Khảo sát quá trình lên men acid lactic bởi Lactobacillus drebrueckii

theo ý muốn. Cĩ thể được sử dụng nhiều lần theo chu kỳ hoặc liên tục. Acid lactic là sản phẩm của quá trình lên men lactic bởi vi khuẩn lactic. Cĩ ứng dụng rất nhiều trong cơng nghiệp, thực phẩm, y dược. Trong cơng nghiệp nhẹ, acid lactic là dung mơi cho cơng nghiệp sản xuất sơn, vecni, nhuộm và thuộc da…, trong cơng nghệ thực phẩm ứng dụng để làm chua quả, sản xuất dưa chua, các sản phẩm lên men từ sữa,sản xuất các loại sữa và bột giàu canxi … Trong y học, người ta sử dụng vật liệu cĩ tên là purasorb ( là một hợp chất cao phân tử được sản xuất từ acid lactic) Purasorb được sử dụng như những đinh gim, gắn phần xương lại với nhau. Ngồi ra các nhà khoa học đang nghiên cứu tạo ra những vật liệu sinh học dùng trong y học bằng các copolyme của acid lactic, chất dẻo mới thay thế cho chất dẻo cũ khĩ phân hủy… Tuy acid lactic được ứng dụng rất nhiều nhưng chưa cĩ nhiều phương nghiên cứu ứng dụng các phương pháp khác vào quá trình lên men nhằm làm tăng hiệu suất lên men thu nhận acid lactic. Trên cơ sở vấn đề đặt ra, việc áp dụng phương pháp cố định tế bào trong sản xuất lên men acid lactic là một hướng nghiên cứu trong việc tìm kiếm các phương pháp lên men nhằm làm tăng hiệu suất lên men acid lactic. 1.2. Mục tiêu đề tài Với mục tiêu đề tài là sử dụng chế phẩm Lactobacillus delbrueckii cố định để lên men liên tục thu nhận acid lactic. Đề tài được tiến hành với các thí nhiệm sau: _Khảo sát các quá trình ảnh hưởng đến lên men acid lactic ( lên men theo mẻ): Độ Brix, pH, thời gian lên men. _ Xác định tốc độ pha lỗng tối ưu của hệ thống lên men liên tục _Kiểm tra tính ổn định của hệ thống lên men liên tục. CHƯƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1. Giới thiệu về lên men acid lactic 2.1.1. Đặc điểm của acid lactic Acid lactic là chất hữu cơ khơng màu, mùi nhẹ, tan trong nước và cồn. Cơng thức hĩa học của acid lactic là CH3CHOHCOOH. Khối lượng phân tử của acid lactic là 98,08. Nhiệt độ sơi là 122oC, điểm tan 17oC Acid lactic cịn cĩ tên gọi khác là 1-hydroxyethanol cacboxylic hay acid 2-hydroxypropanoic. Trong cấu tạo phân tử của chúng cĩ một cacbon bất đối xứng nên chúng cĩ 2 đồng phân quang học: D-acid lactic và L-acid lactic. Hai đồng phân quang học này cĩ tính chất hố lý giống nhau, nhưng chỉ khác là khả năng làm quay mặt phẳng phân cực của ánh sáng. Do đĩ tính chất sinh học của chúng hồn tồn khác nhau. Loại L-acid lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, cồn etylic, eter, khơng tan trong CHCl3. Nhiệt độ nĩng chảy là 28oC, gĩc quay cực ở 15oC là 2,67 o. Loại D-acid lactic ở dạng tinh thể, tan trong nước, cồn. Nhiệt độ nĩng chảy là 28 oC, nhiệt độ sơi 103 oC, gĩc quay cực ở 15 oC là -2,26 o. Nếu D-acid lactic và L-acid lactic cĩ trong một hỗn hợp theo tỷ lệ 50/50 người ta gọi là hỗn hợp Raxemic. Hỗn hợp này được ký hiệu là D1 acid lactic. Trong quá trình lên men khơng khi nào cĩ một hỗn hợp cĩ tỷ lệ lý tưởng này mà chỉ cĩ được hỗn hợp này khi tiến hành tổng hợp hữu cơ. DL-acid lactic là dịch lỏng dạng siro, cĩ khả năng tan trong nước, trong cồn, khơng tan trong CHCl3. Nhiệt độ nĩng chảy của chúng là 16,7 oC, nhiệt độ sơi là 122 oC. [6] 2.1.2. Lên men lactic Lên men lactic là quá trình chuyển hố đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật, điển hình là vi khuẩn lactic. Lên men lactic là một trong những loại hình lên men phát triển nhất trong thiên nhiên. Lên men lactic là một quá trình trao đổi năng lượng. Các phân tử ATP được hình thành trong quá trình chuyển hố cơ chất (lactose) sẽ được vi khuẩn giữ lại trong tế bào để phục vụ cho quá trình trao đổi và sinh trưởng của vi sinh vật. Ngược lại các sản phẩm như acid lactic, ethanol, CO2 được vi khuẩn thải vào mơi trường lên men. Kết