Khả năng kiểm soát tuyến trùng bướu rễ cây hồ tiêu của chế phẩm NEMAITB ở nhà lưới

5 lít - Rây lọc thô (0.5mm) và giấy lọc tinh (15µm) - Đũa thủy tinh, cốc thủy tinh, đĩa petri. - Pipetman. Hóa chất: - Hóa chất ly tâm tách tuyến trùng: bột kaolin (Nhật Bản), dung dịch đường có tỷ trọng 1,18 (đường saccharose 484g/lít) - Dung dịch formalin 4% (Trung Quốc). - Các hóa chất dùng để xác định các chỉ tiêu hóa học của chế phẩm bao gồm: K2Cr2O7, (NH4)2SO4.6H2O, H2SO4, HNO3, HCl, NaOH, H3BO3, v.v. do Trung Quốc sản xuất. - Pha hỗn hợp chất xúc tác: 60g Se + 75g CuSO4 + 865g K2SO4. Hỗn hợp này trộn đều và bảo quản trong chai thủy tinh màu nâu. Hỗn hợp này dùng để bổ sung khi phá mẫu xác định nitơ. - Các hóa chất dùng để pha chất chỉ thị: N-phenylantranilic acid (Anh), Na2CO3 (Trung Quốc). Chất chỉ thị (N-phenylantranilic acid 0.1%): hòa tan 0,1g N-phenylantranilic acid và 0,1g natri carbonat (Na2CO3) trong 100ml nước. Chỉ thị này được đựng trong chai màu nâu và bảo quản trong tối, thời gian sử dụng tối đa không quá 1 tháng. - Môi trường giữ giống và kiểm tra số lượng nấm Trichoderma harzianum (môi trường PGA): khoai tây (200g), đường (20g), agar (20g), nước cất đủ 1000ml, Hấp khử trùng ở 1210C trong 15 phút. Thiết bị: - Máy ly tâm, Juan 412 (Pháp) - Kính hiển vi quang học, Leica (Đức) - Kính hiển vi soi nổi, Olympus SZ-PT (Nhật Bản) - Máy lắc (Hàn Quốc) - Máy đo pH Precisa (Thụy Sỹ) - Cân phân tích Mettler Toledo (Thụy Sỹ) - Nồi hấp Tommy-SS-325 (Nhật Bản) Máy ly tâm Kính hiển vi soi nổi Hình 2.2 Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp xác định độ ẩm [7] Nguyên tắc: dựa trên nguyên lý sấy khô mẫu đến trọng lượng ổn định ở nhiệt độ 1050C. Khối lượng mẫu mất đi khi sấy đến khối lượng không đổi được coi là lượng nước có trong mẫu. Tiến hành : - Cân chính xác 2 – 3 g mẫu trên cân phân tích cho vô chén đựng mẫu với trọng lượng đã biết. Đặt chén đựng mẫu vô tủ sấy, mở nắp chén và sấy ở nhiệt độ 1050C rong 6 giờ. - Đậy nắp chén đã sấy khô và đưa vào bình hút ẩm làm nguội đến nhiệt độ phòng. Cân chén trên cân phân tích có độ chính xác đến 0,002 g. Kết quả: Độ ẩm (%) = với: m1 = khối lượng chén và khối lượng mẫu trước khi sấy (g) m2 = khối lượng chén và khối lượng mẫu sau khi sấy (g) m = khối lượng mẫu phân tích (g) 2.2.2 Phương pháp xác định pH [7] Mẫu được ngâm trong nước cất theo tỷ lệ 1:5 (g/ml), dầm kỹ mẫu bằng đũa thủy tinh và dùng máy khuấy trong 15 phút sau đó để yên khoảng 1 giờ. Lọc bằng giấy lọc. Dung dịch lọc thu được dùng để xác định pH bằng máy đo pH với điện cực thủy tinh. 2.2.3 Xác định độ dẫn điện (EC) [7] Mẫu được ngâm với nước cất theo tỷ lệ 1:5 (g/ml), dầm kỹ mẫu bằng đũa thủy tinh và dùng máy khuấy trong 15 phút sau đó để yên khoảng 1 giờ. Lọc bằng giấy lọc băng xanh. Dung dịch lọc thu được dùng để xác định độ dẫn điện bằng máy đo Orion model 115 (Mỹ). 