Khảo sát một số hợp chất có hoạt tính sinh học trong nuôi cấy mô sẹo cây kim ngân (Lonicera japonica Thumb)

ự nhiên lại rất thấp đã thúc đẩy sự phát triển không ngừng của công nghệ nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn. Tuy nhiên, các con đường sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp mong muốn trong thực vật cũng như trong nuôi cấy tế bào ở quy mô lớn là rất phức tạp. Vì vậy, các thông tin ở mức độ tế bào và phân tử của các quá trình chuyển hóa là rất cần thiết cho sự phát triển của sản xuất công nghiệp. Nhiều nghiên cứu được đã thực hiện ở các điều kiện khác nhau để giải thích các hiện tượng xuất hiện trong quá trình sản xuất các chất trao đổi thứ cấp từ các tế bào thực vật nuôi cấy in vitro. Các kết quả này cũng cho thấy các hệ thống nuôi cấy tế bào thực vật có tiềm năng rất lớn cho việc khai thác thương mại các chất trao đổi thứ cấp. Mục đích và nội dung nghiên cứu Mục đích Bước đầu khảo sát một vài hợp chất có hoạt tính sinh học có trong mẫu mô sẹo, hoa, cành lá của Kim ngân hoa và thử hoạt tính của chúng lên hai chủng vi khuẩn E.coli và Samonella. Từ đó tạo tiền đề cho những nghiên cứu tách chiết và phân lập các chất có giá trị dược lý trong mô sẹo, hoa, cành lá Kim ngân làm nguyên liệu phục vụ cho nghành công nghiệp dược. Nội dung nghiên cứu Bước đầu khảo sát hai hợp chất có hoạt tính sinh học được biết nhiều trong Kim ngân hoa là saponin triterpenoid và flavonoid bằng hai phương pháp: trắc nghiệm sinh hóa và sắc ký lớp mỏng (TLC). Thử hoạt tính dịch chiết của mô sẹo, hoa đối với hai chủng vi khuẩn E.coli và Samonella. CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Khái niệm chung về các hợp chất tự nhiên Khái niệm Hợp chất tự nhiên, là chất biến dưỡng thứ cấp, có trọng lượng phân tử nhỏ, được tạo ra bởi cơ thể của một sinh vật. Chất biến dưỡng thứ cấp có thể cần thiết hoặc nhiều khi không cần thiết cho sự sống của sinh vật, điều này khác với những hợp chất đại phân tử như protein, acid nucleic, polysacchride là những hợp chất căn bản cần thiết đối với sự sống của mỗi sinh vật. (Nguyễn Kim Phi Phụng, 2007, Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Đại học quốc gia thành phố Hồ Chí Minh). Phân loại Các chất biến dưỡng thứ cấp bao gồm nhiều loại hợp chất và được sắp xếp thành những nhóm khác nhau. Việc phân loại các hợp chất thành một nhóm thường không phải bởi một định nghĩa duy nhất, cũng như ranh giới của một nhóm thường không rõ ràng. Alkaloid Alkaloid là những hợp chất có tính base yếu, do sự có mặt của nguyên tử nitơ. Tính base của các alkaloid cũng khác nhau tùy theo sự hiện diện của các nhóm thế R (mang các nhóm chức khác nhau) gắn trên nguyên tử nito. Các alkaloid chia thành ba loại: Alkaloid thật: là những hợp chất có hoạt tính sinh học, luôn có tính base, thường được sinh tổng hợp từ amino acid, phân bố giới hạn trong thực vật và hiện diện trong cây dưới dạng muối của một acid hữu cơ. Protoalkaloid được xem là những amin có hoạt tính sinh học kể cả mescalin và N, N–dimetyltryptamin. Chúng là những amin đơn giản, được tổng hợp từ các amino acid, trong đó nguyên tử nitơ không ở trong vòng dị hoàn. Giả alkaloid là những hợp chất không bắt nguồn từ những amino acid, bao gồm hai nhóm hợp chất lớn là alkaloid steroid và alkaloid terpenoid. Flavonoid Khái niệm Flavonoid là một nhóm hợp chất lớn thường gặp trong thực vật. Hơn một nữa rau quả thường dùng có chứa flavonoid. Flavonoid cũng là thành phần hay gặp trong dược liệu có nguồn gốc từ thực vật. Cho đến nay có khoảng 4.000 chất đã được xác định cấu trúc. Chỉ riêng 2 nhóm flavon và flavonol và với nhóm thế là -OH và / hoặc -OCH3 thì theo lý thuyết có thể gặp 38.627 chất. Phần lớn các chất flavonoid có màu vàng (flavonoid do từ flavus có nghĩa là màu vàng). Tuy nhiên một số có màu xanh, tím, đỏ, một số khác lại không có màu cũng thuộc nhóm flavonoid. Trong thực vật cũng có một số nhóm hợp chất khác không thuộc flavonoid nhưng lại có màu vàng như carotenoid, anthranoid, xanthon. Cấu trúc hóa học Người ta xếp vào nhóm flavonoid những chất có cấu tạo khung theo kiểu C6–C3–C6 hay nói cách khác là khung cơ bản gồm 2 vòng benzen A và B nối với nhau qua một mạch 3 carbon. Hình 2.1: khung cơ bản của flavonoid Người ta xem cấu trúc này gồm hai phần (được theo dõi bằng chất đồng vị): C6 – C3 (tức là vòng B + 3C) phần này xuất phát từ acid shikimic dẫn đến các dẫn chất phenylpropanoid Hình 2.2: sơ đồ hình thành phenylpropanoid C6 hay là (vòng A) xuất phát từ 3 đơn vị acetat dẫn đến acid triacetic. Sau đó 2 phần được ghép lại tạo thành chalcone Hình 2.3: cấu tạo cơ bản của chalcone Phần lớn các flavonoid có thể xem là các dẫn chất có gốc phenyl của các nhân trên. Đánh số thứ tự bắt đầu từ dị vòng, số 1 từ dị tố oxy rồi tiếp đến vòng A, vòng B đánh số phụ. Trường hợp không có vòng C (nghĩa là mạch 3C hở) ví dụ trường hợp chalcon thì đánh số bắt đầu từ vòng B, vòng A đánh số phụ. Hình 2.4: cấu tạo cơ bản của flavan Phân loại flavonoid Sự phân loại các flavonoid dựa vào vị trí của gốc aryl (vòng B) và các mức độ oxy hóa của mạch 3C. Người ta chia ra: Euflavonoid là các flavonoid có gốc aryl ở vị trí C – 2, isoflavonoid có gốc aryl ở vị trí C – 3, neoflavonoid có gốc ary ở vị trí C – 4. Người ta còn phân biệt biflavanoid là những flavonoid dimer, triflavonoid cấu tạo bởi 3 monomer flavonoid, flavolignan là những flavonoid mà phân tử có một phần cấu trúc ligan. Euflavonoid: bao gồm các nhóm: anthocyanidin, flavan, flavan 3–ol flavan 4–ol, 3,4–diol, flavanon, 3–hydroxy flavanon, flavon, flavonol, dihydrochalcon, chalcon, auron. Isoflavonoid: bao gồm nhiều nhóm khác nhau: isoflavan, isoflav-3–ene, isoflavan – 4 –ol, isoflavanon, isoflavon, rotenoid, pterocarpan, coumestan, 3– arylcoumarin, coumaronochromen, coumaronochromon, dihyroisochalcon, homoisoflavon. Isoflavonoid thường gặp trong họ Đậu – Fabaceac. Neoflavonoid chỉ có giới hạn trong một số loài thực vật, bao gồm: 4–arylchrroman, 4–arylcoumarin, dalbergion. Biflavonoid và triflavonoid: những flavonoid dimer và trimer. Những hợp chất này được gọi là proanthocyanidin. Ở đây những biflavonoid tạo thành từ flavon, flavanon, dihydroflavonol–chalcon, dihydro chalcon, auron, isoflavon. Sự phân bố flavnoid trong thực vật Trong thực vật bậc thấp flavonoid ít được gặp. Trong ngành rêu chỉ phát hiện được rất ít chất. Trong dương xỉ số lượng flavonoid ít nhưng đều có mặt các nhóm anthocyanin, flavanon, flavon, flavonol, chalcon, dihydrochalcon. Ngành hạt trần có khoảng 700 loài, 20 họ, số lượng flavnoid cũng không nhiều nhưng cũng đủ các nhóm anthocyanidin, leucoanthocyanidin, flavanon, flavon, flavonol, isoflavon. Nét đặc trưng của nghành hạt trần có khác thực vật bậc thấp và ngành hạt kín ở chỗ sự hiện diện của nhiều dẫn chất biflavonoid. Flavonoid tập trung chủ yếu vào ngành hạt kín ở lớp 2 lá mầm. Có rất nhiều họ chứa flavonoid và đủ các loại flavonoid. Tuy nhiên cũng có một vài nét đặc trưng cho một số họ ví dụ họ Asteraceae là một họ lớn với 15.000 loài, 1000 chi, có rất nhiều dẫn xuất thuộc các nhóm khác nhau. Tuy nhiên, một số chi có nét đặc trưng riêng của nó, ví dụ trong các chi Carthamus, Coreopsis, Cosmos, Dahlia thì hay gặp các dẫn chất chalcon và auron. Chi Gymnosperma, Ageratum thì gặp các dẫn chất flavon và flavonol có nhiều nhóm thế có oxy (có thể đến 8 nhóm). Họ Fabaceae thì hay gặp các chất thuộc nhóm isoflavonoid. Họ Rutaceae thường gặp các flavon và flavonol có nhiều nhóm methoxy. Họ Theaceae hay gặp các flavan–3–ol. Họ Ranunculaceae và Paeoniaceae hay gặp dẫn chất flavonol 3,7 diglycosid. Họ Rosaceae chi Rubrus