Khảo sát đặc điểm và vai trò của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii

ng và trách nhiệm cơ đã giúp tơi hồn thành luận văn, bên cạnh đĩ tơi đã học hỏi được nhiều kiến thức quí báu nơi cơ cũng như phương pháp nghiên cứu khoa học. Tơi chân thành cám ơn thầy cơ ở khoa sinh, khoa hĩa - trường đại học sư phạm tp HCM, thầy cơ ở bộ mơn sinh hĩa - trường đại học khoa học tự nhiên, đã tận tình giúp đỡ tơi trong thời gian thực hiện đề tài luận văn cũng như thầy cơ cơng tác tại phịng thí nghiệm vi sinh - sinh hĩa, phịng thí nghiệm sinh lý thực - trường đại học sư phạm tp HCM đã giúp đỡ, động viên và tạo mọi điều kiện thuận lợi trong suốt thời gian làm đề tài. Tp HCM, tháng 3 năm 2006 NGUYỄN HỒNG MINH HUY MỤC LỤC Trang Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn: 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái. 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn. 1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn: 1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh. 1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về kháng sinh. 1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. 1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh. 1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh. 1.1.3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh. 1.1.3.1. Tách chiết kháng sinh từ sinh khối. 1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc. 1.1.3.3. Tinh sạch chất kháng sinh. 1.2. Các nhĩm chất kháng sinh chính cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn: 1.2.1. Phân loại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn. 1.2.2. Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn. 1.3. Vai trị của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phịng chống nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng: 1.3.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng. 1.3.2. Vai trị của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phịng chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng. Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP. 2.1. Vật liệu: 2.2. Phương pháp: 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật. 2.2.1.1. Phương pháp làm phịng ẩm quan sát hình thái vi thể của xạ khuẩn. 2.2.1.2. Phương pháp xác định hoạt tính kháng sinh – phương pháp khuếch tán trên thạch. 2.2.1.3. Phương pháp xác định sinh khối vi sinh vật. 2.2.2. Phương pháp hĩa sinh. 2.2.2.1. Phương pháp xác định khả năng phân giải các hợp chất cao phân tử của xạ khuẩn. 2.2.2.2. Phương pháp xác định khả năng sinh chất kích 3 3 3 3 6 10 10 11 13 15 16 19 21 21 22 22 22 30 31 31 40 47 52 52 52 53 53 54 54 thích sinh trưởng thực vật. 2.2.3. Phương pháp hĩa lý. 2.2.3.1. Phương pháp khảo sát khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh. 2.2.3.2. Phương pháp tách chiết và tinh sạch kháng sinh. 2.2.3.3. Phương pháp xác định các nhĩm chức trong cấu trúc hĩa học của chất kháng sinh. 2.2.3.4. Phương pháp xác định khả năng hồ tan trong các dung mơi của chất kháng sinh. 2.2.4. Phương pháp khác. 2.2.4.1. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng từ rể bị nhiễm bệnh. 2.2.4.2. Phương pháp tách tuyến trùng nốt sưng ra khỏi đất. 2.2.4.3. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt. 2.2.4.4. Phương pháp khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy xạ khuẩn lên sự phát triển của cây con. Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN. 3.1. Nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.1.1. Đặc điểm hình thái của xạ khuẩn. 3.1.2. Đặc điểm sinh trưởng phát triển trên các mơi trường nuơi cấy khác nhau. 3.1.3. Đặc điểm sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn. 3.2. Nghiên cứu khả năng sinh kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.2.1. Thử họat tính kháng sinh. 3.2.2. Lựa chọn mơi trường thích hợp cho việc tạo kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.3. Nghiên cứu các điều kiện ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.3.1. Ảnh hưởng pH ban đầu: 3.3.2. Ảnh hưởng chế độ thơng khí: 3.3.3. Xác định thời gian sinh kháng sinh tối ưu: 3.3.4. Ảnh hưởng nguồn hydratcacbon: 3.3.5. Ảnh hưởng nguồn nitơ: 3.4. Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 3.4.1. Lựa chọn dung mơi thích hợp. 3.4.2. Tách chiết và tinh sạch kháng sinh: 3.4.3. Tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. 55 57 57 57 60 61 61 61 62 62 62 63 63 64 66 72 72 73 76 76 78 80 83 85 89 89 92 95 3.5. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii lên các tác nhân gây hại cây trồng. 3.5.1. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên nấm bệnh hại cây trồng: 3.5.2. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên tuyến trùng hại cây trồng. 3.6. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii đến hoạt động sinh lý của cây trồng. 3.6.1. Ảnh hưởng dịch nuơi cấy lên khả năng nảy mầm của hạt: 3.6.2. Ảnh hưởng dịch nuơi cấy lên sự phát triển của cây con: Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 98 98 101 107 107 108 111 1 Ở ĐẦU Thiệt hại kinh tế của bệnh cây là điều thấy rất rõ: làm giảm năng suất cây trồng, giảm phẩm chất nơng sản khi thu hoạch và bảo quản, ảnh hưởng xấu đến đất trồng và cơ cấu cây trồng. Từ thế kỷ 18 Anton De Bary đã đặt nền mĩng mơn khoa học bệnh cây (1853). Để khắc phục những thiệt hại do bệnh cây gây ra, người ta đã sử dụng nhiều biện pháp như: kỹ thuật canh tác, thuốc hĩa học, … trong đĩ sử dụng thuốc hĩa học để phịng ngừa và ngăn chặn bệnh hại cây trồng là được nhiều người ưa chuộng do tính dễ sử dụng, hiệu quả cao nếu kết hợp với biện pháp canh tác thì việc phịng bệnh cho cây đạt hiệu quả lớn. Tuy nhiên, sau thời gian dài sử dụng thuốc hĩa học cũng như phân hĩa học người ta đã nhận thấy chúng ảnh hưởng đến mơi trường sống rất lớn. Chúng tác động xấu đến cân bằng sinh thái, gây ơ nhiễm mơi trường đất, nước làm cho người và gia súc bị ngộ độc. Đáng ngại hơn, một số thuốc trừ sâu chậm phân hủy đã lưu tồn lâu trong đất (DDT lưu tồn được 25 năm) sự lưu tồn lâu trong đất của các chất hố học này làm nồng độ của chúng tăng dần theo thời gian. Đồng thời việc sử dụng tuỳ tiện liều lượng, thời gian phun thuốc hĩa học đã tạo nên dư lượng lớn khơng cho phép trong rau màu và lương thực, gây nên những vụ ngộ độc thực phẩm lớn mà con người mà chúng ta từng biết trong thời gian qua. Để khắc phục nhược điểm này của thuốc hĩa học cũng như bảo vệ mơi sinh, người ta đã tìm kiếm các biện pháp và phát hiện vai trị của vi sinh vật trong việc điều chỉnh cân bằng sinh học của hệ sinh thái. Bằng các biện pháp khống chế sinh học, người ta đã từng bước sản xuất ra nhiều chế phẩm vi sinh vật ở qui mơ lớn và được sử dụng trong cơng tác phịng trừ sâu bệnh. Càng ngày người ta càng sử dụng rộng rãi những chế phẩm kháng sinh từ các chủng xạ khuẩn đối kháng, mà đặc tính của những chất kháng sinh 2 đĩ đã thoả mãn được những tính chất cần thiết để cĩ thể sử dụng trong bảo vệ thực vật, như: - Khơng gây ảnh hưởng xấu đến sinh trưởng phát triển của cây. Ở một số nồng độ thích hợp chúng cịn kích thích khả năng nảy mầm của hạt và sinh trưởng của cây. - Khơng gây hại cho người và gia súc. - Cĩ hiệu lực trong một thời gian nhất định ở ngồi mơi trường tự nhiên. - Cĩ tác dụng tiêu diệt một cách cĩ chọn lọc vi khuẩn gram dương, hoặc vi khuẩn gram âm, kháng nấm mạnh. Dicklow.M.B cùng cộng sự vào năm 1996 đã cơng bố patent số 5549889 về lồi Streptomyces dicklowii, lồi cĩ khả năng kháng nấm và tuyến trùng hại cây trồng, rất thích hợp sử dụng làm vi sinh vật khống chế sinh học trong nơng nghiệp. Chúng tơi nhận được chủng Streptomyces dicklowii từ phịng thí nghiệm vi sinh trường Đại học sư phạm Tp Hồ Chí Minh, chủng xạ khuẩn này được nhập từ Mỹ. Để tiến tới sử dụng cĩ hiệu quả chủng xạ khuẩn này trong điều kiện mơi trường Việt Nam, chúng tơi tiến hành thực hiện đề tài: “KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM VÀ VAI TRỊ CỦA CHỦNG XẠ KHUẨN Streptomyces dicklowii” 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Xạ khuẩn và chất kháng sinh từ xạ khuẩn: 1.1.1. Đặc điểm hình thái sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn: 1.1.1.1. Đặc điểm hình thái: Xạ khuẩn sống rất phổ biến trong tự nhiên cũng như trong đất, chúng cĩ nhiều đặc điểm giống vi khuẩn và khác với nấm mốc như kích thước tế bào nhỏ, thành tế bào khơng chứa cenllulose hay kitin, phân chia tế bào theo kiểu vơ ti (Amytoz), khơng phân biệt giới tính; tuy nhiên, xạ khuẩn cũng cĩ những đặc điểm giống nấm mốc hơn như cĩ hệ sợi khuẩn ty phân nhánh, nhưng ở xạ khuẩn hệ sợi khơng cĩ vách ngăn. Sự phân hố của khuẩn ty khí sinh bắt đầu từ những mấu lồi xuất hiện trên bề mặt của sợi khuẩn ty sau đĩ mấu lồi lớn lên thành chồi, chồi phát triển dài ra thành sợi, cuối cùng tạo thành hệ sợi dầy đặc. Đường kính mỗi sợi khuẩn ty là 0,5µm – 1,5µm. (R.E. Buchanan, 1998). Khuẩn ty khí sinh của xạ khuẩn phát triển ra bên ngồi khơng khí trên bề mặt mơi trường rắn tạo thành khuẩn lạc xạ khuẩn; khuẩn lạc xạ khuẩn dạng hình trịn do khuẩn ty phát triển theo hình phĩng xạ tạo thành nhiều vịng trịn đồng tâm (xem hình 1.1), khác với khuẩn lạc của nấm men, nấm mốc và vi khuẩn, khuẩn lạc của xạ khuẩn thường chắc, xù xì, bề mặt cĩ mấu lồi, cĩ nếp nhăn hoặc sần sùi. Theo Procofieva Bengopxkaia (1936), cho rằng khuẩn lạc của xạ khuẩn cĩ 3 lớp: lớp ngồi gồm các sợi bện chặt lại với nhau, lớp trong tương đối xốp hơn, và lớp giữa thì cĩ cấu trúc tổ ong. Khuẩn lạc của xạ khuẩn cĩ thể mang các màu sắc khác nhau như: màu đỏ, màu lam, màu xám, màu tím. 4 Hình 1.1: Các dạng khuẩn lạc của xạ khuẩn Các khuẩn ty mọc phía dưới khuẩn lạc và cắm sâu vào trong mơi trường là khuẩn ty cơ chất, khuẩn ty cơ chất cĩ nhiệm vụ hút chất dinh dưỡng để cung cấp dinh dưỡng cho tồn bộ cơ thể nên cịn gọi là khuẩn ty dinh dưỡng. Đường kính khuẩn ty cơ chất thay đổi từ 0,2μm – 0,3μm, khuẩn ty khơng cĩ vách ngăn và khơng bị đứt đoạn. Tuỳ loại mơi trường mà khuẩn ty cơ chất cĩ thể tiết ra mơi trường một số loại sắc tố trong đĩ cĩ sắc tố hịa tan được trong nước cĩ sắc tố hịa tan được trong dung mơi hữu cơ. Sau thời gian phát triển, trên đầu sợi khuẩn ty khí sinh hình thành nên những sợi phân hĩa gọi là cuống sinh bào tử; tuỳ theo từng lồi mà cuống sinh bào tử cĩ thể thẳng hay uốn cong, xoắn lị so hay xoắn ốc; chúng cĩ thể mọc đơn, mọc đối, mọc vịng, mọc thành chùm, số vịng xoắn của cuống sinh 5 bào tử cĩ thể từ 5 – 10 vịng, đường kính vịng xoắn cĩ thể thay đổi từ 5 – 7nm. (xem hình 1.2) Hình 1.2: Các dạng cuống sinh bào tử ở xạ khuẩn Bào tử của xạ khuẩn được hình thành từ cuống sinh bào tử, thường cĩ hình cầu, hình ovan, hình que … bề mặt bào tử cĩ các dạng như: dạng nhẵn (hình 1.4), dạng xù xì, dạng gai (hình 1.3), dạng tĩc. 6 Hình 1.3: Bào tử dạng gai ở Streptomyces africanus chủng CPJVR-HT (hình chụp dưới kính hiển vi điện tử theo ijs.sgmjournals.org/.../ medium/frontcover.gif ) Hình 1.4: Bào tử dạng nhẵn ở Streptomyces violazeoruber (hình chụp dưới kính hiển vi điện tử theo www.ncl.ac.uk/biol/ assets/MSc-IB.jpg ) 1.1.1.2. Đặc điểm sinh lý sinh hĩa của xạ khuẩn: 1.1.1.2.1. Đặc điểm sinh lý nuơi cấy: Xạ khuẩn phân bố rộng rãi trong tự nhiên, trong mơi trường đất - xạ khuẩn chiếm 20 – 40% tổng số vi sinh vật trong đất, tập trung nhiều ở lớp đất 7 trên bề mặt (sâu xuống khoảng 40cm). Hầu như trong các loại đất đều cĩ mặt của xạ khuẩn, đa số xạ khuẩn là vi sinh vật hiếu khí, ưa ẩm, một số xạ khuẩn ưa nhiệt. Xạ khuẩn thường sống tốt trong mơi trường cĩ pH trung tính. Xạ khuẩn thuộc cơ thể dị dưỡng nên nguồn hydratcacbon mà chúng sử dụng cĩ thể là tinh bột, đường, polysaccaric… nguồn nitơ mà xạ khuẩn sử dụng bao gồm: muối amon, muối nitrat (nguồn nitơ vơ cơ); protein, pepton, cao ngơ, …(nguồn nitơ hữu cơ). 