Khảo sát một số đặc tính Azospirillum SP. Và ảnh hưởng của chúng trên vài dạng cây trồng ngắn ngày

BOÄ GIAÙO DUÏC VAØ ÑAØO TAÏO TRÖÔØNG ÑAÏI HOÏC SÖ PHAÏM THAØNH PHOÁ HOÀ CHÍ MINH NGUYEÃN THANH ÑAØO KHAÛO SAÙT MOÄT SOÁ ÑAËC TÍNH AZOSPIRILLUM SP. VAØ AÛNH HÖÔÛNG CUÛA CHUÙNG TREÂN VAØI DAÏNG CAÂY TROÀNG NGAÉN NGAØY LUAÄN VAÊN THAÏC SÓ SINH HOÏC TP. HOÀ CHÍ MINH – 2005 LÔØI CAÛM ÔN Toâi xin baøy toû loøng bieát ôn chaân thaønh vaø saâu saéc ñeán : TS. Trònh Thò Hoàng, ngöôøi ñaõ taän tình höôùng daãn, giuùp ñôõ vaø taïo moïi ñieàu kieän toát nhaát cho toâi hoaøn thaønh luaän vaên naøy. Quyù thaày coâ Khoa Sinh noùi chung vaø Boä moân Vi sinh noùi rieâng cuûa Tröôøng Ñaïi hoïc Sö phaïm Tp. Hoà Chí Minh ñaõ cung caáp cho toâi nhöõng kieán thöùc quyù baùu trong suoát khoùa hoïc vaø giuùp ñôõ nhieät tình trong suoát quaù trình toâi thöïc hieän luaän vaên. Quyù thaày coâ vaø caùc baïn trong Boä moân Vi sinh, Sinh lyù Thöïc vaät, Sinh hoùa, Sinh hoïc Phaân töû Tröôøng Ñaïi hoïc Khoa hoïc töï nhieân vaø Vieän Khoa hoïc Kyõ thuaät Noâng nghieäp mieàn Nam ñaõ hoã trôï, ñoäng vieân vaø giuùp ñôõ toâi trong suoát quaù trình thöïc nghieäm. Gia ñình oâng Voõ Vaên Giuùp vaø oâng Nguyeãn Ngoïc Yeân ñaõ hoã trôï vaø giuùp ñôõ toâi thöïc hieän caùc thí nghieäm thöïc tieãn. Sôû Giaùo duïc vaø Ñaøo taïo tænh An Giang, Ban Giaùm hieäu Tröôøng Trung hoïc Phoå thoâng Nguyeãn Khuyeán ñaõ taïo moïi ñieàu kieän thuaän lôïi cho toâi trong suoát khoùa hoïc. Vaø thaät haïnh phuùc bieát bao khi trong cuoäc soáng, trong lao ñoäng vaø hoïc taäp luoân coù söï chaêm soùc, ñoäng vieân, giuùp ñôõ cuûa ngöôøi thaân, baïn beø. Toâi luoân bieát ôn vì nhöõng taám chaân tình ñoù vaø göûi lôøi caûm ôn chaân thaønh ñeán nhöõng ngöôøi thaân yeâu cuûa toâi – gia ñình vaø baïn beø trong suoát thôøi gian qua. Nguyeãn Thanh Ñaøo MUÏC LUÏC Trang Lôøi caûm ôn Muïc luïc Danh muïc caùc kyù hieäu, caùc chöõ vieár taét Danh muïc caùc baûng Danh muïc caùc hình Danh muïc caùc ñoà thò MÔÛ ÑAÀU ....................................................................................................... 1 Chöông 1 – TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU.............................................................. 3 1.1 Vai troø cuûa ñaïm vaø taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ............ 4 1.1.1 Ñaïm trong caây vaø vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng cuûa caây troàng ............................................................................................... 4 1.1.1.1 Tyû leä ñaïm vaø caùc daïng ñaïm trong caây.............................. 4 1.1.1.2 Vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng caây troàng ..................... 4 1.1.2 Taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm .................................. 7 1.1.2.1 Coá ñònh ñaïm hoùa hoïc ......................................................... 7 1.1.2.2 Coá ñònh ñaïm sinh hoïc......................................................... 9 1.2 Vi sinh vaät coá ñònh ñaïm vaø cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc ........................................................................................................... 10 1.2.1 Caùc loaøi vi sinh vaät coá ñònh ñaïm ................................................... 10 1.2.1.1 Vi khuaån coá ñònh nitô soáng töï do....................................... 10 1.2.1.2 Vi khuaån coá ñònh nitô coäng sinh ........................................ 10 1.2.1.3 Vi khuaån coá ñònh nitô soáng treân reã hay trong reã moät soá loaøi coû nhieät ñôùi............................................................ 11 1.2.1.4 Ñaïm do vi sinh vaät coá ñònh ñöôïc ....................................... 11 1.2.2 Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ................................................. 11 1.3 Vi khuaån Azospirillum ............................................................................. 14 1.3.1 Ñaëc tính hình thaùi ........................................................................... 14 1.3.2 Söï phaân boá cuûa Azospirillum trong ñaát.......................................... 17 1.3.3 AÛnh höôûng cuûa Azospirillum ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa thöïc vaät ................................................................................... 18 1.3.3.1 AÛnh höôûng nhieãm khuaån ñeán söï phaùt trieån boä reã ............. 18 1.3.3.2 Söï hình thaønh khuaån laïc Azospirillum ôû reã ....................... 19 1.3.4 Caùc cô cheá hoaït ñoäng cuûa Azospirillum giuùp taêng tröôûng thöïc vaät ................................................................................................... 21 1.3.4.1 Söï coá ñònh nitô khoâng khí cuûa Azospirillum...................... 21 1.3.4.2 AÛnh höôûng cuûa hormon ngoaïi tieát Azospirillum leân sinh tröôûng vaø phaùt trieån ôû thöïc vaät.................................. 22 1.3.4.3 Azospirillum kích thích söï haáp thu caùc chaát dinh döôõng khoaùng cuûa thöïc vaät .......................................................... 23 1.3.4.4 Quan heä giöõa nitratreductase cuûa caây chuû vaø vi khuaån Azospirillum ....................................................................... 24 1.4 Phaân vi sinh vaät ........................................................................................ 24 1.4.1 Ñònh nghóa .................................................................................... 24 1.4.2 Phaân loaïi ...................................................................................... 25 1.4.3 Muïc tieâu cuûa vieäc söû duïng phaân vi sinh vaät ............................... 26 1.4.4 Quy trình chung ñeå saûn xuaát phaân vi sinh vaät töø vi khuaån ........ 26 1.4.5 Phaân vi sinh töø Azospirillum ......................................................... 30 Chöông 2 - VAÄT LIEÄU-NOÄI DUNG-PHÖÔNG PHAÙP ................................. 34 2.1 Vaät lieäu ..................................................................................................... 35 2.1.1 Thieát bò vaø duïng cuï......................................................................... 35 2.1.2 Hoùa chaát vaø moâi tröôøng.................................................................. 35 2.1.3 Vaät lieäu thí nghieäm......................................................................... 39 2.2 Noäi dung vaø phöông phaùp nghieân cöùu ................................................... 40 2.2.1 Phaân laäp .......................................................................................... 40 2.2.2 Tuyeån choïn chuûng Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát .................................................................................... 41 2.2.3 Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng ñöôïc choïn ....................................................................................... 43 2.2.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån .......................... 46 2.2.4.1 Chuaån bò ............................................................................. 46 2.2.4.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån treân caây maï trong oáng nghieäm, caây luùa trong chaäu vaø caây luùa ngoaøi ruoäng.................................................................. 47 2.2.5 Taïo cheá phaåm “phaân vi sinh” ....................................................... 52 2.2.5.1 Chuaån bò ............................................................................. 52 2.2.5.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân caây luùa trong chaäu vaø rau caûi ngaén ngaøy ......................... 54 Chöông 3 – KEÁT QUAÛ-THAÛO LUAÄN ............................................................ 57 3.1 Phaân laäp ................................................................................................... 58 3.2 Tuyeån choïn chuûng Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát ..................................................................................................... 61 3.2.1 Khaû naêng coá ñònh ñaïm cuûa 5 chuûng A1 , A2 , A3 , A4 vaø A5 ......... 61 3.2.2 Khaû naêng sinh IAA cuûa 5 chuûng A1 , A2 , A3 , A4 vaø A5 ............... 62 3.3 Khaûo saùt caùc ñaëc ñieåm hình thaùi, sinh lyù, sinh hoùa cuûa chuûng A2 vaø A3.............................................................................................................. 65 3.3.1 Ñaëc ñieåm hình thaùi ......................................................................... 65 3.3.2 Ñaëc ñieåm sinh lyù, sinh hoùa............................................................ 66 3.4 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån..................................... 69 3.4.1 Thôøi gian thích hôïp nhieãm dòch nuoâi caáy vi khuaån ñaït hieäu quaû ................................................................................................. 69 3.4.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa dòch nuoâi caáy vi khuaån treân caây maï trong oáng nghieäm, caây luùa trong chaäu vaø caây luùa ngoaøi ruoäng.... 71 3.4.2.1. Caây maï trong oáng nghieäm ............................................... 71 3.4.2.2. Caây luùa trong chaäu .......................................................... 76 3.4.2.3. Caây luùa ngoaøi ruoäng ......................................................... 78 3.5 Taïo cheá phaåm “phaân vi sinh”.................................................................. 88 3.5.1 Chuaån bò ........................................................................................ 88 3.5.1.1. Dòch nuoâi caáy vi khuaån .................................................88 3.5.1.2. Cheá phaåm “phaân vi sinh” .................................................. 95 3.5.2 Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân caây luùa trong chaäu vaø rau caûi ngaén ngaøy ............................................. 97 3.5.2.1 Luùa trong chaäu.................................................................... 97 3.5.2.2 Caûi thìa................................................................................ 99 KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ......................................................................... 106 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO DANH MUÏC CAÙC BAÛNG Trang Baûng 3.1. Ñaëc ñieåm khuaån laïc cuûa 5 chuûng treân moâi tröôøng NFb raén coù boå sung congo ñoû sau 5 ngaøy nuoâi caáy ............................................. 60 Baûng 3.2. Haøm löôïng ñaïm cuûa 5 chuûng trong moâi tröôøng Dobereiner dòch theå 61 Baûng 3.3. Haøm löôïng IAA trong dòch nuoâi caáy (μg/ ml) theo thôøi gian ........... 64 Baûng 3.4. Chieàu cao trung bình caây luùa (mm) sau 7 ngaøy theo thôøi gian ngaâm haït................................................................................................ 70 Baûng 3.5. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây maï sau 7 ngaøy caáy trong oáng nghieäm cuûa chuûng A2 ...................................................................................................73 Baûng 3.6. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây maï sau 7 ngaøy caáy trong oáng nghieäm cuûa chuûng A3 ...................................................................................................74 Baûng 3.7. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây luùa trong chaäu .......................... 77 Baûng 3.8. Chieàu cao trung bình caây luùa ngoaøi ruoäng (cm) cuûa chuûng A2 .......... 80 Baûng 3.9. Chieàu cao trung bình caây luùa ngoaøi ruoäng (cm) cuûa chuûng A3.81 Baûng 3.10. Soá nhaùnh trung bình cuûa caây luùa ngoaøi ruoäng (nhaùnh/caây) vaøo thôøi ñieåm 45 ngaøy cuûa chuûng A2 vaø A3 ...........................................83 Baûng 3.11. AÛnh höôûng A2 treân chæ tieâu caây luùa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ........ 85 Baûng 3.12. AÛnh höôûng A3 treân chæ tieâu caây luùa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ........ 86 Baûng 3.13. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A2 theo thôøi gian ................. 88 Baûng 3.14. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A3 theo thôøi gian ................. 89 Baûng 3.15. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm .............................................................................. 91 Baûng 3.16. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm 93 Baûng 3.17. Maät ñoä teá baøo A2 vaø A3 trong 1 gram cheá phaåm theo thôøi gian vôùi söï thay ñoåi ñoä aåm 95 Baûng 3.18. AÛnh höôûng cuûa NH3 leân söï gia taêng soá löôïng teá baøo ....................... 96 Baûng 3.19. Söï bieán ñoåi maät ñoä teá baøo A2 vaø A3 theo thôøi gian 96 Baûng 3.20. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây luùa trong chaäu .........................98 Baûng 3.21. Soá laù trung bình cuûa caây caûi thìa (laù/caây) ....................................... 100 Baûng 3.22. Chieàu cao trung bình cuûa caây caûi thìa (cm/caây) 102 Baûng 3.23. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây caûi thìa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch ................................................................................................104 DANH MUÏC CAÙC HÌNH Trang Hình 3.1. Phaân laäp Azospirillum töø ñaát vuøng reã luùa ........................................... 58 Hình 3.2. Hình daïng khuaån laïc cuûa caùc chuûng sau 5 ngaøy nuoâi caáy treân moâi tröôøng NFb raén coù boå sung congo ñoû ........................................... 59 Hình 3.3. Ñònh tính IAA cuûa caùc chuûng thoâng qua thuoác thöû Salkowski ......... 62 Hình 3.4. Phaûn öùng maøu IAA vôùi thuoác thöû Salkowski cuûa caùc chuûng nuoâi caáy 5 ngaøy ................................................................................... 65 Hình 3.5. Khaû naêng söû duïng nguoàn carbon treân moâi tröôøng dòch theå - NFb cuûa chuûng A2 vaø A3 ...................................................................... 67 Hình 3.6. Khaû naêng söû duïng nguoàn carbon treân moâi tröôøng dòch theå Andrade cuûa chuûng A2 vaø A3 ............................................................... 68 Hình 3.7. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån (caây maï 7 ngaøy tuoåi treân moâi tröôøng MS) ........................................................................................... 72 Hình 3.8. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo chæ thò maøu bromothymol blue ...................................................... 92 Hình 3.9. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo chæ thò maøu bromothymol blue 94 DANH MUÏC CAÙC ÑOÀ THÒ Trang Ñoà thò 3.1. Ñöôøng töông quan tuyeán tính giöõa haøm löôïng IAA chuaån vaø OD530nm ............................................................................................... 63 Ñoà thò 3.2. Haøm löôïng IAA trong dòch nuoâi caáy (μg/ml) theo thôøi gian ........... 64 Ñoà thò 3.3. Hieäu quaû cuûa thôøi gian ngaâm haït maàm thoâng qua chieàu cao caây (mm) sau 7 ngaøy troàng luùa trong oáng nghieäm............................. 71 Ñoà thò 3.4. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån treân chieàu cao caây luùa ngoaøi ruoäng (cm/caây) cuûa chuûng A2 vaø A3..………………………………..79 Ñoà thò 3.5. AÛnh höôûng cuûa söï nhieãm khuaån ñeán khaû naêng phaân nhaùnh cuûa caây luùa ngoaøi ruoäng (nhaùnh/caây) vaøo thôøi ñieåm 45 ngaøy cuûa chuûng A2 vaø A3……….. .......................................................................... 82 Ñoà thò 3.6. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A2 theo thôøi gian ................. 89 Ñoà thò 3.7. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A3 theo thôøi gian ................. 90 Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm .............................................................................. 91 Ñoà thò 3.9. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm .. ............ ………………………………………………93 Ñoà thò 3.10. AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” ñeán soá löôïng laù caûi thìa .................................................................................................... 101 Ñoà thò 3.11. AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân chieàu cao caây caûi thìa (cm/caây) ............................................................................... 103 DANH MUÏC CAÙC KYÙ HIEÄU, CAÙC CHÖÕ VIEÁT TAÉT A2 : Chuûng Azospirillum 2 A3 : Chuûng Azospirillum 3 CFU (colony forming unit) : Maät ñoä teá baøo CP : Cheá phaåm CV% (Coefficient of Variation) : heä soá ño löôøng chính xaùc cuûa thí nghieäm ÑC : Ñoái chöùng IAA : Indole-3-acetic acid LSD (Least significant difference test) traéc nghieäm phaân haïng caùc loâ thí nghieäm MT1 : Moâi tröôøng voâ ñaïm NFb MT2 : Moâi tröôøng voâ ñaïm NFb raén coù boå sung congo ñoû MT3 : Moâi tröôøng Dobereiner vaø coäng söï MT4 : Moâi tröôøng Andrade MT5 : Moâi tröôøng nuoâi caáy thöû khaû naêng khöû nitrate MT6 : Moâi tröôøng MS MS : Murashige & Skoog N : Ñaïm NFb : nitrogen-fixing broth OD (Optical Density) : Maät ñoä quang PL : Phaân loaïi a, b, c, … trong xöû lyù thoáng keâ TN : Thí nghieäm 1 MÔÛ ÑAÀU Ñoàng Baèng Soâng Cöûu Long laø nôi cung caáp gaïo lôùn nhaát nöôùc, goùp phaàn xuaát khaåu gaïo ra theá giôùi. Theá nhöng haøng naêm luõ luït keùo veà ñaõ gaây thieät haïi veà ngöôøi cuõng nhö muøa maøng. Nhaèm chaêm lo ñôøi soáng cho ngöôøi daân vuøng luõ ñoàng thôøi vaãn ñaùp öùng ñuû gaïo cho nhu caàu tieâu duøng vaø xuaát khaåu, chính quyeàn khu vöïc chæ ñaïo bao ñeâ moät soá vuøng ngaäp luõ. An Giang cuõng khoâng thuoäc ngoaïi leä. Töø ñoù, ñaát khoâng coøn ñoä maøu môõ do phuø sa mang laïi. Chính vì vaäy, ñeå ñaùp öùng nhu caàu dinh döôõng cho caây troàng, ñaát phaûi thöôøng xuyeân ñöôïc boùn phaân. Vieäc söû duïng phaân boùn hoùa hoïc lieân tuïc laøm cho ñaát bò baïc maøu vaø chua, vai troø cuûa vi sinh vaät ñaát giaûm, chaát löôïng noâng saûn keùm thaäm chí gaây oâ nhieãm moâi tröôøng. Trong khi ñoù, phaân vi sinh vaät laø loaïi saûn phaåm chöùa moät hoaëc nhieàu chuûng vi sinh vaät soáng, coù ích ñaõ ñöôïc tuyeån choïn maø hoaït ñoäng cuûa chuùng taïo neân trong ñaát troàng caùc chaát dinh döôõng hay caùc chaát coù hoaït tính kích thích sinh tröôûng, taïo ñieàu kieän naâng cao naêng suaát hoaëc chaát löôïng noâng saûn, taêng ñoä maøu môõ cho ñaát. Caùc chuûng vi sinh vaät naøy khoâng aûnh höôûng xaáu ñeán ngöôøi, vaät nuoâi, moâi tröôøng sinh thaùi vaø chaát löôïng noâng saûn. Hieän nay ngöôøi ta ñaõ nghieân cöùu saûn xuaát phaân vi sinh vaät bao goàm phaân boùn vi sinh vaät coá ñònh ñaïm, phaân boùn vi sinh phaân giaûi caùc hôïp chaát phospho khoù tan, phaân boùn vi sinh vaät phaân giaûi cellulose, phaân boùn vi sinh vaät quang hôïp. Caùc loaïi phaân ñaïm vi sinh hieän nay ñeàu ñöôïc saûn xuaát töø caùc loaïi vi khuaån coá ñònh ñaïm nhö Azotobacter vaø Azospirillum. Caùc vi khuaån naøy phaân boá nhieàu trong ñaát vaø quanh vuøng reã. Ngoaøi khaû naêng coá ñònh ñaïm chuùng coù theå tieát ra moät soá hoaït chaát coù taùc duïng kích thích sinh tröôûng ôû thöïc vaät ñöa vaøo moâi tröôøng ñaát. Ñaùng chuù yù laø khaû naêng coá ñònh ñaïm cuûa Azospirillum ñöôïc Beijerinck phaùt hieän 2 töø naêm 1922, nhöng vai troø cuûa noù trong hoaït ñoäng coá ñònh ñaïm vuøng reã caây hoøa thaûo chæ ñöôïc bieát ñeán vaøo nhöõng naêm ñaàu cuûa thaäp nieân 70 nhôø vieäc tìm ra nôi cö truù cuûa chuùng. Khi ñaùnh giaù nhöõng döõ lieäu thu thaäp khaép theá giôùi hôn 30 naêm qua ôû ñoàng ruoäng thöû nghieäm nhieãm Azospirillum treân caùc ñoái töôïng caây troàng khaùc nhau, ngöôøi ta keát luaän raèng caùc vi khuaån naøy coù khaû naêng laøm taêng naêng suaát treân nhöõng loaïi ñaát troàng khaùc nhau vaø ôû nhöõng vuøng khí haäu khaùc nhau. ÔÛ Vieät Nam, trong thôøi gian qua, ngöôøi ta ñaõ ñeà caäp tôùi söï toàn taïi, phaân laäp, xaùc ñònh ñaëc ñieåm cuûa Azospirillum trong ñaát vaø reã luùa khu vöïc ngoaïi thaønh Haø Noäi vaø nghieân cöùu khaû naêng coá ñònh nitô cuûa moät soá chuûng Azospirillum sp. trong ñieàu kieän hoäi sinh vôùi maàm luùa [8]. Ñöôïc söï ñoäng vieân vaø giuùp ñôõ nhieät tình cuûa TS. Trònh Thò Hoàng, toâi ñaõ coù cô hoäi thöïc hieän ñeà taøi naøy vôùi loøng mong moûi ñoùng goùp phaàn naøo cho coâng cuoäc xaây döïng queâ höông An Giang giaøu ñeïp. Noäi dung cuûa ñeà taøi bao goàm : - Phaân laäp vaø tuyeån choïn Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát. - Tìm hieåu moät soá ñaëc tính sinh lyù, sinh hoùa. - Böôùc ñaàu taïo cheá phaåm “phaân vi sinh” baèng caùch coá ñònh treân chaát mang laø than buøn. - Sô boä öùng duïng cheá phaåâm “phaân vi sinh” treân caây troàng ngaén ngaøy (luùa nöôùc vaø caûi thìa) trong phoøng thí nghieäm vaø ngoaøi thöïc tieãn vôùi quy moâ nhoû. 3 CHÖÔNG 1 TOÅNG QUAN TAØI LIEÄU 4 1.1. Vai troø cuûa ñaïm vaø taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm 1.1.1. Ñaïm trong caây vaø vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng cuûa caây troàng 1.1.1.1. Tyû leä ñaïm vaø caùc daïng ñaïm trong caây Tyû leä ñaïm trong caây bieåu hieän töø 1 - 6% troïng löôïng chaát khoâ. Tyû leä ñaïm trong boä phaän non cao hôn boä phaän giaø. Trong thôøi kyø hình thaønh quaû, ñaïm taäp trung chuû yeáu ôû caùc cô quan sinh saûn. Trong caây, ñaïm chuû yeáu coù trong thaønh phaàn protein vaø chieám 15 - 17%. Trong ñieàu kieän bình thöôøng, ngöôøi ta tính ñöôïc haøm löôïng protein thoâ trong caây thoâng qua ñònh löôïng nitô toång soá. Ñaïm trong caây coøn toàn taïi döôùi daïng hôïp chaát ñaïm höõu cô hoøa tan (caùc amin vaø amid). Moät löôïng raát nhoû ñaïm vaø trong ñieàu kieän dinh döôõng ñaïm khoâng bình thöôøng, ñaïm toàn taïi trong caây döôùi daïng NH4+ vaø NO3-. Tyû leä giöõa ñaïm höõu cô hoøa tan vaø ñaïm voâ cô theå hieän tình traïng toång hôïp höõu cô trong caây. Thöôøng khi thieáu glucid hoaëc thieáu caùc ñieàu kieän caàn thieát cho vieäc khöû nitrate, cho quaù trình amin hoùa thì tyû leä treân giaûm xuoáng. Ñaïm voâ cô trong caây toàn taïi chuû yeáu döôùi daïng NO3- vì söï tích tröõ löôïng NH4+ nhieàu laøm cho caây deã bò ngoä ñoäc. 1.1.1.2. Vai troø cuûa ñaïm ñoái vôùi ñôøi soáng caây troàng Ñaïm laø yeáu toá quan troïng haøng ñaàu ñoái vôùi cô theå soáng vì noù laø thaønh phaàn cô baûn cuûa protein - chaát cô baûn bieåu hieän söï soáng. Ñaïm naèm trong nhieàu hôïp chaát cô baûn caàn thieát cho söï phaùt trieån cuûa caây nhö dieäp luïc vaø caùc enzyme, caùc base A,T,G,X - thaønh phaàn cô baûn cuûa caùc nucleic acid, trong caùc DNA vaø RNA cuûa teá baøo - nôi cö truù cuûa caùc thoâng tin di truyeàn, ñoùng vai troø quan troïng trong vieäc toång hôïp protein. Do vaäy ñaïm laø yeáu toá cô baûn cuûa quaù trình ñoàng hoùa carbon, kích thích söï phaùt trieån cuûa boä reã vaø kích thích vieäc huùt caùc yeáu toá dinh döôõng khaùc. 