và Prunus ở trong quả hay gặp anthocyanin có mạch đường phân nhánh. Họ Polygonaceae ở chi Hydropiper hay gặp các flavon và flavonol sulfat. Lớp một lá mầm có 53 họ nhưng cho đến nay chỉ khoảng trên 10 họ tìm thấy có flavonoid: Amaryllidaceae, Araceae, Cannaceae, Commelinaceae, Iridaceae, Lemnaceae, Liliaceae, Musaceae, Oridaceae, Poaceae. Hàm lượng và cả thành phần flavonoid trong cây phụ thuộc vào nơi mọc. Cây mọc ở vùng nhiệt đới và núi cao thì hàm lượng cao hơn ở nơi cây thiếu ánh sáng. Hình 2.5: sơ đồ sinh tổng hợp flavonoid Tính chất Các dẫn chất flavon có màu vàng rất nhạt có khi không có màu (trường hợp các nhóm OH đã methyl hóa), flavonol vàng nhạt đến vàng, chalcon và auron vàng đậm, đến đỏ cam. Các chất thuộc nhóm isoflavon, flavanon, isoflavanon, flavanonol, leuco–anthocyanidin, flavan–3–ol do không có nối đôi liên hiệp giữa vòng B với nhóm carbonyl nên không màu. Các dẫn chất anthocyanidin thì màu thay đổi tùy theo pH của môi trường. Tuy nhiên khi các flavonoid ở trong các bộ phận của cây thì còn phụ thuộc vào hỗn hợp với các sắc tố khác. Độ tan không giống nhau, thường flavonoid glycosid và flavonoid sulfat là những hợp chất phân cực nên không tan hoặc ít tan trong dung môi hữu cơ, tan được trong nước tốt nhất là cồn. Các aglycon flavonoid thì tan được trong dung môi hữu cơ, không tan trong nước. Các dẫn chất flavnoid có nhóm 7–hydroxy thường đễ tan trong dung dịch kiềm loãng. Tác dụng sinh học của flavonoid Các dẫn chất flavonoid có khả năng loại bỏ các gốc tự do như -HO, -ROO. Các gốc này sinh ra trong tế bào bởi nhiều nguyên nhân và khi sinh ra cạnh DNA thì sẽ gây ra những ảnh hưởng nguy hại như gây biến dị, hủy hoại tế bào, gây ung thư, tăng nhanh sự lão hóa. Thí nghiệm cho thấy khả năng ức chế của một số flavonoid theo thứ tự: myriceum > quercetin > rhammetin > morin > diosmetin > naringenin > apigenis > catechin > 5,7 dihydroxy–3’, 4’, 5’ trimethoxy flavon > robinin > kaempferol > flavon. Flavonoid tạo được phức với các ion kim loại mà chính các ion kim loại này là xúc tác của nhiều phản ứng oxy hóa. Các flavonoid có 3, 5, 3’, 4’ hydroxyl có khả năng liên kết tốt với các ion kim loại đó theo phức oxychromon, oxycarbonxyl hoặc 3’, 4’ orthodioxyphenol. Thành phần của màng tế bào có các hoạt chất lipid dễ bị peroxyde hóa, tạo ra những sản phẩm làm rối loạn sự trao đổi chất cũng như đến sự hủy hoải tế bào. Đua các chất chống oxy hóa như flavonoid vào cơ thể để bảo vệ tế bào thì có ngăn ngừa các nguy cơ như xơ vữa động mạch, tai biến mạch, lão hóa, tổn thương do bức xạ, thoái hóa gan… Flavonoid cùng với acid ascorbic tham gia trong quá trình hoạt động của enzyme oxy hóa – khử. Flavonoid còn ức chế tác động của hyaluronidase. Enzyme này làm tăng tính thấm của mao mạch. Khi enzyme này thừa thì gây hiện tượng xuất huyết dưới da mà y học gọi là bệnh thiếu vitamin P. Các chế phẩm chứa flavonoid chiết từ các loài Citrus như “Cemaflavone”, “Circularine”,… flavonoid từ lá bạc hà (diosmin) như “Daflon”, “Diosmil”, flavonoid từ hoa hòe (rutin) với nhiều biệt dược khác nhau đã chứng minh tác dụng làm bền thành mạch, làm giảm tính “dòn” và tính thấm của mao mạch. Tác dụng này được hợp lực cùng với acid ascorbic. Flavonoid được dùng trong các trường hợp rối loạn chức năng tĩnh mạch, tĩnh mạch bị suy yếu, giãn tĩnh mạch, trĩ, chảy máu do đặt vòng trong phụ khoa, các bệnh trong nhãn khoa như sung huyết kết mạc, rối loạn tuần hòa võng mạc. Các dẫn chất anthocyanosid có tác dụng tái tạo tế bào võng mạc và đã được chứng minh có tác dụng tăng thị lực vào ban đêm. Tác dụng chống độc của flavonoid thể hiện làm giảm thương tổn gan, bảo vệ được chức năng gan khi một số chất độc được đua vào cơ thể sinh vật thí nghiệm (CCl4, benzene, ethanol, CHCl3, quinine, novarsenol,..) Dưới tác dụng của flavonoid ngưỡng ascorbic được ổn định đồng thời lượng glycogen trong gan tăng. Sự tích lũy glycogen có ý nghĩa quan trọng trong việc nâng cao chức năng giải độc gan. Việc sử dụng một số dược liệu trong điều trị viêm gan, xơ gan, bảo vệ tế bào gan rất hiệu quả như: cây actiso, có biệt dược là Chophytol. Cây Silibummarianum Gaertn có biệt dược “Legalon”; cây bụt dấm – Hibiscus sabdariffa. Tác dụng kích thích tiết mật thể hiện ở các chất thuộc nhóm flavanon, flavon, flavonol, và flavan–3–ol. Flavonoid thể hiện tác dụng chống co thắt những tổ chức cơ nhẵn (túi mật, ống dẫn mật, phế quản và một số tổ chức khác). Ví dụ apigemin có tác dụng làm giảm co thắt phế quản gây ra bởi histamin, acetylcholine, serotonin. Trên bộ máy tiết niệu, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavon, flavonon, flavonol thể hiện tác dụng thông tiểu rõ rệt. Scoparosid trong Sarothammus scoparius, lespecapitosid trong Lespedeza capiata, quercitrin trong lá diếp cá, flavonoid của cây râu mèo đều có tác dụng thông tiểu. Tác dụng chống loét của flavanon và chalcon glycoside của rễ cam thảo đã được ứng dụng để chữa đau dạ dày. Một số dẫn chất khác như catechin, 3–O– methyl catechin, naringennin cũng đã được thử thấy có tác dụng chống loét. Tác dụng chống viêm của nhiều flavonoid thuộc các nhóm flavon, flavonon, dihydroflavonol, anthocyanin, flavan–3–ol , chalcon, isoflavon, biflavon, 4–aryl coumarin, 4–aryl chroman đều được chứng minh bằng thực nghiệm do các chất flavonoid này ức chế con đường sinh tổng hợp prostaglandin. Người ta đã sử dụng rutin, citrin, leucodephinidin, quercetin, catechin để điều trị ban đỏ, viêm da, tổn thương da và màng nhầy trong trường hợp xạ trị. Trên hệ tim mạch, nhiều flavonoid thuộc nhóm flavonol, flavan–3– ol, anthocyanin như quercetin, rutin, myricetin, pelarrgonin, hỗn hợp catechin của trà có tác dụng làm tăng biên độ co bóp và tăng thể tích của tim, thí nghiệm làm hồi phục tim khi bị ngộ độc bởi CHCl3, quinin, methanol, bình thường lại sự rối loạn nhịp. Cao chiết từ lá cây bạch quả (Ginko biloba) chứa các dẫn xuất 3–rutinosid của kaempferol, quercetin và isorhammetin (trong lá già đã vàng thì chứa ginkgetin và isoginkgetin) đã được một số hãng của Pháp bào chế thành biệt dược ví dụ “Ginkogink”, “Tanakan” có tác dụng tăng tuần hoàn máu trong động mạch, tĩnh mạch và mao mạch. Thuốc dùng cho những người có biểu hiện lão suy: rối loạn trí nhớ, khả năng làm việc trí óc sút kém, mất tập trung tư tưởng, hay cáu gắt. Trên hệ thần kinh, một số C– lavon glycoside của hạt táo – Ziziphus vulgaris var. spinosus (chứa spinosin, swertisin và các dẫn chất acyl của spinosin) có tác dụng an thần rõ rệt. Một số tài liệu gần đây có nói đến tác dụng chống ung thư của một số chất như leucocyanidin, leucopelargonidin, leucodelphinidin và tác dụng kháng HIV của một số dẫn xuất thuộc nhóm flavon như chrysin, acacetin 7–O–β–D–galactopyranosid. Các dẫn xuất thuộc nhóm isoflavonoid có tác dụng tương tự estrogen ví dụ như genistein daizein. Tác dụng này được giải thích do sự gần nhau về cấu trúc với diethylstiboestrol. Một số flavonoid khác thuộc nhóm rotenoid như chất rotenon có trong dây mật – Deris ellptica Benth thì tác dụng diệt côn trùng đã được biết và đã được ứng dụng từ lâu. Saponin Định nghĩa Saponin còn gọi là saponosid do chữ latin sapo = xà phòng, là một nhóm glycosid lớn, gặp rộng rãi trong thực vật. Người ta cũng phân lập được saponin trong động vật như hải sâm, cá sao. Saponin có một số tính chất đặc biệt: Làm giảm sức căng bề mặt, tạo bọt nhiều khi lắc với nước, có tác dụng nhũ hóa và tẩy sạch. Làm vỡ hồng cầu ngay ở những nồng độ rất loãng. Độc với cá vì saponin làm tăng tính thấm của biểu mô đường hô hấp nên làm mất các chất điện giải cần thiết, ngoài ra có tác dụng diệt các loài thân mềm