được dùng trong nuôi cấy invitro. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật là những thành phần môi trường có tính quyết định trong sự xác định con đường phát triển của các tế bào thực vật. Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật phổ biến nhất là các hormone thực vật hay các chất tổng hợp có chức năng tương tự của chúng. Các nhóm chất điều hòa sinh trưởng thực vật chính được sử dụng trong nuôi cấy, là: - Auxin : Hoạt hoá phân bào, sinh trưởng kéo dài, cần cho sự tạo mạch dẫn và ra rễ.[8]. Tất cả cây trồng đều tổng hợp được auxin tuỳ theo giai đoạn phát triển của chúng. Auxins tự nhiên quan trọng nhất là IAA (indole-3-acetic acid), nhưng nó được sử dụng hạn chế vì nó dễ bị phân hủy bởi nhiệt và ánh sáng. Một số loại auxin tổng hợp khác như: 2,4D (2,4-dichlorophenoxy acetic acid), IBA (Indole 3-butyric acid), NAA (1-naphthylacetic acid), … - Cytokinin : Kích thích mạnh lên sự phân chia tế bào với điều kiện có sự hiện diện của auxin. Cytokinin còn giúp sự gia tăng kích thước tế bào và sinh tổng hợp protein, ngăn cản sự lão hoá mô, thúc đẩy sự hình thành chồi non, nhưng lại ức chế sự tạo rễ [17]. Sự sinh tổng hợp cytokinin trong cây xảy ra ở những vùng khác nhau, đặc biệt là những nơi có sự phân chia tế bào mạnh (ở ngọn thân ngọn rễ). Nó hiện diện hầu hết trong các mô, đặc biệt trong hạt, trái và trong rễ, tuy nhiên rễ là nơi tổng hợp nhiều nhất. [12] - Gibberellin : Kích thích phân chia tế bào, mô vỏ và biểu bì. Nhóm chất này kích thích sự kéo dài lóng, vùa do sự kéo dài, vùa do sự phân chia tế bào thân. Gibberellin liều cao (hay phối hợp với cytokinin) kích thích mạnh sự tăng trưởng lá.[ 8] 1.5. Đặc điểm tự nhiên tỉnh Bình Phước Bình Phước là một tỉnh miền núi ở phía Tây của vùng Đông Nam Bộ, phía Đông giáp tỉnh Lâm Đồng và Đồng Nai, phía Tây giáp tỉnh Tây Ninh và Campuchia, phía Nam giáp tỉnh Bình Dương và phía Bắc tỉnh Đắk Lắk và Campuchia. Thí nghiệm khảo sát tính thích nghi và sinh trưởng của các cây tạo từ hạt và giâm cành được thực hiện tại Bình Long. Địa danh này là một trong những thị xã thuộc tỉnh Bình Phước, cách Đồng Xoài khoảng 40km, về phía đông. Nơi này mang những đặc điểm tự nhiên và khí hậu của tỉnh Bình Phước. 1.5.1. Đặc điểm tự nhiên Địa hình vùng lãnh thổ Bình Phước là cao nguyên ở phía Bắc và Đông Bắc, dạng địa hình đồi núi, thấp dần về phía Tây và Tây Nam. Tỉnh Bình Phước có tổng diện tích tự nhiên là 6.855,99 km2, có 7 nhóm đất chính với 13 loại đất. Đất có chất lượng cao trở lên (đất đen, đất đỏ bazan, đất phù sa) chiếm 61,13% tổng diện tích tự nhiên của tỉnh, đất chất lượng trung bình chiếm 36,90%. Là một trong những tỉnh có chất lượng đất khá tốt so với cả nước và là điều kiện hết sức quan trọng trong việc phát triển sản xuất nông nghiệp của tỉnh. 1.5.2. Đặc điểm khí hậu Tỉnh Bình Phước nằm trong vùng mang đặc trưng khí hậu nhiệt đới cận xích đạo gió mùa, có 2 mùa rõ rệt: mùa mưa và mùa khô. Nhiệt độ bình quân trong năm cao đều và ổn định từ 25,8 - 26,2oC . Nhiệt độ bình quân thấp nhất 21,5 – 22oC . Nhiệt độ bình quân cao nhất từ 31,7 - 32,2oC . Nhìn chung sự thay đổi nhiệt độ qua các tháng không lớn, song chênh lệch nhiệt độ giữa ngày và đêm thì khá lớn, khoảng 7 – 9oC nhất là vào các tháng mùa khô. Nhiệt độ cao nhất vào các tháng 3,4,5 (từ 37-37,2oC) và thấp nhất vào tháng 12 là 19oC. Nằm trong vùng dồi dào nắng. Tổng số giờ nắng trong năm từ 2400 - 2500 giờ. Số Hình 2. Bản đồ hành chính tỉnh Bình Phước giờ nắng bình quân trong ngày từ 6,2 - 6,6 giờ. Thời gian nắng nhiều nhất vào tháng 1,2,3,4 và thời gian ít nắng nhất vào tháng 7,8,9. Lượng mưa bình quân hàng năm biến động từ 2045 - 2325 mm. Mùa mưa diễn ra từ tháng 5 - 11, chiếm 85-90% tổng lượng mưa cả năm, tháng có lượng mưa lớn nhất 376mm (tháng 7). Mùa khô từ cuối tháng 11 đến đầu tháng 5 năm sau, lượng mưa chỉ chiếm 10 - 15% tổng lượng mưa cả năm, tháng có lượng mưa ít nhất là tháng 2,3. Lượng bốc hơi hàng năm khá cao từ 1113 - 1447mm. Thời gian kéo dài quá trình bốc hơi lớn nhất vào tháng 2,3,4. Do chế độ mưa theo mùa nên biên độ giao động về độ ẩm không khí giữa mùa mưa và mùa khô khá lớn. Độ ẩm trung bình hàng năm từ 80,8 - 81,4%. Bình quân năm thấp nhất là 45,6 - 53,2%, tháng có độ ẩm cao nhất là 88,2%, tháng có độ ẩm thấp nhất là 16%. Các điều kiện tự nhiên và khí hậu của tỉnh Bình Phước phù hợp với đặc điểm sinh thái của cây hoàng lan. Chương 2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Vật liệu trong thí nghiệm giâm cành Cành giâm (hom) là các cành tay (cành cấp 1) và thân hoàng lan được lấy từ các cây 5 – 6 tháng tuổi đặt trong vườn trường Đại học Sư phạm Thành phố Hồ Chí Minh. Giá thể để cắm hom là cát sạch. Nhà giâm hom được che sáng bằng lưới đen, cường độ sáng còn 40 – 50%. Trên luống giâm có khung chụp nilon trắng để