Khảo nghiệm, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vacxin vô hoạt nhũ dầu PRRS nhập từ Trung Quốc, sử dụng tiêm phòng thử nghiệm ở đàn lợn nuôi tại 4 tỉnh Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình và Hà Tây (cũ)

của tôi, số liệu và kết quả nghiên cứu trong Luận văn là trung thực và chưa từng được sử dụng để bảo vệ một học vị nào. Mọi sự giúp đỡ cho việc thực hiện Luận văn này đã được cảm ơn và các thông tin trích dẫn trong Luận văn đã được chỉ rõ nguồn gốc. Hà Nội, tháng 9 năm 2009 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Nhung LỜI CÁM ƠN Để hoàn thành Luận văn này ngoài sự nỗ lực của bản thân, tôi luôn nhận được sự quan tâm và giúp đỡ của các thầy giáo, cô giáo của Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội, cán bộ, công nhân viên của trung tâm Chẩn đoán thú y TW cũng như gia đình, người thân và bạn bè. Nhân dịp này tôi xin bày tỏ lòng cám ơn sâu sắc tới TS. Nguyễn Văn Cảm và PGS.TS. Trương Quang đã trực tiếp giúp đỡ, hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình thực hiện và hoàn thành Luận văn. Xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên chức của trung tâm Chẩn đoán thú y TW đã tạo mọi điều kiện, giúp đỡ chỉ dẫn cho tôi trong quá trình thực hiện đề tài tại trung tâm. Xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ của các thầy, các cô của khoa Thú y và khoa Sau Đại học đã tạo điều kiện cho tôi thực hiện đề tài cũng như có những đóng góp quý báu cho quá trình thực hiện đề tài. Nhân đây cho tôi gửi lời biết ơn tới gia đình, người thân và bạn bè đã luôn động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành Luận văn này. Hà Nội, tháng 9 năm 2009 Tác giả luận văn Nguyễn Thị Hồng Nhung MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT + AEC : 3 amino- 9 ethyl- carbazale + cs : Cộng sự. + CP : Chính phủ. + Ct : Cycle threshold + ĐC : Đối chứng. + ELI = ELISA : Enzyme linked immunosorbent assay. + EMEM : Eagle’s Minium Esential Medium + IP = IPMA : Immunoperoxidase monolayer assay. + NC : negative control. + NP40 : Nonidet P40. + NHC antigen : Normal host cell antigen. + NXB : Nhà xuất bản. + OIE : Office International des Epizooties. + PBS : Phosphate Buffered Saline. + PC : Positive control. + PRRS  : Porcine reproductive and respiratory syndrome. + PRRSV : Porcine reproductive and respiratory syndrome virus. + TB : Trung bình. + TCID50 : Tissue Culture Infectious Dose 50. + TW : Trung ương. + CP : Chính phủ DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 2.1: Lịch sử phát hiện bệnh 4 2.2: Một số tên gọi của bệnh 5 2.3: Sự tương đồng về Nucleotid của các chủng virus phân lập ở một số nước với VR2332 13 4.1. Tình hình PRRS tại 4 tỉnh Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình và Hà Tây (cũ) từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2008 44 4.2. Đánh giá mức độ PRRS tại bốn tỉnh Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình và Hà Tây (cũ) từ tháng 3 đến tháng 7 năm 2008 44 4.3. Kết quả tiêm phòng tại 4 tỉnh Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình và Hà Tây (cũ) 46 4.4. Kết quả theo dõi phản ứng của lợn sau tiêm phòng vacxin PRRS nhập từ Trung Quốc tại 4 tỉnh Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình và Hà Tây (cũ) 47 4.5. Các triệu chứng lâm sàng ở lợn thí nghiệm sau khi công cường độc. 49 4.6. Kết quả kiểm tra nhiệt độ của lợn thí nghiệm 52 4.7. Kết quả kiểm tra biến động về số lượng bạch cầu trong máu của lợn sau công cường độc (nghìn/mm3 máu) 55 4.8. Tỷ lệ phần trăm bạch cầu trong máu của lợn sau công cường độc (%) 56 4.9. Kết quả phát hiện PRRSV trong huyết thanh và phủ tạng của lợn thí nghiệm sau công cường độc (Ct) 58 4.10. Kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của lợn thí nghiệm bằng phương pháp ELISA 61 4.11. Kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của lợn bằng phương pháp IPMA{ 62 4.12. Tổng hợp kết quả kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của lợn bằng hai phương pháp 65 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 2.1: Hình ảnh về hình thái, cấu trúc của PRRSV 14 2.2. Hình ảnh về cấu trúc bộ gen của PRRSV 14 2.3 : Hình ảnh PRRSV phá huỷ đại thực bào ở phổi 17 4.1: Lợn có biểu hiện của PRRS 50 4.2: Lợn ỉa chảy, mệt mỏi, lông xơ xác 50 4.3. Diễn biến nhiệt độ cơ thể của lợn số 6, 7, 8, 9 53 4.4. Diễn biến nhiệt độ cơ thể của lợn 1, 2, 3, 4, 5 54 4.5. Diễn biến nhiệt độ cơ thể lợn số 10, 11, 12 54 4.6: Thảm tế bào MARC- 145 ban đầu 64 4.7: Thảm tê bào MARC- 145 bắt màu đậm ở hiệu giá kháng thể 1/160 64 4.8: Thảm tê bào MARC- 145 bắt màu đỏ đậm ở hiệu giá kháng thể 1/640 64 4.9: Thảm tê bào MARC- 145 bắt màu đỏ đậm ở hiệu giá kháng thể 1/2560 64 4.10: Phổi viêm dính 68 4.11: Gan, túi mật sưng, xuất huyết 68 4.12: Phôi viêm, xoang ngực tích nước vàng 68 4.13: Hạch Amidal xuất huyết 68 4.14: Phôi viêm, gan, lách sưng, tụ huyết, xuất huyết rất nặng 68 4.15: Phôi viêm, xuất huyết nhẹ 69 4.16: Phổi viêm nhẹ 69 4.17: Toàn bộ phổi viêm, xuất huyết, phế quản tận và phế nang thâm nhiễm nhiều tế bào viêm, hồng cầu. 70 4.18: Lòng phế quản tận và vách phế nang có nhiều tế bào viêm xâm nhập. 70 4.19: Rải rác vách phế nang và phế quản tận có tế bào viêm xâm nhập 70 4.20: Rải rác có tế bào viêm xâm nhập và hồng cầu ở vách phế nang 70 4.21: Phổi bình thường 71 1. MỞ ĐẦU 1.1 Tính cấp thiết của đề tài Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn- PRRS (porcine reproductive and respiratory syndrome) hay còn được gọi là “bệnh tai xanh ở lợn”, là một bệnh truyền nhiễm cấp tính, nguy hiểm đối với lợn. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, đặc biệt là gây bệnh cho lợn ở mọi lứa tuổi. PRRS xuất hiện đầu tiên tại vùng Bắc Mỹ năm 1987, sau đó nhanh chóng lan ra khắp Châu Âu năm 1991 và ra nhiều nước khác. Hàng năm PRRS gây thiệt hại rất lớn cho ngành chăn nuôi trên thế giới, kể cả nước có ngành chăn nuôi phát triển và hiện đại. Ước tính nước Mỹ hàng năm phải chi khoảng 560 triệu USD cho công tác phòng, chống dịch bệnh (Jenny G. Cho, Scott A. Dee, 2007) [8]. PRRS không chỉ gây chết lợn do làm suy giảm miễn dịch mắc phải mà nó còn tạo điều kiện cho các vi sinh vật khác xâm nhập và gây bệnh, đặc biệt là Streptococcus suis type II. Đây là một vi khuẩn có thể lây và gây bệnh cho người. Do đó PRRS không chỉ gây thiệt hại về kinh tế mà còn gây hoang mang dư luận “ăn thịt lợn mắc PRRS có thể gây bệnh cho người”. PRRSV được phát hiện ở Việt Nam vào những năm 1997, khi kiểm tra huyết thanh của 51 lợn giống nhập từ Mỹ, có 10/51 mẫu có kháng thể kháng PRRS, ngay sau đó 51 lợn này đã được xử lý. Nhưng PRRS chính thức xuất hiện có triệu chứng lâm sàng rõ rệt vào tháng 3 năm 2007, đầu tiên tại Hải Dương, sau đó nhanh chóng lan ra 6 tỉnh lân cận. Điều này có thể lý giải là, nước ta với nền chăn nuôi đa dạng, cá thể, tự phát chiếm đa số. Chăn nuôi xen lẫn trong khu dân cư, chăn nuôi chưa thành nghề chính. Vì vậy, việc khống chế dịch rất phức tạp, cộng thêm ý thức của người dân còn kém, bán tháo, bán chạy lợn từ vùng dịch ra bên ngoài nên dịch nhanh chóng lan ra khắp 3 miền Bắc- Trung- Nam. Đồng thời PRRSV có khả năng tồn tại và gây bệnh rất dai dẳng. Do đó mà trên thế giới chưa có nước nào thanh toán triệt để PRRS. Để dập dịch, Cục thú y chỉ đạo phòng chống rất quyết liệt với nhiều biện pháp đồng bộ. Một trong số những biện pháp đó là tiêu huỷ toàn bộ lợn ở những nơi mới có dịch, nơi có dịch lan rộng. Biện pháp này nếu thực hiện tốt sẽ là biện pháp có tầm quan trọng chiến lược để tiêu diệt mầm bệnh. Một thực tế xảy ra là, tiêu huỷ đàn lợn không những làm cho người nông dân