5 Caây troàng ñöôïc boùn ñuû ñaïm bieåu hieän ôû laù coù maøu xanh thaãm, sinh tröôûng khoûe maïnh, choài buùp phaùt trieån nhanh, naêng suaát cao. Boùn thöøa ñaïm, laù coù maøu xanh toái, thaân meàm, tyû leä nöôùc cao neân deã bò saâu beänh. Tình hình loáp ñoå cuûa caùc gioáng luùa thaân daøi cuõng laø haäu quaû cuûa vieäc boùn thöøa ñaïm. Ngoaøi ra, boùn thöøa ñaïm sinh tröôûng cuûa caây bò keùo daøi, chín muoän, chaát löôïng noâng saûn keùm, nitrate bò keùo xuoáng laøm oâ nhieãm maïch nöôùc ngaàm. Caây thieáu ñaïm, laù coù maøu vaøng, sinh tröôûng vaø phaùt trieån keùm, coøi coïc coù khi bò thui choät thaäm chí ruùt ngaén chu kyø soáng, naêng suaát thaáp. y Taùc duïng cuûa ñaïm ñoái vôùi caây luùa [10] Ñaïm laø yeáu toá dinh döôõng chuû yeáu, noù coù aûnh höôûng nhieàu ñeán thu hoaïch vì chæ khi ñuû ñaïm caùc chaát khaùc môùi phaùt huy taùc duïng. Ñaïm keát hôïp vôùi caùc chaát ñöôøng, boät ôû laù taïo ra amino acid roài töø ñoù hình thaønh neân caùc loaïi protein caàn thieát cho ñôøi soáng caây luùa. Ñaïm laø moät thaønh phaàn caáu taïo cuûa chaát dieäp luïc thuùc ñaåy quaù trình quang hôïp. Neáu thieáu ñaïm, trong caây seõ coù nhieàu ñaïm töï do, caây luùa seõ coù söùc soáng yeáu deã bò saâu beänh phaù haïi. Caây luùa huùt ñaïm ôû hai daïng : amoân (NH4+) vaø nitrate (NO3-). Trong ruoäng ngaäp nöôùc luùa huùt amoân nhieàu hôn, coøn trong ruoäng caïn nöôùc luùa huùt nitrate nhieàu hôn. Ñaïm amoân huùt vaøo reã coù theå keát hôïp ngay vôùi caùc loaïi acid höõu cô ôû ñoù taïo thaønh caùc daïng amino acid vaø seõ ñöôïc chuyeån leân laù ñeå toång hôïp protein. Caùc gioáng luùa Indica thaân cao huùt ñaïm ít hôn so vôùi gioáng luùa Japonica thaân thaáp. Yeâu caàu veà ñaïm cuûa caây luùa thay ñoåi trong quaù trình sinh tröôûng cuûa noù. Luùa caàn ñaïm nhieàu trong thôøi kyø ñeû nhaùnh, nhaát laø khi ñeû roä vaø giaûm daàn khi luùa ñöùng caùi thoâi ñeû nhaùnh. Luùa cuõng caàn nhieàu ñaïm trong thôøi kyø phaân hoùa ñoøng vaø phaùt trieån ñoøng thaønh boâng, thôøi kyø hình thaønh caùc boä phaän sinh saûn. Caùc gioáng 6 luùa thaân cao thöôøng coù hai ñænh cao veà nhu caàu ñaïm ñoù laø luùc ñeû nhaùnh vaø luùc saép troå boâng. Coøn caùc gioáng luùa thaân thaáp thì thöôøng coù nhu caàu veà ñaïm taêng ñeàu suoát thôøi kyø ñeû nhaùnh ñeán luùc troå boâng, chæ sau khi troå nhu caàu veà ñaïm môùi giaûm xuoáng. Vì vaäy trong kyõ thuaät boùn phaân caàn cung caáp ñuû ñaïm cho luùa ñeû nhaùnh vaø laøm ñoøng, nhöng neáu thöøa ñaïm cuõng khoâng toát vì luùa thöøa ñaïm deã bò loáp ñoå, giaûm söùc choáng chòu vôùi saâu beänh vaø caùc ñieàu kieän khoâng thuaän lôïi khaùc. Keát hôïp boùn phaân höõu cô vôùi phaân ñaïm seõ deã thoûa maõn caùc yeâu caàu veà ñaïm. Boùn phaân ñaïm vieân moät laàn sau khi caáy cuõng seõ cung caáp, ñieàu hoøa ñaïm cho caây trong suoát thôøi gian sinh tröôûng maø khoâng daãn ñeán hieän töôïng thöøa ñaïm taïm thôøi roài laïi thieáu ñaïm nhö hieän töôïng boùn vaõi nhieàu laàn. y Taùc duïng cuûa ñaïm ñoái vôùi rau [25] Caây troàng haáp thu moät löôïng lôùn ñaïm töø ñaát thoâng qua heä thoáng reã. Ñoái vôùi döôõng chaát NH4+, khi caây troàng haáp thu vöôït troäi NO3-, daãn ñeán söï phoùng thích H+ töø reã vaø seõ taïo acid hoùa moâi tröôøng beân ngoaøi. Ngöôïc laïi, ñoái vôùi döôõng chaát NO3-, khi caây troàng huùt NH4+ troäi hôn seõ laøm cho moâi tröôøng kieàm hôn. Nhieàu nghieân cöùu cho thaáy caây troàng haáp thu NH4+ nhanh hôn NO3- trong giai ñoaïn sinh tröôûng sinh döôõng, trong khi caây haáp thu NO3- nhieàu hôn NH4+ khi caây ôû giai ñoaïn sinh tröôûng sinh thöïc. Khi NH3 töï do tích luõy trong caây vôùi löôïng lôùn seõ gaây ngoä ñoäc cho caây neân khi ñöôïc huùt vaøo thöôøng bò ñoàng hoùa ngay baèng nhieàu caùch. Tröôùc heát NH3 ñöôïc ñoàng hoùa baèng con ñöôøng amin hoùa tröïc tieáp caùc cetoacid ñeå taïo thaønh caùc amino acid nhö : amin hoùa α-cetoglutaric ñeå taïo thaønh glutamic acid, amin hoùa oxaloacetic acid ñeå taïo thaønh aspatic acid, amoniac cuõng coù theå keát hôïp ngay vôùi pyruvic acid ñeå taïo thaønh alanin … Caùc loaïi amino acid tham gia vaøo caùc quaù trình ñoàng hoùa sô caáp amoniac nhö α-cetoglutaric acid, 7 Mo Cu,Fe,Mn Cu,Fe,Mn Mg,Mn pyruvic acid, fumaric acid … ñeàu laø nhöõng acid ñöôïc taïo thaønh trong quaù trình chuyeån hoùa glucid. Khaùc vôùi amoân, nitrate khoâng gaây ngoä ñoäc cho caây neân coù theå tích tuï moät löôïng khaù lôùn trong caây, chính söï tích tuï nitrate naøy neân khi söû duïng rau laøm thöùc aên seõ aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán söùc khoûe con ngöôøi. Dinh döôõng nitrate cuõng laøm taêng haøm löôïng protein vaø caùc amid. Vì vaäy ngöôøi ta cho raèng nitrate vaøo trong caây chòu söï chuyeån hoùa raát maïnh. Quaù trình chuyeån hoùa nitrate ôû trong caây tröôùc heát daãn ñeán söï taïo thaønh NH3. Thöïc chaát quaù trình chuyeån hoùa naøy laø moät quaù trình khöû : HNO3 HNO2 (HNO)2 HN2OH NH3 Nitrate coù theå bò khöû hoaøn toaøn ôû reã thaønh daïng amoân, laø daïng ñaïm tham gia tröïc tieáp trong quaù trình taïo amino acid. Neáu boùn nhieàu ñaïm maø thieáu laân hay khoâng boùn laân, kali caân ñoái, ñaëc bieät laø thieáu nguyeân toá vi löôïng Mo thì quaù trình khöû nitrate seõ bò chaäm laïi vaø daãn ñeán tình traïng toàn dö nitrate trong caây. Löôïng nitrate toàn dö trong caây coøn do boùn cho caây caän ngaøy thu hoaïch laøm haøm löôïng nitrate khoâng ñuû thôøi gian ñeå khöû thaønh amoân, taïo thaønh amino acid vaø protid coù ích cho caây. 1.1.2. Taàm quan troïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm 1.1.2.1. Coá ñònh ñaïm hoùa hoïc Trong khoâng khí, phaân töû nitô thöôøng toàn taïi ôû traïng thaùi lieân keát hai nguyeân töû nitô laïi vôùi nhau nhôø noái ba beàn vöõng (N≡N). Naêng löôïng caàn cho söï phaù vôõ lieân keát naøy khoaûng 225kcal neân caây troàng (cuõng nhö caùc loaøi ñoäng vaät) khoâng coù khaû naêng ñoàng hoùa nguoàn nitô naøy. Vì vaäy vieäc nghieân cöùu phaù vôõ caùc lieân keát naøy ñeå taïo ra daïng nitô deã haáp thu ñoái vôùi caây xanh laø heát söùc caàn thieát [3]. 8 Naêm 1905 laàn ñaàu tieân con ngöôøi tìm ñöôïc phöông phaùp phaù vôõ vaø lieân keát vôùi CaC2 ñeå taïo ra moät daïng phaân ñaïm hoùa hoïc ñaàu tieân laø CaCN2. Muoán thöïc hieän phaûn öùng ngöôøi ta duy trì moät nhieät ñoä cao töø 1000 – 1100oC : Ít laâu sau caùc nhaø khoa hoïc Nauy laïi tìm ñöôïc caùch lieân keát N2 vôùi O2 ñeå taïo thaønh moät daïng phaân ñaïm hoùa hoïc khaùc (nitrate) phaûn öùng naøy cuõng ñoøi hoûi nhieät ñoä cao ñeán 4000oC : Naêm 1908 nhaø khoa hoïc Ñöùc Ga-be ñaõ tìm ñöôïc phöông phaùp lieân keát N2 vôùi H2 ñeå taïo thaønh NH3. Phaûn öùng naøy khoâng nhöõng ñoøi hoûi nhieät ñoä cao (600oC), aùp suaát cao (1000atm) maø coøn ñoøi hoûi coù maët moät soá chaát xuùc taùc ñaét tieàn (Os, Ru). Töø ñoù ñeán nay ngaønh coâng nghieäp hoùa hoïc ñaõ coù nhöõng tieán boä raát lôùn. Ngöôøi ta saûn xuaát roäng raõi nhieàu loaïi phaân ñaïm hoùa hoïc khaùc nhau vôùi saûn löôïng ngaøy caøng taêng. Neáu nhö naêm 1913 toaøn theá giôùi saûn xuaát ñöôïc 0,51 trieäu taán phaân ñaïm thì ñeán naêm 1964 con soá naøy ñaõ taêng leân 29 laàn (14,5 trieäu taán) trong khi ñoù phaân kali chæ taêng 8,4 laàn, phaân phospho taêng coù 5,8 laàn [3]. Duø sao thì phaân ñaïm hoùa hoïc treân toaøn theá giôùi cuõng buø ñaép ñöôïc moät phaàn nhoû soá löôïng ñaïm trong ñaát bò laáy ñi haøng naêm. Coù moät thoáng keâ cho bieát haøng naêm caùc saûn phaåm noâng nghieäp treân theá giôùi laáy ñi khoûi ñaát khoaûng 100 - 110 trieäu taán ñaïm, con soá naøy vöôït ñeán baûy laàn so vôùi phaân ñaïm hoùa ho._.ïc saûn xuaát ra ôû caùc nöôùc goäp laïi haøng naêm. Phaân ñaïm coù taùc duïng raát lôùn ñeán muøa maøng, ví duï : boùn 1kg ñaïm thu hoaïch theâm ñöôïc khoaûng 10 -20kg thoùc, 15 - 20kg ngoâ hoaëc 15 - 40kg coû khoâ (G.Colarva P.Greenland, 1963). 1000oC CaC2 + N2 CaCN2 + C H2O N2 + O2 4000oC 2NO O2 NO2 O2 HNO3 9 Khoù khaên chuû yeáu laøm caûn trôû vieäc môû roäng nhanh choùng hôn nöõa vieäc saûn xuaát phaân ñaïm hoùa hoïc laø vì ñieàu kieän ñeå phaù vôõ caùc lieân keát trong phaân töû nitô khoâng phaûi laø ñôn giaûn (caàn nhieät ñoä cao, aùp suaát cao, chaát xuùc taùc ñaét tieàn). 1.1.2.2. Coá ñònh ñaïm sinh hoïc Töông töï nhö quaù trình coá ñònh ñaïm hoùa hoïc, quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc cuõng laø quaù trình phaù vôõ caùc lieân keát trong phaân töû nitô khoâng khí ñeå taïo thaønh caùc daïng nitô deã haáp thu cho caây troàng. Nhöng ôû quaù trình naøy vieäc phaù vôõ caùc lieân keát cuûa phaân töû nitô xaûy ra ôû ñieàu kieän nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng. Chính vì vaäy maø vai troø cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc coù yù nghóa heát söùc lôùn lao ñoái vôùi noâng nghieäp, nhaát laø ñoái vôùi caùc nöôùc coù neàn coâng nghieäp phaân ñaïm chöa phaùt trieån. Quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc laø moät giai ñoaïn cuûa chu trình tuaàn hoaøn nitô trong töï nhieân, ñöôïc thöïc hieän bôûi caùc nhoùm vi sinh vaät nhö laø: vi khuaån, taûo lam, xaï khuaån. Caùc loaïi vi sinh vaät naøy coù theå soáng ñoäc laäp nhö nhöõng vi sinh vaät soáng töï do hoaëc coù theå quan heä ôû nhöõng möùc ñoä khaùc nhau vôùi vi khuaån, thöïc vaät vaø ñoäng vaät khaùc. Moái quan heä naøy thay ñoåi töø quan heä hoäi sinh keát hôïp ñeán quan heä coäng sinh baét buoäc. Trong ñoù thöïc vaät chuû laø vi sinh vaät quan heä treân möùc ñoä phaân töû vaø chöùc naêng sinh lyù chung. Trung taâm cuûa caû heä thoáng naøy laø vi khuaån Procaryote coá ñònh ñaïm chöùa phöùc hôïp enzyme nitrogenase (ñaûm nhieäm söï chuyeån hoùa N2 thaønh NH3) . Chæ vaøi loaøi Procaryote xaùc ñònh môùi coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. Thöïc vaät (ngoaïi tröø caùc loaïi taûo vaø caùc thöïc vaät coäng sinh) khoâng coù khaû naêng coá ñònh ñaïm maø chæ coù nhöõng loaøi Procaryote soáng chung vôùi thöïc vaät môùi coù khaû naêng coá ñònh ñaïm. Quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc haøng naêm cung caáp cho ñaát töø 100 - 180 trieäu taán ñaïm vaø ñoùng goùp 65% löôïng nitô ñöôïc söû duïng trong noâng nghieäp 10 (Burris vaø Robert, 1993). Phaàn lôùn löôïng nitô naøy ñöôïc taïo ra qua quaù trình coá ñònh ñaïm coäng sinh, khoâng coäng sinh vaø coá ñònh ñaïm keát hôïp. 1.2. Vi sinh vaät coá ñònh ñaïm vaø cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm sinh hoïc 1.2.1. Caùc loaøi vi sinh vaät coá ñònh ñaïm [3] 1.2.1.1. Vi khuaån coá ñònh nitô soáng töï do Töø naêm 1893 Winogradski ñaõ phaân laäp ñöôïc vi khuaån