1.1.1.2.2. Khả năng sinh enzym của xạ khuẩn: Enzym là một chất xúc tác sinh học được tạo thành trong tế bào vi sinh vật, nĩ đĩng một vai trị quan trọng trong trao đổi chất của vi sinh vật. Enzym khơng những hoạt động xúc tác những phản ứng chuyển hĩa trong cơ thể mà cịn xúc tác những chuyển hĩa bên ngồi mơi trường – điều này cĩ ý nghĩa lớn trong việc ứng dụng enzym vi sinh vật vào cơng nghiệp, nơng nghiệp,… Ở xạ khuẩn, người ta đã thu nhận các loại enzym như: - Enzym amylaza: thu nhận từ các lồi Streptomyces aureofaciens, Streptomyces diastochromogens, … - Enzym cenllulaza: thu nhận từ các lồi Streptomyces antibioticus, Streptomyces sp. 0143, … - Enzym proteaza: thu nhận từ Streptomyces kinoluteus, Streptomyces verticillatus var. zynogenes, Actinomyces fradiae, … - Enzym kitinaza: thu nhận từ Streptomyces griseus, … Trong đĩ enzym proteaza của xạ khuẩn được ứng dụng nhiều trong cơng nghệ thực phẩm – cĩ tác dụng làm mềm thịt. Các chế phẩm được bán trên thị trường như: PRONAZA của Nhật (thu nhận từ Streptomyces griseus); M – zim của Mỹ (thu nhận từ Streptomyces fradiae) (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998). 8 Ngồi ra người ta cịn chú ý một loại enzym quí ở xạ khuẩn là glucoza izomeraza, enzym này giúp biến đổi đường glucose thành đường fructose với độ ngọt cao hơn. (Nguyễn Trọng Cẩn, 1998) CHO (CHOH)4 CH2OH GLUCOSE IZOMERAZA CH2OH C=O (CHOH)3 CH2OH Glucose Fructose Để thu enzym người ta thường thu canh trường nuơi cấy của chúng. Thành phần dinh dưỡng của mơi trường cũng ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và tổng hợp enzym, nên để tăng sự tổng hợp enzym thì mơi trường nuơi cấy phải cĩ đầy đủ các thành phẩn dinh dưỡng đặc biệt cần bổ sung “chất cảm ứng” tổng hợp enzym, thường là cơ chất tương ứng của enzym cần tổng hợp. Thí dụ: trong tổng hợp proteaza của Actinomyces cần chất cảm ứng là protein đậu nành hay protein động vật. 1.1.1.2.3. Khả năng sinh vitamin của xạ khuẩn: - Vitamin B12: Cũng như vi khuẩn, xạ khuẩn cĩ khả năng tổng hợp tốt vitamin B12, là loại vitamin mà ở động vật và thực vật khơng cĩ khả năng tổng hợp. Nên trong cơng nghệ tổng hợp vitamin B12 thì con đường sản xuất chủ yếu là con đường sinh học mà xạ khuẩn và vi khuẩn là hai lồi vi sinh vật người ta quan tâm nhất – các lồi xạ khuẩn đĩ là: Actinomyces olivaceus, Actinomyces griseus, Actinomyces aureopacieus, Actinomyces pradiae, Actinomyces autibioticus, …Đáng kể nhất là xạ khuẩn Actinomyces olivaceus và lồi vi khuẩn Propionibacterium shermanii là những chủng vi sinh vật được sử dụng trong cơng nghiệp sản xuất vitamin B12. - Caroten (tiền vitamin A): khi vào cơ thể người và động vật sẽ chuyển thành vitamin A. Các chủng xạ khuẩn được quan tâm là: Blakeslea trispora, Mycobacterium smegmatis, Streptomyces chrestomyceticus … 9 1.1.1.2.4. Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật của xạ khuẩn: Khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng của vi sinh vật được phát hiện từ rất sớm. Năm 1925, Saubert phát hiện auxin trong mơi trường nuơi cấy nấm Rhizopus suinus, Kurosawa (1926) trích ly Gibberellin (GA) từ nấm Fusarium moniliforme. Năm 1926 E.Kurosawa (người Nhật) tìm thấy một lồi nấm mốc tên Gibberella fugikuroi. Ơng chứng minh rằng khi nấm nhiễm vào cây con, chúng làm cây con tăng trưởng với tốc độ cao. Năm 1930 người ta đã phân lập và kết tinh một chất từ Gibberella nay được gọi là gibberellin. Trong vịng 30 năm trở lại đây cĩ hơn 70 chất khác nhau được phân lập từ nấm mốc và nhiều thực vật cĩ hoa cũng được xếp vào nhĩm gibberellin (GAs). Gibberellin thường được sử dụng trong các thí nghiệm là GA3 hay acid gibberellic. Cĩ rất nhiều xạ khuẩn trong đất cũng cĩ khả năng sinh tổng hợp Auxin - một dạng phytohoocmon rất cĩ ý nghĩa đối với cây trồng. Auxin cĩ vai trị quan trọng trong sự kiểm sốt sự tăng dài của tế bào. Vì tế bào thực vật cĩ vách bao bọc, nên tế bào chỉ cĩ thể tăng trưởng được khi vách cĩ thể được kéo dài ra. Vách được cấu tạo bởi phần lớn là đường đa mà thành phần chính là cellulose. Ở vách sơ cấp, cellulose hiện diện dưới dạng những sợi dài liên kết với các đường đa khác để tạo ra một mạng lưới. Khi tăng trưởng các liên kết cĩ thể bị đứt tạm thời, do đĩ vách tế bào trở nên đàn hồi hơn và những vật liệu mới được chen vào. Auxin cĩ vai trị chính trong cả hai quá trình trên. Trong các auxin, β – indole acetic acid (IAA) là một kích thích tố sinh trưởng thực vật được người ta quan tâm nhiều. Đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về khả năng sinh IAA của xạ khuẩn: Các chủng xạ khuẩn cĩ khả năng sinh tổng hợp IAA cĩ thể kể như: Streptomyces olivochromoferus 1/247 10 cĩ khả năng tạo thành 33 μgIAA/ ml canh trường, Streptomyces olivochromoferus 1/294 cĩ khả năng tạo thành 9μgIAA/ ml canh trường, …( Lê Thị Hoa, 1998) Qúa trình sinh tổng hợp IAA ở vi sinh vật diễn ra khá phức tạp, bằng phương pháp đồng vị phĩng xạ người ta xác định được IAA cĩ nguồn gốc từ Triptophan (hình 1.5). Hình 1.5: Các con đường hình thành IAA ở vi sinh vật. (theo Lê Thị Hoa,1998) 1.1.2. Khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khuẩn: 1.1.2.1. Khái niệm về chất kháng sinh: Cĩ nhiều lập luận khác nhau hoặc theo nguồn gốc hoặc theo hướng điều trị bệnh nhưng nhìn chung cĩ thể hiểu chất kháng sinh (Antibiotic) là các chất cĩ nguồn gốc vi sinh vật và thực vật cĩ tác dụng ức chế sinh trưởng hoặc tiêu diệt một số vi sinh vật khác một cách cĩ chọn lọc ngay khi ở nồng độ thấp. Chất kháng sinh là một chất hĩa học cĩ hoạt tính kháng lại các vi sinh vật như: vi khuẩn gây bệnh cho người và động vật; nấm gây bệnh ở động vật 11 và thực vật. Các vi sinh vật mẫn cảm với chất kháng sinh ở những mức độ khác nhau, đa số các vi khuẩn gram dương mẫn cảm với chất kháng sinh hơn các vi khuẩn gram âm. 1.1.2.2. Những nghiên cứu trên thế giới và ở nước ta về kháng sinh: - Trên thế giới: Kể từ khi Penicillin được Alexander Fleming phát hiện vào 1928, và được Abraham, Chain và Florey tinh chế ở dạng ổn định cĩ tác dụng chữa bệnh vào 1941 (www.vinachem.com.vn), trong hơn nữa thế kỷ qua, kháng sinh đã trở thành một dược phẩm thần kỳ sớm chiếm vị trí hàng đầu trong lĩnh vực dược phẩm của thế giới, với những kết quả ngày càng mới lạ, với nhu cầu ngày càng tăng và với lượng sản xuất ngày càng lớn. Hơn thế nữa, cạnh bên chất Penicillin đầu đàn, cĩ thêm nhiều loại kháng sinh được chiết xuất từ nấm, từ vi khuẩn, từ xạ khuẩn. Những thành tựu tách chiết kháng sinh từ xạ khuẩn cĩ minh chứng qua một số patent: patent số 3968204 Hamill, 1976 tách chiết kháng sinh A-2315 từ Actinoplanes philippinensis NRRL 5462; patent số 4331658 Hamill, 1982 tách chiết kháng sinh A-32887 từ Streptomyces albus NRRL 11109; patent số 4537770 Michel, 1985 tách chiết kháng sinh A41030 từ Streptomyces virginiae NRRL 12525; patent số 4637981 Hershberger, 1987 tách chiết kháng sinh A-4696G từ Actinoplanes missouriensis; patent số 4659660 Hamill, 1987 tách chiết kháng sinh A47934 từ Streptomyces toyocaensis NRRL 15009; patent số 5229362 Kirst, 1993 tách chiết kháng sinh A10255 từ Streptomyces gardneri. Đĩ là những patent của Mỹ, Mỹ cũng là một trong những nước sản xuất kháng sinh hàng đầu trên thế giới, bên cạnh các nước phát triển cơng nghiệp kháng sinh thì Hàn Quốc cũng đã cĩ nền cơng nghiệp sản xuất kháng sinh, ngồi những kháng sinh tinh khiết dùng điều trị bệnh cịn cĩ kháng sinh dưới dạng chế phẩm sinh học như Biocontrol dưới dạng lỏng cĩ thành phần bao gồm một số chủng Streptomyces sp.; Trung Quốc cũng là nước hết sức chú trọng phát triển cơng nghiệp kháng sinh, các nhà máy kháng sinh được xây dựng ở Tứ Xuyên, Thượng Hải, 12 Trường Sa, Hắc Long Giang, Quảng Châu để sản xuất các nguyên liệu và các thành phẩm kháng sinh từ vi sinh vật. - Ở Việt Nam: chúng ta cũng đã cĩ nhiều cố gắng trong việc tìm kiếm và sản xuất chất kháng sinh phục vụ cho nhu cầu điều trị bệnh, tách chiết cũng như nổ lực hợp tác với nước ngồi để sản xuất kháng sinh mặc dù kết quả chưa đáp ứng được so với nhu cầu thực tế. Những cố gắng ấy cĩ thể tổng kết qua các mốc thời gian sau: Năm 1950, trong kháng chiến chống Pháp, GS Ðặng Văn Ngữ đã nuơi cấy Pénicillum và dùng dịch nuơi cấy để chữa vết thương cho thương binh; Năm 1962 - 1965, Liên Xơ (cũ), theo yêu cầu của ta, đã khảo sát và thiết kế cho Việt Nam một nhà máy sản xuất thuốc kháng sinh, dự định đặt ở Phú Thọ (Bắc bộ), nhưng sau đĩ phải ngưng lại vì chiến tranh mở rộng ra miền Bắc; Năm 1968, Trung Quốc giúp ta thiết kế xưởng Tetracyclin 5 tấn/năm, trước dự định xây dựng ở Cao Bằng, sau chuyển về Sơn Tây rồi Việt Trì, nhưng do quan hệ giữa hai nước lúc đĩ cĩ trục trặc nên cơng trình bỏ dở; Năm 1970, Ðơn vị nghiên cứu chuyên đề kháng sinh do GS Trương Cơng Quyền làm chủ nhiệm ra đời, giáo sư và cộng sự đã cĩ nhiều cơng trình nghiên cứu về kháng sinh: phân lập được một tập hợp khá lớn các chủng vi sinh vật trong đĩ đặc biệt cĩ xạ khuẩn sinh kháng sinh cĩ nguồn gốc từ đất Việt Nam. Đã tiến hành nghiên cứu sinh lý sinh hố các chủng vi sinh vật sinh kháng sinh và tách chiết, định loại được một số kháng sinh. Từ 1985 đến 1990, trong chương trình nghiên cứu khoa học cấp Nhà nước mã số 64C, Bộ Y tế đã cho nghiên cứu sản xuất thử kháng sinh Oxytetracyclin và Tetracyclin. Cũng trong thời gian này (từ 1985 – 1990), Liên Xơ (cũ) thỏa thuận giúp ta xây dựng nhà máy kháng sinh 5 tấn/năm tại Xí nghiệp Dược phẩm TW 24, TPHCM. Cơng việc đang triển khai thì tình hình chính trị ở Liên Xơ cũ chuyển biến khơng thuận lợi, nên cơng trình đình lại vào năm 1992. (theo Nguyễn Duy Cương, 2005). Đến nay, chúng ta cũng đã cĩ một số dây chuyền bào chế kháng sinh đạt tiêu chuẩn GMC Aseane nhưng nguyên liệu phải nhập từ nước ngồi như: 13 tại xí nghiệp dược 24 tại thành phố Hồ Chí Minh nguyên liệu Ampicinlin và Amocillin từ nguyên liệu trung gian 6-APA nhập từ Belarut; bên cạnh đĩ vào 1999- 2000 tổng cơng ty dược Việt Nam đã chủ trì đề tài “Nghiên cứu cơng nghệ điều chế 6-APA, 7-ADCH và cephalexin từ penicillin G” và đề tài “Nghiên cứu áp dụng cơng nghệ sản xuất các kháng sinh mới, hiệu quả bằng nguyên liệu trong nước”. Gần đây lãnh đạo Tổng cơng ty Hĩa chất và tổng cơng ty Dược đã cĩ văn bản trình chính phủ về hợp tác xây dựng nhà máy sản xuất 300 tấn/ năm các cephalexin bán tổng hợp thế hệ 1 và thế hệ 3 từ nguyên liệu trung gian 7-ADCA và 7-ACA nhập khẩu. Từ tình hình trên cho thấy sản xuất nguyên liệu kháng sinh trong nước là một nhu cầu hết sức cấp bách đối với chiến lược quốc gia phát triển ngành dược Việt Nam. Trong chiến lược phát triển khoa học cơng nghệ Việt Nam từ nay đến 2010 (do thủ tướng Phan Văn Khải ký) đã xác định Việt Nam phải sản xuất kháng sinh và phải sản xuất tự túc 60% thuốc dùng trong nước.