Khảo sát khả năng tổng hợp Amylase từ Aspergillus oryzae khi bổ sung muối cảm ứng

ng nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD ii CẢM TẠ Để đạt được kết quả học tập sau năm năm học tập và hoàn thành đề tài tốt nghiệp, em chân thành cảm ơn đến: Thầy Lý Nguyễn Bình, người trực tiếp hướng dẫn đề tài, đã tận tình góp ý, giúp đỡ và cung cấp những tài liệu cần thiết cho em trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Quý thầy cô của trường Đại Học Cần Thơ, đặc biệt là thầy cô trong Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tận trình giảng dạy và truyền đạt cho em những kiến thức cũng như những kinh nghiệm quí báu trong suốt quá trình học tập tại trường. Thầy cô, anh chị phòng thí nghiệm của Bộ môn Công nghệ Thực phẩm đã tạo cho em điều kiện thuận lợi để hoàn thành đề tài nghiên cứu của em. Trong đó, các bạn cùng lớp Công Nghệ Thực Phẩm đã giúp đỡ, góp ý chân thành trong suốt quá trình học tập cũng như hoàn thành đề tài này Sinh viên thực hiện Trần Tuyển Quang Phúc Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD iii TÓM LƯỢC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU Mục đích của đề tài “Khảo sát khả năng tổng hợp amylase từ Aspergillus oryzae khi bổ sung muối cảm ứng” là tìm ra những điều kiện tốt nhất để sản xuất được enzyme amylase có hoạt tính sinh học cao từ chủng nấm Aspergillus oryzae. Các yếu tố được khảo sát bao gồm: - Nhiệt độ: 25, 30, 35oC - Thời gian nuôi: 30, 40, 50, 55 giờ - Độ ẩm của môi trường nuôi: 55, 60, 65% - pH của môi trường: 4,5, 5,0, 5,5 - Thành phần môi trường: Cám, trấu, và các loại bột bổ sung (bột gạo, bột bắp, bột năng) Các chất cảm ứng ở những nồng độ khác nhau (0,15, 0,3, 0,45) bao gồm: NaNO3, NH4NO3, (NH4)2SO4, KNO3, NH4K2SO4, Mg(NO3)2. Kết quả nghiên cứu cho thấy các điều kiện tối ưu để tổng hợp nên amylase có hoạt tính cao: - Nhiệt độ: 30oC - Thời gian nuôi: 50 giờ - Độ ẩm của môi trường 55% - pH: 5,0 (Kết quả trên được chị Chiêm Thị Bích Vân khoá 28 thực hiện) Qua kết quả nghiên cứu cho thấykhả năng tổng hợp amylase của nấm mốc Asperillus oryzae có tăng thêm khi bổ sung một số muối cảm ứng. Sự gia tăng này phụ thuộc vào từng loại muối và ở mỗi nồng độ khác nhau thì khả năng tổng hợpcủa nấm mốc là khác nhau. Cụ thể là: NaNO3 ở nồng độ 0,3% giúp tổng hợp amylase nhiều hơn so với điều kiện chuẩn, khả năng tổng hợp của nấm mốc cao nhất là ở nồng độ 0,45% của muối NH4NO3. Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD iv MỤC LỤC CẢM TẠ ........................................................................................................... ii TÓM LƯỢC NỘI DUNG NGHIÊN CỨU ..................................................... iii MỤC LỤC........................................................................................................ iv DANH SÁCH BẢNG....................................................................................... vi DANH SÁCH HÌNH....................................................................................... vii CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ...............................................................................1 1.1 Đặt vấn đề ..................................................................................................1 1.2 Mục đích nghiên cứu..................................................................................2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU..........................................................3 2.1 Giới thiệu chung.........................................................................................3 2.1.1 Nấm