Khảo sát đặc điểm sinh học của một số chủng nấm sợi thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium từ rừng ngập mặn Cần Giờ - TP. Hồ Chí Minh

đề tài. Tôi xin chân thành cảm ơn Sở giáo dục Đào tạo Bình Dương, ban Giám đốc cùng toàn thể giáo viên Trung tâm GDTX – KT- HN Phú Giáo – Bình Dương đã động viên, giúp đỡ trong quá trình học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý thầy, quý cô trong khoa Sinh học, các học viên cao học K17 và K18, đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tôi xin chân thành cảm ơn PGS.TS. Biền Văn Minh chủ nhiệm khoa SP-KTNL Đại học Sư phạm Huế đã giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn những người thân trong đại gia đình đã động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập. Cuối cùng tôi xin cảm ơn tất cả mọi người đã giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn này. Tp. HCM, tháng 8 năm 2010 Nguyễn Cảnh Trí DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CMC Carboxyl methyl cellulose KL Khuẩn lạc RNM Rừng ngập mặn NXB Nhà xuất bản VSV Vi sinh vật MT Môi trường NS Nấm sợi HST Hệ sinh thái VK Vi khuẩn KS Kháng sinh TV Thực vật ĐV Động vật PHẦN I : MỞ ĐẦU Lý do chọn đề tài Rừng ngập mặn là một hệ sinh thái đặc biệt chỉ có ở các nước nhiệt đới, á nhiệt đới, có nhiều tác dụng trong bảo vệ môi trường, đặc biệt là trong việc ứng phó với biến đổi khí hậu, nước biển dâng. Nhờ những đặc trưng riêng như tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt... rừng ngập mặn được đánh giá là một “bức tường xanh” vững chắc chống gió bão, sóng thần, xói lở, làm sạch môi trường ven biển, hạn chế xâm nhập mặn, bảo vệ nước ngầm. Ngoài ra, RNM còn tích lũy carbon, hấp thụ và làm giảm khí CO2 sinh khí O2, ngưng tụ bụi, làm giảm tác hại của bụi, làm giảm tiếng ồn…chính vì những lý do đó mà rừng ngập măn đã trở thành "lá phổi" đồng thời là "quả thận" bảo vệ môi trường. Ngoài các chức năng trên thì RNM còn là nơi bảo tồn và lưu giữ nguồn gen quý hiếm của VSV và đặc biệt là NS. Trước đây, người ta cho rằng với điều kiện khắc nghiệt của RNM thì không thích hợp cho VSV phát triển. Nhưng cho đến nay, người ta đã xác định được chính những điều kiện khắc nghiệt đó đã làm cho VSV có khả năng sinh ra các chất có hoạt tính sinh học đặc biệt trong đó có NS. Nấm sợi là nhóm VSV có tiềm năng lớn sinh các chất có hoạt tính sinh học quý, trong đó có các chất như enzim, kháng sinh với ý nghĩa thực tiễn cao. Trong những năm gần đây, người ta đặc biệt quan tâm đến nhóm NS này bởi chúng có khả năng sinh các loại enzim ngoại bào (như cellulase, protease, amylase, kitinase ). Đặc biệt là hệ thống enzim phân giải cellulase ở Trichoderma (T.reseei, T.viride, Tkonigii…) có hoạt độ mạnh, được sản xuất ở quy mô công nghiệp và ứng dụng rộng rãi vào các ngành công nghiệp như công nghiệp dệt, giấy, thực phẩm,…. Ngoài ra, Trichoderma còn có khả năng đối kháng mạnh với vi khuẩn, vi nấm và một số loài NS khác gây bệnh TV, động vật và con người. Bản chất hóa học của kháng sinh từ Trichoderma có phổ tác động rộng, và không gây hại cho con người. Ngoài việc sản xuất enzim, kháng sinh từ NS, người ta còn có thể sản xuất kích tố sinh trưởng giberellin từ NS như Fusarium. Chính vì lẽ đó mà việc nghiên cứu Trichoderma và Fusarium đang được rất nhiều nhà nấm học quan tâm. Tuy nhiên ở Việt Nam mới chỉ có một số công trình nghiên cứu nhóm NS này, nhất là Trichoderma và Fusarium từ RNM và vai trò của chúng. Để góp phần tìm hiểu thêm về khu hệ NS của RNM nói chung và hai chi Trichodermar và Fusarium nói riêng chúng tôi tiến hành nghiên cứu đề tài “ Khảo sát điểm sinh học của một số chủng nấm sợi thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium từ rừng ngập mặn Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh “ để tìm hiểu sự đa dạng cũng như vai trò của chúng trong hệ sinh thái rừng ngập mặn. * Mục đích nghiên cứu Tìm hiểu sự đa dạng, đặc điểm, vai trò của NS trong hệ sinh thái RNM Cần Giờ. * Đối tượng nghiên cứu Một số chủng NS thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium trong Rừng ngập mặn Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh. *. Nhiệm vụ nghiên cứu + Phân lập các chủng NS từ RNM Cần Giờ. + Nghiên cứu đặc điểm phân loại để chọn ra các chủng thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium. + Nhận định về sự phân bố của hai chi Trichoderma và Fusarium ở RNM Cần Giờ . + Khảo sát một số đặc điểm sinh học của các chủng NS phân lập được của hai chi Trichoderma và Fusarium. + Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn lên sự ST, khả năng sinh enzim ngoại bào và khả năng đối kháng của một số chủng có đặc điểm sinh học nổi bật. + Lựa chọn địa điểm và thời gian nghiên cứu PHẦN II : NỘI DUNG CHƯƠNG I : TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về rừng ngập mặn Cần Giờ 1.1.1 Vị trí địa lí Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ được hình thành ở hạ lưu sông Đồng Nai – Sài Gòn nằm ở cửa ngõ Đông Nam thành phố Hồ Chí Minh tọa độ: 10°22’ – 10°40’ độ vĩ Bắc và 106°46’ – 107°01’ kinh độ Đông, cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 70km. Vị trí địa lí khu dự trữ sinh quyển Cần Giờ: - Phía Tây giáp tỉnh Tiền Giang và Long An - Phía Bắc giáp tỉnh Đồng Nai - Phía Đông giáp tỉnh Bà Rịa-Vũng Tàu - Phía Nam giáp biển Đông .. Tổng diện tích khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ là 75,740 ha, trong đó: vùng lõi 4,721 ha, vùng đệm 41,139 ha và vùng chuyển tiếp 29,880 ha [56], [57]. Hình 1 : Vị trí địa lý RNM Cần Giờ 1.1.2 Đặc điểm khí hậu, thủy văn * Khí hậu Cần Giờ nằm trong khu vực nhiệt đới gió mùa, cận xích đạo với hai mùa rõ rệt. Mùa mưa bắt đầu từ tháng 5 đến tháng 10. Trong thời gian này thời tiết ôn hòa, ẩm và mưa nhiều. Mùa khô bắt đầu từ tháng 11 đến tháng 4 năm sau. Trong thời gian này khí hậu khô, nắng và ẩm độ thấp.  Nhiệt độ : Nhiệt độ trung bình trong ngày khoảng 25,8o C. Nhiệt độ có hơi giảm dần từ phía Bắc xuống phía Nam RNM nhưng không đáng kể. Biên độ nhiệt trong ngày dao động từ 5oC – 7oC, trong các tháng thường nhỏ hơn 4oC . Nhiệt độ trung bình cao nhất thường xảy ra từ tháng 3 – 5 và thấp nhất vào khoảng tháng 12 đến tháng 1 năm sau [3].  Độ ẩm Độ ẩm tại Cần Giờ cao hơn các nơi khác trong khu vực TP Hồ Chí Minh từ 4-8%. Trong mùa mưa, độ ẩm từ 79- 83 %. Độ ẩm cao nhất vào tháng 9 đạt 83 %. Trong mùa khô độ ẩm đạt từ 74 – 77%, khô nhất vào tháng 4 khoảng 74%. Lượng nước bốc hơi cao nhất vào tháng 6 (173,2 mm/ tháng ) và thấp nhất vào tháng 9 ( 83,4mm/tháng).  Lượng mưa : Độ ẩm ở Cần Giờ rất cao nhưng lượng mưa lại thấp so với các vùng trong thành phố Hồ Chí Minh, lượng mưa trung bình hàng năm ở Cần Giờ từ 1300mm – 1400mm. Lượng mưa phân bố không đều từ phía Nam lên phía Bắc và từ phía Đông sang phía Tây.  Gió Cần Giờ chịu ảnh hưởng bởi hai hướng gió chính - Gió Nam- Tây Nam, xuất hiện từ tháng 5 đến tháng 10 trùng với mùa mưa, sức gió mạnh nhất thường vào tháng 7 và tháng 8. - Gió mùa Bắc – Đông Bắc , xuất hiện tháng 11 đến tháng 4 năm sau, trùng với mùa khô, sức gió mạnh nhất vào thành 2 và tháng 3[3].  Chế độ thủy văn RNM Cần Giờ nằm trong vùng chế độ bán nhật triều không đều ( hai lần nước lớn và hai lần nước ròng trong ngày ). Biên độ triều khoảng 2m khi triều trung bình và 4m khi triều cường. Theo quan sát, hai đỉnh triều thường bằng nhau nhưng hai chân triều lệch nhau. Biên độ triều cực đại trong RNM từ 4,0 – 4,2m vào loại cao nhất quan sát thấy tại Việt Nam. Biên độ triều có xu hướng giảm dần từ phía Nam tiếp giáp với biển Đông. Thời gian có biên độ triều lớn nhất thường từ tháng 9 đến tháng 1 năm sau, với biên độ từ 3,6 - 4,0 m ở vùng phía Nam và 2,8 – 3,3m ở vùng phía Bắc Cần Giờ. Đỉnh triều cao nhất trong năm thường xuất hiện vào tháng 10 và tháng 11, thấp nhất vào tháng 4 và tháng 5. Cần Giờ chịu chế độ bán nhật triều không đều, mỗi ngày xuất hiện hai lần nước lớn và hai lần nước ròng. Theo âm lịch thì hàng tháng có hai kỳ triều cường và hai kỳ triều kém. Biên độ trong thời kỳ triều cường từ 3 – 4m, trong thời kỳ triều kém từ 1,5 – 2m. Theo âm lịch vào các ngày 29, 30,1, 2, 3 và các ngày 14, 15, 16, 17, 18 mỗi ngày có hai con nước lớn ngập toàn bộ RNM Cần Giờ khi triều cường và có 2 ngày thủy triều thấp nhất trong tháng là ngày 8 và ngày 25 âm lịch [3].  Độ mặn Qua các số liệu đo độ mặn từ năm 1997 đến năm 2000, cho thấy độ mặn lớn nhất khi triều cường và nhỏ nhất khi triều kém. Diễn biến độ mặn phụ thuộc vào sự kết hợp giữa thủy triều ở biển Đông và lưu lượng nước thượng nguồn sông Sài Gòn và sông Đồng Nai. Vào khoảng tháng 4, nước biển chiếm ưu thế hơn trong mối tương tác biển – sông nước biển xâm nhập sâu vào trong các vùng đất liền, do đó độ mặn trong rừng được nâng lên cao. Ngược lại, vào thời kỳ tháng 9 đến tháng 10 khi các sông giữ vai trò ưu thế trong sự tương tác sông – biển, lúc đó nước ngọt từ sông đẩy lùi nước biển làm cho độ mặn giảm xuống. Từ khi thủy điện Trị An chính thức đưa vào hoạt động, nhà mày này có ảnh hưởng đến sự biến đổi độ mặn của vùng Cần Giờ rõ rệt. Trong mùa mưa lượng nước xả cao nên độ mặn giảm so với trước kia. Tại mũi Nhà Bè ( trong đất liền ) trước đây độ mặn từ 40/00 đến 9 0/00 nay chỉ còn 4 0/00và lùi xa về phía nam tại xã Tam Thôn Hiệp ( gần biển hơn ), độ mặn đạt 180/00 . Ngược lại, trong mùa khô độ mặn sông Soài Rạp thấp hơn hẳn so với sông Long Tàu do dạng dòng sông hình thành khác nhau. Sông Soài rạp có mặt cắt cạn hơn sông Long Tàu nên tác động từ biển vào sông Soài Rạp yếu hơn sông Long Tàu [3]. 1.1.3 Địa chất, thổ nhưỡng Đất ở huyện Cần Giờ có đặc điểm là đất nhiễm phèn và mặn nhưng mặn là yếu tố chủ đạo. Hầu như toàn bộ đất trên địa bàn đều tầng sét chứa pirite ( tầng sinh phèn) nằm ở các độ sâu khác nhau, khoảng 20 – 80 cm. Các nhóm đất chính gồm : Đất giồng cát ở dọc bờ biển có diện tích khoảng 680 ha, hầu như không bị ngập, đất có phản ứng chua, nghèo hữu cơ, hàm lượng chất dinh dưỡng nghèo. Vùng đất giồng cát chủ yếu dùng làm đất thổ cư, trồng cây ăn trái, hoa màu, … Đất phù sa trên nền phèn tiềm năng có lớp bùn khá cao, phân bố ở xã Bình Khánh, Lý Nhơn có diện tích 1.385 ha được sử dụng trồng lúa, cây ăn trái. Ngoài ra, còn một phần đất phù sa có tầng loang lỗ đỏ vàng, nhiễm mặn về mùa khô, độ cao dưới 2 m ở Bình Khánh. Đất phèn tiềm tàng nhiễm mặn vào mùa khô ở phía Nam, xã Bình Khánh và xã An Thới Đông, tầng sinh phèn xuất hiện nông. Đất sét và thịt chiếm ưu thế có lớp phù sa tầng mặt dày khoảng 15 -20 cm nên mùa mưa có thể trồng lúa. Đất phèn mặn + Vùng mặn phèn tiềm tàng, tầng sinh phèn nông, nhiều mùn hữu cơ, ngập mặn thường xuyên có diện tích 27.280 ha, phân bố trung tập trung ở lòng chảo huyện Cần Giờ, đất sét và thịt chiếm 85 – 95 %. Đất đang hình thành chưa ổn định, nhảo toàn phẩu diện, giàu mùn, đất mặn nhiều, vùng này Đước phát triển tốt. + Vùng đất mặn phèn tiềm tàng, tầng sinh phèn nông, nhiều hữu cơ, ngập mặn theo con nước có diện tích 4.780 ha, phân bố chủ yếu theo thềm lòng chảo, đầm lầy ngập mặn, có độ cao khoảng 1m. Đất sét và thịt chiếm 94 – 95%, tầng mặt đất chặt và cứng. + Vùng đất phèn tiềm tàng, tầng sinh phèn sâu, nhiều cát, ngập mặn theo con nước phân bố ở các giồng cát của xã Long Hòa, cát chiếm ưu thế từ 65 -80% + Đất than bùn, phèn tiềm tàng có diện tích 210 ha phân bố ở An Nghĩa, tiểu khu 5, tiểu khu 9, cù lao Phú Lợi, bên bờ vịnh Gành Rái, Thiềng Liềng, Ngã Bảy. Than bùn chất lượng kém, đất chua vừa, độ mặn cao [3]. 