(theo www.vinachem.com.vn ). Với tiêu chí trên cho thấy rất cần những cơng trình nghiên cứu và tiến tới sử dụng các chủng vi sinh vật trong đĩ đặc biệt là xạ khuẩn để sản xuất các kháng sinh dùng cho nhu cầu rất lớn được đặt ra hiện nay. 1.1.2.3. Các yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh: 1.1.2.3.1. Điều kiện nuơi cấy: - Độ thơng khí: yếu tố thơng khí ảnh hưởng quyết định đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Các xạ khuẩn thuộc nhĩm vi sinh vật hiếu khí nên độ thơng khí để đạt hiệu suất cực đại đĩng vai trị quan trọng ảnh hưởng khả năng sinh kháng sinh; lượng khơng khí cung cấp vào mơi trường nuơi cấy là lưu lượng thổi khí 1 thể tích mơi trường /1 phút. - Nhiệt độ: cĩ những lồi xạ khuẩn ưa nhiệt hay sống tốt khi nhiệt độ của mơi trường cao nhưng đa số các xạ khuẩn sinh kháng sinh mà chúng ta khảo sát thường phát triển tốt ở nhiệt độ 28OC – 30OC (nhiệt độ phịng thí nghiệm). Nhiệt độ tối ưu cho sinh tổng hợp chất kháng sinh thường nằm trong khoảng 18OC – 28OC. 14 - pH: sinh tổng hợp chất kháng sinh phụ thuộc đáng kể vào độ pH của mơi trường. Độ pH thích hợp để sinh tổng hợp chất kháng sinh là pH trung tính, ở pH acid và kiềm sẽ ức chế quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh. - Nhân giống: Qua thực nghiệm cho thấy sinh tổng hợp chất kháng sinh khơng chỉ phụ thuộc vào điều kiện lên men mà cịn phụ thuộc vào chất lượng của bào tử và giống sinh dưỡng, nghĩa là tuổi và khả năng đồng đều về mặt di truyền và hoạt tính trao đổi chất của giống phản ánh điều kiện nuơi cấy. Điều kiện của mơi trường nhân giống cũng như thời gian nhân giống cũng khác nhau tùy vào từng chủng và tuổi của bào tử giống. - Hình thức lên men: trong sinh tổng hợp chất kháng sinh phương pháp nuơi cấy cũng là một trong những yếu tố quyết định; Qui trình sản xuất chất kháng sinh thường được nuơi cấy theo phương pháp nuơi cấy chìm trong nồi lên men cĩ khuấy đảo và sục khí. 1.1.2.3.2. Thành phần mơi trường nuơi cấy: Sinh tổng hợp chất kháng sinh ở vi sinh vật phụ thuộc chặt chẽ vào mơi trường lên men. Trước hết là nguồn C, N và phosphat vơ cơ. Các vi sinh vật khi đã phát triển trên mơi trường nhân giống và cấy truyền lên mơi trường lên men cĩ nguồn gốc C, N và các thành phần mơi trường khác nhau sẽ dẫn đến khả năng sinh các chất khác nhau. - Nguồn cacbon: quá trình sinh trưởng và sinh tổng hợp chất kháng sinh chịu ảnh hưởng sâu sắc thơng qua các nguồn cacbon khác nhau. Tuỳ thuộc vào từng chủng mà cần chọn nguồn cacbon thích hợp; các loại đường đơn: Glucose, Manitole, … hay các loại đường kép: Saccarose, Lactose, … cũng cĩ thể là các loại tinh bột hoặc các chất cĩ thành phần khơng xác định như rỉ đường, đại mạch, …Đối với xạ khuẩn, nhiều chủng cĩ hoạt tính amylaza cao nên nguồn cacbon thích hợp đối với chúng là tinh bột. - Nguồn nitơ: nguồn và nồng độ nitơ trong mơi trường nuơi cấy cũng ảnh hưởng đến sinh tổng hợp chất kháng sinh. Sự dư thừa các ion amin hoặc các nitơ chuyển hĩa nhanh khác sẽ ức chế sinh tổng hợp chất kháng sinh 15 như Erytromoxin, Leucomicin, Novobioxin, … Quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh từ xạ khuẩn thường địi hỏi cĩ cả 2 nguồn nitơ hữu cơ và vơ cơ trong mơi trường. nguồn nitơ hữu cơ thích hợp là các hợp chất từ thực vật như: bột đậu tương, bột đậu xanh, cao ngơ, … nguồn nitơ vơ cơ là: muối amon hoặc nitrat. 1.1.2.4. Sự hình thành và các con đường sinh tổng hợp chất kháng sinh: Cĩ nhiều quan điểm về chất kháng sinh, cĩ quan điểm cho rằng chất kháng sinh là sản phẩm thải của quá trình trao đổi chất của xạ khuẩn, cũng cĩ quan điểm cho rằng chất kháng sinh là chất tham gia cạnh tranh của xạ khuẩn trong mơi trường sống tự nhiên. Dù theo quan điểm nào đi nữa thì các con đường sinh ra chất kháng sinh từ xạ khuẩn được tĩm tắt như sau: - Chất kháng sinh được tổng hợp từ một chất trao đổi sơ cấp duy nhất (như chất kháng sinh cloramphenicol, các chất kháng sinh thuộc nhĩm nucleozit). - Chất kháng sinh được hình thành từ hai hoặc ba chất trao đổi bậc một khác nhau (như các chất kháng sinh lincomicin, novobiocin). - Chất kháng sinh được tổng hợp bằng cách polyme hĩa các chất trao đổi bậc 1, sau đĩ cĩ thể tiếp tục biến đổi qua các phản ứng enzym khác. Cĩ thể phân biệt thành 4 dạng: + Chất kháng sinh nhĩm polypeptit theo con đường trùng hợp các acid amin: bacitracin, polymycin. + Chất kháng sinh được tạo thành nhờ phản ứng polyme hĩa các đơn vị acetat, propionat: chất kháng sinh nhĩm macrolit, tetracilin, rifamicin. + Chất kháng sinh aminoglycozit được tạo thành nhờ các phản ứng trùng hợp polysacarit: neomicin, streptomycin. + Chất kháng sinh được hình thành theo con đường tổng hợp các hợp chất izopreonit từ các đơn vị acetat… 1.1.2.5. Cơ chế tác động của chất kháng sinh: 1.1.2.5.1. Ức chế tổng hợp thành tế bào vi khuẩn: 16 Thành tế bào vi khuẩn cĩ cấu tạo từ peptidoglycan gồm các đơn vị murein, đĩ là disacarit pentapeptit (N – acetylglucozamin, acid N – acetyl muramic) gắn với chuổi peptapeptit. Cycloserin cĩ cấu tạo tương tự D – alanin, nĩ cĩ thể cạnh tranh với D – alanin để gắn vào các enzyme alanin – racemaza và D – alanin – D alanin synthetaza ngăn cản sự tạo thành D – alanin – D – alanin. Các chất kháng sinh β – lactam thấm qua thành tế bào dễ dàng gắn lên màng sinh chất: ở đây một số protein cĩ khả năng gắn với chất kháng sinh gọi là PBP (penicillin binding protein) mỗi protein cĩ ái lực riêng với một loại β – lactam ảnh hưởng trực tiếp lên quá trình sinh tổng hợp murein. 1.1.2.5.2. Ức chế tổng hợp protein: - Các chất kháng sinh ức chế tổng hợp protein: Một số chất kháng sinh như cloramphenicol gắn vào tiểu đơn vị 50S của riboxom, chất này phong bế peptiditranpheraza ngăn cản sự kéo dài mạch polypeptit.(xem hình 1.6) Các chất kháng sinh thuộc nhĩm macrolit như: erythromycin, lincomycin, … ức chế việc giải phĩng acid amin khỏi phức hệ aminocyl – ARNt – ribixom – ARNm. (xem hình 1.6) Tetracilin gắn lên receptor ở cả đơn vị 30S và 50S ức chế quá trình tổng hợp protein. (xem hình 1.6) Puromycin, chất ức chế dịch mã cĩ cấu trúc gần giống với đầu 3’của một tyrocyl – ARNt ở vị trí A, do đĩ nĩ cĩ thể tác dụng với peptidyl – puromycin. Peptidyl – puromycin khơng chuyển sang vị trí P, khơng tham gia vào quá trình vận chuyển, do đĩ khơng tiếp tục quá trình kéo dài chuổi polypeptit và tách ra khỏi riboxom. - Các chất kháng sinh dẫn đến sinh tổng hợp protein bất thường: Một số chất cĩ thể gắn với phần 30S của riboxom làm thay đổi cấu hình khơng gian của tiểu thể này, ảnh hưởng đến việc gắn RNAm vào riboxom làm rối loạn đọc. 17 Ví dụ: Streptomycin tác dụng làm cho codon UUU mã hĩa cho phenyl bị đọc sai thành AUU, mã hĩa cho izolơcin do vậy acid amin phenylalanime bị thay bằng izolơcin.(xem hình 1.6) Hình 1.6: Sự ức chế tổng hợp protein của một số chất kháng sinh. 1.1.2.5.3. Phá hủy màng nguyên sinh chất: Đĩ là các chất kháng sinh như Bacitracin, Polymicin. Polymycin làm phá vỡ lớp phospholipid của cấu trúc màng nguyên sinh chất làm cho các chất khuếch tán ra khỏi tế bào, tế bào sẽ chết. Chất kháng sinh polyen tác động lên thành phần sterol của màng. Màng tế bào vi khuẩn khơng chứa sterol nên thường khơng bị kháng sinh thuộc nhĩm này tác động, ngoại trừ tế bào nấm, tế bào động vật và tế bào người (do cĩ thành phần sterol trên màng). ._.1.1.2.5.4. Ức chế tổng hợp acid nucleic: Những chất kháng sinh như: mitomycin, actinomycin, mitramycin, … gắn với acid nucleic (DNA, RNA) tạo thành phức hợp bất hoạt, ngăn cản sự sao chép của các phân tử acid nucleoic này. 18 Một số chất kháng sinh chống virus như vidarabin, axiclovir cĩ cấu trúc giống acid nucleoic do đĩ cĩ thể gắn với enzym cần tổng hợp DNA của virus. Rifamycin, novobiocin ức chế RNA polymeraza, flucitocin ức chế timidilatsintetaza, ảnh hưởng trực tiếp đến tổng hợp RNA. 1.1.2.5.5. Ức chế cạnh tranh: Những chất kháng sinh này cĩ cấu trúc gần giống với chất trao đổi bình thường (acid amin, coenzym) nên chúng cĩ thể tranh chấp enzym hoặc cĩ thể thay thể chất trao đổi và làm bất hoạt cơ chất này. Ví dụ: ở vi khuẩn, acid folic (vitamin B9) là chất thiết yếu để tổng hợp tạo thymin, chất này được tạo thành qua quá trình chuyển hĩa từ acid paminobenzoic (APAB). Sulfamit do cĩ cấu trúc giống APAB nên cĩ thể thay thế APAB và khơng tạo acid folic. 1.1.3. Tách chiết và tinh chế chất kháng sinh: Chất kháng sinh do vi sinh vật tổng hợp nên vừa nằm trong tế bào vừa nằm trong dịch nuơi cấy – chúng cĩ thể khơng hồ tan hay hịa tan trong dịch nuơi cấy, do vậy trong tách chiết chất kháng sinh người ta thường tiến hành tách chiết kháng sinh từ tế bào (sinh khối) và từ dịch nuơi cấy. Cĩ nhiều phương pháp khác nhau để tách chiết chất kháng sinh như: - Tách chiết chất kháng sinh bằng phương pháp hấp phụ: hấp phụ nhằm mục đích gắn hợp chất cần thiết cĩ trong dung dịch nước ở nồng độ thấp vào một chất hấp thụ gắn thích hợp. Sau đĩ lại phải giải hấp phụ chất đã gắn ở trên bằng một thể tích nhỏ của một dung dịch khác ở một pH chính xác. Phương pháp này cho phép: cơ lập, tinh chế, cơ đặc sản phẩm cần thu nhận. Trong các phịng thí nghiệm và trong sản xuất cơng nghiệp, người ta sử dụng các chất hấp thụ như than hoạt tính cĩ ưu điểm là ít tính đặc hiệu, ít nhạy cảm với pH và cĩ diện tích tiếp xúc lớn, thường đối với xạ khuẩn người ta sử dụng 2% than hoạt tính trong dịch nuơi cấy xạ khuẩn đã loại bỏ sinh khối và pH = 7 khuấy 1 giờ và lọc qua giấy lọc. Than hoạt tính được giải hấp phụ bằng dung 19 mơi hữu cơ (aceton) với tỉ lệ 1:3 trong 6 giờ.; ngồi than hoạt tính cịn cĩ Oxit nhơm và Gel silic là 2 chất được nạp vào các cột dùng trong các quá trình phân ly của các sắc tố hay một số steroit. (Nguyễn Đức Lượng, 2001) - Tách chiết kháng sinh bằng nhựa trao đổi ion: các loại nhựa này là những phân tử của styren trùng hợp với sự cĩ mặt của một lượng nhất định divinyl benzen, sự kết hợp đến 12% divinylbenzen sẽ tạo các cầu nối giữa các mạch trong quá trình trùng hợp, cho phép tạo các mạng polyme làm tăng độ xốp của chúng và làm khung cho nhiều nhĩm hĩa học, tạo ra tính đặc biệt cho mỗi loại nhựa. những nhựa cationit mạnh chứa tới 3 nhĩm sunfonic trong các phân tử benzen làm cho nhựa cĩ tính acid mạnh. Những chất trao đổi ion cenllulotic là những este của cenlluloza, chúng đĩng vai trị của chất trao đổi anion hay cation. Ngồi ra chúng cịn cĩ những tính chất đặc biệt như hút nước, khả năng trao đổi tăng nhanh hơn 5m Eq/g. Đối với tách chiết sản phẩm trao đổi ở xạ khuẩn thường người ta sử dụng 5% nhựa trao đổi ion trong dịch nuơi cấy xạ khuẩn đã loại bỏ sinh khối và lắc trên máy lắc 2 giờ. Sau khi loại dịch lọc, nhựa trao đổi được rửa bằng nước cất. Giải hấp phụ bằng NH4OH 1N và HCl 1N, sau khi giải hấp phụ đem cơ chân khơng ở 60OC và tủa kháng sinh bằng aceton..