kò khí coá ñònh nitô Clostridium pasteurianum vaø tieáp ñoù naêm 1901 Beijerink phaân laäp ñöôïc 2 loaøi vi khuaån hieáu khí coá ñònh nitô laø Azotobacter chroococum vaø A. agilis. Cho ñeán nay ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän ñöôïc raát nhieàu loaøi vi khuaån coá ñònh nitô soáng töï do. Chuùng coù theå laø hieáu khí (Azotobacter, Azomonas, Beijerinckia, Derxia), kò khí khoâng baét buoäc (Aerobacter, Klebsiella, Bacillus polymyxa, B. macerrans), kò khí baét buoäc (nhieàu loaøi Clostridium, Desulphovibri, Dsulphotomaculum...). Moät soá loaøi vi khuaån lam (nhö Aulosia fertilissima, Tolipothrix tenuis, Nostoc sp.) cuõng coù khaû naêng coá ñònh nitô. 1.2.1.2. Vi khuaån coá ñònh nitô coäng sinh Naêm 1866, H.Hellriegel vaø Hwilfath phaùt hieän ra khaû naêng coá ñònh nitô cuûa caùc caây hoï Ñaäu. Naêm 1888, M.W.Beijerinck phaân laäp ñöôïc nhöõng vi khuaån noát saàn ñaàu tieân töø reã caùc caây hoï Ñaäu. Naêm 1889, B.Frank ñaët teân cho vi khuaån noát saàn laø Rhizobium. Trong nhieàu naêm qua ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän thaáy moät soá loaøi vi sinh vaät coá ñònh nitô coù khaû naêng coäng sinh vôùi raát nhieàu loaïi caây khoâng thuoäc hoï ñaäu. Caùc caây naøy thuoäc veà caùc chi thöïc vaät khaùc nhau. Caùc vi sinh vaät naøy thuoäc caùc nhoùm nhö xaï khuaån (Frankia), vi khuaån, vi khuaån lam. 11 1.2.1.3. Vi khuaån coá ñònh nitô soáng treân reã hay trong reã moät soá loaøi coû nhieät ñôùi Gaàn ñaây, nhieàu nghieân cöùu cho bieát coù moät soá vi khuaån coá ñònh nitô soáng treân boä reã hay trong vuøng reã (Rhizosphere) cuûa moät soá loaøi coû nhieät ñôùi (Parker, 1957 ; Moore, 1963 ; Dobereiner, 1966 ; Rinaudo, 1970 ; Yoshida, 1971 ; Dobereiner, 1975, 1980 ; Bohlool, 1981 ; Hill, 1981...) [4]. Ngoaøi khaû naêng coá ñònh ñaïm, chuùng coù theå tieát ra moâi tröôøng ñaát moät soá hoaït chaát coù taùc duïng kích thích sinh tröôûng ôû thöïc vaät [8]. Caùc loaøi vi khuaån ñöôïc phaùt hieän goàm coù: Azotobacter, Beijerinckia, Dexia, vaø moät soá vi khuaån hình xoaén laø Azospirillum [4]. 1.2.1.4. Ñaïm do vi sinh vaät coá ñònh ñöôïc Ñoái vôùi vi khuaån noát saàn coäng sinh vôùi caây boä ñaäu löôïng ñaïm coá ñònh ñöôïc phuï thuoäc vaøo loaøi, vaøo caây chuû, bieán ñoäng trong khoaûng 30 - 50 kg/ha/naêm (ñoái vôùi caây Phaseolus Vulgaris) [4]. Toång soá ñaïm haøng naêm do vi khuaån coäng sinh caây boä ñaäu coá ñònh ñöôïc vaøo khoaûng 50 - 600kg/ha/naêm [11]. Ñoái vôùi moät soá loaøi vi khuaån coäng sinh vôùi caây khoâng thuoäc boä ñaäu nhö Azospirillum coäng sinh vôùi coû Pangola coá ñònh haøng naêm töø 5 - 30kg ñaïm/ha. Caùc vi sinh vaät soáng töï do trong ñaát (Azotobacter, Clostridium, Bluegreenalgae...) cuõng cung caáp haøng naêm cho moãi hecta ñaát khoaûng 5 - 20kg ñaïm. Gaëp ñieàu kieän thuaän lôïi taûo lam coù theå cung caáp moãi hecta ñeán 50kg ñaïm [19]. 1.2.2. Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ñöôïc Winogradski vaø veà sau ñöôïc nhieàu taùc giaû nghieân cöùu, nhöng cho tôùi nay vaãn coøn coù choã chöa giaûi quyeát ñöôïc hoaøn toaøn. Caùi khoù nhaát luùc ñaàu gaëp phaûi laø phaân töû nitô coù söùc “trô” raát cao, löïc “ì” cuûa noù laø do hai nguyeân töû nitô (N≡N) ñöôïc lieân keát vôùi nhau baèng 3 moái lieân keát beàn vöõng. Trong coâng nghieäp phaân ñaïm muoán phaù vôõ caùc lieân keát naøy ñeå taïo ra 12 caùc daïng ñaïm cho caây haáp thu ñöôïc caàn phaûi duøng nhieät ñoä cao, aùp suaát cao. Theo tính toaùn, muoán toång hôïp ra moät taán NH3 töø N2 vaø H2 caàn naêng löôïng töông ñöông vôùi naêng löôïng sinh ra do ñoát chaùy 5 taán than ñaù. Trong khi ñoù, ôû teá baøo vi sinh vaät, quaù trình phaù caùc löïc “ì” dieãn ra ôû nhieät ñoä vaø aùp suaát bình thöôøng, ñoù laø vì teá baøo vi sinh vaät coù heä enzyme nitrogenase. ÔÛ vi khuaån ñaõ bieát khaù roõ baûn ñoà gen nif [3], [22]. Chính heä enzyme naøy ñaõ xuùc taùc laøm cho nitô cuûa khí quyeån lieân keát vôùi hydro sinh ra trong quaù trình trao ñoåi chaát noäi baøo. Ñaây laø moät öu ñieåm cuûa saûn xuaát phaân vi sinh. Luùc ñaàu khi ngöôøi ta chöa bieát raèng chæ ôû ñieàu kieän aùp suaát khí nitô raát cao (1051atm) thì N2 môùi coù khaû naêng keát hôïp vôùi nöôùc, neân löu haønh giaû thuyeát “lieân keát thuyû phaân” ñeå giaûi thích söï bieán ñoåi N2 thaønh hydroxylamin hoaëc nitrite amon: Cô cheá cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ñöôïc toùm taét baèng sô ñoà 1.1 : N2 + 2H2O NH4NO2 N2 + 3H2O NH2OH + NH(OH)2 NH=NH +2H H2N – NH2 +2H 2NH3 -H2O +H2O +H2O 2H N≡N ½ O2 4H NO2 (HNO)22NH2OH Con ñöôøng khöû Con ñöôøng Oxy hoùa 13 Giaû thuyeát khaùc cho raèng trong teá baøo Azotobacter ñaõ thöïc hieän moät phaûn öùng, maø N2 ñöôïc khöû baèng hydro hoaït tính ñeå bieán thaønh NH3. Giaû thuyeát naøy döïa treân cô sôû khi nuoâi caáy vi sinh vaät coá ñònh ñaïm ngöôøi ta ñaõ phaùt hieän NH3 trong moâi tröôøng. Coù hai con ñöôøng chuû yeáu (con ñöôøng oxy hoaù vaø con ñöôøng khöû) bieán nitô phaân töû thaønh NH3 (Kretovich V.P.1964; 1971). Trong thöïc nghieäm, ngöôøi ta phaùt hieän nhöõng hôïp chaát loaïi khöû trong moâi tröôøng nuoâi caáy vaø trong dòch chieát voâ baøo cuûa vi khuaån coá ñònh ñaïm nhö phaùt hieän NH3 ñaùnh daáu khi duøng N18 vaø N15, thaáy hydroxylamin (NH2OH) ôû Azotobacter vinelandii, nhôø phöông phaùp ñoàng vò phoùng xaï, phaùt hieän thaáy hydrazin vaø hai hôïp chaát naøy coù theå keát hôïp vôùi caùc ketoaxit ñeå thaønh caùc amino acid (Bem den A.A, 1966). Trong moâi tröôøng coù vi sinh vaät coá ñònh ñaïm theá oxy hoaù khöû ôû möùc thaáp, hieäu suaát naêng löôïng cuûa quaù trình coá ñònh ñaïm ôû ñieàu kieän kî khí cao hôn ôû ñieàu kieän hieáu khí. Taát caû nhöõng ñieàu ñoù cho pheùp chuùng ta keát luaän raèng con ñöôøng khöû N2 thaønh NH3 ôû vi sinh vaät coá ñònh ñaïm coù nhieàu cô sôû vöõng chaéc hôn. Quaù trình coá ñònh nitô phaân töû laø moät quaù trình khöû lieân tuïc N2, saûn phaåm ñaàu tieân coù theå thu ñöôïc laø NH3 neáu coâng nhaän trong quaù trình naøy coù söï vaän chuyeån 2 ñieän töû thì coù theå döï ñoaùn saûn phaåm cuûa quaù trình naøy laø diimit vaø hydrazin. Nitrogenase laø toå hôïp nhieàu enzyme chöùa saét khoâng lieân keát vôùi caùc nhoùm -hem vaø nhoùm -SH, noù khoâng chæ khöû nitô phaân töû maø coøn khöû acetylen N2 N≡N ATP 2[H] HN=NH diimit ATP 22[H] ATP 2[H] H2N – NH2 hydrazin 2NH3 NH3 14 (HC≡CH). Khaû naêng khöû acetylen thaáy ôû noát saàn caây hoï Ñaäu vaø ôû nhöõng vi sinh vaät coá ñònh nitô kò khí soáng töï do trong ñaát. Dòch voâ baøo Clostridium coù khaû naêng coá ñònh nitô phaân töû, laïi coù khaû naêng khöû acetylen khi coù ATP, feredoxin vaø ion Mg+. Ñieàu ñoù, moät maët môû ra trieån voïng môùi nghieân cöùu quaù trình coá ñònh nitô phaân töû vaø caùc thaønh phaàn cuûa noù, maët khaùc cho pheùp phaùt hieän nhöõng saûn phaåm trung gian cuûa caùc khaâu coá ñònh nitô. 1.3. Vi khuaån Azospirillum 1.3.1. Ñaëc tính hình thaùi Azospirillum ñöôïc phaân laäp laàn ñaàu tieân vaøo naêm 1925 töø ñaát pha caùt ngheøo nitô ôû Haø Lan. Sau ñoù vi khuaån naøy cuõng ñöôïc phaân laäp töø nhieàu nguoàn khaùc nhau : ñaát vaø reã cuûa nhieàu loaøi coû nhieät ñôùi [17]. Hoäi nghò quoác teá laàn thöù nhaát veà coá ñònh nitô naêm 1974 taïi Phaàn lan Dobereiner vaø Day laø nhöõng taùc giaû ñaàu tieân ñaõ thoâng baùo veà söï hoäi sinh giöõa Azospirillum vôùi reã caùc caây Hoøa thaûo vaø nhöõng caây khaùc troàng ôû vuøng nhieät ñôùi. Töø ñoù ñeán nay ñaõ coù nhieàu coâng trình nghieân cöùu veà vaán ñeà naøy, trong ñoù coù nhieàu thoâng tin veà khaû naêng taêng naêng suaát caùc caây Hoøa thaûo do nhieãm Azospirillum [1]. Azospirillum thuoäc nhoùm vi khuaån dò döôõng carbon, vi hieáu khí, teá baøo hình que hôi cong, kích thöôùc teá baøo (0,9 -1,2μm), teá baøo di ñoäng nhôø tieân mao ñôn ôû moät ñaàu, trong teá baøo coù nhöõng chuoãi haït poly-β-hydroxybutyrate (PHB) [23]. Trong moâi tröôøng dòch theå teá baøo coù moät tieân mao ñôn ôû cöïc coøn khi nuoâi moät vaøi loaøi treân moâi tröôøng raén ôû 30oC coù theâm vaøi tieân mao moïc ra beân caïnh tieân mao ñôn [23]. Caùc khuaån laïc cuûa Azospirillum taïo maøu hoàng nhaït hay maøu hoàng ñaäm treân moâi tröôøng thaïch khoai taây [11], [23]. Nhieät ñoä toái öu caùc loaøi Azospirillum vaøo khoaûng 34 - 37oC. Moät vaøi chuûng phaùt trieån toát ôû pH 7, moät vaøi 15 chuûng khaùc thì phaùt trieån toát treân moâi tröôøng acid. Chuùng coá ñònh nitô trong khoâng khí trong ñieàu kieän vi hieáu khí. Vaøi chuûng coù theå khöû NO3- thaønh NO2- hoaëc N2O vaø N2 [23]. Nguoàn carbon ñöôïc haàu heát caùc loaøi söû duïng thöôøng laø caùc muoái cuûa acid höõu cô nhö malate, lactate, succinate, pyruvate, moät vaøi carbon hydrate cuõng ñöôïc söû duïng laøm nguoàn carbon chính. Moät vaøi chuûng caàn biotin. Caùc loaøi naøy coù theå soáng töï do trong ñaát hoaëc soáng coäng sinh vôùi reã cuûa caùc loaïi nguõ coác, coû… nhöng khoâng taïo noát saàn [23]. Moâi tröôøng phaân laäp Azospirillum laø moâi tröôøng voâ ñaïm (NFb). Trong moâi tröôøng NFb baùn loûng caùc teá baøo cuûa Azospirillum taïo daïng ñóa sinh tröôûng sau 48- 96 giôø, daïng ñóa naøy vaän ñoäng tôùi saùt beà maët moâi tröôøng vaø sau ñoù lan toaû ra. Ñoù laø phaûn öùng vi hieáu khí. Coøn treân moâi tröôøng NFb raén caùc khuaån laïc cuûa Azospirillum thöôøng laø troøn, khoâ, ñuïc, rìa trôn hoaëc nhaên. Treân moâi tröôøng NFb boå sung theâm congo ñoû raát deã phaùt hieän caùc khuaån laïc Azospirillum vì chuùng coù ñaëc ñieåm laø baét maøu vôùi congo ñoû trong khi ñoù khuaån laïc cuûa caùc loaøi vi khuaån coá ñònh ñaïm khaùc khoâng baét maøu vôùi congo ñoû [10]. Ngöôøi ta ñaõ phaân laäp vaø ñònh danh ñöôïc 5 loaøi ñoù laø: A.lipoferum, A.brasilense (Tarrand et al., 1978), A.amazonense (Magalhas et al., 1983), A.hapraeferans (Reinhold et al., 1987), A.irakense (Khammas et al., 1989) [23], [29]. Gaàn ñaây nhaát ñaõ phaân laäp theâm ñöôïc 2 loaøi ñoù laø : A.largomobile (Ben Dekhil et al., 1997) sau ñoù loaøi naøy ñöôïc ñaët laïi teân laø : A.lagimobile (Sly and Stackebrandt, 1999) vaø A.dobereinerae [21], [23]. 