như giun, sán, ốc sên. Kích ứng niêm mạc gây hắt hơi, đỏ mắt, có tác dụng long đờm, lợi tiểu cao gây nôn mửa, đi lỏng. Có thể tạo phức với cholesterol hoặc với các chất 3– β–hydroxysteroid khác. Tuy vậy một vài tính chất trên không thể hiện ở một vài saponin. Ví dụ: sarsaparillosid thì không có tính phá huyết cũng như tính tạo phức với cholesterol. Saponin đa số có vị đắng trừ một số như glycyrrhizin có trong cam thảo bắc, abrusosid trong cam thảo dây, oslandin trong cây Polypodium vulgare có vị ngọt. Saponin tan trong nước, alcol, rất ít tan trong aceton, ether, hexan do đó người ta dùng ba dung môi này để tủa saponin. Saponin có thể bị tủa bởi chì acetate, barihydroxyd, ammoni sulfate. Saponin khó bị thẩm tích, người ta dựa vào tính chất này để tinh chế saponin trong quá trình chiết xuất. Phần genin tức là sapogenin và dẫn xuất acetyl sapogenin thường dễ kết tinh hơn saponin. Saponin triterpenoid thì có loại trung tính và loại acid, saponin steroid thì có loại trung tính và loại kiềm. Về mặt phân loại, dựa theo cấu trúc hóa học có thể chia ra: saponin triterpenoid và saponin steroid. Cấu trúc hóa học Saponin triterpenoid Phần genin của loại này có 30 carbon cấu tạo bởi 6 nhóm hemiterpen. Người ta chia àm 2 loại: Saponin triterpenoid pentacyclic: chia ra làm các nhóm: olean, ursan, lupan. (2) (1) Hình 2.6: (1) olean, (2) ursan Saponin triterpenoid tetracyclic: có 3 nhóm chính: dammaran, lanostan, cucurbitan. (4) (3) Hình 2.7: (3) dammaran, (4) lanostan Saponin steroid Nhóm spirostan Hình 2.8: spirostan Nhóm furostan Hình 2.9: furostan Nhóm spirosolan Hình 2.10: spirosolan Công dụng Saponin có tác dụng long đờm, chữa ho. Saponin là hoạt chất chính trong các dược liệu chữa ho như viễn chí, cát cánh, cam thảo, thiên môn, mạch môn,… Một số dược liệu chưa saponin có tác dụng thông tiểu như rau má, tỳ giải, thiên môn, mạch môn,… Saponin có mặt trong một số vị thuốc bổ như nhân sâm, tam thất và một số cây thuộc họ nhân sâm khác. Saponin làm tăng sự thấm của tế bào: sự có mặt của saponin sẽ làm cho các hoạt chất khác dễ hòa tan và hấp thu. Một số saponin có tác dụng chống viêm. Một số có tác dụng kháng khuẩn, kháng nấm, ức chế virus. Một số có tác dụng chống ung thư. Nhiều saponin có tác dụng diệt các loài thân mềm (nhuyễn thể). Sự phân bố trong thực vật Saponin steroid thường gặp trong những cây một lá mầm. Các họ thường gặp là: Amaryllidaceae, Dioscoreaceae, Liliaceae, Smilacaceae. Saponin triterpenoid thường gặp trong những cây 2 lá mầm thuộc các họ như: Acanthaceae, Amaranthaceae, Araliaceae, Campnulaceae, Caryophyllaceae, Fabaceae, Polygalaceae, Rubiaceae, Sapindaceae, Sapotaceae,… Trong cây saponin thường tích lũy ở những bộ phận khác nhau: tích lũy ở quả bồ kết, bồ hòn; rễ cam thảo, viễn chí, cát cánh; lá như dứa Mỹ. Hợp chất glycoside Các glycoside hiện diện trong rất nhiều họ thực vật và ở tất cả các bộ phận cây: lá, vỏ, hạt, …Các glycoside thường là chất kết tinh và có vị đắng. Glycoside là hợp chất mà cấu trúc hóa học gồm có hai phần: phần đuờng và phần không đường thường được gọi là aglycon. Dưới tác dụng của enzyme thực vật hoặc dung dịch acid hoặc kiềm, glycosid bị thủy phân thành aglycon và phần đường: Phần đường của glycosid: phần đường phổ biến là D–glucose, D–galactose, L–arabinose, L–rhamnose, D–xylose, acid glucuronic, acid galacturonic và một số đường khác. Phần aglycon của glycosid: phần aglycon rất đa dạng và gồm tất cả các loại hợp chất tự nhiên như: monoterpen, sesquiterpen, diterpen, triterpen, steroid, iridoid, flavonoid, alkaloid, quinonoid, polyphenol,.. Hợp chất phenol Các hợp chất phenol dùng để chỉ chung các hợp chất mà trong cấu trúc có vòng benzen mang một hoặc nhiều nhóm chức hydroxy – OH. Trong thiên nhiên, các hợp chất phenol là: flavonoid, xanthon, courmarin, quinon, các phenol đơn vòng, các polyphenol (ligin, tanin,..). Các hợp chất phenol dễ tan trong nước vì chúng thường hiện diện trong cây ở dạng glycosid. Nhiều hợp chất phenol có màu sắc tự nhiên, nên có thể đựa vào đặc điểm này để theo dõi chúng trong quá trình chiết tách, cô lập chúng ra khỏi cây cỏ. Các hợp chất phenol thường bị hủy hoại do tác dụng của enzmye phenolase vốn luôn có trong cây vì thế nên sử dụng alcol nóng để chiết tách do alcol giúp hạn chế tác dụng của enzyme này. Sinh tổng hợp các hợp chất đã được biết từ rất sớm, đi từ ba amino acid là phenylamin, tyrosin, tryptophan. Quá trình này xảy ra ngang một chuỗi các phản ứng phức tạp để cho phenylalanin, tyrosin, tryptophan và từ đó dẫn đến những hợp chất phenol. Khái niệm chung về Thin layer chromatography (TLC) Tổng quát về TLC Kỹ thuật sắc ký đã được sử dụng từ nhiều thế kỷ trước để tách các phẩm nhuộm từ cây cỏ. Đến thập kỷ 1930 – 1940, phương pháp này được phát triển nhanh chóng với nhiều kỹ thuật khác nhau. Có các loại sắc ký: sắc ký giấy (kỹ thuật sớm nhất, hiện nay ít được sử dụng vì hiệu quả tách kém thua kỹ thuật sắc ký lớp mỏng), sắc ký lớp mỏng, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel, sắc ký ái lực, sắc ký lỏng hiệu năng cao, điện di. Sắc ký lớp mỏng còn gọi là sắc ký phẳng, dựa chủ yếu vào hiện tượng hấp thu trong đó pha động là một dung môi hoặc hỗn hợp các dung môi, di chuyển ngang qua một pha tĩnh là một chất hấp thu trơ, mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiến, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Do chất hấp thu được tráng thành một lớp mỏng nên phương pháp này được gọi là sắc ký lớp mỏng. Bình sắc ký: một chậu, hũ, lọ,… bằng thủy tinh, hình dạng đa dạng, có nắp đậy. Pha tĩnh: một lớp mỏng khoảng 0.25 mm của một loại chất hấp thu, thí dụ như silica gel, alumin,… được tráng thành một lớp mỏng, đều, phủ lên một nền phẳng như tấm kiếng, tấm nhôm hoặc tấm plastic. Chất hấp thu trên tấm giá đỡ nhờ sulfat calci khan, hoặc tinh bột, hoặc một loại polymer hữu cơ. Mẫu cần phân tích Pha tĩnh (chất hấp thu) Tấm lớp mỏng bằng plastic hoặc nhôm Pha động (dung môi) Nắp đậy bình sắc ký Hình 2.11: bình sắc ký lớp mỏng Mẫu cần phân tích: mẫu chất cần phân tích thường là hỗn hợp gồm nhiều hợp chất với độ phân cực khác nhau. Sử dụng khoảng 1µl dung dịch mẫu với nồng độ loãng 2 – 5%, nhờ một vi quản để chấm mẫu thành một điểm gọn trên pha tĩnh, ở vị trí phía trên cao hơn một chút so với mặt thoáng của chất lỏng đang chứa trong bình. Pha động: dung môi hoặc hỗn hợp hai dung môi, di chuyển chầm chậm dọc theo tấm lớp mỏng và lôi kéo mẫu chất đi theo nó. Dung môi di chuyển đi lên cao nhờ vào tính mao quản. Mỗi thành phần của chất mẫu sẽ di chuyển với vận tốc khác nhau, đi phía sau mực của dung môi. Vận tốc di chuyển này tùy thuộc vào các lực tương tác tĩnh điện mà pha tĩnh muốn níu giữ các mẫu chất ở lại pha tĩnh (hiện tượng hấp thu của pha tĩnh) và tùy vào độ hòa tan của mẫu chất trong dung môi. Với chất hấp thu là silica gel hoặc alumin, các hợp chất kém phân cực sẽ di chuyển nhanh và các hợp chất rất phân cực di chuyển chậm. So sánh TLC với kỹ thuật sắc ký khác Sắc ký lớp mỏng có ưu điểm: sử dụng ít chất hấp thu, cần rất ít mẫu phân tích (vi lượng), quá trình triển khai sắc ký nhanh nên trong một thời gian ngắn có thể biết ngay kết quả mẫu cần phân tích có chứa bao nhiêu chất khác nhau. So với phương pháp sắc ký lớp mỏng, phương pháp sắc ký cột cổ điển cho kết quả kém hơn do phải sử dụng một lượng lớn chất hấp thu, chất mẫu và dung môi nên quá trình thực hiện phải kéo dài, dẫn theo kết quả không tốt. Tiếp theo, kỹ thuật sắc ký lớp mỏng mới là sắc ký cột chớp nhoáng (flash column chromatography) do có sử dụng thêm áp suất nên rút ngắn được thời gian thao tác và khả năng tách