mốc Aspergillus oryzae ...............................................................3 2.1.2 Enzyme amylase..................................................................................5 2.2 Cơ chế tác động của enzyme ......................................................................9 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme ....................................10 2.3.1 Nồng độ cơ chất.................................................................................10 2.3.2 Nồng độ enzyme................................................................................11 2.3.3 Nhiệt độ.............................................................................................12 2.3.4 pH môi trường ...................................................................................12 2.3.5 Các chất kìm hãm ..............................................................................13 2.4 Các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp amylase ..............15 2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng..............................................15 2.4.2 Ảnh hưởng của axid amin ..................................................................16 2.4.3 Ảnh hưởng của nguồn khoáng dinh dưỡng ........................................17 2.4.4 Ảnh hưởng của pH nguyên liệu .........................................................18 2.4.5 Ảnh hưởng của độ ẩm môi trường nuôi cấy...........................................18 2.5 Phương pháp nuôi ....................................................................................19 Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD v 2.5.1 Cách tiến hành...................................................................................19 2.5.2 Phương pháp nuôi cấy .......................................................................20 2.5.3 Thu nhận enzyme chế phẩm...............................................................22 2.6 Ứng dụng của enzyme amylase ................................................................22 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU.......25 3.1 Dụng cụ và hóa chất .................................................................................25 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ THẢO LUẬN .......................................................29 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ......................................................34 5.1 Kết luận ...................................................................................................34 5.2 Đề nghị ....................................................................................................35 TÀI LIỆU THAM KHẢO...............................................................................36 PHỤ LỤC A.................................................................................................... vii PHỤ LỤC B .................................................................................................... xii Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD vi DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Một số vi sinh vật để sản xuất enzyme amylase ......................................4 Bảng 2. Đặc tính enzyme của nấm mốc và vi khuẩn ............................................6 Bảng 3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ tới sinh tổng hợp amylase ..........................16 Bảng 4. Ảnh hưởng của pH đến sinh tổng hợp amylase .....................................18 Bảng 5. Ảnh hưởng độ ẩm của môi trường tới hoạt độ enzyme amylase ............19 Bảng 6. Hoạt tính của amylase ở điều kiện đối chứng (đv/g) .............................29 Bảng 7. Kết quả thống kê ảnh hưởng của các loại muối bổ sung đến hoạt tính riêng của α-amylase ..........................................................................................29 Bảng 8. Kết quả thống kê hoạt tính riêng của glucoamylase khi bổ sung các loại muối ..................................................................................................................30 Bảng 9. Hoạt tính của α-amylase tổng khi bổ sung các loại muối ......................31 Bảng10. Hoạt tính của glucoamylase tổng khi bổ sung các loại muối ................32 Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD vii DANH SÁCH HÌNH Hình 1. Nấm mốc Aspergillusoryzae và bào tử ....................................................3 Hình 2. Vị trí cắt mạch tinh bột của α- amylase...................................................6 Hình 3. Giới hạn cắt của β- amylase ....................................................................7 Hình 4. Vị trí cắt của glucoamylase .....................................................................8 Hình 5. Cơ chế hoạt động của enzyme amylase ...................................................9 Hình 6. Cơ chế tác dụng của enzyme .................................................................10 Hình 7. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất tới hoạt động enzyme................................11 Hình 8. Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng.................................11 Hình 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng .......................................12 Hình 10. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme ...............................................13 Hình 11. Ảnh hưởng của chất hoạt hoá đến hoạt động enzyme ..........................15 Hình 12. Máy đông khô, Hình 13. Máy phân tích ẩm ........................................25 Hình 15. Máy đo pH, Hình 14.Thiết bị đo mật độ quang ...................................26 Hình 16. Tủ ủ ....................................................................................................26 Hình 17. Sơ đồ qui trình công nghệ tham khảo ..................................................27 Hình 18. Hoạt tính riêng của α-amylase khi bổ sung các loại muối....................30 Hình 19. Hoạt tính riêng của glucoamylase khi bổ sung các loại muối...............31 Hình 20. Hoạt tính của α-amylase tổng khi bổ sung các loại muối.....................32 Hình 21. Hoạt tính của glucoamylase tổng khi bổ sung các loại muối................33 Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 1 CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Enzyme là những chất xúc tác sinh học, tồn tại trong tất cả mọi cơ thể sống. Chúng là những chất xúc tác có tính đặc hiệu cao và hiệu lực xúc tác lớn. Do những ưu điểm trên mà enzyme được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như y học, dược phẩm, công nghệ thực phẩm, công nghiệp dệt, mỹ phẩm,… Nguồn enzyme kỹ nghệ thu được từ động vật, thực vật và vi sinh vật, trong đó vi sinh vật là nguồn nguyên liệu phong phú nhất cho việc tinh sản xuất enzyme. Tùy theo chủng vi sinh vật, phương pháp nuôi cấy, nguồn dinh dưỡng,…mà rất nhiều loại enzyme đã được sản xuất và sử dụng phục vụ cho nhu cầu của con người. Amylase là một trong những enzyme được sử dụng rộng rãi trong công nghệ thực phẩm, có thể được tìm thấy trong thực vật, động vật và vi sinh vật nhưng đặc tính xúc tác của mỗi loại là khác nhau, của mỗi nguồn là khác nhau và cách thu