Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ TP.HCM

ợt qua mọi trở ngại, thách thức khác nhau. Bệnh tật chính là một trong số các trở ngại đĩ và rất nhiều bệnh cĩ nguyên nhân do vi sinh vật (VSV) gây ra. Từ rất xa xưa trong lịch sử, bằng con đường tìm tịi, khám phá và tích lũy kinh nghiệm thực tiễn, con người đã phát hiện và ứng dụng hiệu quả nhiều nguồn dược liệu vào mục đích điều trị y học. Với sự phát triển của VSV học, với bước ngoặt lịch sử là phát minh vĩ đại của Alexander Fleming (1928) đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học: khai sinh ra chất kháng sinh và ứng dụng chất kháng sinh vào điều trị cho con người. Chất kháng sinh (CKS) khơng những trở thành thần dược cứu sống con người mà cịn được ứng dụng rộng rãi trong trồng trọt, chăn nuơi, cơng nghiệp thực phẩm và bảo vệ mơi trường. Để phịng chống nấm hại cây trồng , trong nền nơng nghiệp hiện đại, người ta càng sử dụng nhiều CKS cĩ nguồn gốc VSV để thay thế dần các hĩa chất đã sử dụng vốn rất độc đối với con người và mơi trường. Vì vậy, việc thay thế thuốc trừ sâu hĩa học bằng các chế phẩm sinh học là một giải pháp an tồn và hiệu quả, khắc phục được nhược điểm của nơng dược trong bảo vệ thực vật và sức khỏe cộng đồng. Ở nước ta cũng như các nước đang phát triển việc lạm dụng thuốc KS, việc các VK gây bệnh ở người đang kháng nhiều loại KS thơng thường, ngày càng xuất hiện nhiều chủng VSV kháng thuốc nên việc điều trị bằng kháng sinh trở nên rất khĩ khăn cho các thầy thuốc lâm sàng.Việc tìm kiếm CKS mới nhất là các CKS cĩ nguồn gốc từ thiên nhiên, do các VSV tiết ra chống lại các VSV gây bệnh đã lờn thuốc đang thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học, đĩ là một việc làm vơ cùng cấp thiết và quan trọng. Trong quá trình tìm kiếm ấy con ngươi luơn quan tâm đến nhĩm VSV sinh CKS ở các hệ sinh thái đặc biệt, trong đĩ cĩ nấm sợi RNM. Các nhà khoa học tin rằng với mơi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của chúng cũng khác hơn so với với các sinh vật trên đất liền. Vì vậy các sản phẩm trao đổi chất cĩ tính chất khác lạ, trong đĩ sẽ cĩ các CKS mới. Tuy nhiên sự hiểu biết về VSV ở RNM cịn rất hạn chế và là lãnh vực cịn bỏ ngỏ. Nấm sợi là một đại diện quan trọng của hệ VSV RNM. Tìm hiểu về nấm sợi cĩ khả năng sinh KS, vai trị của chúng trong hệ sinh thái RNM là việc làm rất cần thiết. Đặc biệt đối với nấm sợi sinh KS thì việc nghiên cứu tìm ra chất kháng sinh mới đang là đề tài hấp dẫn thu hút sự quan tâm của nhiều nhà khoa học thuộc các lãnh vực khác nhau vì chất kháng sinh đã vuợt ra khỏi phạm vi y học. So với y học việc sử dụng chất kháng sinh sinh ra từ nấm sợi trong bảo vệ thực vật, bảo quản thực phẩm..v..v.. cịn hạn chế. Để gĩp phần nghiên cứu, tìm hiểu về giá trị tài nguyên từ nấm sợi ở RNM và tiềm năng của chúng trong thực tiễn, chúng tơi tiến hành nghiên cứu đề tài: “ Khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn huyện Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh”. 2. Lược sử vấn đề nghiên cứu - Chưa cĩ tác giả nào nghiên cứu "Nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ TPHCM cĩ khả năng sinh kháng sinh". - Cĩ một số đề tài nghiên cứu cĩ liên quan về nấm sợi ở RNM như: + “ Tổng kết kết quả nghiên cứu về tính đa dạng và vai trị của nhĩm nấm sợi phân lập từ một số RNM ở hai tỉnh Nam Định và Thái Bình” của tác giả Mai Thị Hằng (2002) + “ Khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm sợi phân lập từ một số khu RNM Nam Định và Thái Bình” của tác giả Mai Thị Hằng, Lê Thanh Huyền (2002). +“ Khảo sát khả năng ký sinh gây bệnh cơn trùng và tiềm năng kiểm sốt sinh học của nấm RNM Nam Định của tác giả Mai Thị Hằng, Nguyễn Vĩnh Hà (2002). 3. Mục đích nghiên cứu Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi cĩ khả năng sinh kháng sinh cĩ thể sử dụng vào ức chế VSV gây bệnh ở người, cây trồng. 4. Đối tượng nghiên cứu - Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM huyện Cần giờ cĩ hoạt tính kháng sinh. - Các VSV kiểm định nhận từ viện Pasteur, Viện khoa học Kĩ thuật Nơng nghiệp Miền Nam, khoa Nơng học Đại học Nơng Lâm TPHCM, khoa xét nghiệm Bệnh viện Bình Dân. - Sâu tơ nhận từ cơng ty Vipesco; tằm nhận từ cơng ty Dâu tằm tơ, Bảo lộc. 5. Phạm vi nghiên cứu Các chủng nấm sợi sinh kháng sinh cĩ nguồn gốc từ RNM. 6. Nhiệm vụ nghiên cứu - Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi cĩ khả năng kháng sinh từ RNM huyện Cần Giờ. - Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản của các chủng nấm sợi tuyển chọn (đặc điểm sinh học và phân loại) - Bước đầu tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn trong phịng và chống bệnh, sâu hại cho cây trồng 7. Phương pháp nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn các chủng nấm sợi bằng phương pháp vi sinh. - Nghiên cứu các đặc điểm cơ bản, phân loại các chủng nấm sợi bằng phương pháp hĩa sinh. - Xử lý số liệu thu thập bằng phương pháp sử dụng tốn học thống kê đơn giản. 8. Dự kiến cấu trúc luận văn Gồm: - Mở đầu - Chương 1: Tổng quan tài liệu. - Chương 2: Vật liệu và phương pháp nghiên cứu. - Chương 3: Kết quả và bàn luận. - Kết luận và kiến nghị. Thời gian thực hiện đề tài từ tháng 5 năm 2006 đến tháng 7 năm 2007. Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nấm sợi và khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi 1.1.1. Đặc điểm của nấm sợi [6]. Nấm sợi là những vi sinh vật cĩ nhân chuẩn thuộc nhĩm vi nấm, được phân bố khắp nơi như đất, nước, khơng khí, sản phẩm từ sinh vật, bản thân các sinh vật kể cả con người. Nấm sợi sống kí sinh ở động, thực vật hoặc hoại sinh trên chất hữu cơ từ xác động, thực vật, chúng là lồi hơ hấp hiếu khí bắt buộc, khơng chứa diệp lục tố, khơng cĩ khả năng quang hợp [13]. Nấm sợi là VSV ưa mát (Psychrotroph), cĩ nhiệt độ tối ưu khoảng 250C, nhưng cũng cĩ thể thích nghi với 00C. Nấm sợi sống trong mơi trường cĩ pH hơi axít đến trung tính (pH 3- 6). Mặc dù sự sinh trưởng của nấm sợi khơng cần ánh sáng nhưng ánh sáng lại cĩ tác dụng hình thành bào tử, tổng hợp sắc tố [8]. 1.1.1.1. Hình tháí, cấu tạo [54]. Nấm sợi cĩ cấu tạo sợi, phân nhánh hoặc khơng phân nhánh, cĩ vách ngăn ngang hoặc khơng cĩ vách ngăn ngang. Sợi nấm (hypha) cĩ dạng hình ống phân nhánh, bên trong chứa chất nguyên sinh cĩ thể lưu động. Về chiều dài chúng cĩ sự sinh trưởng vơ hạn (nhưng về đường kính thì thường chỉ thay đổi trong phạm vi 1- 30µm thơng thường là 5-10 µm). Sợi nấm chỉ tăng trưởng ở ngọn, vừa dài ra khơng ngừng phân nhánh và vì vậy khi một bào tử nẩy mầm trên một mơi trường đặc sẽ phát triển thành một hệ sợi nấm, sau 3-5 ngày cĩ thể tạo thành một đám nhìn thấy được gọi là khuẩn lạc (colony). Tùy theo mơi trường cơ chất mà hệ sợi nấm sẽ phát triển thành các dạng khác nhau. Vào giai đoạn cuối của sự phát triển, khuẩn lạc sẽ xảy ra sự kết mạng (anastomosis) giữa các khuẩn ty với nhau, làm cho cả khuẩn lạc là một hệ thống liên thơng mật thiết với nhau, thuận tiện cho việc vận chuyển chất dinh dưỡng đến tồn bộ hệ sợi nấm. Hiện tượng kết mạng thường gặp ở nấm bậc cao nhưng lại ít gặp ở các sợi nấm dinh dưỡng của nấm bậc thấp. Hình thái, kích thước màu sắc, bề mặt của khuẩn lạc…cĩ ý nghĩa nhất định trong việc định tên nấm. Hình 1.1.Sự phát triển của hệ sợi nấm [55]. Hình 1.2. Hình thái khuẩn lạc. Hình 1.3. Các loại sợi nấm [54] Hình 1.3. Các loại sợi nấm [54]. Đầu sợi nấm cĩ hình viên trụ, phần đầu gọi là vùng kéo dài (extension zone). Lúc sợi nấm sinh trưởng mạnh mẽ đây là vùng thành tế bào phát triển nhanh chĩng, vùng này cĩ thể dài đến 30 µm. Dưới phần này thành tế bào dày lên và khơng sinh trưởng thêm được nữa. Màng nguyên sinh chất thường bám sát vào thành tế bào. Trên màng nguyên sinh chất cĩ một số phần cĩ kết cấu gấp nếp hay xoăn lại, người ta gọi là biên thể màng (plasmalemmasome) hay biên thể (lomasome). Nhiều khi chúng cĩ tác dụng tiết xuất các chất nào đĩ. Các chất dự trữ thường gặp ở nấm là glicogen, hạt volutin, các giọt mỡ [51]. Nấm sợi chỉ mọc tốt trong mơi trường cĩ nhiều khơng khí, vì thế chúng phát triển trên bề mặt cơ chất (khuẩn ty khí sinh) tạo thành lớp hình sợi, lớp mạng nhện hay lớp sợi bơng. Một số sợi nấm sinh trưởng bằng cách đâm sâu vào cơ chất và hút chất dinh dưỡng (khuẩn ty cơ chất). Bên trong khuẩn ty cĩ một nhân, hai nhân hay nhiều nhân [9]. Vách ngăn Thành TB Sợi nấm cĩ vách ngăn Sợi nấm khơng vách ngăn Nhân Nhân TBC TBC Phần lớn sợi nấm cĩ dạng trong suốt, ở một số nấm, sợi nấm mang sắc tố tạo nên màu tối hay màu sặc sỡ. Sắc tố của một số nấm cịn tiết ra ngồi mơi trường và làm đổi màu khu vực cĩ nấm phát triển. Một số nấm cịn tiết ra các chất hữu cơ tạo nên các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc. Vì bào tử của nấm thường cĩ màu nên cả khuẩn lạc thường cĩ màu [54]. Nấm sợi cĩ cấu tạo của một tế bào cĩ nhân thực, gồm ba thành phần cơ bản của cơ thể sống: thành tế bào, nguyên sinh chất, nhân. Màng tế bào cĩ cấu tạo bởi cellulose hoặc các chất gần giống cellulose. Màng cĩ cấu trúc đặc trưng từng lồi. Khơng cĩ diệp lục nên nấm sợi khơng cĩ khả năng quang hợp. Trong tế bào nấm cịn cĩ các cơ quan như ty thể (mitochondrion), mạng nội chất (endoplasmic reticulum), dịch bào hay khơng bào (vacuolus), thể ribơxơm (ribosome), bào nang (vesicle), thể Golgi sinh (Golgi body, Golgi apparatus, dictyosome), các giọt lipid (lipid droplet), các tinh thể (chrystal) và các vi thể đường kính 0,5-1,5 nm (microbody), các thể Vơrơnin đường kính 0,2µm (Woronin body), thể Chitơxơm đường kính 40 -70nm (chitosome)… Ngồi ra trong tế bào chất cịn cĩ các vi quản rỗng ruột, đường kính 25nm (microtubule), các vi sợi đường kính 5- 8 nm (microfilament), các thể màng biên (plasmalemmasome). Hình 1.4. Cấu trúc sợi nấm [54]. Khơng bào Sợi nấm Vùng kéo dài Thể Golgi Màng Tế bào Thành Tế bào A. Nucleic Ti thể Màng nhân 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý, sinh hĩa. Nấm sợi là những sinh vật dinh dưỡng hĩa năng hữu cơ, thuộc loại hoại sinh. Để thực hiện các quá trình sinh lý khác nhau nấm sợi thường cĩ những nhu cầu khơng giống nhau về các nguồn thức ăn cacbon. Chúng cĩ thể sử dụng nhiều nguồn thức ăn khác nhau từ cacbonhydrat, amino acid đến amonia. Sự thích hợp của một nguồn gốc thức ăn cacbon nào đĩ cĩ thể được đánh giá bằng nhiều chỉ tiêu khác nhau như mức độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, mức độ hình thành tối đa số lượng bào tử, mức độ tích lũy tối đa các chất chuyển hĩa. Sự sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm thường khơng phù hợp với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất. Hầu hết các loại nấm sợi cĩ thể đồng hĩa trực tiếp mantose, lactose, melibiose, rỉ đường...[12]. Các lồi nấm sợi khác nhau cĩ thể cĩ nhu cầu khác nhau đối với nguồn thức ăn nitơ, chúng sử dụng cả nguồn nitơ hữu cơ lẫn vơ cơ. Nhiều lồi nấm sợi (thuộc các chi Aspergillus, Penicillium) cĩ khả năng khử nitrat hĩa. Một số lồi như Aspergillus flavus, Trichoderma lignorum, Myrothecium verrucaria….. cĩ khả năng đồng hĩa trực tiếp nitơ phân tử [12]. Các nguyên tố vi lượng cĩ liên quan mật thiết với các quá trình xúc tác sinh học trong tế bào nấm sợi. Các loại nấm sợi cĩ quan hệ rất khác đối với các loại vitamin và các chất sinh trưởng. Nhu cầu về chất sinh trưởng của một lồi nấm sợi cĩ thể thay đổi tùy theo điều kiện nuơi cấy, tùy theo tuổi giống [12]. Ngồi các chất dinh dưỡng nấm sợi cũng như tất cả các sinh vật khác cịn cĩ nhu cầu về nước cho các họat động sinh lý, sinh hĩa của tế bào. Liên quan đến lượng nước cịn cĩ độ ẩm. Các yếu tố này ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và quá trình sinh trưởng, phát triển của chúng (độ ẩm khơng khí khơng thấp hơn 60 %). Khả năng hấp thụ hay thốt nước của nấm đều liên quan với nhiệt độ mơi trường, khoảng từ 15- 300C, tăng trưởng tối ưu trong khoảng 25 - 300C, tùy lồi [12]. Một trong những yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm sợi rõ rệt là pH, bình thường chúng tăng trưởng ở pH = 6. Mơi trường kiềm hoặc acid, thì nấm sợi khơng hoặc tăng trưởng rất yếu [12]. Riêng các lồi Trichoderma thường xuất hiện ở đất ưa axít, phát triển tốt ở bất cứ pH nào nhỏ hơn 7 và chúng cĩ thể phát triển tốt ở đất kiềm nếu ở đĩ cĩ một lượng lớn CO2 và bicacbonat [22]. 1.1.1.3. Phương thức sinh sản. Nấm sợi sinh sản chủ yếu bằng bào tử, bào tử mọc ra từ sợi nấm và sau đĩ là hệ sợi nấm. Bào tử cĩ thể hình thành theo kiểu vơ tính hoặc hữu tính. Chúng khác nhau về hình dạng và cách phát sinh. * Sinh sản vơ tính: Cĩ 3 loại bào tử vơ tính: + Bào tử động (zoospores) + Bào tử kín (sporangiospore) + Bào tử trần (conidi): loại bào tử phát sinh bằng con đường ngoại sinh hay nội sinh, khi chín được giải phĩng ra ngồi. Bào tử trần cĩ thể cĩ hoặc khơng cĩ vách ngăn ngang (Aspergillus spp, Penicillium spp..), cĩ một vách ngăn ngang (Trichothecium spp…) cĩ từ hai vách ngăn trở lên (Fusarium spp..), cĩ vách ngăn ngang lẫn vách ngăn dọc xen kẽ hay nối tiếp nhau (Alternaria spp…) Hình dạng bào tử hình trứng, cầu, hạt chanh [51]. * Sinh sản sinh dưỡng: sinh sản bằng khuẩn ty hoặc bằng hạch nấm, đây cũng là hình thức sinh sản vơ tính. * Sinh sản hữu tính: + Phương pháp đẳng giao, dị giao, nỗn giao. + Bào tử tiếp hợp (zygospores) + Bào tử túi (ascospores) + Bào tử đảm (basidiosppores) Phương thức sống của nấm sợi: dị dưỡng, phần lớn hoại sinh, một số sống ký sinh trên người, động thực vật, cịn một số khác thì sống cộng sinh. Hình 1.5. Sự tiếp hợp của nấm sợi [54]. a b Hình 1.6. Dạng bào tử kín Hình 1.7. Dạng bào tử trần của nấm sợi.(a-b) 1.1.1.4. Phân loại nấm sợi. Vi nấm là thuật ngữ dùng để chỉ tất cả các loại nấm hiển vi (nấm men và nấm sợi) khơng sinh quả thể lớn (mũ nấm).Việc phân loại vi nấm nĩi chung và nấm sợi nĩi riêng vẫn đang ở thời kì phân loại học hình thái dựa vào các đặc điểm hình thái nuơi cấy, một số đặc điểm sinh lý sinh hĩa và phương thức sinh sản. Các phương pháp sinh hĩa và sinh học phân tử được sử dụng ít trong phân loại vi nấm. Nhà nấm học Italia P. A. Saccardo (1845-1920) đã chỉnh lý các nghiên cứu về nấm và biên soạn bằng tiếng La Tinh 25 tập Kỷ yếu nấm. Các thành tựu nghiên cứu đã được tổng kết khá đầy đủ trong 5 tập sách Giới nấm (The Fungi) của G. C. Ainsworth và cộng sự (Vol 1, 2.3.4A.4B. New York and London: Academic Press, 1963-1973). Năm 1995 đã tái bản lần thứ 8 cuốn Từ điển về nấm (Dictionary of the Fungi) của Ainsworth và Bisby. Nấm được chia thành 4 ngành (Division, Phylum): - Ngành Chytridiomycota - Ngành Zygomycota - Ngành Ascomycota - Ngành Basidiomycota. Các lồi nấm khơng tìm thấy (đúng ra là chưa tìm thấy) dạng sinh sản hữu tính được xếp chung vào nhĩm Nấm bất tồn – Fungi imperfecti. Theo hệ thống phân loại của Saccardo (1880,1886) thì các nấm này được xếp thành một lớp- Lớp Deuteromycetes. Khi phát hiện thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì người ta đổi tên lồi và xếp sang các lớp khác. Ví dụ nấm lúa von trước kia được gọi là Fusarium moniliforme, nhưng sau khi tìm thấy cơ quan sinh sản hữu tính thì lại chuyển thành lồi Gibberella fujikuroi. Các Nấm bất tồn hiện được xếp trong các nhĩm conidial Ascomycetes hay conidial Basidiomycetes. Nấm bất tồn (Deuteromycota), nấm đảm (Basidiomycetes), nấm túi (Ascomycetes) được xếp vào nhĩm nấm bậc cao (Michael J.Carlile et al, 2001). Nấm bất tồn là giai đoạn vơ tính (Anamorph) của nấm túi hoặc nấm đảm.[55] Khĩa phân loại đến lớp (Robert A.Samson, 1984) : 1. Lớp nấm túi (Ascomycetses): bào tử sinh ra trong túi bào tử. 2. Lớp nấm tiếp hợp (Zygomycetes) bào tử kín sinh ra trong các nang bào tử kín, hệ sợi khơng cĩ hoặc cĩ ít vách ngăn. 3. Lớp nấm bất tồn (Deuteromycetes) : sợi nấm cĩ vách ngăn, bào tử trần. Theo hệ thống phân loại căn cứ vào đặc điểm phát sinh của bào tử trần của Hughes (1953). Lớp nấm bất tồn được chia thành 3 nhĩm: - Nhĩm Hyphomycetes: Gồm các nấm bất tồn khơng cĩ túi giá và đĩa giá (giá sinh bào tử trần ở trên các sợi nấm hoặc các sợi nấm kết lại thành bĩ sợi, bĩ giá). - Nhĩm Coelomycetes: Gồm các nấm bất tồn cĩ túi giá hoặc đĩa giá, giá bào tử trần ở trong các thể quả (Fruit - body) gọi là các conidiomata [16]. - Nhĩm Agonomycetes : gồm các nấm bất tồn khơng cĩ bào tử trần. 4. Lớp nấm đảm (Bacidiomycetes) : sợi nấm cĩ vách ngăn, sinh sản vơ tính số ít bằng bào tử trần, chủ yếu bằng bào tử đảm [54]. Người ta cho rằng trong tự nhiên cĩ khoảng 1 triệu đến 1,5 triệu lồi nấm nhưng mới định tên được khoảng 10 000 chi và 70 000 lồi, Trung Quốc đã điều tra được 40 000 lồi. Riêng các lồi nấm thuộc Nấm bất tồn ở nước ta hiện mới chỉ phát hiện được 338 lồi thuộc 306 chi khác nhau (Bùi Xuân Đồng, 2004). Bảo tàng giống chuẩn vi sinh vật (VTCC) thuộc Trung tâm Cơng nghệ sinh học Đại học Quốc gia Hà Nội hiện đang hợp tác với Viện NITE (Nhật Bản) điều tra nghiên cứu khu hệ vi nấm ở Việt Nam và cĩ nhiều khả năng tìm thấy những lồi mới trong quá trình nghiên cứu [54]. Hiện tồn tại nhiều hệ thống phân loại nấm khơng thống nhất với nhau, cĩ nhiều khĩa phân loại đã được sử dụng như: Saccardo P A (1880- 1886), Barron G.L (1968) Barnett H.L và cộng tác viên (1972), Ainsworth G C (1973), V.Arx (1981), Bùi Xuân Đồng (1984), Alexopoulos & Mins (1996), Nguyễn Lân Dũng (2000), Đặng Hồng Miên (1999), Nguyễn Đức Lượng (2003), Persoon ex Gray (1801). Sự phân loại vi nấm đang ở thời kỳ phân loại học hình thái (Phenetic clasifications) và đã bắt đầu dựa vào sự phát triển của sinh học phân tử. Trong luận văn này, chúng tơi dựa vào đặc điểm mơ tả trong các khĩa phân loại: Nguyễn Lân Dũng (2000)(trong tài liệu này cĩ khĩa phân loại của Saccardo P A (cải tiến), Barnett H.L và cộng tác viên (1972)), Bùi Xuân Đồng (1984), Nguyễn Đức Lượng (2003), Đặng Hồng Miên (1999). 1.1.2. Chất kháng sinh từ nấm sợi. 1.1.2.1. Những đặc điểm cơ bản về chất kháng sinh. * Chất kháng sinh được hiểu là chất hĩa học xác định, khơng cĩ bản chất enzym, cĩ nguồn gốc sinh học (trong đĩ phổ biến nhất là từ vi sinh vật) với đặc tính là ở ngay nồng độ thấp (hoặc rất thấp) đã cĩ khả năng ức chế mạnh mẽ hoặc tiêu diệt một cách chọn lọc các vi sinh vật gây bệnh hay các tế bào ung thư (ở nồng độ thấp: 10-3- 10-2 / g /ml) mà vẫn đảm bảo an tồn cho người hay động vật được điều trị [4]. * Cĩ giả thiết cho rằng chất kháng sinh là cơ chế giúp cho vi sinh vật tồn tại trong tự nhiên hoặc cạnh tranh mơi trường dinh dưỡng. Cũng cĩ giả thiết lại cho rằng chất kháng sinh chỉ là sản phẩm thải trong quá trình trao đổi chất của tế bào[5]. Thường các CKS khơng cĩ chức năng rõ rệt đối với tế bào sản sinh ra chúng. Sự mất khả năng hình thành CKS khơng làm mất khả năng sinh trưởng. * Bản chất của chất kháng sinh : CKS là nhĩm chất rất đa dạng về mặt hĩa học, trọng lượng phân tử biến động trong khoảng 150 - 5000 Dalton. Trong một số kháng sinh chỉ chứa cacbon (C), hiđrơ (H) hoặc thường chứa C, H, O, N, một số khác cịn cĩ S, P, halogen. Trong phân tử kháng sinh thường chứa các nhĩm chức như: hydroxyl (-OH), cacboxyl (-COOH), cacbonyl (-CO), các nhĩm định chức chứa nitơ..đồng thời cĩ cấu trúc đặc trưng của chất hữu cơ (mạch béo, vịng béo, vịng thơm, polipeptit, dị vịng cacbonhydrat..). Cho đến nay, CKS đều ở thể rắn, cĩ cấu tạo hĩa học rất khác nhau [41], gồm các nhĩm sau:  Nhĩm - lactam: chứa hệ thống vịng - lactam, dị vịng phức tạp. Như Penicillin, Monolactam, Cephalosporin và hàng loạt nấm khác cũng sản sinh ra CKS chứa hệ thống vịng này.  Nhĩm aminoglucoside: chứa nhiều các đường amin nối với các đường amin khác bởi liên kết glucoside, như streptomycin, kanamycin, gentamycin, neomycin..  Nhĩm teracylin: cĩ cấu tạo hĩa học vịng naphthalen, gồm clotetraxyclin, oxytetraxyclin, tetraxyclin..cĩ phổ kháng khuẩn lớn.  Nhĩm macrolit: chứa vịng laton lớn nối với aminosacaroza và nhĩm polyen, tiểu biểu là erythromycin.  Nhĩm polipeptit: cĩ cấu tạo gồm các axít amin [41]. * Tùy theo mục đích và phương pháp nghiên cứu, các nhà nghiên cứu đã phân loại CKS theo nguyên tắc sau: - Phân loại theo nguồn gốc sinh học của chủng sinh ra chất kháng sinh. - Phân loại theo phổ kháng sinh. - Phân loại theo cơ chế tác dụng hay cơ chế sinh tổng hợp ra CKS đĩ. - Phân loại theo cấu tạo hĩa học. * Cơ chế tác động của kháng sinh lên vi sinh vật [54]. Cơ chế tác động của CKS phụ thuộc vào bản chất hĩa học, nồng độ chế phẩm, cấu trúc hiển vi của tế bào VSV và điều kiện biểu hiện của chúng. Khác với các chất độc, CKS cĩ tác dụng đặc hiệu, tính đặc hiệu đĩ gắn kiền với cơ chế tác động. Cơ chế tác động của CKS cĩ thể được chia thành các nhĩm cơ bản sau: - Ức chế quá trình tổng hợp của thành tế bào (vỏ) của vi khuẩn. Các nhĩm KS gồm cĩ penicillin, bacitracin, vancomycin. Do tác động lên quá trình tổng hợp thành tế bào nên làm cho vi khuẩn dễ bị các đại thực bào phá vỡ do thay đổi áp xuất thẩm thấu. - Ức chế chức năng họat động của màng tế bào. Các nhĩm kháng sinh gồm cĩ: colistin, polymyxin, gentamicin, amphoterricin. Cơ chế làm mất chức năng của màng làm cho các phân tử cĩ khối lượng lớn và các ion bị thốt ra ngồi. - Ức chế quá trình sinh tổng hợp protein. CKS thuộc nhĩm này gồm nhiều chất như streptomyxin, erythromixin, tetraxilin, cloramphenicol... gây cản trở tổng hợp prơtêin. Tác động của một số loại CKS này như sau: Nhĩm aminoglycosid gắn với receptor trên tiểu phần 30S của ribosome làm cho quá trình dịch mã khơng chính xác. Nhĩm chloramphenicol gắn với tiểu phần 50S của ribosome ức chế enzyme peptidyltransferase ngăn cản việc gắn các acid amin mới vào chuỗi polypeptide. Nhĩm macrolides và lincoxinamid gắn với tiểu phân 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide. - Ức chế quá trình tổng hợp acid nucleic. Các CKS cĩ thể gắn vào axít nuclêic (AND, ARN) tạo thành phức phân tử bất hoạt, ngăn cản sự sao chép của các axít này. Nhĩm refampin gắn với enzyme RNA polymerase ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA (RNA thơng tin) . Nhĩm quinolone ức chế tác dụng của enzyme DNA -gyrase làm cho hai mạch đơn của DNA khơng thể duỗi xoắn làm ngăn cản quá trình nhân đơi của DNA. Nhĩm sulfamide cĩ cấu trúc giống PABA (paminobenzonic acid) cĩ tác dụng cạnh tranh PABA và ngăn cản quá trình tổng hợp acid nucleotid. Nhĩm trimethoprim tác động vào enzyme xúc tác cho quá trình tạo nhân purin làm ức chế quá trình tạo acid nuclêic [54]. CKS nhĩm này thì rất độc khơng những đối với VSV mà cịn độc cho người và các VSV khác [11]. 1.1.2.