quả là hàm lượng acid lactic tích lũy trong mơi trường lên men ngày càng tăng, làm giảm pH mơi trường và kéo theo những biến đổi lý hố khác. Trong quá trình lên men lactic, ngồi sản phẩm là acid lactic, acid acetic, ethanol, CO2 trong dịch lên men cịn xuất hiện cả trăm hợp chất hố học mới khác. Chúng là sản phẩm trung gian hoặc sản phẩm phụ của quá trình lên men. Hàm lượng của chúng trong dịch lên men thường rất thấp ( vài ppm hoặc ít hơn ). Một số hợp chất trong nhĩm trên rất dễ bay hơi. Chúng đĩng vai trị quan trọng trong việc gĩp phần hình thành nên mùi vị đặc trưng cho những sản phẩm lên men lactic. Khi nồng độ của acid lactic đạt 2 – 3% sẽ ức chế hoạt động của các vi sinh vật khác, kể cả E.coli. Chính vì thế nên lên men lactic được ứng dụng để sản xuất nhiều sản phẩm khác nhau như: sữa chua, bơ, dưa chua… Phương trình tĩm tắt của quá trình lên men lactic: C6H12O6→2C3H6O3 + 136Kj (32,4 Kcal) Lên men lactic gồm cĩ lên men đồng hình và lên men dị hình Lên men đồng hình: Lượng acid lactic tạo thành chiếm hơn 90%, chỉ một lượng nhỏ pyruvat bị khử carbon chuyển thành acid acetic, ethanol, CO2, và acetoin. Lượng sản phẩm phụ tạo ra phụ thuộc sự cĩ mặt của oxy. Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men đồng hình như: Lactobacterium casei, Lactobacterium cremoris, Lactobacterium bulgaricus, Lactobacterium delbruckii… Phương trình tổng quát trong quá trình lên men đồng hình: C6H12O6 + 2ADP + 2Pi → 2CH3CHOHCOOH + 2ATP Trong một số trường hợp, Lên men đồng hình cĩ thể được chuyển sang dạng dị hình khi điều kiện lên men thay đổi. Lên men dị hình: Chỉ cĩ 50% lượng đường tạo thành acid lactic, ngồi ra cịn cĩ các sản phẩm phụ tương tác với nhau tạo thành ester cĩ mùi thơm. Phương trình tổng quát trong quá trình lên men dị hình: C6H12O6 → CH3CHOHCOOH + CH3COOH + C2H5OH Lượng sản phẩm phụ tạo thành hồn tồn phụ thuộc vào giống vi sinh vật, mơi trường dinh dưỡng và điều kiện ngoại cảnh. Acid lactic thường chiếm 40% lượng đường đã được phân huỷ, acid suecinic 20%, rượu etylic 10%, acid acetic 10%, và các loại khí gần 20% .[6] 2.1.3. Vi khuẩn lên men lactic 2.1.3.1. Đặc điểm chung Vi khuẩn lactic thuộc Lactobacilliaceae. Acid lactic được phát hiện vào năm 1780 nhờ nhà hố học Sheele người Thụy Điển, ở sữa chua, acid lactic được thừa nhận là sản phẩm của quá trình lên men vào năm 1847. Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn Gram (+), khơng di động, khơng cĩ khả năng tạo bào tử ( tuy nhiên hiện nay người ta đã tìm thấy một số giống thuộc họ vi khuẩn lactic cĩ khả năng tạo bào tử). Vi khuẩn lactic thuộc vi khuẩn hiếu khí tuỳ tiện, khơng chứa cytochrom và enzyme catalase, cĩ khả năng sinh tổng hợp enzyme peroxydase rất mạnh. Chúng phân giải H2O2 để tạo ra H2O và O2 để phát triển. Theo khĩa phân loại của Bergay, họ Lactobacilliaceae chia làm 2 họ: Streptococeae và Lactobacieae Streptococeae lại chia ra Streptococcus và Leuconostoc. Lactobacileae chỉ cĩ 1 lồi là Lactobacillus Vi khuẩn lactic cĩ nhiều trong thiên nhiên. Chúng tồn tại nhiều ở cỏ, nhất là cỏ khơ, trong cơ thể người và động vật, trong miệng, ruột. Một số lồi trong họ vi khuẩn lactic như Streptococcus cĩ khả năng gây bệnh. Nhĩm vi khuẩn lactic rất đa dạng gồm nhiều giống rất khác nhau, tế bào của chúng cĩ thể là hình cầu, hình que...Phân biệt chúng về khả năng lên men đồng hình hay dị hình. Khả năng tổng hợp nhiều hợp chất cần cho sự sống của những vi khuẩn này rất yếu.