1.1.4 Động vật và thực vật Về thực vật : Việc nghiên cứu thực vật trong RNM Cần Giờ đã được Viên Ngọc Nam và cộng sự thực hiện năm 1990 và bổ sung năm 1997 đã thống kê được 159 loài thuộc 79 họ trong đó : Loài cây thực sự ngập mặn : 36 loài thuộc 15 họ Loài cây chịu mặn : 33 loài thuộc 19 họ Loài cây trên đất cao : 90 loài 42 họ Những loại cây trồng ở đây là Đước ( Rhizophora apiculata), Trang ( Kendelia candel), Dà vôi ( Ceriops tagal), Dà quánh ( Ceriops decandra), Gõ biển ( Intsia bijuga), Tra ( Thespesia polulnea), Vẹt đen ( Bruguiera sexangula)…Trong đó có 3 loài trồng nhiều nhất là Đước, Dà vôi và Cóc trắng Các quần xã tự nhiên đại diện Quần xã Bần chua, Mấn Quần xã Mấn, Chà là, Gõ biển Quần xã Ráng, Chà là, Tam mộc Nam, Lức Quần xã Cóc kèn, Ô rô Quần xã Đước, Dà, Mấm…[3]. Về động vật và thủy sinh vật RNM Cần Giờ với hệ thống sông rạch chằng chịt, các bãi bồi, ao đầm nhận nước ngọt từ sông Sài Gòn, sông Đồng Nai giàu chất dinh dưỡng tạo điều kiện cho các loài thủy sinh vật có nguồn gốc biển, nước lợ theo thủy triều vào sinh sống. Thành phần động vật và thủy sinh vật ở đây rất đa dạng và phong phú. ĐV thủy sinh không xương sống với trên 700 loài thuộc các ngành như chân khớp ( Arthropoda), Giun đất ( Anneldes), Giun tròn ( Nermathelninthes ), thân mềm ( Molusce); Khu hệ động vật có xương sống gồm có cá trên 120 loài (cá nước lợ, cá nước mặn) thuộc các bộ cá Nhám chuột (Lamnivormes), cá Đuối ( Rajifermes ), cá Trích (Cluppeiformes), cá đối ( Mungilliformes)… 9 loài lưỡng thê, 31 loài bò sát, 4 loài có vú như Nai, Heo rừng, Khỉ, Rái cá.. Trong đó có 11 loài bò sát có tên trong sách đỏ Việt Nam như: tắc kè (gekko gekko), kỳ đà nước (varanus salvator), trăn đất (python molurus), trăn gấm (python reticulatus), rắn cạp nong (bungarus fasciatus), rắn hổ mang (naja naja), rắn hổ chúa (ophiophagus hannah), vích (chelonia mydas), cá sấu hoa cà (crocodylus porosus)… Khu hệ chim có khoảng 130 loài thuộc 47 họ, 17 bộ. Trong đó có 51 loài chim nước và 79 loài không phải chim nước sống trong nhiều sinh cảnh khác nhau Trong số các động vật sống ở đây, có các loài hiếm như Rái cá thường ( Lutra lutra), Rái cá vuốt bé ( Aonux cinerea), Bồ nông chân xám hay còn gọi là Chàng bè( Pelecanus philippinensis), Cò lạo Ấn Độ hay còn gọi là Giang sen ( Mycteria leucocephala), Cò lạo xám ( Mycteria cinerea), choắt lớn mỏ vàng ( Tringa guttifer), Ác la (Pica pica ) [3]. 1.1.5 Khu hệ vi sinh vật Vi khuẩn Trong hệ sinh thái RNM khu hệ vi khuẩn có vai trò vô cùng quan trọng trong chu trình tuần hoàn vật chất và năng lượng của hệ sinh thái. Số lượng VK trong RNM chiếm tỉ lệ lớn, đặc biệt là trong trầm tích của RNM. Quần thể VK dị dưỡng nhiều gấp hai đến ba lần trên nền bùn lẫn lớp nước trên mặt, gấp vài lần trên nền cát. Sự tạo thành lớp mỏng trên nền bùn tạo điều kiện cho các loài tảo, cỏ biển, cây ngập mặn phát triển. Theo nghiên cứu của Nguyễn Thị Thu Hà về các vi khuẩn dị dưỡng trong hệ sinh thái RNM một số vùng thuộc Nam Định và Thái Bình đã phân loại được 80% số chủng phân lập thuộc các chi: Pseudomonas, Photphobacterium, Flavobacterium, Bacillus, xanthomanas, Alcaligenes, Lucibacterium, Vibrio, Aeromonas, Micrococcus, Chromobacterium với tỷ lệ khác nhau tùy từng vùng; trong đó những chi có số lượng nhiều nhất là Pseudomonas, Photphobacterium, Flavobacterium và Bacillus. Trong đất ở độ sâu 2cm chi Pseudomonas chiếm số lượng nhiều hơn cả [18]. Ở Ấn Độ người ta đã xác định được loài vi khuẩn Cyanobacteria có khả năng khử mặn nước biển với độ mặn 250g/l, trong điều kiện phòng thí nghiệm. Các vi khuẩn cyanobacterium, Phormidium tunue là những hứa hẹn cho việc khử muối (Balasubramanian và Kathiresan, 1999) [44]. Nấm Khu hệ nấm trong RNM rất đa dạng, phong phú, phân bố trong mọi cơ chất của RNM, phần lớn là vi nấm. Cùng với vi khuẩn chúng góp phần phân hủy nhanh các hợp chất ở lớp đất mặt như tinh bột, xenlulose, pectin, gelatin, casein, kitin có trong xác ĐV, Thực vật. Một số hợp chất phức tạp hơn như cacboxin methyl xenlulôzơ, các chất lighnoxenlulose ở các mức độ khác nhau được khoáng hóa thành xenlulose, amylase, proteinase, kitinase nhờ hệ enzym ngoại bào. Mai Thị Hằng đã nghiên cứu về tính đa dạng và vai trò của nhóm NS phân lập từ RNM ở hai tỉnh Nam Định và Thái Bình gồm các chi : Penicillum, Paelomyces, Oomyces, Mucor, Cunninghamela, Aspergillus, Cuvularia, Trichoderma, Acremonia, Cladosporium, Sepedonium, Ampelomyces, Pullularia, Geotrichum, Monilia, Fusarium, Glyocladium, Chalara, Alternaria, Eurotium, Endocochlus, Monascus. Các chi phổ biến trong tất cả các mẫu bùn, lá và thân cành cây phân tích ở cả hai vùng trên là Mucor, Paelomyces, Penicllim, Asperegillus, Cladosporium, Oomycetes, Fusarium và Trichoderma[18]. Ở Ấn Độ, người ta đã phân lập được 10 loài nấm RNM từ lá của Pichavaram, 31 loài từ lớp đất mặt và 27 loài từ lá mục. 10 loài nấm từ lá của Pichavaram là : Aspergillus flavus, A. ochraceus, Alternaria alternata, A. tenuissima, Rhizopus nigricans, funiculosum Penicillum, expansum P., fuscoatra Humicola, Mucor racemosa và Fusarium oxysporum. Alternaria alternata và Rhizopus nigricans. Một vài chủng đặc biệt Candidus, Aspergillus có khả năng tạo ra phosphate tan từ các photphat1 không tan cho các sinh vật khác sử dụng. Vì thế, vi nấm đóng một vai trò quan trọng trong việc tái tạo chất dinh dưỡng của các hệ sinh thái (Prabhakaran et al., 1987) [44]. Số nấm đếm được trên lá mục RNM nhiều hơn trên lá tươi. Người ta tìm thấy trên lá cây ngập mặn có các loài nấm ký sinh và hoại sinh như Ascomycetes, Basidiomycetes, và Deutermycetes. Người ta cũng đã tìm thấy 6 chi nấm có trên lá cây Đước đỏ: Cladosporium, pestalotia, Alternaria, Zygosporium, penicilinum và Aureobaccidium [29]. Các chi nấm ký sinh và hoại sinh sống trên lá cây ngập mặn thường gây bệnh cho cây chủ. Hầu hết các loài nấm trên đất liền đều có trên lá cây ngập mặn, còn các loại nấm biển thì có trên rễ, hoặc trên gỗ, phần ngập nước của cây ngập mặn. Khi cây chết gỗ phân hủy tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển. Các mẫu gỗ ngâm trong nước biển có tỉ lệ phân hủy cao hơn các vùng chỉ ngập khi triều cao [29]. 1.1.6 Vai trò của RNM Cần Giờ Cung cấp gỗ, củi Theo số liệu thống kê ( đánh giá kinh tế RNM Cần Giờ) của Ban quản lý RNM Cần Giờ, trữ lượng gỗ bình quân theo số liệu điều tra là 65m3/ha. Với diện tích RNM 20 346 ha, theo lý thuyết, sản lượng gỗ lấy ra hàng năm sẽ bằng 1/10 tổng sản lượng gỗ trong RNM. Với giá cây gỗ đứng tại rừng là 200 000 đồng /m3 ( năm 2004) còn tại TP Hồ Chí Minh là 300 000 đồng /1m3. Như vậy, ước tính giá trị trung bình từ gỗ hàng năm lên đến 4,2 tỷ đồng. Sản lượng củi bình quân thu được sau những lần khai thác và tỉa thưa khoàng 9,75m3/ha . Giá trị củi hiện nay tại TP Hồ Chí Minh là 200 000 đồng /1m3, như vậy ước tính giá trị từ củi hàng năm lên đến 0,9 tỷ đồng[3]. Cung cấp nguồn thủy hải sản Số liệu thống kê về thủy sản tại Cần Giờ từ năm 1978 đết hết năn 1998 cho thấy trung bình hàng năm thu hoạch được 15 000 tấn , với 75 % thuộc về hộ gia đình còn 25% thuộc về các xí nghiệp, nông trường và các đơn vị tập thể khác. Cơ cấu sản phẩm 42% cá, 24 % tôm, 9% cua, ghẹ, 25% hai mãnh vỏ ( ngao, sò, hàu…). Tại Cần Giờ, nguồn lợi thủy sản chủ yếu được đánh bắt nội địa. Theo số liệu thống kê của cơ quan quản lý thủy sản huyện Cần Giờ năm 2004, giá trị sản phẩm hàng năm từ nguồn lợi thủy sản lên đến 75 tỷ đồng [3]. Điều hòa khí hậu, tạo ra oxy RNM là một hệ sinh thái đặc biệt và hiếm có mà VN là một trong những quốc gia may mắn được thiên nhiên ban tặng. RNM chỉ có ở các nước nhiệt đới, á nhiệt đới và có nhiều tác dụng trong bảo vệ MT, đặc biệt là trong việc ứng phó với biến đổi khí hậu và nước biển dâng. Nhờ những đặc trưng riêng như tầng tán dày, hệ thống rễ chằng chịt... RNM được đánh giá là một “bức tường xanh” vững chắc chống gió bão, sóng thần, xói lở, làm sạch MT ven biển, hạn chế xâm nhập mặn, bảo vệ nước ngầm, tích lũy carbon, hấp thụ, làm giảm khí CO2 sinh khí O2, ngưng tụ bụi, làm giảm tác hại của bụi, làm giảm tiếng ồn,… RNM Cần Giờ có vị trí đặc biệt của thành phố Hồ Chí Minh, do đó có tác dụng phòng hộ, tham gia bảo vệ MT cho thành phố với ý nghĩa thực sự quan trọng. Với diện tích hơn 30 000 ha, RNM Cần Giờ có ý nhĩa là “lá phổi “, là “quả thận “của thành phố này. Giá trị cao nhất của RNM Cần Giờ là bảo tồn sinh quyển cho toàn thành phố và các vùng kế cận, cụ thể là vùng kinh tế trọng điểm phía Nam Việt Nam ( như thành phố Hồ Chí Minh, Biên Hòa, Vũng Tàu) [61]. 1.2 Tổng quan về nấm sợi Đa số NS có hình sợi, NS có vách ngăn (đa bào) hay không có ngăn vách (đơn bào). NS thường là một ống hình trụ dài có kích thước lớn nhỏ khác nhau tùy loài. Đường kính của sợi nấm thường từ 3- 5µm, có khi đến 10µm, thậm chí đến 1mm. Chiều dài của sợi nấm có thể tới vài chục cm. Các sợi nấm phát triển chiều dài theo kiểu tăng trưởng ở ngọn. Các sợi nấm có thể phân nhánh và các nhánh có thể lại phân nhánh liên tiếp tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) khí sinh xù xì như bông. Trên môi trường đặc và trên một số cơ chất trong tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc một đoạn sợi nấm có thể phát triển thành một hệ sợi nấm có hình dạng nhất định gọi là khuẩn lạc nấm [58]. Tế bào nấm có cấu trúc tương tự như những tế bào VSV nhân thực khác, vách tế bào nấm cấu tạo bởi vi sợi chitin, có hoặc không có cellulose. Chitin là thành phần chính của vách tế bào ở hầu hết các loài nấm trừ nhóm Oomycetina. Những vi sợi chitin được hình thành nhờ vào enzym chitinsyntaz [45], [46]. Tế bào chất của tế bào nấm chứa không bào (vacuoles), ty thể (mitochondria) và hạt dự trữ (glycogen và lipid), đặc biệt cấu trúc ty thể ở tế bào nấm tương tự như cấu trúc ty thể ở tế bào thực vật. Ngoài ra, tế bào nấm còn có ribôxôm (ribosomes) và những thể khác chưa rõ chức năng. Hầu hết các loài NS không cần ánh sáng trong quá trình sinh trưởng. Tuy nhiên, có một số loài lại cần ánh sáng trong quá trình tạo bào tử (Buller, 1950). Nhiệt độ tối thiểu cần cho sự phát triển là từ 2oC đến 5oC, nhiệt độ thích hợp nhất 22oC đến 27oC và nhiệt độ tối đa mà chúng có thể chịu đựng được là 35oC đến 40oC, cá biệt có một số ít loài có thể sống sót ở OoC và ở 60o C. Nói chung, NS có thể phát triển tốt ở môi trường axít (pH=6) nhưng pH tối ưu là 5 - 6,5. Một số loài phát triển tốt ở pH < 3 và một số ít phát triển ở pH > 9 (Ingold, 1967). NS không có diệp lục tố nên chúng cần được cung cấp dinh dưỡng từ bên ngoài (nhóm dị dưỡng), một số sống và phát triển nhờ khả năng ký sinh (sống ký sinh trong cơ thể ĐV hay TV) hay hoại sinh (saprophytes) trên xác bã hữu cơ. Cũng có nhóm nấm rễ hay địa y sống cộng sinh với nhóm thực vật nhất định. NS sinh sản dưới 2 hình thức: vô tính và hữu tính. Trong sinh sản vô tính, nấm hình thành bào tử mà không qua việc giảm phân, trái lại trong sinh sản hữu tính nấm hình thành 2 loại giao tử đực và cái. Ngoài những đặc điểm chung của NS, nấm sợi RNM có những đặc điểm riêng có ý nghĩa vô cùng quan trong cho nghiên cứu khoa học với các lý do: Trong hệ sinh thái RNM, điều kiện sống vô cùng khắc nghiệt do đó các sản phẩm trao đổi chất của VSV nói chung và NS nói riêng đều mang tính chất khác lạ hơn để phù hợp vời môi trường sống. Mặt khác, để tồn tại và phát triển ở nơi đây thì NS phải có khả năng thích nghi đặc biệt, nhờ tiết ra các enzym ngoại bào, các chất KS và một số sản phẩm trao đổi chất khác. Chính vì vậy các sản phẩm này có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong nghiên cứu hệ sinh thái RNM cũng như những ứng dụng của nó trong đời sống. Đa số NS nơi đây đều có khả năng chịu mặn cao. Chúng sinh trưởng ở nồng độ muối từ 2 % - 20 %, thậm chí một số NS còn có thể sinh trưởng ở nồng độ muối đến 30%. Đây là một đặc điểm đặc trưng cho sinh vật của hệ sinh thái RNM [47],[48]. 