riêng các chất ra khỏi hỗn hợp ban đầu, đã cho kết quả gần đạt được so với sắc ký lớp mỏng, tuy vật vẫn mất thời gian. Những năm gần đây kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp cho kết quả nhanh, tốt, cả về mặt định tính lẫn định lượng nhưng máy rất đắt tiền, không phải phòng thí nghiệm nào cũng có khả năng trang bị. Bảng 2.1: so sánh các đặc trưng của các kỹ thuật sắc ký Sắc ký lớp mỏng Sắc ký cột cổ điển Sắc ký cột chớp nhoáng Sắc ký khí Sắc ký HPLC Cơ chế sắc ký Hấp thu / phân chia Hấp thu Hấp thu Phân chia Phân chia Tính chất hợp chất đem đi phân tích Dung dịch mẫu có tính kém bay hơi Dung dịch mẫu có tính kém bay hơn Dung dịch mẫu có tính kém bay hơi Khí hoặc hơi của các hợp chất có tính bay hơi Mẫu có tính bay hơi nhiều hay ít đều phù hợp Khả năng tách chất Đạt Trung bình Tốt Rất tốt Rất tốt Thời gian tách chất Vài phút đến vài giờ Nhiều giờ Vài mươi phút Vài phút Vài phút Hiệu quả tách chất định tính Rất tốt Cần sắc ký vài lần Cần sắc ký vài lần Rất tốt Rất tốt Hiệu quả tách chất định lượng Có thể Cần sắc ký vài lần Cần sắc ký vài lần Rất tốt Rất tốt Khả năng tách lượng lớn mẫu Có thể Rất tốt Rất tốt Có thể, nhưng rất khó Rất tốt Ưu điểm của TLC Chỉ cần một lượng rất ít mẫu để phân tích. Có thể phân tích đồng thời mẫu và chất chuẩn đối chứng, trong cùng điều kiện phân tích. Tất cả các hợp chất trong mẫu phân tích có thể được định vị trên tấm sắc ký lớp mỏng; trong khi so với HPLC: những hợp chất có tính phân cực mạnh sẽ có sắc ký đồ ở dạng một mũi (để chỉ sự hiện diện của một chất) hay chỉ là tạp bẩn. Các bước chuẩn bị trước khi TLC Chấm mẫu lên tấm bản mỏng Chuẩn bị tấm bản mỏng: từ tấm bản mỏng thương mại 20 x 20 cm, dùng kéo cắt các bản với kích thước cần thiết. Lưu ý sao cho tấm bản mỏng phải lọt được vào bình giải ly. Dùng bút chì để vạch nhẹ các nét mức xuất phát và mức kết thúc. Chuẩn bị dung dịch mẫu: Với mẫu là chất lỏng, có thể chấm trực tiếp mẫu lên bản mỏng; trường hợp đây là dung dịch quá sệt, có thể pha loãng mẫu. Với mẫu là chất rắn, phải hòa tan hoàn toàn mẫu trong dung môi hữu cơ phù hợp, với nồng độ 2 – 5%; dung môi hòa tan mẫu không nhất thiết phải là dung môi giải ly. Nhờ một vi quản, đặt dung dịch mẫu lên bề mặt của tấm sắc ký lớp mỏng một cách thận trọng, tránh không làm lũng bề mặt của lớp mỏng. Thao tác: cầm vi quản (hoặc một ống nhỏ có khắc độ bằng thủy tinh để rút dung dịch) nhúng vào dung dịch mẫu, lực mao dẫn sẽ tự hút dung dịch lên vi quản, rồi đặt đầu vi quản chạm nhẹ lên bề mặt của tấm lớp mỏng, dung dịch trong ống sẽ chảy ra và thấm lên tấm lớp mỏng. Phải nhanh chóng nhấc vi quản rời khỏi tấm lớp mỏng, để vết chấm chỉ lan rộng ra thành vết tròn có đường kính từ 2 – 5 mm. TLC (sắc ký lớp mỏng) là phương pháp định tính vì thế mỗi vết chấm trên bản không nên chứa nhiều hơn 12 microgam (10 microgram là tối ưu) mẫu chất. Với một mẫu, có thể chấm nhiều lần, nhưng giữ cho vết chấm đừng lan rộng ra trên bản, vết phải có đường kính từ 2 – 5 mm; muốn thế, sau mỗi lần chấm, dùng miệng thổi hơi nhẹ hoặc dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi mới chấm tiếp theo vài lần nữa cho đến khi đủ lượng cần cho một vết chấm. Sau khi chấm hoàn tất, dùng máy sấy nhẹ để dung môi bay đi khỏi vết chấm, rồi nhúng bản vào dung dịch giải ly; điều này đặc biệt cần thiết nếu dung dịch pha mẫu là nước hoặc loại dung môi có độ bay hơi kém. Nếu cần khảo sát một lượt nhiều mẫu khác nhau, chuẩn bị các dung dịch mẫu này, mỗi dung dịch mẫu chấm lên cùng một bản, vết này cách vết kia 1cm. Hai vết ở ngoài bìa phải các bờ cạnh 1.5 cm (đối với có kích thước 20 x 20cm). Với bản sắc ký lớp mỏng điều chế, dung dịch mẫu sẽ được chấm lên bản thành một đường dài, đều, dọc theo mức xuất phát. Có thể áp dụng khoảng 10 mg cho một bản có kích thước 20 x 20 cm và chiều dầy bản 5mm. Trên mức kết thúc dung môi (cách bờ cạnh trên 0.5 – 1 cm), nên dùng một đầu viết chì vót nhọt vạch một đường hằn xuống lớp hấp thu. Làm như thế, khi dung môi giải ly đi lên đến đầu trên sẽ bị buộc phải ngừng lại, giúp cho mỗi bản sẽ có kết thúc giống như nhau. Khi dung môi lên đến đầu trên của bản, không nên để bản ở lâu trong bình, nên lấy bản ra khỏi bình giải ly, vì sự khuyếch tán và sự bay hơi dung môi có thể làm các vết vừa tách được sẽ bị trải dài ra. Ngoài ra, các nhà xản xuất có bán sẵn các thiết bị tự động để chấm mẫu lên lớp mỏng. Các loại thiết bị này giúp chấm dung dịch mẫu lên lớp mỏng với lượng thể tích xác định chính xác. Giải ly bản mỏng Chuẩn bị bình có kích thước lớn hơn một chút so với kích thước của bản mỏng. Kích thước của bình và lượng thể tích dung môi giải ly sẽ ảnh hưởng lên giá trị Rf của mẫu. Cần sử dụng bình nhỏ nhất nếu có thể vì như thế bầu khí quyển sẽ nhỏ nhất. Cho dung môi hoặc hỗn hợp dung môi vào bình. Với sắc ký lớp mỏng định tính, chỉ cần một thể tích koảng 10 ml dung môi. Quan sát chiều dầy của lớp dung môi trong bình giải ly: không được cao quá 1 cm, bởi vì các vết chấm mẫu trên bản mỏng cách bìa là 1cm. Nếu sắc ký lớp mỏng với các tấm bản lớn, sử dụng bình lớn, phải tính toán thể tích dung môi trong bình không cao hơn khoảng cách của vết chấm trên bản mỏng (vết chấm trên bản mỏng không được ngập vào trong dung môi khi vừa mới thả bản vào bình). Trước khi cho tấm bản mỏng vào bình, bình cần phải được bão hòa dung môi để có một bầu khí quyển đồng nhất, thực hiện bằng cách phủ bề mặt trong của bình bằng một tờ giấy lọc, nghiêng đảo nhẹ bình giải ly để dung môi thấm ướt tờ giấy lọc. Một hậu quả dễ thấy là nếu bình không được bão hòa dung môi, khi dung môi giải ly là hệ hỗn hợp, mức tiền tuyến dung môi sẽ có hình lõm (hình lòng chảo) do dung môi di ở hai bênh cạnh nhanh hơn đi ở giữa bản. Đặt tấm bản mỏng vào bình triển khai, cạnh đáy của bản ngập vào dung dịch giải ly khoảng 0.5 – 1 cm. Hệ dung môi phù hợp là sau khi giải ly, hệ sẽ cho các vết chính có Rf khoảng từ 0.3 đến 0.6. Hiện hình các vết sau giải ly Sau khi giải ly xong, các hợp chất có màu sẽ được nhìn bằng mắt thường, nhưng phần lớn các hợp chất hữu cơ không có màu, nên nếu muốn nhìn thấy các vết, cần sử dụng phương pháp hóa học hoặc vật lý. Phương pháp vật lý Có nhiều phương pháp khác nhau nhưng phương pháp thông dụng nhất là phát hiện bằng tia tử ngoại (UV). Các nhà sản xuất có bán sẵn dụng cụ để khảo sát bản mỏng bằng tia UV. Dụng cụ đơn giản gồm một thùng rỗng, được bao phủ chung quanh bằng vật liệu màu đen để tạo phòng tối; trên nắp thùng có gắn hai bóng đèn UV với hai loại bước sóng là μ = 254 nm và 366 nm. Thùng có cửa mở ở bên hông. Muốn nhìn bản bằng đèn UV: mở cửa, đặt tấm bản mỏng vào bên trong, ở đáy thùng, đóng cửa lại, bật công tắc cho đèn sáng và quan sát tấm bản mỏng từ bên ngoài, từ trên cao nhìn xuống ngang qua một cửa sổ bằng kiếng. Đèn chiếu tia UV 254 nm: ánh sáng này để nhận ra các hợp chất có thể hấp thu tia UV. Các hợp chất sẽ tạo thành vết có màu tối sẫm. Nếu sử dụng bản mỏng thương mại ví dụ silica gel 60 F254, bản mỏng này là silica gel có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang (silicat kẽm có Mn hoạt hóa) hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, như vậy dưới ánh sáng 254 nm, tấm bản sẽ có màu xanh lục chói. Nếu trên tấm bản có một vết của hợp chất mà hợp chất này cũng hấp thu ánh sáng ở bước sóng 254 nm, vết này sẽ che mất huỳnh quang, xuất hiện là một vệt tối trên nền sáng. Đèn chiếu tia UV 366 nm: ánh sáng này dùng để phát hiện những hợp chất phát huỳnh quang. Các vết của chất mẫu có màu sáng trên nền bản mỏng sẫm màu. Một số điểm cần lưu ý: Có thể thay thế dụng cụ nêu trên bằng máy kiểm tra tiền, nhưng khi sử dụng