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh kháng sinh. Trong quá trình sống, cơ thể vi sinh vật thường xuyên trao đổi chất với mơi trường ngồi tạo ra các sản phẩm trao đổi chất khác nhau. - Sản phẩm trao đổi chất sơ cấp là những sản phẩm cần thiết cho sự sống của tế bào, chúng là những vật chất tham gia xây dựng tế bào như các axít amin, vitamin, nuclêơtic. - Sản phẩm trao đổi chất thứ cấp là những sản phẩm về mặt hĩa học là những hợp chất cĩ cấu tạo cực kỳ phức tạp, chúng khơng cĩ chức năng rõ ràng trong trao đổi chất của tế bào như chất kháng sinh, giberelin, độc tố nấm, các polysacarit. * Quá trình tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng của nhiều nhân tố trong đĩ cĩ thành phần mơi trường (nguồn cacbon, nitơ, nguyên tố vi lượng, phương pháp nuơi cấy, tuổi giống, độ thơng khí…) và điều kiện nuơi cấy. Vì vậy khi nuơi cấy chúng ta tìm điều kiện tối ưu cho các yếu tố trên để hiệu suất tổng hợp chất kháng sinh cao nhất. - Quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc của nguồn thức ăn. Tùy thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp như các loại đường đơn như glucose, manitol, các loại đường kép như saccarose, lactose, cũng cĩ thể là các loại đường đa như tinh bột hoặc các chất cĩ thành phần khơng xác định như rỉ đường….Cĩ nhiều chủng nấm sợi cĩ hoạt tính cellulaza cao nên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là CMC [11]. - Nguồn nitơ và nồng độ ni tơ trong mơi trường nuơi cấy cũng ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ chuyển hĩa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh. Quá trình sinh tổng hợp CKS ở nấm sợi thường cần cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vơ cơ trong mơi trường. - Vai trị của phốt phát vơ cơ cũng là một trong những yếu tố điều chỉnh sự tổng hợp CKS. Nồng độ phốt phát thích hợp cho sinh tổng hợp CKS khơng quá 10mg/ml. Nồng độ phốt phát ban đầu cao sẽ làm tăng lượng axít nuclêic trong tế bào, làm kéo dài pha sinh trưởng, rút ngắn pha tổng hợp, làm tăng ATP trong tế bào dẫn đến giảm hoặc ngừng hẳn sinh tổng hợp CKS. Ngồi ra sự dư thừa phốtphát cũng ức chế tổng hợp các enzym tham gia vào quá trình tổng hợp CKS. - Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp CKS thường nằm trong khoảng từ 28- 30 0C. Sinh tổng hợp CKS phụ thuộc đáng kể vào pH mơi trường, pH thích hợp cho việc tổng hợp CKS là trung tính, mơi trường hơi ngả về axít, pH axít hay kiềm đều ức chế quá trình tổng hợp CKS. - Ngồi ra chất lượng bào tử của giống, tuổi, khả năng đồng đều về mặt di truyền, hoạt tính trao đổi chất cũng ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp CKS 1.1.2.3. Khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi. Nấm sợi là một trong những VSV cĩ khả năng sinh kháng sinh đầu tiên cĩ ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Bệnh truyền nhiễm trước đây trong một thời gian dài đã là mối đe dọa rất lớn đối với con người và các VSV khác. Do vậy việc tìm kiếm thuốc chữa bệnh cho con người, từ lâu đã là mơ ước của nhiều nhà khoa học nĩi riêng và của nhân loại nĩi chung. Và đã cĩ nhiều CKS đã được phát hiện từ nấm sợi như: - Penicillin: Chất kháng sinh penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928, trong khi làm vệ sinh phịng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp pêtri nuơi Staphylococcus bị niễm nấm mốc Penicillium notatum cĩ xuất hiện hiện tượng vịng vơ khuẩn bị tan xung quanh khuẩn lạc nấm. Khi ơng cấy nấm mốc trên thử nghiệm lại trên một số lồi vi khuẩn gây bệnh khác thì vẫn thấy hiện tượng tương tự xảy ra. Từ đĩ ơng kết luận là nấm mốc đã tiết ra mơi trường một chất nhất định làm tan vi khuẩn và ơng đã sử dụng ngay tên giống nấm Penicillin để đặt tên cho chất kháng sinh này (1929). Cơng trình khoa học của Fleming ngay lập tức thu hút được sự quan tâm chú ý của nhiều nhà khoa học trên thế giới, trong đĩ cĩ các nhà khoa học Mỹ đã triển khai lên men thành cơng penicillin theo phương pháp lên men bề mặt (1931). Tuy nhiên, cũng trong khoảng thời gian đĩ mọi nổ lực nhằm tách và tinh chế penicillin từ dịch lên men đều thất bại do khơng bảo vệ được hoạt tính kháng sinh của chế phẩm tinh chế và do đĩ vấn đề penicillin tạm thời bị lãng quên [4]. Mãi đến năm 1945 , ơng mới được nhận giải thưởng Nobel. Năm 1938, ở Oxford, Ernst Boris Chain và Norman Heatley đưa Penicillium vào sản xuất thử. Và chỉ sau hai năm đã tinh chế một lượng lớn penicillin, đủ để thử nghiệm trên chuột thí ngiệm và kết quả điều trị đã thành cơng mỹ mãn, ngày 25/05/1940 [26]. Năm 1940, Dorothy Hodgkin xác định được cấu trúc phân tử của Penicillium [26]. Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium chrysogesrum cĩ khả năng sinh tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium notatum tìm ra trước đĩ. Năm 1946 – 1950, hàng loạt chất kháng sinh đã được phát hiện, hàng loạt nhà máy sản xuất kháng sinh ra đời, chủ yếu là Penicillin, khẳng định giá trị to lớn của Penicillin sử dụng trong chữa bệnh. Kể từ đĩ một kỷ nguyên mới trong y học- kỷ nguyên chất kháng sinh ra đời. Tiếp theo Penicillin hàng loạt chất kháng sinh đã được tìm kiếm và phát hiện. -Cephalosporin: Năm 1948, Brotzu chiết từ chủng nấm mốc thuộc giống Cephalosporium sp cĩ khả năng chống được cả vi khuẩn gram (+) và vi khuẩn gram (-) đặc biệt là Vibriocholerac. Ngày nay người ta phát hiện nhiều lồi nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn khác nhau cĩ khả năng tổng hợp cephalosporin[2]. Tuy nhiên hoạt tính của Cephalosporin thì kém hơn hoạt tính của Penicillin. - Griseofulvin: Năm 1959, Oxford và đồng sự phát hiện do chiết được từ một số lồi nấm mốc thuộc giống Penicilium (Pen.urticae, Pen.nigricans, Pen.raistrichi..). Griseofulvin khơng cĩ hoạt tính chống vi khuẩn nhưng cĩ khả năng chống nấm khá mạnh nên dùng để chữa bệnh nấm cho người và gia súc. Năm 1959, các nhà khoa học Anh, Mỹ đã tách được vịng penicillin, mở đầu cho hàng loạt các loại kháng sinh tổng hợp [26]. Năm 1960, người ta đã bắt đầu tổng hợp được Griseofulvin bằng con đường nhân tạo. - Kháng sinh được chiết suất từ nấm sợi như Citrinin (P.citrinum), Fumagilin (A.fumigatus), Nidulin (A.nidulans), Humicolin (A.humicola), Viridin (T.viride)… Cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu Trichoderma, đã xác định nĩ cĩ khả năng chữa bệnh. Trong đĩ chú ý nhiều là lồi Trichoderma viride, phân tán khắp nơi trong đất. - Glytoxin là chất kháng sinh từ giống Trichoderma viride, ngồi ra người ta cịn phát hiện ở Aspergillus fumgitus, một vài lồi penicilium. Glytoxin khơng bền vững và bị phân hủy nhanh trong ánh sáng. Phổ kháng sinh của nĩ chống các vi khuẩn gram dương và các nấm gây bệnh. Trong kết quả thực nghiệm glytoxin khơng thể hiện hiệu quả chống nhiễm trùng lao của chuột, khơng ngăn cản sự phát triển của u ác tính. Hoạt tính kháng sinh của glytoxin liên quan với sự cĩ mặt trong phân tử là nhĩm chứa lưu huỳnh. Ngày nay, với sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng sự hổ trợ của nhiều ngành khoa học khác đã tạo điều kiện thuận lợi cho lãnh vực nghiên cứu CKS đạt được những thành tựu lớn lao. Các phương pháp hiện đại về kỹ thuật di truyền, cơng nghệ gen, gây đột biến định hướng, chọn dịng gen sinh tổng hợp, tạo và dung hợp tế bào trần đã nâng cao khả năng sinh tổng hợp CKS trong thời gian ngắn. Những thành tựu gần đây trong sinh học phân tử như AND tái tổ hợp, kỹ thuật tách dịng gen và biểu thị sự tổng hợp ở vi khuẩn E.coli khơng những đem lại kết quả to lớn trong việc phát triển chủng, giống mà cịn mở ra phương hướng đầy triển vọng trong sản xuất các chất kháng sinh. Kỹ thuật enzym bất động được coi là một trong những phương hướng nghiên cứu, sản xuất CKS tr._.ong những năm cuối thế kỉ 20 và đầu thế kỉ 21. Ngày nay, tuy đã cĩ hàng ngàn CKS mới được phát hiện nhưng các nhà nghiên cứu trên thế giới vẫn đang chạy đua trong việc tìm tịi và tổng hợp CKS mới, đặc biệt là CKS chống virút và chống ung thư. Ở Việt Nam việc nghiên cứu và sản xuất CKS bắt đầu từ năm 1949 do giáo sư bác sĩ Đặng Văn Ngữ tiến hành với các chủng Penicillium và thu được dịch lọc penicillin (sử dụng trong điều trị vết thương cho các bệnh binh). Sau kháng chiến 9 năm, cơng trình được tiếp tục nghiên cứu ở trường ĐH Y Dược, Hà Nội. Cho đến nay nghiên cứu CKS đã được quan tâm của nhiều nhà khoa học đầu ngành, thuộc viện Cơng nghệ sinh học – Trung tâm khoa học tự nhiên và Cơng nghệ quốc gia, trường Đai học khoa học tự nhiên. Trường Đai học Sư Phạm I Hà Nội đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng, Nguyễn Thành Đạt về nấm sợi và vai trị đối kháng của chúng trong hệ sinh thái RNM. Tác giả Vũ Thị Đoan Chính là người đầu tiên ở Việt Nam đã sử dụng kỹ thuật gây đột biến tế bào trần để nghiên cứu nâng cao hoạt tính kháng sinh. Mặc dù cĩ nhiều cố gắng nhưng những nghiên cứu về CKS của chúng ta cịn hạn chế so với thế giới. 1.1.2.4. Lược sử quá trình nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của nấm sợi ở rừng ngập mặn. Nấm trên đất liền đã được hệ thống hĩa từ lâu, nhưng sự nghiên cứu về nấm ở rừng ngập mặn mới chỉ được các nhà nấm học quan tâm từ những năm 1950 và ban đầu rất ít. Cho đến nay các nhà nghiên cứu nấm đã thành lập hội nghiên cứu nấm tồn cầu trong đĩ cĩ các nấm ở rừng ngập mặn. Người ta nhận ra rằng sinh cảnh rừng ngập mặn là mơi trường lý tưởng cho sự sinh trưởng và phát triển của vi sinh vật nhất là nấm sợi. - 1955-1956 hai lồi nấm đầu tiên được phát hiện ở rừng ngập mặn: Phialophloraphoma litoralis Linder (ngành phụ Deuteromycotina) và Gnomonia longiostris Cribb (ngành phụ Ascomycotina) từ thân cây Avicennia marina var.resinifera do Cribb và cộng tác viên phân lập và phân loại [16]. - 1971- 1975 Jones và Hughes đã xuất bản tài liệu về phương pháp nghiên cứu nấm biển[46]. - Năm 1979 Kohlmeyer và cộng tác viên đã đưa ra danh sách 42 lồi vi nấm rừng ngập mặn, trong đĩ cĩ 23 lồi thuộc ngành phụ Ascomycotina, 17 lồi thuộc ngành phụ Deuteromycotia và 2 lồi thuộc ngành phụ Basidiomycotina [46]. - Năm 1987, Hyde và cộng tác viên cơng bố phát hiện 89 lồi nấm từ cây Rhizophora mucronata lanak (Ấn độ) cĩ gần 300 chủng nấm từ lá cây, chủ yếu là nấm ký sinh. - Năm 1988, Subramanian tìm ra 55 giống nấm sợi kí sinh trên lá R.apiculata và R.mucrolata [46]. - Năm 1994, Newell S.Y, đã phân lập được các lồi nấm nhày (lớp Oomycetes) ưa mặn, cĩ khả năng phân hủy mạnh xác thực vật ở rừng ngập mặn. - Năm 1997, Tadayoshi và cộng tác viên, đã tìm thấy nấm sợi thuộc chi Trichoderma (ở thân cây), Oomycetes (cĩ nhiều ở lá rụng) [16]. Hầu hết các nhà nghiên cứu dừng lại ở sự phân lập, phân loại và sự phân bố của chúng ở trong các rừng ngập mặn ở trong các khu vực địa lý khác nhau. Với số lượng nấm được phát hiện khá nhiều nhưng các nhà nghiên cứu chưa đi sâu vào nghiên cứu vai trị của chúng trong quá trình phân hủy xác thực vật. Một số ít nghiên cứu về sự phân bố của lồi nấm phụ thuộc vào vị trí đại lý, độ màu, độ pH, vi sinh vật, độ mặn của nước biển chảy vào rừng. Các chất cĩ hoạt tính sinh học do VSV rừng ngập mặn sinh ra đang cĩ ít nhà khoa học nghiên cứu, chủ yếu nghiên cứu về enzym phân giải ligno- xenluloza. Trong những năm gần đây, người ta đã phát hiện ra