1.3 Đặc điểm Trichoderma 1.3.1 Vị trí phân loại Trichoderma Trichoderma là một trong những nhóm vi nấm gây nhiều khó khăn cho công tác phân loại do còn nhiều đặc điểm chưa được biết đầy đủ. Persoon ex Gay ( 1801 ) phân loại Trichoderma như sau [ 50]. Giới Fungi Ngành Ascomycota Lớp Euascomycetes Bộ Hypocreales Họ Hypocreaceae Giống Trichoderma Ainsworth và Sussman (1968) lại cho rằng Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales, họ Moniliaceae [36] Theo nhà khoa học Elisa Esposito và Manuela da silva (1997), Trichoderma thuộc họ Hypocreaceae, lớp nấm túi Ascomycetes, các loài Trichoderma được chia thành 5 nhóm: Trichoderma, longibrachiatum, Saturisporum, pachybasium và Hypocreanum [ 36],[37.] Theo GS Nguyễn Lân Dũng và một số tác giả khác, chi Trichoderma thuộc lớp Deuteromycetes, bộ Moniliales họ Moniliaceae [5 ]. 1.3.2 Đặc điểm hình thái , cấu trúc Trichoderma [33],[36], [39]. Hầu hết chi Trichoderma không có giai đoạn sinh sản hữu tính. Chúng sinh sản bằng bào tử đính từ khuẩn ti khí sinh. Khuẩn ti khí sinh không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, phát triển nhanh trong MT nuôi cấy ở 25-30oC, thường không phát triển ở 35oC. Khuẩn lạc không màu trong MT thạch đường bột bắp hay trên MT giàu chất dinh dưỡng như PDA. BT hình thành trong vòng 1 tuần thành khối lỏng lẻo hoặc rắn chắc có màu xanh, màu vàng và ít khi có màu trắng. Chất tạo màu vàng thường chìm trong khối agar, đặc biệt trong môi trường PDA. Cuống sinh BT phân nhánh cao ( khó để xác định hoặc đo đếm) kết thành bụi chặt hay lỏng, thường tạo nên những vòng đồng tâm đặc trưng hoặc hướng theo khuẩn ty khí sinh. Những nhánh chính của cuống sinh BT tạo ra các nhánh bên có thể kết cặp hoặc không, nhánh dài nhất xa phần đỉnh, thể bình phát sinh trực tiếp từ thân chính gần đỉnh. Các nhánh có thể tái phân nhánh, với những nhánh thứ cấp thường kết cặp [47]. Hình 1. 2. Cuống bào tử trần ở nấm T. hazrianum (trái) và T.aggresivum (phải) 1.3.3 Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học 1.3.3.1 Khả năng sinh enzym Trichoderma là nhóm NS được nghiên cứu và ứng dụng nhiều trong lĩnh vực enzym. Các chủng Trichoderma có khả năng tổng hợp các enzym ngoại bào như: amylase, protease, cellulase, chitinase,… Trong nhóm enzym ngoại bào từ Trichoderma thì enzym cellulase được nghiên cứu và sử dụng nhiều hơn. Enzym cellulase được sinh ra từ các chủng Trichoderma reesei và Trichoderma harzianum có hoạt tính mạnh hơn cả. Cellulase: là enzym ngoại bào có khả năng cắt đứt liên kết 1- 4 β-glucosid của phân tử cellulose để tạo thành các đơn phân glucose. Cellulose là thành phần chủ yếu trong xác TV nên enzym này có vai trò quan trọng trong việc phân giải những hợp chất hữu cơ tồn đọng trong MT. Cũng nhờ khả năng phân giải cellulose mà enzym này được ứng dụng nhiều trong các lĩnh vực như sản xuất thức ăn gia súc, công nghiệp thực phẩm. Những NS có khả năng phân giải cellulose là các nấm thuộc chi Aspergillus ( A. niger, A. flavus, A. oryzae….), Trichoderma (T. reesei, T. harzianum…). Amylase: là enzym thủy phân tinh bột và những chất có cấu trúc tương tự thành đường. Vì tinh bột cũng là một trong những sản phẩm chủ yếu của TV nên vai trò của amylase cũng giữ một vị trí hết sức quan trọng trong trong việc phân giải các sản phẩm với thành phần chủ yếu là tinh bột và góp phần trong việc làm sạch MT. Những nấm sợi có khả năng phân giải mạnh tinh bột là A. candidus, A. awamori…. Cũng như cellulase, dựa vào đặc tính phân giải mạnh tinh bột mà amylase được ứng dụng nhiều trong lĩnh vực sản xuất rượu, bia, bánh mì,..[10]. Protease: là các enzym thủy phân liên kết peptid trong các polypeptid tạo thành các polypeptid chuỗi ngắn, các dipeptid hay các axit amin. Trong tự nhiên, enzym này có tác dụng khoáng hóa, phân giải các hợp chất hữu cơ có bản chất protein trong xác động thực vật và SV nói chung thành các hợp chất đơn giản và cuối cùng thành các phân tử vô cơ. Con người đã ứng dụng enzym này trong các lĩnh vực của đời sống như công nghiệp thịt, da, tơ tằm…. nhằm tận dụng khả năng phân giải protein của chúng cũng như tận dụng những sản phẩm từ quá trình phân giải đó. Những NS có khả năng sinh protease mạnh là nhóm mốc vàng (A. oryzae, A. flavus, A. fumigatus…) và nhóm mốc đen (A. niger, A. .awamori, A. .usamii…) Pectinase: là enzym xúc tác quá trình phân giải pectin thành các hợp chất đơn giản như galacturonic, galactose, metanol…..được ứng dụng trong sản xuất nước quả, rượu vang, hoặc trong sản xuất cà phê hòa tan, chế biến đay gai,... Những NS có khả năng sinh pectinase cao được chú ý là P.glaucum, A. awamori, P.citrinum…[51] Kitinase: Kitine là các biopolyme chứa các gốc N-acetyl-glucoszamin liên kết với nhau bởi mối liên kết β-1,4-glucosid. Hàng năm trong tự nhiên có thể tạo 1010-1014 tấn kitine. Kitine bị VSV (chủ yếu là NS) phân giải liên kết β-1,4-glucosid tạo ra các N-acetyl-glucoszamin. Hệ kitinase mạnh còn giúp các NS (Trichoderma spp, Glyocladium spp, Chaetomium spp.) tăng cường hiệu quả tiêu diệt các loài nấm gây bệnh (F. oxysporium, Botritis cinerea, Pyricularia oryzae....có thành tế bào là kitine) và các loài nấm B. assiana, M. anisopliae, P. fumosoroseus...chống các loài côn trùng có vỏ kitine. Các NS này được sử dụng làm tác nhân kiểm soát sinh học chống các VSV gây bệnh và côn trùng trong nông-lâm nghiệp [9]. 1.3.3.2 Khả năng sinh kháng sinh Một trong số những sản phẩm trao đổi chất bậc hai do NS sản xuất ra chính là chất KS. Vai trò của chất KS đối với đời sống hiện còn là một vấn đề đang được nghiên cứu. Tuy nhiên, hiện có hai giả thiết về vai trò của chất KS được nhiều nhà khoa học ủng hộ hơn cả. Giả thuyết thứ nhất cho rằng việc tổng hợp các chất KS nhằm tạo ra ưu thế phát triển cạnh tranh có lợi cho chủng sinh KS. Nhờ đó, chúng có thể tiêu diệt hay kìm hãm được sự phát triển của các loài khác cùng tồn tại và phát triển trong hệ sinh thái cục bộ đó [17]. Giả thiết thứ hai cho rằng việc tổng hợp chất KS là một đặc tính cần thiết và đảm bảo cho khả năng sống sót cao cho chủng sinh ra chất KS trong tự nhiên, nhất là với các loài có bào tử. Người ta đã xác định được một số chất kháng sinh có tác dụng ức chế sự nảy mầm của BT chính chủng sinh ra chất KS đó [18]. Có thể chất KS có vai trò kìm hãm sự nảy mầm của bào tử cho đến khi điều kiện môi trường ngoài hoàn toàn thích hợp cho sự phát triển của chúng [18]. Đối với con người, KS là một trong số những sản phẩm có giá trị và ngày càng trở nên rất quan trọng trong đời sống do những tác dụng mà nó mang lại đối với công tác chữa bệnh, bảo vệ cây trồng, bảo quản thực phẩm và chăn nuôi. Những NS có khả năng sinh chất KS mạnh là các nấm thuộc chi Penicillium, Cephalosporium, Trichoderma. 1.3.4 Khả năng ứng dụng của Trichoderma Lương thực và ngành dệt Trichoderma là những nhà máy sản xuất nhiều enzym ngoại bào rất có hiệu quả. Chúng đượ._.c thương mại hóa trong việc sản xuất các cellulase và các enzym khác phân hủy các polysaccharide phức tạp. Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong thực phẩm và ngành dệt cho các mục đích tương tự. Chất kiểm soát sinh học Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như không được đăng ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật. Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả. Hình thức sử dụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón cho cây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây[45],[52]. Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng Những lợi ích mà chi NS này mang lại đã được biết đến từ nhiều năm qua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kích thích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường. Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong thời gian gần đây. Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất). Những rễ sâu này giúp các loài cây như Bắp hay cây Cảnh có khả năng chịu được hạn hán. Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ [52]. Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen Nhiều VSV kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoá các sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học. Nhiều gen có nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh. Chưa có gen nào được thương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển [61]. Khả năng ứng dụng ở Việt Nam Các kết quả nghiên cứu của Trường Đại học Cần Thơ, Viện Lúa Đồng bằng sông Cửu Long, Công ty thuốc sát trùng Việt Nam, Viện Sinh học Nhiệt đới đã cho thấy hiệu quả rất rõ ràng của nấm Trichoderma trên một số cây trồng ở Đồng bằng sông Cửu Long và Đông Nam Bộ. Các nghiên cứu cho thấy nấm Trichoderma có khả năng tiêu diệt nấm Furasium solani (gây bệnh thối rễ trên cam quýt, bệnh vàng lá chết chậm trên tiêu) hay một số loại nấm gây bệnh khác như Sclerotium rolfsii, Fusarium oxysporum, Rhizoctonia solani. Công dụng thứ hai của nấm Trichoderma là khả năng phân huỷ cellulose, phân giải lân chậm tan. Lợi dụng đặc tính này người ta đã trộn Trichoderma vào quá trình sản xuất phân hữu cơ vi sinh để thúc đẩy quá trình phân huỷ hữu cơ được nhanh chóng. Các sản phẩm phân hữu cơ sinh học có ứng dụng kết quả nghiên cứu mới này hiện có trên thị trường như loại phân Cugasa của Công ty Anh Việt (TP. Hồ Chí Minh) phân VK của Công ty Viễn Khang (Đồng Nai) đã được nông dân các vùng trồng cây ăn trái, cây tiêu, cây điều và cây rau hoan nghênh và ứng dụng hiệu quả [46]. 