cẩn thận vì máy này không có thùng che chắn._. tia UV giống như dụng cụ nói trên, nhưng biết rằng tia UV có thể gây đột biến gen. Bản mỏng với chất hấp thu có trộn thêm chất chỉ thị phát huỳnh quang có thể gây nên sự thay đổi vị trí của các vết trên bản: vết ở đúng vị trí này nhưng lại nhìn thấy vết ở ví trí khác, điều này gây nên nhưng nhầm lẫn tai hại. Phương pháp hóa học Phương pháp hóa học là phát hiện các vết bằng thuốc thử, bằng cách hòa thuốc thử vào một dung môi thích hợp rồi phun xịt dung dịch thuốc thử này lên bản mỏng. Thuốc thử sẽ kết hợp với các hợp chất để tạo ra các dẫn xuất có màu. Các thuốc thử được xếp thành 2 loại: đặc trưng và không đặc trưng. Thuốc thử không đặc trưng khi nó tạo vết có màu hầu hết với các loại hợp chất hữu cơ, thí dụ như: iod, acid sulfuric, rhodamin B, chất chỉ thị phát huỳnh quang. Thuốc thử đặc trưng khi nó chỉ tác dụng với những hợp chất có chứa những nhóm chức hóa học đặc biệt, tạo vết có màu đặc trưng. Thí dụ: thuốc thử dinitrophenylhydrazin tác dụng với những hợp chất có chứa nhóm carbonyl để tạo màu đỏ đậm. Phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản mỏng Muốn khảo sát các hợp chất trên bản mỏng bằng các thuốc thử đặc trưng, phải thấm bản mỏng với dung dịch thuốc thử, có thể thực hiện theo hai cách. Phun xịt bản mỏng bằng bình phun xịt: Thuốc thử pha theo quy định và cho vào bình, thể tích thuốc thử chỉ được chiếm tối đa hai phần ba thể tích chứa của bình. Sử dụng khí nén hoặc dùng một bóp cao su để tạo sức nén, giúp dung dịch đi ra khỏi bình ở dạng giọt sương mịn. Phải bóp vài cái trước để tạo ra các giọt sương đều, rồi mới hướng đầu ra của bình vào tấm bản mỏng, sao cho hơi sương phủ đều lên bề mặt bản mỏng. Phương pháp có ưu điểm là dung dịch thuốc thử được sử dụng với lượng vừa đủ để tạo phản ứng màu với hợp chất trên bản mỏng, nhược điểm là cần có thao tác khéo léo chuyên nghiệp nếu không dung dịch thuốc thử được phủ lên bản không đều, chỗ nhiều gây loang lỗ, chỗ ít không đủ để làm xuất hiện vết. Nhúng bản mỏng vào một lọ có chứa dung dịch thuốc thử. Ưu điểm của phương pháp này là dung dịch thuốc thử có thể phủ đều lên mặt bản: nhược điểm là các chất mẫu nằm trên bản khi gặp một lượng lớn thuốc thử sẽ hòa tan luôn thuốc thử, có thể biến mất khỏi bản. Sau mỗi lần nhúng bản vào dung dịch, một lượng nhỏ chất hấp thu silica gel sẽ rơi vào dung dịch, sau một thời gian, đáy bình chứa đầy silica gel, do đó phải thay dung dịch mới. Thường sau khi phun xịt dung dịch thuốc thử lên bản vào dung dịch thuốc thử, cần phải xúc tiến phản ứng bằng cách sấy nóng bản mỏng cho đến khi các vết xuất hiện. Lưu giữ vết để làm tài liệu Sau khi giải ly bản, cần ghi lại những thông tin cần thiết. Các chi tiết có thể ghi lên mặt trước của bản bằng bút chì, hoặc ghi lên mặt sau bằng bút benzen. Các chi tiết như: dung môi giải ly, giá trị Rf của mẫu chất, hình dạng, màu sắc của vết, thuốc thử dùng để hiện hình các vết. Tờ bản mỏng cần được lưu giữ bằng cách bảo quản trong một bao plastic. Nhưng nếu để lâu, bản cũng sẽ bị phai màu hoặc hư hỏng. Tốt nhất là đối với các bản quan trọng cần phải lưu tài liệu, có thể làm các cách như sau: Đặt tấm bản mỏng dưới một tờ giấy trong, dùng bút chì tô lại các vết đậm, nhạt, vị trí vết. Photocopy lại tấm bản mỏng. Tốt nhất là chụp hình màu để lưu lại hình ảnh nguyên tấm bản với đầy đủ màu sắc của các vết. Ứng dụng của TLC Để công bố các đặc điểm của một hợp chất Một hợp chất tinh khiết có một vết với sắc ký lớp mỏng, với giá trị Rf không đổi, trong một hệ dung môi giải ly xác định, bởi bản sắc ký của một lô sản xuất nhất định. Muốn đo Rf sử dụng thước để đo khoảng đường di chuyển của hợp chất và của dung môi. Rf là tỉ số giữa đoạn đường di chuyển của hợp chất và đoạn đường di chuyển của dung môi, là con số không có đơn vị, luôn luôn nhỏ hơn một (Rf< 1). Quy ước viết Rf với hai con số lẻ sau dấu phẩy. b a Tiền tuyến dung môi Mức xuất phát Hình 2.12 hình minh họa bản sắc ký Nếu vết mẫu hiện trên bản mỏng là một vết tròn, nhỏ, đo khoảng cách từ mức xuất phát đến tâm của vết đo. Nếu vết mẫu quá to, phải thực hiện sắc ký bản mỏng lại, giảm lượng mẫu chấm, sao cho vết hiện nhỏ, gọn. Giá trị Rf của hợp chất thay đổi tùy theo nhiều yếu tố: Loại bản mỏng silica gel hoặc alumina của hãng Merk hay Prolabo (bản mỏng tráng sẵn dù của cùng một hãn sản xuất cũng khác nhau tùy theo lô sản xuất). Hoạt độ của bản lúc sử dụng khác nhau tùy theo thời gian tồn trữ lâu, mau. Độ dầy của bản. Thành phần của dung môi giải ly, chỉ cần thay đổi một ít cũng làm ảnh hưởng kết quả. Độ bão hòa dung môi trong bình giải ly của hai lần giải ly khác nhau cũng khác nhau. Kỹ thuật giải ly: dung môi đi lên hay đi xuống cũng cho kết quả khác nhau. Lượng mẫu chấm lên bản nhiều hay ít cũng làm vị trí của vết trên bản thay đổi. Để tìm hiểu sơ bộ về tính chất của mẫu chất khảo sát Biết được số các hợp chất có trong hỗn hợp mẫu ban đầu: Chuẩn bị nhiều bản, chấm mẫu chất lên mỗi bản; mỗi bản giải ly với một hệ dung môi giải ly khác nhau, cần phải dò tìm mới có thể chọn ra được một hệ dung môi phù hợp làm rải các hợp chất ra trên cùng một bản mỏng. Nhìn số lượng các vết hiện trên bản để đoán biết mẫu ban đầu có chứa bao nhiêu hợp chất. Lưu ý: do bản mỏng có độ phân giải thấp cho nên nhìn thấy một vết trên bản mỏng không có nghĩa đó là một chất, mà đó có thể là hai hoặc ba chất tụ lại với nhau. Để kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất: phân tích cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) để xác định cấu trúc hóa học của hợp chất, mẫu này phải đạt độ tinh khiết ≥ 95%. Kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất hiệu quả nhất là HPLC, máy sẽ cho biết luôn hàm lượng phần trăm của mẫu chất. Tuy nhiên, thực hiện như thế sẽ khá tốn kém vì HPLC cần có các loại dung môi tinh khiết tiêu chuẩn của HPLC. Có thể tự mình kiểm tra độ tinh khiết của một hợp chất bằng sắc ký lớp mỏng. Chuẩn bị ba bản giống nhau, có vết mẫu. Thực hiện sự giải ly, mỗi bản với một hệ dung môi giải ly khác hẳn nhau. Ba hệ dung môi phải lựa chọn như thế nào để có: một hệ dung môi đẩy các vết di chuyển gần với mức xuất phát; một hệ dung môi đẩy vết di chuyển đến khoảng giữa bản và một hệ dung môi đẩy vết di chuyển xa với mức xuất phát. Nếu cả ba bản lúc nào cũng cho thấy vết tròn, gọn là mẫu tinh khiết, còn chỉ cần một bản có thêm các vết khác, là mẫu có lẫn bẩn, cần tinh chế thêm. Nuôi cấy mô tế bào thực vật sản xuất hợp chất thứ cấp Khái niệm Kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật tiêu biểu cho tiềm năng cải thiện các hợp chất có giá trị trong y dược, gia vị, hương liệu và màu nhuộm mà không thể sản xuất chúng từ các tế bào vi sinh vật hoặc tổng hợp bằng con đường hóa học. Những năm gần đây, sự phát triển của các hợp chất thứ cấp quan trọng trong thương mại là kết quả được mong đợi trong lĩnh vực nghiên cứu này. Ưu thế về mặt nguyên lý của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật là có thể cung cấp liên tục nguồn nguyên liệu để tách chiết một tỉ lệ lượng hoạt chất từ tế bào thực vật nuôi cấy (Mulbagal and Tsay, 2004) Một trong những nhân tố quan trọng ảnh hưởng đến việc sản xuất các hợp chất thứ cấp từ tế bào thực vật là sự phân hóa hình thái. Nhiều hợp chất thứ cấp được sản xuất trong suốt quá trình phân hóa tế bào, vì thế chúng được tìm thấy trong các mô có khả năng phân hóa cao như rễ, lá và hoa. Do sự phân hóa hình thái và sự trưởng thành không xuất hiện trong nuôi cấy tế bào nên các chất thứ cấp có khuynh hướng ngưng tạo thành trong quá trình nuôi cấy. Tuy nhiên, các tế bào không phân hóa trong nuôi