nấm biển, nấm ở rừng ngập mặn là nguồn vi sinh vật cĩ tiềm năng sinh kháng sinh mới chống các vi sinh vật nhờn kháng sinh, hay các tế bào gây ung thư. Ở mơi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của chúng sẽ cĩ gì đĩ khác hơn với con đường trao đổi chất của sinh vật đất liền. Vì vậy rất cĩ thể cĩ các sản phẩm trao đổi chất cĩ tính chất gì đĩ hơi khác lạ, trong đĩ cĩ cả chất kháng sinh mới [16]. Từ các nấm Halocyphina villosa, Kupa và cộng sự (1981) đã thu được chất kháng sinh cĩ tên Siccayene, cĩ hoạt tính kháng khuẩn cao. Năm 1999, từ thân cây gỗ rừng ngập mặn, Darfenner và cộng sự đã phân lập được nấm Hypoxylon croceum M 97- 25 sinh ra chất chống nấm mạnh: sordarin và hyposordarin [46]. Năm 2001, từ Zofiella marina thu được kháng sinh zofimatin cĩ cấu trúc tương tự sordarin nhưng lại cĩ khả năng tiêu diệt các vi khuẩn gram âm và gram dương. Chất himaninide A, B, C, D cĩ khả năng diệt vi khuẩn và nấm rất mạnh. Các lịai của chi Geronema Sing phân lập từ các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới sinh ra chất geronemins (A,B,C,D), ức chế quá trình tổng hợp các đại phân tử trong tế bào. Chất herical và dẫn xuất của nĩ thu được từ Hypoxylum ramosum cũng cĩ khả năng ức chế mạnh các loại tế bào. Các chất này đang được nghiên cứu về khả năng diệt các tế bào ung thư như tế bào Hella S 3 (ung thư biểu mơ, ung thư vùng cổ), tế bào L 1210 (ung thư máu), tế bào KB (ung thư miệng, vịm họng…) [16]. Các nấm sợi tồn tại trong hệ sinh thái RNM đã cĩ tài liệu cơng bố về khả năng diệt cơn trùng của tác giả Nguyễn Vĩnh Hà (2002) [16], chủng P.farinosus NT 33. Đây là lãnh vực cịn bỏ ngỏ mà chúng ta cần nghiên cứu để làm giàu thêm bộ sưu tầm vi nấm diệt sâu hại và sử dụng chúng để kiểm sốt quần thể cơn trùng gây hại, ảnh hưởng đến năng suất cây trồng. Ngồi ra cịn cĩ các cơng trình nghiên cứu về vấn đề nấm sợi ở RNM của các tác giả Lê Thanh Huyền, Nguyễn Thị Thu, Nguyễn Thị Hiên dưới sự hướng dẫn của TS Mai Thị Hằng (2002). 1.1.3. Ứng dụng của nấm sợi và các CKS từ nấm sợi. 1.1.3.1. Ứng dụng KS từ nấm sợi trong điều trị bệnh truyền nhiễm và hiện tượng lờn thuốc của vi sinh vật gây bệnh. Từ khi Penicillin được sản xuất để đưa vào điều trị, sự phát triển của kỹ nghệ kháng sinh đã giúp cho thầy thuốc những cơng cụ hữu hiệu trong việc kiểm sốt và khống chế các bệnh nhiễm khuẩn. Việc sản xuất CKS, sử dụng CKS trong trị liệu cùng với thời gian, nhiều chế phẩm bán tổng hợp và tổng hợp ra đời. Song song với sự kiện này, con người cũng biết đến hiện tượng lờn thuốc mà bản chất là sự phát triển tính đề kháng kháng sinh của tác nhân gây bệnh. Tỉ lệ đề kháng của vi khuẩn và số thuốc bị đề kháng đang ngày càng gia tăng. Hiện nay, ngồi các vi khuẩn Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Enterococcus đã kháng thuốc [Levy, 1998], chúng ta cịn phải chú ý những trường hợp nhiễm khuẩn do S. aureus kháng Methicillin thuộc nhĩm Penicillins ức chế được -lactamase, và những chủng vi khuẩn đường ruột kháng các Cephalosporins phổ rộng. Ở các bệnh viện, chủng phân lập nhiều nhất từ bệnh phẩm là Pseudomonas aeruginosa, E. coli, Enterobacter spp., và Staphylococcus aureus. Quá trình theo dõi mức độ đề kháng của các tác nhân trên trong nhiễm khuẩn máu, nhiễm khuẩn đường hơ hấp và nhiễm khuẩn đường tiết niệu, nhằm báo động về hiện trạng kháng thuốc ở bệnh viện và cung cấp vài thơng tin cĩ thể hữu dụng cho việc trị liệu kháng sinh [56]. * P. aeruginosa- trực khuẩn mủ xanh gây bệnh nghiêm trong ở các vết mổ, viêm niệu đạo, viêm phổi, viêm tai ở người đi bơi, màng não mủ đã đề kháng với hầu hết các lọai kháng sinh. Khi kiểm nghiệm trên bệnh nhân và trong in vitro P. aeruginosa đã đề kháng hàng lọat kháng sinh như mezlocillin, ceftazidin, netilmicin, aztreonam, mipenem, mezopenen, gentamycin, tobramycin, amikacin, ciproffloxacin, levofloxaxin và cả các kháng sinh thế hệ mới như cephalosporin, floruoquinol. Hai loại kháng sinh cĩ thể dùng để điều trị là azlocillin và ceftazedime [60]. * S.aureus gây ngộ độc thực phẩm, gây các bệnh đường tai, mũi, họng. Điều trị nhiễm trùng do S.aureus thường dùng các penicillin kháng -lactamase như nafcillin. S.aureus cĩ các prơtêin gắn penicillin được coi là các S.aureus kháng methicillin, thuốc được chọn trong trường hợp này là vancomycin. Vancomycin là loại thuốc độc gây nhiều phản ứng phụ cho cơ thể. Gần đây một số chủng trong lồi này đã kháng cả vancomycin [56]. Candida albicans là tác nhân gây nhiều bệnh đặc biệt, đặc biệt là niêm mạc miệng, lưỡi, dạ dày, hành tá tràng, đường ruột, niệu đạo, sinh dục. Hiện nay 25 % bệnh tai mũi, họng do Candida albicans trở nên khơng kiểm sốt nổi do đã đề kháng với các kháng sinh chống nấm hiện cĩ như nystatin, amphotericin B, vaclotrimazole, 5-fluorocytosine. Đối với các bệnh nhân AIDS thì nhiễm Candida albicans là vấn đề nan giải nhất [16]. Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis nổi kinh hồng của lồi người từ những thế kỷ trước tưởng đã vĩnh viễn bị chặn lại từ khi phát hiện ra steptomycin. Nhưng nĩ đang trở lại và là nổi lo khơng của riêng ai, đe dọa tính mạng tồn nhân loại đặc biệt là các bệnh nhân AIDS vì M. tuberculosis đã đề kháng được nhiều loại kháng sinh hiện cĩ. Các kháng sinh được dùng trong chữa lao hiệu quả là streptomycin, muối Para- amino của salicylic acid (PAS) và ionicotinic acid Hydrazide (INH). Tổ hợp các chất streptomycin, PAS, INH là tổ hợp chống lao hiệu quả nhất mà nhân loại cĩ trong nhiều năm qua (từ năm 1945), nay cũng đã giảm hiệu quả. Nhờ dày cơng nghiên cứu, trước sự tấn cơng của vi trùng, các nhà bác học đã tìm ra ngày càng nhiều kháng sinh hữu hiệu hơn, tiêu diệt được nhiều loại vi trùng lờn thuốc. Tuy nhiên, một kháng sinh mới được sử dụng thì trong một thời gian ngắn thì lại cĩ một số vi trùng coi thường. Cephalosporidines thế hệ thứ 3, thứ 4, Aminoglycosides, Quinolones các thế hệ mới đều đã bị lờn từ 25 đến 50%. Kháng sinh được dùng trong thú y cũng tương tự như trong y học. Vì vậy, nhiều biện pháp đang được nghiên cứu để chống lại sự lờn thuốc của các vi sinh vật gây bệnh. Một trong số các biện pháp hữu hiệu là tìm các kháng sinh mới từ các lồi VSV trong thiên nhiên. Từ RNM người ta đã thu được một số kháng sinh mới, cĩ khả năng chống các VSV gây bệnh đã lờn các loại kháng sinh hiện cĩ (Isaka M, Suyanrnsestakorn C, Tanticharoen M, Kongsaeree P, Thebtaranonth Y, 2002). Vì vậy việc tìm kiếm các kháng sinh từ các vi sinh vật rừng ngập mặn đang được thế giới hết sức quan tâm[60]. Ngày nay, các nhà khoa học đang quay lại nhĩm VSV đầu tiên sinh ra chất kháng sinh- đĩ là nấm sợi nĩi riêng và nấm nĩi chung, hy vọng tìm được giải pháp hữu hiệu chống các VSV lờn thuốc. Đối tượng hấp dẫn lại chính là nấm trong RNM và nấm biển [60], vì các nhà nghiên cứu tin rằng trong các mơi trường sống đặc biệt này con đường trao đổi chất của VSV sẽ khác hơn các VSV trên cạn, nên sẽ cĩ các chất trao đổi khác hơn trong đĩ cĩ thể cĩ các hoạt chất quý kể cả chất kháng sinh [60]. 1.1.3.2.Sử dụng kháng sinh và nấm sợi trong phịng chống nấm bệnh hại cây trồng. Trong thời gian gần đây nhiều chất kháng sinh cịn được sử dụng cĩ hiệu quả trong đấu tranh kiểm sốt sinh học. Trong bảo vệ thực vật, người ta tăng cường phương pháp bảo vệ thực vật bằng phương pháp sinh học. Trong số các “Biện pháp đấu tranh sinh học” trong bảo vệ thực vật theo Cook và Baker (1853) là sử dụng một hay nhiều VSV để kiềm chế bệnh thực vật [41]. Chất kháng sinh và dịch lên men các chủng KSđược dùng để xử lý hạt giống với mục đích tiêu diệt nguồn bệnh bên ngồi và trong hạt, diệt bệnh ở các bộ phận nằm trên đất của cây và khử trùng đất. Nhìn chung so với y học, việc sử dụng KS trong bảo vệ thực vật cịn mới mẻ. Tuy nhiên nhờ những thành tựu của khoa học sinh học hiện đại và xu hướng phát triển tất yếu của cơng nghệ sản xuất kháng sinh hiện nay đã khẳng định tầm quan trọng của kháng sinh trong nền nơng nghiệp hiện đại. Kháng sinh diệt nấm sử dụng trong nơng nghiệp cĩ hiệu quả cao như strobilurin phân lập từ Strobilurus tenacellus (Anke, et al, 1977) [60]. Người ta sử dụng chất kháng sinh để kiểm sốt dịch bệnh do VSV gây ra cho cây trồng. CKS cĩ tác dụng nhanh , dễ phân hủy lại cĩ tác dụng chọn lọc cao. Dịch lên men của một số chủng sinh chất kháng sinh khơng chỉ chống bệnh cho cây mà cịn dùng để xử lí hạt giống tiêu diệt mầm bệnh, cĩ thể kích thích cây sinh trưởng và tăng số lượng vi sinh vật cĩ ích cho vùng rễ [41]. Hằng năm trên thế giới cũng như ở nước ta bệnh cây đã làm thiệt hai rất lớn đến nền nơng nghiệp, khoảng 537 triệu tấn nơng sản. Các bệnh do vi khuẩn như bệnh bạc lá, loét cam, bạc lá lúa, héo xanh cà chua [5]. Các bệnh do nấm gây ra như bệnh thối cổ rễ ở cây bơng và cỏ đinh lăng, bệnh đạo ơn ở lúa, bệnh khơ vằn hại lúa…trong đĩ cĩ 13/ 45 bệnh hại lúa do nấm gây ra, cĩ 26 / 34 bệnh ở ngơ do nấm gây ra [18]. Các chế phẩm từ nấm Trichoderma (Trichoderma harzianu, Trichoderma viride, Glyocladium..) cũng được sử dụng phịng trừ nhiều lồi vi sinh vật gây bệnh như Rhizoctonia, Fusarium, Aspergillus, Pseudomonas….gây bệnh lở cổ rễ, thối gốc rễ, héo rũ ở nhiều lồi cây trồng khác nhau.[5]. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bĩn cho cây trồng vừa cung cấp chất dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây [59]. Trong thực tế sản xuất nhiều nước đã áp dụng phương pháp bĩn vào đất các loại vi sinh vật đối kháng để tiêu diệt các loại vi sinh vật gây bệnh cho cây. Những vi sinh vật đối kháng này hồn tồn khơng gây hại cho cây trồng. Những ứng dụng của nấm Trichoderma trong đấu tranh sinh học với các nấm gây bệnh ở cây trồng đã đạt được những thành tựu tốt đẹp ở các nước châu Âu, Liên xơ…Cơng trình nghiên cứu của Wells và cộng sự (1972) đã thơng báo ở điều kiện ngồi đồng ruộng Tri. harzianum đã ngăn chặn được bệnh do nấm Sclerotium rolfsii. Backman, Redriguer- Kaban (1975) sử dụng bào tử nấm Tri. herzianum ngăn chặn bệnh do nấm Sclerotium rolfsii, Rhizoctonia solani, Pythium spp bảo vệ cây họ đậu và củ cải tránh được bệnh chết ẻo. Theo Emxep V.T (1989) cho biết nấm Trichoderma khơng chỉ tiêu diệt nhiều lồi nấm gây bệnh cho cây trồng trong đất mà cịn cĩ tác dụng cải thiện cấu trúc và thành phần hĩa học của đất, đẩy mạnh sự phát triển các vi khuẩn nốt sần cố định đạm cĩ ích trong đất và kích thích sinh trưởng, phát triển cây trồng. Các vi sinh vật đối kháng khơng chỉ ức chế các vi sinh vật gây bệnh ở vùng rễ mà những chất kháng sinh do chúng tiết ra (Trichodermin, Glitoxin) cĩ thể xâm nhập vào mơ bào cây, làm tăng tính chống chịu bệnh của cây trồng. Vì vậy một số chủng nấm Trichoderma theo các nhà khoa học các nước thì hồn tồn cĩ thể sử dụng trong đấu tranh sinh học [44]. Các chủng nấm sợi như Trichoderma ssp trong các chế phẩm phân hữu cơ vi sinh khơng những cung cấp nguồn phân bĩn an tồn hiệu quả mà cịn giúp kiềm chế các bệnh gây hại cây trồng và tạo được các ổ sinh thái phịng bệnh lâu dài trong tự nhiên. Ở New Zealand, người ta cịn trộn nhiều chủng Trichoderma khác nhau để kiểm sốt bệnh trên cây nho và các cây dạng quả hạch. Ở Mỹ người ta rắc bột bào tử hay phủ gel bào tử lên các hạt giống để tăng tính kháng bệnh của cây trồng hay