Khảo sát đặc điểm men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ

Sinh Học Ứng Dụng Luận văn tốt nghiệp đính kèm tên đề tài “Khảo sát dặc điểm men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ” do sinh viên NGUYỄN THỊ THANH HỒNG thực hiện thông qua hội đồng báo cáo luận văn. Giáo viên hướng dẫn NGUYỄN CÔNG HÀ NGUYỄN BẢO LỘC LÂM THỊ VIỆT HÀ Hội đồng phản biện Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng i LỜI CẢM TẠ Em xin chân thành cảm tạ: Quý thầy cô Trường Đại Học Cần Thơ và đặc biệt là Quý thầy cô Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm nói riêng đã tận tâm giảng dạy, truyền đạt những kiến thức và kinh nghiệm quý báo cho em trong suốt những năm học qua. Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Công Hà, thầy Nguyễn Bảo Lộc và cô Lâm Thị Việt Hà - người đã tận tình hướng dẫn và truyền đạt kinh nghiệm cũng như kiến thức để giúp em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp ngành Công Nghệ Thực Phẩm. Tập thể cán bộ phòng thí nghiệm Bộ Môn Công Nghệ Thực Phẩm, tập thể lớp Công Nghệ Thực Phẩm K29 đã giúp đỡ và cùng trao đổi những kiến thức trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp này. Cần Thơ, ngày 20 tháng 05 năm 2008 Sinh viên thực hiện Nguyễn Thị Thanh Hồng Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng ii TÓM LƯỢC Để cải tiến về mặt chất lượng rượu đế Phong Điền, đề tài chúng tôi hướng tới mục tiêu: Đánh giá chất lượng của men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc. Đề tài nhằm đề ra phương pháp cải tiến phù hợp nhất, thể hiện được nét đặc trưng của bánh men thuốc bắc cho tổ hợp tác Phong Điền, Cần Thơ. Phạm vi đề tài bao gồm 3 thí nghiệm: - Khảo sát qui trình chế biến bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ. - Phân lập, định danh các loại nấm mốc có trong bánh men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ. - So sánh khả năng đường hóa và lên men của men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc với các loại bánh men thuốc bắc khác trên thị trường. Qua quá trình thực hiện, tổng hợp các kết quả thu nhận được có thể rút ra một số kết luận sau: - Quá trình sản xuất bánh men còn thủ công, chưa đảm bảo về mặt chất lượng bánh men thành phẩm. Sản xuất chủ yếu dựa vào kinh nghiệm không có các thông số tỉ lệ gạo: thuốc bắc: men giống bổ sung cụ thể nên không thể áp dụng cho việc sản xuất qui mô lớn. - Sau quá trình phân lập, đinh danh các loại nấm mốc có trong men giống ta thu được 2 loài: Mucor racemosus và Aspergillus restrictus. - Khả năng đường hóa và lên men của men giống so với 2 loại men sử dụng trong tổ hợp tác đạt hiệu suất trung bình. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng iii MỤC LỤC Y Z LỜI CẢM TẠ ............................................................................................................................. i TÓM LƯỢC ............................................................................................................................... ii MỤC LỤC ................................................................................................................................iii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................................. vi DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................. vii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................................. vii CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU ..................................................................................................... 1 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ ................................................................................................................. 1 1.2 MỤC TIÊU THÍ NGHIỆM .............................................................................................. 1 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU ............................................................................... 2 2.1 GIỚI THIỆU VỀ RƯỢU ................................................................................................. 2 2.1.1 Nguyên liệu sản xuất ................................................................................................ 2 2.1.2 Giới thiệu qui trình sản xuất rượu gạo truyền thống ................................................ 5 2.1.3 Quá trình lên men rượu ............................................................................................ 5 2.1.3.1 Khái quát ............................................................................................................ 5 2.1.3.2 Cơ chế của quá trình lên men rượu .................................................................... 6 2.1.3.3 Động học của quá trình lên men ........................................................................ 7 2.1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men..................................................... 8 2.1.3.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu.......... 10 2.2 BÁNH MEN THUỐC BẮC DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU ............................. 12 2.2.1 Bánh men thuốc bắc dùng trong sản xuất rượu ...................................................... 12 2.2.1.1 Giới thiệu ......................................................................................................... 12 2.2.1.2 Các thành phần chủ yếu của bánh men thuốc bắc ........................................... 12 2.2.1.3 Hệ vi sinh vật trong bánh men thuốc ............................................................... 13 2.2.2 Sản xuất bánh men rượu tại Việt Nam ................................................................... 16 2.3 SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI NẤM MỐC VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH .................................................................................................................................. 19 2.3.1 Sơ lược về hệ thống phân loại nấm mốc ................................................................ 19 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng iv 2.3.2 Phân loại nấm ......................................................................................................... 19 2.3.3 Một số nấm mốc thường gặp ................................................................................. 20 2.3.3.1 Mucor ............................................................................................................... 20 2.3.3.2 Rhizopus ........................................................................................................... 21 2.3.3.3 Aspergillus ....................................................................................................... 21 2.3.3.4 Penicillium ....................................................................................................... 22 2.3.4 Phương pháp định danh ......................................................................................... 23 2.3.4.1 Các qui tắc chính .............................................................................................. 