16 Baûng 1.1. Caùc ñaëc ñieåm phaân loaïi cuûa caùc loaøi Azospirillum [23] Ghi chuù : + : hôn 90% caùc chuûng döông tính Ñaëc ñieåm Az os pi ri llu m am az on en se Az os pi ri llu m br as ile ns e Az os pi ri llu m ha lo pr ae fe re ns Az os pi ri llu m ir ak en se Az os pi ri llu m lip of er um - Beà roäng teá baøo (µm) 0,8-1,0 1,0 -1,2 0,7-1,4 0,6-0,9 1,0 -1,5 - Söï saép xeáp cuûa tieân mao treân teá baøo trong moâi tröôøng dòch theå + Moät ñeán ba tieân mao ôû moät hoaëc hai cöïc. - - - - - + Tieân mao ñôn cöïc + + + + + - Vaøi tieân mao moïc ra hai beân khi phaùt trieån treân moâi tröôøng agar - + + + - Nhieät ñoä toái öu (tp) 35oC 37oC 41oC 30-33oC 37oC -Sinh tröôûng trong moâi tröôøng baùn loûng voâ ñaïm chöùa nguoàn C duy nhaát + Glucose + - - + + Sucrose + - - - - Khöû NO3- ñeán NO2- ± + + d + NO2- ñeán N2 O - ± + - ± - Khoaûng pH toái öu 5,7-6,5 6,0 -7,3 6,8 - 8,0 5,5 – 8,5 5,7 - 6,8 - Thuyû phaân Pectin - - - + - 17 − : hôn 90% caùc chuûng aâm tính ± : ña soá caùc chuûng döông tính, vaøi chuûng aâm tính d : 11 - 89 % caùc chuûng döông tính 1.3.2. Söï phaân boá cuûa Azospirillum trong ñaát Nhoùm Azospirillum coù bieân ñoä sinh thaùi roäng, chuùng phaân boá haàu heát trong caùc loaïi ñaát : töø caùc vuøng ñaát noâng nghieäp cho ñeán caùc vuøng ñaát hoang hoaù ngheøo chaát dinh döôõng, soá löôïng cuûa Azospirillum trong ñaát noâng nghieäp thöôøng cao hôn ñaát hoang hoaù [9]. Trong ñaát noâng nghieäp thì nhöõng vuøng ñaát chuyeân canh troàng luùa coù soá löôïng Azospirillum cao hôn nhöõng vuøng ñaát luaân canh luùa maøu raát nhieàu [9]. ÔÛ nöôùc ta theo keát quaû nghieân cöùu cuûa moät vaøi taùc giaû, thì soá löôïng Azospirillum ôû trong ñaát troàng luùa ñoàng baèng soâng Hoàng laø khaù cao. Nhìn chung maät ñoä teá baøo Azospirillum trong caùc chaân ñaát laø töø vaøi chuïc ñeán vaøi vaïn teá baøo/gam ñaát khoâ, trong ñaát khoâng ngaäp nöôùc thì soá löôïng Azospirillum thaáp nhaát [9]. Cuøng ñieàu kieän ngaäp nöôùc nhö nhau soá löôïng Azospirillum trong ñaát canh taùc lôùn hôn ñaát hoang, phaân boùn höõu cô laø yeáu toá daãn ñeán söï cheânh leäch soá löôïng Azospirillum giöõa ñaát canh taùc vaø ñaát hoang. Theo Charyulu vaø Rao (1980), vaøo giai ñoaïn phaân röõa thaân luùa, soá löôïng Azospirillum taêng leân khaù cao so vôùi bình thöôøng [9]. Trong ñaát chuyeân canh luùa söï bieán ñoäng soá löôïng Azospirillum khoâng theå hieän roõ nhö ôû ñaát luaân canh luùa muøa. Ñieàu ñoù noùi leân vai troø cuûa ñaát ngaäp nöôùc ñoái vôùi söï khu truù cuûa Azospirillum [9]. Ñieàu ñaùng chuù yù laø soá löôïng Azospirillum ôû vuøng reã luùa luoân lôùn hôn nhieàu so vôùi soá löôïng trong ñaát, söï cheânh leäch naøy coù theå ñaït tôùi vaøi traêm laàn. Maät ñoä vi 18 khuaån cao ôû reã theå hieän moái töông quan hoäi sinh khaù chaët cheõ giöõa nhoùm vi khuaån naøy vaø reã caây luùa nöôùc [9]. 1.3.3. AÛnh höôûng cuûa Azospirillum ñeán söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa thöïc vaät [17] Trong quaù trình nhieãm khuaån Azospirillum vaøo reã coù theå taïo ra nhöõng thay ñoåi quan troïng caùc chæ soá sinh tröôûng ôû thöïc vaät nhö : taêng troïng löôïng khoâ, taêng haøm löôïng nitô trong thaân vaø haït, taêng ñeû nhaùnh, taêng soá löôïng boâng, thôøi haïn laøm ñoøng vaø ra hoa ngaén hôn, troïng löôïng haït cao hôn ñoái chöùng... Tuy nhieân, nhöõng thay ñoåi veà sinh tröôûng vaø phaùt trieån do xöû lyù vi khuaån khoù quan saùt taïi ñoàng ruoäng, do ñoù, chæ coù thoáng keâ moät caùch kyõ löôõng môùi coù theå nhaän thaáy ñöôïc söï gia taêng saûn löôïng sau thu hoaïch do nhieãm khuaån. Cô cheá taùc ñoäng cuûa vi khuaån Azospirillum sau khi nhieãm vaøo reã cho ñeán nay vaãn laø ñieàu bí aån, coù leõ vì theá maø nhöõng keát quaû thöïc nghieäm thu ñöôïc caû treân ñoàng ruoäng laãn trong phoøng thí nghieäm ñeàu coù bieân ñoä dao ñoäng raát lôùn. Möùc taêng tröôûng ôû thöïc vaät do nhieãm Azospirillum trong ñieàu kieän ñoàng ruoäng thöôøng naèm trong giôùi haïn töø 10 ñeán 30%. Cho ñeán nay ñaõ coù nhöõng taøi lieäu ñaùnh giaù toång hôïp keát quaû xöû lyù nhieãm khuaån Azospirillum ñeán naêng suaát cuûa luùa mì ôû caùc thí nghieäm ñoàng ruoäng nhö sau : taêng saûn trung bình do nhieãm khuaån laø 60% so vôùi ñoái chöùng trong ñoù taêng saûn ôû luùa troàng vuï heø laø 75% coøn troàng vuï ñoâng laø 50%. Thí nghieäm xöû lyù vi khuaån ñoái vôùi nhieàu loaïi caây rau quaû khaùc cuõng cho saûn löôïng taêng töø 70 - 75% so vôùi ñoái chöùng. 1.3.3.1. AÛnh höôûng nhieãm khuaån ñeán söï phaùt trieån boä reã AÛnh höôûng deã thaáy nhaát do nhieãm khuaån Azospirillum laø söï bieán ñoåi hình thaùi boä reã [30]. Tuy nhieân, söï bieán ñoäng ñoù laïi lieân quan tröïc tieáp ñeán maät ñoä vi khuaån khi xöû lyù : neáu xöû lyù vi khuaån cao hôn maät ñoä toái thích thì chuùng seõ kìm haõm söï phaùt trieån chieàu daøi reã, trong khi ôû noàng ñoä thaáp hôn hieäu quaû taùc ñoäng 19 cuûa vi khuaån ñoái vôùi reã khoâng roõ reät. Maät ñoä vi khuaån nhieãm vaøo maï vaø haït gioáng cuûa nhieàu loaïi caây rau quaû vaø caây coâng nghieäp khoaûng 105 - 106teá baøo/ml, cho baép laø 107teá baøo/ml, vaø cho caø chua invitro laø hôn 108teá baøo/ml. Thoâng thöôøng, maät ñoä 108 - 1010teá baøo/ml öùc cheá reã phaùt trieån keùo daøi. Tuy nhieân, maät ñoä vi khuaån neâu treân khoâng cho pheùp khaúng ñònh laø caàn nhieãm bao nhieâu vi khuaån Azospirillum cho moät haït hay moät caây ñeå nhaän phaûn öùng taêng saûn döông tính. Ñoái vôùi luùa nöôùc, maät ñoä vi khuaån trong dung dòch xöû lyù 106teá baøo/ml coù aûnh höôûng döông tính ñeán chieàu cao vaø troïng löôïng khoâ caây maï [17]. AÛnh höôûng döông tính do nhieãm khuaån coøn theå hieän qua caùc chæ soá phaùt trieån reã, keå caû söï taêng tröôûng chieàu daøi, ñaëc bieät laø taïi vuøng sinh tröôûng cuûa reã, taêng soá löôïng vaø chieàu daøi cuûa reã phuï vaø do ñoù laøm taêng theå tích reã, taêng troïng löôïng reã, laøm xuaát hieän sôùm vaø taêng soá löôïng caùc loâng huùt, taêng dieän tích tieáp xuùc cuûa caùc loâng reã, thay ñoåi söï saép xeáp caùc teá baøo choùp reã [17]. Caét ngang reã cuûa caây baép vaø caâp luùa mì bò nhieãm khuaån thaáy caùc teá baøo ôû nhöõng reã naøy saép xeáp moät caùch baát bình thöôøng, ôû lôùp ngoaøi vuøng voû. Ñaëc bieät laø caùc hoaït ñoäng cuûa nhöõng enzyme oxy hoaù, lipid vaø caùc chaát baàn thu ñöôïc ôû nhöõng reã nhieãm thaáp hôn reã khoâng nhieãm [27]. Theo moät soá nghieân cöùu thì haøm löôïng caùc chaát : NO3-, K+ vaø H2PO4- trong caùc reã nhieãm khuaån cao hôn trong caùc reã khoâng nhieãm khuaån [27]. 1.3.3.2. Söï hình thaønh khuaån laïc Azospirillum ôû reã Söï phaân boá cuûa Azospirillum treân beà maët reã vaø caùc hoaït ñoäng xaâm nhieãm vaøo reã cuûa caây luùa mì vaø caây baép thì cuõng gioáng nhö nhöõng vi khuaån khaùc. Trong suoát ba ngaøy ñaàu, caùc khuaån laïc taäp trung chuû yeáu ôû vuøng ñaàu non cuûa loâng reã. Vaøi chuûng Azospirillum xaâm nhieãm vaøo vaøi loaïi caây troàng nhö luùa mì, luùa mieán, baép... Söï xaâm nhieãm ñoù laøm thay ñoåi hình thaùi reã [27]. 20 Azospirillum coù theå baùm treân beà maët reã hoaëc xaâm nhaäp vaøo beân trong reã ñeå hình thaønh caùc taäp ñoaøn vôùi voâ soá hôïp phaàn laø caùc teá baøo ñôn. Caùc khuaån laïc naøy aån vaøo phía trong lôùp nhaày ôû maët reã. Caû reã ñaõ cheát laãn reã coøn soáng ñeàu bò vi khuaån xaâm nhieãm. Trong reã, Azospirillum hình thaønh caùc khuaån laïc ôû gian baøo [17]. ÔÛ caùc loaïi nguõ coác khuaån laïc thöôøng thaáy ôû maët reã, ít thaáy ôû vuøng loâng huùt. Trong khi ñoù ôû luùa nöôùc thì ngöôïc laïi. Khaûo saùt baèng kính hieån vi ñieän töû, ôû reã cuûa moät vaøi loaøi thöïc vaät, thaáy khi baùm vaøo reã Azospirillum töï lieân keát vôùi nhau thaønh nhöõng taäp ñoaøn vi khuaån vaø ñöôïc moät maïng löôùi do caùc sôïi polymer coù baûn chaát protein bao boïc. Naêng löôïng phuïc vuï cho söï chuyeån hoaù naøy chuû yeáu phuï thuoäc vaøo caùc hoaït ñoäng chuyeån hoaù cuûa baûn thaân vi khuaån, vaø söï baùm dính naøy heát söùc loûng leûo. Do ñoù, chæ caàn röûa nheï nhaøng ñaõ coù theå giaûi phoùng phaàn lôùn vi khuaån Azospirillum khoûi reã [17]. Söï baùm dính thöôøng xaûy ra raát nhanh trong voøng vaøi phuùt ñaàu vaø maët reã seõ baõo hoaø vi khuaån sau chöøng hai giôø keå töø khi tieáp caän. Tuy nhieân, cho ñeán nay vaãn chöa khaùm phaù ra cô cheá Azospirillum töï baùm vaøo maët reã. Coù theå caùc yeáu toá hoaù hoïc, dinh döôõng, moâi tröôøng vaø sinh lyù seõ kích thích hoaëc kìm haõm Azospirillum baùm vaøo reã. Söï lieân keát qua lecithin ñöôïc coi nhö laø moät cô cheá baùm dính vaø agglutinin ñöôïc coi nhö laø phöông tieän baùm dính vaøo maët reã [17]. Baèng kyõ thuaät hieån vi ñoâi khi cuõng ñaõ phaùt hieän thaáy khuaån laïc coù trong gian baøo cuûa caùc teá baøo moâ choùp reã. Tuy nhieân, ôû coû Kallar thöôøng chæ thaáy söï hieän dieän daøy ñaëc teá baøo Azospirillum treân maët reã, caùc quaàn theå Azospirillum beân trong reã chöa bao giôø thaáy ñöôïc [17]. Neáu nhö vi khuaån Azospirillum hieän dieän trong gian baøo thì caâu hoûi ñöôïc ñaët ra laø baèng caùch naøo Azospirillum xaâm nhaäp vaøo beân trong ñöôïc ? Coù caùc khaû naêng : 21 + Vi khuaån thaâm nhaäp vaøo beân trong qua caùc moâ reã bò toån thöông, nôi reã phuï töø reã caùi moïc ra. + Vi khuaån thaâm nhaäp vaøo beân trong qua caùc loâng huùt ñaõ cheát hoaëc qua nhöõng choã toån thöông cô hoïc thöôøng gaëp trong quaù trình sinh tröôûng cuûa caây. + Vi khuaån duøng enzyme pectinase hoaø tan pectin vaø do ñoù môû loái thaâm nhaäp vaøo beân trong. 1.3.4. Caùc cô cheá hoaït ñoäng cuûa Azospirillum giuùp taêng tröôûng thöïc vaät Cô cheá hoaït ñoäng giuùp taêng tröôûng thöïc vaät cuûa Azospirillum cho ñeán nay vaãn chöa xaùc laäp, nhöng theo moät soá taùc giaû coù ba nguyeân nhaân chính laøm cho caùc chuûng Azospirillum coäng sinh vôùi caây troàng laøm taêng naêng suaát [1]. + Söï hình thaønh vaø chuyeån vaøo caây löôïng nitô coá ñònh bôûi vi khuaån (Renie, 1980). + Vi khuaån tieát ra caùc hormon thöïc vaät (Tieân vaø coäng söï, 1979). + Söï kích thích ñöa caùc chaát dinh döôõng vaøo caây (Lin vaø coäng söï, 1985). Moät vaøi nghieân cöùu cuûa moät soá taùc giaû, thì caùc chuûng Azospirillum ngoaøi khaû naêng coá ñònh nitô, coøn coù khaû naêng sinh ra chaát kích thích sinh reã ñoù laø indole -3- acetic acid (IAA). Caây maï coù xöû lyù Azospirillum ra reã nhieàu hôn vaø cao hôn ñoái chöùng, chöùng toû hormon thöïc vaät ñaõ phaùt huy taùc duïng toát. Maøu xanh ñaäm hôn vaø laù to baûn hôn theå hieän nitô ñöôïc söû duïng nhieàu hôn ôû nhöõng caây thí nghieäm [1]. Ngoaøi ra thì Azospirillum coù theå taêng hoaït tính nitratereductase ôû reã vaø do ñoù caây khoâng tích luõy nhieàu nitrate trong reã [17]. 1.3.4.1. Söï coá ñònh nitô khoâng khí cuûa Azospirillum Taát caû caùc chuûng Azospirillum phaân laäp ñöôïc ñeàu coù khaû naêng coá ñònh ñaïm khaù hieäu quaû, khi soáng töï do cuõng nhö khi toàn taïi trong quan heä toå hôïp vôùi thöïc vaät. Khaû naêng coá ñònh nitô khoâng khí ñöôïc ñaùnh giaù baèng phaûn öùng khöû 22 acetylen, ñaõ phaùt hieän thaáy söï gia taêng nitô toång soá ôû thaân vaø haït do nhieãm Azospirillum.Vì theá ñaõ coi coá ñònh nitô nhö laø cô cheá chuû yeáu vaø ñaàu tieân cuûa caùc hoaït ñoäng kích thích taêng tröôûng thöïc vaät cuûa Azospirillum. Maëc daàu söï coá ñònh nitô khoâng khí ñöôïc dieãn taû baèng phaûn öùng khöû acetylen, nhöng chính xaùc hôn caû laø nhöõng daãn lieäu thu ñöôïc khi söû duïng kyõ thuaät haáp thu vaø pha loaõng 15N ñaõ xaùc ñònh ñöôïc söï gia taêng hoaït tính nitrogenase ôû reã nhieãm khuaån, keát quaû ñoù phuø hôïp vôùi söï gia taêng toång löôïng nitô ôû caây chuû nhieãm khuaån. Keát quaû nhieãm Azospirillum vaøo luùa mì vaø baép cho thaáy trong toaøn boä löôïng nitô cuûa caây thì chæ coù 18% laø do coá ñònh töø khoâng khí, vaø trong toaøn boä löôïng nitô coá ñònh caây chuû haáp thu ñöôïc chöøng 5% maø thoâi. Tuy nhieân, chæ moät löôïng nhoû nhö theá cuõng ñuû ñeå lyù giaûi cho söï gia taêng haøm löôïng nitô toång soá ôû caây chuû vaø do ñoù löôïng nitô cuûa phaân boùn duø coù cao ñeán möùc öùc cheá hoaït tính nitrogenase cuõng khoâng aûnh höôûng ñeán taêng saûn döông tính ôû caây chuû khi ñöôïc nhieãm khuaån [17]. 