cấy huyền phù thường tạo thành một khối vài trăm tế bào, các tế bào ở giữa khối có sự tiếp xúc với môi trường khác với các tế bào ở bên ngoài nên sự phân hóa sẽ xuất hiện tới một mức độ nào đó trong khối tế bào để tạo thành các chất thứ cấp (Lee, 2001). Nuôi cấy huyền phù tế bào thường khởi đầu bằng cách đặt các khối mô sẹo dễ vỡ vụn trong môi trường lỏng chuyển động (lắc hoặc khuấy). Trong quá trình nuôi cấy, các tế bào sẽ dần dần tách ra khỏi mẫu do những chuyển động xoáy của môi trường. Sau một thời gian ngắn trong dịch huyền phù sẽ có các tế bào đơn, các cụm tế bào với kích thước khác nhau, mẫu nuôi cấy còn thừa chưa phát triển và các tế bào chết. Tuy nhiên, cũng có những dịch huyền phù hoàn hảo, chứa tỉ lệ cao các tế bào đơn và tỉ lệ nhỏ các cụm tế bào. Mức độ tách rời của tế bào trong nuôi cấy phụ thuộc vào đặc tính của các khối tế bào xốp và có thể điều chỉnh bằng cách thay đổi thành phần môi trường (Misawa, 1994). Bên cạnh nuôi cấy huyền phù tế bào, nuôi cấy mô sẹo (trên môi trường rắn) có ưu điểm là thao tác thí nghiệm đơn giản, dễ vận chuyển mẫu nhưng nhược điểm là thể tích nuôi cấy ít nên khó phát triển ở quy mô công nghiệp, mẫu nuôi cấy chỉ tiếp xúc được một mặt với nguồn dinh dưỡng, những sản phẩm do mẫu nuôi cấy tạo ra trong quá trình trao đổi chất sẽ tích tụ xung quanh dẫn đến việc sản xuất sinh khối tế bào thực vật vì có thể duy trì và thao tác tương tự với các hệ thống lên men vi sinh vật ngập chìm trong môi trường lỏng. Sự tích lũy các hợp chất thứ cấp trong tế bào thực vật Sự tiến bộ vượt bậc của công nghệ sinh học trong nuôi cấy mô và tế bào thực vật giúp nhân giống các cây trồng có giá trị và tách chiết các hợp chất quý hiếm mang lại nhiều ý nghĩa về mặt thương mại. Phương pháp này sẽ mở rộng và tăng khả năng thu hồi các hóa chất giá trị có nguồn gốc thực vật, một sự thay thế từ quy mô nông nghiệp truyền thống lên quy mô công nghiệp trong sản xuất các hợp chất thứ cấp (Dicosmo và Misawa, 1995). Kỹ thuật nuôi cấy tế bào được khởi xướng từ cuối những năm 60 của thế kỷ 20 như là một công cụ hữu ích để nghiên cứu và sản xuất hợp chất thứ cấp thực vật. Kỹ thuật này được phát triển với mục tiêu cải thiện hiệu suất các sản phẩm có hoạt tính sinh học. Ưu điểm của chúng là có thể cung cấp sản phẩm một cách liên tục và đáng tin cậy dựa trên những lý do sau: Tổng hợp các hợp chất thứ cấp có giá trị diễn ra dưới sự điều khiển các yếu tố môi trường nuôi cấy, độc lập với khí hậu và điều kiện đất trồng. Phủ định ảnh hưởng sinh học đến các sản phẩm là hợp chất thứ cấp trong tự nhiên (vi sinh vật và côn trùng). Có thể chọn lọc các giống cây trồng cho nhiều loại hợp chất thứ cấp khác nhau; Với việc tự động hóa điều khiển sự sinh trưởng củatế bào và điều hòa quá trình chuyển hóa, chi phí có thể giảm và lượng sản phẩm tăng lên. Bên cạnh đó, những kết quả nghiên cứu gần đây cho thấy nuôi cấy tế bào huyền phù của thực vật cũng được sử dụng để sản xuất các sản phẩm protein tái tổ hợp (Fisher và cs, 1999). Hình 2.13: sơ đồ tổng hợp các hợp chất thứ cấp trong thực vật Trong nuôi cấy tế bào, việc chọn lựa cẩn thận các tế bào có khả năng phát triển và điều kiện nuôi cấy tối ưu sẽ giúp tăng khả năng tích lũy một vài sản phẩm ở mức cao hơn. Để thu được hiệu suất cao cho khai thác thương mại, người ta đã sử dụng nhiều phương pháp khác nhau trong nỗ lực tập trung vào việc kích thích hoạt động sinh tổng hợp của các tế bào nuôi cấy (Rao, 2000; Dixon, 1999). Tế bào nuôi cấy tích lũy một lượng lớn hợp chất thứ cấp chỉ khi ở những điều kiện đặc biệt như: Chọn lựa thành phần môi trường và điều kiện nuôi cấy thích hợp. Chọn lựa các dòng tế bào năng suất cao. Bổ sung tiền chất nuôi cấy và các chất kích kháng bảo vệ thực vật (Mulbagal và Tsay, 2004). Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy. Các thông số hóa học và vật lý như thành phần và pH môi trường, chất điều hòa sinh trưởng, nhiệt độ nuôi cấy, sự thông khí, sự lắc hoặc khuấy, và ánh sáng ảnh hưởng đến hàm lượng các hợp chất thứ cấp đã được nghiên cứu nhiều (Goleniowski và Trippi, 1999; Lee và Shuler, 2000; Wang và cs, 1999). Một vài sản phẩm tích lũy trong tế bào ở mức cao hơn so với ở trong cây trồng tự nhiên khi được nuôi cấy ở điều kiện tối ưu. Các thông số vật lý và yếu tố dinh dưỡng trong một mẻ có thể gần như là yếu tố cơ bản cho việc tối ưu hóa hiệu suất nuôi cấy. Chọn lọc các dòng tế bào cho năng suất cao. Các tế bào thực vật trong nuôi cấy là một tập hợp các đặc điểm sinh lý độc lập. Chọn lọc tế bào dựa vào khả năng tổng hợp một vài hợp chất có giá trị cao trong nuôi cấy đã được Berlin và Sasse công bố năm 1985, và sau đó phương thức này đã được ứng dụng rộng rãi. Chẳng hạn, một dòng tế bào của cây bát tiên (Euphorbia milli) sau 24 lần chọn lọc đã tích lũy gấp khoảng 7 lần lượng anthocyanin được sản xuất từ nuôi cấy tế bào bố mẹ (Yamamoto và cs, 1982). Yamada và Sato (1981) đã chọn lọc được một dòng tế bào của Coptis japonica có khả năng sinh trưởng gấp 6 lần trước đây sau 3 tuần nuôi cấy và lượng berberin đạt tới 1,2 g/L. Cung cấp tiền chất (precursor feeding). Bổ sung các tiền chất của quá trình sinh tổng hợp nội bào vào môi trường nuôi cấy cũng có thể tăng lượng sản phẩm mong muốn do một số hợp chất trung gian nhanh chóng bắt đầu sinh tổng hợp các hợp chất thứ cấp và vì thế làm tăng lượng sản phẩm cuối cùng. Phương pháp này hữu ích khi dùng các tiền chất có giá thành rẻ. Tăng cường kích thích hoặc bổ sung tiền chất hoặc các hợp chất tương tự mang lại hiệu quả trong nhiều trường hợp (Silvestrini và cs, 2002; Moreno và cs, 1993). Chẳng hạn, bổ sung phenylalanine khi nuôi cấy tế bào huyền phù cây Salvia officinalis đã kích thích tạo ra rosmarinic acid, cung cấp ferulic acid trong nuôi cấy tế bào cây Vanilla planifolia đã tăng tích lũy valnillin, hoặc bổ sung leucine dẫn đến việc tăng các monoterpen dễ bay hơi trong nuôi cấy Perilla frutiscens (Mulbagal and Tsay 2004). Sự kích kháng bảo vệ thực vật (elicitation). Thực vật sản xuất các hợp chất thứ cấp trong tự nhiên như một bộ máy bảo vệ chống lại các yếu tố gây bệnh. Chất kích kháng bảo vệ thực vật (elicitor) báo hiệu việc hình thành các hợp chất thứ cấp. Sử dụng các elicitor của bộ máy bảo vệ cây, tức sự kích kháng bảo vệ thực vật, là phương thức để thu được các sản phẩm hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học một cách hiệu quả nhất. Sử dụng các elicitor sinh học và phi sinh học (được phân loại dựa trên nguồn gốc của chúng) để kích thích hình thành các hợp chất thứ cấp trong quá trình nuôi cấy tế bào, có thể giúp rút ngắn thời gian và đạt hiệu suất cao (DiCosmo và Tallevi, 1985). Ứng dụng nuôi cấy tế bào thực vật trong sản xuất các hoạt chất sinh học Những năm gần đây, thuốc truyền thống trở thành một đề tài quan trọng mang tính toàn cầu. Mặc dù ở các nước phát triển người ta thường sử dụng tân dược trong điều trị nhưng các loại thuốc có nguồn gốc thảo mộc vẫn được dùng phổ biến do yếu tố lịch sử và văn hóa. Theo các đánh giá về mặt khoa học, nhiều loài thảo mộc có thể ứng dụng trong y học. Vấn đề đặt ra là vùng sinh trưởng của cây thuốc đang biến mất nhanh chóng do sự không ổn định của điều kiện môi trường và các yếu tố khác. Như vậy, thật khó có một nguồn nguyên liệu đủ lớn để tách chiết các hợp chất thứ cấp dùng trong dược phẩm. Điều này cảnh báo cho ngành công nghiệp cũng như các nhà khoa học cần tính đến tiềm năng của kỹ thuật nuôi cấy tế bào thực vật như một sự thay thế khác để cung cấp nguyên liệu cho nguồn dược phẩm này. Ngay từ năm 1971, Wani và các cộng sự đã tìm ra một diterpene amide mới có khả năng chống ung thư gọi là “taxol” chiết