23 2.3.4.2 Qui trình định loại một chủng nấm mốc (đối với nhiều chi nấm mốc) ............ 23 CHƯƠNG III. PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .......................... 26 3.1 PHƯƠNG TIỆN NGHIÊN CỨU ................................................................................... 26 3.1.1 Thời gian – địa điểm .............................................................................................. 26 3.1.2 Nguyên liệu – hóa chất – thiết bị ........................................................................... 26 3.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM ................................................................................... 27 3.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình chế biến bánh men thuốc bắc tại tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền - Cần Thơ. ................................................................................... 27 3.2.2 Thí nghiệm 2: Phân lập, định danh các loại nấm mốc có trong men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ. ....................................... 28 3.2.3 Thí nghiệm 3: So sánh khả năng đường hóa và lên men của bánh men giống với 2 loại men thuốc bắc khác trên thị trường. ......................................................................... 29 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ...................................................................... 30 4.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc tại tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền – Cần Thơ. ............................................................................................... 30 4.2 Thí nghiệm 2: Phân lập, định danh các loại nấm mốc có trong men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ. ..................................................... 35 4.2.1 Mucor racemosus ................................................................................................... 36 4.2.2 Aspergillus restrictus ............................................................................................. 39 4.3 Thí nghiệm 3: So sánh khả năng đường hóa và lên men của bánh men giống với 2 loại men thuốc bắc khác trên thị trường...................................................................................... 43 CHƯƠNG V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ ............................................................................ 46 5.1 Kết luận .......................................................................................................................... 46 5.2 Đề nghị ........................................................................................................................... 46 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng v TÀI LIỆU THAM KHẢO ....................................................................................................... 47 PHỤ LỤC ................................................................................................................................. 48 PHỤ LỤC A. MỘT SỐ HÌNH ẢNH DÙNG THAM KHẢO ............................................. 48 PHỤ LỤC B. CÁC PHƯƠNG PHÁP GIEO CẤY, PHÂN LẬP VSV ............................... 50 1. Kỹ thuật gieo cấy vi sinh vật ....................................................................................... 50 1.1 Cấy truyền từ ống nghiệm này qua ống nghiệm khác............................................ 50 1.2 Gieo cấy trên thạch nghiêng .................................................................................. 51 1.3 Cấy trên thạch hộp (đĩa Petri) ................................................................................ 51 1.3.1 Dùng que cấy vòng và cấy theo vết cạn dần ................................................... 51 1.3.2 Dùng pipet ....................................................................................................... 52 2. Phân lập các giống vi sinh vật thuần khiết .................................................................. 53 2.1 Phân lập canh trường vi sinh vật tập trung ............................................................ 53 2.2 Phân lập canh trường thuần khiết........................................................................... 54 3. Thực hiện tiêu bản quan sát nấm mốc dưới kính hiển vi ............................................ 55 3.1 Tiêu bản nhuộm sống ............................................................................................. 55 3.2 Tiêu bản thạch ........................................................................................................ 55 PHỤ LỤC C. CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN TÍCH ........................................................... 56 1. Phương pháp xác định nồng độ rượu theo phương pháp chưng cất ............................ 56 2. Xác định tổng hàm lượng tinh bột và đường theo phương pháp thuỷ phân bằng axit 56 3. Xác định hiệu suất thu hồi rượu .................................................................................. 57 PHỤ LỤC D. PHÂN TÍCH THỐNG KÊ ............................................................................ 58 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1. Thành phần của gạo trong 100g. .................................................................................. 2 Bảng 2. Giới hạn hàm lượng các ion trong nước ....................................................................... 4 Bảng 3. Thành phần hóa học của nấm men ............................................................................. 14 Bảng 4. Thời gian và các loại đặc điểm phân loại quan sát. Môi trường Czapek, cao lúa mạch hoặc khoai tây. Nhiệt độ: 25 ± 1oC ........................................................................... 23 Bảng 5. Kết quả so sánh tốc độ lên men của các loại men và men giống ............................... 43 Bảng 6. Kết quả so sánh hiệu suất lên men của các loại men sử dụng. ................................... 45 Bảng 7. Kết quả số liệu phân tích khả năng đường khử và lên men của 3 loại men .............. 58 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng vii DANH MỤC HÌNH Hình 1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae .......................................................................... 15 Hình 2. Một số nấm mốc Mucor .............................................................................................. 20 Hình 3. Nấm mốc Rhizopus ..................................................................................................... 21 Hình 4. Nấm mốc Aspergillus .................................................................................................. 22 Hình 5. Nấm mốc Penicillium ................................................................................................. 22 Hình 6. Sơ đồ thí nghiệm khảo sát khả năng lên men của các loại bánh men thuốc bắc ........ 29 Hình 7. Qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc tại tổ hợp tác sản xuất rượu Phong Điền, Cần Thơ ............................................................................................................................... 