1.3.4.2. Aûnh höôûng cuûa hormon ngoaïi tieát Azospirillum leân sinh tröôûng vaø phaùt trieån ôû thöïc vaät [17] Trong quaù trình sinh tröôûng nhieàu loaøi Azospirillum saûn sinh ra caùc hormon ngoaïi tieát coù taùc duïng ñieàu hoøa sinh tröôûng ôû thöïc vaät nhö indole-3-pyruvic acid vaø indole-3-acetaldehyde laø IAA ôû A.lipoferum. Coù baèng chöùng cho söï toàn taïi con ñöôøng taïo IAM ôû A.brasilense, ñoù laø söï hieän dieän cuûa indole-3-ethanol, indole-3- methanol (IM) vaø indole-3-lactate (ILA) trong moâi tröôøng nuoâi caáy A.brasilense. Hieäu quaû cuûa hormon ngoaïi tieát ñeán caây troàng hoaøn toaøn phuï thuoäc vaøo noàng ñoä söû duïng. Noàng ñoä söû duïng quaù thaáp thì ít coù hieäu quaû. Noàng ñoä thaáp (khoaûng vaøi ppm ñeán vaøi chuïc ppm) seõ gaây hieäu quaû kích thích sinh tröôûng (taêng chieàu cao, taêng sinh khoái). Noàng ñoä söû duïng ôû möùc cao (haøng nghìn ppm) seõ gaây öùc cheá sinh tröôûng. Noàng ñoä raát cao (treân chuïc nghìn ppm) seõ gaây neân söï huûy dieät boä phaän cuûa toaøn caây [18]. 23 Caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng thöïc vaät cuõng aûnh höôûng maïnh ñeán khaû naêng khöû acetylen cuûa Azospirillum. Baèng chöùng cho thaáy khi xöû lyù caùc chaát ñieàu hoøa sinh tröôûng (caû toång hôïp nhaân taïo laãn taùch chieát töø dòch nuoâi caáy vi khuaån), hình thaùi vaø söï phaùt trieån cuûa reã ñöôïc khoâi phuïc hoaøn toaøn gioáng nhö khi xöû lyù Azospirillum. Cuï theå laø taïo ra nhöõng thay ñoåi veà chieàu daøi reã, reã taïo ra nhieàu loâng huùt hôn, taêng toác ñoä phaân baøo vaø bieät hoùa moâ taïo vuøng sinh tröôûng cuûa reã. Caùc chuûng cha meï Azospirillum vaø caùc theå ñoät bieán taïo IAA ngoaïi tieát trong dòch nuoâi caáy aûnh höôûng maïnh ñeán phaùt trieån hình thaùi cuûa reã, trong khi caùc theå ñoät bieán maát khaû naêng taïo IAA ngoaïi tieát thì khoâng coù khaû naêng laøm thay ñoåi hình thaùi cuûa reã. Nhieãm Azospirillum ñaõ caûi thieän söï caân baèng hormon ôû caùc caù theå luùa mì ñoät bieán maát khaû naêng taïo hormon. Gaàn ñaây phaùt hieän ñöôïc moät löôïng ñaùng keå IAA vaø IBA ôû reã ngoâ do nhieãm Azospirillum, trong khi ôû reã ngoâ khoâng nhieãm thì hoaøn toaøn khoâng coù. 1.3.4.3. Azospirillum kích thích söï haáp thu caùc chaát dinh döôõng khoaùng cuûa thöïc vaät [17] Ngoaøi söï taêng hoaëc giaûm caùc chæ soá sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa reã, vi khuaån Azospirillum coøn aûnh höôûng ñeán thay ñoåi caùc chæ soá veà laù. Söï thay ñoåi coù lieân quan tröïc tieáp ñeán söï haáp thu NO3-, NH4+, PO43-, K+, Rb+ vaø Fe2+. Ñoù laø nguyeân nhaân cuûa söï gia taêng haøm löôïng chaát khoâ do tích luõy khoaùng chaát ôû thaân vaø laù. Ngöôøi ta cho raèng vieäc taêng cöôøng khoaùng chaát ñöôïc coi laø nguyeân nhaân taêng theå tích vaø troïng löôïng khoâ cuûa reã [24]. Thöïc vaäy, nhieãm khuaån Azospirillum laøm cho löôïng ion trong ñaát taêng leân vaø do ñoù giuùp caây khaéc phuïc ñöôïc tình traïng ngheøo chaát dinh döôõng. Chính ñieàu ñoù giaûi thích vì sao khi xöû lyù Azospirillum nif- caây vaãn haáp thu raát hieäu quaû nitô maëc duø trong ñaát coù raát ít. Chính vì theá, duø löôïng nitô boùn vaøo ñaát coù thaáp hôn nhu caàu vaãn ñaûm baûo ñöôïc saûn löôïng thu hoaïch oån ñònh. Vaøi nghieân cöùu ñaõ chöùng minh raèng hoaït tính tieáp nhaän proton 24 lieân quan tröïc tieáp ñeán söï caân baèng ion ôû reã. Xöû lyù Azospirillum ñaõ laøm cho hoaït tính thu nhaän proton ôû reã luùa mì taêng leân moät caùch roõ reät. Nhieãm khuaån Azospirillum coøn caûi thieän ñöôïc cheá ñoä nöôùc ôû caây. Caùc caây cao löông ñöôïc nhieãm khuaån chòu haïn toát hôn do tích luõy ñöôïc nhieàu nöôùc ôû laù. Tieàm naêng giöõ nöôùc taêng cao hôn ñoàng thôøi nhieät ñoä taùn laù cuõng thaáp hôn so vôùi caây ñoái chöùng khoâng nhieãm Azospirillum. 1.3.4.4. Quan heä giöõa nitratereductase cuûa caây chuû vaø vi khuaån Azospirillum [17] Hieän nay coù nhieàu giaû thuyeát cho raèng nitratereductase (NR) cuûa vi khuaån laø nguyeân nhaân khôûi ñaàu taïo neân söï tích luõy nhieàu nitô ôû caây chuû do nhieãm Azospirillum : cho nhieãm Azospirillum NR+ vaøo reã caây laøm cho hoaït tính cuûa enzyme naøy ôû laù giaûm haún vaø ngöôïc laïi, nhieãm Azospirillum NR- laøm cho hoaït tính cuûa enzyme naøy ôû laù taêng hôn so vôùi nhoùm Azospirillum NR+. Keát quaû thöû nghieäm xöû lyù Azospirillum brasilense sp 245 boá meï NR+ vaø theå ñoät bieán cuûa noù laø NR- ñaõ xaùc nhaän theå ñoät bieán coù hieäu öùng taêng saûn ít hôn raát._.át (taêng 19,25%). ⋅ Treân ruoäng thöû nghieäm nhieãm A3 : nhaän thaáy khaû naêng phaân nhaùnh ôû caùc loâ 4 vaø 5 thaáp (giaûm 14% (loâ 5), 8,52% (loâ 4)), caùc loâ 1, 2, 3 cao hôn loâ ÑC vaø cao nhaát laø loâ 1 (taêng 16,02%). Töø nhöõng nhaän xeùt veà chieàu cao vaø soá nhaùnh ôû treân nhaän thaáy raèng coù theå coù aûnh höôûng vi khuaån trong caùc loâ 1, 2, 3. ¾ Vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch (luùa 95 ngaøy tuoåi), tieán haønh ñeám soá boâng/ñôn vò dieän tích, ñeám soá haït/boâng, tính tyû leä haït chaéc, caân troïng löôïng 1000 haït, sau ñoù tính naêng suaát luùa/ñôn vò dieän tích. Keát quaû ñöôïc ghi nhaän trong baûng 3.11 (A2) vaø 3.12 (A3). 84 Baûng 3.11. AÛnh höôûng A2 treân chæ tieâu caây luùa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch Chæ tieâu Loâ TN Soá boâng/m2 Soá haït/boâng Tyû leä haït chaéc (%) Troïng löôïng 1000 haït (g) Naêng suaát (g/m2) Ñoái chöùng (100% - PL) 508,45 a 62,46 b 81,75 b 20,74 b 538,45 bc 1 (% so ÑC – PL) 508,40 99,99% a 66,86 107,04% a 89,46 109,43% a 24,04 115,91% a 731,03 135,77% a 2 (% so ÑC – PL) 508,42 99,99% a 63,62 101,86% b 83,58 102,24% b 21,52 103,76% ab 581,78 108,05% b 3 (% so ÑC – PL) 508,38 99,99% a 62,38 99,87% b 81,33 99,49% b 20,64 99,52% b 532,35 98,89% c 4 (% so ÑC – PL) 508,00 99,91% a 58,86 94,24% c 72,88 89,15% c 17,03 82,11% c 371,11 68,92% d 5 (% so ÑC – PL) 507,90 99,89% a 58,61 93,84% c 71,82 87,85% c 6,65 80,28% c 355,97 66,11% d CV% - LSD 0,43 4,00 1,85 2,10 2,67 3,89 7,9 2,89 5,04 47,54 85 Baûng 3.12. AÛnh höôûng A3 treân chæ tieâu caây luùa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch Chæ tieâu Loâ TN Soá boâng/m2 Soá haït/boâng Tyû leä haït chaéc (%) Troïng löôïng 1000 haït (g) Naêng suaát (g/m2) Ñoái chöùng (100% -PL) 507,27 a 61,70 b 81,34 b 21,10 b 537,17 c 1 (% so ÑC – PL) 508,23 100,19% a 66,32 107,49% a 89,93 110,56% a 24,00 113,74% a 727,48 135,43% a 2 (% so ÑC – PL) 508,16 100,18% a 63,62 103,11% ab 82,40 101,30% b 21,77 103,18% ab 579,94 107,96% b 3 (% so ÑC – PL) 507,67 100,08% a 62,72 101,65% ab 82,39 101,29% b 21,62 102,46% ab 567,18 105,59% b 4 (% so ÑC – PL) 505,60 99,67% b 57,29 92,85% c 68,34 84,02% c 17,42 82,56% c 344,83 64,19% d 5 (% so ÑC – PL) 505,20 99,59% b 56,59 91,72% c 67,60 83,11% c 17,29 81,94% c 334,15 62,21% d CV% - LSD 0,17 1,60 3,79 4,24 3,56 5,11 7,39 2,76 2,61 24,54 86 Ghi chuù : 1 laø loâ nhieãm vi khuaån Azospirillum, giaûm ½ löôïng ñaïm ôû laàn boùn phaân ñaàu tieân. 2, 3, 4 vaø 5 laø caùc loâ khoâng nhieãm, giaûm ½ löôïng ñaïm ôû laàn boùn phaân ñaàu tieân. 6 laø loâ ñoái chöùng khoâng nhieãm vi khuaån vaø ñöôïc boùn ñaày ñuû ñaïm. Trong cuøng moät coät, nhöõng giaù trò trung bình coù cuøng moät chöõ caùi theo sau thì khoâng khaùc bieät coù yù nghóa ôû möùc xaùc suaát p = 0,05. Qua keát quaû baûng 3.11 cho thaáy soá boâng ôû caùc loâ thí nghieäm khoâng khaùc bieät coù yù nghóa so vôùi ÑC. Soá haït/boâng ôû loâ 2, loâ 3 khoâng khaùc bieät so vôùi ÑC ; loâ 4, 5 thaáp hôn so ÑC : 5,76% (loâ 4), 6,16% (loâ 5) ; tuy nhieân loâ 1 taêng 7,04% so ÑC. Troïng löôïng 1000 haït ôû loâ 2 khoâng khaùc bieät so vôùi loâ 1, 3 vaø ÑC ; coøn ôû loâ 1 taêng 15,91%, loâ 4 giaûm 17,89%, loâ 5 giaûm 19,72% so ÑC. Naêng suaát luùa ôû loâ 1 ñaït 731,03g/m2 taêng 35,77% so ÑC, ôû loâ 2 vaø 3 khoâng khaùc bieät so ÑC, coøn loâ 4 giaûm 31,08%, loâ 5 giaûm 33,89% so ÑC. Keát quaû ôû baûng 3.12 cuõng nhaän thaáy raèng loâ 1 ñaït naêng suaát 727,48g/m2 taêng 35,43% so ÑC, loâ 2 taêng 7,96%, loâ 3 taêng 5,59%, loâ 4 giaûm 35,81%, loâ 5 giaûm 37,79% so ÑC. Keát quaû phaân laäp laïi ñaát chæ thaáy daïng khuaån laïc A2 vaø A3 vôùi soá löôïng nhieàu trong caùc loâ 1, 2 vaø 3. Nhö vaäy, coù theå do möa hoaëc töôùi tieâu maø vi khuaån A2 vaø A3 theo doøng nöôùc di chuyeån ñeán caùc loâ 2 vaø 3 (ñöôïc boùn ½ löôïng phaân ñaïm) laøm cho caùc loâ naøy ñaït naêng suaát töông ñöông vôùi loâ ñoái chöùng. 87 3.5. Taïo cheá phaåm “phaân vi sinh” 3.5.1. Chuaån bò 3.5.1.1. Dòch nuoâi caáy vi khuaån Nuoâi caáy vi khuaån A2 trong moâi tröôøng Dobereiner. Caùch khoaûng 12giôø ño trò soá maät ñoä quang vaø ñeám giaùn tieáp soá löôïng teá baøo (ñeám soá khuaån laïc treân thaïch ñóa). Keát quaû ñöôïc theå hieän ôû baûng 3.13. Baûng 3.13. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A2 theo thôøi gian Thôøi gian (giôø) OD610nm CFU/ml log (CFU/ml) 0 0,03 2,99*105 5,48 12 0,062 4,2*105 5,62 24 0,101 2,61*106 6,42 36 0,145 0,78*107 6,89 48 0,284 2,98*107 7,47 60 0,28 2,9*107 7,46 72 0,274 2,86*107 7,46 84 0,269 2,75*107 7,44 96 0,265 2,82*107 7,45 Ghi chuù: CFU/ml – soá teá baøo coù trong 1ml dòch nuoâi caáy 88 Ñoà thò 3.6. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A2 theo thôøi gian 5,45 5,95 6,45 6,95 7,45 7,95 0 12 24 36 48 60 72 84 96 Töông töï, khi khaûo saùt söï gia taêng soá löôïng cuûa chuûng A3 ta thu ñöôïc keát quaû theå hieän ôû baûng 3.14. Baûng 3.14. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A3 theo thôøi gian Thôøi gian (giôø) OD610nm CFU/ml log (CFU/ml) 0 0,030 1,68*105 5,23 12 0,058 2,65*105 5,42 24 0,069 1,1*106 6,04 36 0,125 4,14*106 6,62 48 0,248 1,75*107 7,24 60 0,228 1,65*107 7,22 72 0,207 1,68*107 7,23 84 0,184 1,75*107 7,24 96 0,165 1,62*107 7,21 Ghi chuù : CFU/ml – soá teá baøo coù trong 1ml dòch nuoâi caáy thôøi gian (giôø) lo g (C FU /m l) 89 Ñoà thò 3.7. Söï thay ñoåi maät ñoä teá baøo cuûa chuûng A3 theo thôøi gian Qua keát quaû nhaän thaáy trong khoaûng 12giôø ñaàu nuoâi caáy chuûng A2, A3 ñeàu sinh tröôûng raát chaäm, maät ñoä teá baøo gia taêng raát ít. Sau ñoù chuùng baét ñaàu sinh tröôûng maïnh, thôøi gian sinh tröôûng maïnh nhaát töø khoaûng 24 - 48giôø. Sau ñoù soá löôïng teá baøo coù khuynh höôùng thay ñoåi khoâng ñaùng keå. Do ñoù choïn thôøi ñieåm 48giôø nuoâi caáy ñeåø khaûo saùt caùc noäi dung khaùc. ™ AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa 2 chuûng A2 vaø A3 Tieán haønh nuoâi caáy vi khuaån trong moâi tröôøng MT3 ôû caùc nhieät ñoä 18, 25, 30, 35, 40, 45, 50oC. Sau 48giôø laáy maãu ño trò soá maät ñoä quang, keát quaû ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 3.15 theå hieän ôû ñoà thò 3.8 vaø hình 3.8. 5,2 5,7 6,2 6,7 7,2 7,7 0 12 24 36 48 60 72 84 96 thôøi gian (giôø) lo g (C FU /m l) 90 Baûng 3.15. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm Chuûng Nhieät ñoä (oC) A2 A3 18 0,005 0,005 25 0,105 0,081 30 0,284 0,248 35 0,322 0,343 40 0,383 0,250 45 0,088 0,053 50 0,003 0,002 Ñoà thò 3.8. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm A2 A3 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Nhieät ñoä (oC) O D 61 0n m 18 25 30 35 40 45 50 91 Hình 3.8. AÛnh höôûng cuûa nhieät ñoä leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo chæ thò maøu bromothymol blue Trong moâi tröôøng coù chaát chæ thò maøu bromothymol blue, neáu nhieät ñoä thích hôïp cho söï phaùt trieån cuûa vi khuaån seõ laøm taêng ñoä ñuïc moâi tröôøng vaø thay ñoåi maøu chæ thò töø xanh laù caây sang xanh döông (vi khuaån kieàm hoùa moâi tröôøng). Qua keát quaû trong baûng 3.15, ñoà thò 3.8 vaø hình 3.8 nhaän thaáy 2 chuûng A2 vaø A3 khoâng sinh tröôûng ôû 18oC vaø 50oC. A2 sinh tröôûng trong khoaûng nhieät ñoä 25 - 45oC vaø sinh tröôûng maïnh ôû 40oC. A3 sinh tröôûng trong khoaûng nhieät ñoä 25 - 40oC vaø sinh tröôûng maïnh ôû 35oC. 92 ™ AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa 2 chuûng A2 vaø A3 Nuoâi caáy vi khuaån trong MT3 coù giaù trò pH=4, 5, 6, 7, 8 vaø 9 ôû 40oC (A2) vaø 35oC (A3). Sau 48 giôø laáy maãu ño trò soá maät ñoä quang, keát quaû ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 3.16, theå hieän ôû ñoà thò 3.9 vaø hình 3.9. Baûng 3.16. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm Chuûng pH A2 A3 4 0,005 0,005 5 0,006 0,005 6 0,120 0,117 6,8 0,383 0,343 7 0,226 0,176 8 0,162 0,151 9 0,038 0,076 Ñoà thò 3.9. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo giaù trò OD610nm 0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3 0,35 0,4 0,45 Chuûng vi khuaån O D 6 10 nm 4 5 6 6,8 7 8 9 10 A3 A2 93 Hình 3.9. AÛnh höôûng cuûa pH leân söï sinh tröôûng cuûa A2 vaø A3 döïa vaøo chæ thò maøu bromothymol blue Moâi tröôøng boå sung bromothymol blue, vi khuaån phaùt trieån seõ laøm ñuïc vaø kieàm hoùa moâi tröôøng (pH trung tính moâi tröôøng maøu xanh laù caây, pH acid moâi tröôøng maøu vaøng, pH kieàm moâi tröôøng maøu xanh döông). Qua keát quaû ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 3.16, theå hieän ôû ñoà thò 3.9 vaø hình 3.9 nhaän thaáy taïi caùc giaù trò pH=4, 5 vaø 9, caû 2 chuûng A2 vaø A3 khoâng sinh tröôûng. Chuùng sinh tröôûng ôû bieân ñoä pH töø 6 ñeán 8 vaø thích hôïp ôû pH=6,8. 94 3.5.1.2. Chuaån bò cheá phaåm “phaân vi sinh” Š AÛnh höôûng ñoä aåm cuûa than buøn leân söï gia taêng soá teá baøo vi khuaån Caùc chuûng A2 vaø A3 ñöôïc nuoâi caáy treân than buøn hoaït hoùa vôùi caùc ñoä aåm : 30%, 40%, 50% vaø 60%. Kieåm tra soá löôïng teá baøo A2 vaø A3 (baûng 3.17) thoâng qua vieäc ñeám soá khuaån laïc taïi thôøi ñieåm 0giôø vaø 72giôø. Baûng 3.17. Maät ñoä teá baøo A2 vaø A3 trong 1 gram cheá phaåm theo thôøi gian vôùi söï thay ñoåi ñoä aåm Ñoä aåm Thôøi gian (giôø) 30% 40% 50% 60% 0 4,75*107 4,8*107 4,81*107 4,83*107 A2 72 2,6*103 3,6*104 5,11*107 4,25*105 0 1,0*107 1,08*107 1,06*107 1,1*107 A3 72 3,54*103 2,11*104 1,34*107 3,63*105 Qua keát quaû ôû baûng 3.17 nhaän thaáy luùc 0giôø soá löôïng vi khuaån töông ñöông nhau. Sau 72giôø soá löôïng vi khuaån ôû ñoä aåm 50% taêng khoâng nhieàu, coøn caùc ñoä aåm khaùc thì giaûm. Ñieàu naøy chöùng toû vi khuaån A2 vaø A3 phaùt trieån ñöôïc trong cheá phaåm coù ñoä aåm 50%. Š AÛnh höôûng noàng ñoä NH3 leân söï sinh tröôûng cuûa vi khuaån Söû duïng ñoä aåm 50%, caáy vi khuaån leân than buøn coù boå sung NH3 thay ñoåi 1,5%; 1,8%; 2,1%; 2,4% vaø 2,7%. UÛ 40oC (A2) vaø 35oC (A3). Keát quaû thu ñöôïc ôû baûng 3.18. 95 Baûng 3.18. AÛnh höôûng cuûa NH3 leân söï gia taêng soá löôïng teá baøo NH3 Thôøi gian (giôø) 1,5% 1,8% 2,1% 2,4% 2,7% 0 1,11*107 1,18*107 1,22*107 1,20*107 1,13*107 A2 72 4,03*104 2,01*105 1,73*106 4,51*107 2,46*103 0 1,04*107 1,05*107 1,10*107 1,07*107 1,08*107 A3 72 1,97*105 2,89*106 3,27*106 4,10*107 2,80*102 Sau 3 ngaøy nuoâi caáy töø keát quaû trong baûng 3.18 nhaän thaáy vôùi caùc tyû leä NH3 1,5%, 1,8%, 2,1% vaø 2,7% soá löôïng teá baøo giaûm. Soá löôïng teá baøo taêng ôû 2,4%. Š AÛnh höôûng cuûa moâi tröôøng dinh döôõng leân söï toàn taïi cuûa vi khuaån Caáy vi khuaån vaøo than buøn ñöôïc hoaït hoùa vôùi 2,4% NH3. Ñoä aåm than buøn 50% coù boå sung moâi tröôøng Dobereiner. Keát quaû thu ñöôïc ôû baûng 3.19. Baûng 3.19. Söï bieán ñoåi maät ñoä teá baøo A2 vaø A3 theo thôøi gian Thaønh phaàn Thôøi gian (giôø) Ñoái chöùng (than buøn) Than buøn+MT3 0 1,71*107 1,67*107 A2 72 2,23*107 3,60*108 0 2,08*107 2,10*107 A3 72 0,83*107 4,03*108 96 Qua keát quaû ôû baûng 3.19 sau 3 ngaøy nuoâi caáy nhaän thaáy maät ñoä teá baøo cuûa 2 chuûng ñeàu taêng khi thay nöôùc caát baèng moâi tröôøng nuoâi caáy vi khuaån. Nhö vaäy qua caùc khaûo saùt veà ñoä aåm, tyû leä NH3 vaø thaønh phaàn dinh döôõng boå sung vaøo neàn chaát mang laø than buøn, ta coù theå chuaån bò cheá phaåm ñoái vôùi 2 chuûng : 2,4% NH3 ñeå hoaït hoùa than buøn, boå sung dòch nuoâi caáy vi khuaån ôû ñoä aåm 50%, uû ôû nhieät ñoä 40oC (A2) vaø 35oC (A3) trong 48giôø. Ñem saáy nheï ôû 45oC ñeå baûo quaûn. 3.5.2. Khaûo saùt aûnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân caây luùa trong chaäu vaø rau caûi ngaén ngaøy 3.5.2.1. Luùa trong chaäu Chuùng toâi tieán haønh phaân laäp maãu ñaát tröôùc gieo troàng nhaän thaáy coù caùc khuaån laïc maøu ñoû treân moâi tröôøng NFb raén. Troän 10gram cheá phaåm cho moãi chaäu ñaát, cho 3 haït naûy maàm vaøo trong moãi chaäu ñaát. Sau 7 ngaøy ño chieàu daøi laù, 25 ngaøy ñeám soá nhaùnh, 95 ngaøy sô boä thu hoaïch ñeám soá boâng, soá haït vaø caân troïng löôïng haït. Keát quaû laø trung bình cuûa 30 caây ñöôïc ghi nhaän ôû baûng 3.20. 97 Baûng 3.20. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây luùa trong chaäu Cheá phaåm Caùc chæ tieâu Ñoái chöùng (100% - PL) A2 (% so ÑC – PL) A3 (% so ÑC – PL) CV% - LSD Chieàu cao caây (cm) 18,54 b 20,38 109,92% a 19,96 107,66% a 2,33 1,04 Soá nhaùnh/caây 4,43 b 5,32 120,09% a 5,21 117,61% a 5,32 0,60 Soá boâng/caây 4,80 a 4,92 102,50% a 4,85 101,04% a 7,31 0,80 Soá haït chaéc/boâng 64,00 b 87,61 136,89% a 85,50 133,59% a 3,50 6,28 Soá haït leùp/boâng 20,68 a 18,71 90,47% b 18,26 88,30% b 1,16 0,48 Troïng löôïng haït chaéc/boâng (g) 1,15 b 1,58 137,39% a 1,49 129,57% a 3,18 0,10 Troïng löôïng haït leùp/ boâng (g) 0,28 a 0,14 50,00% b 0,15 53,57% b 24,31 0,10 Ghi chuù : Trong cuøng moät haøng, nhöõng giaù trò trung bình coù cuøng moät chöõ caùi theo sau thì khoâng khaùc bieät coù yù nghóa ôû möùc xaùc suaát p = 0,05. 98 Qua baûng 3.20 nhaän thaáy khi nhieãm cheá phaåm vi khuaån thì chieàu cao caây taêng 9,92% (A2), 7,66% (A3) , soá nhaùnh/caây taêng 20,09% (A2), 17,61% (A3) , soá boâng/caây taêng khoâng ñaùng keå : 2,5% (A2), 1,04% (A3), soá haït chaéc/boâng taêng 36,89% (A2), 33,59% (A3), troïng löôïng haït chaéc taêng 37,39% (A2), 29,57% (A3); ngöôïc laïi soá haït leùp/boâng giaûm 9,53% (A2), 11,7% (A3), troïng löôïng haït leùp/boâng giaûm 50% (A2), 46,43% (A3) so vôùi ñoái chöùng. Keát quaû phaân laäp laïi ñaát chæ thaáy daïng khuaån laïc A2 vaø A3 vôùi soá löôïng nhieàu trong caùc loâ gaây nhieãm. Nhö vaäy, “cheá phaåm” vi khuaån A2 vaø A3 laøm taêng chieàu cao caây, taêng soá nhaùnh, maëc duø soá boâng khoâng taêng nhöng taêng soá löôïng vaø troïng löôïng haït chaéc, laøm giaûm soá löôïng vaø troïng löôïng haït leùp. 3.5.2.2. Caûi thìa Chuùng toâi tieán haønh phaân laäp maãu ñaát tröôùc gieo troàng nhaän thaáy coù caùc khuaån laïc maøu ñoû treân moâi tröôøng NFb raén. Troän 50gram cheá phaåm “phaân vi sinh” cho moãi loâ (3 laàn laëp laïi). Ñoái chöùng laø 50gram than buøn hoaït hoùa. Tieán haønh khaûo saùt : Š AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” ñeán söï sinh truôûng laù caây caûi thìa Laù laø cô quan quan troïng cuûa caây troàng. Thoâng qua quaù trình quang hôïp, laù cung caáp nhöõng döôõng chaát chính cho caây caû veà löôïng laãn chaát ñeå hình thaønh sinh khoái cuûa caây. Ñoái vôùi nhöõng caây troàng maø saûn phaåm thu hoaïch laø laù nhö caây caûi thìa thì söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån maïnh meõ cuûa boä laù coù yù nghóa voâ cuøng quan troïng trong saûn xuaát goùp phaàn vaøo vieäc naâng cao naêng suaát, phaåm chaát ñoàng thôøi gia taêng hieäu quaû kinh teá cho ngöôøi troàng rau. Caùch 5 ngaøy ñeám soá laù treân 5 caây/loâ ñöôïc ñaùnh daáu, theo doõi trong 25 ngaøy. Keát quaû ñöôïc ghi nhaän trong baûng 3.21 vaø ñoà thò 3.10. 99 Baûng 3.21. Soá laù trung bình cuûa caây caûi thìa (laù/caây) Cheá phaåm Thôøi gian (ngaøy) Ñoái chöùng (100% - PL) A2 (% so ÑC – PL) A3 (% so ÑC – PL) CV% - LSD 5 4,23 c 4,75 112,29% a 4,59 108,51% b 1,39 0,14 10 5,01 b 5,91 117,96% a 5,68 113,37% a 3,94 0,50 15 5,46 b 7,01 128,39% a 6,71 122,89% a 6,27 0,91 20 6,42 b 9,01 140,34% a 8,82 137,38% a 3,43 0,63 25 7,96 c 12,82 161,06% a 12,31 154,65% b 1,41 0,35 Ghi chuù : Trong cuøng moät haøng, nhöõng giaù trò trung bình coù cuøng moät chöõ caùi theo sau thì khoâng khaùc bieät coù yù nghóa ôû möùc xaùc suaát p = 0,05. 100 Ñoà thò 3.10. AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” ñeán soá löôïng laù caûi thìa 0 5 10 15 5 10 15 20 25 Thôøi gian (ngaøy) So á la ù ÑC A A Keát quaû ôû baûng 3.21 vaø ñoà thò 3.10 cho thaáy, soá laù/caây taêng daàn theo thôøi gian sinh tröôûng. Giai ñoaïn 5 ngaøy sau khi troàng (caáy) soá laù ôû caùc coâng thöùc töông ñöông nhau, ñaït 4,23 laù/caây (ÑC), 4,75 laù/caây (CP A2). Ñaây laø giai ñoaïn phuïc hoài sau khi caáy, caây chöa huùt ñöôïc dinh döôõng nhieàu. Soá laù/caây gia taêng maïnh meõ vaøo giai ñoaïn 15 ngaøy sau khi troàng vaø ñaït soá löôïng toái ña ôû giai ñoaïn 25 ngaøy sau khi troàng. Khi soá laù/caây ñaït toái ña, caây boùn CP A2 coù soá laù/caây taêng 61,06%, caây boùn CP A3 coù soá laù/caây taêng 54,65% so vôùi ÑC. Š AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân chieàu cao caây caûi thìa Song song vôùi vieäc ñeám soá laù, chuùng toâi ghi nhaän chieàu cao cuûa 5 caây/loâ ñöôïc ñaùnh daáu ôû caùc thôøi gian 5, 10, 15, 20, 25 ngaøy. Keát quaû ñöôïc ghi nhaän trong baûng 3.22. 2 3 101 Baûng 3.22. Chieàu cao trung bình cuûa caây caûi thìa (cm/caây) Cheá phaåm Thôøi gian(ngaøy) Ñoái chöùng (100% - PL) A2 (% so ÑC – PL) A3 (% so ÑC – PL) CV% - LSD 5 8,58 a 8,85 103,15% a 8,57 99,88% a 3,55 0,70 10 8,74 b 9,49 108,58% a 8,95 102,40% b 1,72 0,35 15 9,43 b 11,45 121,42% a 11,13 118,03% a 4,09 0,99 20 10,31 b 13,72 133,07% a 13,66 132,49% a 3,77 1,07 25 11,12 b 16,51 148,47% a 16,24 146,04% a 1,31 0,43 Ghi chuù : Trong cuøng moät haøng, nhöõng giaù trò trung bình coù cuøng moät chöõ caùi theo sau thì khoâng khaùc bieät coù yù nghóa ôû möùc xaùc suaát p = 0,05. 102 Ñoà thò 3.11. AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân chieàu cao caây caûi thìa (cm/caây) 0 5 10 15 20 5 10 15 20 25 Thôøi gian (ngaøy) C hi eàu c ao (c m ) ÑC A A Keát quaû thí nghieäm ñöôïc trình baøy trong baûng 3.22 vaø ñoà thò 3.11 cho thaáy, chieàu cao caây taêng daàn theo thôøi gian sinh tröôûng. Giai ñoaïn 5 ngaøy sau khi troàng (caáy) chieàu cao caây ôû caùc loâ thí nghieäm töông ñöông nhau, ñaït 8,57 cm/caây (CP A3), 8,85 cm/caây (CP A2). Ñaây laø giai ñoaïn phuïc hoài sau khi caáy, caây chöa huùt ñöôïc dinh döôõng nhieàu. Töø giai ñoaïn 15 ngaøy sau khi troàng (caáy) caây sinh tröôûng nhanh vaø ñaït chieàu cao toái ña ôû giai ñoaïn 25 ngaøy sau khi troàng. Khi chieàu cao caây ñaït toái ña, caây boùn CP A2 coù chieàu cao taêng 48,47%, caây boùn CP A3 coù chieàu cao taêng 46,04% so vôùi ÑC. Š AÛnh höôûng cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh” treân caây caûi thìa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch Vaøo thôøi ñieåm 28 ngaøy sau khi caáy, tieán haønh ño chieàu cao, ñeám soá laù, caân troïng löôïng cuûa 5 caây/loâ vaø tính naêng suaát treân 1m2. Keát quaû ghi nhaän ôû baûng 3.23. 