giữ ẩm. Các chất điều hoà sinh trưởng được dùng là: IBA, IAA, 2.4D, và thuốc kích thích ra rễ thương phẩm: OXYBERON Dust 0.5 (Nhật) và N3M (Việt Nam). Và một số dụng cụ khác như : kéo cắt cành, dụng cụ chăm sóc vườn ươm, … 2.1.2. Vật liệu trong thí nghiệm nuôi cấy invitro Vật liệu dùng trong nuôi cấy mô Hoàng lan là : Chồi ngọn và chồi nách lấy từ các cây 1 năm tuổi mang từ huyện Giồng Trôm – Bến Tre, đặt trong vườn ươm Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ. Các hóa chất được sử dụng trong các thí nghiệm nuôi cấy chồi hoàng lan như: các hóa chất khử trùng (Javel, HgCl2), các chất điều hòa sinh trưởng (BA, IBA, NAA, GA3), các hóa chất để pha môi trường nuôi cấy (xuất xứ từ các hãng hóa chất như: Prolab, Himedia, Merck, Sigma…). Và một số dụng cụ khác: tủ cấy, ống nghiệm, bình tam giác, ... Môi trường được dùng trong các thí nghiệm là WPM (Wood Plant Media), được chuẩn pH về từ 5,7 – 5,8. Địa điểm thực hiện: phòng thí nghiệm Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ. 2.1.3. Vật liệu trong thí nghiệm khảo sát sinh trưởng Cây con được trồng để theo dõi sinh trưởng là những cây đã nảy mầm từ hạt (cây từ hạt) và cây được tạo ra từ giâm cành (cây giâm cành). Cây giâm cành là các cành giâm đã ra rễ được trồng vào các túi bầu đất, được tưới nước 2 lần/ ngày. Cây ra ngôi được 3 tháng được mang trồng ra đất, tiếp tục khảo sát sinh trưởng, để đánh giá tính thích nghi của những cây này. Tiến hành gieo hạt hoàng lan : Hạt được lấy từ các quả chín tại huyện Giồng Trôm – Bến Tre. Các hạt được chọn đem gieo là những hạt chắc, không bị sâu bệnh. Trong lá mầm và phôi hạt Hoàng lan có nhiều dầu nên sau khi thu hoạch, loại bỏ các hạt lép, hong khô trong nắng nhẹ hoặc ở nơi mát mẻ rồi đem gieo ngay.[16] Đặt các hạt vào trong các đĩa Petri có giấy thấm đã tưới ẩm, 2 – 3 ngày tưới nước và thay giấy thấm cho đến khi các hạt nẩy mầm. Sau đó, chuyển các hạt đã nảy mầm sang các túi bầu đựng đất, được đục lỗ xung quanh đáy, tưới nước 2 lần/ngày vào buổi sáng và chiều. Cây con mọc được 3 – 4 tháng, đem trồng ra đất để khảo sát sự sinh trưởng đối chứng với các cây có từ giâm cành. Thời gian tiến hành: tháng 05/2009. Địa điểm thực hiện: vườn ươm Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ. 2.2. Phương pháp tiến hành 2.2.1. Nhân giống vô tính hoàng lan 2.2.1.1. Phương pháp giâm cành hoàng lan 2.2.1.1.1. Tiến hành Mỗi cành tay hoặc thân cây được cắt thành 3 đoạn: đoạn ngọn (đoạn 1), đoạn dưới ngọn (đoạn 2), và đoạn gốc cành (đoạn 3). Hom dài khoảng 5 – 7cm, được cắt vát ở gốc. Mỗi hom có 2 lá đã bị cắt bỏ 1/2 – 1/3 lá để giảm diện tích thoát hơi nước. Hom cắt xong được nhúng vào chậu nước sạch tránh mất nước làm giảm sức sống của hom. Tiếp tục nhúng đồng thời các cành giâm vào dung dịch chất điều hòa sinh trưởng, sao cho dung dịch này ngập đến ¼ đoạn cành. Thời gian ngâm các cành giâm trong dung dịch là 10 phút. Sau đó, lấy đồng thời các hom ra và cắm vào giá thể. Sau khi cắm hom, phun nước giữ ẩm cho hom và thể nền. Hàng ngày tưới ẩm 2 lần. Hình 3. Gieo hạt hoàng lan Chất điều hoà sinh trưởng chính dùng trong các nghiệm thức ra rễ là IBA, được pha ở các mức từ 50 – 1000ppm. Bên cạnh đó, tiến hành các nghiệm thức ra rễ có sự phối hợp giữa IBA và các chất kích thích sinh trưởng khác. Đồng thời, thực hiện nghiệm thức đối chứng bằng nước lã. Các thuốc kích thích ra rễ được pha theo hướng dẫn sử dụng của nhà sản xuất in trên vỏ bao bì. 2.2.1.1.2. Bố trí thí nghiệm Các nghiệm thức ra rễ thực hiện trong giâm cành hoàng lan được thể hiện ở bảng 2. Bảng 2. Các nghiệm thức giâm hom hoàng lan STT Nghiệm thức Số lượng mẫu Số lần lặp Tổng 1 Nước cất 10 4 40 2 IBA 50ppm 10 4 40 3 100ppm 10 4 40 4 500ppm 10 4 40 5 1000ppm 10 4 40 6 IBA 100ppm 50ppm 2,4D 10 4 40 7 100ppm IAA 10 4 40 8 Thuốc thương phẩm Oxyberon dust 0.5 10 4 40 9 N3M 10 4 40 Tổng cộng 360 Các nghiệm thức được thực hiện trên cành tay và thân cây ở từng đoạn hom: đoạn 1, đoạn 2, đoạn 3. Như vậy, tổng số mẫu thực hiện: 360 x 3 x 2 = 2.160 mẫu. Địa điểm thực hiện: Vườn ươm Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ. Thời gian thực hiện từ : 06/ 2009. Các chỉ tiêu theo dõi : - Thời gian ra rễ trung bình của cành giâm ở mỗi nghiệm thức (tuần). - Tỷ lệ sống (%) của các cành giâm, tính theo công thức - Tỷ lệ ra rễ (%) của các cành giâm, tính theo công thức - Số lượng rễ chính trung bình/cành giâm ở mỗi nghiệm thức : Đếm tất cả rễ của các cành giâm ra rễ ở mỗi nghiệm thức, tính tổng số rễ rồi chia cho tổng số cành giâm ra rễ. - Chiều dài rễ trung bình một rễ (cm): Đo chiều dài của từng rễ ở ._.mỗi cành giâm trong từng nghiệm thức, tính tổng các chiều dài rồi chia cho tổng số lượng rễ của các cành giâm trong nghiệm thức đó. 2.2.1.2. Phương pháp nuôi cấy mô hoàng lan 2.2.1.2.1. Phương pháp khử trùng