[7] Các lồi vi khuẩn lactic khác nhau tạo thành acid lactic trong mơi trường và như vậy sức chịu acid cũng khác nhau. Đa số các trực khuẩn lactic đồng hình tạo thành acid cao hơn ( khoảng 2-3,5%), liên cầu khuẩn (khoảng 1%). Các trực khuẩn này cĩ thể phát triển ở pH: 3.8 – 4, cầu khuẩn khơng thể phát triển ở mơi trường này. Hoạt lực lên men tốt nhất ở vùng pH: 5.5 – 6.0 . Đa số vi khuẩn lactic, đặc biệt là trực khuẩn đồng hình rất kén chọn thành phần dinh dưỡng trong mơi trường và chỉ phát triển được trong mơi trường cĩ tương đối đầy đủ các acid amin hoặc các hợp chất nitơ phức tạp. Ngồi ta chúng cịn nhu cầu về vitamin (B1, B2, B6, PP), các acid pantotenic và folic. Bởi vậy, mơi trường nuơi vi khuẩn lactic cĩ thành phần khá phức tạp. [1] Vi khuẩn lactic chịu được ở trạng thái khơ hạn, bền vững với CO2 và cồn etylic, nhiều lồi vẫn sống được trong mơi trường cĩ 10 – 15% cồn hoặc cao hơn, một số trực khuẩn bền với NaCl (tới 7 – 10%). Các vi khuẩn lactic ưa lạnh phát triển ở nhiệt độ tương đối thấp (5 oC hoặc thấp hơn), các lồi ưa ấm cĩ nhiệt độ sinh trưởng tối thích là 25 - 35 oC, các lồi ưa nhiệt cĩ nhiệt độ tối thích là 40 – 45 oC. Khi gia nhiệt tới 60 – 80 oC hầu hết chúng bị chết sau 10 – 30 phút. Sự phát triển của nĩ cần cĩ sự cĩ mặt của peptone, acid amin hay muối amơn. Chúng cĩ yêu cầu đặc biệt về chất dinh dưỡng là giàu vitamin, acid amin và khống chất. Quá trình lên men xảy ra tốt nhất trong mơi trường acid pH từ 5.5 – 6, khi pH nhỏ hơn 5.5 quá trình lên men bị dừng lại. Vi khuẩn lactic cĩ hoạt tính proteaza: phân huỷ protein của sữa thành các peptid và acid amin. Hoạt tính này ở các lồi là khác nhau, thường là trực khuẩn cao hơn. Vi khuẩn lactic lên men được đa số disacarit. Chúng cĩ khả năng lên men nhiều loại đường đơn và đường đơi nhưng khơng cĩ khả năng lên men các loại glucid phức tạp và tinh bột, chỉ cĩ lồi L.delbrueckii là đồng hố được tinh bột. Một số vi khuẩn lên men lactic dị hình sử dụng được pentoza và acid citric. Một số lồi cĩ khả năng tạo thành màng nhầy. Một số khác cĩ khả năng đối kháng với thể hoại sinh và các vi sinh vật gây bệnh hoặc làm thối rửa thực phẩm. Như vậy, ngồi khả năng tạo thành acid lactic, các lồi này cịn cĩ khả năng sinh ra các hợp chất cĩ hoạt tính kháng sinh ( người ta gọi các hợp chất này là bacteriocin). Những chất kháng sinh này khơng dùng trong y học mà chỉ được dùng trong bảo quản thực phẩm cĩ hiệu quả khả quan. Các vi khuẩn lactic ngồi việc tạo thành acid cịn cĩ 1 số lồi tạo được chất thơm ( diacetyl, acetoin, acid bay hơi...) như Streptococcus diacetylactic. Vi khuẩn Lactobacillus cĩ thể làm giảm hội chứng nhạy cảm đường ruột. Các vi khuẩn này cĩ nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hố hết ở ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hocmon và các chất dinh dưỡng quan trọng khác, sinh ra các khí như NH3, CO2, H2S... 2.1.3.2. Các chủng vi sinh vật được sử dụng trong lên men lactic Lactobacillus Lactobacillus là tên một giống vi khuẩn, giống này cĩ nhiều lồi như Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus sporogenes, Lactobacillus kefir... Trong đường ruột luơn cĩ nhiều loại vi khuẩn ký sinh, trong đĩ cĩ cả những loại cĩ ích và cĩ hại cho sức khỏe con người. Sự tồn tại của vi khuẩn lactic tạo thành sự cân bằng vi khuẩn trong đường ruột. Vi khuẩn Lactobacillus cĩ thể làm giảm hội chứng nhạy cảm đường ruột.[6] Các vi khuẩn này cĩ nhiệm vụ biến đổi chất xơ thực phẩm, thức ăn chưa tiêu hố hết ở ruột non thành acid lactic, acetic, butyric, hàng loạt vitamin, acid amin, men, hocmon và các chất dinh dưỡng quan trọng khác. Nĩ cũng sinh ra các khí như NH3, CO2, H2S... Quá trình biến đổi đĩ gọi chung là quá trình lên men, mà nhờ nĩ, thức ăn được tiêu hố hồn tồn. Trong mơi trường hoạt động của đại tràng, các vi khuẩn cĩ ích cĩ khả năng lấn áp, đè bẹp và tiêu diệt rất nhiều loại vi trùng gây bệnh. Lactobacillus cũng giúp tiêu hố đường lactose trong sữa một cách dễ dàng hơn. Loại vi khuẩn cĩ ích này cũng đem lại hiệu quả cao cho những người bị đau bụng tiêu chảy vì loạn khuẩn đường ruột do hậu quả của việc dùng quá nhiều kháng sinh khiến các vi khuẩn cĩ ích bị tiêu diệt. Một nghiên cứu gần đây cho thấy, vi khuẩn Lactobacillus cịn cĩ tác dụng chữa bệnh chàm ở trẻ em. Một số chủng Lactobacillus thường dùng trong lên men lactic như: Lactobacillus bulgaricus: Lên men đồng hình, là trực khuẩn trịn, đơi khi ở dạng hạt, thường kết thành chuỗi dài, Gram (+), khơng cĩ khả năng di động.Chúng cĩ khả năng lên men được các loại đường glucose, lactose, galactose, khơng lên men được sacaroza, xylose, arabinose, sorbose, dulcitol, mannitol, dextrin, inulin. Chúng khơng cĩ khả năng tạo ra nitrit từ nitrate. Đây là giống ưa nhiệt, nhiệt độ tối thích cho phát triển là 40 – 45 oC, tối thiểu là 15 – 20 oC. Hình 2.1 : Vi khuẩn Lactobacillus bulgaricus [10] Lactobacillus casei: Lên men lactic đồng hình, trực khuẩn nhỏ, Gram (+), thường gặp ở dạng chuỗi dài hoặc ngắn, tích tụ tới 1,5% acid. Chúng khơng cĩ khả năng chuyển động. Cĩ khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, salicin. Trong quá trình lên men chúng tạo ra D-acid lactic. Nhiệt độ tối thích cho phát triển là 38 – 40 oC, nhờ cĩ hoạt tính proteaza nên cĩ thể phân hủy protein trong sữa thành acid amin. Hình 2.2 : Vi khuẩn Lactobacillus casei [10] Lactobacillus lycopersici: lên men lactic dị hình, là trực khuẩn Gram (+), sinh hơi, trong thiên nhiên chúng tồn tại thành từng đơi một, cĩ khả năng tạo bào tử. Trong quá trình lên men đường, chúng tạo ra cồn, acid lactic, acid acetic và CO2 . Ngày nay chúng được coi như các biến chủng của Lactobacillus brevis.[6] Lactobacillus pasteurianus: là trực khuẩn Gram (+), cĩ kích thước rộng: 0.5 – 1.0µm, dài: 7.0 - 35µm. Trong thiên nhiên chúng tồn tại riêng lẻ, khơng di động. Chúng cĩ khả năng lên men được arabinose, glucose, fructose, galactose, maltose, tạo ra một loạt các sản phẩm như: CO2, alcohol, acid lactic, acid acetic, acid formic. Nhiệt độ thích hợp từ 29 – 33 oC. Lactobacillus bifidus: trực khuẩn rất nhỏ, thuộc loại Gram (+). Chúng khơng cĩ khả năng di động, cĩ khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, galactose, saccharose, inulin, dextrin. Nhiệt độ phát triển tốt nhất của vi khuẩn này là 37 oC. Lactobacillus causaciccus: Trực khuẩn Gram (+) ngắn, khơng cĩ khả năng chuyển động, cĩ khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose, mannitol. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 48 – 50 oC. Latobacillus brevis: lên men lactic dị hình, là loại trực khuẩn Gram (+), khơng cĩ khả năng di động, cĩ kích thước rộng: 0.7 – 1.0µm, dài: 2.0 – 4.0µm, tìm thấy chủ yếu trong muối chua bắp cải. Trong thiên nhiên chúng thường lêi kết với nhau thành chuỗi. Trong quá trình phát triển chúng cĩ thể sử dụng lactate canxi như nguồn cung cấp carbon. Chúng cĩ khả năng lên men các loại đường arbinose, xylose, gluxose, fructose, galactose, maltose. Trong lên men ngồi acid lactic (1,2%), nĩ cịn tạo thành acid acetic, rượu etylic (2,4%), CO2, nĩ cịn tạo hương làm cho sản phẩm cĩ hương vị dễ chịu. Nhiệt độ phát triển tối đa là 30 oC, vi khuẩn này cĩ nhiều trong sữa, kefia, dưa chua… Hình 2.3 Vi khuẩn Latobacillus brevis [10] Lactobacillus leichmannii: trực khuẩn Gram (+). Trong tự nhiên chúng cĩ khả năng tạo thành chuỗi ngắn, kích thước tế bào từ 0.6 – 2.0µm. Chúng cĩ khả năng lên men glucose, fructose, maltose, saccharose, trehalose và khơng cĩ khả năng lên men lactose, galactose, raffinose, arabinose, rhamnose, dextrin, inulin. Trong quá trình lên men, chúng tạo ra L-acid lactic, khơng cĩ khả năng tạo nitrit từ nitrat. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 36 oC. Lactobacillus helveticcus: trực khuẩn, cĩ kích thước rộng: 0.7 – 0.9µm, dài: 2.0 – 6.0µm. Trong thiên nhiên chúng cĩ thể tồn tại riêng lẻ từng tế bào, cũng cĩ thể tạo thành chuỗi tế bào. Chúng cĩ khả năng lên men các loại đường glucose, fructose, galactose, mannose, maltose, lactose. Nhiệt độ phát triển từ 40 – 42 oC. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và phomai cứng. Lactobacillus thermophilus: là trực khuẩn Gram (+), kích thước tế bào 0.5 – 3.0µm, khơng cĩ khả năng di động. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30 oC, cĩ thể chịu được nhiệt độ 65 – 75 oC. Vi khuẩn này được sử dụng nhiều trong sản xuất sữa chua và phomai. Lactobacillus plantarum: trực khuẩn Gram (+), kích thước tế bào rộng: 0.7 – 1µm, dài 3 – 8µm. Nhiệt độ phát triển tối ưu là 30 oC, cĩ khả năng chịu được nồng độ NaCl 5,5%. Vi khuẩn này được dùng nhiều trong chế biến sữa.[6] Hình 2.4 Vi khuẩn Lactobacillus plantarum [9] Leuconostoc Leuconostoc gồm những liên cầu khuẩn lên men lactic đồng dạng, lên men đường sinh acid lactic và 1 lượng lớn acid acetic, cồn etylic, và khí CO2. Khả năng của 2 lồi Leuconostoc dextranicium và Leuconostoc citrovorum lên men acid citric của sữa với sự sản sinh chất cĩ mùi thơm diacetyl và khả năng kích thích liên cầu khuẩn lactic làm cho chúng được đem dùng vào giai đoạn đầu của chế biến bơ và phomai. Một số đặc trưng của giống Leuconostoc cho nĩ vị trí quan trọng trong thực phẩm như: Sản sinh diacetyl, sự chịu đựng của những nồng độ muối cao làm cho Leuconostoc mesenteriodes được đem dùng ở giai đoạn đầu của sự lên men lactic. Sự chịu đựng được ở những nồng độ đường cao đến 55 – 60% (đối với Leuconostoc mesenteriodes) làm cho vi khuẩn cĩ thể phát triển trong xiro bán lỏng và kem đá… sản sinh ra nhiều thán khí từ đường làm hư hỏng 1 số loại phomai, xiro. Hình 2.5 Vi sinh vật thuộc nhĩm Leuconostoc [9] Streptococcus Streptococcus là cầu khuẩn hoặc trực khuẩn rất ngắn, chủ yếu lên men lactic đồng hình, kết song đơi hoặc thành chuỗi ngắn. Giống ưa ấm, nhiệt độ phát triển tối thiểu là 10 oC, tối đa là 40 – 45 oC và phát triển tốt ở 30 – 35 oC. Trong mơi trường nĩ tích tụ được 0.8 – 1% acid. Một số chủng tạo thành bacteriocin. Một số dạng Streptococcus thường dùng để lên men lactic như: Streptococcus lactis: là liên cầu khuẩn Gram (+). Nhiệt độ phát triển từ 10 – 45 oC, cĩ thể chịu được nồng độ NaCl 4%. Khi lên men đường glucose, maltose, lactose, xylose, arabinose, saccharose, trehalose, monnitol, tạo ra acid lactic, CO2, acid acetic, diacetyl. Chúng cĩ khả năng lên men được raffinose, inulin, glycerol, sorbitol. Chúng được sử dụng rộng rãi trong chế biến các sản phẩm như sữa chua, cream – bơ chua, phomai. Streptococcus lactic cĩ khả năng lên men 30 oC đối với sữa, đường glucose, mantose, lactose, galactose. Hình 2.6 Vi khuẩn Streptococcus lactis [10] Streptococcus cremoris : là tế bào hình cầu và kết thành chuỗi dài, ưa ấm và tạo ít acid trong mơi trường. Nhiệt độ thích hợp cho phát triển là 25 oC, tối thiểu là 10 oC, và tối đa là 36 – 38 oC. Streptococcus thermophilus : cĩ dạng hình cầu, kết thành chuỗi dài, phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 40 – 45 oC, tích tụ khoảng 1% acid. Thường dùng phối hợp với trực khuẩn lactic để chế biến sữa chua và các loại đặc biệt, sữa chua nấu chín và phomai. Hình 2.7 Vi khuẩn Streptococcus thermophilus [10] Streptococcus falcalis : là tế bào Gram (+), chúng thường tạo thành chuỗi tế bào hình cầu, cĩ khả năng chịu được nồng độ NaCl 5%, cĩ khả năng lên men đường glucose, maltose, lactose, trehalose, silicin, sorbitol.