từ cây thông đỏ Pacific (Taxus brevifolia). Đến năm 1983, taxol được Cục quản lý Dược phẩm và Thực phẩm Hoa Kỳ (FDA) đồng ý đưa vào thử nghiệm ở giai đoạn I điều trị cho ung thư buồng trứng. Sau đó, FDA đã cho phép sử dụng taxol trong điều trị các trường hợp ung thư buồng trứng và ung thư vú. Ngoài ra, taxol cũng có tác dụng đối với các bệnh nhân có khối u ác tính, ung thư phổi và các dạng u bướu khác (Wickremesinhe và Arteca, 1993 và 1994), và nó được xem như là chất đầu tiên của một nhóm mới trong hóa trị liệu ung thư (Cragg và cs, 1993). Tuy nhiên, sử dụng taxol trong điều trị bị hạn chế do chỉ tách chiết được một lượng rất ít từ vỏ của cây thông đỏ tự nhiên. Lớp vỏ mỏng này chứa khoảng 0,001% taxol tính theo khối lượng khô. Ở cây 100 năm tuổi trung bình chỉ thu được 3 kg vỏ (khoảng 300 mg taxol), lượng này ứng với một liều trong toàn đợt điều trị ung thư. Sở dĩ nguồn taxol khan hiếm như vậy là do các cây tự nhiên sinh trưởng rất chậm (Cragg và cs 1993). Do đó, cần có những nguồn khác để thay thế mới đáp ứng được nhu cầu sử dụng ngày càng tăng trong y học. Nuôi cấy tế bào các loài Taxus được xem như là một phương pháp ưu thế để cung cấp ổn định nguồn taxol và dẫn xuất taxane của nó (Slichenmyer và Von Hoff, 1991). Hiện nay, việc sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào các loài Taxus đã trở thành một trong những ứng dụng rộng rãi của nuôi cấy tế bào thực vật và đang tạo ra các giá trị thương mại to lớn. Fett-Neto và cs (1994) đã nghiên cứu ảnh hưởng của các chất dinh dưỡng và một số yếu tố khác lên sự tích lũy taxol trong nuôi cấy tế bào T. cuspidata. Srinivasan và cs (1995) nghiên cứu quá trình sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào của T. baccata. Lee và cs (1995) đã nghiên cứu sản xuất taxol bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây T. mairei, một loài được tìm thấy tại Đài Loan ở độ cao 2000 m so với mực nước biển. Các dòng tế bào thu được từ mô sẹo có nguồn gốc thân và lá, và một trong những dòng này sau khi được bổ sung các tiền chất vào môi trường nuôi cấy, thì sau 6 tuần cứ một lít dịch huyền phù tế bào sẽ có khoảng 200 mg taxol. Tsay và cộng sự (1994) đã nghiên cứu sản xuất imperatorin từ nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Angelica dahurica var. Formosana. Đây là một loài cây bản địa lâu năm ở Đài Loan, được sử dụng để chữa chứng đau đầu và bệnh vảy nến. Imperatorin được xem là thành phần hoạt động chính trong điều trị các bệnh về da. Nếu sản xuất cây Angelica dahurica var. formosana bằng phương pháp nhân giống truyền thống sẽ mất một thời gian dài mới có thể đáp ứng được nhu cầu. Vì vậy, phương pháp nuôi cấy tế bào huyền phù sản xuất imperatorin đã được chọn lựa sử dụng. Nghiên cứu đã cho thấy trong chu kỳ sinh trưởng của tế bào huyền phù, sản phẩm imperatorin đạt giá trị cực đại trong khoảng giữa 10 và 14 ngày. Benzylamino purine ở nồng độ từ 0,5-1,0 mg/L đã kích thích tổng hợp imperatorin, một tỷ lệ thích hợp ammonium nitrate và nitrate (2:1) cũng như tăng nồng độ phosphate từ 1-2 mM sẽ làm tăng lượng impertatorin. Glucose là nguồn carbon tốt hơn saccharose và fructose về hiệu quả sản xuất imperatorin. Vai trò của elicitor cũng đã được khảo sát, bổ sung thêm vanadyl sulphate trong môi trường sẽ tăng tích lũy imperatorin, quyết định nồng độ và thời gian sinh trưởng của tế bào. Bổ sung vanadyl sulphate ở nồng độ 30 mg/L vào môi trường đã cho hiệu quả tốt nhất sau 10 ngày nuôi cấy. Hoặc bổ sung 20 g/L chất hấp phụ amberlite XAD-7 vào môi trường, quá trình tổng hợp imperatorin cũng tăng mạnh ở ngày nuôi cấy thứ 10. Hàm lượng imperatorin sản xuất bởi phương thức này đạt 460 μg khối lượng tươi cao hơn đối chứng 140 lần. Berberine là một isoquinoline alkaloid có trong hệ rễ của cây Coptis japonica và vỏ của cây Phellondendron amurense. Berberine chloride được sử dụng để chữa bệnh rối loạn tiêu hóa. Để thu được nguyên liệu thô từ rễ cây Coptis phải mất 5-6 năm. Yamada và Sato (1980) đã chọn lọc dòng tế bào có khả năng sản xuất berberine cao của loài (1981) C. japonica. Sau đó, công ty hóa dầu Mitsui (Nhật Bản) đã cải thiện được năng suất bằng cách thêm 10-8 M gibberellic acid vào môi trường, hiệu xuất berberine đã tăng lên rất nhiều tới 1.66 g/l (Misawa 1994). Rễ của cây Panax ginseng, một loại thảo dược lâu năm còn gọi là nhân sâm được sử dụng rộng rãi như một vị thuốc bổ, một dược phẩm quý giá, có tác dụng chữa bệnh rối loạn tiêu hóa, bệnh đái đường, suy nhược cơ thể. Trong rễ của nó chứa nhiều loại saponin và sapogenin khác nhau. Trong đó, ginsenoside-Rb có hoạt tính an thần, còn Rg có hoạt tính kích thích. Từ 1973, Furuya và cs đã nuôi cấy mô mô sẹo P. ginseng để phân lập saponins và sapogenins. Năm 1994, Choi bắt đầu nghiên cứu nuôi cấy P. ginseng trên quy mô công nghiệp. Đến nay, đây là một trong các đối tượng được các nhà khoa học trên thế giới tập trung nghiên cứu nhiều nhất. Merkli và cs (1997) đã nuôi cấy rễ tơ của cây Trigonella foenum-graecum bằng cách gây nhiễm chủng A4 của Agrobacterium rhizogenes. Các rễ tơ này đã sản xuất diosgenin, một spirostanol quan trọng cho sự bán tổng hợp (semi-synthesis) của các hormone steroid. Hàm lượng diosgenin thu được cao nhất là 0,040 % khối lượng khô gần gấp 2 lần so với các rễ không biến nạp chủng A4 8 tháng tuổi (0,024 %). Các tác giả này đã nghiên cứu ảnh hưởng của cholesterol, pH môi trường và chitosan đến khả năng sản xuất diosgenin. Kết quả cho thấy bổ sung 40 mg/L chitosan vào môi trường nuôi cấy sẽ tăng hàm lượng diosgenin lên gấp 3 lần so với đối chứng. Yeh và cs (1994) nghiên cứu sản xuất diosgenin bằng nuôi cấy tế bào huyền phù của cây Dioscorea doryophora. Phương pháp này được sử dụng như một cách thay thế quá trình tổng hợp steroid. Nuôi cấy tế bào huyền phù được thiết lập bằng cách đưa mô sẹo vào môi trường có 0,2 mg/L 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D). Nồng độ saccharose tối thích cho tổng hợp diosgenin là 3%. Lượng diosgenin thu được trong trường hợp này đạt tới 3,2% khối lượng khô. Sản xuất diosgenin từ cây D. doryophora bằng nuôi cấy tế bào huyền phù hiện nay đã được ứng dụng trên quy mô công nghiệp. Gentiana davidii var. formosana là thảo mộc bản địa sống lâu năm ở Đài Loan. Từ xưa nó đã được sử dụng như một loại thuốc thô sơ trong y học cổ truyền Trung Quốc nhằm ngăn chặn béo phì và lão hóa, bảo vệ phổi khỏi các chất độc (Zheng và cs 1997). Secoiridoid glycoside là hợp chất chính với đặc tính y học ở trong rễ của chi Gentiana (Skrzypczak và cs 1993). Chueh và cs (2000) nghiên cứu tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy tế bào huyền phù của G. davidii var. formosa để sản xuất gentipicroside và swertiamarin, hai dược chất quan trọng. Tế bào huyền phù sinh trưởng tối ưu khi nuôi cấy mô sẹo trong môi trường bổ sung 1,2 mg/L kinetin và 3% saccharose, pH 4,2-5,2, tốc độ lắc 80-100 vòng/phút. Sự tích lũy cao nhất 2 hợp chất swertiamarin và gentipicroside trong tế bào được xác định lần lượt sau 12 và 24 ngày nuôi cấy. Miyasaka và cs (1989) đã nghiên cứu sản xuất cryptotanshinone từ nuôi cấy mô sẹo cây Salvia miltiorrhiza. Salvia là một chi quan trọng của họ Lamiaceae và một vài loài của Salvia mọc hoang dại trên khắp thế giới dùng làm thuốc dân gian. Hiệu quả của BA đối với việc hình thành cryptotanshinone trong nuôi cấy mô sẹo S.miltiorrhiza đã được khảo sát. Mô sẹo sơ cấp được tạo ra từ nuôi cấy mảnh lá ở trong tối trên môi trường bổ sung 1,0 mg/L 2,4-D. Mô sẹo sau đó phát triển nhanh hơn trên môi trường có 1,0 mg/L 2,4-D và 0,5 mg/L BA. Kết quả phân tích HPLC cho thấy mô sẹo chứa một lượng