2.2.4 Xác định hàm lượng chất hữu cơ tổng số theo phương pháp WALKEYBLAC [7] Nguyên tắc: oxy hóa chất hữu cơ bằng lượng Biocromate kali (K2Cr2O7) dư trong môi trường acid đậm đặc, lượng K2Cr2O7 dư được xác định bằng muối Morh chuẩn, từ đó xác định được lượng K2Cr2O7 đã dùng để oxy hóa mẫu. Tiến hành: -Cân 0,1 g mẫu nghiền mịn cho vô bình nón 250 ml, thêm 10 ml dung dịch Bicromate kali 1 N sao cho dung dịch thấm đều vào mẫu, thêm 15 ml H2SO4 (d =1,84). Đậy nắp bình để yên 30 phút, làm nguội, rửa phễu và thành bình bằng nước cất, thêm khoảng 100 -150ml nước cất, lắc đều. Thêm 0,3 ml chỉ thị N -phenylantranilic 0,1% và dùng dung dịch Morh chuẩn cho đến khi dung dịch chuyển từ màu nâu hung sang màu xanh tím, cuối cùng là xanh lá cây sẫm. Mẫu trắng : lấy 10 m Bicromate kali 1 N và 15 H2SO4 (d=1,84) đặc cho vô bình nón 250 ml. Đậy bình bằng phễu thủy tinh, để yên 30 phút, làm nguội. Thêm 100-150ml nước cất, lắc đều, thêm 0,3 m chỉ thị N -phenylantranilic 0,1% rồi chuẩn độ. Kết quả: % chất hữu cơ = Với: V0 : thể tích muối Morh 0,2 N dùng cho mẫu đối chứng (ml) V : thể tích muối Morh 0,2 N dùng cho mẫu phân tích (ml) g : lượng mẫu cân( g) 2.2.5 Xác định tổng C hữu cơ [7] Hàm lượng C hữu cơ (%) được xác định và tính theo công thức sau: % C = % Chất hữu cơ: 1,724 2.2.6 Phương pháp xác định hàm lượng axit humic [7] Nguyên tắc: axit humic là thành phần của chất mùn trong phân bón được tách bằng NaOH 0,1 N (pH = 13). Axit humic được kết tủa bằng axit, sau đó định lượng như là chất hữu cơ thông thường. Tiến hành: - Cân 2 g mẫu đã nghiền mịn ( chính xác tới 0,002 g) cho vô bình nón 250 ml thên 100 ml NaOH 0,1 N ( pH=13), đậy kín và lắc bình trong 30 phút, để qua đêm. Lọc dung dịch ,loại bỏ cặn, dung dich trong dùng để xác định axit humic. - Lấy 25 ml dung dịch lọc trên cho vô cốc 100 -150 ml và kết tủa bằng H2SO4 1N ( dùng 8 -10 ml). Kết tủa đến khi xuất hiện cặn đục bền và được xem là hoàn toàn và ổn định ở pH =1. đun cốc trên bếp điện ( không đun sôi) để cho axít humic đông tụ. Để nguội và lọc qua giấy lọc, tráng cốc và rửa kết tủa bằng H2SO4 0,05 N - Hòa tan kết tủa trên giấy lọc bằng NaOH 0,05 N nóng vô bình định mức 100 ml. quá trình hòa tan kết thúc khi dung dịch chảy xuống là trong. Để nguội thêm nước tới vạch và lắc đều. - Để xác định axit humic, lấy 25 ml dung dịch cho vô bình nón 250 ml, cô khô, để nguội. Sau đó xác định chất hữu cơ theo phương pháp WALKEYBLAC. Tính kết quả: hàm lượng axít humic tính