mẫu cấy Các chồi dài khoảng 0.5cm không bị sâu, bệnh được chọn, đem rửa sạch, lắc trong dung dịch xà phòng 10 – 15 phút, tráng qua nhiều lần bằng nước máy trước khi được vô trùng bên trong tủ cấy. Vô trùng mẫu cấy bằng cồn 70o , lắc trong 5 – 10 giây, tráng mẫu bằng nước cất vô trùng 3 lần. Tiếp tục cho các mẫu vào các dung dịch hóa chất khử trùng (Javel – Natri hypochlorite, HgCl2) ở các nồng độ khác nhau,có bổ sung thêm 1 – 2 giọt Tween, lắc trong thời gian khác nhau, sau đó, tráng lại 3 lần bằng nước cất. Các nghiệm thức của thí nghiệm được thiết lập và trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Các nghiệm thức khử trùng mẫu cấy trong nuôi cấy invitro hoàng lan STT Nghiệm thức Số mẫu Số lần lặp Tổng Hóa chất Nồng độ Thời gian (phút) 1 Javel (%) 10 10 20 3 60 2 15 20 3 60 3 30 10 20 3 60 4 15 20 3 60 5 50 10 20 3 60 6 15 20 3 60 7 HgCl2 (mg/l) 0.05 5 20 3 60 8 7 20 3 60 9 10 20 3 60 10 0.07 5 20 3 60 11 7 20 3 60 12 10 20 3 60 13 0.1 5 20 3 60 14 7 20 3 60 15 10 20 3 60 Tổng 900 Thời gian theo dõi mẫu cấy sau khi khử trùng : 2 – 3 tuần. Các chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ mẫu vô trùng (%): được tính theo công thức - Tỷ lệ mẫu sống vô trùng (%): được tính theo công thức 2.2.1.2.2. Phương pháp tạo chồi Các mẫu vô trùng được cấy vào môi trường có BA, BA phối hợp với NAA với nồng độ khác nhau, nhằm kích thích tạo chồi. Thí nghiệm này được bố trí thông qua bảng 4. Bảng 4. Các nghiệm thức tạo chồi trong nuôi cấy invitro hoàng lan STT Nghiệm thức Số mẫu Số lần lặp Tổng 1 Đối chứng (không điều hòa sinh trưởng) 20 3 60 2 BA (mg/l) 0,5 20 3 60 3 1,0 20 3 60 4 2,0 20 3 60 5 3,0 20 3 60 6 0,2mg/l NAA + 2,0mg/l BA 20 3 60 7 0,5mg/l NAA + 2,0mg/l BA 20 3 60 8 1,0mg/l NAA + 2,0mg/l BA 20 3 60 Tổng 480 Thời gian theo dõi sự hình thành chồi, cụm chồi : 4 tuần. Các chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ (%) mẫu tạo chồi, tính theo công thức - Số chồi trung bình/chồi, tính theo công thức 2.2.1.2.3. Phương pháp vươn chồi hoàng lan Chồi hình thành được cấy chuyền vào môi trường vươn chồi. Môi trường WPM có GA3 ở các nồng độ khác nhau được sử dụng, có phối hợp với BA. Các nghiệm thức được bố trí ở bảng 5. Bảng 5. Các nghiệm thức vươn chồi trong nuôi cấy invitro hoàng lan STT Nghiệm thức Số mẫu Số lần lặp Tổng 1 Đối chứng (không điều hòa sinh trưởng) 20 3 60 2 2mg/l BA 20 3 60 3 0,5mg/l GA3 + 2mg/l BA 20 3 60 4 1mg/l GA3 + 2mg/l BA 20 3 60 5 2mg/l GA3 + 2mg/l BA 20 3 60 6 3mg/l GA3 + 2mg/l BA 20 3 60 Tổng 360 Thời gian theo dõi: 3 - 4 tuần. Chỉ tiêu theo dõi: Kích thước tăng trưởng của chồi (cm), được tính bằng sự chênh lệch chiều cao chồi ban đầu với chiều cao chồi sau khi cấy chuyền vào môi trường có kích tố tăng trưởng chiều cao (GA3), theo công thức: , trong đó: ∆h : Kích thước tăng trưởng của chồi (cm) h1 : chiều cao chồi ban đầu (cm) h2 : chiều cao chồi lúc sau (cm) 2.2.1.2.4. Phương pháp tạo rễ Các chồi có chiều cao khoảng 2cm được chọn để tạo rễ. Chồi được cắt khỏi cụm chồi và ngâm 10 phút trong dung dịch IBA (5ppm và 10ppm) đã vô trùng, trước khi cấy vào môi trường WPM và ½ WPM. Các nghiệm thức trong thí nghiệm tạo rễ được thể hiện ở bảng 6. Bảng 6. Các nghiệm thức tạo rễ trong nuôi cấy invitro hoàng lan STT Nghiệm thức Số mẫu Số lần lặp Tổng Môi trường Hóa chất 1 WPM Đối chứng 20 3 60 2 5ppm IBA 20 3 60 3 10ppm IBA 20 3 60 4 1/2 WPM Đối chứng 20 3 60 5 5ppm IBA 20 3 60 6 10ppm IBA 20 3 60 Tổng 360 Thời gian theo dõi: 4 tuần. Các chỉ tiêu theo dõi: - Tỷ lệ (%) chồi tạo rễ, được tính theo công thức - Số rễ trung bình/mẫu, được tính theo công thức 2.2.2. Khảo sát sự sinh trưởng của cây Hoàng lan có từ hạt và giâm cành tại Bình Phước 2.2.2.1. Bố trí thí nghiệm trồng cây hoàng lan ở thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước Những cây con đem trồng để khảo sát sinh trưởng là những cây được tạo từ hạt và cây từ thí nghiệm giâm cành. Các cây này đã được đưa ra bầu đất 3 – 4 tháng, tương đối đồng đều nhau về đường kính thân, chiều cao cây, số cành cấp I, số lá và diện tích lá. Thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, 1 yếu tố 3 lần lặp. Trong đó, nền lập địa trồng cây là như nhau. Các yếu tố khác tương đối đồng đều như: cây con, mật độ, kỹ thuật tác động, chăm sóc. Yếu tố lặp: cây con từ hạt và cây con từ giâm cành. Các hố trồng cây không được bón lót, có chiều sâu khoảng 0,5m và chiều rộng hố 0,3m. Mật độ trồng: 1 x 1 (m2). Tổng số mẫu đem trồng là 60 cây. Tổng diện tích thí nghiệm khoảng 60m2. Các cây hoàng lan con có từ hạt và giâm cành được trồng theo sơ đồ hình 4. ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ● ● ● ○ ○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ● ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ● ● ● ○ ○ ○ Hình 4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm trồng hoàng lan Chú thích : ○ – Cây từ hạt ● – Cây từ giâm cành Trong những tháng mùa khô (tháng 05 và 06/2010), chúng tôi tưới nước cho cây 2 lần/ngày vào buổi sáng và buổi chiều, mỗi lần 1000ml nước. Số liệu sinh trưởng được thu thập 1 lần/tháng, đo tất cả các cây sau đó tính trung bình theo từng công thức, từng lần lặp. Địa điểm thực hiện: vườn tại thị xã Bình Long, tỉnh Bình Phước. Thời gian tiến hành và khảo sát: từ tháng 04 – 09/2010. 2.2.2.2. Phương pháp đo chiều cao trung bình cây và đường kính trung bình thân cây Đo chiều cao trung bình cây H (cm) : Dùng thước cây đo từ gốc sát mặt đất đến đỉnh ngọn cây, một tháng 1 lần. Tăng trưởng chiều cao cây : Δh (cm) = Hn+1 – Hn. Hn: Chiều cao cây đo lần thứ n. Hn+1: Chiều cao cây đo lần thứ n+1. Đo đường kính trung bình thân cây D (mm): Dùng thước kẹp để đo ở vị trí kế dưới 2 lá đầu tiên trong suốt quá trình thí nghiệm. Tăng trưởng đường kính thân: Δd = Dn+1 – Dn Dn: Đường kính thân cây đo lần thứ n. Dn+1: Đường kính thân cây đo lần thứ n+1. 2.2.2.3. Thống kê số lá trung bình/cây 1m 1m  Đếm tất cả số lá có trên cây vào mỗi tháng, cùng ngày với đo chiều cao và đường kính thân cây. Tính số lá trung bình qua mỗi tháng để tính được sự tăng trưởng số lá trung bình qua mỗi tháng. Tăng trưởng số lá trung bình (ΔL): ΔL = Ln+1 – Ln Ln : Số lá đếm được lần thứ n. Ln+1 : Số lá đếm được lần thứ n+1. 2.2.2.4. Tính diện tích lá trung bình/cây Tiến hành đo diện tích lá mỗi tháng cùng ngày đo chiều cao và đường kính thân cây. Chọn 3 lá bánh tẻ ở mỗi cây và vẽ lá lên giấy kẻ li. Tính diện tích trung bình của 1 lá và diện tích lá trung bình/cây (S), như sau : 2.2.2.5. Thống kê số cành cấp I/cây (C) Thống kê số cành cấp I có trên cây cùng ngày với đo chiều cao và đường kính thân, đếm tất cả các cành cấp I của tất cả các cây theo mỗi lần lặp, từ đó tính số cành cấp I trung bình /cây ở mỗi tháng và tính tăng trưởng số cành cấp I/cây. Tăng trưởng số cành cấp I : ∆C = Cn+1 - Cn Cn : Số cành cấp I trung bình/cây đo lần thứ n. Cn+1 : Số cành cấp I trung bình/cây đo lần thứ n+1. 2.2.2.6. Phân tích thành phần cơ giới và hóa học của đất Lấy mẫu đất của 3 lô ở tầng 0 – 80cm tại khu vực trồng cây, đem phân tích thành phần cơ giới và thành phần hóa học tại Phân viện Nghiên cứu Khoa học Lâm nghiệp Nam Bộ. 2.2.2.7. Phương pháp đo cường độ ánh sáng Dùng máy ANNA F11 để đo cường độ ánh sáng ở mỗi lô thí nghiệm. Đo ở vị trí trồng cây cách mặt đất 1m, đặt máy hướng về phía đông và đo cường độ ánh sáng. 2.2.3. Phương pháp xử lý số liệu Dùng toán thống kê, phần mềm excel 2010 và Stagraphic Sgwinplus 3.0 để xử lí các số liệu thu được. Các giá trị cần thực hiện phân tích như: - Giá trị trung bình: = : Giá trị trung bình Xi : Trị số đo đếm n : Số mẫu đo đếm - Độ lệch tiêu chuẩn : Phản ánh độ sai lệch hoặc độ dao động của các giá trị so với giá trị trung bình. S = với i = 1,2,…n Trong đó : S là độ lệch chuẩn, n là số mẫu quan sát, Xi là trị số đo đếm, là giá trị trung bình. - So sánh trung bình 2 mẫu : Tính các giá trị trung bình , . Xét tỉ số t = , nếu t > 1,96 thì với độ tin cậy 95%. Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết quả giâm cành hoàng lan Sự hình thành một cá thể mới trong quá trình giâm cành phụ thuộc vào đặc tính của giống và điều kiện ngoại cảnh, trong đó điều kiện thời tiết khí hậu giữ một vai trò quan trọng. Các thí nghiệm giâm cành đoạn cành và đoạn thân hoàng lan được thực hiện từ tháng 11/2009 – 08/2010, thời tiết chuyển từ mùa mưa sang mùa khô, nhiệt độ tăng dần qua các tháng, biên độ nhiệt dao động trong 1 ngày khá lớn. 3.1.1. Tỷ lệ sống Sức sống của cành đã giảm đi khi bị tách khỏi cây mẹ, đồng thời, tác động của ngoại cảnh, chủ yếu là điều kiện khí hậu, cùng với ảnh hưởng của chất điều hòa sinh trưởng, cành giâm sau khi được cắt rời cây mẹ, góp phần làm giảm sức sống của hom giâm. Trong nghiên cứu này, với điều kiện chăm sóc ổn định, tỷ lệ sống của cành giâm từ cành tay và thân cây hoàng lan đã được ghi nhận. 3.1.1.1. Tỷ lệ sống của đoạn cành trong giâm cành hoàng lan Qua các thí nghiệm tiến hành giâm cành trên cành tay hoàng lan ở 3 vị trí ngọn cành (đoạn 1), dưới ngọn (đoạn 2), và gần gốc cành (đoạn 3), cho thấy đoạn ở ngọn có tỷ lệ sống cao hơn so với đoạn ở hai vị trí còn lại và đoạn ở gần gốc cành có tỷ lệ sống thấp nhất sau 8 tuần theo dõi. Các số liệu về tỷ lệ sống của các đoạn 1, đoạn 2 và đoạn 3 được trình bày trên bảng 7. Ở tất cả các nghiệm thức, sức sống của các đoạn cành giảm dần, tỷ lệ sống ở tuần thứ 8 thấp hơn 4 tuần trước đó. Ở nghiệm thức đối chứng chịu sự tác động chủ yếu từ ngoại cảnh, các cành đoạn 1 sau 8 tuần có tỷ lệ sống (80%) cao hơn tỷ lệ sống của các cành đoạn 2 (42.5%) và đoạn 3 (30%). Đoạn 1 của cành khi được xử lý với IBA, có tỷ lệ sống cao hơn so với