[6] Gần đây, người ta nghiên cứu sản xuất phomai từ sữa dừa dưới tác dụng của vi khuẩn Streptococcus diacetylactis. Giống được bảo quản trong mơi trường sữa và giữ trong tủ đơng. Nhiệt độ nuơi cấy sinh trưởng và lên men mạnh nhất khi nuơi cấy ở 28 oC, phát triển khá ở 35 oC và thấp nhất ở 20 oC. Sau nhiều thử nghiệm cho thấy mơi trường tốt nhất là mơi trường sữa bột gầy bổ sung glucose và nước chiết nấm men. Streptococcus diacetylactis cịn được gọi là Pneumococci, là cầu khuẩn Gram (+), xếp từng đơi hay thành chuỗi, cĩ vỏ bằng polysaccharide. Pneumococci dễ bị ly giải bởi những chất hoạt động bề mặt như muối mật. Thường trú ở đường hơ hấp trên của người và cĩ thể gây viêm phổi, viêm xoang, viêm phế quản, nhiễm khuẩn máu, viêm màng não... Ở bệnh phẩm đàm hay mủ, vi khuẩn đứng riêng lẻ hay xếp thành chuỗi. Khi trở nên già thì biến thành Gram (-) và dễ tự ly giải. 2.1.4. Đặc điểm chung của Lactobacillus delbrueckii Lactobacillus delbrueckii thuộc: Giới: Bacteria Ngành: Fermicutes Lớp: Bacilli Bộ: Lactobacillilales Họ: Lactobacillaceae Giống: Lactobacillus Lồi: Lactobacillus delbrueckii Trực khuẩn dài, kích thước 0,5- 0,8µm,2,0- 9,0 mm,khơng di động, Gram (+) Cĩ khả năng lên men được các loại đường glucose, fructose, galactose, maltose và dexrin.Khơng cĩ khả năng lên men xylose, arabinose, mannitol, inulin, rhamnose, lactose, raffinose, trehalose. Ngồi ra chúng cĩ thể đồng hĩa được tinh bột. Thường gặp trên hạt đại mạch, trên bề mặt của thực vật và xác cây đang phân giải, đây là trực khuẩn lớn. Trong quá trình phát triển của mình chúng cĩ khả năng tạo thành sợi. Nhiệt độ tối ưu cho chúng phát triển từ 45 ÷ 50oC,pH là 4.5 – 6.8, khác với các lồi khác chúng khơng cĩ khả năng lên men đường lactose vì vậy chúng khơng được dùng trong chế biến sữa. Thơng thường cĩ khả năng lên men đường thành acid lactic trong điều kiện kỵ khí. 2.1.5. Các yếu tố ảnh hưởng đến sự phát triển của vi khuẩn lactic. 2.1.5.1. Ảnh hưởng của pH pH là số đo hoạt tính của ion hydrogen trong mơi trường. Thang pH thay đổi từ 0-14, pH cĩ ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật. Mỗi sinh vật điều cĩ một phạm vi pH nhất định và pH sinh trưởng tốt nhất. Vi sinh vật ưa acid cĩ pH phát triển tốt nhất khoảng 0-5.5, vi sinh vật trung tính từ 5.5-8, vi sinh vật ưa kiềm từ 8.5-11.5, vi sinh vật ưa kiềm cực đoan sinh truởng tối ưu ở pH 10 và lớn hơn. Mặc dù mỗi nhĩm vi sinh vật cĩ khoảng pH khá rộng nhưng mức chịu đựng của chúng cĩ giới hạn nhất định. Khi pH của tế bào cĩ sự biến đổi đột ngột sẽ phá vỡ màng sinh chất, ức chế hoạt tính của enzyme hay protein chuyển màng.[ 11] Khi pH mơi trường thay đổi tương đối lớn, vi sinh vật vẫn cĩ phương pháp thích nghi ở một giới hạn cho phép. Phần lớn pH nội bào của vi sinh vật vẫn giữ trung tính, nguyên nhân là do tính thấm H+ qua màng sinh chất tương đối thấp. Vi sinh vật trung tính thơng qua hệ thống vận chuyển đã sử dụng K+ thay cho H+. Vi sinh vật ưa kiềm cực đoan dung Na+ thay cho H+ từ mơi trường bên ngồi. Ngồi ra hệ thống chất đệm nội bào cũng cĩ tác dụng ổn định pH nội bào. Trong quá trình trao đổi chất của vi sinh vật sinh ra các chất cĩ tính acid hoặc bazơ giúp trung hịa pH mơi trường. Chẳng hạn, Thiobacillus cĩ thể oxy hĩa các hợp chất chứa lưu huỳnh tạo acid sulfuric, một số vi khuẩn phân giải acid amin tạo NH3 làm kiềm hĩa mơi trường.[11] Vi khuẩn lactic nĩi chung và Lactobacillus delbrueckii nĩi riêng cĩ thể phát triển được trong mơi trường acid, khoảng pH của chúng cĩ thể từ 4.5 – 8.5. Trong quá trình lên men, vi khuẩn sẽ sinh ra acid lactic, khi pH thấp hơn 4 một mặt nĩ sẽ ứu chế các vi khuẩn tạp nhiễm, tuy nhiên nĩ cũng ức chế sự phát triển của Lactobacillus delbrueckii, do đĩ cần phải theo dõi suốt quá trình lên men, dùng bazơ để điều chỉnh pH về thích hợp. 2.1.5.