nhận enzyme cũng khác nhau. Amylase của mỗi loài vi sinh vật khác nhau thì đặc tính của chúng cũng khác nhau, vì vậy để nâng cao hiệu quả sử dụng enzyme thì loại enzyme đó phải có hiệu lực xúc tác lớn nhất, để có một enzyme có hiệu lực xúc tác lớn nhất thì phải phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố, trong đó yếu tố quan trọng nhất là nguồn chủ thể tạo ra enzyme. Hiện nay, người ta dùng nấm mốc để sản xuất enzyme trong đó Aspergillus oryzae là một trong những loài được sử dụng rộng rãi. Tuy nhiên, enzyme amylase còn được tổng hợp từ: động vật, thực vật và vi sinh vật khác. Do nấm mốc có nhiều ưu điểm hơn các loại khác nên được chọn là vi sinh vật hàng đầu trong việc tổng hợp nên amylase. • Tốc độ sinh sản rất mạnh • Nguồn enzyme thu được có hoạt tính rất cao • Thích hợp cho sản xuất công nghiệp • Nguồn nguyên liệu rẻ tiền và dễ kiếm • Có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 2 1.2 Mục đích nghiên cứu Mục đích chung: Hoàn thiện qui trình sản xuất amylase từ kết quả của luận văn năm trước. Mục tiêu: • Bổ sung các chất cảm ứng để nâng cao hiệu quả sản xuất amylase. • Nuôi cấy nấm mốc Aspergillus oryzae để tổng hợp amylase trên các môi trường khác nhau để thu được enzyme có hoạt tính cao nhất. • Môi trường nuôi cấy với sự thay đổi của các thành phần và điều kiện nuôi • Có thể tổng hợp cùng một lúc nhiều loại enzyme khác nhau Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 3 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung 2.1.1 Nấm mốc Aspergillus oryzae Nấm mốc hay còn gọi là nấm sợi (molds, moulds) thuộc loại thực vật hạ đẳng, có bào tử, không có diệp lục tố, không có khả năng tổng hợp chất hữu cơ từ khí CO2 mà sử dụng trực tiếp các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để phát triển và đảm bảo hoạt động bình thường. Chúng phát triển trên thực phẩm, trên giầy dép, trên quần áo, trên dụng cụ, vật liệu. Chúng phát triển rất nhanh trên nhiều nguồn cơ chất hữu cơ khi gặp khí hậu nóng ẩm. Aspergillus oryzae có cấu tạo hình sợi phân nhánh, những sợi này sinh trưởng ở đỉnh và phát triển rất nhanh, tạo thành một đám chằng chịt các sợi, từng sợi được gọi là các khuẩn ti hay sợi nấm; còn cả đám sợi được gọi là khuẩn ti thể hay hệ sợi nấm. Aspergillus oryzae phân bố rộng rãi trong tự nhiên: đất, nước, không khí, nguyên vật liệu, lương thực, thực phẩm… Aspergillus oryzae hoàn toàn hiếu khí chúng chỉ phát triển được trong điều kiện hoàn toàn thoáng khí và chúng không di chuyển được. Aspergillus oryzae cũng như một số nấm mốc khác hay các tế bào động thực vật đều có khả năng tổng hợp amylase nhưng mức độ tổng hợp amylase ở từng loài khác nhau hoàn toàn. (www.biochem.szote.Uszeged.hm) Hình 1. Nấm mốc Aspergillusoryzae và bào tử Amylase tổng hợp từ Aspergillus oryzae có hoạt lực cao hơn so với amylase sản xuất từ nấm mốc khác cũng như các vi khuẩn. Amylase của các chủ thể khác Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 4 nhau thì khả năng chịu nhiệt và axid của chúng cũng khác nhau. Một số vi sinh vật được sử dụng phổ biến để sản xuất enzyme amylase được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Một số vi sinh vật để sản xuất enzyme amylase STT Vi sinh vật Enzyme pH tối thích Nhiệt độ tối ưu (oC) α-amylase 4,5-6,2 40 β-amylase 3,5-7,0 50 1 Asp.awamori γ- amylase 4,5-4,7 55-75 α-amylase 4,7-6,0 65 2 Asp.niger γ- amylase 3,8 50 α-amylase 3,8 50 3 Asp.usami γ- amylase 5,0 55 α-amylase 5,5-5,9 50-70 β-amylase 4,8 30 4 Asp.oryzae γ- amylase 4,8 50 5 Bacillus amilolique faciens α-amylase 5,7-6,0 55-60 6 Bac.diastaticus α-amylase 5,8 70 7 Bac.subtilis