(theo Nguyễn Đức Lượng, 2001) - Phương pháp tách chiết chất kháng sinh bằng dung mơi hữu cơ: quá trình tách chiết bằng dung mơi hữu cơ thường được thực hiện qua 2 giai đoạn: đầu tiên là giai đoạn trộn 2 pha nước và dung mơi để tăng bề mặt tiếp xúc, đảm bảo các phân tử của các chất lỏng tiếp xúc chặt chẽ với nhau. thời gian khuấy phải đủ để cho phép khuyếch tán mạnh các sản phẩm phải chiết vào dung mơi hữu cơ; cuối cùng là giai đoạn nhũ dịch sau khi lắng, các dung mơi được dùng bao gồm các chất như sau: các ancol (butanol, isopropanol, propanol.), các este (acetal, butyl, amyl), các ceton (metyl ityl aceton, metylbutyl ceton), các ete (ete izopropilic, dioxan), benzen, phenol, pyridin, dicloetan, clorofoc. Các dung mơi đều phân cực, khi chọn dung mơi hữu cơ, ngtười ta thường quan tâm đến 2 tính chất: độ hồ tan của nĩ trong nước và ái 20 lực của nĩ với chất cần tách chiết, trong đĩ độ hồ tan của dung mơi lại phụ thuộc vào nhiệt độ, ta chọn nhiệt độ sao cho độ hồ tan của dung mơi là nhỏ nhất. 1.1.3.1. Tách chiết kháng sinh từ sinh khối: Cĩ nhiều phương pháp tách chiết gồm các phương pháp sau: phương pháp cơ học và siêu âm (dùng thiết bị Edebo,và thiết bị Rogers), phương pháp enzym (sử dụng chính enzym của tế bào phá vở tế bào đối với tế bào nấm men hoặc sử dụng enzym bên ngồi để phá vở những thành phần tương ứng trên thành tế bào của vi sinh vật), phương pháp hĩa lý (gây sốc nhiệt), phương pháp hố học. Với phương pháp tách chiết kháng sinh bằng hĩa học dựa trên khả năng tạo ra áp suất thẩm thấu mạnh của 1 số hĩa chất, người ta cho 1 số hĩa chất vào như NaCl, Foluen, Cồn … các chất này sẽ tạo ra một áp suất thẩm thấu đủ mạnh để làm tế bào bị vỡ và giải phĩng các chất trong tế bào ra (Nguyễn Đức Lượng, 2001), bên cạnh đĩ, để việc tách chiết kháng sinh đạt hiệu quả cao từ sinh khối địi hỏi khả năng hồ tan của chất kháng sinh trong tác nhân chiết phải lớn, hay khả năng tách chiết phụ thuộc vào độ hồ tan của chất dùng để tách chiết. Trước khi tách chiết, sinh khối cần rửa bằng nước để loại bỏ thành phần mơi trường; các dung mơi dùng để tách chiết cĩ nhiều loại như: etyl acetat, butanol, etanol, metanol, … nhưng trong đĩ aceton là dung mơi cĩ cực thấp nhất thường hay được sử dụng nhiều hơn trong tách chiết chất kháng sinh. 1.1.3.2. Tách chiết kháng sinh từ dịch lọc: Cũng tương tự như tách chiết kháng sinh từ sinh khối, các chất kháng sinh trong dịch lọc cĩ trọng lượng phân tử thấp thường hồ tan trong nước và dung mơi hữu cơ nên người ta thường lựa chọn dung mơi hịa tan chất kháng sinh mạnh để tách kháng sinh ra khỏi mơi trường dịch lọc; butanol là dung mơi thường được sử dụng. 21 Dù tách chiết kháng sinh từ dịch lọc hay từ sinh khối đều phải trải qua quá trình loại bỏ dung mơi bằng cách cơ chân khơng ở nhiệt độ thường dưới 60OC, sau đĩ làm giảm khả năng hồ tan của chất kháng sinh vào dung mơi bằng cách hạ nhiệt xuống thấp. Chất kháng sinh thu được từ sinh khối và dịch lọc gọi là kháng sinh thơ là nguyên liệu cơ sở cho tinh sạch kháng sinh. 1.1.3.3. Tinh sạch chất kháng sinh: Để tinh sạch chất kháng sinh, người ta cĩ thể thay đổi dung mơi hay chất hấp phụ kháng sinh (than hoạt tính) để loại bỏ các tạp chất cĩ đặc tính hồ tan được trong dung mơi tách chiết trước đĩ. Tuy nhiên, phương pháp tinh sạch chất kháng sinh cĩ hiệu quả cao được thực hiện là bằng phương pháp sắc ký hấp phụ, sắc ký bản mỏng, hay sắc ký lỏng cao áp. 1.2. Các nhĩm chất kháng sinh chính cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn: 1.2.1. Phân loại các chất kháng sinh từ xạ khuẩn: Cĩ nhiều khố phân loại khác nhau để phân loại chất kháng sinh như: theo cấu trúc hố học, theo vị trí tác dụng, theo phương thức tác dụng, theo phổ tác dụng đối với vi khuẩn. thậm chí trong y học, trong nơng nghiệp, trong hố dược người ta cũng cĩ những cách phân loại kháng sinh khác nhau, trong luận văn này chúng tơi dựa vào khố phân loại của Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh, 2001; chất kháng sinh cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn được phân chia 12 nhĩm sau: 1.2.1.1. Các kháng sinh β-lactam: Các chất kháng sinh này cĩ khung cơ bản là một vịng betalactam, là một amin vịng 4 cạnh; vịng này được gắn với một vịng thiazolidin tạo thành khung penam (vịng thiazolidin cĩ 5 cạnh no), các cephem (vịng cĩ 6 cạnh chưa no), các penem (cĩ vịng 5 cạnh chưa no), các monobactam (chỉ cĩ vịng betalactam) – đĩ là 4 phân nhĩm trong nhĩm kháng sinh betalactam. Các kháng sinh trong nhĩm này như: Penicilin (hình 1.7), Cephalosporins, … 22 Hình 1.7: Kháng sinh penicilin.(B: vịng betalactm; A: vịng thiazolidin) Các chất kháng sinh trong nhĩm này cĩ tác dụng lên vỏ vi khuẩn, ngăn phản ứng sinh tổng hợp của vỏ này, nên các loại kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ ác dụng kìm vi khuẩn. tuy nhiên ở vi khuẩn gram ( - ) màng tế bào ngồi cùng cĩ 1 lớp lipid, ngăn cản trực tiếp của chất kháng sinh. 1.2.1.2. Các kháng sinh aminoglycosid: Các kháng sinh này cĩ cấu trúc heterosid bao gồm một phần genin thuộc nhĩm aminocyclitol gắn với các phần đường trong đĩ cĩ phần đường amino (osamin). Các genin là những polyol vịng (cyclitol) trong đĩ cĩ 2 nhĩm hydrocyl được thay thế bằng các chức amin hay guanidin. Những kháng sinh thuộc nhĩm này bao gồm: Streptomycin (hình 1.8), Neomycin, Gentamicin, … Hình 1.8: Kháng sinh Streptomycin Các chất kháng sinh cĩ nguồn gốc vi sinh vật thuộc nhĩm này được tách chiết từ mơi trường nuơi cấy của các chủng: Streptomyces, Microspora và Bacillus. Việc chiết aminosid từ mơi trường nuơi cấy thường thực hiện qua 23 trao đổi cation để giữ các kháng sinh cĩ tính base (theo Nguyễn Khang, 2005), với sơ đồ tách chiết sau: Sơ đồ tách chiết 1 aminosid (theo Nguyễn Khang, 2005) 1.2.1.3. Các kháng sinh Macrolide: Là các kháng sinh cĩ heterosid mà genin là một vịng lactor cĩ chứa nhiều nguyên tử (vịng lớn – macrocycle) số lượng các nguyên tử của vịng thường từ 12 – 17 hay nhiều hơn. Người ta cịn xếp cạnh các macrolid này với các chất synergistin và lincosamid. Các kháng sinh là: Erythromycin, Oleandomycin, Azithromycin (hình 1.9), … 24 Hình 1.9: Kháng sinh Azithromycin Các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ vịng 14 nguyên tử với nhĩm –N(CH3)2 của đường amin cĩ tác dụng quyết định về kháng sinh gắn vào riboxom của vi khuẩn. 1.2.1.4. Các kháng sinh polyene macrolide: Các kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ vịng lacton lớn. Theo Berdy (1974) chất kháng sinh này cĩ 3 – 7 dây nối đơi và được chia thành các nhĩm nhỏ: dien, trien, tetraen, pentaen, hexaen, heptaen với cơng thức tổng quát: - CH2-(CH=CH)8-CH2-. Hầu hết các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ nhân amino saccaroza (mycozamin) đính vào vịng lacton bằng liên kết glucozit. Một vài chất kháng sinh thuộc nhĩm phụ heptaen cĩ nhân thơm (4-amino acetophenose) hoặc N-metyl (4-amino acetophenol) liên kết hĩa trị với các nguyên tử cacbon của vịng lớn. Một đặc điểm khác của nhĩm kháng sinh macrolic polyen là sự cĩ mặt rất nhiều các nhĩm hydroxyl trong phân tử của chúng; sự cĩ mặt của các nhĩm này cùng với nối đơi trong cấu tạo phân tử làm cho kháng sinh cĩ tính chất lưỡng tính. Chất kháng sinh ít tan trong ete, rượu nhưng tan trong dung mơi cĩ cực. Các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ tác 25 dụng phá vỡ tính thẩm thấu của màng tế bào chất, gắn vào sterol của màng rồi phá hủy làm rối loạn tính thấm. Nhiều chất kháng sinh nhĩm polien cĩ hoạt phổ kháng khuẩn khác nhau, cĩ loại ức chế cả protozoa, tế bào ung thư, tuyến trùng gây bệnh thực vật. các kháng sinh cĩ thể kể như: Rimocidin (hình 1.10), Pimaricin, … Hình 1.10: Kháng sinh Rimocidin 1.2.1.5. Các kháng sinh macrocyclic lactose khác: Chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ chứa vịng lactone lớn nối các aminosacarose. Monorden Hình 1.11: Kháng sinh Monorden 1.2.1.6. Các kháng sinh amino acid và peptide: Các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ cấu trúc hĩa học bao gồm các chuỗi acid amin, cơ bản là cấu trúc peptit mạch vịng Các chất kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ đại diện là: polymicin, bacimycin, Sinanomycin (hình 1.12), … 26 Hình 1.12: Kháng sinh Sinanomycin 1.2.1.7. Các kháng sinh glycopeptide: Nhĩm kháng sinh này cĩ cấu trúc hĩa học giống như nhĩm peptide gồm các chuỗi acid amin mạch vịng, nhưng cĩ gắn thêm các nhĩm chức glycose. Các kháng sinh thuộc nhĩm này là: Vancomycin (hình 1.13), Bleomycin, … Hình 1.13: Kháng sinh Vancomycin Các kháng sinh thuộc nhĩm này chỉ cĩ tác dụng mạnh với vi khuẩn gram (+) và khơng kháng với những vi khuẩn gram (-) 1.2.1.8. Các kháng sinh Tetracycline: Là các kháng sinh cĩ 4 vịng, những kháng sinh của nhĩm này là dẫn chất của octahydronaphtalen được lấy từ mơi trường nuơi cấy một số lồi Streptomyces. Những chất kháng sinh này cĩ phổ kháng sinh rộng bao gồm các vi khuẩn gram âm, như các kháng sinh: Tetracycline (hình 1.14), Minocycline, … 27 Hình 1.14: Kháng sinh Tetramycin. 1.2.1.9. Các kháng sinh quinone và anthracycline: Là các kháng sinh cĩ cấu trúc 3 vịng anthracene và cĩ gắn các phân tử oxy bởi nối đơi (cấu trúc quinone). Các kháng sinh gồm: Nogalamycin (hình 1.15), Streptonigrin, … Hình 1.15: Chất kháng sinh Nogalamycin. 1.2.1.10. Các kháng sinh ansamycin: Các kháng sinh ansamycin là những kháng sinh phát triển từ nhĩm kháng sinh macrolactam cĩ nguồn gốc vi sinh vật, các kháng sinh này cĩ cấu trúc 1 vịng mà trong đĩ cĩ 1 nhánh aliphatic ansa dưới hình thưc là 1 cầu nối giữa 2 vị trí khơng nằm kế cận của vịng π – system; những kháng này kháng nấm, kháng khuẩn, kháng u. những đại diện cho nhĩm kháng sinh này là những benzenic ansamycin với 17 cacbon và 1 nguyên tử N chuổi ansa (hình 1.16a). 28 Hình 1.16a: Cấu trúc của kháng sinh Ansamycin. Các kháng sinh nguồn gốc từ xạ khuẩn thuộc nhĩm này như: geldanamycin (hình 1.16b), herbimycin A, … Hình 1.16b : 1.2.1.11. Các kháng sinh Nucleoside: Các nhĩm kháng sinh thuộc nhĩm này cĩ cấu trúc hĩa học dựa trên cấu trúc nucleotic (bao gồm pyrimidin hay purine) nhưng cĩ sự thay đổi trên gốc đường và trên phần baze sự thay đổi này cĩ ảnh hưởng sâu sắc đến tác động sinh học. Các kháng sinh này cĩ khả năng kháng virus, kháng vi khuẩn, kháng u (ung thư). Những kháng sinh nucleoside cĩ nguồn gốc từ xạ khuẩn gồm: tunicamycin, polyoxin, puromycin, … 29 Hình 1.17: chất kháng sinh Tunicamycins 1.2.1.12. Các kháng sinh Polyether: Là các lọai kháng sinh trong cấu trúc cĩ nhiều nối ether (-o- ) Hình 1.18: Chất kháng sinh Nanchangmycin 1.2.2. Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn: Chất kháng sinh chống nấm từ xạ khuẩn phải kể sớm nhất là chất kháng sinh Nistatin được thu nhận từ dịch nuơi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces noursei (do Hansen và Brown, 1942) để chữa trị bệnh nấm cho người; về sau người ta đã thu nhận được nhiều chất kháng sinh cĩ nguồn gốc vi sinh vật phần lớn từ mơi trường nuơi cấy xạ khuẩn thuộc chủng Streptomyces; các kháng sinh thuộc nhĩm này phần lớn thuộc nhĩm kháng sinh Macrolit, nhĩm Polien, griseofulvin. Các Macrolit được xếp loại theo 30 kích cở vịng genin, quan trọng nhất là các chất kháng sinh cĩ vịng 14 đến 16 nguyên tử hĩa học. 1.3. Vai trị của xạ khuẩn và chất kháng sinh trong phịng chống nấm bệnh và tuyến trùng hại cây trồng: 1.3.1. Thực trạng về bệnh hại cây trồng: Ở các nước sản xuất nơng nghiệp, bệnh cây đã gây ra những thiệt hại kinh tế nghiêm trọng. Các dịch bệnh đạo ơn hại lúa, bệnh bạc lá (do vi khuẩn gây ra), bệnh vàng lụi (do virus gây ra), bệnh khơ vằn (do nấm gây ra), …đã gây tổn thất lớn khơng những về năng suất mà cịn làm mất tính ổn định của giống cây trồng. Theo thống kê của tổ chức lương nơng thế giới cho thấy: các loại cây trồng trên đồng ruộng hiện nay phải chống đở với 100.000 lồi sâu hại khác nhau, 10.000 lồi nấm, 200 lồi vi khuẩn, 600 lồi tuyến trùng và 600 lồi virus gây bệnh; thiệt hại hàng năm khoảng 20% (tức 1/5) sản lượng lương thực thực phẩm trên thề giới bị mất trắng. Sau đây là một số bệnh gây thiệt hại lớn phổ biến ở Việt Nam: 1.3.1.1. Bệnh đạo ơn trên lúa (do Piricularia oryzae gây ra): Là bệnh phổ biến ở các nước trồng lúa kể cả ở Việt Nam, tại đồng bằng sơng cửu long, hàng năm thường cĩ 2 thời điểm xuất hiện bệnh nhiều nhất là vào tháng 11 -12 dương lịch và tháng 5 -6 dương lịch. Các huyện Châu thành, Cai lậy, chợ gạo Tiền giang; Phú tân, Chợ mới An giang; Thạnh trị Cần thơ là những nơi thường cĩ bệnh. Bệnh gây thiệt hại cho lúa ở giai đoạn mạ và nảy chồi; nếu nhiễm trể ở giai đoạn trổ, bệnh làm thối đốt thân thối cổ gié nên làm đổ gãy, làm hạt lép hay làm giảm trọng lượng hạt. ở Nhật - số liệu từ năm 1953 – 1960 cho thấy sản lượng thất thu hàng năm từ 1,4 – 7,3%, trung bình là 2,98%. Tính riêng năm 1960, thất thu do bệnh cháy lá chiếm 24,8% trong tổng thất thu do sâu bệnh thiên tai. đối với bệnh thối cổ gié , người ta tính cứ 10% gié bị nhiễm bệnh thì năng suất thất thu 6% và tỷ lệ hạt kém phẩm chất gia tăng 5%. bệnh 31 do nấm Pyricularia oryzae gây ra, vết bệnh là các đốm hoặc vết thương trên lá (Hình 1.19) Hình 1.19: Triệu chứng đốm trên lá của bệnh cháy lá lúa do nấm Pyricularia oryzae gây ra. 1.3.1.2. Bệnh héo vàng cây khoai tây (do Fusarium oxysporum gây ra): Gây thiệt hại lớn ở các nước trồng khoai tây trên thế giới, ở Việt Nam cĩ nơi bệnh gây thiệt hại 40% năng suất (theo Vũ Triệu Mân, 1998). Fusarium oxysporum tấn cơng gây hại ở vị trí gốc thân, cổ rễ và củ. Ở gốc cây vết bệnh màu nâu hoặc xám nhạt bao quanh gốc thân gây hiện thối khơ tĩp lại, thường trên vết bệnh cĩ bao phủ lớp nấm trắng thưa, ngồi ra bệnh cịn gây hại ở củ và mầm củ, củ bị nấm xâm nhập nhìn bề ngồi bình thường nhưng phần thịt củ cĩ nhiều vịng vân vàng hoặc nâu và ăn sâu vào trong củ, khi đĩ gọi là bệnh thối khơ củ khoai tây. 1.3.1.3. Bệnh khơ vằn hại lúa: (do Rhizoctonia solani gây ra) Bệnh phân bố ở diện rộng ở các vùng trồng lúa trên thế giới, ở nước ta bệnh khơ vằn là bệnh nghiêm trọng thứ 2 sau bệnh đạo ơn (do nấm Pyricularia). Phạm vi ký chủ của nấm Rhizoctonia sp. bao gồm trên 180 lồi cây trồng, nấm phát sinh mạnh trong nhiệt độ cao, ẩm độ cao; vị trí gây bệnh là bẹ lá, phiếm lá và cổ bơng. Áp sát mặt nước là nơi phát sinh bệnh đầu tiên - vết lúc đầu là vết đốm hình bầu dục màu lục tối sau lan rộng thành dạng vết vằn 32 (hình 1.20); tương tự ở lá và cổ bơng. Trên vết bệnh ở vi trí gây hại đều xuất hiện hạch nấm màu nâu, hạch nấm rất dễ dàng rơi ra khỏi vết bệnh và nổi lên mặt nước ruộng. H ình 1.20: Vết bệnh khơ vằn trên lá lúa và hạch nấm Rhizoctonia solani. 33 1.3.1.4. Bệnh thối gốc và lở cổ rễ: Bệnh do nhiều loại nấm gây ra: Fusarium sp, Rhizoctonia solani, Pythium, Phytophthora spp., … Trong số đĩ chủ yếu gây hại do 3 chi: Fusarium, Rhizoctonia và Pythium. Chi Fusarium phân bố rộng trong tự nhiên, sống hoại sinh trong đất, trên xác thực vật và ký sinh trên cây. Chúng thường tiết ra chất kích thích sinh trưởng (giberilin) làm cho cây dài ra, lá úa vàng, khơng ra hoa kết quả hoặc tạo ra các độc tố gây hại cho cây trồng như acid furavic, phitonivnin. Lồi Fusarium oxysporum, gây bệnh thối rễ ở cây lương thực, cây nơng nghiệp, rau xanh và cây rừng. Cây bị bệnh thối rể thường chết héo do khơng hút được nước cung cấp cho cây; lồi này cịn gây bệnh mốc sương, bệnh thối khơ, thối ướt ở khoai tây gây thiệt hại cho năng suất cây trồng. Đây là bệnh phổ biến ở nước ta và trên thế giới; bệnh xuất hiện đặc trưng ở rễ, cổ rễ và gốc thân sát mặt đất, vết bịnh thâm đen làm rễ khơng hút được nước cung cấp cho cây làm cây chết đổ gục trên ruộng. Lúc đầu vết bệnh chỉ là 1 chấm đen sau lan rộng ra rất nhanh bao quanh cổ rễ.(hình 1.21) Hình 1.21: Bệnh lở cổ rể ở cây đậu do Nấm Rhizoctonia sp. 1.3.1.5. Bệnh chết rạp thối rễ (do Pythium sp. gây ra): 34 Pythium làm cây chết nhanh từ lúc 2 lá mầm. Bệnh chết rạp thối rễ phổ biến vào mùa mưa, nhiệt độ tương đối thấp phạm vi ký chủ rộng hại cây con cà chua, ớt, họ đậu (hình 1.22), vải, …bệnh thối rễ thường gây ra do một nhĩm nhiều lồi nấm bao gồm: Pythium, Rhizoctonia solani, Fusarium solani, … nguồn bệnh tồn tại lâu dài trong đất, chúng sống trên tàn dư cây trồng trong đất, riêng Pythium cĩ khả năng sống ẩn trong đất trồng mà khơng cĩ tàn dư cây trồng. Hình 1.22: Bệnh chết rạp thối rể trên cây đậu do Pythium sp. gây ra 1.3.1.6. Tuyến trùng hại cây trồng: 1.3.1.6.1. Tác hại của tuyến trùng lên cây trồng: Bên cạnh các bệnh do nấm gây nhiều tổn thất đến cây trồng thì một đối tượng động vật khơng xương: tuyến trùng cũng là đối tượng hết sức nguy hiểm cho cây trồng. Tuyến trùng gây hại thực vật (Phytonematodes) phần lớn sống trong đất phá hại bộ rể của cây (xem hình 1.23, 1.24) chúng gây tác hại lớn đến sinh trưởng, năng suất và phẩm chất cây trồng. Chúng tập trung nhiều ở tầng đất canh tác khoảng độ sâu 5 – 20 cm. Tuyến trùng thực vật là một trong những đối tượng dịch hại nguy hiểm; chúng cĩ mặt và gây hại trên các loại cây khác 35 nhau trên các loại đất khác nhau trong vườn ươm và trên đồng ruộng; triệu chứng gây hại dễ nhầm lẫn với triệu chứng do các nguyên nhân khác như thiếu chất dinh dưỡng, bệnh virus, cơn trùng … Ở nước ta đã cĩ nhiều thiệt hại do tuyến trùng gây ra: theo Phạm Thị Nhất (1975) khảo sát cĩ 90 – 95% diện tích cà chua bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng ở vùng Gia Lâm và Thanh Trì, Hà Nội làm giảm 50% năng suất thậm chí mất trắng; khảo sát của Nguyễn Bá Khương từ 1976 – 1978 tuyến trùng gây hại trên 32 loại rau, tạo u sưng trên rễ thuốc lá với tỉ lệ 81,5%; khảo sát của Bùi Lạng từ 1978 – 1981 tuyến trùng gây hại trên cây thuốc lá làm giảm 21,7% chiều cao cây và giảm 37,2% tốc độ ra lá. Hình 1.23:Tuyến trùng lây nhiễm vào rễ (theo www.plantaardiy.com) Tuyến trùng tuổi 2 Rể cây 36 Hình 1.24: Tuyến trùng tạo nốt sưng trên rễ cà chua (theo www.plantaardit.com) Qua các dẫn liệu trên cho thấy tác hại ghê gớm của tuyến trùng lên cây trồng. trong quá trình tìm hiểu nguyên nhân gây hại của tuyến trùng, con người đã phát hiện được mối quan hệ hổ trợ giữa hai tác nhân gây hại cây trồng: tuyến trùng và vi sinh vật gây bệnh. Cĩ thể đơn cử một vài thí dụ sau: - Bridge (1978) phân lập từ bệnh vàng lá ở cây tiêu cĩ tuyến trùng Radopholus similis, Meloidogyne incognita và nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani từ những rể cây bị bịnh ở Indonesia. Ơng cho rằng bệnh vàng lá khơng phải do một tác nhân gây bệnh là tuyến trùng hay 1 loại nấm mà do sự tương tác giữa tuyến trùng và nấm. Cùng nhận xét của Bridge, Phan Quốc Sủng (1988) cho rằng bệnh hại rễ do tuyến trùng nốt sưng Radopholus similis và Meloidogyne incognita tác động với Fusarium sp., Rhizoctonia bataticola. - Chi cục kiểm dịch thực vật vùng II (1987) cho rằng tuyến trùng Meloidohyne incognita và nấm Fusarium sp. kết hợp tấn cơng bộ rễ tiêu, sự kết hợp này phụ thuộc vào điều kiện ngoại cảnh mà cây cĩ những triệu chứng khác nhau. 37 - Thuốc lá: sau khi nhiễm tuyến trùng M. incognita, M. javanica, M. arenaria thì cũng bị nhiễm Fusarium oxysporum sau đĩ 2 tuần; và nhiễm Alternaria tenuis sau 3 tuần làm 70% số lá bị bệnh (theo Powell và Batten, 1971). - Cây dâu: tuyến trùng M. incognita là nguyên nhân đầu tiên dẫn đến sự xâm nhập của vi khuẩn, nấm, và virus làm giảm 10 – 12% sản lượng lá dâu (Goviudaian, 1991). Theo khảo sát của Ngơ Thị Xuyên (1991) tuyến trùng nốt sưng xuất hiện trên cây thuốc lá từ tháng 2 đến tháng 6, đáng chú ý là vào tháng 3, 4, 5 khi thời tiết ấm lên đã tạo điều kiện thích hợp cho tuyến trùng sinh sản, lây nhiễm tạo nhiều u sưng gây chết cây, kết hợp với bệnh nấm hoặc vi khuẩn nâng tỉ lệ bệnh của cây thuốc lá lên 90 – 100%, vào những tháng: tháng 7, 8, 9, 11, 12, mật độ tuyến trùng giảm. 1.3.1.6.2. Đặc điểm sinh học của tuyến trùng nốt sưng (Meloidogyne spp) hại cây trồng: Tuyến trùng là lồi động vật nhỏ sống trong đất và trong nước. Chúng thuộc ngành Nemathelminthe. Tuyến trùng cĩ kích thước hơi nhỏ, mắt thường khĩ nhìn thấy được, nhưng cĩ thể quan sát dưới kính phĩng đại từ 7 đến 40 lần. Tuyến trùng cĩ 2 nhĩm hình dạng chính: hình sợi, nhọn ở 2 đầu và hình quả lê. Trong đất cĩ rất nhiều loại tuyến trùng, trong đĩ cĩ cả tuyến trùng hoại sinh (khơng cĩ kim ở đầu, ăn xác bả thực vật) và tuyến trùng ký sinh gây hại cho cây trồng (cĩ mang kim ở đầu để chích hút chất dinh dưỡng từ cây). Tuyến trùng ký sinh gây hại cây trồng cĩ 3 loại: - Ngoại ký sinh: tuyến trùng chỉ bám bên ngồi mơ bị hại, chọc kim vào trong mơ để hút chất dinh dưỡng. - Nội ký sinh: tuyến trùng chui hẳn vào bên trog mơ cây, sống và sinh sản ngay bên trong mơ. Với cách ký sinh này, tuyến trùng nội ký sinh thường làm 38 cho mơ cây sưng phù lên, tạo thành những nốt sưng bất thường (hình 1.25). Vì vậy người ta gọi tuyến trùng loại này là tuyến trùng nốt sưng. Chúng ký sinh ở rễ thì làm cho rể hư hỏng, khơng hút được đầy đủ chất dinh dưỡng từ đất nên cây bị cằn cỗi, lá vàng, rụng lá, cây chết dần. Triệu chứng bệnh do tuyến trùng gây ra thể hiện ra rất chậm. Trên cây đa niên, bệnh cĩ thể tiến triển trong nhiều năm trước khi làm chết cây nên rất khĩ nhận biết để phịng trị kịp thời. Loại tuyến trùng này hiện nay được quan tâm nghiên cứu để hiều biết sinh lý và cách phịng chống. a b Hình 1.25: a/ Tuyến trùng Meloidogyne arenaeria trong nốt rể được bổ dọc, chụp qua kính hiển vi nổi. b/ Tuyến trùng Meloidogyne arenaeria nội ký sinh ở rể cây tiêu và đám trứng (nhuộm màu đỏ) do nĩ đẻ ra ở trong mơ của rể cây bệnh. (theo - Bán nội ký sinh: tuyến trùng chui phân đầu vào trong mơ cây, cịn phần thân mình thì cịn bên ngồi mơ cây bị ký sinh. Vịng đời của tuyến trùng nốt sưng phát triển biến thái qua các giai đoạn khá phức tạp; từ giai đoạn trứng đến tuyến trùng tuổi 1, 2, 3, 4 và trưởng thành. Trong các giai đoạn biến thái tuyến trùng tuổi 2 là giai đoạn quan trọng nhất trong chu trình sống của luyến trùng. Ở giai đoạn này tuyến trùng chui ra khỏi trứng và u sưng để đi vào trong mơi trường đất. Từ đây chúng sẽ tìm cách xâm nhập vào rễ cây mới, tiếp tục sống và gây bệnh cho cây. Chính ở giai 39 đoạn tuổi 2 này là thời điểm thích hợp cho chúng ta cĩ thể dùng các biện pháp để ức chế sự lây lan của tuyến trùng. Khi xâm nhập vào cây tuyến trùng tạo vết thương trên rễ cây, điều này tạo điều kiện thuận lợi cho các tác nhân gây bệnh khác như các loại nấm, virus, … cùng xâm nhập vào cây. Mật số tuyến trùng hiện diện trong đất là điều cần quan tâm, bởi vì khơng phải hể cĩ tuyến trùng ký sinh trong đất là cây trồng sẽ bị thiệt hại, mà chỉ khi nào mật số tuyến trùng đạt đến ngưỡng gây hại thì cây trồng mới bị nhiễm bệnh hay nĩi cách khác: nếu trong đất cĩ ký chủ thích hợp với tuyến trùng và được trồng liên tục trong nhiều năm thì tuyến trùng nhân mật số lên dần cho đến lúc đạt mật số gây hại thì từ đĩ cây trồng sẽ bị hại và càng ngày mức độ thiệt hại càng tăng lên. Chính điều này mà người trồng trọt cần thực hiện canh tác theo phương thức luân canh – hình thức thay đổi ký chủ đối với tuyến trùng, bên cạnh đĩ cĩ một số thuốc hố học trị được tuyến trùng như: Nemagon, DD, Furadan, Mocap, … tuy nhiên bơm thuốc vào trong đất rất khĩ và tốn kém. 1.3.2. Vai trị của xạ khuẩn, chất kháng sinh trong phịng chống bệnh và tuyến trùng hại cây trồng. 