đối chứng. Ở nghiệm thức 500ppm và 1000ppm IBA, đoạn 1 có tỷ lệ sống là 85% sau 8 tuần. Trong khi đó, ở các nghiệm thức 50ppm IBA và 100ppm IBA, mặc dù nồng độ IBA thấp hơn, nhưng do được tiến hành vào giữa mùa khô, nên tỷ lệ sống sau 8 tuần của đoạn 1 thấp hơn đối chứng. Bảng 7. Tỷ lệ sống của các đoạn cành tay hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Tỷ lệ sống TB ở tuần thứ 4 (%) Tỷ lệ sống TB ở tuần thứ 8 (%) Thời gian thực hiện Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất 80 ± 2.90 57.5 ± 1.52 52.5 ± 2.72 80 ± 2.90 42.5 ± 0.79 30 ± 1.29 11/2009 - 12/2010 50ppm IBA 77.5 ± 1.52 55 ± 1.59 50 ± 2.91 47.5 ± 0.79 27.5 ± 1.52 22.5 ± 1.52 02/2010 - 03/2010 100ppm IBA 90 ± 1.84 62.5 ± 2.00 55 ± 2.76 67.5 ± 2.00 30 ± 2.25 20 ± 1.84 01/2010 - 02/2010 500ppm IBA 92.5 ± 0.79 65 ± 2.05 27.5 ± 0.79 85 ± 0.92 32.5 ± 1.52 5 ± 0.92 11/2009 - 12/2009 1000ppm IBA 92.5 ± 1.52 67.5 ± 0.79 10 ± 1.29 85 ± 2.05 37.5 ±1.52 0 11/2009 - 12/2010 50ppm 2,4D + 100ppmIBA 27.5 ± 0.79 27.5 ± 2.39 12.5 ± 2.00 0 0 0 02/2010 - 03/2010 100ppm IAA + 100ppm IBA 15 ± 0.92 22.5 ± 2.72 5 ± 1.59 0 0 0 02/2010 - 03/2011 Oxyberon dust 0.5 52.5 ± 0.79 22.5 ± 2.00 17.5 ± 2.39 35 ± 0.92 12.5 ± 2.00 10 ± 2.25 12/2009 - 01/2010 N3M 62.5 ± 2.76 40 ± 2.59 30 ± 1.29 32.5 ± 0.79 27.5 ± 2.72 22.5 ± 2.39 12/2009 - 01/2011 Đoạn 2 và 3 của cành khi được xử lý đều có tỷ lệ sống thấp hơn đối chứng ở tất cả các nghiệm thức. Ở các nghiệm thức có IBA, nồng độ IBA càng cao, tỷ lệ sống của các đoạn 3 giảm đi. Khi xử lý cành tay hoàng lan với IBA kết hợp với 2,4D và IAA, các đoạn có sức sống rất thấp, và chết sau 8 tuần thí nghiệm. Điều này cho thấy, có thể auxin (2,4D và IAA) có tác dụng làm giảm sức sống của cành tay hoàng lan. Qua số liệu trên bảng 7, đoạn ở ngọn có tỷ lệ sống cao hơn so với đoạn giữa và đoạn gốc của cành tay. Tỷ lệ sống cao nhất của đoạn cành đạt 85%. Như vậy, khi giâm hom cành tay hoàng lan có thể sử dụng đoạn 1 và xử lý bằng IBA (500 – 1000ppm). Để có tỷ lệ sống cao, nên thực hiện giâm cành vào mùa mưa hoặc đầu mùa khô (tháng 11 – 12 trong năm). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Hoang và cộng sự (1986), mặc dù Hoang đã sử dụng thân hoàng lan để giâm cành. 3.1.1.2. Tỷ lệ sống của đoạn thân trong giâm cành hoàng lan Kết quả về tỷ lệ sống của đoạn thân hoàng lan được thể hiện ở bảng 8 . Qua các nghiệm thức giâm cành trên thân cây hoàng lan, tỷ lệ sống của các đoạn thân có xu hướng giảm dần sau 8 tuần theo dõi và đoạn 1 có tỷ lệ sống cao hơn so với đoạn 2 và đoạn 3, tương tự với kết quả thu được khi thực hiện trên cành tay, tuy nhiên tỷ lệ sống của các đoạn thân cao hơn so với các đoạn cành. Ở nghiệm thức đối chứng, đoạn 1 có tỷ lệ sống sau 6 – 8 tuần là 77,5% cao hơn so với đoạn 2 và đoạn 3. Các nghiệm thức giâm cành sử dụng thuốc thương phẩm được thực hiện cùng thời điểm với nghiệm thức này. Khi sử dụng thuốc kích thích ra rễ N3M, các đoạn thân có tỷ lệ sống khá cao sau 8 tuần, đoạn 1 sống hoàn toàn, tỷ lệ sống trung bình của đoạn 2 là 82,5%, đoạn 3 là 60% cao hơn so với đối chứng. Ngược lại, khi sử dụng thuốc kích thích ra rễ Oxyberon dust 0.5, tỷ lệ sống của các đoạn thân đều thấp hơn. Như vậy, tỷ lệ sống của các đoạn thân hoàng lan không chỉ chịu ảnh hưởng của điều kiện ngoại cảnh, mà còn chịu sự ảnh hưởng của thuốc kích thích. Bảng 8. Tỷ lệ sống của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Tỷ lệ sống TB ở tuần thứ 4 (%) Tỷ lệ sống TB ở tuần thứ 8 (%) Thời gian thực hiện Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất 95 ± 1.51 90 ± 2.25 82.5 ± 2.00 77.5 ± 2.00 67.5 ± 3.28 67.5 ± 3.53 04-06/2010 50 ppm IBA 95 ± 1.59 90 ± 1.84 90 ± 1.29 90 ± 1.31 85 ± 0.92 85 ± 1.59 06-08/2010 100ppm IBA 57.5 ± 2.72 37.5 ± 3.01 25 ± 0.92 20 ± 2.25 15 ± 3.05 12.5 ± 1.52 03-05/2010 500ppm IBA 70 ± 3.44 60 ± 5.36 52.5 ± 3.53 55 ± 3.05 32.5 ± 2.00 17.5 ± 1.52 03-05/2010 1000ppm IBA 85 ± 3.05 20 ± 2.59 10 ± 1.29 62.5 ± 4.34 20 ± 2.59 7.5 ± 1.52 02-04/2010 50ppm 2,4D + 100ppm IBA 100 92.5 ± 2.39 75 ± 3.05 85 ± 3.05 82.5 ± 2.39 37.5 ± 2.72 05-07/2010 100ppmIAA + 100ppm IBA 67.5 ± 2.00 57.5 ± 2.00 55 ± 2.76 67.5 ± 2.00 57.5 ± 2.00 55 ± 2.76 05-07/2011 Oxyberon dust 0.5 92.5 ± 2.39 80 ± 2.59 70 ± 2.25 62.5 ± 2.00 62.5 ± 2.00 57.5 ± 5.26 04-06/2010 N3M 100 100 90 ± 3.18 100 82.5 ± 2.39 60 ± 1.30 04-06/2010 Từ tháng 02 – 05/2010, các nghiệm thức sử dụng IBA với nồng độ 100ppm, 500ppm, 1000ppm được tiến hành. Các đoạn thân chịu sự ảnh hưởng phần lớn từ điều kiện ngoại cảnh, nên có tỷ lệ sống thấp hơn so với đối chứng. Trong đó, đoạn 1 có tỷ lệ sống trung bình cao hơn so với đoạn 2 và 3, tỷ lệ sống của đoạn này tăng dần theo nồng độ IBA, cao nhất là 62,5% ở 1000ppm IBA. Đối với đoạn 2 và 3, tỷ lệ sống ở 500ppm IBA cao hơn so với 100ppm và 1000ppm. Nghiệm thức