α-amylase 4,6-5,1 37 8 Endomyces sp γ- amylase 4,8 55 9 Phizopus delamar γ- amylase 5,5 45 (Nguyễn Đức Lượng và ctv,2002) Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 5 2.1.2 Enzyme amylase Enzyme là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, hòa tan trong nước và dung dịch muối loãng, enzyme có phân tử lượng lớn từ 20kDa - 1.000kDa nên không qua được màng bán thấm. Tất cả các yếu tố làm biến tính protein như acid, kiềm đặc, muối của kim loại nặng… đều có thể làm enzyme bị biến tính và mất hoạt tính xúc tác. Enzyme amylase thuộc loại hydrolase, chỉ chứa những phân tử protein thuần, nghĩa là sản phẩm phân giải của enzyme này hoàn toàn chỉ gồm những acid amin. Vì vậy chúng thuộc enzyme đơn giản. Amylase xúc tác thủy phân tinh bột, được sử dụng nhiều nhất trong lĩnh vực đường hóa trong thực phẩm. Thủy phân tinh bột trước tiên cho những polymer mạch ngắn gọi là dextrin sau đó thành maltose và cuối cùng thành glucose. Các enzyme trong lĩnh vực đường hóa tinh bột là α-amylase, β-amylase, γ-amylase, glucose isomerase… Amylase được tổng hợp bằng con đường sinh học, chúng không thể tổng hợp bằng con đường hóa học. Do đó muốn thu nhận amylase chỉ có con đường là thu nhận từ cơ thể sinh vật hay nói cách khác là bằng con đường sinh tổng hợp. Hoạt tính enzyme amylase sinh ra từ nấm mốc và vi khuẩn là tương đương nhau nhưng khả năng đường hóa của enzyme nấm mốc tốt hơn enzyme của vi khuẩn, ngược lại khả năng dịch hóa (tạo dextrin) của enzyme vi khuẩn lại cao hơn của enzyme nấm mốc. Enzyme có nhiều tính chất ưu việt hơn hẳn các chất xúc tác hóa học do có tính đặc hiệu cao và hiệu lực xúc tác lớn. α-amylase (EC 3.2.1.1) α-amylase (1,4- α-glucanohydrolase) là enzyme nội phân thủy phân liên kết α- 1,4-glucoside của cơ chất một cách ngẫu nhiên, α-amylase không chỉ có khả năng thủy phân tinh bột mà còn có khả năng thủy phân những hạt tinh bột còn nguyên vẹn. α-amylase của nấm mốc và vi khuẩn có nhiều đặc tính khác nhau như pH tối ưu của α-amylase nấm mốc là 4,7 - 4,9 còn của α-amylase vi khuẩn là 5,9 - 6,1. Nhiệt độ tối ưu của α-amylase nấm mốc là 55 - 66oC và khả năng chịu nhiệt là 70oC trong khi đó α-amylase vi khuẩn là 60 -75oC và khả năng chịu nhiệt là 90oC. Trong phân tử α-amylase có ít nhất một ion Ca2+ có tác dụng làm bền cấu trúc bậc 2,3 của phân tử enzyme. α-amylase sẽ hoàn toàn mất hết khả năng thủy phân Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 6 cơ chất nếu bị loại bỏ ion này. α-amylase được hoạt hóa bởi ion đơn hóa trị (như: Cl->Br->I-) nếu có nguồn gốc từ động vật và vi sinh vật. Nếu có nguồn gốc thực vật thì được hoạt hóa bởi ion hóa trị II. Chúng bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như Cu2+, Hg2+… Hình 2. Vị trí cắt mạch tinh bột của α- amylase Enzyme α-amylase được tổng hợp từ những nguồn chủ yếu sau: • Từ vi khuẩn: Bacillus subtilis, B.cereus, B.amyloliquefacciens, B.polymyxa, B.stearothermophilus, B.caldolyticus, B.acidocadorius, Lactobacillus, Micrococus, Pseudomonas, Proteus… • Từ các loại nấm mốc: Aspergillus oryzae, Penicillium sp, Mucor sp, Candida sp, Neurospora sp, Rhizopus sp. Enzyme α-amylase được thu nhận từ nấm mốc (Asp.oryzae là chủ yếu) và từ vi khuẩn (Bacillus subtilis là chủ yếu), hai nguồn enzyme này có những đặc tính rất khác nhau, những đặc tính có thể tóm tắt trong bảng 2. Bảng 2. Đặc tính enzyme của nấm mốc và vi khuẩn Đặc tính α-amylase nấm mốc α-amylase vi khuẩn pH tối ưu 4,7-4,9 5,9-6,1 Nhiệt độ tối ưu 55-66oC 56-75oC Khả năng chịu nhiệt 70oC 90oC Khả năng thủy phân Khả năng đường hóa cao (80- 82%) tinh bột được chuyển hóa thành maltose) Khả năng