1.3.2.1. Sử dụng xạ khuẩn chống nấm gây bệnh và tuyến trùng hại cây trồng: Để phịng trừ nấm gây bệnh và tuyến trùng hại cây trồng người ta cĩ nhiều biện pháp trong đĩ biện pháp sinh học được chú ý do biện pháp này sử dụng những sinh vật sống hay các sản phẩm hoạt động sống của chúng nhằm ngăn ngừa hoặc giảm bớt tác hại do các sinh vật cĩ hại gây ra nhưng khơng gây độc hại cho cây trồng, người và gia súc, khơng gây ơ nhiễm mơi trường. Tuy nhiên biện pháp này cịn ít được nghiên cứu, việc ứng dụng trong sản xuất cịn hẹp, giá thành cao. Biện pháp sinh học để phịng trừ bệnh cây được nghiên cứu ứng dụng theo 3 hướng sau: 40 Sử dụng các siêu ký sinh (ký sinh bậc 2): đĩ là các loại nấm, vi khuẩn, thực khuẩn thể, tuyến trùng ăn thịt…Cĩ rất nhiều lồi nấm sợi cĩ khả năng gây bệnh cho sâu hại cây trồng như: Aschersoria sp., Beauveria bassiana, Conidiobolus obrus, Zoophthora radicans … đã được sử dụng để sản xuất các loại chế phẩm diệt sâu hại. Những lồi được dùng phổ biến là nấm Bạch cương – Beauveria bassiana, nấm Lục cương – Metarrhizium anisoplia. Cơ chế gây hại của các lồi nấm này là ký sinh và làm chết nhiều loại cơn trùng gây hại (khoảng hơn 100 lồi cơn trùng) (xem hình 1.26). Một số loại vi khuẩn sống trong đất, phân chuồng như vi khuẩn Achrobacterium, Pseudomonas sống ký sinh trên nấm Fusarium gây bệnh hại cây trồng. Ngồi ra cịn cĩ nhiều loại nấm sống trong đất sống ký sinh trên cơ thể tuyến trùng hại cây. Hình 1.26: Sợi nấm Beauveria sp. mọc trên cơ thể cơn trùng Sử dụng các vi sinh vật đối kháng và chất kháng sinh: các vi sinh vật đối kháng tiêu diệt hoặc ức chế sự hoạt động của vi sinh vật gây bệnh cây chủ yếu bằng các chất kháng sinh do bản thân vi sinh vật đối kháng sinh ra. Một số sinh vật đối kháng được biết: + Nấm Trichoderma harzianum ức chế nấm Botrytis cinerea hại cà chua, nấm Sclerotium rolfii hại lạc: Người ta thấy những điểm ký sinh và sự 41 quấn sợi nấm lên nấm bệnh Rhizoctonia solani (nguyên nhân gây bệnh khơ vằn) (hình 1.27, 1.28) sợi nấm gây bệnh Pythium sp. bị quăn lại và chết từng đoạn khi bị Trichoderma sp. ký sinh và sau đĩ nấm Trichoderma sp. lấn áp và ức chế sợi nấm bệnh. a b Hình 1.27: a/ Nấm Trichoderma sp. ức chế Pythium sp. b/ Nấm Trichoderma sp ức chế Rhizoctonia solani. (www.vertigo.uqam.ca/.../ mathias_de_kouassi.html) Hình 1.28: Nấm Trichoderma harzianum ký sinh trên sợi nấm Rhizoctonia solani + Tuyến trùng Tylenchulus senipenetrans gây bệnh ở rể cây cam quít bị nấm Arthrobotrys dactyloides sống trong đất bắt bằng vịng trịng do chúng tạo ra và giết chết tuyến trùng. 42 Hình 1.29: Tuyến trùng Tylenchulus senipenetrans bị nấm Arthrobotrys dactyloides bắt bằng các vịng trịng do nĩ tạo ra và giết chết tuyến trùng. Sử dụng fitonxit: là chất đề kháng của cây, do cây trồng sản sinh ra, cĩ tác dụng tiêu diệt vi sinh vật gây bệnh. Các chất fitonxit được nghiên cứu ứng dụng là từ củ hành, củ tỏi, rau ngải. Cụ thể người ta dùng nước tỏi, nước hành xử lý hạt giống để giảm nguy cơ mắc bệnh cho cây trồng. Xạ khuẩn – vai trị chống nấm gây hại cây trồng: Từ lâu các nhà k._. 8 10 12 14 16 18 Cao nấm men 1% Bột đậu tương 1% Bột đậu tương 2% NGUỒN NITƠ Si nh k hố i ( g/ l) 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 H oạ t l ự c kh án g si nh (m m ) Sinh khối Hoạt lực kháng sinh Biểu đồ 3.4: Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sự tích lũy sinh khối và hoạt tính kháng sinh của xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Hình 3.12: Ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả năng sinh kháng sinh của Streptomyces dicklowii Qua khảo sát trên cho thấy, với mơi trường MT10 bổ sung nguồn nitơ là bột đậu tương tỉ lệ 1% thì xạ khuẩn sinh kháng sinh mạnh hơn mơi trường bổ sung bột đậu tương tỉ lệ 2%; kết quả này phù hợp với nghiên cứu 85 của Lê Gia Hy , 1994. Kết quả trên theo chúng tơi cĩ thể do trong mơi trường nuơi cấy cĩ quá nhiều nguồn nitơ thì sẽ gây ra hiện tượng ức chế quá trình sinh tổng hợp các enzym kể cả các enzym proteaza ngoại bào (theo Nguyễn Đức Lượng, 2001) từ đĩ ảnh hưởng lên khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Từ kết quả thí nghiệm ở mục 3.3.4 và 3.3.5 cho thấy trên mơi trường MT10 cĩ thành phần rỉ đường 1,5%, (NH4)2SO4 1% thì xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ khả năng tổng hợp chất kháng sinh trong dịch nuơi cấy cao và trên mơi trường MT10 cĩ thành phần glucose 1,5%, bột đậu tương 1% thì chủng xa khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ kháng sinh trong sinh khối nhiều. Điều này cho thấy nếu ta kết hợp nguồn hydratcacbon là rỉ đường 1,5%, nguồn nitơ là bột đậu tương 1%, và các thành phần khống đa vi lượng như mơi trường MT10 thì chúng ta hy vọng thu được tổng lượng kháng sinh từ dịch nuơi cấy và trong sinh khối cao; để kiểm tra lại điều này chúng tơi tiếp tục thực hiện khảo sát kế tiếp. Cụ thể tiến hành 2 phương án thí nghiệm nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii trên các mơi trường cĩ 2 nguồn cacbon khác nhau là rỉ đường và glucose như sau: - Mơi trường a (MTa): MT10 + bột đậu tương 1% + rỉ đường 1,5%. - Mơi trường b (MTb): MT10 + bột đậu tương 1% + glucose 1,5%. Kết quả được trình bày ở bảng 3.12 Bảng 3.12: Khảo sát mơi trường thích hợp cho nuơi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii để thu kháng sinh Mơi trường Sinh khối (g/l) Hoạt tính kháng sinh từ sinh khối (D – d)mm Hoạt tính kháng sinh từ dịch thể (D – d)mm MTa 21 24 23 MTb 14 21,5 20 Chú thích: D: đường kinh vịng vơ khuẩn, d: đường kính lỗ đục (8mm) 86 Qua kết quả trên chúng ta khẳng định được mơi trường thích hợp cho việc nuơi cấy xạ khuẩn cĩ hoạt tính kháng sinh cao là mơi trường MTa (MT10 + rỉ đường 1,5% + bột đậu tương 1%). MTa (kháng sinh từ sinh khối) MTa (kháng sinh từ dịch lọc) 87 MTb (kháng sinh từ sinh khối) MTb (kháng sinh từ dịch thể) Hình 3.13: khảo sát mơi trường thích hợp cho nuơi cấy Streptomyces dicklowii thu kháng sinh từ sinh khối và dịch lọc. 3.4. Tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn S. dicklowii. 3.6.1. Lựa chọn dung mơi thích hợp: Dịch nuơi cấy sau 5 ngày của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii được ly tâm và tách sinh khối và dịch lọc riêng. - Tiến hành chiết rút chất kháng sinh từ dịch lọc bằng các loại dung mơi: n – butanol, n – probanol, toluen, clorofoc. - Tiến hành chiết rút chất kháng sinh từ sinh khối bằng các loại dung mơi: aceton, etylacetat, etanol, metanol, n – butanol, n – probanol. Dịch kháng sinh chiết rút được sau đĩ đem đi xác định hoạt tính kháng sinh. Kết quả được trình bày ở bảng 3.13. Bảng 3.13: Khả năng tách chiết kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii bằng các loại dung mơi 88 Nguồn chiết Dung mơi Hoạt tính kháng sinh (D – d, mm) Sinh khối Aceton Etyl acetat Etanol Metanol n – butanol izoprobanol 24 11 24 24 18 23 Dịch lọc n – butanol n – probanol Toluen Clorofoc 21 20 14 khơng Kết quả ở bảng 3.13 cho thấy để tách chiết kháng sinh từ sinh khối đạt hiệu quả cao chỉ cĩ 3 loại dung mơi cĩ độ phân cực là Aceton, Etanol và Metanol trong đĩ Aceton cĩ độ phân cực thấp nhất tuy nhiên sử dụng Etanol dùng trong tách chiết kháng sinh từ sinh khối khơng độc đối với người sử dụng, dễ tìm kiếm trong thị trường và hiệu quả cũng tương tự như Aceton, Metanol nên chúng tơi chọn dung mơi Etanol dùng tách chiết kháng sinh từ sinh khối. Khi sử dụng các dung mơi Etyl acetat thuộc nhĩm este thì khả năng trích ly kháng sinh từ sinh khối là thấp nhất hay các dung mơi thuộc nhĩm ancol (n – butanol, izoprobanol) khả năng trích ly kháng sinh từ sinh khối của xạ khuẩn đều khơng cao. Đối với dịch lọc của mơi trường nuơi cấy xạ khuẩn, dung mơi thuộc nhĩm ancol là n – butanol tách chiết được kháng sinh đạt hiệu quả cao nên dung mơi n – butanol được lựa chọn dùng tách chiết kháng sinh trong dịch nuơi cấy (sau khi tách sinh khối) của chủng Streptomyces dicklowii. Trong khi đĩ dung mơi Clorofoc hồn tồn khơng tách chiết được kháng sinh ở nhiệt độ phịng. 89 Hình 3.14: Lựa chọn dung mơi để tách chiết kháng sinh từ sinh khối và từ dịch nuơi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Cũng từ bảng 3.13 cho thấy lượng chất kháng sinh được tách từ sinh khối cao hơn chất kháng sinh được tách từ dịch lọc. Để phục vụ cho việc tách chiết, làm tinh sạch chất kháng sinh của chủng Streptomyces dicklowii chúng tơi tiến hành khảo sát độ hồ tan của chất kháng sinh này trong các hệ dung mơi khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 3.14. 90 Bảng 3.14: Độ hồ tan của chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii trong các dung mơi. Dung mơi Độ hịa tan Metanol dễ tan Dimetylfocmamit dễ tan Butanol bảo hịa nước dễ tan Benzol dễ tan cồn 70% dễ tan nước Tan được cồn tuyệt đối Khĩ tan Ethel Khơng tan Clorofoc Khơng tan 3.6.2. Tách chiết và tinh sạch kháng sinh: Để tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh chúng tơi sử dụng phương pháp dùng các loại dung mơi. Trên cơ sở kết quả khảo sát ở phần 3.4.1 và 3.4.2 chúng tơi tiến hành chiết rút và làm tinh sạch chất kháng sinh theo sơ đồ 3.1 91 Giải thích các bước trong sơ đồ: - Dịch nuơi cấy sau khi kết thúc lên men được điều chỉnh hạ pH xuống pH = 3 nhằm ngăn chặn những chuyển hố tiếp theo trong dịch nuơi cấy đồng thời loại đi những thành phần dinh dưỡng cịn thừa trong dung dịch kể cả CaCO3 mà xạ khuẩn khơng dùng hết. Sau đĩ ly tâm dịch nuơi cấy, tách phần sinh khối và dịch thể. - Sinh khối được rữa sạch mơi trường bằng nước cất (rữa 2 lần) chất kháng sinh trong sinh khối được rút chiết bằng etanol 70% (pH= 7->8) khuấy đảo liên tục ở nhiệt độ 45OC khoảng 30 phút nhằm tạo điều kiện để chất kháng sinh đi qua thành tế bào hịa vào trong dung mơi. Tiếp theo dung mơi (etanol) được đuổi đi bằng cơ chân khơng ở nhiệt độ 60OC cịn 1/3 thể tích dịch cơ. Hạ 92 nhiệt độ xuống 4OC làm giảm sự hịa tan của kháng sinh đưa đến kháng sinh tủa. - Phần dịch lọc được tách chiết bằng dung mơi n - butanol (pH=7) tỉ lệ 4 : 6 (4 phần là butanol : 6 phần là dịch lọc) ở bình lĩng; sau khi bỏ lượng nước bên dưới bình lĩng, phần trên đem cơ chân khơng (60OC) cịn 1/15 để đuổi hết dung mơi. Cuối cùng cho aceton vào; ở nhiệt độ bình thường kháng sinh hịa trong dung mơi, nhưng ở nhiệt độ lạnh (4OC) aceton giảm sự hồ tan, làm tủa chất kháng sinh. Kháng sinh kết tủa được tách bằng ly tâm 4500 vịng/ phút trong thời gian 15 phút, ta cĩ được kháng sinh thơ. Giai đoạn tiếp theo là làm tinh sạch kháng sinh thơ thu kháng sinh tinh khiết: - Kháng sinh thơ tiếp tục được pha với dung mơi metanol (nhằm loại bỏ những tạp chất tương tự như kháng sinh cĩ khả năng hồ tan trong aceton và butanol), đồng thời bổ sung 4% CaCl (nhằm tạo phức với kháng sinh làm kháng sinh