gần như mất trắng mà còn gây ra hoang mang dư luận. Đặc biệt việc tiêu huỷ không đảm bảo an toàn sinh học sẽ gây ô nhiễm môi trường và làm cho dịch lây lan càng nhanh, càng rộng. Một câu hỏi đặt ra, làm thế nào để ngăn chặn và làm giảm thiệt hại của PRRS? Có rất nhiều phương án đã được đưa ra, nhưng tất cả các giải pháp đó đến nay chưa đem lại hiệu quả cao. Vì vậy, Bộ Nông nghiệp và phát triển nông thôn muốn có một giải pháp mang tính chiến lược, lâu dài đó là sử dụng vacxin phòng bệnh. Hiện nay đã có ba loại vacxin PRRS được phép lưu hành tại Việt Nam, nhưng dịch PRRS vẫn xảy ra. Vì vậy, việc tìm ra một vacxin tốt luôn là một đòi hỏi cấp thiết. Cơ sở để lựa chọn vacxin là lợn nhiễm chủng PRRSV nào? PRRSV có hai dòng nguyên mẫu là dòng Châu Âu (đại diện là virus Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (đại diện là VR- 2332). Theo phân tích mẫu bệnh phẩm ở lợn mắc PRRS tại Việt Nam của Mỹ, Trung Quốc và trung tâm Chẩn đoán thú y TW đều thống nhất rằng: PRRSV lưu hành tại Việt Nam thuộc cả hai dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ, nhưng PRRSV có độc lực cao thuộc dòng Bắc Mỹ. Cấu trúc gen của PRRSV có độc lực cao tại Việt Nam có sự tương đồng với PRRSV có độc lực cao tại Trung Quốc là 99% và với dòng Bắc Mỹ là 83% (Tô Long Thành, Nguyễn Văn Long và cs, 2008) [14]. Điều này chứng tỏ sự tương đồng cao giữa PRRSV gây bệnh ở Việt Nam và Trung Quốc. Do đó, Cục thú y đã giao cho trung tâm Chẩn đoán thú y TW khảo nghiệm vacxin PRRS nhập từ Trung Quốc. Được sự giúp đỡ của trung tâm Chẩn đoán thú y TW, tôi đã tiến hành đề tài: “Khảo nghiệm, đánh giá tính an toàn và hiệu lực của vacxin vô hoạt nhũ dầu PRRS nhập từ Trung Quốc, sử dụng tiêm phòng thử nghiệm ở đàn lợn nuôi tại 4 tỉnh Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình và Hà Tây (cũ)” 1.2 Mục đích của đề tài Đánh giá tính an toàn của vacxin vô hoạt, nhũ dầu PRRS nhập từ Trung Quốc. Đánh giá hiệu lực của vacxin vô hoạt nhũ dầu PRRS nhập từ Trung Quốc. Đưa ra được kết luận về sự bảo hộ của vacxin với PRRSV đang lưu hành tại Việt Nam.  2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về PRRS 2.1.1 Khái quát về PRRS Hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn- PRRS (Porcine reproductive and respiratory syndrome), là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm ở lợn (kể cả lợn rừng), biểu hiện đặc trưng của lợn bệnh là các rối loạn về sinh sản ở lợn nái như sảy thai, thai chết lưu, lợn sơ sinh chết yểu. Lợn con theo mẹ, lợn nái hậu bị có biểu hiện viêm đường hô hấp rất nặng, tỷ lệ chết cao. Bệnh do hai dòng virus gây ra là dòng Châu Âu với tên gọi là Lelystad và dòng Bắc Mỹ với tên gọi là VR- 2332, bệnh lây lan nhanh và mạnh. 2.1.2 Lịch sử PRRS Bảng 2.1: Lịch sử phát hiện bệnh Quốc gia Năm xuất hiện Tác giả Mỹ 1987 Keffaber 1989, Loula 1991, Benfield và cs Canada 1987 Dea và cs 1990 Nhật Bản 1989 Shimizu và cs 1994 Đức 1990 Lindhaus và Lindhaus 1991 Hà Lan 1991 Wensvoort và cs 1991 White 1991 Meredith 1992 Tây Ban Nha Pháp Anh Đan Mạch 1992 Botner và cs 1994 Hồng Kông 1991 Chang và cs 1993 PRRS lần đầu tiên được phát hiện, mô tả và thông báo ở Mỹ vào năm 1987, với biểu hiện triệu chứng ở cơ quan sinh sản và hô hấp. Lợn nái mắc bệnh tăng tỷ lệ sảy thai ở thai kỳ cuối, đẻ non, đẻ ra lợn con yếu hoặc chết, tỷ lệ đẻ thấp, chậm động dục trở lại. Tỷ lệ chết cao ở lợn con và lợn con sau cai sữa. Lợn con đang bú sữa hoặc lợn con đã cai sữa có biểu hiện triệu chứng hô hấp rất nghiêm trọng. Sau đó cũng vào năm 1987 bệnh thấy ở Canada, Nhật Bản, Đức, Hà Lan… Từ bảng 1 cho thấy: Châu Á dịch đã xuất hiện từ rất sớm, năm 1989 tại Nhật Bản. Châu Âu bệnh bắt đầu xuất hiện năm 1990 ở Đức, sau đó lan ra rộng khắp (Shimizu và cs, 1994) [33]. Bệnh xuất hiện lúc đầu với rất nhiều tên gọi khác nhau như bệnh thần bí ở lợn, bệnh lợn tai xanh, hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn … Điều này được tổng hợp tại bảng 2.2. Bảng 2.2: Một số tên gọi của bệnh Tên Bệnh Nguồn gốc Bệnh bí hiểm ở lợn (Mystery swine disease) Khi chưa biết nguyên nhân bệnh (được sử dụng nhiều ở Mỹ) Bệnh tai xanh Tai một số lợn nái mắc bệnh có màu xanh Bệnh Heko- Heko Nhật Bản Lan er bing Trung Quốc Hội chứng vô sinh và sảy thai ở lợn (Swine infertility and abortion syndrome) Lợn nái bị bệnh thường vô sinh và sảy thai Hội chứng sảy thai và bệnh đường hô hấp (porcine epidemic abortion and respiratory syndrome) Lợn bị sảy thai và bệnh đường hô hấp Hội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn (Porcine reproductive and respiratory syndrome) Lợn bị rối loạn sinh sản và bệnh đường hô hấp Đến năm 1991 khi bệnh lây ra ở nhiều nước trên thế giới với triệu chứng hô hấp và sinh sản đặc trưng, nên Uỷ ban Châu Âu đề nghị tên chính thức của bệnh là “Porcine reproductive and respiratory syndrome”- viết tắt là PRRS, bên cạnh các tên như nêu trong bảng trên (Zimmermen và cs, 1999) [38]. Năm 1992 tổ chức thú y thế giới công nhận tên PRRS như một tên gọi quốc tế cho bệnh này. Ngày nay tên PRRS đã được sử dụng rộng rãi. 2.1.3 Tình hình hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn (PRRS) 2.1.3.1 Trên thế giới Những dấu hiệu đầu tiên của PRRS đã được biết đến từ những năm 1981- 1983, nhưng bệnh lần đầu tiên được khẳng định vào năm 1987 ở Mỹ . Cũng năm 1987 ở Canada xuất hiện bệnh, năm 1989 bệnh xuất hiện ở Nhật Bản, Đức năm 1990, Hà Lan, Tây Ban Nha, Pháp, Anh năm 1991, Đan Mạch năm 1992 … Năm 1992, dịch lan tràn khắp nơi trên thế giới. Thống kê từ năm 2005- 2007 một số nước thông báo có dịch bao gồm: + Canada, Colombia, Costarica, Pháp, Ireland, Nhật Bản, Hàn Quốc, Philippines có dịch từ tháng 7- 12 năm 2006. + Đức, Hà Lan có dịch từ tháng 7- 12 năm 2005. + Bồ Đào Nha có dịch từ tháng 1- 6 năm 2005. + Tây Ban Nha có dịch từ 1- 12 năm 2006.. + Anh có dịch từ tháng 1- 6 năm 2006. + Mỹ có dịch từ tháng 7- 12 năm 2006. Hàng năm Mỹ tổn thất khoảng 560 triệu USD do PRRS gây ra. + Trung Quốc xuất hiện PRRS từ những năm 1995, gây chết hàng loạt lợn. Năm 2006 PRRS lại hoành hành tại đây trong vòng 3 tháng, làm trên 2 triệu lợn mắc bệnh, 400 nghìn con chết, ước tính tỷ lệ chết 20%. Bệnh có tốc độ lây lan nhanh, chỉ sau 3- 5 ngày bệnh có thể lây ra toàn đàn, với biểu hiện sốt cao 40- 420C, nên năm 2006 bệnh này còn có tên là “bệnh sốt cao”. Năm 2007 dịch lại bùng phát ở Trung Quốc, xảy ra ở 26/33 tỉnh với 257.000 con mắc, chết hơn 68.000 con, tiêu huỷ 175.000 con. Tại Trung Quốc, đã phân lập từ mẫu bệnh phẩm của lợn bị bệnh được cả chủng độc lực thấp và độc lực cao của dòng Bắc Mỹ. + Hồng Kông, PRRS đã xuất hiện khá lâu, từ những năm 1991 do cả 2 dòng Châu Âu và Bắc Mỹ. + Philippines PRRS xuất hiện từ năm 2006, trong năm 2007 có 18 ổ dịch, 13.542 con mắc, làm chết 1.743 con. Sau đó PRRS lan ra cả nước, gây ốm và chết lợn nái và lợn con theo mẹ (Cục thú y, 2008) [4]. 