bằng phần trăm (%) theo công thức sau: % axít humic = Trong đó: V0 : thể tích muối Morh 0,2 N dùng cho mẫu đối chứng (ml) V : thể tích muối Morh 0,2 N dùng cho mẫu phân tích (ml) g : lượng mẫu cân( g) 2.2.7 Xác định nitơ tổng số theo phương pháp micro Kjeldahl [7] Nguyên tắc: mẫu được vô cơ hoá bằng axít H2SO4 (d=1,84) đậm đặc với sự tham gia của chất xúc tác, muối amonium sunfat (NH4)2SO4 được tạo thành tác dụng với kiềm mạnh (NaOH) sẽ phóng thích ra NH3. Và qua dung dịch 0,25 N H3BO3 tự phân ly. Lượng BO2- được tạo thành tương đương lượng NH3 bị đẩy ra trong quá trình cất đạm và được định lượng bằng cách chuẩn độ ngược với HCl (0,25 N). Cách tiến hành: - Vô cơ hoá mẫu: cân 0,2 g mẫu đã nghiền mịn (chính xác đến 0,002 g) cho vào ống phá mẫu chuyên dụng, bổ sung 1 g chất xúc tác và hút 5 ml axít H2SO4 (d=1,85) đậm đặc, nối với bộ thu khí và bắt đầu phá mẫu trên bếp đun chuyên dụng của máy mẫu kết thúc, để ống phá mẫu nguội và thêm vào 50 ml nước cất, trộn đều và để nguội, lắp vào máy chưng cất. - Chưng cất: lắp ống phá mẫu vào máy chưng cất Kjeldahl bán tự động Prolabo, bơm chính xác 80 ml NaOH 32%, dịch chưng cất tự động chuyển sang bình tam giác 250 ml có chứa sẵn 20 ml dịch axít boric 4% có chỉ thị màu. Quá trình chưng cất kết thúc khi không còn NH3 (thử bằng giấy quỳ). Mẫu chưng cất được đem chuẩn độ bằng HCl 0,25N cho tới khi dung dịch xuất hiện màu phớt đỏ. - Thông qua lượng HCl 0,25N chuẩn độ biết được lượng axít boric kết hợp với NH3 và do vậy xác định được lượng NH3 giải phóng từ mẫu. Cứ 1 ml HCl 0,25N tương ứng với 0,0035 g nitơ. g V HCl 100 . 0035 , 0 . Tính kết quả: hàm lượng nitơ tổng số được tính bằng phần trăm (%) theo công thức sau: %Nitơ tổng số = Trong đó: VHCl: thể tích axít HCl 0,25N dùng để chuẩn độ, ml g: lượng mẫu đem xác định, g 2.2.8 Xác định phốt pho tổng số bằng phương pháp so màu ( AOAC: 965.17-1990) [7] Nguyên tắc: dựa vào khả năng của ion arthophosphate phản ứng với molydate ammôn tạo thành phosphatemolydate, phức chất có màu xanh lơ. 2(MoO2.4MoO3)+H3PO4+4H2O (MoO2.4MoO3).2H3PO4.4H20 Cường độ màu phụ thuộc vào hàm lượng phosphor trong dung dịch mẫu, đo ở bước sóng hấp thụ cực đại 650nm, với phương pháp này cho phép xác định hàm lượng phosphor trong giới hạn 1-20mg/lít. Hóa chất: - Dung dịch 1: dung dịch chuẩn gốc ( chứa 100 mgP/ml): hòa tan 0,4394g KH2PO4 bằng nước cất và định mức đến 1000ml. Từ dung dịch gốc chuẩn bị dung dịch chuẩn để phân lập than chuẩn (dung dịch chuẩn có chứa 25mg/ml) Lấy 25ml dung dịch chuẩn gốc cho vào bình định mức 100ml và thêm nước cất đến vạch 100ml - Dung dịch HCl 10%. Pha 250ml HCl đậm đặc (HCl có d=1,19g/ml) với 750ml nước