2 3 103 Baûng 3.23. Giaù trò trung bình caùc löôïng giaù caây caûi thìa vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch Cheá phaåm Chæ tieâu Ñoái chöùng (100% - PL) A2 (% so ÑC – PL) A3 (% so ÑC – PL) CV% - LSD Chieàu cao (cm) 11,18 c 16,92 151,34% a 16,42 146,87% b 2,15 0,72 Soá laù (laù) 8,29 b 13,36 161,16% a 12,92 155,85% a 3,38 0,88 Troïng löôïng caây (g) 10,23 b 16,27 159,04% a 15,77 154,15% a 4,35 1,39 Naêng suaát (kg/m2) 0,92 b 1,46 158,70% a 1,42 154,35% a 5,31 0,15 Chieàu cao caây laø moät trong nhöõng yeáu toá caáu thaønh naêng suaát quan troïng. Keát quaû thí nghieäm ôû baûng 3.23 cho thaáy, vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch, chieàu cao caây taêng 51,34% (CP A2), 46,87% (CP A3) so vôùi ñoái chöùng. Laù laø boä phaäân quan troïng cuûa caây vaø laø yeáu toá caáu thaønh naêng suaát, vì vaäy naêng suaát cao hay thaáp phuï thuoäc raát nhieàu vaøo yeáu toá naøy. Soá lieäu ôû baûng 3.23 cho thaáy vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch, soá laù/caây taêng 61,16% (CP A2), 55,85% (CP A3) so vôùi ñoái chöùng. Troïng löôïng caây laø yeáu toá quan troïng, aûnh höôûng tröïc tieáp ñeán naêng suaát caây troàng. Soá lieäu thoáng keâ ôû baûng 3.23 cho thaáy coù söï thay ñoåi veà troïng löôïng caây giöõa caùc loâ thí nghieäm. Vaøo thôøi ñieåm thu hoaïch, troïng löôïng caây taêng 59,04% (CP A2), 54,15% (CP A3) so vôùi ñoái chöùng. 104 Söï sinh tröôûng vaø phaùt trieån cuûa caây troàng laø cô sôû ñaùnh giaù söï thích nghi cuûa caây troàng ñoái vôùi ñaát ñai vaø caùc bieän phaùp kyõ thuaät taùc ñoäng. Do ñoù, naêng suaát caây troàng laø chæ tieâu quan troïng nhaát ñeå ñaùnh giaù hieäu quaû cuûa caùc bieän phaùp kyõ thuaät taùc ñoäng nhö phaân boùn, gioáng… Keát quaû ôû baûng 3.23 cho thaáy naêng suaát rau taêng 58,7% (CP A2), 54,35% (CP A3) so vôùi ñoái chöùng. Keát quaû phaân laäp laïi ñaát chæ thaáy daïng khuaån laïc A2 vaø A3 vôùi soá löôïng nhieàu trong caùc loâ gaây nhieãm. Nhö vaäy, khi söû duïng caùc “cheá phaåm” A2 vaø A3 giuùp taêng chieàu cao, taêng soá laù, taêng troïng löôïng caây vaø chính nhôø theá taêng naêng suaát caây troàng. 105 CHÖÔNG 4 KEÁT LUAÄN VAØ ÑEÀ NGHÒ 106 ™ Keát luaän 1/ Phaân laäp - Ñaõ phaân laäp vaø tuyeån choïn ñöôïc hai chuûng vi khuaån Azospirillum coù khaû naêng coá ñònh ñaïm vaø sinh IAA toát, kyù hieäu laø A2 vaø A3. Söû duïng hai chuûng naøy ñeå nghieân cöùu. 2/ Ñaëc tính sinh lyù, sinh hoùa - Coù khaû naêng di ñoäng maïnh, hình que, Gram aâm, - Kích thöôùc A2 : (2,52 – 2,87) μm × (0,69 – 1,38) μm. A3 : (2,18 – 2,56) μm × (0,61 – 0,98) μm. - Thôøi gian sinh tröôûng toái öu cuûa A2 vaø A3 : 48giôø. - Nhieät ñoä thích hôïp : A2 (40oC), A3 (35oC). - pH thích hôïp : pH=6,8. - Trong moâi tröôøng voâ ñaïm A2 söû duïng glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose vaø malat, khoâng söû duïng ñöôïc dextrin ; A3 söû duïng caùc nguoàn carbon glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, malat vaø dextrin. Trong moâi tröôøng dinh döôõng A2 vaø A3 söû duïng glucose, galactose, saccharose, maltose, lactose, dextrin vaø khoâng söû duïng ñöôïc lactose. - A2 vaø A3 coù khaû naêng khöû nitrate thaønh nitrite. 3/ Taïo vaø thöû nghieäm cheá phaåm “phaân vi sinh” - Thöû nghieäm dòch nuoâi caáy vi khuaån treân : Š Caây luùa trong oáng nghieäm : coù theå keát hôïp giöõa ½ ñaïm trong moâi tröôøng MS vaø löôïng vi khuaån (0,5*107CFU/ml) seõ giuùp caây sinh tröôûng vaø phaùt trieån toát, ít toán keùm. Š Caây luùa trong chaäu (söû duïng ñaát ñeâ bao thuoäc huyeän Chôï Môùi, tænh An Giang) : khi boùn ½ löôïng phaân ñaïm keát hôïp vôùi maät ñoä vi khuaån khoaûng 0,5*107CFU/ml keát quaû laø chieàu cao caây, soá nhaùnh, soá löôïng vaø troïng löôïng haït 107 chaéc taêng, maëc daàu soá boâng khoâng taêng nhöng laøm giaûm soá löôïng vaø troïng löôïng haït leùp. Š Caây luùa ngoaøi ruoäng (ñöôïc troàng treân ñaát ñeâ bao thuoäc huyeän Chôï Môùi, tænh An Giang) : khi giaûm ½ löôïng ñaïm ôû laàn boùn phaân ñaàu tieân keát hôïp vôùi dòch nuoâi caáy vi khuaån khoaûng 0,5*107CFU/ml keát quaû laø taêng chieàu cao, taêng söï phaân nhaùnh, soá boâng khoâng taêng nhöng soá löôïng vaø troïng löôïng haït chaéc taêng, ñoàng thôøi soá löôïng vaø troïng löôïng haït leùp giaûm ñi daãn ñeán taêng naêng suaát luùa treân caùc loâ 1, 2 vaø 3. - Böôùc ñaàu taïo cheá phaåm “phaân vi sinh” cho hai chuûng : ‚ A2 : 2,4% NH3, ñoä aåm 50% (söû duïng moâi tröôøng MT3), 40oC, 48giôø. ‚ A3 : 2,4% NH3, ñoä aåm 50% (söû duïng moâi tröôøng MT3), 35oC, 48giôø. - Thöû nghieäm cheá phaåm “phaân vi sinh” treân : Š Caây luùa trong chaäu (söû duïng ñaát ñeâ bao thuoäc huyeän Chôï Môùi, tænh An Giang) : khi boùn 10g cheá phaåm/chaäu thu ñöôïc söï gia taêng veà chieàu cao, soá nhaùnh, soá löôïng vaø troïng löôïng haït chaéc, soá boâng khoâng taêng nhöng giaûm soá löôïng vaø troïng löôïng haït leùp so vôùi ñoái chöùng. Š Caûi thìa (ñöôïc troàng treân ñaát xaùm thuoäc quaän Taân Bình, Tp Hoà Chí Minh) : boùn 50g cheá phaåm/m2 giuùp taêng chieàu cao, taêng soá laù, taêng troïng löôïng caây vaø chính nhôø theá taêng naêng suaát caây troàng so vôùi ñoái chöùng. ™ Ñeà nghò Töø nhöõng keát quaû nghieân cöùu ñaït ñöôïc, chuùng toâi xin ñeà nghò nghieân cöùu tieáp theo trong ñieàu kieän thôøi gian vaø thieát bò toát hôn. - Ñònh danh vi khuaån A2 vaø A3 ñeán möùc ñoä loaøi. - Tieáp tuïc phaân laäp Azospirillum treân caùc loaïi ñaát khaùc nhau ñeå choïn chuûng thích hôïp nhaèm öùng duïng cho vieäc saûn xuaát phaân vi sinh. 108 - Taùch chieát vaø thu IAA töø moâi tröôøng sinh toång hôïp do vi khuaån tieát ra nhaèm öùng duïng cho caây troàng. - Tìm hieåu chi tieát veà ñieàu kieän, thaønh phaàn moâi tröôøng ñeå thu sinh khoái nhieàu hôn nhaèm phuïc vuï cho vieäc saûn xuaát phaân vi sinh töø Azospirillum. - Laëp laïi thí nghieäm treân nhöõng neàn ñaát khaùc nhau, trong nhöõng muøa vuï khaùc nhau ñeå khaúng ñònh tính öu vieät cuûa cheá phaåm “phaân vi sinh”. - Xaùc ñònh thôøi gian baûo quaûn cheá phaåm. - Tieáp tuïc thöïc hieän moät soá thí nghieäm veà haøm löôïng chaát khoâ, chaát xô, ñöôøng toång soá, nitrate treân rau. 109 TAØI LIEÄU THAM KHAÛO Tieáng Vieät 1. Nguyeãn Thò Phöông Chi, Nguyeãn Ngoïc Duõng, Haø Thò Hoàng Thanh (1995), “Söû duïng Azospirillum ñeå saûn xuaát phaân vi sinh cho luùa”, Taïp chí sinh hoïc, 17 (1), tr. 30 -35. 2. Nguyeãn Laân Duõng vaø coäng söï (1976), Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu vi sinh vaät hoïc, 2, Nxb Khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi. 3. Nguyeãn Laân Duõng (1984), Vi sinh vaät ñaát vaø söï chuyeån hoùa caùc hôïp chaát carbon, nitô, Nxb Khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi. 4. Nguyeãn Laân Duõng (1992), Tìm hieåu veà coâng ngheä sinh hoïc, Nxb Giaùo duïc. 5. Nguyeãn Laân Duõng, Ñoaøn Vaên Möôïc, Nguyeãn Phuøng Tieán, Ñaëng Ñöùc Traïch, Phaïm Vaên Ty (1992), Moät soá phöông phaùp nghieân cöùu vi sinh vaät hoïc, Nxb Khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi. 6. Nguyeãn Laân Duõng, Nguyeãn Ñình Quyeán, Phaïm Vaên Ty (1998), Vi sinh vaät hoïc, Nxb Giaùo duïc. 7. Nguyeãn Maïnh Duõng (1997), Phaân vi sinh vaät Nhöõng nghieân cöùu vaø öùng duïng, 1, Nxb Khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi. 8. Nguyeãn Ngoïc Duõng, Nguyeãn Thò Phöông Chi, Haø Thò Hoàng Thanh, Lyù Kim Baèng (1991), “Khaû naêng coá ñònh nitô cuûa Azospirillum sp. trong ñieàu kieän hoäi sinh vôùi maàm haït luùa”, Taïp chí sinh hoïc, 13(3), tr 25-27. 9. Nguyeãn Ngoïc Duõng, Nguyeãn Thò Phöông Chi, Haø Thò Hoàng Thanh (1991), “Söï phaân boá cuûa moät soá nhoùm vi khuaån dò döôõng carbon coá ñònh nitô trong ñaát troàng luùa vaø reã luùa taïi moät soá vuøng ven Haø Noäi”, Taïp chí sinh hoïc, 17(2), tr 15-18. 10. Buøi Huy Ñaùp (1980), Caây luùa Vieät Nam, Nxb Khoa hoïc vaø kyõ thuaät, Haø Noäi. 110 11. Nguyeãn Thaønh Ñaït, Nguyeãn Duy Thaûo (1986), Vi sinh vaät hoïc, Nxb Giaùo duïc. 12. Nguyeãn Ngoïc Ñeä MS (1994), Giaùo trình caây luùa, Tuû saùch Ñaïi hoïc Caàn Thô, Caàn Thô. 13. Phaïm Thò AÙnh Hoàng (2003), Kyõ thuaät sinh hoùa, Nxb Ñaïi hoïc Quoác gia, Tp. Hoà Chí Minh. 14. Voõ Thò Baïch Mai (2004), Söï phaùt trieån choài vaø reã, Nxb Ñaïi hoïc Quoác gia, Tp Hoà Chí Minh. 15. Voõ Ñình Ngoä, Nguyeãn Sieâu Nhaân, Traàn Maïnh Trí (1997), Than buøn ôû Nam Vieät Nam vaø söû duïng than buøn trong noâng nghieäp, Nxb Noâng nghieäp, Tp. Hoà Chí Minh. 16. Mai Thaønh Phuïng (2004), Caåm nang canh taùc luùa ngaén ngaøy ôû Ñoàng baèng Soâng Cöûu Long. 17. Nguyeãn Vaên Uyeån vaø coäng söï (1994), Coâng ngheä sinh hoïc vaø moät soá öùng duïng ôû Vieät Nam, Nxb Noâng nghieäp. 18. Vuõ Vaên Vuï (1999), Sinh lyù thöïc vaät öùng duïng, Nxb Giaùo duïc. 19. Vuõ Höõu Yeâm (1995), Giaùo trình phaân boùn vaø caùch boùn phaân, Nxb Noâng nghieäp, Haø Noäi. Tieáng Anh 20. Axelehmann (1976),“The van urk-salkowski reagent–a senitive and specific chromogenic reagent for silica gel thin–layer chromatographic detection and indentification of indole derivatives”, Journal of chromatography, p. 267-276. 21. Barbara Eckert, Olmar Baller Weber, Gudrun Kirchkof, Andras Halbritter, Marion Stoffels and Harmann (2001), “Azospirillum doebereinerae sp. nov., a nitrogen fixing bacterium associated with the C4 – grass Miscanthus”, International Journal of Systemtic and Evolutionary Microbiology. 111 22. Bernard R.Glick, Jack J.Pasternak (1998), Molecular biotechnology. Principles and Application of Recombinant DNA, ASM Press, Washington D.C, 2nd ed. 23. John G. Holt, Noel R. Krieg, Peter H.A.Sneath, James T.Staley, Stanley T. Williams (1994), Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology, vol.1, 9th ed. 24. M. G. Murty and J. K. Ladha (1988),”Influence of Azospirillum inoculation on mineral uptake and growth of rice under hydroponic conditions”, Plant and soil 108, p 281-285. 25. Mohammad Pessarakli (1995), Handbook of plant and crop physiology, Mareel Dekker, Ine, New York. 26. N.V. Doronina, E.G.Ivanona and Yu.A.Trtsenko (2001), “ New evidence for the ability of methythesize auxins”, Microbiology, vol.71.no.1. 27. Okon,Y; K.Pulnik,Y (1987) , “Development and function of Azospirillum inoculated roots”, Soil and Fertilizer, vol 50 No.3, p.308. 28. Sivramiah Shantharam and Autar K. Mattoo (1997), “Enhancing biological nitrogen fixation : An appraisal of current and alternative technologies for N input into plants”, Plant and soil 194, p 205-216. 29. Yaacov Okon and Carlos A.Labandera, Gonzalez (1994), “Review. Agronomic applications of Azospirillum : An evaluation of 20 years worldwide field inoculation”, Soil biol. Biochem, Vol. 26, No.12. 30. Y. Okon and Y. Kapulnik (1986), “Development and function of Azospirillum- inoculated roots”, Plant and soil 90, p 3-16. 112 ._.