phun bào tử lên khắp cánh đồng trước khi trồng trọt [35]. Một trong những nghiên cứu ứng dụng của Trichoderma ssp đĩ là khả năng kiểm sốt sinh học cũng như khả năng đối kháng một số nấm gây bệnh ở thực vật [35]. Các chủng nấm sợi cĩ khả năng ức chế vi sinh vật gây bệnh thực vật rất hiệu quả, trong đĩ phải kể đến chủng Trichoderma harzianum T 22 cĩ hoạt tính mạnh, thích hợp với đa số loại đất và cây trồng. Một số chủng bảo vệ thực vật khi cộng sinh ở vùng rễ. Các nấm Trichoderma cĩ thể kìm hãm nấm gây bệnh cây thơng qua các cơ chế tiết kháng sinh, men đặc trưng và cĩ thể kí sinh trên các nấm gây bệnh cho cây. Hiên tượng kí sinh của nấm Trichoderma trên nấm gây bệnh cho cây được gọi là hiện tượng “giao thoa sợi nấm”. Trước tiên sợi nấm của Trichoderma thắt chặt lấy các sợi nấm gây bệnh, xuyên qua sợi nấm gây bệnh, làm thủng màng ngồi của sợi nấm, gây nên sự phân hủy các chất nguyên sinh của nấm gây bệnh [33]. Nấm Aspergillus niger đối kháng với các nấm Fusarium solani, Rhizoctonia solania, Alternaria alternata. Nấm Aureobasidium pollulans và Sporobolomyces roseus đối kháng với nấm Septoria nodorum. Nấm Cercospora kikuchii đối kháng với nấm Diaporthe phaseolorum var.sojae. Các kết quả nghiến cứu của trường Đại học Cần Thơ, Viện nghiên cứu lúa Đồng Bằng sơng Cứu Long, Cơng ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện sinh học Nhiệt đới đã cho thấy vai trị của nấm sợi đối với cây trồng. Như nấm Trichoderma cĩ khả năng tiêu diệt nấm Fusarium solani (gây bệnh thối rễ) . Hoặc để phịng trừ bệnh thối gốc chảy mũ trên cây bưởi (do nấm Phytopthora sp.gây ra) thì dùng một kg nấm Trichoderma harzianum trộn đều với 40 kg phân chuồng , rồi rải xung quanh cây từ 3- 5 (kg thùy theo cây lớn nhỏ)[22]. Dùng các chủng nấm Trichoderma xử lí đất trước khi gieo trồng bắp hay trộn nấm sợi với phân chuồng hoai mục trước khi bĩn ruộng 5- 10 ngày, rồi rải lên ruộng trước khi gieo hạt cĩ tác dụng hạn chế bệnh khơ vằn hại bắp [35]. Hiện nay các chủng Trichoderma ssp đã được sử dụng rộng rãi trong các chế phẩm sinh học thương mại như: GlioGard- một chế phẩm với thành phần chính là Trichoderma virens ngăn chặn sự úng thối của cây con. Chế phẩm Trichodex với Trichoderma harzianum là thành phần chính kết hợp với Trichoderma polysporum trong việc sản xuất Binabt được dùng chữa trị các vết thương đã bị nhiễm trùng ở cây trồng. Ở Việt Nam, các bệnh do nấm, vi khuẩn, virút đã gây tổn thất lớn cho cây trồng. Việc dùng thuốc hĩa học đã mang lại hiệu quả tốt, làm giảm đáng kể sự thất thu sản lượng cây trồng. Tuy nhiên, việc dùng thuốc hĩa học cũng gây nên hậu quả năng nề cho sức khỏe của người tiêu dùng. Nhiều hĩa chất cịn tồn lưu trong sản phẩm là nguyên nhân gây ung thư cho người sử dụng [4]. Việc sử dụng nấm sợi cĩ khả năng sinh kháng sinh để bảo vệ cây trồng là biện pháp an tồn và hiệu quả, làm tăng năng suất cây trồng, giữ được phẩm chất nơng sản [41]. Cĩ các cơng trình nghiên cứu của các sinh viên khoa sinh trường Đại học Sư Phạm, trường Đại học Khoa học tự nhiên, Hà Nội về các nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn ở Việt Nam cĩ các hoạt tính đối kháng với các nấm gây bệnh cho cây trống và các cơn trùng gây hại cây trồng, nghiên cứu đặc điểm của nấm sợi Trichoderma, nghiên cứu về tính đa dạng và vai trị của nấm sợi, khảo sát hoạt tính đối kháng và tiềm năng ứng dụng của các chủng nấm sợi, khảo sát khả năng kí sinh gây bệnh cơn trùng và tiềm năng kiểm sốt sinh học của nấm RNM…v..v…Theo cơng trình nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng, các chủng nấm sợi phân lập được từ rùng ngập mặn ở một số vùng Nam Định, Thái Bình cịn thể hiện họat tính diệt sâu tơ mạnh trong đĩ cĩ chủng P.farinosus NT 33, thể hiện hoạt tính đối kháng cao với các loại vi sinh vật cĩ hại cho cây trồng [22]. 1.1.3.3.Sử dụng kháng sinh và nấm sợi trong phịng chống cơn trùng gây hại cây trồng [16],[19]. Các bệnh gây hại do cơn trùng gây ra cho cây trồng luơn là vấn đề lớn đối với các nước nơng nghiệp. Hàng năm, cơn trùng hại cây trồng đã làm giảm 14 % tổng sản lượng của các ngành nơng, lâm nghiệp nước ta. Cơn trùng làm giảm năng suất, chất lượng cây trồng. Việc sử dụng các loại thuốc trừ sâu hĩa học để diệt các loại cơn trùng gây hại tuy hiệu quả nhanh và cao nhưng lại rất độc hại cho mơi trường. Việc sử dụng thuốc hĩa học bừa bãi, khơng đúng liều là một tác nhân chọn lọc làm xảy ra hiện tượng lờn thuốc ở cơn trùng cĩ hại. Thuốc hĩa học cịn tiêu diệt các sinh vật khác, kể cả các lồi cĩ lợi. Việc lạm dụng thuốc hĩa học cịn ảnh hưởng tới sức khỏe con người, làm ơ nhiễm mơi trường, mất cân bằng sinh thái. Ngày nay, các biện pháp kiểm sốt sinh học các loại cơn trùng gây hại cĩ hiệu quả và an tồn cho mơi trường đang được quan tâm. Tuy biện pháp này cĩ tác dụng chậm hơn song khơng gây ơ nhiễm mơi trường, khơng ảnh hưởng tới các sinh vật khác. Và cĩ nhiều lồi VSV được sử dụng trong kiểm sốt sinh học như vi khuẩn, nấm sợi, virút . Năm 1815 lần đầu tiên Agostino Bassi (Italia) đã mơ tả tỉ mỉ về nấm trắng Muscardin (B.bassian) gây bệnh trên tằm và đưa ra biện pháp ngăn ngừa. Các lồi nấm sợi được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong lãnh vực phịng trừ sinh học như Beauveria bassiana (Blas), Paecilomyces fumosoroseus thuộc lớp nấm bất tồn, do tính gây bệnh cao ở nhiều lồi cơn trùng. Vào những năm 70 của thế kỷ 20, Liên xơ (cũ) là nước cĩ số lượng cơng trình nghiên cứu ứng dụng nấm diệt cơn trùng lớn nhất thế giới. Ở Úc thử nghiệm diệt sâu hại mía, diệt lồi mối Coptotemes bằng M .anisopliae. Ở Trung Quốc người ta sử dụng nấm P.farinosus, B. bassiana, M.anisopliae phịng trừ Dendrolimus tabulaeformis. Các nước Bắc Âu cũng sử dụng nấm sợi trong phịng trừ cơn trùng cĩ hại. Ở Việt Nam, vào những năm 70 của thế kỷ 20 cũng cĩ những cơng trình nghiên cứu về nấm diệt cơn trùng và ứng dụng sản xuất chế phẩm diệt cơn trùng. 1.2. Giới thiệu sơ lược về rừng ngập mặn huyện Cần giờ thành phố Hồ Chí Minh [24], [25], [42]. 1.2.1. Đặc điểm chung của rừng ngập mặn. RNM là các vùng sình lầy cát ngập triều ven biển ở các khu vực thuộc kinh độ ơn hịa trung bình và cao là rừng ngập mặn (mangrove) trong các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới của thế giới. Đất ngập nước cĩ rừng ven biển là phức hệ thảm thực vật cây gỗ, đất than bùn bở rời và hầu như khơng cĩ nền đáy, cĩ khả năng thích nghi cả hai phương diện: ngập lụt và độ mặn. Tầm quan trọng của đầm lầy rừng ngập mặn trong vận chuyển chất hữu cơ đến chuỗi thức ăn ven biển vùng bên cạnh, đến sự ổn định vật lý đối với bờ biển như chống xĩi mịn, sạt lở, bảo vệ các vùng nội địa khỏi sự phá hoại của giĩ bão và sĩng biển, cĩ tác dụng như những bồn chứa các chất dinh dưỡng và cacbon[24]. Chức năng quang trọng của hệ sinh thái rừng ngập mặn là sức sản xuất sơ cấp thuần và sức sản xuất sơ cấp thơ [24]. 1.2.2.Đặc điểm của RNM huyện Cần Giờ Thành phố Hồ Chí Minh: 1.2.2.1.Điều kiện tự nhiên sinh thái của rừng ngập mặn Cần Giờ Rừng Sác Cần Giờ là vùng rừng ngập mặn của thành phố Hồ Chí Minh. Trước đây, vốn là khu rừng nguyên sinh xuất hiện theo lịch sử của quá trình hình thành bãi bồi vùng cửa sơng ven biển với các lồi cây phổ biến như Đước (Rhizophora apiculata), Đưng (Rhizophora mucronata), Dà (Ceriops spp), Vẹt (Bruguiera spp).v.v..Theo các tài liệu cũ, một số vết tích gốc cây được phát hiện trong quá trình đào kênh mương, đào mĩng làm nhà người dân đã phát hiện rừng ở đây đã từng phát triển khá tốt với những cây to, lớn cĩ chiều cao 20- 25 m, đường kính từ 35- 40 cm hoặc cao hơn. Hình1.8. Cảnh quan nơi lấy mẫu nghiên cứu của RNM Cần Giờ. Hàng trăm năm qua miền đất ngập triều ven biển này đã trải qua nhiều thay đổi. Các khu rừng ngập mặn trù phú xưa kia đã bị hũy diệt hồn tồn, đặc biệt là các đợt rải chất khai quang trong chiến tranh (1965- 1970). Sau 23 năm tích cực gây trồng và bảo vệ (từ năm 1978 đến 2002) rừng đã dần được phục hồi với thành phần lồi cây phong phú, đa dạng cũng như các quần xã thực vật tiêu biểu và đặc trưng. Năm 2000 tổ chức UNESCO đã cơng nhận rừng ngập mặn Cần Giờ là khu dự trữ sinh quyển của thế giới, đầu tiên của Việt Nam [25]. 1.2.2.2.Vị trí địa lý [42]. Rừng ngập mặn Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sơng Đồng Nai- Sài gịn đổ ra biển Đơng ở cửa Xồi Rạp, Đồng Tranh và vịnh Gành Rái. Rừng Sác nằm ở điạ bàn huyện Cần Giờ, là cửa ngõ Đơng Nam của Thành phố Hồ Chí Minh, cách trung tâm thành phố khoảng 30 km và nĩ được hình thành do bồi tụ phù sa của hệ thống các sơng lớn (Sồi Rạp, Lịng Tàu) trước khi ra biển Đơng. Diện tích tự nhiên: 71.361 ha trong đĩ diện tích rừng và đất rừng là 38.664 ha [25]. 1.2.2.3.Thổ nhưỡng, khí hậu, độ mặn [42], [25]. - Rừng ngập mặn Cần Giờ phát triển trên một đầm mặn mới, do phù sa sơng mang đến và lắng đọng tạo thành nền đất. Đất được tạo ra bởi tổng hợp các quá trình lắng tụ trầm tích sét, phèn hĩa và nhiễm mặn. Cho đến nay các lớp đất sâu chưa kết chặt nên khơng cĩ khả năng tạo thành đất nền rắn chắc, cĩ chứa lượng cao lưu huỳnh ở dạng khử khơng cĩ lợi cho nơng nghiệp và một lượng muối (NaCl) cao. - Khí hậu rừng mang đặc tính nĩng ẩm và chịu chi phối của qui luật giĩ mùa cận xích đạo với 2 mùa: mùa mưa (từ tháng 5 đến tháng 10), mùa khơ (từ tháng 11 đến tháng 4). - Lượng mưa trung bình từ 1.300 mm – 1.400 mm hàng năm (thấp nhất khu vực) - Qua các số liệu đo độ mặn từ năm 1977 đến năm 2000, cho thấy độ mặn lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém. - Vào tháng 4 nước mặn xâm nhập sâu hơn vào trong đất liền, do đĩ độ mặn của nước trong rừng được nâng cao lên. Cịn vào tháng 9, 10 nước ngọt từ sơng đẩy lùi nước mặn ra biển làm hạ bớt độ mặn. - Từ khi thủy điện Tri An hoạt động, thì độ mặn đã giảm từ 9 0/00 xuống 4 0/00 và tại Tam Thơn Hiệp độ mặn chỉ đạt 18 0/00 . Độ mặn 24 - 30 0/00 mùa khơ. - Ngược lại vào mùa mưa, độ mặn lại tăng hơn so với trước do lượng nước xả của hồ Trị An giảm đi [25]. 