cất trong bình định mức 1000ml - Dung dịch 2: Dung dịch Na2SO3 20% - Dung dịch 3: Dung dịch Hydroquynona {C6H4(OH)2}0,5%. Hòa tan 0,5g C6H4(OH)2 trong một ít nước cất, thêm 3 giọt H2SO3, thêm nước cất cho đủ 100ml. Dung dịch này chuẩn bị trước khi dùng. - Dung dịch 4: Thuốc thử Brigg’s = dung dịch Molybdate ammôn 5%. Hòa tan 50g Molybdate ammôn trong 400ml nước cất, cho 150ml H2SO4 đậm đặc vào 400ml nước cất, để nguội và cho vào bình định mức đến 1000ml. - Hỗn hợp thuốc thử chuẩn bị khi sử dụng: trộn lẫn các dung dịch 2, 3, 4 theo tỷ lệ 1:1:1. Cách thực hiện: - Chuẩn bị dung dịch tro (dung dịch thử): cân 1,0g mẫu đã nghiền mịn (chính xác đến 0,002g) cho vào chén sứ, sau đó đem vô cơ hóa mẫu ở 5500C trong 4 giờ, để nguội. Lấy mẫu ra, thấm ướt phần tro bằng vài giọt nước cất và thêm 10ml dung dịch HCl 10% và 0,5ml HNO3. Đem đun sôi nhẹ trong 5 phút (đến bay hơi). Để nguội đến nhiệt độ phòng, sau đó đem lọc và rửa sạch chén nung. Định mức thể tích dung dịch tro (dung dịch thử) đến 100ml. - Phản ứng lên màu: Hút 10ml dung dịch thử cho vào bình tam giác và định mức đến 100ml. Dung dịch này được gọi là dung dịch thử 2. Tiếp theo, hút 1ml dung dịch thử 2 cho vào ống nghiệm, thêm 3ml hỗn hợp thuốc thử và nước cất đủ 10ml. Lắc đều hỗn hợp, để yên 30 phút. Đem đo ở bước sóng 650nm trên máy quang phổ Hewlet Packard 8453 với chương trình HPUV-Vis Chemstations. 2.2.9 Phương pháp định lượng Calcium và Magnesium [12] - Xác định tổng Ca và Mg Nguyên tắc: để xác định tổng Ca và Mg, thông thường người ta sử dụng phương pháp xác định độ cứng toàn phần của nước (độ cứng toàn phần của nước là tổng lượng muối bicarbonate, clorur, sulfat, nitrat, v.v. của chất khoáng). Nguyên tắc của phương pháp này là dùng Trilon B (EDTA C10H14N2O8Na2) để chuẩn độ và chất chỉ thị màu là Đen Eriochrom T (C20H12N2O7SNa). Trong môi trường pH = 10 các ion Ca và Mg tác dụng với chất chỉ thị màu tạo thành phức hợp có màu đỏ tím. Nếu kí hiệu Đen Eriochrom T là NaHI thì có phản ứng: NaHI D Na+ + HI2-. Mg2+ + HI2- " MgI- + H+ Xanh lam Đỏ tím Chất phức hợp này kém bền hơn phức hợp của Ca và Mg với Trilon B. Do đó, khi dùng Trilon B chuẩn độ, Trilon B sẽ kết hợp với Ca và Mg để tạo thành hợp chất phức hợp bền hơn. Chất chỉ thị màu được phóng thích tự do và trở lại màu xanh lam. Nếu ký hiệu Trilon B là Na2H2Y2- thì có phản ứng: Na2H2Y2- D 2Na+ + H2Y2-. MgI- + H2Y2- " MgY2- + HI2- + 2H+ Đỏ tím Không màu Không màu Xanh lam Hóa chất: dung dịch KCN 3%, dụng dịch đệm amonium pH 10 (cân 6,7 g NH4Cl + 30 ml nước cất, hòa tan, thêm 57 ml NH4OH và dẫn nước cất đủ 100 ml), NaOH 10%, dung dịch Trilon B 0.05N, chỉ thị Đen Eriochrom T, giấy đo