dextrin hóa cao Lượng calcium trong cấu trúc enzyme Ít Nhiều (Nguyễn Đức Lượng, 2000) Tinh bột với liên kết α-1,4 glycoside Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 7 β-amylase (EC 3.2.1.2) β-amylase (α-1,4 glucan-maltohydrolase) là enzyme ngoại phân, tiến trình phân giải bắt đầu từ đầu không khử của các nhánh ngoài cùng của cơ chất. β-amylase cắt liên kết α-1,4 glycoside nhưng khi gặp liên kết α-1,4 glycoside đứng kế cận α-1,6 glycoside thì nó ngừng tác dụng. Hình 3. Giới hạn cắt của β- amylase β-amylase là một loại albumin. Tâm xúc tác của nó chứa gốc –SH, -COOH cùng với vòng imidazol của gốc histidin. β-amylase chỉ phổ biến trong thực vật, đặc biệt có nhiều trong hạt nảy mầm. β- amylase rất bền khi không có ion Ca2+, bị kìm hãm bởi ion kim loại nặng như: Cu2+, Hg2+ và các loại urê, iod, ozon… β-amylase của vi khuẩn bền nhiệt hơn các β-amylase của thực vật (>70oC) và pH tối ưu cũng cao hơn (pH>7). Ngược lại với α-amylase, β-amylase của vi khuẩn không cần calcium để ổn định hoạt tính. Một số vi sinh vật để tổng hợp enzyme β-amylase: • Từ các loại vi khuẩn: Bacillus polymyxa, B.cereus, B.megaterium, Streptomyces, Pseudomonas sp. • Từ nấm mốc: Rhizopus lapanicus. Amylopectin với liên kết α-1,4 v à α-1,6 glucoside Giới hạn cắt của β- amylase Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 8 Glucoamylase (EC 3.2.1.3) Glucoamylase (α-1,4 glucan-glucohydrolase) không chỉ có khả năng phân cắt liên kết α-1,4 glycoside mà còn phân cắt được các nối α-1,6 glycoside. Khi thủy phân liên kết α-1,4 glycoside trong chuỗi polysaccharid, glucoamylase tách lần lượt từng phân tử glucose ra khỏi đầu không khử của mạch để tạo thành glucose. Chúng không thủy phân được các dextrin vòng. Đa số glucoamylase có hoạt lực cao nhất ở vùng pH 3,5 - 5,5 và nhiệt độ 50oC, glucoamylase bền axid hơn β-amylase nhưng kém bền hơn trong rượu, acetone và không bền với kim loại nặng Cu2+, Hg2+… Các vi sinh vật dùng để sản xuất glucoamylase là: Aspergillus oryzae, Asp.niger, Asp.awamori,… các chủng sản xuất glucoamylase ở Tây Âu và ở Mỹ là các biến chủng của Asp.niger và Rhizopus niveus. Hiện nay công nghiệp sản xuất glucoamylase thực hiện chủ yếu trong thiết bị lên men chiều sâu dung tích trên 150 m3. Hình 4. Vị trí cắt của glucoamylase Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 9 Hình 5. Cơ chế hoạt động của enzyme amylase 2.2 Cơ chế tác động của enzyme Bản chất của cơ chế tác dụng bởi enzyme trong các phản ứng hóa học là khả năng hoạt hóa cơ chất để các cơ chất tham gia phản ứng mạnh hơn. Theo đó, cơ chất tương tác với enzyme do sự cực hóa, sự chuyển dịch của các electron, sự biến dạng các liên kết. Từ đó làm thay đổi động năng, thế năng dẫn đến cơ chất dễ dàng tham gia phản ứng hơn. Điểm đặc biệt là khi có enzyme tham gia xúc tác, thì năng lượng cần cho phản ứng nhỏ hơn khi không có enzyme và cũng nhỏ hơn so với các phản ứng được xúc tác bởi các chất xúc tác khác. Quá trình xúc tác xảy ra ba giai đoạn: - Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 10 Hình 6. Cơ chế tác dụng của enzyme E + S
ES