30 Hình 8. Mucor racemosus có sợi bông màu xanh nhạt trên môi trường CDA ........................ 37 Hình 9. Nang bào tử kín của Mucor racemosus được chụp dưới vật kính 40X ..................... 37 Hình10. Trụ nang có phần phụ bao quanh gốc do vỏ nang khi vỡ còn sót lại ......................... 37 Hình 11. Nang bào tử kín khi còn non ..................................................................................... 38 Hình 12. Bào tử áo có nhiều trên sợi nấm ............................................................................... 38 Hình 13. Bào tử áo có hình cầu, hình trứng, cuống nang phân nhánh không đều ................... 38 Hình 14. Bào tử kín phần lớn có hình elip ............................................................................... 38 Hình 15. Aspergillus restrictus trên môi trường CDA có màu xanh lục. ............................... 40 Hình 16. Bọng đỉnh giá mang thể bình, đỉnh bọng hình cột .................................................... 40 Hình 17. Cấu tạo bông lớn với thể bình một tầng khi nhuộm xanh metylen ........................... 40 Hình 18. Cấu tạo một bông Aspergillus restrictus trưởng thành ở vật kính 40X. .................. 41 Hình 19. Cấu tạo bông Aspergillus restrictus khi còn non ...................................................... 41 trên môi trường thạch sống ở vật kính 40X ............................................................................. 41 Hình 20. Bào tử trần ................................................................................................................. 41 Hình 21. Cấu tạo bọng hình cầu .............................................................................................. 41 Hình 22. Đồ thị thể hiện hàm lượng đường tạo thành của các loại bánh men ......................... 43 Hình 23. Đồ thị thể hiện hàm lượng tinh bột còn lại của các loại bánh men ........................... 44 Hình 24. Đồ thị thể hiện thể tích rượu tạo thành của các loại men .......................................... 45 Hình 25. Mucor racemosus f.racemosus Fres: ......................................................................... 48 Hình 26. Bào tử trần và bộ máy mang bào tử trần của lòai Aspergillus flavus Link ex Fries (loại bộ máy mang bào tử trần có cuống thể bình): .................................................. 49 Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 1 CHƯƠNG I. GIỚI THIỆU 1.1 ĐẶT VẤN ĐỀ Rượu đế là một trong những thức uống có cồn đã được phổ biến từ rất lâu đời và gần như trở thành sản phẩm cổ truyền đặc trưng của từng dân tộc. Cùng với sự phát triển của khoa học, các loại rượu truyền thống đã được nghiên cứu cải tiến về công nghệ sản xuất và chất lượng ngày càng được nâng cao. Tuy nhiên, mỗi một loại rượu đều mang được nét đặc trưng của từng vùng và làm nên thương hiệu riêng cho từng sản phẩm. Sản phẩm rượu đế Phong Điền mang nét đặc trưng riêng biệt, tạo nên thương hiệu được nhiều người biết đến. Tuy nhiên tình hình sản xuất rượu của tổ hợp tác tại Phong Điền đang cần cải tiến để có một sản phẩm rượu đạt các tiêu chuẩn Việt Nam về mặt chất lượng. Nhìn chung quá trình sản xuất và nét đặc trưng riêng được qui định bới giống men sử dụng, nguồn nguyên liệu sản xuất (gạo), cách thức lên men. Trong đó bánh men thuốc bắc góp phần quan trọng và là yếu tố cần quan tâm hàng đầu khi sản xuất rượu. Hệ vi sinh vật (nấm mốc, nấm men, vi khuẩn) có trong bánh men thuốc bắc đóng vai trò quan trọng quyết định sự thành công của quá trình lên men rượu. Bánh men thuốc bắc được sử dụng phổ biến và lò sản xuất bánh men thuốc bắc hiện diện gần như hầu hết ở các địa phương. Mỗi loại bánh men có cách thức sản xuất khác nhau nên hệ vi sinh vật có trong các loại men cũng không giống nhau hoàn toàn về cả số lượng và chất lượng phụ thuộc vào kinh nghiệm của người sản xuất. Từ tầm quan trọng đã được trình bày như trên thì việc “khảo sát đặc điểm men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc tại Phong Điền, Cần Thơ” sẽ góp phần hoàn thiện qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc đạt hiệu quả lên men tốt nhất cho tổ hợp tác tại Phong Điền. Góp phần nâng cao chất lượng rượu, tăng thu nhập cho người dân và đa dạng hóa sản phẩm rượu đáp ứng nhu cầu của người tiêu dùng. 1.2 MỤC TIÊU THÍ NGHIỆM Xác định được đặc điểm vi sinh của men giống sử dụng trong sản xuất bánh men thuốc bắc của tổ hợp tác Phong Điền, Cần Thơ. Trên cơ sở đó đề ra biện pháp nâng cao chất lượng về mặt vi sinh cho men giống bổ sung góp phần hoàn thiện qui trình sản xuất bánh men thuốc bắc, sử dụng trong quá trình sản xuất rượu tại địa phương. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 2 CHƯƠNG II. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 GIỚI THIỆU VỀ RƯỢU 2.1.1 Nguyên liệu sản xuất * Gạo Đây là nguyên liệu chính để sản xuất rượu. Hiện nay, ở vùng Đồng Bằng sông Cửu Long có rất nhiều loại gạo được sử dụng để làm rượu. Gạo là một sản phẩm lương thực. Hạt gạo màu trắng, nâu hoặc đỏ thẫm, chứa nhiều dinh dưỡng. Hạt gạo chính là nhân của thóc sau khi tách bỏ vỏ trấu và cám. Thóc có rất nhiều loại và giống khác nhau. Thóc được chia làm 2 loại chính là tẻ và nếp, trong mỗi loại có rất nhiều giống khác nhau, mỗi giống có kích thước và đặc tính khác nhau. Nguyên liệu chính để nấu rượu đế rất đơn giản gồm các loại ngũ cốc có hàm lượng tinh bột cao thông dụng như gạo tẻ, gạo nếp, gạo lứt, gạo nương lúa mạch, ngô hạt, mầm thóc, sắn, hạt mít, hạt dẻ, hạt bo bo…Người dân ta thường sử dụng nhất là gạo tẻ và gạo nếp để nấu rượu đế. Các loại gạo nếp như nếp cái hoa vàng, nếp bông chát, nếp ruồi, nếp mỡ, nếp mường, nếp sáp, nếp thơm, nếp hương, nếp ngự, nếp quạ, nếp cái, nếp tiêu, nếp sột soạt, nếp ba tháng…Và các loại gạo tẻ như gạo cúc, gạo co, gạo trì, gạo ba trăng, gạo trăng biển, gạo tứ quý, gạo bắc thơm, gạo tám, gạo nàng hương… Bảng 1. Thành phần của gạo trong 100g. Thành phần Khối lượng (g) Nước 6.70 Protein 7.10 Lipid tổng số 4.90 Tro 3.60 Carbohydrate 77.60 Đường 0.12 Xơ 0.50 Khoáng 2.11 Vitamin 0,062 Nguồn: Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 3 * Men thuốc bắc: Men thuốc bắc có từ lâu đời ở nước ta cũng như ở Trung Quốc. Ở miền núi nhân dân còn dùng lá để nấu rượu. Đặc điểm của phương pháp này là trong men thuốc bắc có các loại nấm mốc và nấm men; nấm mốc phân giải tinh bột thành đường và nấm men chuyển hoá đường thành rượu. Hai quá trình xảy ra liên tục và người ta tưởng rằng chúng xảy ra đồng thời. Thuốc bắc có 20 vị, trong đó có 6 vị chính. được nghiền nhỏ trộn lẫn với bột và cho nhiễm nấm mốc, nấm men từ không khí rơi vào, sau đó nặn thành từng bánh giữ ở chỗ khô ráo hoặc gói kín để gác bếp dùng dần. Phương pháp nấu rượu thủ công hoặc rượu nếp vẫn dùng men thuốc bắc. Nguyên liệu tinh bột không nấu thành dịch mà nấu chín như xôi, rồi rắc men thuốc bắc đã tán nhỏ. Để một vài giờ mốc phát triển và sinh ra hệ enzyme thuỷ phân tinh bột, sau đó ủ và cho lên men. Rượu nấu bằng men thuốc bắc từ gạo nếp cho chất lượng cao, hương vị đậm đà hơn so với rượu nấu từ gạo. Men thuốc bắc của người dân phía Bắc Việt Nam, được sản xuất với lượng thuốc bắc cho vào nhiều hơn men thuốc bắc ở các vùng khác. Người ta cho lượng thuốc bắc như sau: + Đại hồi: 3 gam. + Tiểu hồi: 3 gam. + Thất phát: 2 gam. + Nha tạo: 2 gam. + Tạo giác: 1 gam. + Quế chi: 3 gam. + Quế khâu: 3 gam. + Cam thảo: 3 gam. (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng) Nhưng phương pháp lên men rượu bằng men thuốc bắc cho hiệu suất thấp, nhiều khi chỉ đạt khoảng 50% so với lý thuyết. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 4 * Nước Nước chiếm phần lớn trong sản phẩm rượu của chúng ta. Do đó, nước sử dụng trong sản xuất rượu cần phải đạt các tiêu chuẩn: ‚ Độ cứng không vượt quá 7 mg đương lượng/lít, trong suốt, không màu, không mùi. ‚ Không có hoặc có rất ít muối ion kim loại nặng như: Hg2+, Ba2+,… ‚ Khả năng oxy hoá 1 lít nước không vượt quá 2ml dung dịch KMnO4 (0.01N). ‚ Chất cặn không vượt quá 1000 mg/l. ‚ Muối CaSO4, MgCl2, NaCl với hàm lượng từ 300 – 400 mg/l thích hợp cho hoạt động của enzyme amylase, lượng đường khử tăng lên. ‚ Muối CaCO3, MgCO3, Fe2+, Fe3+ với lượng 400 mg/l, muối nitrit 400 mg/l sẽ ảnh hưởng không tốt đến quá trình lên men. ‚ Ecoli < 20 tế bào/lít. Bảng 2. Giới hạn hàm lượng các ion trong nước Ion Hàm lượng (mg/l) Ion Hàm lượng (mg/l) Cl- 0,5 F 3 −2 4SO 80 Zn 3 As 0,05 Cu 5 Pb 0,1 Fe 0,3 − 3NO 40 (Nguồn: Bùi Thị Huỳnh Hoa – công nghệ sản xuất rượu, bia và nước giải khát) Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 5 2.1.2 Giới thiệu qui trình sản xuất rượu gạo truyền thống 2.1.3 Quá trình lên men rượu 2.1.3.1 Khái quát Lên men rượu là một quá trình trao đổi chất nhờ tác dụng của các enzyme tương ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Tùy theo sản phẩm tích tụ sau quá trình lên men người ta chia làm nhiều kiểu lên men khác nhau. Tuy nhiên, có 2 hình thức lên men chính: lên men yếm khí và lên men hiếu khí. Nguyên liệu (gạo) Xử lý (vo, để ráo nước) Nấu chín Nước Trải cơm ra và để nguội Phối trộn Bánh men thuốc bắc đã nghiền mịn Ủ 48 ÷ 72 giờ ở nhiệt độ 28 ÷ 320C Cho nước sạch ngập cơm rượu Cho lên men tiếp ở nhiệt độ 28 ÷ 320C khoảng 48 giờ Chưng cất Pha trộn Rượu đế Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 6 + Lên men hiếu khí: là sự phân huỷ đường với sự có mặt của oxy như các quá trình lên men acid acetic, acid citric… + Lên men yếm khí: là sự phân huỷ đường không có sự hiện diện của oxy như quá trình lên men lactic, lên men rượu, butylic… Trong quá trình lên men rượu, nấm men chuyển hóa đường thành rượu etylic và CO2, có thể gọi quá trình này là quá trình rượu hóa hay cồn hóa. Trong quá trình này nấm men phát triển theo 2 giai đoạn: + Quá trình phát triển sinh khối: với sự có mặt của oxy tế bào nấm men gia tăng kích thước và số lượng. + Quá trình lên men: nấm men hấp thụ các chất dinh dưỡng và sử dụng các enzyme sẵn có của mình để thực hiện xúc tác sinh hóa trong quá trình trao đổi chất để duy trì sự sống, đồng thời tạo thành rượu và CO2. 2.1.3.2 Cơ chế của quá trình lên men rượu Để lên men người ta cho vào môi trường một lượng tế bào nấm men nhất định. Tùy theo phương pháp lên men mà lượng nấm men cho vào khác nhau. Thông thường khi lên men, lượng tế bào nấm men phải đạt > 100 triệu tế bào trong 1 ml dịch lên men. Do điện tích bề mặt của tế bào nấm men rất lớn nên khả năng hấp thụ các chất dinh dưỡng khác trong môi trường lên men, trước tiên được hấp thụ trên bề mặt của nấm men, sau đó khuếch tán qua màng vào bên trong tế bào nấm men, rượu và CO2 sẽ được tạo thành. Rượu etylic tạo thành khuếch tán ra môi trường bên ngoài qua màng tế bào nấm men. Rượu hòa tan trong nước nên khuếch tán rất nhanh vào trong môi trường. CO2 cũng hòa tan vào trong môi trường nhưng sự hòa tan không lớn và nhanh chóng đạt trạng thái bão hòa. Khi bão hòa, CO2 bám vào xung quanh tế bào nấm men hình thành bọt khí. Tế bào nấm men thường dính liền với nhau, bọt khí sinh ra càng nhiều và lớn dần lên thành những túi lớn, đến lúc nào đó có sự chênh lệch giữa khối lượng riêng của môi trường và nấm men thì tế bào nấm men sẽ nổi lên trên bề mặt. Khi đến bề mặt, do có sự thay đổi sức căng bề mặt nên chúng bị vỡ ra làm cho CO2 bị phóng thích ra bên ngoài. Lúc này do khối lượng riêng của nấm men đủ lớn trở lại nên chúng sẽ bị chìm xuống. Quá trình này diễn ra liên tục nên tế bào nấm men vốn từ trạng thái tĩnh chuyển sang trạng thái động làm gia tăng khả năng tiếp xúc giữa tế bào nấm men và môi trường. Do đó, quá trình trao đổi chất diễn ra nhanh hơn, mạnh mẽ hơn, khi đó sẽ làm tăng nhanh quá trình lên men. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 7 2.1.3.3 Động học của quá trình lên men Tốc độ của quá trình lên men có thể quan sát được bằng cách theo dõi sự thay đổi hàm lượng đường trong dịch lên men bằng cách theo dõi sự thay đổi hàm lượng rượu và CO2 tạo thành. Quá trình lên men chia thành 3 thời kỳ chính: + Thời kỳ đầu: khoảng 60 giờ kể từ khi có nấm men tiếp xúc với dịch lên men. sự lên men xảy ra rất chậm, đường lên men không đáng kể. + Thời kỳ 2: đây là thời kì lên men chính. Chiếm khoảng 60 – 120 giờ sau thời kì đầu. Sự phát triển của nấm men và sự lên men sau mỗi giờ tăng lên nhanh đáng kể và đạt đến trị số cực đại. + Thời kỳ cuối: đây là giai đoạn lên men phụ xảy ra rất chậm đồng thời là thời kì ổn định tạo mùi cho sản phẩm. Tùy theo phương pháp lên men, loại sản phẩm mà thời gian lên men phụ kéo dài khác nhau không quan sát được. Thời kỳ lên men chính là thời kỳ biến đổi sâu sắc các thành phần trong dịch lên men. Chúng ảnh hưởng đến kết quả của quá trình lên men. Đặc trưng của quá trình lên men dịch đường hoá từ nguyên liệu chứa tinh bột là giai đoạn lên men phụ. Trong giai đoạn này sự đường hóa cũng xảy ra nhưng rất chậm và không hoàn toàn, đặc biệt khó khăn đối với tinh bột không hòa tan. Do đó, tốc độ lên men trong thời kỳ này không phụ thuộc vào số lượng tế bào nấm men mà chủ yếu phụ thuộc vào sự phân hủy hàm lượng dextrin không lên men còn lại. Tuy nhiên, chính những loại đường không lên men này sẽ tạo thành vị ngọt cho sản phẩm. Như vậy, chu kỳ lên men dịch đường hóa tinh bột phụ thuộc vào thời gian lên men cuối hay phụ thuộc vào khả năng đường hoá của phức hệ enzyme amylase. Thời gian lên men cuối càng kéo dài thì hiệu suất của quá trình lên men càng cao. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 8 2.1.3.