pH. Vô cơ hóa mẫu bằng cách acid sunfuric đậm đặc: Cân 1,0g mẫu đã sấy khô tuyệt đối và nghiền mịn (chính xác đến 0,002g) cho vào chén sứ, sau đó đem vô cơ hóa mẫu ở 5500C trong 4 giờ, để nguội. Sau đó thêm vào đó 5 ml HCl 3N đun sôi cách thủy 15 phút, làm lạnh thêm 25 ml HCl 0,5 N và chuyển vào bình định mức thêm nước cất vào đến 50 ml(gọi là dung dịch A). Cách thực hiện: hút 20 ml dung dịch A cho vào bình tam giác 100 ml. Trung hòa dung dịch trong bình tam giác bằng NaOH 10% và cho 4ml dung dịch đệm amonium đến đổi màu giấy quỳ tím. Tiếp theo, nhỏ vào bình 5 giọt KCN 3% (để ngăn cản một số ion như Fe3+, Fe2+, Cu2+, v.v. tác dụng với Trilon B). Sau đó thêm vào bình khoảng nửa hạt gạo chất chỉ thị đen Eriochrom T, dung dịch có màu đỏ tím, dùng dung dịch Trilon B có chuẩn độ cho đến khi chuyển sang màu xanh lam (a: ml Trilon B). Thể tích Trilon B 0.05N chuẩn độ dung dịch có giá trị tương đương với hàm lượng Ca và Mg. Song song tiến hành chuẩn mẫu trắng (tương tự các bước được thực hiện như trên, chỉ thay dung dịch A bằng nước cất). - Xác định hàm lượng Calcium Nguyên tắc: dùng Trilon B xác định Calcium trong dung dịch mẫu với chỉ thị là Murexid (C8H5O6N5) trong môi trường có pH = 12. Ký hiệu chất chỉ thị Murexid là H3I- trong môi trường pH = 12, H3I- có màu tím và khi kết hợp với Calcium tạo thành phức hợp có màu hồng: H3I- + Ca2+ " CaH3I+ Tím Hồng Chất phức hợp của Ca với Murexid không bền bằng chất phức hợp tạo bởi Ca với Trilon B. Vì vậy, Trilon B này sẽ đẩy chất chỉ thị Murexid ra khỏi phức hợp với Ca để trở về dạng tự do có màu tím: CaH3I+ + H2Y2- " CaY2- + H3I- + 2H+ Hồng Tím Hóa chất: dung dịch NaOH 10%, dung dịch KCN 3%, chỉ thị Murexid, dung dịch Trilon B 0.05N. Cách thực hiện: hút 20 ml dung dịch A vào bình tam giác 100 ml. Thêm 2 ml dung dịch NaOH, 5 giọt KCN 3% và khoảng nửa hạt gạo chỉ thị Murexid. Chuẩn độ bằng dung dịch Trilon B 0.05N cho đến khi màu hồng của dung dịch chuyển sang màu tím. Song song tiến hành chuẩn mẫu trắng (tương tự các bước thực hiện như trên, chỉ thay dung dịch A bằng nước cất). Tính kết quả: Tính thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ tổng Ca và Mg trong 100g mẫu khô. Gọi - v: thể tích dung dịch Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ mẫu tổng Ca và Mg. v0: thể tích dung dịch Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ mẫu trắng Dv: v – v0 V: thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ dung dịch mẫu tương đương với 100g mẫu khô tính bằng ml/100g mẫu khô. V = (ml/g) 2. Tính thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ Ca trong 100g mẫu khô. - V1: thể tích Trilon B 0.02N dùng để chuẩn độ - C: Độ nguyên chuẩn của dung dịch Trilon B - a: trọng lượng mẫu khô tương đương với thể tích dung dịch mẫu lấy để chuẩn độ - 24,04: đương lượng của Calcium - V1: thể tích Trilon B cần để chuẩn độ khi xác định lượng Calcium trong dung dịch mẫu tương đương với 1g mẫu khô. Ta có: V1 = Lượng Calcium (tính bằng mg) trong 100g mẫu khô là: m1 = Lượng Magnesium (tính bằng mg) trong 100g mẫu khô là: m2 = (V – V1)xCx12,16 12,16: đương lượng gam của Mg. 2.2.10 Phương pháp kiểm tra số lượng vi sinh vật [3] Nguyên tắc: định lượng bào tử có trong 1g môi trường cấy bằng kĩ thuật trải đĩa. Cách tiến hành Huyền phù hóa mẫu và pha loãng: Cân 10g chế phẩm cần khảo sát cho vào erlen chứa 90ml nước muối sinh lý đã được vô trùng, lắc đều ta được dịch pha loãng 10-1. Cho vào máy lắc trong 30 phút, tiếp tục pha loãng mẫu bằng dung dịch nước muối sinh lý ra các nồng độ 10-2, 10-3, 10-4,... Trải và ủ : hút 100 ml dịch ủ có độ pha loãng thích hợp vào đĩa petri đã chứa sẵn môi trường PGA. Dùng que thủy tinh trải đều dung dịch mẫu lên mặt thạch. Lật ngược đĩa petri, gói lại. Đặt ở tủ ấm 300C, thời gian từ 2-3 ngày. Thực hiện tương tự với các mẫu có các độ pha loãng khác nhau. Đọc và tính kết quả: Đếm số khuẩn lạc đã mọc trên đĩa petri. Ghi nhận các nồng độ pha loãng cho từ 10 – 100 khuẩn lạc/ đĩa. Tính số lượng tế bào nấm mốc/gam mẫu (cfu/g) B = y x 10n Trong đó: B: số lượng tế bào nấm mốc có trong 1g mẫu y: số khuẩn lạc nấm mốc n: số lần pha loãng 2.2.11 Phương pháp chiết xuất thô hoạt chất sinh học từ chế phẩm NemaITB [11] Chuẩn bị dịch chiết Cân 100 gram chế phẩm được nghiền và ngâm trong trong 200ml cồn 960 khoảng 4 giờ chiết lấy dịch, bỏ bã. Tiếp tục thêm 20ml cồn vào bã chế phẩm ngâm khoảng 4 giờ, chiết lấy dịch, bỏ bã (lặp lại 4 lần). Gom tất cả dịch thu được, trộn đều và đem cô quay chân không, thu dịch chiết và định mức đến 100ml, dịch này được xem như dịch nguyên chất (nồng độ 100%) dùng để khảo sát. Dịch chiết này được pha loãng 1, 10 và 30 lần với nước cất đã hấp khử trùng. Dich chiết giàu hoạt chất sinh học, (100 ml) Chế phẩm (100 g) Dich chiết cồn Ngâm khuấy với cồn Cô quay chân 960, 4 giờ x 5 lần không 2.2.12 Phương pháp định tính azadirachtin bằng sắc ký bản mỏng [11] Định tính azadirachtin của chế phẩm NemaITB và azadirachtin chuẩn của hãng Sigma trên tấm sắc ký bản mỏng F245, Merck, kích thước 5x8cm với hệ dung môi triển khai n-hexan:acetone, tỷ lệ 3:2. Sử dung thuốc phun hiện màu vanillin: H2SO4: cồn 960 với tỉ lệ 3g:3ml:20ml. Cách tiến hành: Chọn tấm sắc ký bản mỏng F245, Merch, cắt kích thước 5x8cm Vẽ vạch xuất phát Chấm dung dịch azadirachtin chuẩn của hãng Sigma, dịch chiết của chế phẩm