1.4 Đặc điểm Fusarium 1.4.1 Vị trí phân loại Chi Fusarium là một chi nấm có số lượng loài đã được mô tả đặc biệt lớn, trên một nghìn loài, nhưng cũng là một chi nấm mà số lượng loài đến nay còn được chấp nhận so với số lượng loài đã được mô tả nói trên chiếm một tỉ lệ rất nhỏ: trên dưới 1% hoặc 3-4% tùy các tác giả khác nhau. Nguyên nhân do khả năng biến dị rất cao của các chủng thuộc chi Fusarium trên các cơ chất tự nhiên. Những nghiên cứu về phân loại học chi Fusarium từ đầu thế kỷ này, đặc biệt từ những năm 1950 trở lại đây đã có những đổi mới như kỹ thuật nuôi cấy đơn BT, các kỹ thuật hiển vi khác được cải tiến, trước hết là các đặc điểm phân loại của mỗi loài đã được nghiên cứu có hệ thống và do đó đã có những giới hạn cho những đặc điểm đó khá rõ rệt [9]. Theo Nguyễn Lân Dũng ( 1979) phân loại Fusarium như sau [ 48]. Giới: Mycetae (fungi) Ngành: Eumycota Ngành phụ: Deuteromycotina (The imperfect fungi) Lớp: Hyphomycetes Bộ: Hyphales (Moniliales) Họ: Hypocreaceae Chi: Fusarium 1955: Bilai đề nghị một hệ thống gồm 26 loài tập hợp trong 9 nhóm loài. 1977: Bilai bổ sung vào chi này thêm 5 loài nữa. 1971: Booth bổ sung thêm các đặc điểm của bộ máy mang bào tử trần của nhiều loài và căn cứ vào đặc điểm này cùng với các đặc điểm hình thái và nuôi cấy khác, đã đề nghị 12 nhóm loài với 44 loài và được chấp nhận hoặc mô tả mới của chi Fusarium. Theo một quan điểm phân loại khác về chi Fusarium, Snyder và Hansen (1940), sau đó Toussoun và Nelson (1968), Messiaen và Cassini (1968), ngoài các đặc điểm khác, dùng đặc điểm của vách ngăn gốc bào tử trần lớn là một trong các đặc điểm cơ bản, đã tập hợp các loài của Wollenweber và Reinking (1935) vào 9 loài và một số thứ. Về chi Fusarium ở 3 nước Đông Dương, Bugnicourt (1939) đã phát hiện và mô tả 29 loài và thứ ký sinh trên 112 loài cây Hạt kín và 3 loài côn trùng. Các loài và thứ này đã được kiểm tra lại và đựợc xác định là thuộc 11 loài và thứ còn giá trị, 18 nhóm phân loại khác đã trở thành các tên đồng nghĩa (Bùi Xuân Đồng 1986). Sau Burnicourt, một số loài và thứ khác thuộc chi Fusarium đã được phát hiện và mô tả. [9] 1.4.2 Đặc điểm hình thái , cấu trúc của Fusarium Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Hệ sợi nấm sản sinh độc tố tiết vào hệ mạch gây héo cây chủ. Ở nấm Fusarium lỗ ở chính giữa vách ngăn lớn hơn so với các lỗ khác.Thường sinh trưởng rất nhanh, có màu trắng, hồng vàng, tím và thỉnh thoảng xuất hiện màu lục. Fusarium sinh sản vô tính trung bình giữa 3 kiểu bào tử vô tính là bào tử đính lớn (Macroconidia), bào tử đính nhỏ (Microconidia) và BT vách dày (hậu BT - Chlamydospores). BT đính lớn, thường nhiều nhân, hình liềm hoặc thân cong sinh ra từ cuống BT. Đầu và cuối BT lớn thuôn nhọn. Một vài loài BT lớn tách rời và không gắn trên cuống BT, những tế bào sinh BT lớn gọi là thể bình (phialide). Tiểu BT đính thường đơn nhân đôi khi 2 ngăn, hình cầu hoặc hình trứng được sinh ra từ một thể bình hay những cuống BT phân nhánh hoặc không phân nhánh. BT đính nhỏ thường được giữ trong một nhóm nhỏ và tiểu BT đính của Fusarium rất giống BT của Cephalosporium vì thế giai đoạn này thường được qui vào nấm Cephalosporium[10]. BT vách dày hình tròn hoặc hình trứng, vách dày, nằm tận cùng hoặc chen giữa các sợi nấm giả. Chúng có thể phát triển đơn hoặc thành chuỗi, chúng tách ra và mọc các ống mầm nếu BT gặp điều kiện thuận lợi. Hậu BT hay BT vách dày rất bền và tồn tại độc lập trong thời gian dài[6],[10]. 1.4.3 Khả năng sinh các chất có hoạt tính sinh học Các chất độc và chất kích thích Nhóm Trichothecenes bao gồm 150 loại hợp chất có cấu trúc tương tự nhau (Grove, 1988). Nó được tạo ra từ nấm thuộc nhóm Fusarium, Trichoderma, Stachybotrys, Verticimonosporium, Cephalosporium và Myrothecium. NS đồng ruộng điển hình và nghiêm trọng nhất là Fusarium và Alternaria Arten. Ngũ cốc nhiễm độc tố nấm mốc Fusarium trên diện rộng, loại thường gặp nhất là độc tố nấm mốc Deoxynivaleno (ĐON). Loại độc tố này được mô tả như là "độc tố gây nôn mửa". Nó gây ra các hiện tượng chán ăn, sưng tấy hệ tiêu hóa cũng như buồn nôn và bỏ ăn. Nó gây ra tổn thất năng suất đáng kể, đặc biệt trong chăn nuôi lợn và sản xuất thức ăn cho lợn. Đồng thời nhóm độc tố này cũng có ảnh hưởng tiêu cực đối với hệ miễn dịch. Điều này có nghĩa là khi ta sử dụng thức ăn chăn nuôi nhiễm độc tố này, nó sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đối với các cơ quan trong cơ thể gia súc, ức chế miễn dịch và là nhân tố làm giảm đáng kể năng suất.[31],[49] Zearalenone là độc tố do nấm Fusarium roseum sinh ra, được phân lập năm 1961, còn được gọi là ZON, Zea, hay ZEN. Sau đó, người ta cũng tìm thấy trên bắp và lúa mì bị mốc có 4 loại Fusarium khác cũng sinh ra độc tố này (Fusarium moniliforme, F. tricinctum, F. oxysporum và F. sporotrichioides). Loại độc tố này gây tổn thất lớn cho chăn nuôi lợn , gây động dục giả là ảnh hưởng chủ yếu được thấy ở cơ quan sinh sản của vật nuôi. Triệu chứng đối với gia súc cái là phù nề và sưng tấy âm đạo, sưng tuyến vú, ảnh hưởng tới khả năng sinh sản hay thậm chí là vô sinh. Đối với gia súc đực thì đáng chú ý nhất là chất lượng tinh trùng giảm.[31] Fumonisins là độc tố được tạo ra từ nấm Fusarium verticillioides (syn., moniliforme) và Fusarium proliferatum. Về mặt bản chất được coi là một chất chịu nhiệt và vẫn chưa tìm thấy một biện pháp nào để làm giảm độc tố của nó. Theo Scott, 1993 thì độc tố Fumonisins này liên quan tới bệnh ung thư thực quản của con người sống ở phía Bắc Châu Phi và nó cũng có thể gây ra bệnh ung thư gan ở chuột nhắt và bệnh phù nề phổi. Theo Placinta và cộng sự năm 1999 thì việc nhiễm độc tố của ngô và thức ăn gia súc khác ở các Châu: Châu Âu, Châu Phi, Châu Á, Bắc Mỹ đã được thông báo trong những năm gần đây, nó đã gây lên hậu quả lớn nhất trong số các chủng Fumonisins là chủng FB1.[31] Bảng 1: Loài của Fusarium và độc tố do chúng sinh ra Loài của Fusarium Độc tố F. culmorum; F.graminearum; F.sporotrichioides Deoxynivalenol F. sporotrichioides; F.poae T-2 toxin F. sporotrichioides; F.graminearum; F.poae Diacetoxyscirpenol Bảng này gồm có độc tố: tricothecenes, zearalenone, moniliforim, fumonisins và axit furasic. Tricothecenes được chia nhỏ thành 2 nhóm: Nhóm A và Nhóm B. Tricothecenes nhóm A bao gồm T-2 toxin, HT-2 toxin, neosolaniol và diacetoxyscirpenol (DAS), trong khi đó tricothecenes nhóm B bao gồm vomitoxin (deoxynivalenol, DON) và nivalenol. Một số trong những độc tố trên có mang hoạt tính gây ung thư[31]. 1.4.3.2 Khả năng ứng dụng của Fusarium Tiêu diệt côn trùng Sự phân bố rộng lớn dưới dạng ký sinh côn trùng của chi Fusarium trên trứng Pilidia (Apethymus braecatus Gmel) ở Tiệp (Prihoda A. 1956), trên Diaspidinae ở Maroc (Smirnoff w. A. 1956) và trên trứng Châu chấu (Akbar K. 1958). Kilpatrick R. A. đã thông báo nấm Fusarium oxysporum schlecht là một trong những nấm ưu thế tiêu diệt ấu trùng giống Sitona năm 1956-1960 ở Mỹ. Theo tài liệu của Morquer R. và Nysterakis (1944), nấm Fusarium lateriticum Nees gây bệnh cho trứng, ấu trùng và vật chủ trưởng thành của Phylloxera vitifoliae Fitch. Loài Fusarium acridiorum App. Et Wr là NS ký sinh trứng châu chấu Schistocerea gregaria Forst. Khi trứng bị nhiễm loại NS này thì trên bề mặt trứng phủ một lớp mỏng màu hồng và trứng bị thối. Sản xuất hóoc môn sinh trưởng thực vật Công nghệ sinh học dùng loài F. monoliforme Sheldon để sản xuất chất kích thích sinh trưởng thực vật giberellin đã có những ứng dụng trong thực tiễn nông nghiệp ở nhiều nước. Ở nước ta cũng có những công trình nghiên cứu phân lập tuyển chọn các chủng nấm thuộc loài này, nghiên cứu nuôi cấy, chiết xuất giberellin và nghiên cứu ứng dụng kích thích tố sinh trưởng thực vật này đối với một số cây trồng đã thực hiện trong hơn 30 năm qua[45]. 1.5. Tình hình nghiên cứu Trichoderma và Fusarium từ rừng ngập mặn * Tình hình nghiên cứu nấm sợi Ở Mỹ , năm 1983 phòng thí nhiệm của quân đội Mỹ ở Natik và Trường Đại học Rutgers sử dụng Trichoderma viride và chọn lọc được biến chủng QM9414 có khả năng sinh cellulase cao ( theo Rehm,1893 ) [38]. Năm 1998, Yu đã nuôi cấy Trichoderma reesei Rut 30 trong MT chứa 5% bột cellulase và 1% cám mì, thu được hoạt lực CMCase là 232,4 IU/g [33]. Năm 2003, khoa Sinh Lý Thực vật Trường Đại học California tuyển chọn chủng nấm Trichoderma harzianum có khả năng phân giải DDT, endosulfan, pentachloronitrobenzen và pentachorophenol. Nấm này phân giải endosulfan trong nhiều điều kiện dinh dưỡng khác nhau trong suốt quá trình sống của nó Năm 2004, Trần Thanh Phong khảo sát khả năng sinh tổng hợp enzim cellulase từ Trichoderma reesei và Aspergillus niger trên MT lên men bán rắn. Năm 2007, Trương Phước Thiên Hoàng Trường Đại học KHTN Thành Phố Hồ Chí Minh, khảo sát hoạt tính một số hệ enzim thủy phân amylase, cellulase, pectinase thu từ 3 chủng Trichoderma phân lập từ miền Đông Nam Bộ. * Tình hình nghiên cứu NS từ rừng ngập mặn Cho đến nay, trên thế giới và Việt Nam đã có những công trình nghiên cứu, phân lập và phân loại NS trong hệ sinh thái RNM. Trước đây người ta cho rằng điều kiện môi trường RNM quá khắc nghiệt không thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển của NS . Năm 1997, theo Tadayoshi và cộng sự tìm thấy các chủng nấm sợi ở RNM Thái Lan và Nhật Bản thuộc chi Trihoderma có nhiều ở thân cây [45]. Ở Việt Nam, cho đến năm 2000 Mai Thị Hằng và cộng sự mới thông bào về nấm sợi RNM. Năm 2002, tác giả này tiếp tục nghiên cứu sự đa dạng, khả năng diệt côn trùng và phân giải cacbuahydro của nấm sợi từ RNM ở tỉnh Nam Định và Thái Bình. Riêng ở RNM Cần Giờ chỉ một số ít tác giả nghiên cứu.[18] Năm 2000, Phan Thanh Phương, khảo sát khả năng sinh kháng sinh của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh. Năm 2007, Khưu Phương Yến Anh, Nghiên cứu khả năng sinh cellulase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh. Năm 2007, Phạm Thị Thanh Thúy, nghiên cứu khả năng phân giải Carbuahydro của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh . Năm 2009, Võ Thị Bích Viên, khảo sát đặc điểm sinh học một số chủng nấm sợi thuộc chi Aspergillus và Penicillium từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh Năm 2009, Nguyễn Thị Lan Hương, Nghiên cứu khả năng sinh enzym amylase của một số chủng nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ TP Hồ Chí Minh. Có thể nói cho đến nay chưa có một công trình nghiên cứu nào về Trichoderma và Fusarium từ RNM Cần Giờ. CHƯƠNG II : VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Vị trí lấy mẫu: Các chủng NS được phân lập từ RNM ở các xã An Thới Đông, Tam Thôn Hiệp, Long Hoà, Lý Nhơn khu Lâm Viên Cần Giờ thuộc Huyện Cần Giờ, TP. Hồ Chí Minh. Lấy mẫu được tiến hành theo mùa (mùa mưa, đầu mùa khô, và giữa mùa khô); vị trí lấy mẫu (trong rừng, cách khu dân cư và biển tối thiểu 2km). Mẫu bao gồm: thân cành chết khô còn trên cây, thân cành mục trên đất, lá tươi trên cành, lá vàng mới rụng, lá mục trên mặt đất, đất bề mặt và cách bề mặt từ 5-10cm. Các VSV kiểm định gồm: E.coli, B. subtilis do viện Paster thành phố Hồ Chí Minh cung cấp 2.1.2. Hoá chất - Các loại đường chuẩn: glucose, saccarose, lactose, mantose, galactose (Trung Quốc). - Các loại muối: KNO3, (NH4)2SO4, NaNO3, NaCl, KCl, KH2PO4, MgSO4.7H2O, FeSO4, Na2HPO4 (Trung Quốc). - Các hợp chất khác: Yeast extract (Mỹ), CMC (Nhật), Maelt extract (Đức), pepton (Anh), kitin, casein, Tween-80 ( Trung Quốc), dầu DO , Agar ( Việt Nam). - Chất kháng sinh Chloramphenycol (Ấn Độ) 2.1.3. Thiết bị, dụng cụ: - Nồi hấp áp lực Huxlex (Đài Loan) - Tủ sấy Memmert (Đức) - Kính hiển vi quang học, máy chụp hình kĩ thuật số Olympus 5.1 (Nhật Bản) - Máy đo pH Pometer KL-009 (II) (Trung Quốc) - Máy li tâm Rotina ( Đức) - Tủ lạnh National – (Nhật Bản) - Tủ giữ mẫu Sanyo – (Nhật Bản). - Máy giập mẫu. ( Đức) - Máy lắc Gerhardt – (Đức) - Cân phân tích Sartorius –( Đức) 2.1.4 . Môi trường - MT1 : MT Czapek - Dox cải tiến ( phân lập nấm sợi) [5], [ 12], NaNO3 : 3,5 g K2HPO4 : 1,5g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt) Glucoza : 20 g Agar : 20 g Nước biển : 1000 ml PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút. - MT2: Yeast extract agar ( YEA ) - Giữ giống và khảo sát khả năng sinh kháng sinh [5], [ 12]. Cao nấm men : 5 g Glucoza : 20 g Agar : 20 g Nước biển : 1000ml PH = 5,5-6,0. khử trùng 1atm/30 phút. - MT3 : MT Potato glucose agar ( PGA) - định loại nấm sợi [5], [ 12]. Nước chiết khoai tây : 200ml Glucoza : 20 g Agar : 20 g Nước biển : 1000ml PH = 5,5-6,0. khử trùng 1atm/30 phút + Cách chế nước chiết khoai tây: Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch. Cân 200g khoai tây đã gọt vỏ, xắt hạt lựu, thêm 1lít nước cất, đun sôi trong vòng 30 phút, lọc lấy dịch trong. - MT 4 : MT Malt Extract Agar (MEA) - khảo sát khả năng sinh kháng sinh [2]. Cao malt : 20 g Peptone : 1 g Glucoza : 20 g Agar : 20 g Nước biển : 1000 ml PH = 5,5-6,0. khử trùng 1atm/30 phút - MT5 : MT thử hoạt tính cellulase[2], [5]. NaNO3 : 3,5 g K2HPO4 : 1,5g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt) CMC : 20 g Agar : 20 g Nước biển 1000 ml PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút. - MT6 : MT thử hoạt tính protease [3], [4]. NaNO3 : 3,5 g K2HPO4 : 1,5g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt) Cazein : 20 g Agar : 20 g Nước biển 1000 ml PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút. - MT 7 : MT thử hoạt tính amylase[ 24]. NaNO3 : 3,5 g K2HPO4 : 1,5g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt) Tinh bột tan : 20 g Agar : 20 g Nước biển 1000 ml PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút. - MT8 : MT thử hoạt tính kitinase [24]. NaNO3 : 3,5 g K2HPO4 : 1,5g MgSO4.7H2O : 0,5g KCl : 0,5g FeSO4.7H2O : 0,01g (vêt) Bột kitin : 20 g Agar : 20 g Nước biển 1000 ml PH = 6,5. khử trùng 1atm/30 phút. + Cách chiết kitin từ vỏ, đầu tôm - Vỏ, đầu tôm rửa sạch, sấy khô. - Xử lý protein bằng dung dịch NaOH 4% ở 70 -75oC trong 4 giờ, sau đó rửa sạch bằng nước cất. - Tách khoáng bằng dung dịch HCl 8% ở 26 -30 oC trong 16 giờ, rửa sạch - Sấy khô, xay nhuyễn thành dạng bột, bảo quản trong lọ thủy tinh. MT 9 : MT Meat peptone agar (MPA) - Nuôi cấy và giữ giống vi khuẩn kiểm định Pepton : 5 g NaCl : 5 g Cao thịt : 5 g Agar : 20 g Nước cất 1000ml PH = 7,5 khử trùng 1atm 30 phút 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Phương pháp vi sinh vật 2.2.1.1. Phương pháp lấy mẫu [4], [5], [31], [41] Chúng tôi phân lập các chủng NS ở RNM Cần Giờ từ các mẫu đất, lá và cành. Các mẫu đất gồm: đất mặt ( ký hiệu ĐM ), đất từ 5- 10cm (ĐS), các mẫu lá gồm: lá vàng trên cây ( LV), lá mục dưới đất ( LM), các mẫu cành gồm: cành khô ( CK ) và cành mục (CM). Tiến hành thu mẫu vào 3 đợt, tháng 9, tháng 12 năm 2008 và tháng 3 năm 2009 tại 4 xã Long Hòa, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh. Cách lấy mẫu : Đối với mẫu cành và lá, dùng dao, kéo vô trùng cắt lấy khoảng 10 g mẫu cho vào túi nilông vô trùng buộc kín, đánh số, ghi địa danh, ngày tháng lấy mẫu và bảo quản. Đối vối mẫu đất thì dùng dao vô trùng lầy 10 g đất mặt hoặc gạt bỏ lớp đất mặt và lấy mẫu từ 5-10cm. Các mẫu sau khi lấy xong thì được bảo quản lạnh và phân lập ngay trong vòng 24 giờ [ 24], [31]. 2.2.1.2. Phân lập mẫu theo phương pháp pha loãng mẫu a. Nguyên tắc Tách rời bào tử NS, nuôi cấy trên MT thạch đĩa để cho mọc thành các KL riêng rẽ. từ các KL riêng rẽ cấy truyền sang MT thạch nghiêng từ một hoặc nhiều lần cho đến khi các chủng thuần khiết. b. Tiến hành Cân 10 g mẫu đất, thân, lá ( đã nghiền nhỏ ) cho vào bình tam giác, cho thêm vào bình 90 ml nước biển vô trùng và cho vào máy lắc 200 vòng / phút lắc 20 phút, thu lấy dịch lọc ta có độ pha loãng 10 -1 . Lắc đều rồi hút 1ml dịch 10-1 cho vào ống nghiệm đựng 9 ml nước biển vô trùng ta được dung dịch pha loảng 10-2 . Tiếp tục pha loãng như thế cho đến nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6 Dùng pipet hút 0,1 ml dịch lọc ở các nồng độ 10-3 , 10-4, 10-5 , 10-6 nhỏ lên hộp petri có chứa ( MT2 ) . Dùng que cấy trang dàn đều khắp bề mặt thạch, giữ nguyên que trang tiếp tục trang lên đĩa 2 và 3. Lật ngược hộp lại gói bằng giấy báo và nuôi ở nhiệt độ phòng từ 3-7 ngày. Tách các khuẩn lạc riêng rẽ, cấy chuyền cho đến khi đạt độ thuần khiết thì cấy chuyền sang ống thạch nghiêng để bảo quản và nghiên cứu các đặc điểm tiếp theo. [20] Yêu cầu các chủng phân lập phải đạt độ thuần khiết và có ký hiệu riêng biệt[6],[7],[22]. 2.2.1.3. Phương pháp giữ giống trên MT thạch có lớp dầu khoáng a. Nguyên tắc : Bảo quản để không làm thay đổi phẩm chất ban đầu của chủng giống bằng cách tạo MT yếm khí bằng dầu khoáng để ức chế sự sinh trưởng của NS. b. Tiến hành: Cho một lượng dầu khoáng vào ống eppendofy, khử trùng ở 121 oC 30 phút, để nguội. NS cần bảo quản đã được nuôi cấy trong ống nghiệm 3-5 ngày, dùng que cấy vô trùng lấy một ít bào tử NS cho vào ống eppendofy, đậy nắp và dùng keo parafin quấn quanh miệng ống và bảo quản ở điều kiện lạnh[4],[5],[6],[12]. 2.2.1.4. Phương pháp quan sát hình thái NS * Quan sát đại thể NS Quan sát đại thể NS bằng cách tạo KL khổng lồ, cách tiến hành như sau: - Cho vào ống nghiệm 5 ml nước cất vô trùng - Dùng que cấy lấy một ít bào tử từ các ống giống thạch nghiêng cho vào ống nghiệm đựng 5 ml nước cất vô trùng , lắc đều tạo dung dịch huyền phù - Dùng que cấy móc nhúng vào dịch huyền phu rồi nhanh chóng chấm một điểm vào giữa đĩa petri có chứa MT3 . - Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng 5-7 ngày để tạo khuẩn lạc khổng lồ, hàng ngày lấy ra quan sát và mô tả các điểm sau: + Tốc độ phát triển của KL (đo đường kính của khuẩn lạc). + Hình dạng, kích thước và mép KL. + Màu sắc và sự biến đổi màu sắc của KL (cả mặt trái và mặt phải). + Giọt tiết, sắc tố tiết vào môi trường [4],[5],[6].  Quan sát vi thể NS Phương pháp phòng ẩm Chuẩn bị các đĩa petri có chứa MT3 thật mỏng ( khoảng 1mm ) Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có đường kính 8 mm Đặt một miếng thạch mỏng có kích thước 8 mm lên một miếng lam vô trùng. Cấy NS vào xung quanh của miếng thạch, đậy lamen lên. Cho miếng lam vào giữa đĩa petri có sẵn một miếng giấy lọc hoặc bông đã được làm ẩm bằng nước cất vô trùng. Đậy nắp đĩa petri lại và ủ ở nhiệt độ phòng 2-3 ngày. Sau 2 - 3 ngày, lấy lam kính ra, khẽ gỡ lá kính, nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái NS bằng kính hiển vi ở vật kính 40 và 100 về các đặc điểm như – Khuẩn ty: hình dáng, màu sắc, vách ngăn, sự phân nhánh. – Đặc điểm cơ quan sinh bào tử: cuống sinh BT, Thể bình và BT Phương pháp lamen nghiêng Cấy các chủng NS váo các đĩa petri có chứa MT3 sau đó, lấy một tấm lamen vô trùng đặt nghiêng một góc 30 – 45oC so với bề mặt thạch, nuôi ở nhiệt độ phòng 2- 3 ngày. Sau 2-3 ngày lấy lá kính ra nhỏ vào một giọt lactophenol và quan sát hình thái nấm sợi bằng kính hiển vi ở vật kính 40 và 100 về các đặc điểm như trên. [ 5 ],[6] 2.2.2. Các phương pháp hoá sinh 2.2.2.1. Kiểm tra hoạt tính enzym ngoại bào của NS bằng phương pháp khuếch tán trên MT thạch a. Nguyên tắc: Thuốc thử phản ứng với cơ chất tạo màu sắc đặc trưng, còn phần cơ chất bị enzym ngoại bào của NS phân hủy sẽ có màu trong suốt quanh KL. b. Tiến hành * Phương pháp cấy chấm điểm Chuẩn bị các chủng NS nghiên cứu trên các MT thích hợp. Cấy nấm sợi RNM trên đĩa petri chứa MT khảo sát khả năng sinh các enzym ngoại bào amylase, cellulase, protease, pectinase, kitinase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng từ 4 - 6 ngày thu kết quả. * Phương pháp thỏi thạch Cấy các chủng NS trên đĩa petri chứa MT amylase, cellulase, protease, pectinase, kitinase. Ủ ở nhiệt độ phòng trong vòng từ 4 - 6 ngày cho mọc thành KL. Dùng khoan nút chai khoan các thỏi thạch có KL nấm sợi và chuyển các thỏi thạch đó sang đĩa petri có chứa các MT tương ứng ( 3 thỏi một đĩa ) . Đưa các đĩa chứa các thỏi thạch vào tử lạnh 2 - 4oC từ 6 – 8h cho enzim khuyếch tán, sau đó chuyển sang tủ ấm 37oC trong 24 tiếng và thu kết quả. c. Kiểm tra kết quả Xác định khả năng sinh enzym của các chủng NS bằng thuốc thử rồi đo kích thước vòng phân giải (D-d, mm). D: đường kính vòng phân giải, d: đường kính khuẩn lạc D-d ≥ 25 rất mạnh D-d ≥ 10 trung bình D-d ≥ 20 mạnh D-d < 10 yếu. Xác định hoạt tính proteaza bằng thuốc thử HgCl2. , đổ thuốc thử HgCl2. 10% lên bề mặt thạch, nếu nấm sợi sinh enzym proteaza sẽ có màu trong suốt quanh KL ( cấy chấm điểm ) hoặc thỏi thạch ( phương pháp thỏi thạch ), do các phân tử protein đã bị enzim phân hủy. Các protein chưa bị phân hủy sẽ có màu trắng đục. Xác định hoạt tính amylase, cellulase, kitinase, pectinase bằng thuốc thử lugol. NS sinh cellulaza tạo vòng trong suốt quanh KL, vùng cellulaza chưa bị phân hủy có màu nâu đỏ. NS sinh amylaza tạo vòng trong suốt quanh KL, vùng amylaza chưa bị phân hủy có màu tím đậm. NS sinh chitinaza tạo vòng trong suốt quanh KL, vùng chitinaza chưa bị phân hủy có màu đỏ gạch [4], [5],[6],[ 13]. 2.2.2.2. Khả năng sinh chất có hoạt tính đối kháng với vi sinh vật kiểm định * Phương pháp thỏi thạch a. Nguyên tắc Nếu VSV trên khối thạch có chất kháng sinh thì chúng sẽ ức chế, và tiêu diệt các VSV kiểm định tạo thành vòng vô khuẩn xung quanh khối thạch. b. Tiến hành Cấy NS trên môi trường MEA, ủ ở nhiệt độ phòng từ 3-4 ngày. Dùng khoan nút chai vô trùng khoan các khối thạch có đường kính 8mm. Chuẩn bị MT trường nuôi cấy VSV kiểm định ( môi trường MEA ), lấy một vòng que cấy VSV kiểm định (vi khuẩn E.coli, vi khuẩn Baciluss), hòa vào 2ml nước cất vô trùng, lắc đều tạo dung dịch huyền phù. Đổ dịch huyền phù chừa VSV kiểm định vào các bình tam giác chứa môi trường PDA lỏng ở nhiệt độ khoảng 45o C, lắc đều và đổ một lớp mỏng vào đĩa petri. Dùng kim mũi mác lấy các khối thạch chứa chủng NS nghiên cứu đặt lên các đĩa thạch có VSV kiểm định. Sau đó đặt mẫu trong tủ lạnh 2 - 4oC từ 6h - 8h, sau đó ủ ở nhiệt độ phòng 24h. c. Thu kết quả Xác định hoạt tính kháng sinh bằng cách đo kích thước vòng vô khuẩn D-d. D là đường kính vòng vô khuẩn, d là đường kính khối thạch. Đơn vị tính là mm. D-d ≥ 25 rất mạnh D-d < 10 yếu D-d ≥ 20 mạnh D-d = 0 không kháng. D-d ≥ 10 trung bình 2.2.2.3. Khảo sát ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng, khả năng sinh emzim ngoại bào và khả năng đối kháng với VSV 4 chủng NS a. Nguyên tắc Mỗi loại NS thích nghi với mỗi nồng độ muối khác nhau, ứng với mỗi nồng độ hoạt tính sinh học có thể khác nhau. b. Tiến hành Chuẩn bị môi trường YEA, có bổ sung các nồng độ muối NaCl ở các nồng độ 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7% và 10%. Cấy chấm điểm các chủng NS nghiên cứu lên MT ở mỗi nồng độ muối trên. Nuôi ở tủ ấm 3 - 5 ngày ở nhiệt độ 28 - 30oC, mẫu đối chứng trên môi trường không có NaCl. - Xác định ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh trưởng bằng cách đo đường kính khuẩn lạc - Kiểm tra khả năng sinh enzim ngoại bào và hoạt tính đối kháng bằng cách đo đường kính vòng thủy phân hoặc vòng vô khuẩn tương ứng với từng nồng độ muối[6]. 