2.1.3.2 Tại Việt Nam Năm 1997, lần đầu tiên trong lịch sử PRRSV được phát hiện ở đàn lợn giống nhập ngoại từ Mỹ vào các tỉnh Miền Nam. Sau khi kiểm tra 51 con có 10/51 con có huyết thanh dương tính với PRRSV, toàn bộ số lợn đã được tiêu huỷ. Tuy nhiên, những năm tiếp theo các nghiên cứu của (Nguyễn Lương Hiền, Ngô Thanh Long, Nguyễn Ngô Minh Triết và cs, 2000) [7] ở 17 trại của 5 tỉnh phía Nam cho hay, trong 3.402 mẫu huyết thanh xét nghiệm có 596 mẫu có kháng thể PRRS. Như vậy, có thể thấy PRRSV đã xuất hiện và lưu hành ở nước ta. Những dấu ấn quan trọng cho sự bùng nổ PRRS tại Việt Nam đó là ngày 12/3/2007 hàng loạt đàn lợn tại Hải Dương có những biểu hiện ốm khác thường. Ngày 23/3/2007, Chi cục thú y tỉnh, đã báo cáo cho Cục thú y, ngay sau đó trung tâm Chẩn đoán thú y TW đã tiến hành lấy mẫu xét nghiệm và cho kết quả dương tính với PRRSV. Do lần đầu tiên PRRS xuất hiện, việc khống chế còn nhiều thiếu sót. Do đó PRRS đã lan nhanh chóng ra 6 tỉnh lân cận theo con đường buôn bán và vận chuyển lợn. Tính từ tháng 3 năm 2007 đến hết tháng 7 năm 2008 ở Việt Nam đã xuất hiện 3 đợt dịch nghiêm trọng + Đợt 1: Từ 12/3- 15/5/2007 có 7 tỉnh thành có dịch. Dịch xảy ra đầu tiên tại Hải Dương sau đó lan ra 6 tỉnh thành lân cận là Hưng Yên, Bắc Ninh, Bắc Giang, Thái Bình, Hải Phòng, Quảng Ninh, với 25 huyện, 146 xã có lợn mắc bệnh, 31.750 lợn ốm, 7.296 con bị tiêu huỷ. + Đợt 2: Từ 25/6 - 11/12/2007 PRRS xảy ra ở 14 tỉnh, thành với 40 huyện, 178 xã có dịch, 38.827 lợn ốm, 13.070 lợn bị tiêu huỷ. + Đợt 3: Từ cuối tháng 3 - 7/7/2008 có 17 tỉnh, thành với 73 huyện, 840 xã có dịch, làm 271.215 con ốm, tiêu huỷ là 261.854 con. Trong đó Thanh Hoá là tỉnh bị thiệt hại nặng nề nhất trong đợt dịch này với 193.003 con ốm, tiêu huỷ 192.946 con, chiếm 73% số lợn tiêu huỷ trong cả đợt dịch (Đậu Ngọc Hào và cs, 2008) [6]. + Từ đầu năm đến tháng 6 năm 2009, PRRS xảy ra ở 6 tỉnh, thành với 12 huyện và 45 xã. Tổng số lợn bị mắc là 4.313 con, số lợn chết là 311 và số lợn tiêu huỷ là 3.644 (Cục thú y, 2009) [5] Kết quả thống kê các đợt dịch cho thấy: (1) Lợn mọi lứa tuổi đều mắc, nhưng lợn nái và lợn con theo mẹ chiếm đa số; (2) Tỷ lệ lợn mắc PRRS tại Việt Nam cao hơn so với những nghiên cứu đánh giá của quốc tế; (3) Dịch lây lan nhanh do không quản lý được việc vận chuyển lợn ốm, do việc giết mổ lợn bệnh bừa bãi tại địa phương, do người dân thiếu kiến thức về dịch PRRS nên không khai báo dịch…; (4) Tại ổ dịch, ngoài PRRSV là nguyên nhân chính, người ta còn xác định được rất nhiều vi khuẩn, virus kế phát, cộng phát có thể gây chết lợn. Một câu hỏi đặt ra là “nguồn gốc PRRS từ đâu?”, ở trong nước hay từ nơi khác xâm nhập vào? Trung tâm Chẩn đoán thú y TW kết hợp với bộ Nông nghiệp Mỹ, trung tâm Chẩn đoán thú y Trung Quốc phân tích cấu trúc gen của PRRSV độc lực cao đang lưu hành ở Việt Nam. Theo kết quả ban đầu khẳng định có sự tương đồng tới 83% với dòng Bắc Mỹ và gần 99% với chủng virus độc lực cao của Trung Quốc theo (Tô Long Thành và Nguyễn Văn Long, 2008) [14]. Một câu hỏi nghi vấn đặt ra là có thể PRRSV của Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc? 2.2 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về PRRS 2.2.1 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Năm 1987 khi lần đầu tiên dịch PRRS được phát hiện ở Bắc Mỹ cho đến nay đã có rất nhiều công trình nghiên cứu về PRRS. Nhiều thành quả đã được ứng dụng và mang lại hiệu quả thiết thực cho công tác phòng, kiểm soát PRRS trên thế giới. Wenvoort (1991) [35], Collins (1990) [23], áp dụng định đề Koch đã khẳng định nguyên nhân của PRRS là do virus, khẳng định có hai dòng virus nguyên mẫu là dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ gây ra PRRS. Tác giả đã đặt tên cho virus gây ra PRRS ở Châu Âu là Lelystad. Benfield (1992) [19], Cozelman (1993) [24], Dea (1992) [25], Saito (1996) [32] đã khẳng định virus gây PRRS có quan hệ họ hàng gần với virus viêm động mạch ngựa, virus tăng enzyme lactate dehydrogenase ở chuột, virus gây sốt xuất huyết ở khỉ. Cũng như đưa ra những đặc tính quan trọng của họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Benfield (1992) [19], đã mô tả, đặt tên cho virus gây bệnh ở Bắc Mỹ là VR- 2332 và đưa ra đặc tính của PRRSV như sức đề kháng của PRRSV. Tác giả khẳng định PRRSV thích hợp ở pH từ 6,5- 7,5. Mengeling và cs (1996a) [28], Mengeling và cs (1998) [30], nghiên cứu về vacxin chống lại PRRSV. Khẳng định virus vacxin kích thích đáp ứng miễn dịch chậm, virus vacxin có thể truyền qua nhau thai, truyền từ con được tiêm vacxin sang con không tiêm vacxin. Vezina và cs (1996) [34], Yoon và cs (1995) [36], đã nghiên cứu về quá trình đáp ứng miễn dịch của lợn khi cơ thể lợn nhiễm PRRSV. Các tác giả đã khẳng định kháng thể IgM xuất hiện vào ngày thứ 7 và ngày thứ 14 IgG xuất hiện sau khi nhiễm PRRSV. Kháng thể trung hoà xuất hiện vào 4- 5 tuần sau nhiễm PRRSV và đạt tối đa vào lúc 10 tuần, miễn dịch kéo dài khoảng 1 năm. Zimmermen và cs (1999) [38] đã nghiên cứu một cách đầy đủ và sâu sắc về Hội chứng hô hấp và sinh sản ở lợn. Các tác giả đã giải thích về nguồn gốc tên gọi PRRS, cũng như cung cấp cho độc giả một bảng danh sách tên gọi trước khi có tên PRRS. Jun Han, Yue Wang, Kay S.Faaberg (2006) [26] đã khẳng định, về mặt di truyền học và tính kháng nguyên hai loại virus Lelystad và VR- 2332 hoàn toàn khác nhau, nếu chúng xuất phát từ một tổ tiên thì chúng được tiến hoá theo hai hướng khác nhau. Hai virus này đã trở thành hai dòng virus nguyên mẫu, dòng Châu Âu (virus Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (VR2332). 2.2.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Năm 1997 nước ta nhập 51 lợn giống từ Mỹ khi kiểm tra có 10/51 con có huyết thanh dương tính với PRRS. Từ năm 1997 đến 2006 có rất nhiều tác giả trong nước nghiên cứu về hội chứng PRRS nhưng chỉ dừng lại ở điều tra, giám sát. Bắt đầu từ tháng 3 năm 2007 khi PRRS thực sự bùng nổ thì việc nghiên cứu không chỉ có chiều sâu mà còn phân tích rất nhiều khía cạnh về PRRS ở Việt Nam. Tô Long Thành (2007) [13], đã trình bày một cách tổng hợp về hội chứng PRRS nói chung, khẳng định lợn các lứa tuổi đều mắc, nhưng nặng nhất ở lợn nái và lợn con. Tác giả đã đưa ra biện pháp phòng hội chứng PRRS, trong đó nhấn mạnh việc phòng PRRS bằng vacxin. Khi lợn mắc PRRS không chỉ có những bệnh tích đặc trưng nhất của PRRS là ở phổi và hạch lâm ba, mà còn có những bệnh tích khác do vi khuẩn kế phát gây ra. Những vi khuẩn kế phát ở đường phổi thường gặp là Mycoplasma hyopneumoniae (suyễn lợn), Pasteurella multocida (Tụ huyết trùng), Streptococcus suis type 2 (liên cầu khuẩn type 2), Bordetella bronchiseptica (viêm teo mũi) và Haemophilus parasuis (viêm đường hô hấp)… Bùi Quang Anh và cs (2007) [2]. Phạm Ngọc Thạch và cs (2007) [12], nghiên cứu về một số chỉ tiêu lâm sàng và chỉ tiêu máu của lợn mắc PRRS tại Hải Dương và Hưng Yên đã cho thấy, khi lợn mắc PRRS tần số hô hấp, tim mạch, thân nhiệt đều cao hơn sinh lý bình thường, chỉ tiêu sinh lý, sinh hoá máu thay đổi đặc biệt là số lượng bạch cầu, độ dự trữ kiềm trong máu tăng cao. Trong khi hàm lượng protêin tổng số, hàm lượng đường huyết lại giảm rõ rệt. Lê Văn Năm (2007) [11], khi khảo sát các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể ở lợn mắc PRRS tại một số địa phương thuộc Đồng bằng Bắc Bộ- Việt Nam đã thấy rằng các biểu hiện lâm sàng và bệnh tích đại thể của lợn mắc PRRS tương tự như các tài liệu trong và ngoài nước công bố. Nhưng điểm khác đó là tỷ lệ tiêu chảy, lạc giọng của lợn con theo mẹ cũng như tỷ lệ táo bón ở lợn lớn hơn.. Tô Long Thành, Nguyễn Văn long và cs (2008) [14], đã cho biết năm 2008 số lượng bệnh phẩm lợn mắc PRRS gửi đến trung tâm Chẩn đoán thú y TW nhiều hơn năm 2007, khẳng định những mẫu bệnh phẩm dương tính với PRRS có sự bội nhiễm vi khuẩn. Chủng virus độc lực cao của Việt Nam có sự tương đồng về cấu trúc gen với chủng virus độc lực cao của Trung Quốc đến 99%. Khi sử dụng virus PRRS gây bệnh tại Việt Nam công cho lợn thí nghiệm lợn không chết, huyễn dịch bệnh phẩm lấy tại ổ dịch của Việt Nam gây chết 100% lợn trong 72h. Điều này cho thấy vai trò của vi khuẩn bội nhiễm. Trần Thị Bích Liên (2008) [9], đã tổng quát về tình hình dịch PRRS cả Việt Nam và thế giới cũng như những đặc điểm cơ bản về PRRSV. Đặc biệt tác giả đưa ra phương pháp chẩn đoán PRRS như phân lập virus bằng phương pháp IPMA, IPMA kết