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ Cũng giống như các sinh vật khác, nhiệt độ mơi trường cũng ảnh hưởng rất lớn đối với vi sinh vật. Trên thực tế, do vi sinh vật thường là các vi sinh vật đơn bào cho nên chúng rất mẫn cảm với sự biến hĩa của nhiệt đơ, và thường bị biến hĩa cùng với sự biến hĩa về nhiệt độ của mơi trường xung quanh. Chính vì vậy, nhiệt độ của tế bào vi sinh vật cũng phản ánh trực tiếp nhiệt độ của mơi trường xung quanh. Một nhân tố quyết định ảnh hưởng của nhiệt độ đối với sự sinh trưởng của vi sinh vật đĩ là tính mẫn cảm với nhiệt độ của các phản ứng xúc tác nhờ enzyme. Trong phạm vi nhiệt độ thấp, khi nhiệt độ tăng lên sẽ làm tăng tốc độ sinh trưởng của vi sinh vật, vì phản ứng xúc tác nhờ enzyme cũng giống như các phản ứng hĩa học nĩi chung, khi nhiệt độ tăng lên 10 oC tốc độ phản ứng sẽ tăng gấp đơi. Vì các phản ứng trong tế bào đều tăng cho nên tồn bộ hoạt động trao đổi chất sẽ tăng lên khi nhiệt độ cao hơn, và vi sinh vật sẽ sinh trưởng nhanh hơn. Lúc nhiệt độ tăng lên đến một lúc nhất định thì nhiệt độ càng tăng, tốc d 9ộ sinh trưởng càng giảm. Khi nhiệt độ tăng quá cao, vi sinh vật sẽ chết. Khi nhiệt độ quá cao sẽ gây ra sự biến tính của enzyme, của cá cthể vận chuyển ( transport carryers) và các protein khác. Màng sinh chất sẽ bị tổn thương vì 2 lớp lippit sẽ bị hịa tan. Do đĩ mặc dầu ở nhiệt độ cao các phản ứng xúc tác tiến hành càng nhanh, nhưng do các nguyên nhân nĩi trên mà tế bào bị tổn thương đến mức khĩ hồi phục và dẫn đến việc ức chế sinh trưởng. Tại điều kiện nhiệt độ rất thấp màng sinh chất bị kết đơng lại, enzyme cũng ngừng hoạt động. Nĩi chung, nếu vựt quá nhiệt độ tốt nhất đối với vi sinh vật, chức năng và kết cấu tế bào điều bị ảnh hưởng. Nếu nhiệt độ rất thấp, tuy chức năng chịu ảnh hưởng nhưng thành phần hĩa học và kết cấu khơng nhất thiết bị ảnh hưởng.[11] Vi khuẩn lactic trong cơ thể phát triển tốt nhất ở nhiệt độ từ 36 – 38 oC, ngược lại trong cơ thể động vật thì cao hơn từ 41 – 43 oC và cĩ thể đạt đến 46.5 oC. Nhiệt độ tối ưu cho sự phát triển của Lactobacillus từ 30 – 40 oC. Lactobacillus delbrueckii phát triển trong khoảng nhiệt độ 10 – 50 oC (Buchta, 1983) 2.1.5.3. Ảnh hưởng của oxy Các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện cĩ oxygen được gọi là vi sinh vật hiếu khí (aerobe), cịn các vi sinh vật sinh trưởng trong điều kiện khơng cĩ oxygen được gọi là các vi sinh vật kỵ khí (anaerobe). Hầu hết các cơ thể đa bào đều phải cần sinh trưởng trong điều kiện cĩ oxygen, chúng là các hiếu khí bắt buộc (obligate aerobes). Oxygen là chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi vận chuyển điện tử khi hơ hấp hiếu khí. Ngồi ra các vi sinh vật nhân thực (eucaryotes) hiếu khí cịn dùng oxygen để tổng hợp sterol và các acid béo khơng bão hịa. Các vi sinh vật kỵ khí khơng bắt buộc ( facultative anaerobes ) khơng cần oxygen để sinh trưởng nhưng khi cĩ oxygen thì sinh trưởng tốt hơn. Khi cĩ oxygen chúng sử dụng phương thức hơ hấp hiếu khí. Các vi sinh vật kỵ khí tùy nghi (aerotolerant anaerobes ) như vi khuẩn Enterrococcus faecalis cĩ thể sinh trưởng như nhau trong điều kiện cĩ hay khơng cĩ oxygen. Ngược lại vi khuẩn Bacteroides, Fusobacterrium, Clostridiun pasteurianum, Methanococcus…. Sẽ bị chết khi cĩ oxygen.[11] L. delbrueckii là vi khuẩn hiếu khí tùy tiện.Trong điều kiện hiếu khí sinh khối của vi khuẩn sẽ phát triển nhanh hơn so với điều kiện kỵ khí. Trong điều kiện hiếu khí, từ 1 phân tử glucose sẽ bị oxy hĩa hồn tồn thành CO2 và H2O và tổng hợp các enzyme, từ 1 phân tử glucose tạo ra 36 hoặc 38 ATP, trong điều kiện kỵ khí từ 1 phân tử glucose tạo ra 2ATP do đĩ lượng cơ chất bị phân hủy rất nhanh và tổng hợp một số chất kháng khuẩn. 