P + E Trong đó: E: Enzyme S: Cơ chất P: Sản phẩm Ở giai đoạn thứ nhất: Enzyme sẽ kết hợp với cơ chất bằng liên kết yếu. Kết quả là tạo thành phức hợp dạng ES, phức hợp này không bền. Phản ứng xảy ra rất nhanh và đòi hỏi một ít năng lượng. Ở giai đoạn thứ hai: Cơ chất bị biến đổi, dẫn đến làm căng và phá vở các liên kết đồng hóa trị. Ở giai đoạn thứ ba: Sản phẩm được tạo thành, enzyme được giải phóng và trở lại trạng thái tự do. Liên kết giữa E và S để tạo thành phức ES là liên kết hydro, tương tác tĩnh điện, tương tác Vanderwaals. 2.3 Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt động của enzyme 2.3.1 Nồng độ cơ chất Như phần cơ chế tác dụng của enzyme tham gia sẽ xảy ra ba giai đoạn: Giai đoạn đầu: Enzyme sẽ tương tác với cơ chất tạo thành phức hợp ES. Ở giai đoạn này, nếu nồng độ cơ chất thấp thì tốc độ phản ứng (V) phụ thuộc tuyến tính với nồng độ cơ chất. Giai đoạn hai: Phức hợp ES sẽ tách ra, tốc độ phản ứng cực đại và nó hoàn toàn không phụ thuộc vào nồng độ cơ chất. Phức hợp ES Cơ chất Enzyme Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 11 Giai đoạn ba: Enzyme sẽ được giải phóng và hoạt động tự do. Hình 7. Ảnh hưởng nồng độ cơ chất tới hoạt động enzyme 2.3.2 Nồng độ enzyme Trong trường hợp thừa cơ chất, nồng độ enzyme tăng sẽ làm tăng tốc độ phản ứng. Sự tăng tốc độ phản ứng trong tế bào sinh vật lại phụ thuộc rất nhiều vào khả năng điều hòa của gene. Nhìn chung tốc độ phản ứng phụ thuộc vào tuyến tính với lượng enzyme. Tốc độ phản ứng V = k[E] Trong đó: V: Tốc độ phản ứng [E]: Nồng độ enzyme k: Hằng số tốc độ phản ứng Hình 8. Ảnh hưởng nồng độ enzyme đến tốc độ phản ứng Nồng độ enzyme Hoạt độ enzyme Tốc độ phản ứng Nồng độ cơ chất Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 12 2.3.3 Nhiệt độ Bản chất của enzyme là protein. Do đó, nhiệt độ có ảnh hưởng rất lớn đến cấu trúc của chúng. Phần lớn enzyme bị mất hoàn toàn hoạt động ở 70oC, gọi là nhiệt độ tới hạn. Tuy nhiên một số enzyme của các vi khuẩn ưa nhiệt vẫn hoạt động ở 90oC hoặc cao hơn. Ở nhiệt độ tới hạn, enzyme bị biến tính ít khi được phục hồi trở lại. Tốc độ phản ứng của enzyme chỉ có thể tăng ở giới hạn nhiệt độ nào đó khi mà protein chưa bị phá vỡ cấu trúc. Đại lượng biểu thị cho ảnh hưởng của nhiệt độ tới tốc độ phản ứng của phản ứng enzyme là hệ số Q10. Hệ số này càng lớn, phản ứng càng khó xảy ra ở nhiệt độ thường. Hệ số Q10 của phản ứng enzyme là 1-2 Hệ số Q10 của phản ứng hóa học là 2-3 Từ hệ số Q10 có thể tính được năng lượng hoạt hóa của phản ứng enzyme. Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ đến vận tốc phản ứng của enzyme cho thấy nhiệt độ hoạt động thích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-50oC. Ở nhiệt độ thấp dưới 0oC, hoạt độ enzyme bị giảm nhiều, nhưng lại có thể được phục hồi khi đưa về nhiệt độ bình thường. Nhiệt độ ứng với vận tốc enzyme cực đại gọi là nhiệt độ tối thích. Mỗi enzyme có nhiệt độ tối thích khác nhau tùy thuộc vào nguồn gốc của chúng. Tuy nhiên ở một nhiệt độ giới hạn nào đó thì phản ứng sẽ chậm lại do sự biến tính dần protein của enzyme với nhiệt, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ thì enzyme không hoạt động nữa. Hình 9. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tốc độ phản ứng 2.3.4 pH môi trường Độ bền của phân tử enzyme cũng phụ thuộc vào trạng thái ion hóa của phân tử. Việc xác định độ bền pH của enzyme có ý nghĩa quan trọng trong quá trình thu nhận chế phẩm enzyme, tinh sạch và nghiên cứu enzyme. Để xác định độ bền pH Nhiệt độ (oC) Tốc độ phản ứng Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 13 của enzyme cần giữ enzyme trong các dung dịch đệm có pH khác nhau trong thời gian xác định, sau đó chỉnh về cùng pH giống nhau (pH thích hợp để xác định hoạt độ của nó) trước khi tiến hành xác định hoạt độ. pH môi trường thường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, enzyme và ảnh hưởng đến độ bền của protein enzyme. Do đó tốc độ của phản ứng enzyme sẽ tăng dần đến giá trị cực đại và sau đó sẽ giảm dần. Đa số enzyme bền ở pH từ 5 - 9. Độ bền sẽ tăng nếu có mặt của cơ chất và coenzyme hoặc Ca2+… Enzyme rất nhạy cảm với sự thay đổi