IBA có nồng độ 50ppm được tiến hành vào tháng 06 – 08/2010, tỷ lệ sống của các đoạn sau 8 tuần cao hơn so với đối chứng, đoạn 1 là 90%, đoạn 2 và 3 là 85%. Như vậy, sự sống sót của cành giâm hoàng lan chịu ảnh hưởng khá lớn từ điều kiện khí hâu và thời điểm giâm cành hoàng lan thích hợp nhất vào những tháng mùa mưa của năm. Các nghiệm thức có sự kết hợp giữa IBA với 2,4D và IAA được tiến hành cùng thời gian vào tháng 05 – 07/2010. Ở nghiệm thức 100ppm IBA kết hợp với 50ppm 2,4D, kết quả về tỷ lệ sống cũng giảm dần sau 8 tuần, tỷ lệ sống trung bình của đoạn 1 và 2 cao hơn so với đối chứng, tuy nhiên thấp hơn so với kết quả thu được từ nghiệm thức có 50ppm IBA, như vậy, chính 2,4D là tác nhân chính làm giảm tỷ lệ sống của các đoạn thân, và sự ảnh hưởng này thể hiện rõ rệt qua tỷ lệ sống của đoạn 3. Tương tự như vậy, ở nghiệm thức có sự kết hợp giữa 100ppm IBA và 100ppm IAA, IAA đã có ảnh hưởng tức thời lên các cành giâm, nên chỉ sau 3 tuần tỷ lệ sống của các đoạn thân giảm đi và thấp hơn so với đối chứng, sau đó tỷ lệ này không đổi sau các tuần tiếp theo. Số liệu trên bảng 8 cho thấy, để giâm hom đoạn thân hoàng lan có thể sử dụng thuốc N3M hay IBA (50mg/l) để đạt hiệu quả cao. Thời gian áp dụng từ tháng 6 – 8 trong năm. 3.1.2. Thời gian ra rễ Theo nghiên cứu của Hoang và cộng sự (Philipines), hoàng lan là loại cây dễ ra rễ. Tuy nhiên, sự hình thành rễ mới ở cành tay và thân cây không giống nhau. Theo dõi sự ra rễ của các đoạn cành tay và đoạn thân hoàng lan, thời gian ra rễ được xác định như sau: Đối với cành tay hoàng lan, thời gian ra rễ của các đoạn cành khá chậm. Dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng IBA ở nồng độ 1000ppm và thuốc thương phẩm Oxyberon dust 0.5 (Nhật), sau 4 tuần, các đoạn cành bắt đầu ra rễ và tiếp tục ra rễ ở 3 – 4 tuần sau đó. Đối với thân hoàng lan, ở nghiệm thức đối chứng, các đoạn thân ra rễ sau 4 tuần kể từ khi được giâm vào giá thể. Khi có tác động của chất điều hòa sinh trưởng, thời gian ra rễ nhanh hơn, sau 2 – 3 tuần giâm vào giá thể, các đoạn thân bắt đầu ra rễ. Cụ thể : - Ở nghiệm thức có IBA 50ppm, 500ppm, IBA 100ppm kết hợp với 2.4D 50ppm, IBA 100ppm kết hợp với IAA 100ppm và thuốc thương phẩm N3M (Việt Nam) , rễ mới xuất hiện sau 5 hoặc 6 tuần. - Ở nghiệm thức có IBA 1000ppm và Oxyberon dust 0.5, rễ mới xuất hiện sau 2 tuần. Như vậy, thân hoàng lan có thể ra rễ sau 3 tuần kể từ khi giâm vào giá thể, và tiếp tục ra rễ trong các tuần tiếp theo cho đến tuần thứ 8. Cành tay hoàng lan khó ra rễ hơn, dưới tác động của chất điều hòa sinh trưởng, các đoạn cành ra rễ sau 4 tuần. Qua đó, tôi đã theo dõi quá trình ra rễ của hoàng lan ở 2 mốc thời gian : 3 – 4 tuần, và 6 – 8 tuần. 3.1.3. Tỷ lệ tạo rễ trong giâm cành hoàng lan 3.1.3.1. Tỷ lệ tạo rễ của các đoạn cành tay trong giâm cành Kết quả ra rễ của cành giâm từ cành tay hoàng lan được trình bày ở bảng 9. Bảng 9. Tỷ lệ ra rễ của các đoạn cành tay hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Tỷ lệ ra rễ TB ở tuần thứ 4 (%) Tỷ lệ ra rễ TB ở tuần thứ 8 (%) Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất 0 0 0 0 0 0 50ppm IBA 0 0 0 0 0 0 100ppm IBA 0 0 0 0 0 0 500ppm IBA 0 0 0 0 2.5 ± 3.53 0 1000ppm IBA 0 0 0 2.5 ± 0.79 5 ± 1.59 0 50ppm 2,4D + 100ppmIBA 0 0 0 0 0 0 100ppm IAA + 100ppm IBA 0 0 0 0 0 0 Oxyberon dust 0.5 7.5 ± 1.52 0 0 15 ± 2.00 2.5 ± 0.79 0 N3M 0 0 0 0 0 0 Nhìn chung, cành tay hoàng lan khó ra rễ. Sau 8 tuần, ở nghiệm thức đối chứng, các đoạn cành tay hoàng lan không ra rễ. Ở tất cả các nghiệm thức, đoạn 3 – đoạn ở gần gốc cành tay không ra rễ.  Hình 5. Các đoạn cành tay ra rễ A. 500ppm IBA – đoạn 2; B. 1000ppm IBA – đoạn 1; C. 1000ppm IBA- đoạn 2; D. Oxyberon dust 0.5 – đoạn 1; E. Oxyberon dust 0.5 – đoạn 2 Khi bổ sung IBA với nồng độ tăng dần từ 50 – 1000ppm, các đoạn 2 ra rễ tốt hơn so với đoạn 1. Đồng thời, những nghiệm thức được thực hiện trong điều kiện ngoại cảnh thích hợp (phụ lục 1), các đoạn cành dễ ra rễ hơn.Tuy nhiên tỷ lệ ra rễ trung bình còn thấp. Đoạn 2 hình thành rễ mới ở 500ppm IBA với tỷ lệ 2,5%. Ở nghiệm thức IBA 1000ppm, đoạn 1 ra rễ với tỷ lệ 2,5%; đoạn 2 có tỷ lệ ra rễ với tỷ lệ 5%, cao hơn so với đoạn 1 và so với đoạn 2 ở nồng độ 500ppm IBA. Ở các nghiệm thức sử dụng các thuốc ra rễ thương phẩm, thuốc kích thích ra rễ N3M chưa có hiệu quả đối với các đoạn cành. Trong khi đó, sử dụng thuốc Oxyberon dust 0.5 (Nhật Bản) cho kết quả tốt lên đoạn 1 với tỷ lệ ra rễ trung bình là 7,5% sau 4 tuần, và 15% sau 8 tuần; tỷ lệ ra rễ trung bình ở đoạn 2 là 2,5% sau 8 tuần. Tác dụng của sự kết hợp giữa IBA với các auxin khác đã không có hiệu quả đối với sự ra rễ của cành tay hoàng lan, các đoạn cành ở các nghiệm thức này không ra rễ. Như vậy, cành tay hoàng lan có tỷ lệ ra rễ không cao, đoạn 2 ra rễ tốt hơn so với các