2.2.3. Phương pháp toán học Xử lí số liệu bằng toán thống kê . Phương pháp tính giá trị trung bình x1 + x2 +…+ xn X = n Với n là số lần lặp lại thí nghiệm Phương pháp tính khoảng ước lượng giá trị trung bình S µ = X ± n Trong đó n số lần lặp lại thí nghiệm S là sai tiêu chuẩn mẫu S = S2 1 n S2 gọi là phương sai mẫu S2 = ∑ ( xi – x )2 [21]. n -1 i=1 CHƯƠNG III : KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Quá trình lấy mẫu được tiến hành ở 4 xã: Long Hòa, Lý Nhơn, An Thới Đông và Tam Thôn Hiệp huyện Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh, các vị trí lấy mẫu được thể hiện trên bản đồ hình Hình 3.1 Bản đồ xác định vị trí lấy mẫu đợt 1 Chúng tôi dùng máy GPS định vị vệ tinh toàn cầu để xác định tọa độ của 4 xã như sau: * Xã Long Hòa: 10o29’37.11’’N 106o52’07.45’’E * Xã Lý Nhơn: 10o33’34.45’’N 106o49’18.13’’E * Xã Tam Thôn Hiệp: 10o35’17.14’’N 106o49’26.54’’E * Xã An Thới Đông: 10o34’34.65’’N 106o49’20.53’’E 3.1 Kết quả phân lập Qua 3 đợt phân lập từ các mẫu đất, thân, lá của RNM Cần Giờ, chúng tôi thu được 420 chủng NS . Trong đó, đợt 1 phân lập được 80 chủng (19,04% ), đợt 2 phân lập được 200 chủng ( 47,6%), đợt 3 phân lập được 140 chủng ( 33,33% ). Sau đó chúng tôi tiếp tục phân loại để tuyển chọn các chủng NS thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium. Dựa vào đặc điểm khóa phân loại đến chi của các tác giả Robert A. Samson, Allen S.Heekstra, Jens C.Frisvad ( 2004) và Bùi Xuân Đồng (2000), Chúng tôi xếp các chủng NS có các đặc điểm như trong bảng vào hai chi Trichoderma và Fusarium Bảng 3.1 : Các đặc điểm phân loại chi Trichoderma và Fusarium Trichoderma Fusarium Khuẩn lạc nấm có màu lục hoặc từ lục trắng đến lục, vàng xanh, lục xỉn đến lục đậm. Trichoderma có tốc độ phát triển nhanh trên môi trường giàu chất dinh dưỡng thạch, đường, khoai tây, Aga ( PGA), chúng có thể đạt 2-9cm sau 4 ngày nuôi cấy ở 25o C. Chất tạo màu vàng thường chìm trong khối agar, đặc biệt trong PGA. Mùi dừa hay là mùi ngọt đặc trưng được tạo ra ở một số loài. Hệ sợi của nấm không màu, có vách ngăn Cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuống nhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần. Bào tử có hình cầu, hình elip, hình thuôn, không có vách ngăn và thường có màu xanh Khuẩn lạc thường xốp như bông có màu hồng, tím da cam, hồng tím, hồng nâu, đỏ carmin, vài vùng có dạng bột. Trên môi trường thạch đường, khoai tây, aga (PGA), nhiệt độ nuôi cấy 27oC 7 ngày tuổi khuẩn lạc có đường kính 4 - 5cm. Thường không có chất tạo màu. Hệ sợi nấm phân nhánh, có vách ngăn, sợi nấm thường không màu, chuyển màu nâu khi già. Cuống sinh bào tử lớn và ngắn, đơn hoặc có 2 đến 3 nhánh ở phần đỉnh. Bào tử có dạng hình liềm hoặc hình thoi, có vách ngăn ngang. Tùy loài mà số lượng vách ngăn ngang có thể dao động từ 0- 1 đến 5-7 vách ngăn. Hình 3.2 Hình ảnh KL một số chủng NS thuộc chi Trichoderma Hình 3.3 Hình ảnh KL một số chủng NS thuộc chi Fusarium Từ kết quả đó chúng tôi tuyển chọn được 183 chủng NS thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium. Trong đó, Trichoderma 103 chủng ( 56,28% ) và Fusarium 80 chủng (lệ 43,72% ). Kết quả phân lập từng đợt thu được như sau; 3.1.1 Kết quả phân lập đợt 1 Đợt 1 chúng tôi phân lập được 37 chủng NS thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium. Trong đó, 17 chủng Trichoderma ( 45,9%) và 20 chủng Fusarium ( 54,1%) . Đặc điểm của các chủng Trichoderma phân lập đợt 1 được chia làm 4 nhóm như sau: Nhóm 1 gồm 6 chủng, có ký hiệu LV3T, LV6T, LM2T, LM3T, LM4T, ĐM3T với các đặc điểm được mô tả: KL màu xanh lục, mặt trái KL không màu, mép KL mịn có màu trắng. Hệ sợi màu trắng có vách ngăn, cuống sinh BT phân nhánh nhiều chằng chịt, tận cùng BT mọc ra thành một khối tròn, ._.g có khả năng đối kháng với vi khuẩn B. subtillis (81,1 %), 7/37 chủng không có khả năng đối kháng với VK B. subtillis (18,9%). Trong đó 3/37 chủng đối kháng mạnh ( 8,1%), 16/37 chủng đối kháng trung bình ( 43,2 %) , 10/37 chủng đối kháng yếu ( 27%). Khả năng đối kháng với E.coli 9/37 chủng ( 24,3%), 28/37 chủng không đối kháng với E.coli ( 75,6%). Trong đó khả năng đối kháng chỉ ở mức trung bình và yếu. Khả năng đối kháng cả hai loại VSV nói trên có 8/37 chủng ( 21,6 %). Khả năng đối kháng với B.subtilis 30/37 cao hơn đối kháng với E.coli 9/37, vì E.coli là VK Gram âm, thành tế bào có cấu trúc dày hơn VK Gram dương vì thế KS khó xâm nhập vào để ức chế sự hoạt động của chúng. Như vậy, trong các chủng có khả năng đối kháng với VK B. subtillis có 3 chủng mạnh trong đó 2 chủng thuộc chi Trichoderma và 1 chủng thuộc chi Fusarium. Có thể tóm tắt bảng 3.14 như sau ( tổng 37 chủng ) Bảng 3.14 Tóm tắt khả năng đối kháng với VSV đợt 1 Vi sinh vật kiểm định Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) B. subtillis 10 27 17 43,2 3 8,1 E.coli 4 10,8 5 13,5 0 0 Khả năng đối kháng với VSV kiểm định của Trichoderma và Fusarium được thể hiện qua biểu đồ sau: 0 5 10 15 20 S ố l ư ợ n g c h ủ n g Trichoderma Fusarium B.subtilis E.coli Biểu đồ 3.16 khả năng đối kháng với VSV kiểm định của Trichoderma và Fusarium đợt 1 Qua biểu đồ chúng tôi thấy khả năng đối kháng với VSV kiểm định của Trichoderma cao hơn Fusarium. Hình 3.37 Khả năng đối kháng với VSV của chủng LM6T, M3T, CM4F,CM7F, ELM13F và E CM2T. 3.2.2.2. Kết quả về khả năng đối kháng với VSV đợt 2 Khả năng đối kháng với VSV của các chủng NS đợt 2 chúng tôi thu được như bảng 3.16 Bảng 3.15 . Khả năng đối kháng với VSV đợt 2 stt Ký hiệu Hoạt tính đối kháng với VSV (D-d )mm stt Ký hiệu Hoạt tính đối kháng với VSV (D-d )mm chủng B.subilis E.coli chủng B.subilis E.coli 1 LV1T 4 3 46 CM4T 16 5 2 LV2T 16 10 47 CM5T 12 7 3 LV3T 5 0 48 CM6T 0 9 4 LV4T 17 14 49 CM7T 0 12 5 LV5F 6 0 50 CM8T 24 11 6 LV6T 10 0 51 CM9T 3 0 7 LV7F 10 0 52 CM10T 2 0 8 LV8F 5 0 53 CM11T 6 0 9 LV9F 15 0 54 CM12T 11 0 10 LV10F 13 0 55 CM13T 10 0 11 LV11F 4 0 56 CM14T 3 0 12 LM1T 4 0 57 CM15T 0 15 Bảng 3.16 tiếp theo stt Ký hiệu Hoạt tính đối kháng với VSV (D-d )mm stt Ký hiệu Hoạt tính đối kháng với VSV (D-d )mm chủng B.subilis E.coli chủng B.subilis E.coli 13 LM2T 4 0 58 CM16F 0 0 14 LM3T 0 8 59 CM17F 4 0 15 LM4T 0 0 60 CM18F 12 0 16 LM5T 4 0 61 CM19F 14 7 17 LM6T 6 6 62 CM20F 0 0 18 LM7T 2 16 63 CM21F 28 16 19 LM8T 24 20 64 CM22F 16 0 20 LM9F 3 18 65 CM23F 13 0 21 LM10T 6 4 66 CM24F 13 0 22 LM11T 18 0 67 CM25F 0 0 23 LM12T 12 0 68 CM26F 0 0 24 LM13F 0 0 69 ĐM1T 8 0 25 LM14F 0 0 70 ĐM2T 9 6 26 LM15F 0 5 71 ĐM3T 0 0 27 LM16F 0 0 72 ĐM4T 0 16 28 LM17F 6 4 73 ĐM5T 7 2 29 LM18F 3 12 74 ĐM6T 20 15 30 LM19F 10 8 75 ĐM7T 7 3 31 LM20F 6 0 76 ĐM8T 3 0 32 LM21F 16 0 77 ĐM9T 4 0 33 CK1T 8 0 78 ĐM10F 4 0 34 CK2T 14 0 79 ĐM11F 12 6 35 CK3T 10 0 80 ĐM12F 24 20 36 CK4T 4 0 81 ĐM13F 20 12 37 CK5T 4 0 82 ĐM14F 9 0 38 CK6T 22 20 83 ĐM15F 12 0 39 CK7F 3 4 84 ĐS1T 0 7 40 CK8F 6 0 85 ĐS2T 0 10 41 CK9F 3 5 86 ĐS3T 16 0 42 CK10F 2 0 87 ĐS4T 5 0 43 CM1T 20 3 88 ĐS5F 6 6 44 CM2T 5 11 89 ĐS6F 14 3 45 CM3T 8 0 Từ bảng 3.16 chúng tôi thu được kết quả như sau: trong 89 chủng NS phân lập đợt 2 có 72/89 chủng có khả năng đối kháng với vi khuẩn B. subtillis ( 80,8 %), 17/89 chủng không có khả năng đối kháng với VK B. subtillis (19,2%). Trong đó, 5/89 chủng đối kháng rất mạnh (5,6%), 3/89 chủng đối kháng mạnh (3,3%), 25/89 chủng đối kháng trung bình ( 28,1%), 39/89 chủng đối kháng yếu ( 43,8%). Khả năng đối kháng với E.coli: 38/89 chủng (42,7%), 51/89 chủng không đối kháng với E.coli (57,3%). Trong đó, đối kháng mạnh 3/89 chủng(3,3%), khả năng đối kháng trung bình 14/89 chủng (15,7%), đối kháng yếu 21/89 ( 23,6%) . Khả năng đối kháng cả hai loại VSV nói trên có 24/89 chủng( 26,9%), trong đó có 3/89 chủng vừa đối kháng mạnh với B. subtillis vừa đối kháng mạnh với E.coli (3,3%). So với kết quả đợt 1 thì khả năng đối kháng với VSV của các chủng NS không có gì thay đổi. Như vậy, trong các chủng có khả năng đối kháng với VK B. subtillis có 5 chủng rất mạnh trong đó 3 chủng thuộc chi Trichoderma và 2 chủng thuộc chi Fusarium, 3 chủng mạnh, 2 chủng thuộc chi Trichoderma, 1 chủng thuộc chi Fusarium. Có thể tóm tắt bảng 3.16 như sau ( tổng 89 chủng ) Bảng 3.16 Tóm tắt khả năng đối kháng với VSV đợt 2 Vi sinh vật kiểm định Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh Hoạt tính rất mạnh SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) B. subtillis 39 43,8 25 28,1 3 3,3 5 5,6 E.coli 21 23,6 14 17,7 3 3,3 0 0 Khả năng đối kháng với VSV của Trichoderma và Fusarium được thể hiện qua biểu đồ 0 10 20 30 40 50 Số lượng chủng Trichoderma Fusarium B.subtilis E.coli Biểu đồ 3.17 khả năng đối kháng với VSV kiểm định của Trichoderma và Fusarium đợt 2 Qua biểu đồ chúng tôi nhận thấy khả năng đối kháng với VSV của Trichoderma cao hơn Fusarium. Hình 3.38 khả năng đối kháng với B.subtilis của chủng LM8T, CK6T và ĐM12F Hình 3.39 khả năng đối kháng với E.coli của chủng LM8T, CK6T và ĐM12F 3.2.2.3 Kết quả về khả năng đối kháng với VSV đợt 3 Khả năng đối kháng với VSV của các chủng NS đợt chúng tôi thu được như bảng 3.17 Bảng 3.17 . Khả năng đối kháng với VSV đợt 3 Stt Ký hiệu Hoạt tính đối kháng với VSV (D-d )mm Stt Ký hiệu Hoạt tính đối kháng với VSV (D-d )mm chủng B..subtillis E.coli chủng B..subtillis E.coli 1 LV1T 10 0 30 CK6F 0 0 2 LV2T 18 0 31 CM1T 9 0 3 LV3T 0 0 32 CM2T 20 18 4 LV4T 5 6 33 CM3T 3 0 5 LV5T 10 0 34 CM4T 3 0 6 LV6F 0 5 35 CM5T 10 0 7 LM1T 0 5 36 CM6T 0 8 8 LM2T 13 0 37 CM7T 0 6 9 LM3T 0 0 38 CM8T 0 0 10 LM4T 18 6 39 CM9T 10 0 11 LM5T 16 7 40 CM10F 4 0 12 LM6T 0 0 41 CM11F 16 18 13 LM7T 6 0 42 CM12F 0 0 14 LM8T 23 12 43 CM13F 0 0 15 LM9T 18 0 44 CM14F 20 14 16 LM10T 0 0 45 CM15F 0 0 17 LM11T 0 7 46 CM16F 12 0 18 LM12T 0 0 47 ĐM1T 12 0 19 LM13F 20 20 48 ĐM2T 24 20 20 LM14F 8 3 49 ĐM3T 18 0 21 LM15F 0 1 50 ĐM4F 12 0 22 LM16F 0 6 51 ĐM5F 0 0 23 LM17F 0 10 52 ĐM6F 0 5 24 LM18F 3 5 53 ĐS1T 10 0 25 CK1T 7 0 54 ĐS2T 0 7 26 CK2T 3 0 55 ĐS3F 0 0 27 CK3T 9 3 56 ĐS5F 6 8 28 CK4T 0 7 57 ĐS4F 7 15 29 CK5F 0 0 Từ bảng 3.17 chúng tôi thu được kết quả như sau: trong 57 chủng NS phân lập đợt 1 có 33/57 chủng có khả năng đối kháng với vi khuẩn B. subtillis (57,8%), 24/57 chủng không có khả năng đối kháng với VK B. subtillis (42,2%). Trong đó, 2/57 chủng đối kháng rất mạnh ( 3,5%), 3/57 chủng đối kháng mạnh (5,2%), 14/57 chủng đối kháng trung bình ( 24,5%), 13/57 chủng đối kháng yếu ( 22,8%). Khả năng đối kháng với E.coli 25/57 chủng (43,8%), 32/57 chủng không đối kháng với E.coli ( 56,2%). Trong đó, 2/57 chủng đối kháng mạnh (3,5 %), 6/57 chủng đối kháng trung bình (10,2%), 17/57 đối kháng yếu (29,8%). Khả năng đối kháng cả hai loại VSV nói trên có 13/57 ( 22,8%), trong đó có 2/57 chủng đối kháng mạnh với cả hai loại VK nói trên. Như vậy, trong các chủng có khả năng đối kháng với VK B. subtillis có 2 chủng rất mạnh thuộc chi Trichoderma, 3 chủng mạnh 1 chủng thuộc chi Trichoderma 2 chủng thuộc chi Fusarium. Khả năng đối kháng với E.coli có 2 chủng mạnh trong đó 1 chủng thuộc chi Trichoderma và 1 chủng thuộc chi Fusarium. Có thể tóm tắt bảng 3.18 như sau ( tổng 57 chủng ) Bảng 3.18 Tóm tắt khả năng đối kháng với VSV đợt 3 Vi sinh vật kiểm định Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh Hoạt tính rất mạnh SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) B. subtillis 13 22,8 15 24,5 3 5,2 2 3,5 E.coli 17 29,8 6 10,2 2 3,5 0 0 0 5 10 15 20 S ố l ư ợn g ch ủn g Trichoderma Fusarium B.subtilis E.coli Biểu đồ 3.18 khả năng đối kháng với VSV kiểm định của Trichoderma và Fusarium đợt 3 Tổng kết cả 3 đợt khảo sát về khả năng đối kháng với VSV Tổng hợp chung cả ba đợt khảo sát chúng tôi nhận thấy khả năng sinh đối kháng với VSV của các chủng NS thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium cả 3 đợt như sau : 73,8%, số chủng có khả năng đối kháng với B. subtillis, trong đó đối kháng mạnh và rất mạnh chiếm 8,6%. 