của pH môi trường, mỗi enzyme chỉ hoạt động mạnh nhất ở một vùng pH xác định gọi là pH tối thích. pH tối thích của đa số enzyme nằm trong vùng axid yếu, kiềm yếu hay trung tính; chỉ có một số ít có pH tối thích trong vùng axid hay kiềm mạnh. Hình 10. Ảnh hưởng của pH tới hoạt độ enzyme 2.3.5 Các chất kìm hãm Trong các chất kìm hãm enzyme, một số chất như những ion kim loại, các chất vô cơ, hữu cơ… có khả năng kìm hãm tốc độ phản ứng của enzyme. Các chất này có thể kìm hãm thuận nghịch hay không thuận nghịch. Phản ứng enzyme (E) và các chất kìm hãm (I) nhanh chóng đạt đến cân bằng: Trong đó: K1, K-1: Hằng số tốc độ phản ứng Các chất kìm hãm cạnh tranh E + I EI K -1 K1 Hoạt độ enzyme Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 14 Các chất kìm hãm cạnh tranh có cấu trúc tương tự như cấu trúc của cơ chất. Do đó, chúng có khả năng kết hợp với trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là một số chỗ kết hợp cần thiết ở enzyme bị chất kìm hãm chiếm mất. Do đó cơ chất mất một phần khả năng tương tác, làm cho tốc độ phản ứng không tăng. Phản ứng cạnh tranh có thể biểu thị như sau: Các chất kìm hãm không cạnh tranh Kiểu cạnh tranh trên là hiện tượng chiếm đoạt trung tâm hoạt động trong cấu trúc enzyme, nhưng kiểu kìm hãm không cạnh tranh lại xảy ra hoàn toàn khác hẳn. Ở đây, chất kìm hãm sẽ kết hợp với enzyme ở vị trí không phải là trung tâm hoạt động của enzyme. Kết quả là chúng làm thay đổi cấu trúc không gian của phân tử enzyme. Như vậy phức hợp EI này sẽ làm thay đổi hướng không có lợi cho hoạt động xúc tác của enzyme. Sau khi kết hợp với chất kìm hãm để tạo thành phức hợp EI, chúng vẫn có khả năng kết hợp với cơ chất để tạo thành một phức hợp EIS như phản ứng sau: Kìm hãm bởi sản phẩm của phản ứng Các sản phẩm được tạo thành do các phản ứng enzyme tham gia có thể trở thành chất kìm hãm tốc độ của chính phản ứng đó. Thí dụ: nếu có một phản ứng kiểu: S1 + S2 = P1 + P2 Do tính thuận nghịch của phản ứng trên, các enzyme có ái lực với P1 và P2 tương đương với S1 và S2. Trong trường hợp như thế P1 + P2 được coi như chất kìm hãm với S1 và S2. Kìm hãm do thừa cơ chất Trong một số trường hợp cơ chất bị thừa lại trở thành chất kìm hãm phản ứng. Giả sử ta có phản ứng: E + I EI E + S ES E + P E + S = ES E + P E + I = EI ES + I = EIS EI + S = EIS E + S = ES E + P Luận văn tốt nghiệp khoá 29 - 2008 Trường Đại học Cần Thơ Ngành Công nghệ Thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp &SHƯD 15 Nếu có cơ chất thứ hai tham gia vào, và nó có khả năng dính vào một vị trí nào đó trên phức hệ ES (ngoài vùng xúc tác) làm cho chúng không hoạt động, khi đó phức hệ này được coi là chất kìm hãm. ES + S = ESS 2.3.6 Các chất hoạt hóa Các chất hoạt hóa enzyme có thể là các anion, các ion kim loại ở ô thứ 11 đến ô thứ 55 trong bảng tuần hoàn Mendeleev, các chất hữu cơ có cấu trúc phức tạp làm nhiệm vụ chuyển hóa hydro, các chất có khả năng phá vỡ một số liên kết trong phân tử tiền enzyme, các chất có khả năng phục hồi nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme. Hình 11. Ảnh hưởng của chất hoạt hoá đến hoạt động enzyme 2.4 Các yếu tố của môi trường ảnh hưởng đến sự tổng hợp amylase 2.4.1 Ảnh hưởng của nguồn nitơ dinh dưỡng Nitơ tham gia vào quá trình tạo protein, axid nucleic và nhiều chất có đặc tính sinh học khác của tế bào sinh vật. Trong môi trường lên men nitơ thường được bổ sung dưới dạng muối nitrate, các hợp chất amon hoặc một số hợp chất có nguồn gốc vi sinh vật. Cho nguồn nitơ nhất định vào môi trường có thể kích thích tổng hợp amylase này và ức chế tổng hợp amylase khác. Theo mức độ tiêu t._.