đoạn ở các vị trí khác trên cành tay. Trong thí nghiệm này, IBA ở nồng độ 1000ppm có hiệu quả tốt nhất cho sự ra rễ của cành tay. 3.1.3.2. Tỷ lệ tạo rễ của đoạn thân trong giâm cành Thực hiện các thí nghiệm tương tự như ở cành tay hoàng lan, các đoạn thân có tỷ lệ ra rễ cao hơn. Các kết quả được trình bày ở bảng 10. Nghiệm thức đối chứng, đoạn 2 ra rễ với tỷ lệ 10%, cho thấy đoạn này dễ ra rễ hơn so với đoạn 1 và 3, trong đó đoạn 1 không ra rễ. Dưới tác dụng của thuốc kích thích ra rễ thương phẩm, các đoạn thân ra rễ nhiều hơn đối chứng. Tỷ lệ ra rễ của đoạn 2 là 27,5% khi dùng N3M và 35% khi dùng Oxyberon dust 0.5, cao hơn hẳn so với đoạn 1 và đoạn 3. Ở các nghiệm thức có IBA với nồng độ tăng dần từ 100 – 1000ppm, tỷ lệ ra rễ của các đoạn 1, 2 và 3 tăng theo mức tăng của nồng độ IBA, đoạn 1 có tỷ lệ ra rễ cao nhất 40% ở 1000ppm IBA. Dưới tác động của ngoại cảnh, các đoạn thân không ra rễ hoặc ra rễ với tỷ lệ thấp. Tại nồng độ 100ppm IBA, các đoạn không ra rễ; hoặc ở nồng độ IBA 500ppm và 1000ppm, đoạn 2 và 3 có tỷ lệ ra rễ thấp hơn so với đoạn 1. Bảng 10. Tỷ lệ ra rễ của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Tỷ lệ (%) ra rễ TB ở tuần thứ 4 Tỷ lệ (%) ra rễ TB ở tuần thứ 8 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất 0 0 0 0 10 ± 1.29 5 ± 0.92 50 ppm IBA 0 0 0 7.5 ± 1.52 22.5 ± 2.00 15 ± 1.59 100ppm IBA 0 0 0 0 0 0 500ppm IBA 7.5 ± 2.39 2.5 ± 0.79 0 12.5 ± 3.01 2.5 ± 0.79 0 1000ppm IBA 12.5 ± 0.8 0 0 40 ± 3.90 15 ± 3.05 2.5 ± 0.79 50ppm 2,4D + 100ppm IBA 0 0 0 12.5 ± 0.79 17.5 ± 2.00 10 100ppm IAA + 100ppm IBA 0 2.5 ± 0.79 0 22.5 ± 0.79 25 ± 0.92 17.5 ± 2.39 Oxyberon dust 0.5 2.5 ± 0.79 7.5 ± 0.79 0.25 ± 0.79 27.5 ± 2.76 35 ± 3.79 22.5 ± 4.19 N3M 0 0 0 10 ± 1.29 27.5 ± 2.72 5 ± 1.59 Trong điều kiện khí hậu thích hợp, các đoạn 3 có tỷ lệ sống cao hơn và ra rễ dễ hơn. Tại nồng độ IBA 50ppm, tỷ lệ ra rễ của các đoạn thân cao hơn so với đối chứng, đoạn 2 tỏ ra dễ ra rễ hơn, đặc biệt đoạn 3 ra rễ với tỷ lệ cao hơn đoạn 1. Ở các nghiệm thức kết hợp giữa IBA với 2,4D và IAA, cả 3 đoạn đều ra rễ và đoạn 2 ra rễ nhiều nhất. Tỷ lệ ra rễ của các đoạn này đều cao hơn so với đối chứng, nhưng tỷ lệ ra rễ ở đoạn 1 là 22.5% thấp hơn so với kết quả ở nồng độ 1000ppm IBA. Như vậy, sự phối hợp giữa các chất điều hòa sinh trưởng tác động lên sự ra rễ của thân hoàng lan với hiệu quả còn thấp. Như vậy, IBA là kích tố ra rễ thích hợp để thực hiện giâm cành các đoạn thân hoàng lan. Điều này phù hợp với các nghiên cứu trước đây. Trong các nồng độ IBA đã thực hiện, nồng độ 1000ppm IBA cho kết quả ra rễ tốt nhất, tỷ lệ ra rễ cao nhất là 40% ở Hình 6. Các đoạn thân ra rễ A.Đoạn 1; B. Đoạn 2; C. Đoạn 3 đoạn 1 của thân. Thuốc thương phẩm kích thích ra rễ có nguồn gốc khác nhau cũng có hiệu quả trong giâm cành ở mức độ thấp hơn. Thuốc N3M có thể sử dụng để nhân giống hoàng lan 1 cách rộng rãi và dễ dàng bằng phương pháp giâm cành. 3.1.4. Số lượng và kích thước rễ Trong giâm cành, một bộ phận của cây bị tách rời cơ thể mẹ, để có thể sống độc lập, nó phải phát triển thành một cơ thể mới, tái sinh các cơ quan dinh dưỡng. Sự tái sinh bộ rễ phụ thuộc vào nhiều yếu tố như: đặc tính của loài, điều kiện ngoại cảnh, hàm lượng các phytohormones (auxins), vị trí của cành giâm trên cây, lượng chất dinh dưỡng chứa trong cành giâm, độ lớn của cành giâm… Dưới tác động của chất kích thích ra rễ khác nhau, các vị trí khác nhau trên thân và cành hoàng lan tái sinh bộ rễ với số lượng và chiều dài rễ khác nhau. 3.1.4.1. Số lượng và chiều dài rễ ở cành tay hoàng lan Các đoạn cành tay hoàng lan có thể ra rễ ở các nghiệm thức 500 – 1000ppm IBA và Oxyberon dust 0.5. Số lượng rễ được hình thành và chiều dài rễ sau 8 tuần được trình bày trên bảng 11. Bảng 11. Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn cành hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Số rễ Chiều dài rễ (cm) 500ppm IBA 1 6 1000ppm IBA 1- 2 6.5 - 8 Oxyberon dust 0.5 4 - 6 2 - 5.5 Qua bảng 11, ở các nghiệm thức 500ppm và 1000ppm IBA, số lượng rễ hình thành được ít, từ 1 – 2 rễ, chiều dài rễ dao động từ 6–8cm. Nghiệm thức 1000ppm IBA, số lượng rễ mới nhiều hơn và rễ dài hơn so với 500ppm IBA. Ở nghiệm thức sử dụng thuốc Oxyberon dust 0.5, chất lượng bộ rễ tốt hơn, các đoạn có từ 4 – 6 rễ mới, chiều dài rễ ngắn hơn, từ 2 – 5,5cm. Các nghiệm thức này được tiến hành cùng thời gian (11 – 12/2009), nên chịu ảnh hưởng của tác nhân ngoại cảnh như nhau. Như vậy, chất lượng bộ rễ phụ thuộc chủ yếu vào liều lượng và chất kích thích ra rễ. 3.1.4.2. Số lượng và chiều dài rễ ở thân hoàng lan Chất lượng bộ rễ của các đoạn cành giâm từ thân hoàng lan tốt hơn so với bộ rễ ở các đoạn cành tay. Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn thân được thể hiện ở bảng 12. Ở tất cả các nghiệm thức, số lượng rễ hình thành được ở đoạn 2 cho số rễ cao hơn đoạn 1 và 3. Dựa theo kết quả về số rễ có được từ các nghiệm thức, số rễ của các cành giâm nhiều hơn khi nồng độ IBA tăng. Ở nghiệm thức IBA 1000ppm, số rễ thống kê được cao hơn so với đối chứng. Bảng 12. Số lượng và chiều dài rễ của các đoạn thân hoàng lan trong giâm cành Nghiệm thức Số lượng rễ Chiều dài rễ (cm) Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Đoạn 1 Đoạn 2 Đoạn 3 Nước cất - 1.25 ± 0.79 - - 1.02 ± 0.87 - 50 ppm IBA - 1.89 ± 0.71 1.67 ± 1.27 - 2.42 ± 0.91 2.83 ± 0.62 100ppm IBA - - - - - - 500ppm IBA 2.29 ± 1.48 - - 1.69 ± 0.52 - - 1000ppm IBA 2.5 ± 0.51 2.83 ± 2.24 - 2.87 ± 1.08 1.13 ± 0.36 - 50ppm 2,4D + 100ppm IBA 1 1.71 ± 0.69 - 2.52 ± 2.29 1.3 ± 0.50 - 100ppm IAA + 100ppm IBA 1.22 ± 0.34 2 ± 0.58 1.29 ± 0.45 3.37 ± 1.42 2.63 ± 0.95 2.06 ± 1.13 Oxyberon dust 0.5 2.8 ± 0.56 3.56 ± 1.12 2.56 ± 1.49 2.79 ± 0.86 2.01 ± 0.48 1.26 ± 0.44 N3M - 1.91 ± 0.70 - - 1.98 ± 0.83 - Đối với chiều dài rễ, rễ của các đoạn 1 dài nhất và rễ của các đoạn 2 dài hơn rễ đoạn 3, có thể là do các tế bào ở đoạn 1 gần mô phân sinh đỉnh ngọn, nên rễ hình thành được sẽ phát triển nhanh hơn. Chiều dài rễ cũng tăng dần theo nồng độ của IBA. Qua kết quả trên, ta cũng thấy được, ở điều kiện ngoại cảnh thuận lợi (phụ lục 1), các cành giâm có tỷ lệ ra rễ cao, thì số lượng rễ nhiều hơn và kích thước rễ cũng dài hơn, điều này được thể hiện ở kết quả của hầu hết các nghiệm thức trên bảng 11. 3.2. Kết quả nuôi cấy invitro chồi hoàng lan 3.2.1. Kết quả vô trùng chồi ngọn hoàng lan Dưới tác động của các hóa chất khử trùng (Javel, HgCl2), các mẫu chồi hoàng lan được vô trùng, tuy nhiên, đối với từng loại chất khử trùng và nồng độ chất khử trùng khác nhau, tỷ lệ mẫu được vô trùng cũng khác nhau, đồng thời, tỷ lệ sống của mẫu cấy cũng bị ảnh hưởng. Các kết quả về khử trùng mẫu chồi hoàng lan được thể hiện ở bảng 13 và hình 7. Về tỷ lệ số mẫu vô trùng, xử lý mẫu cấy bằng HgCl2 tỏ ra hiệu quả hơn so với xử lý bằng Javel. Khi sử dụng Javel để khử trùng mẫu, nồng độ và thời gian xử lý mẫu càng cao, các tác nhân gây hại (nấm, vi khuẩn) bị loại bỏ càng nhiều, nên tỷ lệ mẫu vô trùng tăng lên. Nhưng Javel cho hiệu quả khử trùng rất thấp. Ở nồng độ 10% Javel xử lý mẫu trong thời gian 10 phút và 15 phút, đều không có hiệu quả khử trùng. Ở nồng độ 50% Javel xử lý mẫu trong 15 phút, tỷ lệ số mẫu vô trùng chỉ đạt 13,3%. Khi sử dụng HgCl2 để khử trùng mẫu thì hiệu quả khử trùng mẫu cao hơn. Ở nồng độ 0.05mg/l HgCl2 xử lý trong 5 phút, tỷ lệ số mẫu vô trùng là 66,67%. Bên cạnh đó, tương tự với kết quả khi xử lý bằng Javel, nồng độ HgCl2 và thời gian xử lý tăng lên, tỷ lệ số mẫu vô trùng cũng tăng lên. Ở nồng độ HgCl2 cao nhất (0,1mg/l) xử lý trong thời gian lâu nhất (10 phút) cho hiệu quả khử trùng cao nhất, tỷ lệ số mẫu vô trùng là 93,67%. Về tỷ lệ số mẫu sống vô trùng, các nghiệm thức ở nồng độ 0,07mg/l HgCl2 có tỷ lệ mẫu sống cao hơn so với các nghiệm thức còn lại. Ở các nghiệm thức có nồng độ HgCl2 thấp hơn (0,05mg/l), có hiệu quả khử trùng thấp hơn nên tỷ lệ mẫu sống vô trùng thấp hơn so với các nồng độ cao hơn. Ở các nghiệm thức có nồng độ HgCl2 cao hơn (0,1mg/l)2, tỷ lệ số mẫu sống thấp hơn do ảnh hưởng của chất khử trùng. Bảng 13. Tỷ lệ mẫu vô trùng và tỷ lệ mẫu sống sau khi khử trùng Nghiệm thức Tỷ lệ mẫu vô trùng (%) Tỷ lệ mẫu sống sau khử trùng (%) Hóa chất Nồng độ Thời gian (phút) Javel (%) 10 10 0 0 15 0 0 30 10 3.67 ±1.43 0 15 8.33 ± 3.79 0 50 10 10 ± 2.48 3.33 ± 7.17 15 13.3 ± 3.79 3.33 ± 14.34 HgCl2 (mg/l) 0.05 5 66.67 ± 5.17 51.67 ± 5.17 7 72.33 ± 6.25 53.33 ± 7.17 10 76.67 ± 3.79 55 ± 4.97 0.07 5 81.67 ± 1.43 66.67 ± 5.17 7 82 ± 4.97 73.33 ± 7.17 10 84.5 ± 1.24 78.33 ± 3.79 0.1 5 87.33 ± 5.17 65 ± 6.57 7 92.33 ± 1.43 63.3 ± 5.17 10 93.67 ± 3.79 60.67 ± 6.25 Như vậy, HgCl2 là hóa chất khử trùng hiệu quả hơn so với Javel. Và xử lý mẫu cấy ở nồng độ 0,07mg/l HgCl2 trong thời gian 10 phút có tỷ lệ số mẫu sống vô trùng cao nhất (78,33%). Hình 7. Đồ thị về tỷ lệ số mẫu vô trùng và tỷ lệ mẫu sống 3.2.2. Kết quả về tạo chồi hoàng lan trong nuôi cấy mô Các mẫu cấy vô trùng được cấy chuyền qua môi trường WPM, có chất điều hòa sinh trưởng BA và NAA. Sau 4 tuần, các chồi mới được hình thành từ các nách lá. Kết quả tạo chồi được thể hiện qua bảng 14 và hình 9. Số liệu trên bảng 14 cho thấy tỷ lệ số mẫu tạo chồi sau 6 tuần nuôi cấy đều giảm trên tất cả các nghiệm thức. Điều này là do, một số mẫu không tạo chồi hoặc tạo nên những cấu trúc bất thường và một số chất có tác động ức chế được sản sinh từ chính mẫu cấy trong quá trình nuôi cấy. Các chồi mới được hình thành sau 3 tuần nuôi cấy bị thoái hóa và tạo nên những dạng bất thường khi được cấy chuyền sang môi trường mới. Các dạng bất thường này có màu xanh nhạt, giòn dễ gãy hoặc có hiện ._.