hợp với PCR, phương pháp phát hiện kháng nguyên, kháng thể. Tác giả chỉ rõ để phát hiện kháng nguyên sử dụng phương pháp RT- PCR là hiệu quả nhất, phát hiện kháng thể có hai phương pháp có độ chính xác cao là IPMA và ELISA. Youjun Feng và cs (2009) [17], đã chỉ rõ các biến chủng của PRRSV của Trung Quốc và Việt Nam có bộ gen tương đồng tới 99%. Phân tích di truyền đã cho thấy các chủng virus này đều có sự đứt đoạn acid amin trên protein không cấu trúc Nsp2. Nhóm tác giả khẳng định các biến chủng của PRRSV tại Việt Nam và Trung Quốc là đồng nhất. 2.3 Virus học PRRS 2.3.1 Nguồn gốc và phân loại PRRS Nguyên nhân gây PRRS đã được Collins và cs xác định vào năm 1990, sau khi sử dụng dịch lọc bệnh phẩm của lợn ngoài thực địa gây nhiễm cho lợn thí nghiệm đã khẳng định PRRS do một loại virus gây ra (Collins và cs, 1990) [23]. Năm 1991, Viện nghiên cứu thú y TW ở Lelystad (Hà Lan) sau khi đã áp dụng định đề Koch và phân lập virus trên tế bào đại thực bào phế nang của lợn đã khẳng định PRRS do virus gây ra. Các tác giả Hà Lan đặt tên virus gây bệnh là virus Lelystad (Wensvoort và cs, 1991) [35]. Năm 1992 tại Mỹ các nhà khoa học cũng phân lập được một loại virus gây PRRS và đặt tên là virus VR- 2332 (Benfield và cs, 1992) [19]. Về mặt di truyền học và tính kháng nguyên, hai chủng virus này hoàn toàn khác nhau, người ta cho rằng nếu chúng xuất phát từ một tổ tiên thì chúng được tiến hoá theo hai hướng khác nhau. Hai virus Lelystad và VR- 2332 đã trở thành hai dòng virus nguyên mẫu, dòng Châu Âu (virus Lelystad) và dòng Bắc Mỹ (VR- 2332) (Tô Long Thành, 2007) [13], (Jun han và cs, 2006) [26]. Các kết quả nghiên cứu của Benfield, 1992 [19], Cozelman, 1993 [24], Dea, 1992 [25], Saito, 1996 [32], Tô Long Thành, 2007 [13] cho thấy PRRSV có quan hệ gần về mặt sinh học, về cấu trúc di truyền với virus gây viêm động mạch ở ngựa (Equine virus- EAV), virus LDHV (Lactate đehydrogenase elevating virus) ở chuột và virus SHFV (Simian Hemorrhagic fever virus) ở khỉ. Dựa vào đặc điểm đó người ta đưa 4 nhóm đó vào cùng giống Arterivirus, họ Arteriviridae, bộ Nidovirales. Chúng đều mang chung một số đặc tính sau: + Là loại virus ARN có vỏ bọc, có khả năng sinh sản trên tế bào đơn nhân, tế bào đại thực bào cũng như khả năng truyền qua nhau thai để gây bệnh cho bào thai. + Bộ gen dễ thay đổi, nên tính kháng nguyên không ổn định giúp trốn tránh phản ứng miễn dịch của cơ thể, giúp nó tồn tại rất lâu trong cơ thể vật chủ. + Gây bệnh âm ỉ. + Lan truyền do tiếp xúc trực tiếp hay qua đường không khí ở khoảng cách gần Meng và cs, 1995a [27], Nelson và cs, 1994 [31], đã kết luận: + Cấu trúc gen và nguồn gốc của PRRSV ở Châu Á có sự tương đồng cao với dòng Bắc Mỹ. VR- 2332 phân lập được ở hầu hết các nước Châu Á. Bảng 2.3: Sự tương đồng về Nucleotid của các chủng virus phân lập ở một số nước với VR2332 Giống Nguồn Gốc Tương đồng (%) VR2332 USA 100 Taiwan Taiwan 97 807/94 Canada 92 Olot Tây Ban Nha 66 110 Hà Lan 66 2.3.2 Hình thái và cấu trúc của PRRSV Virus gây ra PRRS ở lợn thuộc họ Arteriviridae, bộ Nidovirales, chứa duy nhất hệ gen ARN sợi đơn dương. PRRS virus có cấu trúc hình cầu, gồm 20 mặt đối xứng, đường kính hạt virion của virus vào khoảng 45- 55 nm, thậm chí lên đến 80 nm. Nhân Nucleocapsid có đường kính 25- 35 nm, trên bề mặt có nhiều gai nhô ra rất rõ trích theo William T.Christianson và Han Soo Joo (2001) số 2 [18] Sợi ARN của virus có kích thước 15- 15,5 Kb và gồm ít nhất 8 khung đọc mở ORF- Open reading frame (ORF 1a, ORF 1b, ORF 2- 7), có chức năng mã hoá cho 20 loại protein thành thục, trong đó có 6 protein chính có khả năng trung hoà kháng thể, bao gồm 4 phân tử glycoprotêin màng, 1 protêin xuyên màng (M), 1 protein Nucleocapsit (N), kháng thể đơn dòng kháng protein N là chủ yếu (Youjun Feng và cs, 2009) [17]. Protein không cấu trúc số 2 (Nsp2) và glycoprôtêin 5 (được mã hoá bởi ORF5) được coi là 2 vùng có tính đồng nhất cao và là những vùng đóng vai trò quyết định tính gây bệnh của các chủng PRRSV. Đây là hai đoạn có khả năng biến đổi rất lớn, quyết định độc lực của virus. Người ta dựa vào đây để định type virus (Tô Long Thành, 2007) [13]. Cũng dựa vào protein không cấu trúc này mà từ 2 dòng virus ban đầu là dòng Châu Âu và dòng Bắc Mỹ, hiện nay PRRSV đã biến đổi thành nhiều chủng khác nhau. Dòng Bắc Mỹ có chủng P129, MN184, 2 chủng này có nhiều đoạn đứt trên prôtêin Nsp2, dòng Bắc Mỹ khi lan sang Trung Quốc, Việt Nam đã tạo ra 1 chủng mới có sự đứt đoạn 30 aa trong prôtêin Nsp2 ở vị trí aa thứ 481 và 532- 560 (Youjun Feng và cs, 2009) [17]. 2.3.3 Sức đề kháng của PRRSV PRRSV tồn tại 1 năm trong nhiệt độ lạnh từ – 200C đến – 700C, 40C virus tồn tại được 1 tháng. PRRSV đề kháng kém ở nhiệt độ cao, ở 370C sống được 48 giờ, 560C bị giết sau 45 phút. Với các chất sát trùng thông thường và môi trường acid, virus dễ dàng bị tiêu diệt, ánh sáng mặt trời, tia tử ngoại vô hoạt virus rất nhanh (Trần Thị Bích Liên, 2008) [9], (Tô Long Thành, (2007) [13]. Tính gây nhiễm của PRRSV bị ảnh hưởng bởi pH, PRRSV chịu đựng được pH trong khoảng 6,5- 7,5, khả năng gây nhiễm của PRRSV bị bất hoạt nhanh chóng ở pH 7 (Benfield và cs, 1992) [19], (Bùi Quang Anh và cs, 2008) [3]. Trong thịt đông lạnh ở 40C PRRSV tồn tại tới 48 giờ. PRRSV bất hoạt nhanh chóng trong điều kiện khô hạn ở môi trường bên ngoài, nhưng tồn tại được 9 ngày trong nước giếng, 11 ngày trong nước máy trích theo (Trần Thị Bích Liên, 2008) [9]. Trong mẫu huyết thanh ở 250C, thì 47%, 14%, 7% mẫu huyết thanh vẫn phân lập được PRRSV trong 24, 48, 72 giờ. Ở 40C hoặc – 250C, thì 85% mẫu huyết thanh vẫn phân lập được PRRSV trong 72 giờ (Zimmermen và cs 1999) [38]. 2.3.4 Vật chủ và phương thức lây truyền Khả năng gây bệnh của mầm bệnh là một đặc tính sinh học quan trọng. Mầm bệnh có độc lực càng cao, khả năng gây bệnh càng lớn và ngược lại. Tuy vậy, nó còn phụ thuộc rất lớn vào vật chủ, nhân tố trung gian và phương thức lây truyền, để mầm bệnh đó phát triển, phát tán và hình thành dịch. Vật chủ của PRRSV là lợn. Lợn ở tất cả các giống, các lứa tuổi đều mẫn cảm, nhưng lợn con và lợn nái mang thai thường mẫn cảm hơn cả.. Vịt trời, thuỷ cầm chân màng, lợn rừng là loài mang trùng. Vì thế lợn rừng, vịt trời, thủy cầm được coi là nguồn dịch thiên nhiên và phát tán mầm bệnh. PRRSV được xác định là không lây sang gia súc và người (Tô Long Thành, 2007) [13]. Đường truyền lây là một yếu tố quan trọng, nó ảnh hưởng tới tốc độ lây lan và quy mô dịch bệnh truyền nhiễm. PRRSV có trong dịch mũi, nước bọt, phân và nước tiểu của lợn ốm hoặc lợn mang trùng. Từ đây mầm bệnh được phát tán ra môi trường bên ngoài. Nhiều tác giả cho rằng trong tinh dịch của lợn đực giống bị PRRS cũng là nguồn lây lan virus (Yaeger và cs 1993) [37]. Lợn nái mang thai bị bệnh, virus có thể truyền qua nhau thai cho lợn con (Christianson và cs, 1993) [21]. Lợn con nhiễm bệnh và lợn mang trùng có thể đào thải virus ra môi trường Tóm lại PRRS truyền chủ yếu theo đường không khí, lây trực tiếp do tiếp xúc hay gián tiếp qua nhân tố trung gian mang mầm bệnh như phân, rác, chất độn chuồng, thức ăn… 2.3.5 Cơ chế gây bệnh của virus Đặc trưng nổi bật của họ virus Arteriviridae là khả năng thích ứng đặc biệt trên tế bào đại thực bào. Đối với PRRSV, tế bào thực bào phế nang phổi là tế bào thích ứng đặc biệt. Đại thực bào là tế bào duy nhất có receptor phù hợp với cấu trúc hạt virus. Sau khi xâm nhập vào tế bào đại thực bào chúng nhân lên và phá huỷ rất nhanh tế bào. Lúc đầu, PRRSV có thể kích thích các tế bào đại thực bào, nhưng sau 2 hoặc 3 ngày virus sẽ giết chết chúng, các virion được giải phóng ồ ạt rồi xâm nhiễm