nhỏ cryptotanshinone (0,26 mg/g khối lượng khô). Loại bỏ 2,4-D khỏi môi trường nuôi cấy cho kết quả là lượng cryptotanshinone trong mô sẹo tăng lên. Nồng độ cao nhất của cryptotanshione thu được trong mô sẹo nuôi cấy trên môi trường có 0,2 mg/L BA trong 6 ngày là 4,59 mg/g khối lượng khô (Wu và cs, 2003). Bảng 2.2 Các hợp chất thứ cấp đã được sản xuất từ nuôi cấy mô và tế bào thực vật (Mulbagal and Tsay 2004) Loài thực vật Hợp chất thứ cấp Dạng nuôi cấy Tham khảo Agave amaniensis Saponins Mô sẹo Andrijany và cs 1999 Ailanthus altissima Alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1987 Ailanthus altissima Canthinone alkaloids Huyền phù Anderson và cs 1986 Allium sativum Alliin Mô sẹo Malpathak và David 1986 Aloe saponaria Tetrahydroanthracene Huyền phù Yagi và cs 1983 Ambrosia tenuifolia Altamisine Mô sẹo Goleniowski và Trippi 1999 Anchusa officinalis Rosmarinic alkaloids Huyền phù De-Eknamkul và Ellis 1985 Brucea javanica Canthinone alkaloids Huyền phù Liu và cs 1990 Bupleurum falcatum Saikosaponins Mô sẹo Wang và Huang 1982 Camellia sinensis Theamine, dẫn xuất của γ-glutamyl Huyền phù Orihara và Furuya 1990 Canavalia ensiformis L-Canavanine Mô sẹo Ramirez và cs 1992 Capsicum annuum Capsaicin Huyền phù Johnson và cs 1990 Cassia acutifolia Anthraquinones Huyền phù Nazif và cs 2000 Catharanthus roseus Indole alkaloids Huyền phù Moreno và cs 1993 Catharanthus roseus Catharanthine Huyền phù Zhao và cs 2001 Choisya ternata Furoquinoline alkaloids Huyền phù Sejourne và cs 1981 Chrysanthemum cinerariaefolium Pyrethrins Mô sẹo Rajasekaran và cs 1991 Chrysanthemum cinerariaefolium Chrysanthemic acid và pyrethrins Huyền phù Kuel và cs 1985 Cinchona L. Alkaloids Huyền phù Koblitz và cs 1983 Cinchona robusta Robustaquinones Huyền phù Schripsema và cs 1999 Cinchona sp. Anthraquinones Huyền phù Wijnsma và cs 1985 Cinchona succirubra Anthraquinones Huyền phù Barthe và cs 1987 Citrus sp. Naringin, Limonin Mô sẹo Barthe và cs 1987 Coffea arabica Caffeine Mô sẹo Waller và cs 1983 Cornus kousa Polyphenols Huyền phù Ishimaru và cs 1993 Corydalis ophiocarpa Isoquinoline alkaloids Mô sẹo Iwasa và Takao 1982 Croton sublyratus Plaunotol Mô sẹo Morimoto và Murai 1989 Cruciata glabra Anthraquinones Huyền phù Dornenburg và Knorr 1996 Cryptolepis buchanani Cryptosin Mô sẹo Venkateswara và cs 1987 Digitalis purpurea Cardenolides Huyền phù Hagimori và cs 1982 Dioscorea deltoidea Diosgenin Huyền phù Heble và Staba 1980 Dioscorea doryophora Diosgenin Huyền phù Huang và cs 1993 Duboisia leichhardtii Tropane alkaloids Mô sẹo Yamada và Endo 1984 Ephedra spp. L-Ephedrine, D-pseudoephedrin Huyền phù O’Dowd và cs 1993 Eriobotrya japonica Triterpenes Mô sẹo Taniguchi và cs 2002 Eucalyptus tereticornis Sterol và hợp chất phenolic Mô sẹo Venkateswara và cs 1986 Eucommia ulmoides Chlorogenic acid Huyền phù Wang và cs 2003 Fumaria capreolata Isoquinoline alkaloids Huyền phù Tanahashi và Zenk 1985 Gentiana sp. Secoiridoid glycosides Mô sẹo Skrzypczak và cs 1993 Ginkgo biloba Ginkogolide A Huyền phù Carrier và cs 1991 Glehnia littoralis Furanocoumarin Huyền phù Kitamura và cs 1998 Glycyrrhiza echinata Flavonoids Mô sẹo Ayabe và cs 1986 Glycyrrhiza glabra var. glandulifera Triterpenes Mô sẹo Ayabe và cs 1990 Hyoscyamus niger Tropane alkaloids Mô sẹo Yamada và Hashimoto 1982 Isoplexis isabellina Anthraquinones Huyền phù Arrebola và cs 1999 Linum flavum 5-Methoxypodophyllo-toxin Huyền phù Uden và cs 1990 Lithospermum erythrorhizon Dẫn xuất của shikonin Huyền phù Fujita và cs 1990 Lycium chinense Cerebroside Huyền phù Jang và cs 1998 Giới thiệu chung về Kim ngân hoa Vị trí phân loại Giới: Plantae Ngành: Tracheobionta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Dipsacales Họ: Caprifoliacea Chi: Lonicera L Loài: Lonicera japonica Thunb Hình 2.14: hoa Kim ngân Mô tả cây Kim ngân là một loại dây leo, thân có thể vươn dài tới 10m hay hơn. Cành lúc còn non màu lục nhạt, có phủ lông mịn, khi cành già chuyển màu nâu đỏ nhạt, nhẵn. Lá mọc đối, đôi khi mọc vòng ba lá một, hình trứng dài, đầu hơi tù, phía cuống tròn, cuống ngắn 2 – 3 mm, cả hai mặt đều phủ lông mịn. Vào các tháng 5 – 8, hoa mọc từng đôi ở kẽ lá, mỗi kẽ lá có 1 cuống mang 2 hoa, hai bên lá mọc đối mang 4 hoa, lá bắc giống lá nhưng nhỏ hơn. Hoa hình ống xẻ 2 môi, môi lớn lại xẻ thành 3 hay 4 thùy nhỏ, phiến của tràng dài gần bằng ống tràng, lúc đầu màu trắng, sau khi nở một thời gian chuyển màu vàng, cùng một lúc trên cây có hoa mới nở màu vàng như bạc, lại có hoa nở đã lâu màu vàng như vàng cho nên có tên là Kim ngân (kim là vàng, ngân là bạc); cây Kim ngân xanh tốt vào mùa đông cho nên còn có tên là nhẫn đông nghĩa là chịu đựng mùa đông, 4 nhị thòi dài cao hơn tràng; vòi nhụy lại thòi dài cao hơn nhị, mùi thơm dễ chịu. Quả hình trứng dài chừng 5mm. Phân bố, thu hái và chế biến Kim ngân là một cây loại mọc hoang dại tại nhiều tỉnh vùng núi nước ta, nhiều nhất ở Cao Bằng, Lạng Sơn, Ninh Bình, Thanh Hóa, Nghệ An, Hà Tĩnh, Bắc Giang, Thái Nguyên, Quảng Ninh, Vĩnh Phúc, Phú Thọ. Một số nơi người ta bắt đầu trồng lấy hoa và cành lá làm thuốc. Do cây Kim ngân có lá xanh tốt quanh năm, đến tháng 4 -5 lại cho hoa đẹp và thơm cho nên có thể trồng làm cảnh và lấy bóng mát. Kim ngân có thể trồng ở miền núi cũng như ở đồng bằng. Đất đai và khí hậu Hà Nội cũng rất thích hợp. Ta có thể trồng bằng dâm cành: cắt những cành bánh tẻ dài chừng 20–60 cm, khoanh thành khoanh, chôn xuống dưới đất, để chừa đoạn sau cùng; vào thời kỳ đầu cần tưới đều. Có thể trồng quanh năm nhưng tốt nhất vào tháng 9–10 hoặc tháng 2 -3. Sau một năm có thể bắt đầu thu hoạch; thu hoạch lâu năm, càng về những năm sau càng nhiều hoa. Nếu hái hoa cần hái vào lúc hoa sắp nở hay khi hoa mới nở, màu còn trắng chưa chuyển vàng. Có thể hái hoa riêng, cành lá riêng nhưng có thể hái hoa kèm theo một ít cành lá, về nhà mới phân, chia cành lá riêng, hoa riêng. Hoa hay cành lá hái về phơi hay sấy khô là dùng được. Không phải chế biến gì khác. Việc bảo quản hoa lá cành lá Kim ngân tương đối dễ vì ít bị mốc, mọt. Thành phần hóa học Hoa và lá chứa flavonoid, chất chính là luteolin-7-rutinosid (lonicerin=scolymosid). Một số chất carotenoid: ξ-caroten, β-cryptoxanthin, auroxanthin. Acid chlorogenic và các đồng phân của nó. Lá có loganin và secologanin. (2) (1) Hình 2.15: (1) scolymosid, (2) β-cryptoxanthin (3) (5) (4) Hình 2.16: (3) acid chlorogenic, (4) loganin, (5) secologanin Tác dụng dược lý Tác dụng kháng sinh – tác dụng kháng sinh được nhiều nhà nghiên cứu chú ý và chứng minh trong thực nghiệm. Người ta thấy nước hoa Kim ngân có tác dụng ức chế rất mạnh đối với tụ cầu khuẩn vi khuẩn thương hàn, trùng lỵ Shiga. Nước sắc có tác ụng mạnh hơn các dạng bào chế khác. Năm 1950, Lưu Quốc Thanh (Trung Hoa tân y học báo) đã báo cáo dùng nước sắc cô đặc 100% của hoa Kim ngân thấy có tác dụng khánh sinh rất mạnh đối với vi trùng thương hàn, tả, liên cầu khuẩn tiêu máu (vòng vô khuẩn tới 11–20 mm), vi trùng lỵ, trực khuẩn E.coli, tụ cầu khuẩn, phế cầu khuẩn, đối với bạch hầu cũng có tác dụng nhưng kém hơn (2-10mm). Bảng 2.3: nồng độ loãng nhất có tác dụng ức chế đối với sự phát triển của vi khuẩn Vi khuẩn Nồng độ pha loãng Vi khuẩn lỵ Shiga 1/640 Vi khuẩn lỵ Flexner 1/1280 Sonnei 1/320 Thương hàn (Samonella) 1/300 Vi khuẩn phó thương hàn A 1/300 Phó thương hàn B 1/300 Tả (Vibrio cholerae) 1/160 Trực khuẩn E.coli 1/160 Dịch hạch (Yersinia pestis) 1/1280 Tụ cẩu khuẩn vàng (Staphylococcus aureus) 1/40 Liên cầu khuẩn tiêu máu A 1/320 Liên cầu khuẩn tiêu máu B 1/160 Bạch hầu (Corynebacterium diphtheriae) 1/80 Ph._.