2.1.6. Cơng nghệ sản xuất acid lactic: 2.1.6.1. Phương pháp sản xuất truyền thống: Theo phương pháp truyền thống, cơng nghệ sản xuất acid lactic phải trải qua 3 giai đoạn chính: Chuẩn bị mơi trường lên men Người ta thường sử dụng nguồn mật rỉ vì rẻ và dễ kiếm. Trước tiên mật rỉ cần được xử lý để tẩy màu và tách các chất keo cĩ trong mật rỉ. Để xử lý màu, người ta thường dùng than hoạt tính. Trước tiên mật rỉ cần phải được làm lỗng theo tỉ lệ 1:3, sau đĩ cho chảy qua cột than hoạt tính.Than hoạt tính sẽ hấp phụ các chất màu. Sau đĩ làm lỗng mật rỉ đến nồng độ chất khơ 15% và dùng H2SO4 5% theo khối lượng dịch để acid hĩa mơi trường.H2SO4 cĩ ý nghĩa rất quan trọng trong quá trình xử lý mật rỉ: H2SO4 như một chất chuyển hĩa đường saccharose thành đường nghịch đảo giúp quá trình lên men sau này tốt hơn. Trong giai đọan này người ta đun dung dịch 90 – 95 oC trong 6 giờ. Tiếp tục pha lỗng dung dịch đường xuống cịn 5 – 10% đường và điều chỉnh pH ngược lại đến 6,3 – 6,5. Làm nguội dung dịch đường xuống 50 oC và bơm chúng vào thùng lên men để tiến hành quá trình lên men. [5] Giai đoạn lên men Vi khuẩn lactic được nuơi cấy riêng ở phân xưởng nhân giống,khi lượng giống đảm bảo về số lượng tế bào (khỏang.106 tế bào/ml) người ta chuyển giống vào thùng lên men với tỉ lệ giống là 2,5 – 3%. Trong quá trình lên men, người ta sử dụng vơi mịn để trung hịa lượng acid tạo thành nhằm tránh hiện tượng acid hĩa dung dịch lên men và tạo ra lactate canxi.Số lượng CaCO3 cho vào tùy thuộc vào lượng acid lactic tạo thành.Duy trì pH trong dịch lên men ở mức 5 – 6. Trong quá trình lên men, người ta tiến hành khuấy trộn liên tục mơi trường. Giai đoạn tạo lactate canxi và thu nhận acid lactic Sau khi lên men xong,dung dịch lên men được đun nĩng đến 80 – 90 oC.Người ta dùng CaCO3 để điều chỉnh dịch đến pH 10 – 11 để yên từ 3 – 5 giờ.Sau đĩ loại bỏ chất lắng,lọc dịch bằng máy lọc khung bản ở nhiệt độ 70 – 80 oC. Sau khi lọc xong, tồn bộ dịch lên men được chuyển sang thiết bị kết tủa lactate canxi. Quá trình tạo kết tủa lactate canxi phải mất 10 – 16 giờ.Kết thúc quá trình, người ta đem lọc bằng máy lọc khung bản. Để riêng kết tủa và dịch lọc.Dịch lọc được đem đi cơ đặc lại và tiến hành kết tủa lại 1 lần nữa để thu hồi tồn bộ lượng acid lactic cĩ trong dịch lên men. Phần kết tủa này được trộn chung với phần trước và đem sang thiết bị thu nhận acid lactic.Để thu nhận acid lactic người ta cho H2SO4 vào phần tủa.Phản ứng sẽ xảy ra và tạo thành CaSO4 kết tủa và dung dịch chứa acid lactic ( C3H6O3). Dung dịch acid lactic được đem đi khử màu bằng than hoạt tính và đem cơ đặc chân khơng để thu nhận acid lactic tinh khiết. [5] 2.1.6.2. Phương pháp sản xuất hiện đại: Phương pháp thẩm tích điện và trao đổi ion Phương pháp này khác với phương pháp truyền thống ở 2 nội dung: Thay đổi giống và mơi trường lên men. Thay đổi phương pháp thu nhận acid lactic. Giống và mơi trường lên men: Giống dùng trong quá trình lên men là Lactobacillus acidophilus. Lượng giống cho vào để lên men là 5% so với dung dịch lên men. Dung dịch chứa đường: 40 – 100 đường trong 1000ml 1% dầu bắp thơ 1 – 4% nước chiết bắp Người ta bổ sung khá nhiều khống vi lượng vào mơi trường lên men. Nhiệt độ lên men 40 – 50 oC Điều chỉnh pH trong suốt quá trình lên men là 4,8 – 5,7 bằng NaOH [5] Phương pháp thu nhận acid lactic Sau khi lên men người ta dùng CaCO3 đưa pH dung dịch lên men đến pH 6,5 và thực hiện các điều kiện cho việc tạo thành lactic canxi như phương pháp truyền thống. Tồn bộ dung dịch, cả phần lactate và sinh khối được đưa vào thiết bị thẩm tích điện (eletro dialysis) để thu nhận lactate canxi ở dạng lỏng và sinh khối vi sinh vật. Sinh khối vi sinh vật cĩ khả năng lên men sẽ được chuyển ngược lại để lên men mẻ kế tiếp. Lactat canxi được cơ đặc chân khơng và chuyển sang máy thẩm tích điện trích ly (water spiltting eletrodialysis ) để thu nhận acid lactic. Dung dịch acid lactic sẽ được đưa qua cột trao đổi ion để tách các ion Ca+ và các cation khác. Acid lactic sau khi thu được sẽ cĩ độ tinh thiết 99%. [5] 2.1.6.3.Phương pháp thu nhận acid lactic Phương pháp thu nhận acid lactic ở pH > pKa Đầu tiên người ta cho dung dịch lên men tiếp xúc với chất hấp thụ alamin 336 (tricaprylylamin hịa tan trong methyl iso butylketone). Tiếp đến, chất hấp phụ sẽ ._.