sang các tế bào khác. Ở giai đoạn đầu của quá trình xâm nhiễm của PRRSV, dường như hiệu giá kháng thể chống lại các loại virus và vi khuẩn không liên quan khác trong cơ thể của lợn tăng cao do sự kích hoạt của đại thực bào trong hệ thống miễn dịch. Điều này rất dễ gây ra sự nhầm lẫn trong việc đánh giá mức độ miễn dịch đối với các bệnh truyền nhiễm ở cơ thể lợn Trong hệ thống miễn dịch, đại thực bào là tế bào trình diện kháng nguyên, là tế bào đóng vai trò mở đầu cho quá trình đáp ứng miễn dịch. Khi đại ._.thực bào bị tấn công và phá huỷ thì khả năng đáp ứng miễn dịch của cơ thể giảm, rất dễ mắc các bệnh nhiễm trùng thứ phát. Đối với lợn thịt sắp xuất chuồng khi mắc PRRS, những biểu hiện bệnh ở đường hô hấp là rất rõ. Khi con vật bị PRRS sẽ bị viêm phổi rất nặng nề, tất yếu khả năng cung cấp oxy cho cơ thể giảm, gây rối loạn chuyển hoá các chất trong cơ thể. Đặc biệt nguy hiểm với con vật mang thai, nhu cầu về năng lượng, oxy tăng, nên rất dễ bị sảy thai, thai suy dinh dưỡng và chết thai. Ngoài ra virus còn có thể truyền qua nhau thai để gây bệnh cho thai (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) [16]. Nhìn chung lợn mọi lứa tuổi đều có thể mắc, nhưng bệnh sảy ra trầm trọng ở lợn nái và lợn con. 2.3.6 Đáp ứng của vật chủ chống lại PRRSV Sau khi PRRSV xâm nhập vào cơ thể lợn, cơ thể lợn sẽ huy động hệ thống miễn dịch của mình chống lại. Đây là một chuỗi liên tục nhiều khâu bao gồm cả đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào. Nhờ sử dụng phản ứng IFA, ELISA và IPMA, đã xác định được rằng có sự xuất hiện của kháng thể IgM và IgG trong huyết thanh ở thời điểm 7 ngày đối với kháng thể IgM và 14 ngày đối với kháng thể IgG (Vezina và cs, 1996) [34]. Kháng thể này đạt ở mức cao sau 30- 50 ngày sau đó giảm dần và không tìm thấy sau 4- 6 tuần. Bằng phản ứng trung hoà virus trong huyết thanh, đã chứng minh được rằng có sự xuất hiện của kháng thể trung hoà nhưng muộn hơn. Kháng thể trung hoà xuất hiện vào 4- 5 tuần sau nhiễm PRRSV, đạt tối đa vào lúc 10 tuần và kéo dài miễn dịch khoảng 1 năm (Yoon và cs, 1995b) [36]. Riêng với lợn đực sau 10 tuần nhiễm PRRSV, cơ thể lợn mới xuất hiện kháng thể trung hoà, 18 tuần đạt cực đại (Nelson và cs , 1994) [31]. Những kháng thể trên có vai trò chống lại sự tái nhiễm của PRRS. Đặc biệt là kháng thể chống lại Glycoprotein vỏ virus, sẽ trung hoà virus và tạo đáp ứng miễn dịch với những protein tái tổ hợp từ ORF 3 và ORF 5 phần nào giúp bảo vệ lợn chống lại PRRSV. Sự hiểu biết về đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào của cơ thể chống PRRSV còn hạn chế. Những nghiên cứu đầu tiên cho thấy sự tăng tế bào lympho xuất hiện ngắn từ 3- 9 ngày là dấu hiệu của lợn nhiễm PRRSV. Tuy nhiên ở ngày thứ 14 sau khi nhiễm, tổng số tế bào ở mạch ngoại vi ở mức bình thường. Sự tăng tế bào lympho TCD8 làm người ta giả thiết rằng những tế bào T tiết độc tố tế bào đặc hiệu được tạo ra (Trần Thị Bích Liên, 2008) [9]. Virus làm thế nào để chống lại hàng rào miễn dịch của cơ thể? Không nằm ngoài cơ chế chung của một virus, PRRSV luôn điều biến để lẩn tránh đáp ứng miễn dịch một cách mạnh mẽ. + Interferon (IFN): Do tế bào nhiễm virus tiết ra, để ngăn cản virus đó vào lần sau, cũng như tạo bức tường ngăn cản virus xâm nhập sang tế bào khác. PRRSV rất nhạy cảm với tác động của IFN type I, chúng có thể đã đề kháng lại với những phản ứng của IFN- Alfa, thậm chí cả IL- 10 và IL- 12 trong tế bào thực bào và tế bào tua. Vì thế PRRSV có thể phá huỷ hàng loạt tế bào đại thực bào. + Vai trò của Interleukin (IL): IL- 10 có vai trò quan trọng trong điều hoà đáp ứng miễn dịch đối với PRRSV. Sau khi nhiễm PRRSV, hiệu giá của ARNtt của IL- 10 đã tăng lên ở các tế bào phế nang phổi của lợn và trong dịch rửa phế quản. + Vai trò “tự nguyện chết”- (apoptosis): ở những lợn nhiễm PRRSV người ta tìm thấy nhiều tế bào chết do cơ chế này ở các mô bị nhiễm đặc biệt ở phổi, tinh hoàn và hạch amidal. Tuy nhiên, PRRSV gây ra hiện tượng apoptosis trực tiếp, gián tiếp hay qua tín hiệu truyền tải thì hiện nay còn chưa rõ ràng. Tóm lại hiện nay cơ chế đáp ứng của cơ thể chống PRRSV hiện chưa được rõ ràng. Sự phát triển của việc nghiên cứu vacxin phòng PRRS đã đem lại lợi ích thiết thực nhưng một số trường hợp lợn được tiêm không tạo được đáp ứng miễn dịch, tạo miễn dịch chéo. 2.4 Hội chứng rối hô hấp và sinh sản ở lợn- PRRS. PRRS do PRRSV gây ra. Khi virus xâm nhập vào cơ thể lợn, những lợn bị mắc sẽ có các triệu chứng, bệnh tích sau: 2.4.1 Triệu chứng của PRRS Lợn mọi lứa tuổi đều mắc, nhưng mỗi lứa tuổi lợn khi mắc PRRS lại có những triệu chứng khác nhau + Lợn nái Nếu ở tình trạng bệnh cấp tính sẽ gây sảy thai, chiếm 1- 3% số nái từ ngày chửa thứ 21- 109. Một số lợn nái sảy thai ở giai đoạn cuối, chiếm 1- 6% Một số lợn đẻ non sau khi mang thai 4 tuần, sau đó duy trì tình trạng động dục giả và chậm động dục sau cai sữa, chiếm 1- 20%. Đẻ ra thai chết, thai gỗ hoặc đẻ ra lợn con rất yếu, chết yểu. Đôi khi ở lợn nái có triệu chứng thần kinh như mất điều hoà vận động, có khi con nái bị mất sữa. Bệnh ở lợn nái diễn ra trong hai kỳ, kỳ thứ nhất kéo dài 1 tuần, kỳ thứ 2 kéo dài 1- 4 tháng. Trong kỳ hai, 5- 80% lợn nái có biểu hiện rối loạn sinh sản từ ngày chửa thứ 100- 118. Nái nhiễm bệnh kém ăn, sốt cao 39- 400C, một số con bị ho, nhưng viêm vú và mất sữa là triệu chứng đặc trưng thường gặp. Hiện tượng tai tím, tai xanh có xuất hiện nhưng không nhiều, nếu xuất hiện thì trong vài giờ là hết (Tô Long Thành, 2007) [13] . + Lợn đực Lợn đực mắc PRRS thường sốt trong thời gian ngắn, bỏ ăn. Một số lợn có biểu hiện hôn mê và có triệu chứng đường hô hấp. Đặc biệt là viêm dịch hoàn, giảm tính hăng, xuất tinh kém, tỷ lệ thụ thai thấp. Biểu hiện cụ thể bìu dịch hoàn sưng đỏ, các chỉ số về tinh trùng kém, như C 10%, tỷ lệ sống của tinh trùng < 70% (Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội) [16] . + Lợn con theo mẹ Lợn thường chết yểu, thường mắc bệnh đường hô hấp, hiện tượng ỉa chảy xảy ra khá phổ biến. Lợn có biểu hiện viêm kết mạc, sưng mí mắt, lợn con ủ rũ gầy còm, thở nhanh, đôi khi đi nghiêng ngả. Tỷ lệ chết trước khi cai sữa từ 10- 40%. + Lợn cai sữa và lợn choai Lợn có biểu hiện ủ rũ, thở nhanh, thở khó. Xuất huyết dưới da vùng tai, mông, đùi, lông xơ xác, nếu có nhiễm trùng kế phát thì triệu chứng đường hô hấp, tiêu hoá càng rõ rệt và gây chết đến 15%. Nếu lợn con bị phơi nhiễm trong thời kì kháng thể mẹ truyền sang con đã hết hiệu lực thì chúng sẽ bị huyết nhiễm virus từ 3 đến 4 tuần lễ và liên tục bài thải virus. Đồng thời lợn có biểu hiện kém ăn, lông xơ xác, viêm phổi, nhiễm trùng kế phát là điều không tránh khỏi do đó gây chết lợn lên tới 12- 20% (Tô Long Thành, 2007) [13]. 2.4.2 Bệnh tích của PRRS Đối với PRRS bệnh tích đặc trưng nhất là ở phổi. Phổi có hiện tượng viêm hoại tử, đặc trưng bởi những đám chắc, đặc. Trên các thuỳ phổi bị bệnh có màu xám đỏ, có mủ, chắc đặc. Mặt cắt ngang của các thuỳ phổi bệnh lồi ra, khô. Nhiều trường hợp viêm phế quản phổi hoá mủ. Bệnh tích vi thể thấy phổi có hiện tượng dịch thẩm xuất và hiện tượng thâm nhiễm bạch cầu, trong phế nang chứa đầy dịch viêm, đại thực bào. Một số trường hợp hình thành tế bào khổng lồ nhiều nhân. Một bệnh tích khá đặc trưng ở phổi là hiện tượng phế nang bị nhăn và thấy có hiện tượng đại thực bào bị phân huỷ PRRS là bệnh làm giảm khả năng miễn dịch do vậy mà dễ có hiện tượng nhiễm trùng kế phát. Nên ngoài bệnh tích ở phổi còn có một số bệnh tích khác tuỳ theo tình trạng bội nhiễm. Thường thấy viêm màng bao tim, viêm màng phổi, viêm phúc mạc, viêm màng não khi ghép với Salmonella cholerasuis, Haemophilus parasuis (Trần Thị Bích Liên, 2008) [9]. 