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Mỗi hoạt động của vi sinh vật nói chung và của nấm men nói riêng liên hệ mật thiết với ngoại cảnh. Có 3 mức độ ảnh hưởng khác nhau đến hoạt động sống của nấm men. + Điểm cực tiểu là điều kiện tối thiểu để nấm men tồn tại, ở điều kiện này bắt đầu xuất hiện các hoạt động sống. + Điểm tối thích là điều kiện tốt nhất cho hoạt động sống. Nấm men có cường độ hoạt động mạnh nhất. + Điểm cực đại là điều kiện tối đa và là giới hạn trên tồn tại của hoạt động sống. Quá giới hạn này nấm men sẽ chết. Vì vậy vấn đề quan trong trong quá trình nuôi cấy nấm men là điều chỉnh điều kiện ngoại cảnh sau cho đạt được giới hạn tối ưu. * Ảnh hưởng của nhiệt độ: Để thấy rõ ảnh hưởng của nhiệt độ đến hoạt động sống của nấm men cụ thể nấm men Saccharomyces Cerevisiae Rasse XII trong quá trình lên men rượu. Nấm men chủng XII phát triển tốt nhất ở nhiệt độ 30-33oC, nhiệt độ tối đa 38oC, tối thiểu là 5oC. Nấm men được nuôi cấy ở nhiệt độ thấp hơn nhiệt độ tối ưu ở 17-22oC có năng lực lên men rất lớn. Đối với ._.quá trình lên men thì nấm men có thể chịu được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 1-45oC. Nếu nhiệt độ quá 50oC nấm men sẽ chết. * Ảnh hưởng của acid (pH): Nấm men có thể phát triển trong môi trường có chỉ số pH = 2 – 8 nhưng thích hợp nhất là 4 – 4.5. Vi khuẩn bắt đầu phất triển ở pH = 4.2 và cao hơn, khi pH < 4.2 chỉ có nấm men phát triển. Vì vậy trong lên men rượu, để ngăn ngừa khả năng nhiễm khuẩn nên thực hiện trong khoảng pH = 3.8 – 4.0. Tuy nhiên trong thực tế có những loài vi khuẩn do quen dần với độ acid thấp nên ngoài việc điều chỉnh pH thích hợp còn phải kết hợp sử dụng các chất sát trùng. Khi pH = 8 thì nấm men phát triển rất kém, ngược lại vi khuẩn phát triển rất mạnh. Ở pH = 3.8 nấm men phát triển mạnh thì hầu như vi khuẩn chưa phát triển. Để tạo pH thích hợp trong môi trường nuôi cấy nấm men (kể cả lên men) người ta có thể bổ sung vào môi trường bất cứ một loại acid nào miễn là anion của acid không gây ảnh hưởng mạnh đến trung tâm hoạt động của nấm men. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 9 * Ảnh hưởng của nồng độ rượu: Quá trình nuôi cấy nấm men chủ yếu là tạo điều kiện cho nấm men phát triển sinh khối đạt số lượng theo yêu cầu. Song nấm men cũng thực hiện một quá trình lên men rượu đáng kể (phụ thuộc vào chế độ thông khí). Thường trong dịch nấm men có khoảng 4 – 6% rượu. Nồng độ rượu sinh ra có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men. Nồng độ rượu phụ thuộc vào thưòi gian, số lượng tế bào và nguyên liệu chuẩn bị môi trường nuôi cấy. Cùng một môi trường nuôi cấy, số lượng tế bào nấm men cho vào bằng nhau, điều kiện nuôi cấy giống nhau thì nồng độ rượu ban đầu 1% chưa có ảnh hưởng đến tốc độ và khả năng phát triển của nấm men, từ 4 – 6% đã có ảnh hưởng xấu. * Ảnh hưởng của việc thông thoáng khí và đảo trộn: Oxy là thành phần không thể thiếu trong quá trình phát triển sinh khối. Tuy nhiên, nó lại là nguyên nhân gây hư hỏng cho rượu, bia trong các giai đoạn chế biến còn lại. Với sự có mặt của oxy nấm men sẽ lên men không hoàn toàn vì chúng sẽ phát triển sinh khối. Trong giai đoạn bảo quản chúng sẽ làm cho sản phẩm có nhiều aldehyt, sản phẩm dễ bị biến màu do các phản ứng oxy hóa, phản ứng hóa nâu, hình thành các acid hữu cơ làm chua và gây thối sản phẩm. Một số quá trình lên men trong giai đoạn đầu diễn ra quá chậm do không đủ oxy cho sự phát triển sinh khối, do vậy không đủ số lượng tế bào lên men, ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và dây chuyền sản xuất. Tuy nhiên, lại có một số chủng nấm men phát triển nhanh và tạo ra lượng rượu nhiều hơn trong môi trường không khí, chủng này thường nuôi cấy và phát triển trong môi trương ban đầu có đầy đủ oxy. Thông khí là cung cấp đủ oxy cho quá trình hô hấp của nấm men. Việc thông khí kết hợp với đảo trộn có ảnh hưởng rõ rệt đến quá trình sinh trưởng và phát triển của nấm men. Thiếu không khí tức là điều kiện yếm khí, nấm men sẽ thực hiện quá trình lên men rượu, nồng độ rượu trong môi trường tăng nhanh chóng, khi đó sự phát triển của nấm men dần dần sẽ bị kìm hãm. Việc thông khí và đảo trộn còn có tác dụng làm cho môi trường luôn ở trạng thái động, tăng cường sự tiếp xúc giữa tế bào nấm men với môi trường dinh dưỡng, do đó rút ngắn được thời gian nuôi cấy. Ngoài các yếu tố trên, các chất sát trùng dùng trong sản xuất như formol, Na2SiF6, NaF, CaOCl2,…các muối kim loại nặng, các tia cực tím,… đều ảnh hưởng lớn đến hoạt động sống của nấm men Tuy nhiên, mỗi yếu tố (hay chất hóa học) có ảnh hưởng khác nhau trong từng điều kiện nuôi cấy và từng chủng nấm men khác nhau. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 10 2.1.3.5 Các sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian của quá trình lên men rượu Trong quá trình lên men, ngoài sản phẩm chính là rượu và CO2 còn tạo ra nhiều chất khác. Bằng cách phân tích sắc ký khí người ta phát hiện trên 50 chất khác nhau, nhưng có thể xếp thành 4 nhóm chính: acid, ester, aldehyt và alcol có số cacbon lớn hơn 2 (alcol cao phân tử). * Sự tạo thành acid: Trong quá trình lên men rượu luôn tạo các acid hữu cơ bao gồm: acid acetic, acid lactic, acid citric, acid pyruvic và acid succinic nhưng nhiều hơn cả là acid acetic và acid latic. Acid acetic có thể được tạo thành từ phản ứng oxy hoá khử giữa hai aldehyde acetic – 1 phân tử bị oxy hoá, phân tử thứ hai sẽ bị khử: CH3CHO + CH3CHO + H2O = CH3COOH + C2H5OH Acid lactic được tạo thành bởi pyruvat dehydronase theo phản ứng: CH3CO - COOH + NAD.H2 = CH3CHOHCOOH + NAD Hoặc: CH2O(H2PO3)CHOHCHO + H2O = CH3CHOHCOOH + H3PO4 Acid citric theo Laphon được tạo từ aldehyde acetic. Phản ứng được biểu diễn tổng quát như sau: 9CH3CHO + 4H2O = (CH2COOH)2C(OH)COOH + 6CH3CH2OH Acid succinic được tạo thành có thể theo hai con đường: dehydro và trùng hợp hai phân tử acid acetic với một phân tử aldehyde acetic: 2CH3COOH + CH3CHO → COOHCH2CH2COOH + C2H5OH Hoặc được tạo thành do deamin acid glutamic. Trường hợp này aldehyde glyceric tiếp nhận hydro và tạo ra cả glycerin. Phương trình tổng quát tạo acid succinic cùng với glycerin từ acid glutamic được biểu diễn như sau: C6H12O6 + COOH-CH2-CH2-CHNH2COOH + 2H2O = COOH-CH2CH2COOH + 2C3H8O3 +NH3 + CO2 Glycerin và aldehyde đều là sản phẩm trung gian của lên men rượu. Trong điều kiện lên men nhằm mục đích chỉ thu rượu etylic, người ta khống chế pH dịch lên men trong giới hạn 4,5 – 5,2. Với điều kiện ấy lượng glycerin tạo thành chỉ chiếm 0,3 – 0,45% dịch giấm chín, tương ứng tiêu tốn đường 2 – 3% so với lượng đưa vào. Nếu tăng pH tới kiềm thì lượng đường tham gia tạo glycerin tăng tới 23,4% và đường tạo aldehyde nhưng chưa chuyển thành rượu đạt 11,9%. Lên men đường xảy ra theo phương trình: 2C6H12O6 + H2O = 2C3H8O3 + CO2 + CH3COOH + CH3CH2OH Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 11 Người ta còn dùng sunfitnatri cho vào canh trường lên men nhằm điều chỉnh sản phẩm tạo thành. Khi cho sunfitnatri thì: CH3CHO + NaSO3 + H2CO3 = CH3CHONaHSO3 + NaHCO3 (H2CO3 có sẵn trong dịch) Nghĩa là tùy theo điều kiện của môi trường, sự lên men có thể xảy ra theo ba kiểu khác nhau: Lên men rượu bình thường: C6H12O6 → 2C2H5OH + 2CO2 Lên men sunfit: C6H12O6 → CH3CHO + C3H8O3 + CO2 Lên men trong môi trường kiềm: 2C6H12O6 + H2O → 2CO2 + CH3COOH + C2H5OH + 2C3H8O3 (Nguyễn Đình Thưởng, Nguyễn Thanh Hằng- 2005) * Sự tạo thành rượu bậc cao: Một trong những sản phẩm phụ quan trọng được tạo thành trong quá trình lên men rượu là các rượu có số nguyên tử carbon lớn hơn hai. Các alcol này tuy ít nhưng nếu lẫn vào etylic sẽ gây ảnh hưởng xấu đến chất lượng sản phẩm. Đó là các alcol propylic, izobutylic, izoamylic, amylic …Hàm lượng của chúng chỉ khoảng 0,4 – 0,5% so với cồn etylic nhưng gây cho sản phẩm có mùi khó chịu. Các alcol này có tên chung là dầu fusel là do nấm men sử dụng nitơ của các acid amin. Phương trình tổng quát quá trình tạo thành alcol có phân tử cao được đơn giản theo phản ứng: R-CH(NH2) - COOH + H2O → RCH2OH + NH3 + CO2 Như vậy việc tạo thành alcol cao phân tử gắn liền với sự biến đổi của acid amin xảy ra trong điều kiện yếm khí chỉ có thể đồng thời với lên men rượu. Bằng con đường tương tự, nhiều acid amin cũng được tạo thành như valin và izolơxin… chúng là tiền đề để tạo ra các alcol bậc cao sau này. Thực ra quá trình amin hoá acid pyruvic xảy ra rất phức tạp, qua nhiều giai đoạn có liên hệ chặt chẽ với nhau. Acid acetic tạo thành có hoạt tính cao lại tác động cho các quá trình khác tiếp theo. * Sự tạo thành ester: Song song với việc tạo ra acid và alcol, dưới tác dụng của enzyme trong nấm men, các acid và alcol sẽ tác dụng lẫn nhau để tạo ra những ester tương ứng. Lượng sản phẩm phụ và sản phẩm trung gian tạo thành trong quá trình lên men phụ thuộc vào nhiều yếu tố. Chúng thay đổi theo nhiệt độ, pH, mức độ sục khí cũng như chủng giống nấm men và cả nguồn nguyên liệu. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 12 2.2 BÁNH MEN THUỐC BẮC DÙNG TRONG SẢN XUẤT RƯỢU 2.2.1 Bánh men thuốc bắc dùng trong sản xuất rượu 2.2.1.1 Giới thiệu Hiện nay ở nước ta có nhiều loại men sản xuất rượu. Men lá dùng để sản xuất rượu cần, men cơm rượu dùng làm cơm rượu, bánh men thuốc bắc dùng sản xuất rượu đế, rượu nếp than. Trong các loại trên, bánh men thuốc bắc được sử dụng phổ biến hơn cả, hầu hết địa phương nào cũng có lò sản xuất bánh men thuốc bắc. Nguyên liệu chủ yếu là bột gạo, nấm men và một số vị thuốc bắc. Các thành phần này với liều lượng khác nhau ở mỗi lò men, đây được xem là bí quyết gia truyền. 2.2.1.2 Các thành phần chủ yếu của bánh men thuốc bắc * Bột gạo: phải chọn nguyên liệu tốt, đặc biệt không nhiễm vi sinh vật hoặc côn trùng vì sẽ ảnh hưởng đến hệ vi sinh vật của bánh men. Có thể sử dụng bột gạo hay bột nếp với độ ẩm khoảng 11.3%. * Men giống: sử dụng ở dạng đông khô, gồm 2 chủng chủ yếu là Saccharomyces và Endomycopsis. Nấm men được hoạt hóa bằng nước trước khi cho vào hòa trộn với bột. * Thuốc bắc: thành phần hóa học của các vị thuốc bắc có thể chia thành 2 nhóm: nhóm các chất độn và nhóm hoạt chất. Nhóm các chất độn bao gồm: nước, muối vô cơ, đường, tinh bột, chất béo,… Nhóm hoạt chất gồm: acid hữu cơ, acid vô cơ, tinh dầu, chất béo,… Nhóm này tác động đến hệ thần kinh, hệ tuần hoàn, hệ hô hấp, hệ vận động. Ngoài ra, một số chất như: dầu, phenol, ancaloit còn chứa các chất kháng sinh. Nhìn chung vai trò của các vị thuốc bắc trong viên men được quan tâm chủ yếu ở 2 tác dụng: kháng khuẩn và tạo hương cho rượu. Tuy nhiên, vấn đề này hiện nay chưa được nghiên cứu nhiều. Một số công trình nghiên cứu cho thấy các vị thuốc bắc có ảnh hưởng tốt đến sự phát triển sinh khối của nấm men và nấm mốc trong giai đoạn đầu của quá trình lên men. Hiện nay, có khoảng 20 vị thuốc bắc được sử dụng phổ biến trong sản xuất rượu nếp than như: bạc hà, thảo quả, đinh hương, cam bắc thảo,… Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 13 2.2.1.3 Hệ vi sinh vật trong bánh men thuốc * Nấm mốc (nấm sợi) - Các loại nấm mốc thường gặp trong viên men Trong bánh men thuốc bắc thấy phát triển nhiều loại mốc khác nhau thuộc Aspergillus, Penicillium, Mucor và Rhizopus. Trong đó, Mucor và Rhizopus thấy phát triển nhiều hơn cả. Loài Mucor, đặc biệt là Mucor rouxii có nhiều đặc tính rất quý như khả năng chịu nhiệt độ cao (32 – 35oC), chúng vừa có khả năng đường hóa vừa có khả năng rượu hóa. - Vai trò của nấm mốc trong lên men rượu Nấm mốc có khả năng sinh ra các enzyme amylase, đặc biệt là α–amylase và amyloglucosidase để thủy phân tinh bột thành đường, chủ yếu là glucose. Nguồn tinh bột ban đầu được nấu hay hấp sau đó hóa lỏng bằng α–amylase, đường hóa bằng amyloglucosidase. + α–amylase cắt ngẫu nhiên liên kết 1–4glycozid trong mạch amylose và amylopectin thành hỗn hợp oligomer bao gồm các đoạn phân nhánh và không phân nhánh. + Amyloglucosidase cắt các nối α – 1,4 từ đầu không khử của amylose phóng thích các monomer đơn D – glucose, đồng thời các nối α – 1,6 cũng được thủy giải nhưng chậm hơn. Enzyme này có khả năng thủy phân hầu như hoàn toàn tinh bột thành glucose (đến 98%). - Các yếu tố ảnh hưởng đến việc sản sinh enzyme đường hóa của nấm mốc + Các chất dinh dưỡng: glucose là nguồn carbon tối hảo cho tất cả các sợi nấm. Tuy nhiên, muốn cho sợi nấm sinh ra enzyme đường hóa thì tinh bột là nguồn carbon thích hợp. Khi nuôi sợi nấm sinh enzyme thì nguồn nitrogen được sử dụng dưới dạng sunfat amon. Tỷ lệ carbon và nitơ trong môi trường có ảnh hưởng lớn đến tổng hợp sinh nấm và khả năng tạo ra enzyme. Khi nguồn carbon và nitơ đầy đủ thì sợi nấm mới tích lũy enzyme tối đa. + Hàm lượng nước trong môi trường: hàm lượng nước thích hợp sẽ tạo điều kiện cho sự phát triển của nấm. Nếu môi trường thừa nước thì sẽ làm giảm trạng thái xốp của môi trường, giảm lượng oxy khuếch tán, vi khuẩn dễ dàng phát triển. Nếu thừa nước thì bề mặt môi trường bị khô là nguyên nhân kìm hãm sự phát triển của sợi nấm mới tich lũy enzyme tối đa. + Nhiệt độ: trong quá trình phát triển của nấm sợi, sinh ra lượng nhiệt khá lớn làm tăng nhiệt độ của môi trường. Nhiệt độ thích hợp nhất cho nấm phát triển là 32 – Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 14 33oC, thông thường chỉ cần điều chỉnh nhiệt độ vào giai đoạn đầu của quá trình nuôi cấy nhằm kích thích bào tử nấm mọc ra sợi nấm tốt. + Thời gian: phụ thuộc vào từng loại nấm, thông thường sau thời gian nuôi cấy từ 30 – 32 giờ thì nấm sợi sẽ phát triển mạnh nhất và sự tạo thành enzyme đường hóa nhiều nhất kết thúc, khi sợi nấm bắt đầu sinh bào tử (Nguyễn Đức Lượng). * Nấm men Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm men có cấu tạo đơn bào, thường sinh sản bằng cách nẩy chồi hoặc phân cắt. Nhóm này có nhiều trong tự nhiên và có thể sử dụng trong sản xuất rượu, bia, bánh mì,... Tế bào nấm men giàu protein, vitamin (đặc biệt là vitamin nhóm B và tiền vitamin D2). Bảng 3. Thành phần hóa học của nấm men Các chất Thành phần (%) Cacbin CaO Nitơ Hydro P2O5 K2O SO3 MgO Fe2O3 SiO 49.8 12.4 6.7 3.54 2.34 0.04 0.42 0.38 0.035 0.09 (Nguồn: Nguyễn Đức Lượng, 1996) - Các loại nấm men thường gặp trong men rượu: Mỗi gam bánh men có chứa từ vài chục đến vài trăm triệu tế bào nấm men. Chúng gồm 2 giống: Endomycopsis (chủ yếu là endo fibuligenes) và Saccharomyces (chủ yếu là Saccharomyces cerevisiae). + Endo fibuligenes là loài nấm men rất giàu enzyme amylase, glucoseamylase nên chúng vừa có khả năng đường hóa, vừa có khả năng rượu hóa. + Saccharomyces cerevisiae có khả năng lên men nhiều loại đường như: glucose, saccharose, maltose, fructose, rafinose, galactose. Đồng thời, chúng có thể lên men ở nhiệt độ cao (36 – 40oC) và có khả năng chịu được độ acid. Ngoài ra, chúng còn có khả năng chịu được thuốc sát trùng Na2SiF6 với nồng độ 0.02 – 0.025%. Đặc điểm này rất thuận lợi trong trường hợp lên men có sử dụng thuốc sát trùng. Điều quan trọng hơn là có khả năng lên men nhiều loại nguyên liệu: gạo, ngô, khoai, sắn với lượng đường trong dung dịch 12 – 14%, có khi 16 – 18%. Nồng độ rượu cao nhất Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 15 trong dịch lên men có thể chịu được là 10 – 12%. Nhiệt độ lên men thích hợp nhất là 28 – 32oC. Ngoài 2 chi nấm men cơ bản trên, trong men thuốc bắc còn