1.2.2.4. Các giá trị chủ yếu của rừng ngập mặn Cần Giờ [25],[19]. Vùng ven biển Cần Giờ cĩ các sinh cảnh tự nhiên và sinh cảnh nhân tạo. Sinh cảnh cĩ giá trị đa dạng sinh học cao nhất là các bãi bồi và RNM tự nhiên ít bị tác động. Thực vật ưu thế trong RNM thuộc về lồi Trang (Kandelia candel), Bần, Sú, Đước Đơi (Rhizophorz apiculata), Mắn Trắng (Avicennia alba)…và khoảng 30 lồi cây ngập mặn khác là mơi trường sống của nhiều lồi nấm sợi. Nhờ cĩ chủ trương bảo tồn, trồng lại RNM làm cho các lồi cây được phục hồi sau chiến tranh tạo điều kiện cho các lồi vi sinh vật trong đất, tảo phù du sinh sơi phát triển, tham gia vào chu trình tuần hồn vật chất của hệ sinh thái rừng ngập mặn, bổ sung tính đa dạng sinh học của vùng đất ẩm, ngập triều ven biển này. Các loại tảo là nguồn thức ăn cho các lồi thủy sản ở cửa sơng, vùng triều. Các lồi vi khuẩn, sinh vật đáy, nấm sợi, nấm men…giử vai trị quan trọng trong việc phân hủy các chất hữu cơ rơi rụng, xác bả các lồi động vật rừng chết, khống hĩa cung cấp chất dinh dưỡng cho các lồi tảo phù du, ấu trùng tơm cua, cá …trong rừng và cả ven biển. Một điều rất quan trọng là ngay ở cả Cần Giờ cĩ các chủng nấm sợi như Penicilium, Asperillus, Cladosporium, Canninghamela cĩ khả năng phân giải đến 50- 70 % lượng dầu DO (Phan Nguyên Hồng và cộng sự 2004), tạo enzym ngoại bào cĩ khả năng phân giải cellulose hoặc cĩ khả năng sinh các loại kháng sinh. Đây là nguồn gen quí giá chưa được khai thác đặc biệt là nấm sợi sinh kháng sinh. Với độ che phủ cao chính là lá phổi xanh của thành phố. Đây là vùng xử lý khí độc, điều tiết nhiệt độ, độ ẩm, ngăn giĩ bảo. Ngồi ra RNM Cần Giờ là khu vực quan trọng đối với ngư nghiệp, khai thác hải sản ở các bãi bồi ngập triều, nơi kiếm ăn và sinh sản của nhiều lồi cá , tơm cua, đồng thời chúng đĩng vai trị quan trọng đối với việc duy trì năng suất các sản phẩm của biển vùng ven bờ. RNM Cần Giờ cịn cĩ tiềm năng lớn về du lịch sinh thái. Chính các yếu tố tự nhiên đã tạo ra nét riêng biệt mơi trường sinh thái của Cần Giờ và quyết định đến sự phân bố tài nguyên tại đây. Tĩm lại: Hệ sinh thái RNM Cần Giờ là nơi lưu trữ nguồn gen quý hiếm do đặc trưng của vùng đất khơng ổn định, độ ẩm cao, sự dao động của thủy triều ra vào thường xuyên, làm VSV ở đây cĩ nguồn gen dễ biến đổi để thích nghi với mơi trường. Đây là hệ sinh thái cĩ năng suất sinh học cao nhất trong hệ sinh thái, nơi hơi tụ của sự đa dạng về sinh vật đất liền lẫn sinh vật biển. Nấm sợi được phân bố khắp nơi ở RNM. Chúng ta cĩ thể thấy rõ vai trị to lớn của các nhĩm nấm sợi trong rừng ngập mặn cũng giống như trong bất kỳ hệ sinh thái nào khác, nĩ khơng những tham gia vào vịng tuần hồn vật chất, khép kín chu trình sinh địa hĩa mà cịn là tác nhân kiểm sốt sinh học hữu hiệu giữ cân bằng sinh thái. Nấm sợi cĩ khả năng sinh kháng sinh là nguồn gen quí hiếm đặc thù cho hệ sinh thái rừng ngập mặn cĩ ý nghĩa sinh thái và cơng nghệ sinh học. Đây là nguồn tài nguyên quí giá của đất nước. Vì vậy việc đầu tư tìm hiểu khai thác, lưu giữ và bảo tồn chúng là việc làm hết sức cần thiết và cấp bách. Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1.Đối tượng nghiên cứu Vị trí lấy mẫu nghiên cứu trên bảng đồ huyện Cần Giờ TP HCM Ghi chú: : Vị trí lấy mẫu Hình 2.1. Vị trí lấy mẫu trên bảng đồ huyện Cần Giờ TPHCM [53]. - Các chủng nấm sợi được phân lập từ RNM ở các xã An Thới Đơng, Tam Thơn Hiệp, Long Hịa, Bình Khánh, khu Lâm Viên Cần Giờ thuộc huyện Cần giờ, thành phố Hồ Chí Minh. - Thời gian lấy mẫu vào tháng 7,8,9 (1 lần / tháng - mùa mưa). - Các vi sinh vật kiểm định gồm: + Bacillus subtilis ATCC 6633 nhận từ PTN vi sinh Đại học Khoa học Tự Nhiên TPHCM. + Escherichia coli ATCC 15224 nhận từ phịng xét nghiệm vi sinh Bệnh viện Bình Dân. + Candida albicans, Staphylococcus aureus 290 P, Pseudomonas aeroginosa nhận từ phịng vi sinh của Viện Pasteur, TP Hồ Chí Minh. + VK được phân lập từ bệnh phẩm của bệnh nhân tại bệnh viện Bình Dân, gồm E.coli, Pseu.aeroginosa, Enterobacter (1), (2) các chủng này được phân lập từ 2 bệnh nhân khác nhau và kháng với các loại kháng sinh khác nhau( xem phụ lục). - Các nấm gây bệnh cây trồng: Nhận từ Viện Khoa học Kỹ thuật Nơng nghiệp Miền Nam, TPHCM: + Fusarium oxysporum gây bệnh héo rũ và chết vàng ở cây (phân lập từ cây chè). + Rhizoctonia sp gây bệnh khơ vằn (phân lập từ cây bồ ngĩt). + Sclerotium sp gây bệnh thối thân (phân lập từ cây thuốc lá). Nhận từ phịng Bệnh cây trồng của khoa Nơng học- Đại học Nơng Lâm TPHCM: + Curvularia sp gây bệnh đen hạt ở lúa (phân lập từ cây lúa). + Phythophthora gây bệnh thối thân (phân lập từ cây dứa). + Pyricularia oryzae gây bệnh đạo ơn (phân lập từ cây lúa). - Các dạng cơn trùng dùng thử nghiệm: + Ấu trùng dâu tằm tuổi ba nhận từ cơng ty Dâu tằm tơ – huyện Bảo Lộc, Tỉnh Lâm Đồng. + Sâu tơ (rau cải ) tuổi ba nhận từ Viện nghiên cứu của Cơng ty cổ phần Thuốc sát trùng Việt Nam- VIPESCO, Quận Gị vấp, TPHCM. 2.1.2. Hĩa chất - Các loại đường chuẩn: glucoza, fructoza, saccaroza, galactoza, (Trung Quốc), rĩ đường (Việt Nam). - Các loại hĩa chất khác: KH2 PO4, K2 HPO4, MgSO4.7 H2O, MgSO4, FeSO4.7 H2O, NaCl, KNO3,(NH4 ._.t tính kháng sinh ở nồng độ muối 20 %. Điều này chứng tỏ đây là những chủng nấm du nhập từ đất liền vào và thích nghi với điều kiện ở RNM, nơi mà mỗi ngày đều cĩ nước biển ra vào với nồng độ muối khá cao khoảng 40/0 . a b c d Hình 3.16. Hoạt tính đối kháng của chủng Đ 33.1(a)( ở nồng độ muối 7%) với E.coli (mặt trái đĩa pêtri) chủng T1.2 (b) (ở nồng độ muối 3 % ) với B.subtilis. chủng T’1 (c)(ở nồng độ muối 10 %) với E.coli chủng T7.1 (d)( ở nồng độ muối 5%) với B.subtili. 3.5.3.2. Ảnh hưởng của pH lên hoạt tính kháng sinh. Nuơi cấy các chủng T.viride T 1.2, A. foetidus T’1, A. tubingensis T 7.1, P.citrinum Đ 33.1 trên MT 2, điều chỉnh pH trong mơi trường ban đầu, sau 4 ngày cấy thử hoạt tính kháng sinh theo phương pháp 2.2.3.2. với VKKĐ là B.subtilis. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.12. Bảng 3.12. Ảnh hưởng của mơi trường pH ban đầu lên họat tính kháng sinh Hoạt tính kháng sinh ( D- d, mm) Độ pH STT CHỦNG NC 3 4 5 6 7 8 9 1 T 1.2 5 25 27 26 20 0 0 2 T’1 0 18 30 30 15 0 0 3 T 7.1 0 22 24 25 14 0 0 4 Đ 33.1 0 15 26 25 0 0 0 0 5 10 15 20 25 30 (D-d, mm) 3 4 5 6 7 8 9 Độ pH ban đầu T1.2 T'1 T7.1 Đ33.1 Đồ thị 3.6. Ảnh hưởng của mơi trường pH ban đầu lên hoạt tính kháng sinh Qua bảng 3.12 và đồ thị 3.6, cho thấy pH ảnh hưởng lớn đến khả năng sinh tổng hợp kháng sinh, pH quá cao hoặc quá thấp đều khơng cĩ lợi cho khả năng sinh trưởng cũng như sinh tổng hợp kháng sinh. Tất cả các chủng nghiên cứu đều cĩ khả năng sinh kháng sinh ở mơi trường ban đầu cĩ pH trung tính và hơi axít. Đối với chủng T.viride T1.2 cĩ khả năng cho hoạt tính kháng sinh ở pH từ 3 đến 7. Các chủng A. foetidus T’1, A. tubingensis T 7.1 cĩ khả năng sinh KS ở pH từ 4 đến 7. Cịn chủng P.citrinum Đ 33.1 cĩ khả năng sinh KS ở pH từ 4 đến 6. a (pH= 4 ) b (pH=4) Hình 3.17. Hoạt tính kháng sinh của chủng T.viride T1.2 (a), chủng A. tubingensis T7.1(b) 3.5.3.3. Xác định thời gian sinh tổng hợp chất kháng sinh. Để xác định trong khoảng thời gian nuơi cấy nào CKS được tổng hợp và cĩ hoạt tính cao, chúng tơi tiến hành khảo sát thời gian sinh tổng hợp CKS của các chủng nấm nghiên cứu. Nuơi các chủng T.viride T 1.2, A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 trên MT 2 theo phương pháp 2.2.3.2 để thử hoạt tính KS qua từng ngày nuơi cấy, từ ngày thứ 2 đến ngày thứ 7 sau khi cấy, với VKKĐ là B. subtillus. Kết quả khảo sát được ghi nhận ở bảng 3.13. Bảng 3.13. Xác định thời gian sinh tổng hợp chất kháng sinh. Hoạt tính kháng sinh (D- d, mm) Thời gian (ngày). STT CHỦNG NC 2 3 4 5 6 7 1 T 1.2 0 8 25 26 17 2 2 T’1 0 7 32 30 20 11 3 T 7.1 0 5 27 24 10 5 4 Đ 33.1 0 3 26 22 15 8 0 5 10 15 20 25 30 35 2 3 4 5 6 7 Thời gian (ngày) (D -d , m m ) T1.2 T '1 T7.1 Đ33.1 Đồ thị 3.7. Xác định thời gian sinh tổng hợp chất kháng sinh. Qua bảng 3.13 và đồ thị 3.7 cho thấy: Các chủng sau 2 ngày nuơi cấy chưa thể hiện hoạt tính kháng sinh, chỉ thể hiện rõ từ ngày thứ 3 trở đi và hoạt tính giảm dần vào ngày thứ 6 đến thứ 7. Chủng A. foetidus T’1, A.tubingensis T7.1, P.citrinum Đ 33.1 cho hoạt tính mạnh nhất vào ngày thứ 4 và giảm vào ngày thứ 5 sau khi nuơi cấy nấm. Chủng T.viride T1.2 thì hoạt tính kháng sinh đạt cao vào ngày thứ 5 và giảm vào ngày thứ 6. Thời gian nuơi cấy càng lâu thì hoạt tính kháng sinh của các chủng càng yếu. Thời gian sinh kháng sinh nhiều nhất của các chủng nghiên cứu khơng giống nhau vì mỗi chúng nấm cĩ tốc độ sinh trưởng và phát triển khác nhau mà CKS là sản phẩm trao đổi chất bậc hai nên thời gian sinh KS khơng trùng khớp với thời gian sinh trưởng của chúng. Kết quả trên tạo cơ sở cho việc tách chiết CKS ở đúng thời điểm các chủng nấm sợi sinh CKS nhiều nhất để thu được CKS cĩ hoạt tính mạnh hơn. Cĩ thể ở thời điểm sinh nhiều chất KS nhất thì hoạt tính kháng các VSVKĐ mạnh hơn. 3.5.3.4.Độ bền nhiệt. Chúng tơi tiến hành khảo sát khả năng chịu nhiệt của dịch chiết kháng sinh thơ thu từ 4 chủng nấm nghiên cứu T.viride T 1.2, A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 khi nuơi cấy trên MT 2, khơng cĩ agar. Dịch chiết kháng sinh thơ đem giữ ở nhiệt độ 600C, 800C, 1000C, 1150C, 121 0C với thời gian nhất định rồi thử hoạt tính kháng sinh trên VK B.subtilis theo phương pháp 2.2.3.2. Kết quả được ghi nhận ở bảng 3.14. Bảng 3.14 : Độ bền nhiệt của KS trong dịch lên men của các chủng T.viride T 1.2, A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 Hoạt tính kháng sinh ( D – d , mm) Nhiệt độ Thời gian T’1 T 7.1 T 1.2 Đ 33.1 35 - 39 0C Đối chứng 20 18 30 28 60 0 C 10’ 20 18 29.5 28 30’ 20 18 29.5 28 60’ 20 18 29.5 28 80 0 C 10’ 19 17.5 29.5 28.5 30’ 20 17.5 30 28 60’ 19 18 30 28 100 0 C 10’ 20 18 30 27 30’ 19 18 30 27 60’ 19 18 30 28 115 0 C 10’ 20 18 29.5 28 30’ 20.5 18 30 28 60’ 20 18.5 29.5 28 121 0 C 10’ 19 18 29.5 28 30’ 19 18 30 28 60’ 19.5 18 29.5 28 Qua bảng 3.14 chúng tơi nhận thấy các dịch chiết kháng sinh thơ này rất bền với nhiệt độ, hoạt tính kháng sinh khơng hề giảm khi ở nhiệt độ cao, kể cả 1210 C trong vịng 60 phút. Điều này thuận lợi trong khâu tách chiết, tinh chế, sử dụng trong cơng nghiệp, trong sản xuất phân bĩn và bảo quản. Kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu [41]. a b Hình 3.18. Khả năng bền nhiệt dịch chiết KS thơ của chủng A. foetidus T’1 (a) ; A.tubingensis T 7.1(b) ở nhiệt độ 1210C (mặt trái đĩa pêtri) 3.6. Bước đầu tìm hiểu khả năng diệt cơn trùng của các chủng nấm nghiên cứu: Các chủng nấm sợi RNM được tuyển chọn đều cĩ khả năng sinh kháng sinh và để tìm ra hướng ứng dụng sâu hơn cho các chủng nấm nghiên cứu sau khi khảo sát khả năng đối kháng với VSV gây bệnh ở người đã lờn các loại kháng sinh và nấm gây bệnh cho cây trồng, chúng tơi tiến hành tìm hiểu khả năng diệt sâu tơ, tằm bằng dịch nuơi cấy và bào tử trần của chúng. Dùng bào tử trần, phun 3 ml dịch nuơi cấy lên mỗi đĩa pêtri chứa khoảng 40 cá thể sâu tơ (hay tằm), sau đĩ theo dõi sự phát triển của chúng trong vịng 15 ngày. Kết quả khảo sát trên tằm, sâu tơ được ghi nhận ở bảng 3.15- 3.22, đồ thị 3.8- 3.15. Bảng 3.15. Khả năng diệt tằm của các chủng T.viride T1.2 Tỉ lệ ( %) chềt của tằm theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 0 0 2.5 7.5 12.5 12,5 DNC 10.0 15.5 17.5 25.5 70.0 72.5 BTT+HS 2.5 5.0 12.5 15.0 55.0 62.5 Chú thích: Dịch NC: dịch nuơi cấy, HS+ BTT: hệ sợi và bào tử trần 0 10 20 30 40 50 60 70 80 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % tằ m c hết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.8. Khả năng diệt tằm của các chủng T.viride T 1.2. Qua bảng 3.15 và đồ thị 3.8 cho thấy: Khi khơng xử lý bằng dịch NC thì tỉ lệ tằm chết là 12,5 % Khi xử lý tằm bằng dịch nuơi cấy nấm sợi T.viride T 1.2 đã xác định được LD 50 ( thời gian gây chết 50 % ) ở tằm sau 12 ngày là 70 %. Cịn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở tằm cũng sau 12 ngày là 55 %. Vậy tỉ lệ tằm chết do DNC cao hơn do BTT- HS. Khả năng diệt tằm của các chủng T.viride T 1.2 mạnh. Bảng 3.16. Khả năng diệt sâu tơ của chủng T.viride T 1.2. Tỉ lệ ( %) chềt của sâu tơ theo thời gian (ngày) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 2,5 10 10 10 10 10 Dịch NC 52.5 60,0 62,5 62,5 62,5 62,5 BTT + HS 0 45,0 50,0 50,0 50,0 50,0 0 10 20 30 40 50 60 70 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % sâ u ch ết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.9 Khả năng diệt sâu tơ của chủng T.viride T 1.2 Qua bảng 3.16 và đồ thị 3.9 cho thấy: Ở mẫu đối chứng tỉ lệ sâu chết 10% Khi xử lý sâu tơ bằng dịch nuơi cấy nấm sợi T.viride T 1.2 đã xác định được LD 50 ở sâu tơ sau 4 ngày 52,5%. Cịn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở sâu tơ cũng sau 8 ngày 50 %, vậy tỉ lệ sâu tơ chết do DNC cao hơn và thời gian sâu chết cũng nhanh hơn. Khả năng diệt sâu tơ của chủng T.viride T 1.2 ở mức trung bình. Hình 3.19. Khả năng diệt tằm và sâu của chủng T.viride T 1.2. Hình 3. 