39,3% số chủng có khả năng đối kháng với E.coli , số chủng đối kháng mạnh 2,7%. Khả năng đối kháng cả hai loại VSV nói trên là 2,7%, khả năng này chủ yếu ở chi Trichoderma. Bảng 3.19 Tóm tắt khả năng đối kháng với VSV cả 3 đợt Vi sinh vật kiểm định Hoạt tính yếu Hoạt tính trung bình Hoạt tính mạnh Hoạt tính rất mạnh SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) SL TL(%) B. subtillis 62 33,9 57 31,1 9 4,9 7 3,8 E.coli 42 23,0 25 13,7 5 2,7 0 0 Qua 3 đợt, chúng tôi nhận thấy khả năng đối kháng với B.subtillis vào mùa mưa và đầu mùa khô cao (trên 80%), nhưng vào mùa khô tỉ lệ giảm xuống 57,8%. Khả năng đối kháng với E.coli cao nhất vào mùa khô (trên 40%) và thấp nhất vào mùa mưa (24%) . Như vậy khả năng đối kháng của các chủng NS thay đổi theo mùa. Ngoài ra khả năng đối kháng của các chủng NS còn tùy thuộc vào cơ chất. Theo kết quả chúng tôi khảo sát thì các chủng đối kháng mạnh mà chúng tôi thu được phân lập từ cành mục, lá mục và đất mặt. So sánh kết quả của chúng tôi với kết quả khảo sát ban đầu của Phan Thanh Phương ( năm 2007), Võ Thị Bích Viên (năm 2009) cho thấy khả năng đối kháng của NS với VK B. subtilis cao hơn khả năng đối kháng với VK E.coli, các chủng mạnh phân lập từ cơ chất cành mục, lá mục, và đất mặt. Như vậy kết quả của chúng tôi phù hợp với 2 tác giả trên. 0 10 20 30 40 50 60 70 80 S ố l ư ợn g ch ủn g Trichoderma Fusarium B.subtilis E.coli Biểu đồ 3.19 Khả năng đối kháng với VSV kiểm định của Trichoderma và Fusarium cả 3 đợt. 3.3 Ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng, khả năng sinh các enzim ngoại bào và khả năng đối kháng với VSV . Khả năng chịu mặn là một đặc tính quan trọng của các VSV trong RNM, trong đó có NS. Để hiểu rõ hơn nét đặc trưng của các chủng NS có nguồn gốc từ RNM, chúng tôi chọn mỗi chi 2 chủng tiêu biểu để khảo sát ảnh hưởng của độ mặn lên sự sinh trưởng, khả năng sinh các enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với VSV. Để thuận tiện cho trình bày chúng tôi đặt tên cho các chủng theo tên chi đã khảo sát như sau: LM13F – Fusarium.13, ĐM12F- Fusarium.12, LM8T- Trichoderma.8 và CK6T- Trichoderma.6 3.3.1 Đặc điểm vi thể và đại thể 4 chủng NS Chủng Fusarium.13 Mặt phải KL Mặt trái KL Bào tử Hình 3.40 Đặc điểm hình thái đại thể và vi thể chủng Fusarium.13 Chủng Fuariums.12 . Mặt phải KL Mặt trái KL Bào tử Hình 3.41 Đặc điểm hình thái đại thể và vi thể chủng Fuariums.12 Chủng Trichoderma.8 Mặt phải KL Mặt trái KL Cơ quan mang BT Hình 3.42 Đặc điểm hình thái đại thể và vi thể chủng Trichoderma.8 Chủng Trichoderma.6 Mặt phải KL Mặt trái KL Cơ quan mang BT Hình 3.43 Đặc điểm hình thái đại thể và vi thể chủng Trichoderma.6 Từ các đặc điểm miêu tả của hai chủng và dựa vào khóa phân loại Bùi Xuân Đồng (2000), Nguyễn Lân Dũng (2004) chúng tôi xếp hai chủng Tri.8 và Tri.6 vào chi Trichoderma. . 3.3.2 Ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh trưởng của 4 chủng NS Chúng tôi tiến hành tạo khuẩn lạc khổng lồ trên môi trường PDA ở các nồng độ muối 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7% và 10% sau đó tiến hành đo đường kính khuẩn lạc sau 72 giờ nuôi cấy ở nhiệt đô phòng thí nghiệm, kết quả thu được như sau: Bảng 3.20 Ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh trưởng của 4 chủng Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự sinh trưởng Nồng độ NaCl (%) Ký hiệu chủng 1 2 3 4 4 6 7 10 Fusarium.13 30 32 40 35 28 22 7 0 Fusarium.12 27 30 32 20 10 3 0 0 Trichoderma.8 42 59 65 57 30 24 5 0 Trichoderma.6 40 53 60 55 36 20 3 0 0 10 20 30 40 50 60 70 Đ ư ờn g kí nh K L m m 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ NaCl (%) Fusarium.13 Fusarium.12 Trichoderma.8 Trichoderma.6 Biểu đồ 3.20 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh trưởng của 4 chủng NS 3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh enzym ngoại bào của 4 chủng NS 3.3.3.1 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh enzym amylase của 4 chủng NS Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm các chủng NS Fusarium.13, Fusarium.12, Trichoderma.8 và Trichoderma.6 ở các nồng độ muối 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7% và 10% và nuôi cấy ở tủ ấm 37oC từ 3-5 ngày. Sử dụng thuốc thử Lugol để thử hoạt tính và thu kết quả. Kết quả thu được như bảng sau: Bảng 3.21 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh amylase của 4 chủng Khả năng sinh amylase Nồng độ muối (%) 1 2 3 4 5 6 7 10 Ký hiệu chủng Fusarium.13 2 5 11 6 3 2 0 0 Fusarium.12 7 11 15 9 6 3 1 0 Trichoderma.8 11 18 20 15 11 4 1 0 Trichoderma.6 0 1 3 2 0 0 0 0 Qua bảng kết quả chúng tôi thấy chủng Fusarium.13có khả năng sinh amylase trong khoảng nồng độ muối từ 1% - 6%, các chủng Fusarium.12 và Trichoderma.8 có khả năng sinh amylaza trong khoảng nồng độ muối từ 1% - 7%, chủng Tri.6 có khả năng sinh amylase trong khoảng nồng độ muối từ 2% - 4%. Nồng độ muối thích hợp nhất cho khả năng sinh amylase là 3 %. Như vậy các chủng NS Fusarium.13, Fusarium.12, Trichoderma.8 và Trichoderma.6 là những chủng NS chịu mặn được du nhập từ đất liền vào và thích nghi dần với điều kiện sống ở RNM. 0 5 10 15 20 Đ ư ờ ng k ín h vò n g th ủy p h ân m m 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ NaCl ( %) Fusarium.13 Fusarium.12 Trichoderma.8 Trichoderma.6 Biểu đồ 3.21 Ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh amylase của 4 chủng NS 3.3.3.2 Ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng sinh protease của 4 chủng NS Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm các chủng NS Fusarium.13, Fusarium.12, Trichoderma.8 và Trichoderma.6 ở các nồng độ muối 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7% và 10% và nuôi cấy ở tủ ấm 37oC từ 3-5 ngày. Sử dụng thuốc thử HgCl2 để thử hoạt tính và thu kết. Kết quả thu được ở bảng 3.22 Bảng 3.22 Kết quả về ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh protease của 4 chủng NS Khả năng sinh protease Nồng độ muối(%) Ký hiệu chủng 1 2 3 4 5 6 7 10 Fusarium.13 2 4 9 3 1 0 0 0 Fusarium.12 17 23 26 20 15 5 3 0 Trichoderma.8 0 2 3 1 1 0 0 0 Trichoderma.6 4 8 5 3 3 1 0 0 Qua bảng kết quả chúng tôi thấy chủng Fusarium.13 có khả năng sinh protease trong khoảng nồng độ muối từ 1% - 5%, chủng Trichoderma.8 từ 2%- 5 % Fusarium.12 từ 1%-7% chủng Trichoderma.6 từ 1% - 6%. Nồng độ muối thích hợp nhất cho khả năng sinh protease của cả 4 chủng là 3 %. 0 5 10 15 20 25 30 Đ ư ờn g kí nh v òn g th ủy p hâ n m m 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ NaCl (%) Fusarium.13 Fusarium.12 Trichoderma.8 Trichoderma.6 Biểu đồ 3.22 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh protease của 4 chủng 3.3.3.3 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh cellulase của 4 chủng Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm các chủng nấm sợi Fusarium.13, Fusarium.12, Trichoderma.8 và Trichoderma.6 ở các nồng độ muối 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7% và 10% và nuôi cấy ở tủ ấm 37oC từ 3-5 ngày, Sử dụng thuốc thử Lugol để thử hoạt tính và thu kết quả. Kết quả thu được ở bảng 3.23 Bảng 3.23 Kết quả về ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh cellulase của 4 chủng NS Hoạt tính cellulase ( D-d mm) Nôđộ muối(%) Ký hiệu chủng 1 2 3 4 5 6 7 10 Fusarium.13 7 13 16 12 5 3 0 0 Fusarium.12 5 12 16 11 4 1 0 0 Trichoderma.8 8 12 13 7 3 0 0 0 Trichoderma.6 2 6 8 5 2 1 0 0 Ảnh hưởng của nồng độ muối lên khả năng sinh cellulase của 4 chủng Chủng Fusarium.13, Fusarium.13 và Trichoderma.6 có khả năng sinh muối từ 1% - 6 %, chủng Trichoderma.6 từ 1%-5 %. Nồng độ muối thích hợp nhất cho khả năng sinh enzim cellulase của cả 4 chủng là 3 %. 0 2 4 6 8 10 12 14 16 Đ ướ ng k ín h vò ng th ủy p hâ n m m 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ NaCl ( % ) Fusarium.13 Fusarium.12 Trichoderma.8 Trichoderma.6 Biểu đồ 3.23 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh enzym cellulase của 4 chủng NS 3.3.3.4 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh chitinase của 4 chủng NS Chúng tôi tiến hành cấy chấm điểm các chủng NS Fusarium.13, Fusarium.12, Trichoderma.8 và Trichoderma.6 ở các nồng độ muối 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6% 7% và 10% và nuôi cấy ở tủ ấm 37oC từ 3-5 ngày Sử dụng thuốc thử Lugol để thử hoạt tính và thu kết quả. Kết quả thu được ở bảng 3.21 Bảng 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh chitinase của 4 chủng NS Hoạt tính chitinase ( D –d mm) Nồng độ NaCl(%) Ký hiệu chủng 1 2 3 4 5 6 7 10 Fusarium.13 2 6 10 8 3 1 0 0 Fusarium.12 15 20 22 18 10 6 1 0 Trichoderma.8 10 15 18 13 10 5 1 0 Trichoderma.6 2 5 8 6 3 0 0 0 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh chitinase của 4 chủng NS như sau : Chủng Fusarium.13 từ 1-6%, chủng Fusarium.12 và Chủng Trichoderma.8 có khả năng sinh chitinase từ nồng độ NaCl 1%-7%, chủng Trichoderma.6 từ 1-5%. Nồng độ muối thích hợp nhất cho khả năng sinh chitinase của cả 4 chủng là 3 %. 0 5 10 15 20 25 Đ ườ ng k ín h vò ng th ủy ph ân m m 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ NaCl ( % ) Fusarium.13 Fusarium.12 Trichoderma.8 Trichoderma.6 Biểu đồ 3.24 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh chitinase của 4 chủng NS Từ các kết quả trên chúng tôi nhân thấy khả năng sinh enzim ngoại bào của các chủng Fusarium.13, Fusarium.12, Trichoderma.8 và Trichoderma.6 nằm trong khoảng nồng độ muối 1%-7%, trong đó nồng độ muối thích hợp nhất là 3%. So sánh kết quả của chúng tôi với kết quả nghiên cứu của Khưu Phương Yến Anh năm 2007 về khả năng sinh enzim cellulase, kết quả của Nguyễn Thị Lan Hương năm 2009 về khả năng sinh enzim amylase và kết quả của Võ Thị Bích Viên năm 2009 thì kết quả của chúng tôi thu được là phù hợp. Như vậy các chủng Fusarium.13, Fusarium.12, Trichoderma.8 và Trichoderma.6 là những chủng NS du nhập từ đất liền vào RNM và thích nghi dần với điều kiện sống ở đây. Những chủng NS trên là những chủng chịu mặn chứ không ưa mặn. 3.3.4 Ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng đối kháng với B.subtillis và E.coli của 4 chủng NS Chúng tôi thử khả năng đối kháng với VSV bằng phương pháp thỏi thạch kết quả thu được như bảng 3.26 và 3.27 Bảng 3.25 Ảnh hưởng của độ mặn lên khả năng đối kháng với B.subtillis của 4 chủng NS Khả năng đối kháng với B.subtillis Nồng độ NaCl(%) Ký hiệu chủng 1 2 3 4 5 6 7 10 Fusarium.13 13 19 24 16 9 0 0 0 Fusarium.12 15 22 25 16 11 3 0 0 Trichoderma.8 11 22 25 17 7 0 0 0 Trichoderma.6 11 18 22 14 5 2 0 0 0 5 10 15 20 25 Đ ườ ng k ín h vò ng v ô kh uẩ n m m 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ NaCl (%) Fusarium.13 Fusarium.12 Trichoderma.8 Trichoderma.6 Biểu đồ 3.25 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng đối kháng với B.subtillis của 4 chủng Bảng 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng sinh đối kháng với E.coli của 4 chủng NS Khả năng đối kháng với E. coli Nồng độ NaCl % Ký