khơng tan - theo Nguyễn Đức Lượng, 2001); lần rửa kháng sinh thơ cuối cùng là bằng aceton và thu phần kháng sinh tủa – ta thu được kháng sinh tinh khiết cĩ màu vàng sáng (hình 3.18). Hình 3.18: Chất kháng sinh được chiết tách từ chủng xạ khuẩn S. dicklowii 3.6.3. Tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh từ chủng xạ khuẩn: 93 3.6.3.1. Khả năng bền vững nhiệt độ của chất kháng sinh: Mục đích để biết khả năng bền vững nhiệt độ của chất kháng sinh được tách chiết từ xạ khuẩn, chúng tơi tiến hành khảo sát nhiệt độ ảnh hưởng lên chất kháng sinh được tách từ Streptomyces dicklowii kết quả được trình bày ở bảng 3.14. Bảng 3.14: Khả năng bền nhiệt của chất kháng sinh chủng xạ khuẩn S. dicklowii. Hoạt tính kháng sinh (D – d) mm Nhiệt độ xử lý (OC) Xử lý10 phút Xử lý20 phút Xử lý40 phút Xử lý60 phút 30 23 23 23 23 40 23 23 23 23 60 23 22 22 22 80 22 21 20 19 100 19 19 17 16 Chú thích: D: đường kinh vịng vơ khuẩn d: đường kính lỗ đục (8mm). Ở nhiệt độ 30OC – 40OC hoạt tính kháng sinh khơng đổi, ở nhiệt độ 60OC kéo dài hơn 10 phút thì hoạt tính kháng sinh cĩ giảm ít nhưng ở nhiệt độ trên 60OC và kéo dài thời gian thì hoạt tính kháng sinh giảm đáng kể. Từ đĩ cho thấy việc tách chiết, sử dụng, bảo quản chất kháng sinh khơng nên ở nhiệt độ cao hơn 60OC mới bảo đảm hoạt lực kháng sinh. 3.6.3.2. Xác định các nhĩm chức trong cấu trúc hố học cùa chất kháng sinh bằng phản ứng màu: Mục đích thơng qua các phản ứng chỉ thị đặc trưng cho từng nhĩm chức hố học mà từ đĩ bước đầu phân loại chất kháng sinh thuộc nhĩm cấu trúc nào theo khĩa phân loại của Masaji Sezaki,2001. Nhận biết sự hiện diện vịng lớn Lacton bằng phản ứng chỉ thị màu với H2SO4đđ: cho vài giọt chất kháng sinh tinh sạch vào ống nghiệm cĩ 4ml 94 H2SO4đđ, lắc nhẹ quan sát sự thay đổi màu: nhận thấy cĩ sự thay đổi từ khơng màu khi cho kháng sinh vào thì dung dịch chuyển sang màu đỏ thẩm điều đĩ xác định chất kháng cĩ vịng lớn lacton và tan được trong H2SO4đđ. Trên cơ sở trên tiếp tục cho vài giọt chất kháng sinh vào dung dịch H3PO4đđ để nhận biết các nhĩm hrydrastis trên vịng lớn Macrolide: nhận thấy cĩ sự đổi màu từ khơng màu khi cho vài giọt kháng sinh vào thì dung dịch chuyển sang màu vàng đã chứng tỏ cĩ nhĩm OH trong cấu trúc. Với 2 yếu tố trên chất kháng sinh khơng thể thuộc nhĩm 1,8, 9, 10, 11, 12 theo khố phân loại của Masaji Sezaki. Xác định nhĩm chức gốc amin (- NH2) bằng phản ứng với Ninhydrin: cho vài giọt kháng sinh vào ống nghiệm cĩ Ninhydrin nhưng khơng cĩ phản ứng màu hay chất kháng sinh khơng cĩ nhĩm chức amin, chất kháng sinh khơng thuộc nhĩm phân loại 2, 6, 7. Xác định nhĩm chức phenol bằng phản ứng đặc trưng với FeCl3: khi cho vài giọt chất kháng sinh vào ống nghiệm cĩ sẳn FeCl3 nhận thấy khơng xảy ra phản ứng màu hay chất kháng sinh khơng cĩ nhĩm chức phenol , nên chất kháng sinh khơng thể thuộc nhĩm 5, 8, 9. Xác định nối đơi –C=C- bằng phản ứng với KMnO4: cho vài giọt chất kháng sinh vào ống nghiệm cĩ sẳn KMnO4 nhận xét thấy phản ứng xảy ra làm mất màu KMnO4 chứng tỏ trong cấu trúc của chất kháng sinh cĩ nối đơi và điều này cĩ thể cho biết chất kháng sinh thuộc nhĩm 4. Các phản ứng trên được minh hoạ ở các hình 3.16, 3.17. 95 Hình 3.16: Phản ứng màu của chất kháng sinh chủng Streptomyces dicklowii với H2SO4đđ , H3PO4đđ , Nihydrin, Fehling (chú thích: CKS - chất kháng sinh; ĐC - đối chứng) Hình 3.17: Khảo sát các nhĩm chức bằng các phản ứng màu với FeCl3, KMnO4 của chất kháng sinh chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. (chú thích: ĐC - đối chứng; CKS - chất kháng sinh) Từ các kết quả trên, đối chiếu với khĩa phân loại kháng sinh của Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh (2001) chất kháng sinh của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ thể thuộc nhĩm 4, nhĩm polyene macrocyclic. 96 3.7. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii lên các tác nhân gây hại cây trồng. 3.7.1. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh lên bệnh hại cây trồng: Chúng tơi tiến hành thử dịch nuơi cấy xạ khuẩn ở 2 hình thức: nuơi cấy nấm gây bệnh trên mơi trường dịch thể (nước chiết khoai tây và glucose) cĩ bổ sung dịch nuơi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii 20% (đối chứng là mơi trường dịch thể nước chiết khoai tây khơng bổ sung dịch nuơi cấy xạ khuẩn) và cấy chấm 2 điểm nấm bệnh trên mơi trường thạch MT15 (thành phần gồm nước chiết khoai tây và glucose) đối xứng qua lỗ đục, rồi nhỏ dịch nuơi cấy xạ khuẩn vào lỗ đục. Kết quả cho thấy ở bảng 3.17, hình 3.19, 3.20, 3.21. Bảng 17: Khả năng ức chế của dịch nuơi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên bệnh hại cây trồng Khả năng sinh trưởng Chủng nấm gây bệnh Trong dịch thể (20% dịch nuôi cấy ) Trên môi trường thạch Fusarium oxysporum - - Rhizoctonia solani - - Pythilium sp. - - Sclerotium sp. + + Colletotrichum sp. + + Chú thích: +: không bị ức chế; - : bị ức chế 97 Hình 3.19: Khả năng ức chế của dịch nuơi cấy xạ khuẩn lên nấm bệnh cây trồng bằng phương pháp dịch thể. Sau 3 – 5 ngày quan sát kết quả trên đĩa petri thấy: tại vị trí chất kháng sinh khuếch tán quanh lỗ thạch các lồi nấm Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani, Pythium sp khơng mọc được. Riêng nấm Colletotrichum sp và Sclerotium sp vẫn phát triển được trên vùng cĩ chất kháng sinh khuếch tán. a. Rhizoctonia solani b. Pythium sp. 98 c. Fusarium oxysporum Hình 3.20: Khả năng ức chế của dịch nuơi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên nấm bệnh cây trồng a. Sclerotium sp. b. Colletotrichum sp. Hình 3.21: Sự khơng ức chế của dịch nuơi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii đối với nấm Sclerotium sp. và Colletotrichum sp. gây bệnh hại cây trồng Qua 2 phương pháp thử nghiệm sự ức chế nấm gây bệnh cho cây trồng đã cho những kết quả phù hợp, điều đĩ khẳng định chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ khả năng ức chế 3 loại nấm bệnh là: Fusarium oxysporum (gây bệnh héo vàng cho cà), Rhizoctonia solani (gây bệnh khơ 99 vằn), Pythium sp (gây bệnh chết rạp thối rễ) và khơng cĩ khả năng ức chế Collectotrichum sp , Sclerotium sp. 3.7.2. Khảo sát khả năng ức chế của chất kháng sinh từ Streptomyces dicklowii lên tuyến trùng hại cây trồng: Một đặc điểm đáng quí mà khơng phải chủng xạ khuẩn sinh kháng sinh nào cũng cĩ là ở chủng Streptomyces dicklowii thể hiện hoạt tính diệt tuyến trùng hại cây trồng rất cao. Để khảo sát khả năng này của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii hiện chúng tơi đang cĩ, chúng tơi tiến hành tìm hiểu đặc điểm hình thái và vịng đời của tuyến trùng nốt sưng ở một số cây trồng tại tp HCM và một số vùng khácđể trên cơ sở của những hiểu biết này cĩ thể tách được tuyến trùng - đối tượng phục vụ cho các thí nghiệm thử hoạt tính diệt tuyến trùng của Streptomyces dicklowii – trong điều kiện phịng thí nghiệm. 3.7.2.1. Tìm hiểu đặc điểm hình thái và vịng đời của tuyến trùng nốt sưng: Từ việc khảo sát một số vùng trồng rau và cây thuốc cĩ nhiễm tuyến trùng nốt sưng ở ngoại ơ thành phố HCM và tỉnh An Giang đồng thời kết hợp tham khảo các tài liệu về tuyến trùng nốt sưng của Vũ Triệu Miên, 1998; luận án tiến sĩ nghiên cứu về đặc điểm sinh học và khả năng phịng chống tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita của Nguyễn Mạnh Hùng, 1999 chúng tơi đã cĩ được những hiểu biết khá thú vị về tuyến trùng nốt sưng - một loại khơng xương sống gây hại cho cây trồng. Với các cây trồng bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng như Xà lách, Mồng tơi, chuối, ngưu tất, …chúng tơi thu được bộ rễ bị nhiễm tuyến trùng nốt sưng (hình 3.22). từ những nốt sưng ở các bộ rễ chúng tơi đã tách được tuyến trùng ở một số giai đoạn biến thái của vịng đời (hình 3.23). Đầu tiên trứng (hình 3.23a) phát triển thành phơi và tuyến trùng tuổi một được hình thành ngay trong vỏ trứng (hình 3.23b). Tuyến trùng tuổi 1 chui ra ngồi vỏ trứng phát triển thành tuyến trùng tuổi 2 (hình 3.23c). Tuyến trùng tuổi 2 cĩ thể từ u sưng 100 chui vào đất, gặp điều kiện thuận lợi chúng di chuyển, xâm nhập lây lan qua nhiều rễ cây khác. Tại các rễ mới xâm nhập này chúng khơng di chuyển sang các bộ phận khác của cây, chúng tiết ra các men và các chất kích thích sinh trưởng làm cho tế bào rễ sinh sản quá độ, rễ cĩ chổ sẽ trở nên phình to, tạo nên các u sưng. Cũng tại các rễ mới xâm nhập này tuyến trùng tuổi 2 tiếp tục phát triển và phân hĩa giới tính thành tuyến trùng cái và tuyến trùng đực tuổi 3 (hình 3.23d và 3.23e). Các giai đoạn phát triển từ tuyến trùng non phân hố giới tính đều xảy ra trong u sưng, mỗi u sưng cĩ từ 1 -> 10 tuyến trùng cái hình quả chanh (hình 3.23f). Tuyến trùng cái tuổi 3 tiếp tục phát triển chiều ngang thành tuyến trùng cái tuổi 4 và tuyến trùng cái trưởng thành cĩ dạng hình quả lê hay giọt nước, tuyến trùng cái trưởng thành cĩ mang túi trứng .Tuyến trùng đực tuổi 3 phát triển về chiều dài và trở thành con đực tuổi 4 và con đực trưởng thành chui vào đất. 101 Hình 3.22: Rễ của cây Cải xà lách và rễ của Mồng tơ bị tuyến trùng nốt sưng xâm nhập. 102 a b c d 103 e f Hình 3.23: Một số giai đoạn biến thái của vịng đời tuyến trùng: 3.23a/ trứng, 3.23b/ tuyến trùng tuổi 1, 3.23c/ tuyến trùng tuổi 2, 3.23d/ tuyến trùng tuổi 3♂, 3.23e/ tuyến trùng tuổi 3♀, 3.23f/ nốt sưng ở rễ cây xà lách cĩ 1 tuyến trùng cái. Vịng đời của tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne sp. được mơ tả vắn tắt ở sơ đồ 3.24. 104 Hình 3.24: Sơ đồ vịng đời tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne sp. (Vũ Triệu Mân, 1998) 3.24a/ trứng; 3.24b/ tuyến trùng tuổi 1, 3.24c và 3.24c1/tuyến trùng tuổi 3 3.24d và 3.24d1/tuyến trùng tuổi 4, 3.24e/ tuyến trùng cái trưởng thành 3.24e1/ tuyến trùng đực trưởng thành, 3.24g/con đực trưởng thành. 