20. Khả năng diệt tằm và sâu tơ của các chủng A.tubingensis T 7.1 Bảng 3.17. Khả năng diệt tằm của các chủng A.tubingensis T 7.1 Tỉ lệ (%) chềt của tằm theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 0 0 2.5 7.5 12.5 12,5 ĐC DNC BTT + ĐC DNC HS+BT T ĐC DNC HS-BTT ĐC DNC HS + BTT ĐC DNC BTT+ HS Dịch NC 0 0 22,5 47,5 57,5 65,0 BTT + HS 0 0 0 0 27,5 50,0 0 10 20 30 40 50 60 70 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % tằm c hết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.10. Khả năng diệt tằm của chủng A.tubingensis T 7.1. Qua bảng 3.17 và đồ thị 3.10 cho thấy: Khi xử lý tằm bằng dịch nuơi cấy chủng nấm sợi A.tubingensis T 7.1 đã xác định được LD 50 ( thời gian gây chết 50 % ) ở tằm sau 12 ngày 57,5 %. Cịn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở tằm sau 14 ngày là 50 %, vậy tỉ lệ tằm chết do DNC cao hơn . Khả năng diệt tằm của chủng A.tubingensis T 7.1 ở mức trung bình. Bảng 3.18. Khả năng diệt sâu tơ của các chủng T 7.1 Tỉ lệ ( %) chềt của sâu tơ theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 2,5 10 10 10 10 10 Dịch NC 22.5 52,5 62,5 62,5 62,5 62,5 BTT + HS 0 37,5 52,5 52,5 52,5 52,5 0 10 20 30 40 50 60 70 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % sâ u ch ết NC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.11.Khả năng diệt sâu tơ của chủng A.tubingensis T 7.1 Qua bảng 3.18 và đồ thị 3.11 cho thấy: Khi xử lý sâu tơ bằng dịch nuơi cấy nấm sợi A.tubingensis T 7.1 đã xác định được LD 50 ở sâu tơ sau 6 ngày 52,5%. Cịn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở sâu tơ cũng sau 8 ngày 52,5 %, vậy tỉ lệ sâu tơ chết do DNC cao hơn và thời gian sâu chết cũng nhanh hơn. Khả năng diệt sâu tơ của chủng A.tubingensis T 7.1 mức trung bình. Bảng 3.19. Khả năng diệt tằm của các chủng A.foetidus T’1. Tỉ lệ ( %) chết của tằm theo thời gian (ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 0 0 2.5 7.5 12.5 12,5 Dịch NC 0 0 0 0 60 67,5 BTT + HS 0 0 0 7,5 20,0 55,0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % tằ m c hết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.12.Khả năng diệt tằm của chủng A.foetidus var acidus T’1. Qua bảng 3.19 và đồ thị 3.12 cĩ thể thấy: Khi xử lý tằm bằng dịch nuơi cấy chủng nấm sợi A.foetidus T’1 đã xác định được LD 50 (thời gian gây chết 50 %) ở tằm sau 12 ngày 60%. Cịn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở tằm sau 14 ngày là 55 %, vậy tỉ lệ tằm chết do DNC cao hơn . Khả năng diệt tằm của các chủng A.foetidus var acidus T’1 ở mức khá mạnh. Bảng 3.20. Khả năng diệt sâu tơ của các chủng A.foetidus var acidus T’1 Tỉ lệ ( %) chềt của sâu tơ theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 2,5 10 10 10 10 10 Dịch NC 22.5 50,5 57,5 57.5 57,5 57,5 BTT + HS 0 37,5 52,5 52,5 52,5 52,5 0 10 20 30 40 50 60 70 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % sâ u ch ết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.13. Khả năng diệt sâu tơ của các chủng A.foetidus var acidus T’1. Qua bảng 3.20 và đồ thị 3.13 cho thấy khi xử lý sâu tơ bằng dịch nuơi cấy nấm sợi A.foetidus T’1 đã xác định được LD 50 ở sâu tơ sau 6 ngày 50,5%. Cịn khi xử lý bằng BTT- HS xác định được LD50 ở sâu tơ sau 8 ngày 52,5 %, vậy tỉ lệ sâu tơ chết do DNC cao hơn và thời gian sâu chết cũng nhanh hơn. Khả năng diệt sâu tơ của các chủng A.foetidus var acidus T’1 ở mức trung bình. Hình 3.21 . Khả năng diệt tằm, sâu tơ của các chủng A.foetidus var acidus T’1 ĐC BTT+ HS DNC ĐC DNC HS+ BTT Hình 3.22. Khả năng diệt tằm và sâu tơ của chủng P.citrinum Đ 33.1 Bảng 3.21. Khả năng diệt tằm của các chủng P.citrinum Đ 33.1 Tỉ lệ ( %) chềt của tằm theo thời gian ( ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 0 0 2.5 7.5 12.5 12,5 Dịch NC 0 0 2,5 10,0 15,0 32,5 BTT + HS 0 0 0 2,5 5,0 27,5 0 5 10 15 20 25 30 35 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % tằ m c hế t DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.14. Khả năng diệt tằm của các chủng P.citrinum Đ 33.1 ĐC DNC BTT-HS ĐC DNC BTT+ Qua bảng 3.21 và đồ thị 3.14 cĩ thể thấy: khi xử lý tằm bằng dịch nuơi cấy chủng nấm sợi P.citrinum Đ 33.1 đã xác định được tỉ lệ tằm chết là 32,5 % sau 14 ngày nuơi cấy. Cịn khi xử lý bằng BTT- HS tỉ lệ tằm chết sau 14 ngày 27,5 %, vậy tỉ lệ tằm chết do DNC cao hơn. Khả năng diệt tằm của chủng P.citrinum Đ 33.1 yếu Bảng 3.22. Khả năng diệt sâu tơ của chủng P.citrinum Đ 33.1 Tỉ lệ ( %) chết của sâu tơ theo thời gian (ngày ) Tác nhân lây nhiễm 4 6 8 10 12 14 Đối chứng 2,5 10 10 10 10 10 Dịch NC 0 0 30 30 30 30 BTT + HS 0 0 25 25 25 25 0 5 10 15 20 25 30 35 4 6 8 10 12 14 Thời gian (ngày) Tỉ lệ % sâ u ch ết DNC BTT-HS ĐC Đồ thị 3.15. Khả năng diệt sâu tơ của chủng P.citrinum Đ 33.1 Qua bảng 3.22 và đồ thị 3.15 khi xử lý sâu tơ bằng dịch nuơi cấy nấm sợi P.citrinum Đ 33.1 đã xác định tỉ lệ chết ở sâu tơ sau 8 ngày 30%. Cịn khi xử lý bằng BTT- HS tỉ lệ chết ở sâu tơ sau 8 ngày 25%, vậy tỉ lệ sâu tơ chết do DNC cao hơn. Khả năng diệt sâu tơ của chủng P.citrinum Đ 33.1 yếu. * Các chủng nấm nghiên cứu đều cĩ khả năng diệt tằm, sâu tơ ở các mức độ khác nhau. Dịch chiết kháng sinh thơ (dịch nghiên cứu – DNC) cĩ hoạt lực mạnh hơn so với BTT và hệ sợi. -DNC của chủng T.viride T 1.2 cĩ khả năng diệt 70 % tằm sau 12 ngày, cịn BTT cĩ khả năng diệt 55% sau 12 ngày. -DNC của chủng A.tubingensis T 7.1 cĩ khả năng diệt 57,5 % tằm sau 12 ngày, cịn BTT cĩ khả năng diệt 50% sau 14 ngày. -DNC của chủng A.foetidus T ‘1 cĩ khả năng diệt 60 % tằm sau 12 ngày, cịn BTT cĩ khả năng diệt 55% sau 14 ngày. -DNC của chủng P.citrinum Đ 33.1 cĩ khả năng diệt 32,5 % tằm sau 14 ngày, cịn BTT cĩ khả năng diệt 27,5 % sau 14 ngày, chủng này cĩ khả năng diệt tằm yếu. - DNC T.viride T 1.2 cĩ khả năng diệt 52,5% sâu tơ sau 4 ngày và 62,5% sau 8 ngày, cịn BTT cĩ khả năng diệt 45 % sâu tơ sau 6 ngày. - DNC A.tubingensis T 7.1 cĩ khả năng diệt 52,5% sâu tơ sau 6 ngày, cịn BTT cĩ khả năng diệt 52,5% sâu tơ sau 8 ngày. - DNC A.foetidus T’1 cĩ khả năng diệt 50,5% sâu tơ sau 6 ngày, cịn BTT cĩ khả năng diệt 52,5% sâu tơ sau 8 ngày. - DNC của chủng P.citrinum Đ 33.1 cĩ khả năng diệt 30% sâu tơ sau 8 ngày, cịn BTT cĩ khả năng diệt 25% sâu tơ sau 8 ngày. Kết quả trên cho thấy, các chủng nấm nghiên cứu cĩ khả năng diệt tằm mạnh hơn diệt sâu, kết quả này cũng phù hợp với nghiên cứu của tác giả Nguyễn Vĩnh Hà (2002). Cĩ thể do sâu tơ sống trong điều kiện tự nhiên luơn phải chống chọi với các điều kiện bất lợi của mơi trường nên sức đề kháng cao hơn so với tằm. Thời gian chết của sâu tơ nhanh hơn so với tằm, vì thời gian sinh trưởng của sâu tơ ngắn hơn thời gian sinh trưởng của tằm rất nhiều. Qua các lần thí nghiệm lặp lại thử khả năng diệt cơn trùng chúng tơi thấy: khi cơn trùng mới lột xác, nếu tiến hành thử nấm sợi ngay thì thời gian diệt cơn trùng chết sẽ nhanh hơn do khi mới lột xác da của chúng cịn mềm, lớp biểu bì bên ngồi chưa hình thành hồn chỉnh dẫn tới dịch kháng sinh sẽ dễ dàng đi vào bên trong để phân giải các chất mà khơng bị lớp biểu bì da cản trở. Dịch chiết KS thơ cĩ hoạt độ diệt tằm, sâu tơ cao hơn hệ sợi và bào tử thể. Nấm sợi cũng như các VSV khác đều sử dụng nguồn dinh dưỡng khác nhau trong tự nhiên để sống là nhờ cĩ hệ enzym nơi, ngoại bào của chúng. Các chủng cĩ khả năng diệt cơn trùng, thì các enzym thủy phân ngoại bào đĩng vai trị quan trọng trong quá trình phân hủy da hay biểu bì của cơn trùng. Nhờ cĩ hệ enzym phong phú thì các chủng nấm sợi này dễ tồn tại trong tự nhiên. Trong thời gian gần đây, nhiều tác giả đã tách chiết được ngoại độc tố destruxin từ dịch nuơi cấy nấm sợi cĩ khả năng diệt cơn trùng Beauveria và Metarhizium. Theo Genthner và cộng tác viên, Sloman cũng xác định từ dịch nuơi cấy chủng Metarhizium sub sp. Anisopliae Ma.83 loại độc tố destruxin A. Cĩ thể những chủng nấm sợi này khơng những diêt cơn trùng bằng hệ enzym mà bằng cả độc tố của mình nữa.Vì thời gian cĩ hạn nên chúng tơi chưa đi sâu vào vấn đề này. Cả 4 chủng nấm sợi nghiên cứu đều cĩ khả năng diệt tằm, sâu tơ ở các mức độ khác nhau. Trong đĩ chủng T.viride T 1.2 cĩ hoạt lực mạnh với sâu và tằm, chủng A.foetidus T’1 và A.tubingensis T 7.1 cĩ hoạt lực trung bình, cịn chủng P.citrinum Đ 33.1 cĩ hoạt lực yếu. Các chủng này tiếp tục được lưu giữ, nghiên cứu và khai thác tiềm năng ứng dụng làm thuốc trừ sâu sinh học cho các cây vùng ngập mặn.Với hoạt tính đối kháng cao với các lồi VSV cĩ hại, những nấm sợi này chính là các tác nhân tự nhiên kiểm sốt sinh học, giữ cân bằng sinh thái trong hệ sinh thái RNM. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ. 1.Kết luận. 1.1.Kết quả phân lập và tuyển chọn các chủng nấm sợi cĩ khả năng sinh KS của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM huyện Cần Giờ. - Từ 312 chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, chúng tơi đã khảo sát hoạt tính kháng sinh, cĩ 134 chủng cĩ hoạt tính kháng sinh. - Cĩ 39/312 chủng ( chiếm 12,5%) kháng cả VK G+ lẫn G- - Đã tuyển chọn được 4 chủng  Chủng T.viride T 1.2 cĩ hoạt tính kháng sinh phổ rộng, vừa kháng nấm gây bệnh (C.albicans) ở người, vừa kháng VK G+, vừa kháng VK G-, vừa kháng 6/ 6 nấm gây bệnh ở cây trồng, kháng 3/ 5 chủng VK gây bệnh đã lờn các loại KS.  Chủng A.foetidus T’1, A.tubingensis T7.1 vừa kháng VK gram dương vừa kháng VK gram âm, vừa kháng nấm gây bệnh ở cây trồng, kháng 5/ 5 chủng VK gây bệnh đã lờn các loại KS.  