NemaITB lên các vị trí đã đánh dấu. Cho vào bình hỗn hợp dung môi hữu cơ trển khai n-hexan:acetone (3:2) Sấy khô dung môi Phun thuốc hiện màu vanillin: H2SO4: cồn 960 (3g:3ml:20ml) Sấy khô trên bản mỏng xuất hiện những vạch màu Tính tỉ số khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký Rf = a/b Trong đó: Rf: tỉ số khoảng cách a: khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tâm vệt sắc ký b: khoảng cách từ tuyến xuất phát tới tuyến dung môi 2.2.13 Phương pháp tách tuyến trùng từ rễ - phương pháp lọc tĩnh [5] Xếp các đĩa petri lên trên mặt bằng phẳng, đặt các rây lọc (đường kính khoảng 90 mm, cao 15 mm) vô điã petri, sau đó đặt một lớp giấy lọc lên trên rây. Lấy mẫu rễ cho vô rây lọc, điều chỉ lượng nước vừa ngập rễ trên rây, đậy nắp lại và đặt yên tĩnh trong 48 giờ ở nhiệt độ phòng, tuyến trùng sống sẽ dễ dàng chui qua rây lọc, lắng xuống đáy đĩa petri. Thu hoạch tuyến trùng: nhấc rây ra khỏi đĩa petri, thu lại dịch nước chứa tuyến trùng trong đĩa petri. Hình 2.3 Tách tuyến trùng cảm nhiễm bằng phương pháp lọc tĩnh 2.2.14 Phương pháp tách tuyến trùng theo phương pháp ly tâm [5] - Chuẩn bị mẫu đất: mẫu đất bảo quản trong túi nhựa được trộn đều lên, sau đó định lượng 100g. - Xử lý mẫu đất: ngâm và hòa tan đất trong nước bằng cách cho mẫu đất vào một xô nhựa có dung tích 5 lít đổ thêm 500 ml nước cất vào, ngâm từ 30 – 60 phút tùy thuộc vào loại đất. Bóp vụn đất và khuấy đều để đồng nhất mẫu đất cho đất tan thành dịch huyền phù. - Lọc thô loại bỏ cặn thô: dịch đất từ xô 1 được lọc qua rây lọc thô số 1 (kích thước lỗ 0.5 mm) sang xô 2. Cặn trên rây được rửa lại bằng nước sạch, sau đó loại bỏ cặn đất và rác bẩn còn lại trên rây. - Gạn lọc: phần dung dịch đất có chứa tuyến trùng trong xô 2 tiếp tục được khuấy đều và gạn lọc từ xô 2 về xô 1, trong khi gạn lọc phải xoay vòng xô để cạn được giữ lại trên xô (chứ không phải đổ thẳng từ xô này qua xô khác vì như vậy sẽ nôi kéo cạn theo khi đổ) và tiếp tục lặp lại 5-7 lần, tùy loại đất mà gạn lọc cho đến khi loại bỏ hết cặn đất và cát nặng, chỉ còn lại dịch chứa tuyến trùng ở dạng huyền phù. - Ly tâm lần 1, loại bỏ nước: chuyển dung dịch huyền phù vào 2 ống ly tâm thêm 4g bột kaolin vào mỗi ống và khuấy đều bằng đũa thủy tinh. Trước khi đặt vào các ống ly tâm vào máy ly tâm phải được cân đều nhau (chỉnh cân để kim về tâm trước khi cân) và đặt đối xứng. Ly tâm lần 1, ở tốc độ 3000 vòng trong 5 phút. Sau khi ly tâm đổ bỏ phần dung dịch ở phía trên giữ lại cặn chứa tuyến trùng. - Ly tâm lần 2, tách tuyến trùng ra khỏi cặn: thêm dung dịch đường saccaro có tỷ trọng 1,18 (484g đường/ 1 lít nước), khuấy đều trong thời gian tối thiểu là 