nhiều loài men dại khác. Chúng vừa có khả năng thủy phân tinh bột, vừa có khả năng chuyển hóa đường thành rượu tuy sự chuyển hóa này thấp. Đặc biệt, các loài nấm men dại chịu được nhiệt độ rất cao (60 – 65oC) và chịu được chất sát trùng ở nồng độ 0.05 – 1% (Nguyễn Đức Lượng). Hình 1. Nấm men Saccharomyces cerevisiae - Vai trò của nấm men trong quá trình chuyển hóa đường thành rượu: Nấm men đóng vai trò quan trọng trong quá trình lên men rượu cổ truyền. Trong suốt thời gian lên men ngoài ethanol, CO2 còn tạo ra nhiều sản phẩm phụ như: glycorol, dầu fusel, ester, acid hữu cơ, diacetyl. Sự hiện diện của các hợp chất này tùy thuộc vào dòng nấm men và điều kiện lên men, chúng góp phần quan trọng tạo nên hương vị đặc trưng cho sản phẩm. Để thu được năng suất rượu cao, nấm men thường được lựa chọn dựa vào 2 đặc tính: Lên men với tốc độ mạnh và khả năng chịu được nồng độ rượu cao trong môi trường lên men. Ethanol là sản phẩm chính của quá trình rượu hóa nhưng ở một nồng độ nào đó ethanol có thể làm thay đổi cấu trúc và tính thấm của màng tế bào nấm men, ảnh hưởng đến sự phát triển và các hoạt động biến dưỡng của nấm men, ức chế quá trình lên men. So sánh khả năng chịu cồn cao của các dòng nấm men bằng cách cho lên men trong dung dịch đường có nồng độ cao (15 – 30% v/v) hoặc có thể dùng phương pháp lên men liên tục rồi bổ sung glucose vào từ từ cho đến khi kết thúc quá trình lên men. Đo độ rượu của các dòng nấm men khác nhau, mẫu nào có nồng độ cao chứng tỏ dòng nấm men đó có khả năng chịu đựng độ cồn cao nhất. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 16 - Các yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng và phát triển của nấm men: + Nhiệt độ: nấm men có thể chịu đựng được giới hạn nhiệt độ khá rộng từ 0 ÷ 5oC. Nếu lên men ở nhiệt độ lớn hơn 50oC, nấm men sẽ chết. + Ảnh hưởng của pH: nấm men có thể phát triển được trong môi trường pH = 2 ÷ 8 nhưng thích hợp nhất là pH = 4,.5 ÷ 5. + Ảnh hưởng của oxy: trong giai đoạn đầu của quá trình lên men, nấm men cần oxy để tăng sinh khối nhưng ở các giai đoạn sau thì không tăng. + Ảnh hưởng của độ rượu: hàm lượng ethanol sinh ra, nếu vượt quá giới hạn chịu đựng sẽ ức chế sự phát triển của nấm men. * Vi khuẩn Trong bánh men thuốc bắc thấy nhiều loài vi khuẩn phát triển. Trong đó thấy chủ yếu là các loài vi khuẩn lactic và vi khuẩn acetic. Các loài vi khuẩn thường làm chua môi trường. Thời gian đầu của quá trình lên men, quá trình này xảy ra là có lợi vì pH môi trường do chúng tạo ra sẽ thích hợp cho nấm men và nấm sợi phát triển. Tuy nhiên pH xuống quá thấp lại ảnh hưởng xấu cho quá trình lên men. Mặt khác nếu trong dịch lên men có mặt oxy thì vi khuẩn acetic sẽ oxy hóa rượu thành acid acetic. Quá trình này làm tổn hao lượng rượu tạo thành. 2.2.2 Sản xuất bánh men rượu tại Việt Nam Hiện nay có nhiều loại bánh men rượu được sản xuất hoàn toàn thủ công tại Việt Nam. Mỗi địa phương và mỗi dân tộc có phương pháp sản xuất riêng. Tuy nhiên, tất cả các loại bánh men rượu đều phải đảm bảo một số yêu cầu cơ bản sau: ‚ Trong bánh men rượu phải có vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme amylase. ‚ Trong bánh men rượu phải có các loại nấm men (có khi có vi khuẩn và nấm mốc) có khả năng chuyển hóa đường thành rượu. ‚ Có các loài vi sinh vật có khả năng tạo được hương thơm cho quá trình lên men. Phân tích hệ vi sinh vật có trong bánh men rượu của nhiều địa phương khác nhau, nhiều tác giả cho thấy rằng có sự hiện diện của các loài nấm mốc Mucor và Rhizopus, các loài nấm men như Saccharomyces, Candida, các loài vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp amylase và tạo hương. Như vậy bánh men rượu là một hỗn hợp vi sinh vật, ở đó có sự tác động tương hỗ trong quá trình lên men. Quá trình lên men rượu cổ truyền là một quá trình gần giống với phương pháp sản xuất cồn công nghiệp theo phương pháp Amilo. Ở đây đồng thời xảy ra một loạt các quá trình sinh hóa khác nhau khi lên men như: quá trình tăng sinh khối, quá trình đường hóa, quá trình rượu hóa. Vì thế Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 17 việc sản xuất bánh men rượu có liên quan rất lớn đến khả năng phát triển hài hòa của các nhóm vi sinh vật trong bánh men ấy. Tùy theo sở thích, phương pháp và nguyên liệu sản xuất rượu khác nhau mà nhiều địa phương và nhiều dân tộc đang sản xuất các dạng bánh men khác nhau. Trong đó, số lượng được sản xuất đáng kể nhất thuộc 3 nhóm bánh men rượu sau: - Bánh men rượu có thuốc bắc (bánh men thuốc bắc). - Bánh men rượu không có thuốc bắc. - Bánh men rượu có lá rừng chứa tinh dầu. Việc cho thuốc bắc vào bánh men rượu có hai tác dụng: tác dụng tạo hương trong sản phẩm và tác dụng ức chế sự phát triển của các vi sinh vật không có ích. Ở bánh men không có thuốc bắc ta có cho thêm một ít kháng sinh để hạn chế sự phát triển này. Vì thế trong dân gian còn có tên là bánh men rượu thuốc tây, để phân biệt với men thuốc bắc trên đây. Việc sử dụng bánh men rượu thuốc bắc hay thuốc tây còn tùy thuộc vào sở thích của người uống rượu có thích mùi hương thuốc bắc hay không. Một số vùng của đồng bào Tây Nguyên sản xuất bánh men một lá, bánh men hai lá, bánh men ba lá. Qui trình sản xuất các loại bánh men thuốc bắc và không có thuốc bắc như đã trình bày. Ở đây, bà con đồng bào thiểu số dung một loại lá có lượng tinh dầu cao và để tạo hương sau này, khi tiến hành lên men rượu. Tùy theo sở thích mà số lượng lá cho vào ít hay nhiều, vì thế còn có tên một lá, hai lá, ba lá. Việc cho lá rừng vào còn có tác dụng như một nguồn vi sinh vật giống tự nhiên, (giống như bà con miền Bắc dùng lá sung, lá ngái hay lá chuối để lên mốc tương). Công nghệ chung để sản xuất bánh men rượu như sau: Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 18 * Qui trình sản xuất bánh men rượu Trong qui trình sản xuất trên ta lưu ý phần nguyên liệu. Tùy từng địa phương có thể dung toàn bằng bột gạo, cũng có thể pha trộn bột gạo với bột khoai mì, cũng có nơi dùng bột khoai mì và bột bắp. Nếu dùng bột gạo hoàn toàn, bánh men rượu sẽ nặng và rắn chắc, khi đó lượng nấm mốc chỉ thấy phát triển bề mặt. Nếu dùng hoàn toàn bằng bột khoai mì, bánh men nhẹ, nhưng lượng nấm men ít và lại nhiều vi khuẩn và nấm sợi. Kết quả kiểm tra cho thấy bánh men rượu tốt nhất là được sản xuất từ bột gạo với bột khoai mì. Hiện nay, việc sản xuất bánh men rượu theo phương pháp hoàn toàn thủ công, vì thế chất lượng bánh men thuốc bắc phụ thuộc rất nhiều ở kinh nghiệm của từng người và từng gia đình. Một khía cạnh nào đó của quá trình sản xuất này mang sắc thái gia truyền. Khoai mì khô (sắn) Nghiền Phối trộn Tạo độ ẩm 55 – 60% ủ Gạo Làm sạch Giống bánh men Nghiền Thuốc bắc (hoặc lá rừng hoặc thuốc tây) Tạo hình Xếp vào các khay (hoặc nong, nia, vỉ tre có trải một lớp trấu) Bánh men rượu Nuôi trong nhiệt độ phòng có thông gió trong thời gian 4 – 10 ngày Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 19 2.3 SƠ LƯỢC VỀ HỆ THỐNG PHÂN LOẠI NẤM MỐC VÀ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH DANH 2.3.1 Sơ lược về hệ thống phân loại nấm mốc Đơn vị nhỏ nhất là loài. Mỗi loài được gọi bằng một tên khoa học gồm hai phần: tên giống và tên loài (danh pháp kép). Tên giống viết hoa, tên loài viết thường và được in nghiêng. Giống là một nhóm có chứa một hoặc nhiều loài, trong khi bậc kế tiếp là họ có thể có một hoặc nhiều giống. Do vậy, hệ thống phân loại theo bậc được xếp từ trên xuống gồm có 7 bậc như sau: Giới (Kingdom). Ngành (Phylum). Bộ (Order). Họ (Family). Giống (Genus). Loài (Species). 