Chủng P.citrinum Đ 33.vừa kháng VK gram dương vừa kháng VK gram âm, vừa kháng nấm gây bệnh ở cây trồng, kháng 3 / 5 chủng VK gây bệnh đã lờn các loại KS. 1.2. Đã nghiên cứu đặc điểm cơ bản của các chủng nấm sợi tuyển chọn (đặc điểm sinh học & phân loại) * Đã định danh - Chủng T 1.2 là giống Trichoderma viride Pers ex. SF Gray aggr . - Chủng T’1 là giống Aspergillus foetidus var acidus Naka, Simo and Wat. - Chủng T 7.1 là giống Aspergillus tubingensis (Schober) Messeray. - Chủng Đ 33.1 là giống Penicillium citrinum Thom. * Đã nghiên cứu một số các đặc điểm sinh học của 4 chủng tuyển chọn T.viride T 1.2, A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ33.1. - Đều cĩ khả năng sinh enzym ngoại bào như cellulaza, proteaza, amylaza ở mức độ thấp đến trung bình. - Cĩ khả phân giải dầu mạnh như chủng P.citrinum Đ 33.1, trung bình như chủng A.tubingensis T 7.1. - Cĩ khả năng sinh trưởng và phát triển ở MT cĩ các nồng độ muối khác nhau thậm chí ở nồng độ 20% (NaCl). Tuy nhiên, nếu MT khơng cĩ muối thì mức độ tăng trưởng mạnh hơn - Sử dụng tốt nguồn cacbon: glucose, succrose,CMC, tinh bột, galactose và phát triển mạnh trên MT rỉ đường. - Sử dụng tốt nguồn nitơ: NaNO3, cao thịt, bột đậu, sử dụng trung bình mơi trường NH4 Cl, (NH4)2SO4, NH4NO3, sử dụng yếu NaNO2. - Đã xác định thời gian sinh trưởng và phát triển của: Chủng T. viride T 1.2 phát triển rất nhanh, sau 1 ngày cấy đã cĩ đường kính khuẩn lạc 8mm. Chủng A. foetidus T’1 và chủng A. tubingensis T 7.1 phát triển ở mức trung bình, đường kính khuẩn lạc 30 – 40 mm sau 7 ngày cấy. Chủng P. citrinum Đ 33.1 thì phát triển chậm, đường kính khuẩn lạc 22 - 25 mm sau 7 ngày cấy. * Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến tính chất của chất kháng sinh. - Dịch chiết KS thơ của 4 chủng nấm NC rất bền với nhiệt độ: ở 1210C, trong vịng 60 phút thì hoạt tính kháng sinh vẫn khơng thay đổi. - Đã thử hoạt tính kháng sinh khi nuơi cấy trên các mơi trường với nồng độ muối khác nhau, các chủng A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 vẫn cĩ họat tính kháng sinh với nồng độ NaCl 10%. Cịn chủng T.viride T 1.2 chỉ cĩ hoạt tính kháng sinh mạnh khi được nuơi cấy trên mơi trường khơng cĩ muối. * Đã thử hoạt tính kháng sinh khi nuơi cấy trên mơi trường với độ pH ban đầu khác nhau. Hoạt tính kháng sinh mạnh khi mơi trường ban đầu nuơi cấy ở pH trung tính và hơi axít từ 4,5  6. * Khi khảo sát sự sinh trưởng, phát triển theo thời gian chúng tơi thử hoạt tính kháng sinh: - Các chủng đều cĩ hoạt tính kháng sinh từ ngày thứ 4 sau khi cấy. - Chủng T. rivide T1.2 hoạt tính kháng sinh mạnh nhất vào ngày thứ 5 sau khi cấy. - Các chủng A.tubingensis T 7.1, A.foetidus T’1, P.citrinum Đ 33.1 hoạt tính mạnh nhất vào ngày thứ 4 sau khi cấy. 1.3. Đã tìm hiểu khả năng ứng dụng của các chủng nấm sợi đã được tuyển chọn trong chống cơn trùng hại cho cây trồng. - DNC cĩ khả năng diệt tằm, sâu tơ với tỉ lệ cao hơn và thời gian chết nhanh hơn khi sử dụng BTT-HS. - Chủng T. rivide T1.2 hoạt lực mạnh với tằm, hoạt lực trung bình với sâu. - Chủng A.tubingensis T 7.1 hoạt lực trung bình với tằm và sâu tơ. - Chủng A.foetidus T’1 hoạt lực khá mạnh với tằm, hoạt lực trung bình với sâu tơ. - Chủng P.citrinum Đ 33.1 hoạt lực yếu với tằm, sâu tơ. 2. Kiến nghị. Vì thời gian thực hiện đề tài cĩ hạn, các trang thiết bị ở phịng thí nghiệm chỉ ở mức cơ bản. Mong rằng các nghiên cứu sau sẽ tiếp tục khảo sát sâu hơn về các chủng nấm sợi RNM cĩ khả năng sinh kháng sinh như:  Phân loại các chủng nấm sợi bằng kỷ thuật di truyền phân tử.  Xác định được bản chất chất kháng sinh do các chủng nấm sợi sinh ra.  Nghiên cứu ứng dụng dịch chiết kháng sinh trong bảo vệ động vật hoặc thực vật. TÀI LIỆU THAM KHẢO.    Tiếng Việt: 1. Lê Huy Bá (2004), Mơi trường, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TP HCM 2. Nguyễn Thị Thúy Bạch (2003), Nghiên cứu Streptomyces Rừng ngập mặn Thái Thụy- Thái Bình, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, tr .14-69. 3. Phạm Văn Biên, Bùi Cách Tuyến (2003), Cẩm nang sâu bệnh hại cây trồng, tập 1, 2, Nhà xuất bản Nơng nghiệp, TP Hồ Chí Minh. 4. Nguyễn Văn Cách (2004), Cơng nghệ lên men các chất kháng sinh, Nhà xuất bản khoa học và kỹ thuật, Hà Nội, tr. 20-28. 5. Nguyễn Hồng Chiến (2000), Nghiên cứu chủng xạ khuẩn Streptomyces V6 sinh chất kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh cà chua, Luận án Thạc sĩ Sinh học, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, tr. 8- 23. 6. Phạm Thị Quỳnh Châu (2001), Nghiên cứu hệ nấm mốc trên cà phê nhân ở một số tỉnh miền nam Việt Nam, sơ bộ định tính một vài độc tố và enzym của một số lồi nấm mốc trên cà phê nhân, Khĩa luận cử nhân khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, TP HCM, tr. 10. 7. Lê Huy Chính, Nguyễn Vũ Trung (2005), Cẩm nang vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 8. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, Tập 1, 2, Nhà xuất bản ĐH Sư phạm, Hà Nội, (1) tr. 196-203, (2) tr. 270. 9. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vât học (TậpI, II), Nhà xuất bản Đại học và Trung học Chuyên nghiệp , Hà Nội. 10. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đồn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vât học (Tập III), Nhà xuất bản Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 360 11. Trịnh Thị Mỹ Dung (2003), Phân lập, khảo sát đặc điểm các chủng xạ khuẩn phân lập từ đất, khĩa luận cử nhân Sinh học, Trường Đại học Sư phạm TPHCM, tr. 4-10. 12. Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phịng chống nấm mốc & mycotoxin, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội, tr. 137. 13. Nguyễn Lân Dũng, Vi sinh vật tổng hợp, Nhà xuất bản Khoa học & Kỹ thuật, Hà Nội. 14. Hội nghị Khoa học sinh viên Eureka (2002), Khảo sát hoạt tính các hệ enzym thủy phân chiết tách từ mơi trường nuơi cấy Trichoderma và thử ứng dụng chế biến phân hữu cơ vi sinh, Đồn thanh niên cộng sản Hồ Chí Minh, Trường Đại học khoa học Tự nhiên 15. Nguyễn Thị Thu Hà (2001), Nghiên cứu đặc điểm chủng xạ khuẩn SD HT và ứng dụng trong việc diệt nấm và tuyến trùng hại cây trồng, khĩa luận Cử nhân Sinh học, trường Đại học Sư phạm TPHCM, tr. 15. 16. Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát họat tính đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ rừng ngập mặn khu vực Giao Thủy, Nam Định và Thái Thụy, Thái bình, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, tr. 5- 30. 17. Bùi Thị Việt Hà, Kiều Hữu Ảnh (2002), Phân lập và tuyển chọn xạ khuẩn sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật, Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội. 18. Bùi Thị Việt Hà, Kiều Hữu Ảnh (2002), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật của hai chủng xạ khuẩn T41 và D- 42, Đại học Khoa học Tự nhiên- Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 13. 19. Mai Thị Hằng, Phan Nguyên Hồng (2002), Đánh giá vai trị của vi sinh vật trong hệ sinh thái rừng ngập mặn, Trường Đại học Sư Phạm, Hà Nội, tr. 8- 24, 101-128. 20. Nguyễn Hiếu Hạnh, Vũ Thị Thanh Hồn (2006), Nghiên cứu biện pháp xử lý hạt giống bằng thuốc hĩa học để phịng trừ nấm Aspergillus spp gây bệnh mốc hạt sau khi gieo, Viện Khoa học Kĩ thuật Nơng nghiệp Miền Nam, TPHCM 21. Đậu Ngọc Hào, Lê Thị Ngọc Diệp (2003), Nấm mốc và độc tố Aflatoxin trong thức ăn chăn nuơi, Nhà xuất bản Nơng nghiệp Hà Nội. 22. Trương Phước Thiên Hồng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thủy phân amylase, cellulase, peectinase thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ Miền Đơng Nam bộ, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, TPHCM, tr. 5-11-16-95. 23. Phạm Thành Hổ (2005), Nhập mơn cơng nghệ sinh học, Nhà xuất bản Giáo Dục. 24. Lê Văn Khoa (2005), Đất ngập nước, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr. 24-108. 25. Lê Văn Khơi (2006), Khơi phục và phát triển bền vững hệ sinh thái rừng ngập mặn Cần Giờ thành phố Hồ Chí Minh (1978- 2000), Nhà xuất bản Nơng nghiệp, tr. 13-56. 26. Nguyễn Đức Lượng (2002), Cơng nghệ vi sinh (T1,T2), Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TPHCM, (2)tr 165. 27. Nguyễn Đức Lượng (2002), Thí nghiệm Cơng nghệ sinh học, (T1), Nhà xuất bản Đại học Quốc gia TPHCM GS N.X.ÊGƠRƠV, hiệu đính người dịch PGS Nguyễn Lân Dũng (1983), Thực tập vi sinh vât học, Nhà xuất bản “MIR” Maxcơva, Nhà xuất bản Đại học & Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội, tr. 167. 28. Vũ Triệu Mân, Lê Lương Tề (2001), Giáo trình bệnh cây nơng nghiệp, Nhà xuất bản Nơng nghiệp, Hà Nội. 29. Biền Văn Minh (2000), Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, Luận án Tiến sĩ Sinh học, Trường Đại học Sư Phạm Hà Nội. 30. Đặng vũ Hồng Miên (1999), Bảng phân loạii các lồii nấm mốc thường gặp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội 31. Lê Hồng Ngọc (1998), Tìm hiểu thành phần và vai trị của nấm mốc trong chế phẩm vi sinh vật hữu hiệu EM, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên. 32. Lê Xuân Phương (2001), Vi sinh vật cơng nghiệp, Nhà xuất bản Xây dựng, ĐH Đà Nẳng. 33. Lương Đức Phẩm- Hồ Sưởng (1978), Vi sinh tổng hợp, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 34. Nguyễn Phong Phú (2004), Khảo sát khả năng thủy phân một số thành phần khĩ tiêu cĩ trong nguyên liệu thực phẩm bởi nấm mốc Trichoderma, Luận văn tốt nghiệp, Trường Đại học Dân Lập Văn Lang, tr. 10-11. 35. Lê Lương Tề, Vũ Triệu Mân (1999), Bệnh vi khuẩn và virus hại cây trồng, Nhà xuất bản Giáo Dục. 36. Trần Thị Thanh (1997), Cơng nghệ vi sinh, Trường Đại học Sư Phạm TPHCM. 37. Nguyễn Xuân Thành (2005), Giáo trình Vi sinh vật học cơng nghiệp, Nhà xuất bản Giáo Dục. 38. Trần Thanh Thủy (1999), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, Nhà xuất bản Giáo Dục, tr. 54-168. 39. Trần Linh Thước (2003), Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm, Nhà xuất bản Giáo Dục. 40. Nguyễn Thị Thu (2005), Nghiên cứu đặc tính sinh học và khả năng sinh kháng sinh của các chủng Streptomyces phân lập từ rừng ngập mặn Việt Nam, Luận văn tốt nghiệp, trường Đại học Sư Phạm Hà Nội, tr. 11- 17. 41. Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh quyển rừng ngập mặn Cần giờ, Nhà xuất bản Nơng nghiệp- TPHCM, tr. 6- 17. 42. La Nam Vương (1999), Nghiên cứu xạ khuẩn sinh kháng sinh phân lập từ đất khu vực thị xã Lạng sơn, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Hà Nội. 43. Viện sinh học nhiệt đới (1993- 1998), (1999- 200),Tuyển tập các cơng trình nghiên cứu Khoa học Cơng nghệ, Nhà xuất bản Nơng nghiệp, TP HCM, tr. 57-98. Tiếng Anh: 44. Lowell L.Black (1971), Vegetable Diseases. A Practical Guide, Asian Vegetable Research & Development Center, Shanhua, Taiwan 45. A.d.Agate (1988), Mangrove Microbiology, UNDP / UNESCO Regional project research and its application to the management of the mangroves, pp 9.-32. 46. Kenneth B.Raper (1965), The genus Aspergillus, The Williams & Wilkins Company, Baltimore, pp. 310-315 47. Miguel Ulloa & Richard T Hanlin (2000), Illutrated Dictionery of mycology, Universidad National Autonoma de México. 48. Robert A. Samson, Ellen S. Hoekstra, jena C. Frisvad (2004), Introduction to Food and Airborne Fungi, An institude of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences, pp.196-197. 49. Gary J. Samuels (2004), Trichoderma a guide to identification and biology, United States Department of Agriculture. Trang Web 50. nấm sợi. 51. Natural solution for human health 52. Antibiotic/ drug-discovery. 53. khang sinh 54. 55. 56. thuvienkhoahoc.com 57. 58. detail_vn.php.htm 59. 60. fungi/Trichoderma spiecies.html PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các chủng vi khuẩn (kháng các loại KS) được phân lập từ các bệnh phẩm của các bệnh nhân khác nhau. E.coli Pseu. aeroginosa (1) Pseu. aeroginosa (2) Ent ( 1) Ent ( 2) Chất kháng sinh S R S R S R S R S R Cefuroxime      Ceftriaxone     Ceftazidim      Cefotaxime     Cefoperazone      Cepim     Amikacin     Tobramycine      Gentamycin      Ciprofloxacin      Piperacillin + Tazobactam     Ticarcillin+ A. clavulanic    Imipenem      Amoxicillin + A. clavulanic      Ertapenem     Ampi+sulbact     Ghi chú: R: resistance- kháng thuốc S: khơng kháng Pseu.aeroginosa: Pseudomonas aeroginosa; E.coli: Escherichia coli Ent: Enterobacter; (1), (2) các chủng này được phân lập từ 2 bệnh nhân khác nhau. ._.