2.4.3 Phương pháp chẩn đoán PRRS Để chẩn đoán bệnh này có thể sử dụng một số phương pháp sau: Có thể dựa vào triệu chứng, bệnh tích đại thể, vi thể để chẩn đoán bệnh, nhưng phương pháp huyết thanh thanh học phát hiện kháng thể và phương pháp phát hiện virus là những phương pháp tin cậy và cần thiết. 2.4.3.1 Phương pháp huyết thanh học Có thể phát hiện kháng thể trong huyết thanh của lợn, dịch của cơ thể, từ thai chết lưu bằng nhiều phương pháp, nhưng hiện nay thường sử dụng bốn phương pháp sau (William T. Christianson và Han Soo Joo, 2001) [18]: + IPMA (Immunoperoxidase monolayer assay)- Phương pháp miễn dịch có gắn enzyme trên thảm tế bào một lớp. Đây là phương pháp sử dụng một thảm tế bào đã gây nhiễm virus chuẩn để phát hiện kháng thể. Nếu huyết thanh có kháng thể thì có sự kết hợp của kháng nguyên, kháng thể và kháng kháng thể, khi cho cơ chất vào sẽ xuất hiện màu đậm, đó là phản ứng dương tính. Phản ứng âm tính nếu thảm tế bào có màu hồng nhạt. + Phản ứng kháng thể huỳnh quang gián tiếp: Cơ chế giống phản ứng ELISA hay IPMA, nhưng khác là kháng kháng thể có gắn chất phát quang, khi soi dưới kính hiển vi huỳnh quang có hiện tượng phát màu. + Phản ứng trung hoà huyết thanh SN (Serum Neutrolization) + Phản ứng ELISA (Enzyme- linked immunosortbent assay) trực tiếp và gián tiếp, nhưng người ta thường sử dụng phản ứng ELISA gián tiếp. Thực chất giống phương pháp IPMA, đó là sự kết hợp của kháng nguyên, kháng thể, kháng kháng thể có gắn enzyme nên khi cho cơ chất vào có hiện tượng phát màu. Phản ứng IPMA là phản ứng được dùng đầu tiên để phát hiện kháng thể PRRS và hiện nay vẫn đang được sử dụng nhiều ở Châu Âu. IPMA có thể được làm trên thảm tế bào PAM, CL2621 hoặc MA104, MARC145. Phản ứng ELISA được sử dụng nhiều ở Mỹ, đây là phản ứng sử dụng kháng nguyên gắn vào đĩa mà virus chuẩn được gây nhiễm trên tế bào PAM. 2.4.3.2 Phương pháp phát hiện virus Để phát hiện virus có thể sử dụng một số phản ứng sau: + Phương pháp IPMA sử dụng phân lập virus trên một số loại tế bào, tế bào phế nang lợn (PAM), tế bào MA- 104, tế bào MARC 145, tế bào CL- 2621 và tế bào CRL- 11171. + Phương pháp hoá đỏ chín miễn dịch (Immunohisto- Chemistry). + Phương pháp huỳnh quang gián tiếp phát hiện kháng nguyên. + Phương pháp nhân gen (Realtime RT- PCR). + Phương pháp lai phân tử tại chỗ. 2.4.4 Phòng và điều trị PRRS Đây là bệnh do virus, nên việc điều trị chủ yếu vẫn là sử dụng thuốc trợ sức, trợ lực để nâng cao sức đề kháng và đặc biệt là điều trị hiện tượng nhiễm trùng kế phát. Dó đó việc phòng bệnh là quan trọng nhất. Chúng ta có thể phòng PRRS bằng một số cách sau: Đảm bảo chất lượng con giống + Vệ sinh môi trường chăn nuôi, ngăn ngừa sự xâm nhập của các chủng virus mới vào trại + Tiêm phòng định kỳ các bệnh truyền nhiễm của lợn theo đúng hướng dẫn của cơ quan chức năng. + Nâng cao năng lực của cán bộ thú y và ý thức của người chăn nuôi. Trong các biện pháp trên thì biện pháp sử dụng vacxin đang được tiến hành tại Việt Nam. 2.5 Vacxin và vacxin phòng PRRS 2.5.1 Hiểu biết chung về Vacxin Vacxin là một chế phẩm sinh học được dùng để tạo miễn dịch chủ động kháng lại bệnh, nhằm ngăn cản khả năng gây bệnh của mầm bệnh. Thuật ngữ vacxin được xuất phát từ “vacca”có nghĩa là bò cái để ghi nhận công lao của Jenner đã dùng mụn đậu ở bò để chữa đậu cho người. Hiện nay theo Tô Long Thành, 2009 [15], vacxin được chia thành 2 nhóm lớn là nhóm vacxin truyền thống và nhóm vacxin thế hệ mới: + Vacxin truyền thống gồm có: Vacxin vô hoạt, vacxin nhược độc, vacxin giải độc tố, vacxin dưới đơn vị. + Vacxin thế hệ mới gồm có: Vacxin tái tố hợp và vacxin AND. Một vacxin cần đảm bảo tính thuần khiết, an toàn và hiệu lực. 2.5.1.1 Vacxin truyền thống a. Vacxin vô hoạt Vacxin vô hoạt là loại vacxin được chế từ các chủng vi sinh vật cường độc, đã được giết chết bằng hoá chất hoặc nhiệt độ cao. Vacxin này thường chứa nguyên vi sinh vật, nên hầu như nó tạo miễn dịch không hoàn toàn, miễn dịch có độ dài ngắn. Hiện nay nhờ công nghệ mới mà vacxin vô hoạt đã được cải thiện nhờ chất bổ trợ có chất lượng cao. Vacxin vô hoạt có một số ưu điểm sau: + Có tính an toàn cao, không có hiện tượng đột biến và cường độc trở lại. + Có thể dùng cho mọi đối tượng vật chủ kể cả vật chủ bị suy giảm miễn dịch. + Bảo quản dễ dàng, rất thích hợp cho vùng có khí hậu nóng hoặc những nơi chưa có điều kiện bảo quản. + Vacxin này kích thích miễn dịch tốt nếu được dùng nhắc lại. Vacxin vô hoạt có một số nhược điểm sau: + Do phải sử dụng trực tiếp trên từng cá thể, nên không thể áp dụng tiến bộ khoa học khi số lượng đàn lớn như biện pháp cho uống hoặc khí dung. + Không có khả năng tạo miễn dịch cục bộ. + Phải sử dụng nhắc lại mới có hiệu quả cao + Đôi khi không tạo đáp ứng miễn dịch ở một vài cá thể. + Giá thành cao hơn so với vacxin nhược độc cùng loại. + Nếu quá trình vô hoạt không triệt để, dẫn đến việc đưa mầm bệnh cường độc vào vật chủ. Một số vacxin vô hoạt: vacxin vô hoạt tụ huyết trùng gia cầm, lợn, trâu, bò, vacxin vô hoạt lở mồm long móng, vacxin vô hoạt cúm gia cầm… b. Vacxin nhược độc Vacxin nhược độc là vacxin được chế từ những chủng vi sinh vật đã được làm giảm tính độc không còn gây hại cho vật chủ, nhưng vẫn giữ được tính kháng nguyên. Do đó vẫn kích thích cơ thể sinh đáp ứng miễn dịch. Hiện nay vi sinh vật được làm giảm độc bằng cách tiêm truyền nhiều đời cho vật chủ tự nhiên, hoặc được nuôi cấy trong điều kiện không thuận lợi đối với vi sinh vật. Vacxin nhược độc có một số ưu điểm sau: + Hoạt hoá hết hệ thống miễn dịch. + Không làm thay đổi tính kháng nguyên. + Tạo đáp ứng miễn dịch nhanh, mạnh và lâu dài. + Giá thành vacxin thấp hơn vacxin vô hoạt cùng loại. + Dễ dàng vận chuyển và có thể sử dụng trên quy mô công nghiệp nhờ khả năng xâm nhập được vào cơ thể theo nhiều con đường, nên có thể cho uống hoặc sử dụng khí dung. Vacxin nhược độc có một số nhược điểm sau: + Có thể tạo đột biến, trở lại cường độc khi vào cơ thể vật chủ. Do khả năng có thể truyền vi sinh vật vacxin từ con tiêm sang không tiêm vacxin. Do sự lưu hành của vacxin nhược độc rất khó kiểm soát nên đặc tính nhược độc không ổn định, có thể đột biến và cường độc trở lại + Không sử dụng được cho những vật chủ bị suy giảm miễn dịch. + Cần phải bảo quản tốt nên hạn chế phạm vi sử dụng. Một số vacxin nhược độc: vacxin nhược độc Newcastle thế hệ I, vacxin chó dại Flury LEP, HEP, vacxin IB, vacxin Lasota, vacxin Marek… Ngày nay vacxin nhược độc đã được cải tiến bằng cách cắt bỏ gen độc, gen gây bệnh, rồi đem chế vacxin. Nhưng những kết quả thống kê cho thấy chỉ sau ít đời vi sinh vật lại xuất hiện gen độc trở lại. Những nước phát triển có trình độ khoa học kỹ thuật cao ưa chuộng sử dụng vacxin vô hoạt. Bởi an toàn và hiện nay do có nhiều chất bổ trợ mới nên hiệu quả của vacxin vô hoạt ngày càng được cải thiện. c. Vacxin giải độc tố Vacxin giải độc tố là vacxin chế từ các độc tố của vi khuẩn đã được vô hoạt. Vacxin này chế ra để phòng những vi khuẩn gây bệnh bằng chính độc tố của mình. Các vacxin giải độc tố đang được sử dụng là vacxin giải độc tố uốn ván, vacxin giải độc tố bạch hầu. d. Vacxin dưới đơn vị Vacxin dưới đơn vị là vacxin thay vì sử dụng toàn bộ vi sinh vật, hay độc tố của chúng mà sử dụng các mảnh protein của mầm bệnh để kích thích sinh miễn dịch. Có ba loại vacxin dưới đơn vị là vacxin được chế từ protêin lấy từ mầm bệnh hay từ mô bào tự nhiên, vacxin protein tái tổ hợp, vacxin chứa các peptit. Vacxin dưới đơn vị có một số ưu điểm sau: + Vacxin chứa kháng nguyên tinh khiết hơn vacxin chứa toàn bộ vi sinh vật. + Vacxin