2.3.2 Phân loại nấm Giới nấm (Mycetalia) Ngành Nấm nhày (Myxomycetes). Lớp Acrasiomycetes. Lớp Hydromyxomycetes. Lớp Myxomycetes. Lớp Plasmodiophoromycetes. Ngành nấm (Mycota). Giai đoạn dinh dưỡng là sợi nấm hoặc đơn bào, có vách. Chia thành 5 lớp. Lớp Nấm Roi (Mastigomycetes) gồm nấm có bào tử động, sợi nấm không vách ngăn. Lớp Nấm Tiếp Hợp (Zygomycetes). Sợi nấm không vách ngăn, sinh sản hữu tính theo lối đẳng giao cho ra một bào tử tiếp hợp. Lớp Nấm Nang (Ascomycetes). Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản hữu tính cho ra nang chứa bào tử nang. Lớp Nấm Đảm (Basidiomycetes). Sợi nấm có vách ngăn, sinh sản vô tính bằng bào tử hay hạch nấm, chưa biết sinh sản hữu tính (kể cả những nấm đã biết sinh sản hữu tính nhưng trong giai đoạn vô tính vẫn xếp vào lớp này). Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 20 2.3.3 Một số nấm mốc thường gặp 2.3.3.1 Mucor Mốc Mucor có khuẩn ti đơn bào phân nhánh mạnh, sinh bào tử nang. Mucor mọc ở các hạt, thức ăn gia súc, những thực phẩm… bị ẩm thành một lớp lông tơ màu xanh. Một số loài Mucor có khả năng lên men rượu và oxy hóa. Chúng được dùng trong sản xuất acid hữu cơ, rượu và chế phẩm enzyme. (Lương Đức Phẩm, 2004). Chi Mucor là chi tiêu biểu của họ Mucoraceae (bộ Mucorales), đặc trưng bởi hệ sợi nấm không có các đoạn sợi nấm bò và rễ giả, các nang bào tử kín với cuống nang phân nhánh hoặc không phân nhánh, đơn độc hay thành cụm, mọc từ các sợi nấm. Các đặc điểm hình thái (kích thước, hình dạng, màu sắc,…) của khuẩn lạc, nang bào tử kín và các bộ phận của nang, bào tử kín và bào tử tiếp hợp (nếu có) đặc trưng cho mỗi loài của chi. Nhiều loài thuộc chi Mucor phân bố rộng rãi trong đất, không khí, gây mốc các sản phẩm công nông nghiệp. Một số loài có hoạt tính biến đổi sinh học các hợp chất steroid (phần lớn hydroxy hóa ở các vị trí 6β và 11α). Các loài M.racemosus, M.tonkinensis được dùng để lên men rượu, thủy phân tinh bột. (Bùi Xuân Đồng, 2004). Hình 2. Một số nấm mốc Mucor Mucor racemosus Fres. - Khuẩn lạc trên môi trường cao men bia màu xám, xám nâu, xốp bông, cao dưới 1 cm. Cuống nang không phân nhánh, sau phân nhánh không đều. Nang bào tử kín hình cầu, phần lớn trong khoảng 20 – 70 μm đường kính. Vỏ nang sần sùi, vỡ từng mảng. Trụ nang hình trái xoan, hình quả lê, elip, có phần phụ bao quanh gốc do vỏ nang khi vỡ còn sót lại. Bào tử kín phần lớn hình elip, 6 – 10 x 5 – 8 μm. Bào tử áo có nhiều trên các sợi nấm khí sinh, trên cả cuống nang, hình cầu, hình trứng,… phẩn lớn 10 – 20 μm đường kính, không màu hoặc màu vàng, nhẵn. Tạo thành bào tử tiếp hợp (hiếm). (Bùi Xuân Đồng, 2004). Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 21 2.3.3.2 Rhizopus Trên khuẩn ti của Rhizopus hình thành những nút và từ đây sẽ mọc những rễ cắm sâu vào cơ chất và mọc những cuống sinh bào tử nang. Trong bào tử nang chứa nhiều bào tử hình trứng hoặc hình tang trống. Vỏ bào tử có những nếp nhăn. Cuống sinh bào tử nang phình rỗng dần ở cuối. Đặc điểm này đặc trưng cho giống Rhizopus. Bào tử nang lúc đầu trắng toát, khi chín thì đen hoàn toàn. Trường hợp mốc phát triển mạnh ta thấy dày đặc những chấm đen. Hình 3. Nấm mốc Rhizopus 2.3.3.3 Aspergillus Họ nấm Aspergillus có thể có tới hơn 200 loài. Khuẩn ti có vách ngăn. Trên đầu tế bào hình chai mọc các cuống sinh bào tử đính. Các bào tử đính xòe ra như những bông hoa cúc và mang màu sắc đặc trưng cho từng loài (màu hoa cau, màu xanh lục, màu đen,…). Một số loài trong giống này có nhiều ứng dụng thực tế là: mốc vàng – A. oryzae và A. flavus; mốc đen – A. niger, A. awamori hoặc A. usami. Chúng sinh ra nhiều enzyme: amylase, protease, pectinase,… và được dùng trong sản xuất tương, nước chấm, rượu, đường mật, chế biến đay gai. A. niger còn dùng chủ yếu trong sản xuất acid citric. (Lương Đức Phẩm, 2000). Chi Aspergillus Mich ex Fr đặc trưng bởi nhữnh đặc điểm sau: Hệ sợi nấm gồm các sợi ngăn vách, phân nhánh, không màu, màu nhạt hoặc trong một số trường hợp trở thành nâu hay màu sẫm khác ở các vùng nhất định của khuẩn lạc. Bộ máy mang bào tử trần phát triển từ một tế bào có đường kính lớn hơn, màng dày hơn các đoạn lân cận của sợi nấm (tế bào chân – foot cell). Giá bào tử trần phát triển từ tế bào chân, như là một nhánh của sợi nấm, gần thẳng góc với trục của tế bào chân và thường ở trên mặt cơ chất. Giá bào tử trần không có nhánh, không có hoặc rất ít vách ngang, có phần đỉnh to ra thành bọng hình chùy, hình elip, hình nửa cầu hoặc hình cầu. Bọng hữu thụ này (bọng đỉnh giá) mang các thể bình. Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 22 Thể bình hoặc chỉ có một tầng hoặc có 2 tầng. Trong trường hợp sau, mỗi thể bình cấp 1 (cũng gọi là cuống thể bình, metula) mang một cụm gồm 2 – 3 (hoặc nhiều hơn) thể bình cấp 2 (gọi là thể bình) ở phần đỉnh. Các bào tử trần được tạo thành nối tiếp nhau trong miệng thể bình, thành chuỗi hướng gốc (bào tử ở ngay miệng thể bình là bào tử non nhất, càng xa miệng thể bình càng già), không phân nhánh. Bào tử trần không ngăn vách, thay đổi về hình dạng, kích thước, màu sắc, dấu vết ở mặt ngoài (nhẵn, có gai, có nốt sần) tùy từng loài. Tất cả các chuỗi bào tử trần đỉnh bọng. Khối bào tử trần đỉnh bọng có thể có các dạng hình cột (các chuỗi bào tử trần song song, sát nhau), hình cầu hoặc hình tia tỏa tròn. (Bùi Xuân Đồng, 2004). Hình 4. Nấm mốc Aspergillus 2.3.3.4 Penicillium Khuẩn ti có vách ngăn và phân nhánh. Một số đầu sợi lại chia thành các nhánh và từ các nhánh này mới mọc các cuống đính bào tử. Toàn bộ nhánh sinh đính bào tử có hình dáng giống cái chổi. Bào tử đính có hình cầu và khi chín có màu xanh hoặc trắng… Nhưng các mốc Penicillium thường gặp có màu xanh và người ta cũng thường gọi là mốc xanh. Giống Penicillium có nhiều loài, một số được dùng trong sản xuất chất kháng sinh penicillium (Penicillium notatum) và nhiều loài được dùng để làm chín phomat. Hình 5. Nấm mốc Penicillium Luận văn tốt nghiệp khóa 29 – 2008 Trường Đại Học Cần Thơ Ngành công nghệ thực phẩm – Khoa Nông Nghiệp và Sinh Học Ứng Dụng 23 2.3.4 Phương pháp định danh 2.3.4.1 Các qui tắc chính Chủng nấm mốc tuyệt đối thuần khiết (không lẫn nấm mốc hoặc các vi sinh vật khác). Sử dụng các môi trường nuôi cấy, nhiệt độ và thời gian nuôi cấy đúng với các chuyên luận phân loại đối với từng chi (hoặc từng nhóm loài của chi). Quan sát và ghi chép đầy đủ các đặc điểm phân loại của chủng nấm mốc cần định loại (đặc điểm khuẩn lạc trên môi trường thạch hộp lồng, đặc điểm vi học). Dùng chuyên luận các nhóm phân loại (taxon) bậc cao (ngành, ngành phụ, lớp, bộ, họ) để định loại đến chi, sau đó dùng các chuyên luận phân loại của các chi đã xác định để định loại đến các loài (và thứ nếu có). Kiểm tra chủng nấm mốc đã định loại với chủng mẫu của loài trong bộ sưu tập mẫu (nếu có). Viết tên các nhóm phân loại đúng danh pháp quốc tế. 2.3.4.2 Q._.