hiệu chủng 1 2 3 4 5 6 7 10 Fusarium.13 11 18 22 13 5 0 0 0 Fusarium.12 9 19 20 15 3 0 0 0 Trichoderma.8 9 18 22 11 4 0 0 0 Trichoderma.6 7 16 21 11 3 0 0 0 0 5 10 15 20 25 Đ ư ờn g kí nh v òn g vô k hu ẩn 1 2 3 4 5 6 7 8 Nồng độ NaCl (%) Fusarium.13 Fusarium.12 Trichoderma.8 Trichoderma.6 Biểu đồ 3.26 Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên khả năng đối kháng với E.coli của 4 chủng NS Như vậy nồng độ muối thích hợp nhất cho khả năng đối kháng với VSV của các chủng NS là 3%. So sánh kết quả này với kết quả của Phan Thanh Phương năm 2007 thì kết quả này là phù hợp. PHẦN III : KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 3.1 Kết luận * Kết quả phân lập: Đã phân lập được 420 chủng NS sau 3 lần khảo sát tại 4 xã ở RNM Cần giờ. Trong đó, đợt 1 thu được 80 chủng (19,04%), đợt 2 thu được 200 chủng (47,60%) , đợt 3 thu được 140 chủng (33,33%). Đã xác định được 183 chủng thuộc hai chi Trichoderma và Fusarium, trong đó Trichoderma 103 chủng ( 56,28%) và Fusarium la 80 chủng ( 43,72%) dựa trên khóa phân loại của Robert A. Samson, Allen S.Heekstra, Jens C.Frisvad ( 2004) và Bùi Xuân Đồng (2000). * Nhận định về sự phân bố Số lượng chủng của hai chi Trichoderma và Fusarium bị ảnh hưởng bởi mùa, vị trí lấy mẫu và cơ chất lấy mẫu . + Theo mùa : số lượng chủng lớn nhất vào đầu mùa khô (89 chủng), đến giữa mùa khô (57 chủng) và thấp nhất là giữa mùa mưa(37 chủng) + Theo xã: số lượng chủng cao nhất ở xã Lý Nhơn, đến An Thới Đông, đến Long Hòa và thấp nhất là xã Tam Thôn Hiệp. + Theo cơ chất lấy mẫu : Số lượng chủng NS cao nhất ở cơ chất lá mục, đến cành mục, đến đất mặt, lá vàng và cành khô, thấp nhất ở cơ chất đất 5-10cm * Kết quả khảo sát khả năng sinh enzym ngoại bào Khả năng sinh enzym ngoại có liên quan chặt chẽ với nguồn gốc phân lập. + Khả năng sinh amylase mạnh là các chủng có nguồn gốc từ lá. + Khả năng sinh protease mạnh là các chủng từ đất mặt và cành khô. + Khả năng sinh cellulase mạnh là các chủng từ lá mục và cành mục. + Khả năng sinh chitinase mạnh là các chủng từ đất. Đã xác định được khả năng sinh cellulase mạnh nhất thuộc về các chủng của Trichoderma, sinh protease mạnh nhất thuộc về các chủng Fusarium là hoàn toàn phù hợp với đặc điểm sinh học đặc trưng của 2 chi này. Hầu hết các chủng thuộc Trichoderma có hoạt tính enzym ngoại bào cao hơn các chủng Fusarium ( trừ Protease). * Kết quả khảo sát khả năng đối kháng Đã xác định được khả năng đối kháng của các chủng NS với VSV như sau: - Số chủng kháng với B .subtilis (135 chủng ) nhiều hơn kháng với E. coli (72 chủng) - Đã xác định được 16 chủng đối kháng mạnh với B.subtillis và 5 chủng đối kháng mạnh với E.coli. - Các chủng thuộc Trichoderma đối kháng với cả 2 loại VSV kiểm định cao hơn các chủng thuộc chi Fusarium. - Đã tuyển chọn được 4 chủng ( mỗi chi 2 chủng ) có hoạt tính đối kháng mạnh để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự sinh trưởng, khả năng sinh enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với VSV kiểm định ( đang bảo quản và lưu giữ ở phòng thí nghiệm sinh hóa của khoa Sinh học, trường Đại học sư phạm Tp. Hồ Chí Minh *Ảnh hưởng của độ măn lên sự sinh trưởng, khả năng sinh các enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với VSV của 4 chủng Đã xác định được nồng độ NaCl 3% là thích hợp nhất cho sự sinh trưởng, cho hoạt tính các enzym ngoại bào và khả năng đối kháng với VSV kiểm định của 4 chủng NS tiêu biểu. Điều này cho thấy các chủng NS đã khảo sát là những chủng chịu mặn tùy tiện, có nguồn gốc từ đất liền vào và thích nghi dần với điều kiện sống của RNM Cần Giờ. 3.2 Kiến nghị Tiếp tục đi sâu nghiên cứu các chủng NS có hoạt tính sinh học nổi bật làm cơ sở cho những ứng dụng tiếp theo. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Kiều Hữu Ảnh, Vi sinh vật công nghiệp, 1999 NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội, tr 167-172. 2. Trần Văn Ba, Phan Nguyên Hồng, Hoàng Thị Sản, Lê Thị Trễ, Nguyễn Hoàng Trí, Mai Sĩ Tuấn, Lê Xuân Tuấn (1997), Vai trò của rừng ngập Mặn Việt Nam, NXB Nông nghiệp, Hà Nội, trang 78-96. 3. Báo cáo tổng kết năm 2004 của Ban Quản lý rừng ngập mặn Cần Giờ 4.. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty (2000), Vi sinh vật học (tập 1,2), NXB Đại học và Trung học Chuyên nghiệp, Hà Nội. 5.. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Hiền, Lê Đình Lương, Đoàn Xuân Mượu, Phạm Văn Ty (1978), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học (tập3), NXB Khoa học và Kỹ thuật, Hà Nội. 6. Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Đăng Đức, Đặng Hồng Miên, Nguyễn Vĩnh Phước, Nguyễn Đình Quyến, Nguyễn Phùng Tiến, Phạm Văn Ty (1976), Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật học ( tập 2 & 3 ) NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 7. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000), Sinh học vi sinh vật, NXB Giáo dục, trang 60-62. 8. Nguyễn Thành Đạt (2005), Cơ sở sinh học vi sinh vật, tập 1, 2, NXB Đại học Sư phạm Hà Nội, (1) tr.196-203,(2) tr.270. 9. Bùi Xuân Đồng (2004), Nguyên lý phòng chống nấm mốc và Mycotoxin, NXB Khoa học và Kỹ thuật, trang 155-160 10. Bùi xuân Đồng, (1982), nhóm nấm Hyphomycetes ở Việt Nam, tập 1 NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội. 11. Bùi Xuân Đồng, Hà Huy Kế (1999), Nấm mốc và phương pháp phòng chống, NXB Khoa học và Kỹ thuật, trang 69-111. 12. Bùi Xuân Đồng, Phạm Thị Huyền, Nguyễn Ánh Tuyết(2006), Thí Nghiệm công nghệ sinh học tập 2 Thí nghiệm vi sinh vật học, NXB Đại học Quốc gia TP.Hồ Chí Minh Trang 400-408 13.Bùi Xuân Đồng (1986), Nấm mốc bạn và thù, NXB Khoa học và Kỹ thuật Hà Nội 14. Nguyễn Vĩnh Hà (2002), Khảo sát hoạt tính đối kháng của các chủng nấm sợi phân lập từ RNM khu vực Giao Thủy, Nam Định và Thái Thụy, Thái Bình, Luận văn Thạc sĩ Khoa học Sinh học. 15.Nguyễn Liên Hoa, Nguyễn Lân Dũng, Lê Hoàng Yến, Nguyễn Văn Bắc 2006 , Vi sinh vật học NXB Đại học và Trung học chuyên nghiệp 16. Trương Phước Thiên Hoàng (2007), Khảo sát hoạt tính một số hệ enzym thuỷ phân amylase, cellulose, peectinase, thu từ ba chủng Trichoderma phân lập từ miền Đông Nam Bộ, Luận án Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Khoa học Tự Nhiên TP Hồ Chí Minh, trang 5-11, 16-95. 17. Phan Nguyên Hồng (1994),” Nguyên nhân và Hậu quả của sự suy giảm tài nguyên môi trường RNM ở Việt Nam”, Hội thảo Quốc gia: Trồng và phục hồi RNM ở Việt Nam- Cần Giờ, TP Hồ Chí Minh, 06-08/08-1994, trang 24-39. 18. Phan Nguyên Hồng, Mai Thị Hằng, Nguyễn Thị Thu Hà, Vũ Thị Hiền (2002), hội thảo khoa học :“đánh giá vai trò của vi sinh vật trong hệ sinh thái RNM” 18. Hội thảo khoa học(2002): “Đánh giá vai trò của VSV trong hệ sinh thái RNM”, trung tâm nghiên cứu hệ sinh thái RNM, Bộ môn Công nghệ sinh học-Vi sinh, khoa Sinh-KTNN, Hà Nội. 19.Nguyễn Thị Lan Hương (2009), Nghiên cứu khả năng sinh enzim amylase của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. 20. Lê Văn Khôi (2006), Khôi phục và phát triển bền vững hệ sinh thái RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh (1978-2000), NXB Nông Nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang 6-17. 21 Ngô Kim Khôi, Nguyễn Hải Tuấn, Nguyễn Văn Tuấn(2001), Tin học ứng dụng trong lâm nghiệp, NXB Nông nghiệp Hà Nội 22. Nguyễn Đức Lượng, Nguyễn Chúc, Lê Văn Việt Mẫn 2001, Thực tập vi sinh vật học thực phẩm, Trường ĐH Kỹ thuật TP. Hồ Chí Minh, trang 23-26, 53-56. 23. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ enzyme, NXB Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. 24. Nguyễn Đức Lượng (2004), Công nghệ vi sinh tập 2, NXB Đại Học Quốc Gia TP. Hồ Chí Minh. 25. Phan Thanh Phương (2007), khảo sát khả năng sinh kháng sinh của một số chủng Nấm sợi phân lập từ RNM Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. 26. Phạm Thị Thanh Thuý (2007), Nghiên cứu khả năng phân giải Carbuahydro của một số chủng NS phân lập từ RNM Cần Giờ, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường ĐH Sư phạm TP. Hồ Chí Minh. 27. Trần Thanh Thuỷ (1998), Hướng dẫn thực hành vi sinh vật học, NXB Giáo dục. trang 54,70,71,85,168-172. 28. Trần Linh Thước, Phạm Phú Phùng, Lê Duy Thắng (2000), Thực tập vi sinh vật , tủ sách Đại học Khoa học Tự nhiên 29. Lê Đức Tuấn (2002), Khu dự trữ sinh quyển RNM Cần Giờ, NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, trang 6-17. 30. Nguyễn Ngọc Tú, Nguyễn Cửu Thị Hương Giang, Bảo vệ cây trồng từ các chế phẩm bằng vi nấm. NXB Nông nghiệp TP. Hồ Chí Minh, 1997. 31. Lê Ngọc Tú chủ chủ biên ( 2006), Độc tố học và an toàn thực phẩm , NXB Koa học và Kỹ thuật Hà Nội 32. Trần Cẩm Vân (2001), Giáo trình vi sinh vật môi trường, NXB ĐH Quốc gia Hà Nội, trang 57-63. 33 .Võ Thị Bích Viên 2009, Khảo sát một số đặc điểm sinh học của các chủng nấm sợi thuộc hai chi Aspergilus và penicillium từ RNM Cần Giờ TP. Hồ Chí Minh “,luận văn Thạc sĩ Sinh học Trường ĐHSP Thành phố HCM Tài liệu tiếng Anh 34. A.D.Agate C.V. Subramania M. Vannucci (1988), Mangrove microbiology, UNDP/UNESCO Regional Project RAS/86/1988. 35. Ainsworth,G.S. and sussman, A. S (1968), the fungi an advance treatise, Vol III. The fungal population, Acad press Inc, New York, USA [25 hoang] 36. Grodona, I; Hemosa, R; Jeleida, M; Gomis, M. D; Mateo, P . F;Bridge, P. I.; Monte, E. and Garcia-Acha, I. (1997 ) Physiological and biochemical characterization of Trichderma harzianum, a biocontrol agent against soilborne fungal plant pathogen, Appl. Eviron. Microbiol, 63, 3. 37. Harman, G. E and Kubicek, C. P (ed) (1998), Trichodarma and Gliocladium, Vol I, Basic biology, taxonomy and genetics, pp 6-10, 64-69 38. Katsuhiko Ando, (2002), Identification of Fungi Imperfecti, NITE Biological Resource Center National Intitute of Technology and Evaluation. 39. La Grange et al (1996), “ Expression of a Trichoderma reesei β-xylanase gene (XYN2) in S.cerevisiae” Applied and environmental Microbiology, pp 1036-1044. 40. Papavizas (1985), Trichoderma and Gliocladium : Biology, ecology, and potential for biocontrol. Ann. Rev. Phytopath pp 23-54 41. Robert A. Samson at al (1984), Introduction Food – Borne Fungi, CBS, Institute of the Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences. 42. W. Gam, E.S. Hoekstra and A. Aptroot (1998), CBS Course of Mycology, CBS, P.O. Box 273, 3740 AG Baarn, the Netherlands 43J.I. Pitt and A.D. Hocking (2000), Fungi and Food Spoilage. Blackie Academic & Professtional, Second Edition. 44.Dr. N. Rajendran - Research Officer Dr. S. Baskara Sanjeevi - Research Assistant (2002), MANGROVES OF INDIA ENVIRONMENTAL INFORMATION SYSTEM CENTRE pp16-22 Trang Web 45. 46. 47. / 48. 49. 50. spiecies.html [ 39hoang] 51. 52. TrichodermaIndex.cfm 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59.www.cangio.hochiminhcity.gov.vn/DetailNews.asp?ID=458 60. 61. Phụ lục 1 Hình ảnh một số chủng có khả năng đối kháng vơi B.sutillis và E.coli Phụ lục 5 : Hình ảnh một số chủng có khả năng sinh amylase Phu lục 4 Hình một số chủng có khả năng sinh cellulase Phụ lục 3 Hình ảnh một số chủng có khả năng sinh chitinase Phụ lục 6 : Bản đồ xác định vị trí lấy mẫu đợt 2 Bản đồ xác định vị trí lấy mẫu đợt 3 Phụ lục 2 Hình ảnh một số chủng có khả năng sinh protease ._.