3.7.2.2. Tìm hiểu khả năng ức chế của dịch nuơi cấy: 105 Tuyến trùng tuổi 2 tách từ đất (số lượng 100 con tuyến trùng) đưa vào giữ trong nước muối sinh lý trong 5 đĩa petri trong đĩ cĩ 1 đĩa petri đối chứng (khơng cĩ bổ sung dịch nuơi cấy xạ khuẩn), 4 đĩa petri cịn lại bổ sung dịch nuơi cấy xạ khuẩn theo các tỉ lệ 50%, 5%, 0,5%, 0,05% dịch nuơi cấy xạ khuẩn (dnc) sau mỗi 24 giờ đếm tuyến trùng dưới kinh hiển vi được kết quả bảng 3.18. Bảng 3.18: khả năng ức chế của dịch nuơi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên tuyến trùng Meloidogyne sp. hại cây trồng Tỉ lệ tuyến trùng chết so với lúc ban đầu Số ngày theo dõi đối chứng 50% dnc 5% dnc 0,5%dnc 0,005%dnc 1 ngày 4% 100% 60% 46,2% 7,9% 2 ngày 10% - 84% 77% 19,7% 3 ngày 10% - 100% 86,5% 21,7% 4 ngày 10% - - 100% 21,7% Chú thích: dnc: dịch nuơi cấy. Qua kết quả trên, chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii cĩ khả năng ức chế được tuyến trùng ký sinh trong rễ hại cây trồng và với tỉ lệ dịch nuơi cấy xạ khuẩn từ 0,5% trở lên là ức chế được tuyến trùng nốt sưng. Dùng thuốc hố học diệt tuyến trùng rất khĩ do: tuyến trùng sống sâu trong tầng đất canh tác, hơn nữa tuyến trùng là sinh vật trung gian gây cho cây trồng bị bệnh do chúng làm tổn thương rễ, do hoạt động sống ký sinh trong rễ cây đã tạo điều kiện cho các lồi nấm bệnh, vi khuẩn, virus xâm nhiễm làm cho cây trồng bị bịnh; nên sử dụng các biện pháp sinh học là biện pháp vừa phịng bệnh vừa trị bệnh cho cây trồng, các vi sinh vật trong chế phẫm vi sinh ở mức độ nào đĩ sẽ phát tán trong đất tiêu diệt nấm bệnh và tuyến trùng, khả năng ức chế tuyến trùng và nấm bệnh của chủng xạ khuẩn S. dicklowii cĩ ý nghĩa lớn trong cơng tác bảo vệ thực vật bằng biện pháp sinh học. 106 3.8. Khảo sát ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii đến hoạt động sinh lý của cây trồng: Bên cạnh khả năng kháng các tác nhân gây bệnh hại cây trồng của dịch nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii, điều chúng tơi quan tâm tìm hiểu là dịch nuơi cấy của chủng này cĩ ảnh hưởng như thế nào đến hoạt động sinh lý của cây trồng: khả năng nảy mầm của hạt, quá trình sinh trưởng phát triển của cây. Để làm sáng tỏa điều băn khoăn trên, chúng tơi tiến hành một số thí nghiệm tiếp theo. 3.8.1. Ảnh hưởng dịch nuơi cấy lên khả năng nảy mầm của hạt: Kết quả thử nghiệm ảnh hưởng của dịch nuơi cấy chủng xạ khuẩn đến khả năng nẩy mầm của hạt sau 2 ngày được trình bày ở bảng 3.19 và hình 3.25 như sau: Bảng 3.19: ảnh hưởng nồng độ dịch nuơi cấy xạ khuẩn lên khả năng nảy mầm của hạt Tỉ lệ nãy mầm của hạt (%) Mẫu thí nghiệm Dịch nuôi (%) Đậu đen Đậu trắng Đối chứng nước 0% 38% Xạ khuẩn 100% 0% 30% 50% 14% 82% 10% 50% 92% 2% 72% 84% 1% 44% 76% Kết quả cho thấy: - Dịch nuơi cấy ở các độ pha lỗng khác nhau ảnh hưởng khả năng nảy mầm của các loại hạt khác nhau. 107 - Nếu dịch nuơi cấy khơng pha lỗng thì gây ức chế sự nảy mầm của hạt. - Nếu dịch nuơi cấy pha lỗng thì kích thích sự nảy mầm của hạt: ở nồng độ pha lỗng 50% dịch nuơi cấy chủng xạ khuẩn đã kích thích các loại hạt đậu đen, đậu trắng tăng tỉ lệ nảy mầm; tuy nhiên, nồng độ pha lỗng dịch nuơi cấy ở 2% là nồng độ thích hợp làm tăng tỉ lệ nảy mầm của cả 2 loại hạt đậu. Hình 3.25: Dịch nuơi cấy ảnh hưởng lên sự nẩy mầm của hạt 3.8.2. Tìm hiểu ảnh hưởng dịch nuơi cấy lên sự phát triển của cây con: Tiếp tục đến giai đoạn cây mầm phát triển thành cây con, chúng tơi khảo sát dịch nuơi cấy xạ khuẩn ảnh hưởng lên sự phát triển thân mầmvà rễ mầm của cây lúavì sự phát triển của thân mầm và rễ mầm ảnh hưởng rất nhiều đến khả năng phát triển cũng như năng suất sau này của cây. Sau 4 ngày nuơi trong dịch cần khảo sát, chúng tơi tiến hành đo thân mầm và rễ mầm sau đĩ dùng phương pháp thống kê lấy giá trị trung bình, và lấy sự chênh lệch về kích thước. 108 Kết quả được trình bày như sau ở bảng số 3.20, hình 3.26. Bảng 3.20: Ảnh hưởng dịch nuơi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii lên sự phát triển cây con. Nồng độ dịch nuôi XK Thân mầm (mm) Rễ mầm (mm) 0% (đối chứng) 25,9 ± 2,0 52,6 ± 5,4 1% dnc 27,5 ± 2,6 67,3 ± 1,7 2% dnc 25,8 ± 4,5 60,3 ± 1,3 10% dnc 25 ± 5,5 15,2 ± 6,2 Chú thích: dnc: dịch nuơi cấy xạ khuẩn ±: sự chênh lệch sau 3 lần lặp lại. Qua kết quả bảng 3.20 cho thấy ở nồng độ thấp thích hợp: 1 – 2% dịch nuơi cấy chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii khơng ảnh hưởng xấu đến sự phát triển thân mầm mà ngược lại chúng làm cho thân mầm phát triển dài hơn; cũng ở nồng độ này cũng giúp hệ rễ của cây phát triển mạnh cĩ ý nghĩa trong hấp thụ chất dinh dưỡng nuơi cây. 109 Đối chứng (0% dịch nuơi cấy) 1% dịch nuơi cấy 2% dịch nuơi cấy 10% dịch nuơi cấy 110 Hình 3.25: Dịch nuơi cấy xạ khuẩn Streptomyces dicklowii ảnh hưởng sự sinh trưởng của cây con (lúa Jamin 85) 111 Chương 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1. Kết luận: 4.1.1. Đã tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh học của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. • Đặc điểm hình thái đại thể và vi thể. • Đặc điểm sinh lý sinh hố: + Streptomyces dicklowii là chủng xạ khuẩn cĩ sức sinh trưởng rất mạnh: sau 24 giờ nuơi cấy đã xuất hiện khuẩn lạc, tạo sắc tố màu vàng trên mơi trường nước chiết khoai tây (PGA) khuẩn lạc cĩ mùi đất nồng rất rõ. + Sinh trưởng tốt ở nhiệt độ = 30 – 40OC; tốt nhất ở 30 – 35OC. + Chịu được nồng độ muối 4% trở lại , ở nồng độ 5% trở lên sẽ khơng sinh trưởng (đây là đặc điểm đặc trưng của lồi Streptomyces dicklowii) + Cĩ khả năng phân giải các hợp chất hữu cơ cao phân tử: tinh bột, cellulose (CMC), gelatin. Trong đĩ khả năng phân giải gelatin cĩ hiệu suất cao nhất (30mm). + Cĩ khả năng sinh chất kích thích sinh trưởng thực vật thuộc nhĩm auxin: IAA. 4.1.2. Chủng Streptomyces dicklowii tạo chất kháng sinh trong hoạt động sống. chất kháng sinh này kháng với vi khuẩn gram (+): Bacillus subtilic, Streptococcus sp., khơng kháng vi khuẩn gram (-): Echerichia coli. Các yếu tố mơi trường tối ưu cho chủng Streptomyces dicklowii sinh kháng sinh. • pH mơi trường ban đầu: trung tính đến kiềm yếu. • Chế độ nuơi cấy lắc: 200 vịng/ phút. • Nguồn Nitơ trong mơi trường: 1% bột đậu tương, nguồn Hydratcacbon: 1,5% rỉ đường. • Thời gian lên men tạo kháng sinh cao nhất: qua 5 ngày nuơi cấy. 112 4.1.3. Đã tiến hành tách chiết và tinh sạch chất kháng sinh từ sinh khối và dịch nuơi cấy của chủng Streptomyces dicklowii. Đồng thời đã tiến hành tìm hiểu tính chất của chất kháng sinh của chủng này và đã phân loại chất kháng sinh này theo cấu trúc hố học. Qua đĩ đã sơ bộ xác định chất kháng sinh của chủng này thuộc nhĩm 4: Polyene macrolide.(theo khố phân loại kháng sinh của Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh, 2001) 4.1.4. Dịch nuơi cấy của chủng Streptomyces dicklowii cĩ khả năng ức chế 3 loại nấm gây bệnh cây trồng như: Fusarium oxysporum (gây bệnh thối rễ), Rhizoctonia solani (gây bệnh khơ vằn, lở cổ rễ), Pythilium sp. (gây bệnh chết rạp thối rễ), đồng thời ở nồng độ từ 0,5% trở lên dịch nuơi cấy của chủng này cũng cĩ khả năng diệt tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne sp. với tỷ lệ: 84% sau 2 ngày và 100% sau 3 ngày trong điều kiện in vitro. 4.1.5. Dịch nuơi cấy chủng Streptomyces dicklowii khơng gây ảnh hưởng xấu đến hoạt động sinh lý của cây trồng; ở nồng độ thấp thích hợp: từ 1 – 2% dịch nuơi cấy kích thích sự nảy mầm của hạt đậu trắng, đậu đen và thúc đẩy thân mầm rễ mầm cây lúa phát triển tốt hơn. 4.2. Đề nghị: Do thời gian thực hiện đề tài cĩ hạn, chúng tơi chưa thể giải quyết trọn vẹn các vấn đề đặt ra của đề tài. Để cĩ cơ sở đầy đủ hơn nhằm sử dụng chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii vào thực tế phịng chống bệnh hại cây trồng, chúng tơi nhận thấy cần tiếp tục nghiên cứu, giải quyết các vấn đề sau: - Sử dụng các phương pháp mới để định danh kiểm tra lại chủng này đến lồi. - Thăm dị khả năng ức chế nấm và tuyến trùng gây bệnh của chủng xạ khuẩn này trên cây bệnh ngồi đồng ruộng. Đặc biệt nghiên cứu sâu hơn về khả năng diệt tuyến trùng nốt sưng gây hại cây trồng của chủng xạ khuẩn Streptomyces dicklowii. Đây là 113 vấn đề cĩ ý nghĩa thực tiển, một yêu cầu rất bức bách của người trồng trọt, nhằm giải quyết vấn nạn tuyến trùng gây hại cây trồng. 114 TÀI LIỆU THAM KHẢO A. Tài liệu trong nước: 1. Nguyễn Trọng Cẩn, 1998 – Cơng nghệ enzym – NXB Nơng nghiệp, Tp HCM. 2. Hồng Minh Châu, 2002 – Cơ sở hĩa học phân tích – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 3. Nguyễn Ngọc Châu, Nguyễn Vũ Thanh, 2000 - Động vật chí Việt Nam, tập 4 – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 4. Nguyễn Lân Dũng, 1978 - Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học, tập 3 – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 5. Nguyễn Lân Dũng, 2000 – Vi sinh vật học – NXB Giáo dục. 6. Nguyễn Đăng Đức, 1986 – Xác định hoạt lực kháng sinh bằng vi sinh vật, tập 1 – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 7. Bùi Thị Việt Hà, 1998 – Nghiên cứu xạ khuẩn sinh chất kháng sinh kháng nấm phân lập từ đất - luận án thạc sỉ, Hà Nội. 8. Lê Thị Hoa, 1998 – Nghiên cứu khả năng sinh chất kich thích sinh trưởng thực vật (IAA) của xạ khuẩn - luận án thạc sỉ, Hà Nội. 9. Bùi Xuân Hồng, Nguyễn Huy Văn, 2000 – Vi nấm dùng trong cơng nghệ sinh học – NXB Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội. 10. Nguyễn Mạnh Hùng, 1999 – Nghiên cứu đặc điểm sinh học và khả năng phịng chống tuyến trùng nốt sưng Meloidogyne incognita (Kofoid et White, 1919) Chitwood, 1949 trên một số cây trồng vùng Hà Nội và phụ cận.- luận án tiến sĩ, Hà Nội. 11. Lê Gia Hy, 1992 – Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh chống bệnh đạo ơn của một số chủng xạ khuẩn (Streptomyces) phân lập ở Việt Nam. - Tạp chí sinh học số 14. 115 12. Lê Gia Hy, 1994 - Ảnh hưởng mơi trường lên men lên khả năng sinh tổng hợp kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật của chủng xạ khuẩn 5820 - Tạp chí sinh học số 16. 13. Lê Gia Hy, 1995 – Tách chiết, tinh chế và một số tính chất hố lý của chất kháng sinh chống nấm từ chủng Streptomyces sp. 5820 - Tạp chí sinh học số 17. 14. Lê Gia Hy, 1996 – Nghiên cứu chủng Streptomyces sp.TH447 ưa nhiệt sinh chất kháng sinh chống nấm gây bệnh thực vật phân lập ở Việt Nam. - tạp chí sinh học số 18. 15. Nguyễn Khang, 2005 – Kháng sinh học – NXB Y học, Hà Nội. 16. Trần Kim Loang, 1996 - Kết quả nghiên cứu bệnh hại café tại Daklak - Viện khoa học kỹ thuật nơng lâm nghiệp Tây Nguyên. 17. Nguyễn Đức Lượng, 2003 – Thí nghiệm vi sinh vật, tập 2 – NXB Đại học quốc gia, tp HCM. 18. Nguyễn Đức Lượng, 2003 - Cơng nghệ sinh học – NXB Đại học quốc gia, tp HCM. 19. Vũ Triệu Mân, 1998 - Bệnh cây nơng nghiệp – NXB Nơng nghiệp – Hà Nội 20. Tơn Nữ Tuấn Nam, 2002 - Điều tra bệnh vàng lá chết chậm trên cây tiêu tại Tây Nguyên và đề xuất biện pháp phịng trừ - (kết quả nghiên cứu khoa học 2001 – 2002) Viện khoa học kỹ thuật nơng lâm nghiệp Tây Nguyên. 21. Nguyễn Kim Phi Phụng, 2003 - Thực tập hĩa hữu cơ 1 – NXB Đại học quốc gia, tp HCM. 22. Lê Xuân Phương, 2001 – Vi sinh vật cơng nghiệp – NXB Xây dựng. 23. Trần Minh Tâm, 2000 – Cơng nghệ vi sinh ứng dụng – NXB Nơng nghiệp, tp HCM. 24. Trần Thị Thanh, 2000 – Cơng nghệ vi sinh – NXB Giáo dục. 116 25. Đồng Thị Thanh Thu, 2000 – Sinh hĩa ứng dụng – NXB Đại học quốc gia. 26. Lê Ngọc Thạch, 2002 – Hố học hữu cơ – NXB Đại học quốc gia, tp HCM. 27. Trần Thanh Thủy, 1998 - Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học – NXB Giáo dục. 28. Tạp chí khoa học - số 23(2): 7 – 10 tháng 6 – 2001. B. Tài liệu nước ngồi: 29. Enefiok. J. Nkanga; Charles Hagedorn, 1978 – Antimicrobial agents and chemotherapy. 30. Joshua Lederberg, 1999 – Encyclopedia of microbiology, second edition, volume A – C – Academic press. 31. Larry McKane, 1980 – Microbiology essentials and applications, second edition. 32. Masaji Sezaki & Shinji Miyadoh, 2001 – Practically used Antibiotics and Their Related Substances – Pharmaceutial Research Center, Meiji Seika Kaisha, Ltd. 33. R. E. Buchanan & N. E. Gibbons – Bergey’s manual of determinative bacteriology, eighth edition – the Williams & Wilkins company/ Baltimore. 34. Zuckerman; Dicklow, 1996 – Nematocidal and Fungicidal Streptomyces dicklowii biopesticide – United States Patent 5549889. 35. William A. Remes, 1978 – The chemistry of antitumor antibiotics, volume 2. C. Tài liệu internet: 36. 37. 38. 39. 117 40. 41. 42. Abstracts%20Paszkowka2.htm 43. 44. 45. 46. 47. www.vusta.org.vn/vn/hoithao/hoithoash05.asp?topic=G1 48. www.uea.ac.uk/b137/images.gif 49. www.vertigo.uqam.ca/.../mathias_de_kouassi.html ._.