sử dụng rất an toàn cho mọi vật chủ kể cả vật chủ bị suy giảm miễn dịch, ít khi có tác dụng phụ. Vacxin dưới đơn vị có mốt số nhược điểm sau: + Kháng nguyên của vacxin khó giữ được cấu trúc không gian nguyên thuỷ của chúng, vì thế kháng thể tạo ra chống protein dưới đơn vị có thể không nhận biết được kháng nguyên. Thường protêin tự nhiên được chiết tách không tinh khiết. Do đó giải độc tố được xem là thành công của vacxin dưới đơn vị. 2.5.1.2 Vacxin thế hệ mới a. Vacxin tái tổ hợp Vacxin tái tổ hợp là vacxin sử dụng một véc tơ sinh học để nhân gen mã hoá cho kháng nguyên. Véc tơ sinh học được sủ dụng là vi khuẩn hoặc virus, gen mã hoá cho kháng nguyên sẽ được gắn vào bộ gen của véc tơ sinh học. Quá trình nhân lên của vật mang sẽ làm gen kháng nguyên nhân lên, chúng ta sẽ thu được kháng nguyên để chế vacxin. Vacxin tái tổ hợp có một số ưu điểm sau: + An toàn hơn vacxin nhược độc. + Giá thành rẻ, chất lượng vacxin ổn định và đồng nhất. Vacxin tái tổ hợp có một số nhược điểm sau: + Cùng một mầm bệnh có thể có rất nhiều kháng nguyên, nên hiệu quả của vacxin tái tổ hợp sẽ không cao. + Vacxin có thể có hiệu quả với chủng này, nhưng không có hiệu quả với chủng khác. + Một protein tái tổ hợp đơn giản có thể không kích thích được đủ tất cả các thành phần của hệ thống miễn dịch. b. Vacxin ADN Vacxin ADN là loại vacxin sử dụng chính đoạn ADN của mầm bệnh mã hoá kháng nguyên bắn vào tế bào vật chủ thích nghi. Tế bào này sẽ giúp sao mã, giải mã và dịch mã để tạo ra các protêin kháng nguyên. Các protêin kháng nguyên này sẽ kích thích hệ thống miễn dịch sinh miễn dịch nếu kháng nguyên này xâm nhập vào lần sau. Vacxin này có một số ưu điểm sau: + Kháng nguyên được thể hiện ở dạng nguyên thuỷ của nó, vì thế quá trình chế biến và trình diện kháng nguyên tới hệ thống miễn dịch tốt hơn. + Kích toàn bộ hệ thống miễn dịch cả dịch thể và tế bào, kích thích cả đáp ứng phòng hộ và đáp ứng CD4 trong cùng một cơ thể. Thời gian miễn dịch kéo dài. + Dễ sản xuất, bảo quản và tinh chế. + Dễ cải tiến và kết hợp vacxin. + Tạo ra miễn dịch dài và hoạt phổ miễn dịch rộng. + Có thể giảm liều vacxin vì kháng nguyên được sản xuất và thể hiện trong một thời gian dài. + Trình tự của ADN có thể thay đổi dễ dàng trong phòng thí nghiệm nên nó đáp ứng được khả năng biến đổi của mầm bệnh. Dù là lại vacxin nào cũng cần đảm bảo một số đặc tính sau: + Vacxin phải chứa kháng nguyên và các kháng nguyên đó phải được hệ thống miễn dịch coi là mục tiêu cần tấn công. + Các kháng nguyên trong vacxin phải kích thích sinh đáp ứng miễn dịch phòng hộ hay vacxin phải có hiệu lực. + Vacxin phải an toàn. Ngoài ra trên thực tế một vacxin cần phải có giá thành hợp lý, ổn định về tính sinh học, dễ sử dụng, ít có tác dụng phụ 2.5.2 Vacxin phòng PRRS Ngay những năm 1994 trên thị thường Mỹ đã xuất hiện một loại vacxin phòng PRRS là RespPRRS/Repro và Prime Pac PRRS ra đời sau đó 2 năm (1996). Vacxin RespPRRS/Repro sử dụng phòng PRRS cho lợn từ 3- 18 tháng tuổi. Vacxin Prime Pac PRRS sử dụng để phòng bệnh cho lợn nái non và nái già. Nhìn chung hai loại vacxin này sử dụng hỗ trợ cho nhau. Hiện nay trên thị trường có rất nhiều loại vacxin phòng PRRS như: + Vacxin BSL- PS1000 là vacxin đông khô, thế hệ mới có nguồn gốc từ chủng JKL- 100 thuộc dòng Bắc Mỹ. Một liều chứa ít nhất 105TCID50, có độ an toàn rất cao. Vacxin được sử dụng cho: Lợn nái tơ và nái rạ (không mang thai), tiêm vacxin trước khi phối giống hoặc trước khi cai sữa. Lợn đực, tiêm phòng lúc 18 tuần tuổi và tái chủng hàng năm Lợn con ở trại không có dịch tiêm 1 lần lúc 3 tuần tuổi, trại có dịch cần tiêm 2 lần lúc 3 tuần tuổi và 6 tuần tuổi Tiêm bắp mỗi liều 2ml + Vacxin BSK- PS 100 do công ty Besta- Singapore sản xuất, là loại vacxin vô hoạt chứa chủng PRRSV dòng Châu Âu. Vacxin này an toàn với cả vật mang thai. Cách sử dụng cụ thể như sau: Lợn con tiêm chủng lúc 3- 6 tuần tuổi Nái hậu bị tiêm chủng lúc 18 tuần tuổi, tái chủng sau 3- 4 tuần Nái rạ không mang thai tiêm chủng lúc 3- 4 tuần trước phối giống Nái mang thai tiêm phòng lúc 60- 70 ngày của thai kỳ Đực giống tiêm chủng lúc 18 tuần, tái chủng 6 tháng một lần Tiêm bắp với liều 2ml + Vacxin Amervac- PRRS vacxin nhược độc dạng đông khô, chứa virus chủng Châu Âu do Tây Ban Nha sản xuất. Lợn con chủng 1 lần lúc 3- 4 tuần tuổi Nái hậu bị chủng 1 lần trước 5 tuần trước khi phối giống Nái tiêm 1 lần sau khi sinh 12- 15 ngày Đực giống chủng lúc 5 tuần tuổi và sau tái chủng 6 tháng 1 lần. Tiêm bắp cổ với liều 2 ml Ngoài ra còn một số vacxin như: Repro Cye PRRS, Ingelvac PRRS MLV, Ingelvac PRRS, Repro cye PRRS PLE. Hiện nay, trong danh mục thuốc thú y được phép lưu hành của Bộ NN và PTNN Việt Nam có ba loại vacxin PRRS là: Porcilis của Intervet- Hà Lan, Amervac PRRS của Hipra- Tây Ban Nha và BSL- PS 100 của Besta- Singapore. Một loại vacxin PRRS nữa đang chờ giấy phép lưu hành của Bộ nông nghiệp và phát triển nông thôn là vacxin PRRS vô hoạt nhũ dầu do công ty CAHIC của Trung Quốc sản xuất. Vacxin chứa chủng JXA1, thuộc dòng Bắc Mỹ. Đây là vacxin vô hoạt điển hình, vacxin được chế từ toàn bộ PRRSV chủng JXA1, một trong những chủng độc lực cao ở Trung Quốc được làm chết để làm kháng nguyên và được kết hợp thêm chất bổ trợ là dầu để tăng hiệu quả. Được sử dụng như sau: Lợn con từ 3 tuần tuổi trở lên tiêm 1 lần có thể tiêm lần hai tuỳ mức độ dịch của từng địa phương. Tiêm bắp phía sau tai với liều 2ml. Lợn nái trước phối giống và lợn đực giống mỗi 6 tháng tiêm 1 lần với liều 4ml vào cơ cổ. Dù là loại vacxin PRRS nào, sự thành công của một chương trình vacxin PRRS cần có hiểu biết cơ bản như sau: + Virus vacxin có thể tồn tại hàng tuần, hàng tháng. Sư tồn tại của nó tương đồng với sự có mặt của độc lực virus (Mengeling và cs, 1996a) [28]. + Virus vacxin có thể được truyền từ lợn tiêm vacxin sang lợn không được tiêm vacxin (Mengeling và cs, 1998) [30]. + Virus vacxin có thể truyền qua nhau thai, gây ra hiện tượng tự nhiễm bẩm sinh (Mengeling và cs, 1996c) [29]. + Virus có thể tồn tại rất lâu ở lợn đực và nó có thể truyền qua tinh dịch (Christopher- Henning và cs, 1997) [22]. + Vacxin kích thích quá trình đáp ứng miễn dịch chậm (Mengeling và cs, 1996a) [28]. + Thời gian hình thành đáp ứng miễn dịch phụ thuộc vào mối quan hệ của dòng virus vacxin và dòng virus thực địa. Sự tương đồng càng cao về cấu trúc gen thì quả trình đáp ứng miễn dịch diễn ra càng mạnh, càng nhanh và thời gian miễn dịch kéo dài (Mengeling, 1998) [30]. + Vacxin có hiệu quả khi nó có thể truyền virus vacxin thẳng qua nhau thai và truyền ngang đối với các cá thể khác trong bầy đàn (Botner và cs, 1997) [20]. 3. ĐỐI TƯỢNG, ĐỊA ĐIỂM, NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Đối tượng nghiên cứu Vacxin PRRS vô hoạt nhũ dầu nhập Trung Quốc được chế từ chủng virus JXA1- đây là một trong những chủng virus độc lực cao. Lợn từ 3 tuần tuổi trở lên (trừ lợn nái mang thai). 3.2 Thời gian nghiên cứu Bắt đầu từ tháng 7 năm 2008 đến tháng 4 năm 2009. 3.3 Địa điểm nghiên cứu Tại 4 tỉnh Nam Định, Thái Bình, Ninh Bình và Hà Tây (cũ) Tại trung tâm Chẩn đoán thú y TW. 3.4 Nội dung nghiên cứu 3.4.1 Đánh giá tính an toàn của vacxin PRRS nhập từ Trung Quốc 3.4.2 Đánh giá hiệu lực của vacxin PRRS nhập từ Trung Quốc 3.5 Nguyên liệu, dụng cụ, hoá chất 3.5.1 Vacxin Vacxin vô hoạt nhũ dầu do công ty CAHIC- Trung Quốc sản xuất phòng bệnh rối loạn hô hấp và sinh sản ở lợn. Dùng để phòng PRRS chủng có độc lực cao thuộc dòng Bắc Mỹ. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, vacxin PRRS nhập từ Trung Quốc sau khi tiêm cho lợn có phản ứng nhẹ, nhưng không gây chết lợn. Đặc biệt có tác dụng tốt để phòng PRRS chủng có độc lực cao tại Trung Quốc. 3.5.2 Virus PRRS độc lực cao của Việt Nam Virus mang mã số NCVD PRRS- 07196, đây là virus do trung tâm Chẩn đoán thú y TW phân lập được từ mẫu mô của lợn bệnh tại Bắc Giang trên dòng tế bào MARC- 145 . 3.5.3 Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất Trang thiết bị, dụng cụ, hoá chất của phòng thí nghiệm thuộc trung tâm Chẩn đoán Thú y TW. 3.6 Phương pháp nghiên cứu 3.6.1 Phương pháp đánh giá tính an toàn của vacxin Để đánh giá tính an toàn của vacxin PRRS sử dụng phương pháp tiêm đồng loạt cho lợn mọi lứa tuổi trừ lợn nái mang thai. Sau tiêm sẽ theo dõi 1 tuần về biến đổi cục bộ và thân nhiệt của cơ thể, ăn uống, đi lại, sống, chết… Phương pháp đánh giá hiệu lực của vacxin 3.6.2.1 Bố trí thí nghiệm Sử dụng 12 lợn 3 tuần tuổi của trại ông Nguyễn Quý Tâm, xã Tân Hội, Huyện Đan Phượng- Hà Tây (cũ) đã được tiêm và chưa được tiêm vacxin phòng PRRS để công cường độc. Thí nghiệm được bố trí như sau: Nhóm lợn Lợn số Lịch tiêm vacxin Liều tiêm Tuổi lợn Vị trí tiêm Được tiêm một mũi vacxin 1, 2, 3, 4, 5 2 ml/mũi 3 tuần Bắp thịt sau gốc tai Được tiêm hai mũi vacxin 10, 11, 12 Đối chứng 6, 7, 8, 9 Không tiêm vacxin Tiêm vacxin mũi hai sau mũi một 28 ngày. Sau khi tiêm vacxin hoàn tất, chúng tôi tiến hành bắt 12 lợn đã chọn về trung tâm Chẩn đoán thú y TW chuẩn bị công cường độc. Lợn thí nghiệm được đưa về trung tâm Chẩn đoán thú y TW, được nuôi thích nghi trong 3 ngày trước khi công cường độc. Mỗi lợn được tiêm 1ml huyễn dịch chứa 106 TCID50 PRRSV chủng cường độc được phân lập tại Việt Nam năm 2007 mang mã số là 07196. Thời gian theo dõi lợn sau khi công cường độc là 21 ngày. 3.6.2.2 Chỉ tiêu đánh giá Chỉ tiêu Thời gian theo dõi - Theo dõi triệu chứng lâm sàng - Hàng ngày (cả sáng và chiều) - Kiểm tra nhiệt độ - Hàng ngày (đo vào buổi sáng từ 7-9 giờ) - Lấy máu đếm bạch cầu - Ngày 0, 4, 7, 10, 14, 21 sau công cường độc - Ngày 0, 4, 7, 14, 21 sau công cường độc - Lấy máu kiểm tra kháng thể - Lấy máu kiểm tra virus huyết - Mổ khám kiểm tra bệnh tích, lấy bệnh phẩm xác định PRRSV. - Khi lợn chết hoặc khi kết thúc thí nghiệm mà lợn không chết. 3.6.3 Phương pháp tiến hành 3.6.3.1 Phương pháp đếm bạch cầu Bạch cầu là những tế bào máu có vai trò quan trọng trong cơ chế bảo vệ cơ thể nhờ chức năng thực bào và chức năng miễn dịch. Do đó sự biến động số lượng bạch cầu của lợn thí nghiệm là một chỉ tiêu quan trọng. * Nguyên liệu cần sử dụng là: - Acid acetic 1% (1ml acid acetic trong 99 ml nước khử ion). Sau khi pha bảo quản ở nhiệt độ phòng. - Chất chống đông EDTA. - Buồng đếm Newbauer. - Kính hiển vi * Các bước chuẩn bị: + Lấy máu cho vào ống efpendof có chứa chất chống đông EDTA. + Trộn đều mẫu máu bằng máy vortex. + Cho 100 ml máu vào ống efpendof có chứa 900 ul acid acetic. + Trộn đều hỗn hợp bằng máy vortex. * Cách đếm bạch cầu: + Trộn đều hỗn hợp trong ống efpendof một lần nữa + Đặt lamen lên buồng đếm Newbauer nhỏ mẫu máu vào buồng đếm sao cho mẫu vừa láng đều trên buồng đếm. + Đếm bạch cầu ở 4 ô vuông lớn ở 4 góc rồi lấy trung bình Công thức tính Số lượng bạch cầu/ml máu = Số bạch cầu đếm được x 100/1ml máu Đơn vị ml máu tương đương với mm3 máu. 3.6.3.2 Phương pháp ELISA gián tiếp ELISA là một trong những phương pháp quan trọng để xác định kháng thể PRRS trong huyết thanh. ELISA có nhiều loại trực tiếp, gián tiếp, trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng ELISA gián tiếp để phát hiện kháng thể PRRS trong huyết thanh của 12 lợn thí nghiệm. a. Nguyên lý chung Thực chất của phản ứng ELISA sử dụng kháng thể hoặc kháng kháng thể có gắn enzyme cho kết hợp trực tiếp hay gián tiếp với kháng nguyên. Sau đó cho cơ chất vào. Nếu kháng thể tương ứng với kháng nguyên thì kháng thể hay kháng kháng thể có gắn enzyme không bị rửa trôi. Enzyme sẽ giải phóng cơ chất tạo lên màu. Khi so màu bằng quang phổ kế sẽ định lượng được mức độ của phản ứng. b. Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất cần dùng Bộ kít INDEXX Herd Check gồm: - Đĩa nhựa 96 giếng - Đối chứng dương, âm - Nước rửa (washing concentrate) 10X. Khi rửa phải pha nước rửa thành nồng độ 1X (1/10 nước rửa 10X và 9/10 nước cất). - Dung dịch pha loãng mẫu (Sample Diluent).. - Antiporcine HRPO conjugate- kháng kháng thể có gắn enzyme. - TMB (3, 3, 5, ,5 tetra methyl benzidine) substrate - hỗn hợp chất phát màu và cơ chất của phản ứng ELISA. - Dung dịch dừng phản ứng (Stop solution). Mẫu huyết thanh cần chẩn đoán. Dụng cụ phòng thí nghiệm bao gồm: máng để đổ nguyên liệu, pipet đơn, đa kênh, máy đọc ELISA... c. Cách tiến hành * Chuẩn bị + Chuẩn bị mẫu huyết thanh bằng cách pha loãng huyết thanh cần kiểm tra ở nồng độ 1/40 (10 ml huyết thanh + 390 ml PBS). + Chuẩn bị nguyên liệu cho phản ứng: Trước khi làm phản ứng, lấy nguyên liệu ra để ở nhiệt độ phòng từ 5- 10 phút. + Chuẩn bị đĩa phản ứng. * Các bước tiến hành - Bước 1: Nhỏ đối chứng dương và âm theo đúng sơ đồ đĩa ELISA (trang 38), với lượng 100 ml. - Bước 2: Nhỏ mẫu huyết thanh đã chuẩn bị vào vị trí từ 1 đến 46 theo theo đúng sơ đồ trang 38. Mỗi giếng nhỏ lượng 100 ml. - Bước 3: Ủ 30 phút ở nhiệt độ phòng. - Bước 4: Rửa đĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 ml dung dịch rửa. - Bước 5: Nhỏ 100 ml conjugate vào tất cả các giếng - Bước 6: Ủ ở nhiệt độ phòng trong 30 phút. - Bước 6: Rửa đĩa 3- 5 lần bằng nước rửa. Mỗi lần rửa cho vào mỗi giếng 300 ml dung dịch rửa. - Bước 7: Nhỏ 100 ml TMB - Bước 8: Ủ ở nhiệt độ phòng 15 phút. - Bước 9: Nhỏ 100 ml dung dịch dừng phản ứng. - Bước 10: Đọc kết quả ở bước sóng 650 nm, nhờ máy đọc ELISA Labsystems multiskan MS. - Bước 11: Tính kết quả dựa vào công thức S/P = OD mẫu PRRS – OD mẫu NHC OD pos PRRS – OD pos NHC * Lưu ý: Kết quả ELISA chính xác cần thoả mãn các điều kiện sau: + PC (PRRS) – NC (PRRS) ≥ 0,15 + PC (NHC) ≤ 0,12 + NC (NHC) ≤ 0,25 Sơ đồ đĩa ELISA 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC PRRS NHC A ĐC + ĐC+ 7 7 B ĐC - ĐC - C 1 1 D 2 2 E 3 3 F 4 4 G 5 5 H 6 6 46 46 3.6.3.3 Phương pháp IPMA IPMA sử dụng để phát hiện kháng thể nghi hoặc kháng nguyên nghi. Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng IPMA để phát hiện kháng thể nghi. * Nguyên lý: Thực chất của phản ứng này là kháng nguyên kết hợp với kháng thể giống như phương pháp ELISA. * Nguyên liệu, dụng cụ và hoá chất cần dùng a. Thiết bị: - Buồng cấy an toàn sinh học cấp độ 2 - Kính hiển vi đảo chiều. - Máy hút chân không, máy li tâm lạnh, máy khuấy từ và que khuấy từ - Cân điện tử chính xác đến 4 đơn vị. - Tủ lạnh, tủ mát, tủ ấm thường, tủ ấm CO2, tủ sấy - Nồi đun cách thuỷ, nồi hấp - Một số thiết bị khác để bảo quản và nuôi cấy tế bào. b. Dụng cụ - Chai thuỷ tinh, cốc thuỷ tinh các kích cỡ 100, 200, 500, 1000 ml - Pipet thuỷ tinh 1,5 và 10 ml - Micropipet đơn, Micropipet nhiều đầu - Dụng cụ nuôi cấy tế bào chai nhựa Flask T75, đĩa nhựa 96, 24, 6 giếng. - Ống Falcon đáy vát. c. Hoá chất - Môi trường EMEM với 5% FCS (Fetal calf serum - huyết thanh thai bê) - Dung dịch A: Dung dịch cố định tế bào, gồm: PBS có 10% Formalin và 1% NP40. - Dung dịch B: Dung dịch nước rửa, gồm PBS với 1% Tween 80 - Dung dịch C: Dung dịch pha loãng mẫu, gồm PBS 1% Tween 80 và 5% sữa gầy - Dung dịch E: Dung dịch AEC, gồm 1ml AEC + 14 ml Acetate buffer 0, 1 M (PH 5,2 ) + 15 ml H202 30%.  d. Môi trường tế bào MARC 145 e. Giống virus cường độc kí hiệu PRRS NCVD – 07196, phân lập từ mẫu phủ tạng lợn của Bắc Giang nhiễm PRRS năm 2007. * Cách tiến hành * Bước 1: Chuẩn bị tế bào MARC -145 vào đĩa 96 giếng. + Sau khi ống tế bào MARC- 145 đựng trong cryotube được đưa ra khỏi bình nitơ lỏng, nh._.