30 giây. Các ống ly tâm được cân chỉnh cho bằng nhau và tiến hành ly tâm lần thứ 2 ở tốc độ 3000 vòng trong 5 phút. Kết quả ly tâm lần này, tuyến trùng sẽ tách khỏi cặn treo lơ lửng trong dung dịch. Đổ dung dịch chứa tuyến trùng này qua rây lọc tinh có kích thước lỗ 15µm, tuyến trùng sẽ được giữ trên rây.Chuyển tuyến trùng vào cốc thủy tinh bằng bình tia có chứa dung dịch formon 4 % để bảo quản. Xử lý mẫu Ngâm mẫu (30-60 phút) Lọc qua rây lọc thô 0,5 mm Gạn lọc (5-7 lần) Chuyển dung dịch vào ống ly tâm Thêm bột kaolin Cân đều 2 ống ly tâm Ly tâm lần 1 Thêm dung dịch đường (1,18) Khuyấy đều dịch đường Ly tâm lần 2 Thu tuyến trùng trên giấy lọc15µm Hình 2.4 Các bước thực hiện tách tuyến trùng bằng phương pháp ly tâm 2.2.15 Phương pháp đếm tuyến trùng [5] Tuyến trùng được đếm bằng đĩa đếm tuyến trùng (countinh dish) và bút đếm dưới kính hiển vi soi nổi. Trong trường hợp mẫu có ít tuyến trùng có thể đổ cả tuyến trùng vào đĩa đếm. Sau khi lắc nhẹ cho dung dịch chứa tuyến trùng dàn đều, có thể đếm toàn bộ tuyến trùng theo các dãy ô cho toàn bộ đĩa hoặc có thể đếm đại diện một số ô hoặc dãy, sau đó tính trung bình một ô và nhân với tổng số ô trong đĩa. Trong trường hợp mẫu có quá nhiều tuyến trùng có thể pha loãng dung dịch tuyến trùng thành 30 ml, sau đó lấy 1 ml bằng pipepman để đếm, lặp lại 5 lần như vậy, tính trung bình số lượng tuyến trùng trên 1 ml rồi nhân với 30. Hình 2.5 Hình ảnh đếm tuyến trùng 2.2.16 Phương pháp thử độc tính [20] Chuẩn bị dịch chiết Cân 25 gram mẫu chế phẩm NemaITB được nghiền và ngâm trong 100ml nước cất khoảng 24 giờ. Sau đó ly tâm và lọc qua giấy lọc Whatman để thu dịch lọc, dịch chiết này được xem như dịch nguyên chất (nồng độ 25%) dùng để khảo sát. Các dịch chiết này được pha loãng 5, 10, 20 và 40 lần với nước cất. Phương pháp thử độc tính in vitro Hút 1ml dịch huyền phù tuyến trùng chứa khoảng 20 tuyến trùng cảm nhiễm cho vào đĩa petri. Sau đó thêm vào 10ml dịch chiết cần khảo sát, mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Đặt đĩa petri ở nhiệt độ phòng. Theo dõi phần trăm (%) tuyến trùng chết sau 12, 24 và 48 giờ. 2.2.17 Phương pháp thử nghiệm trên cây trồng Thử nghiệm trong điều kiện nhà luới Thí nghiệm được thực hiện tại vườn ươm viện Sinh Học Nhiệt Đới từ tháng 02 năm 2009. Tiêu giâm hom 5 tháng tuổi được đưa trở lại bầu, cứ 02 hom tiêu được đưa vào một bầu có đường kính 20x20 cm, với đất đã được xử lý nhiệt để làm sạch tuyến trùng. Bổ sung nồng độ chế phẩm cần khảo sát trước 7 ngày lây nhiễm. Tách tuyến trùng cảm nhiễm tuổi 2 từ rễ hồ tiêu thu ở Bình Dương (phương pháp lọc tĩnh, mô tả ở mục 2.2.13). Lây nhiễm tuyến trùng vào cây chủ: tạo 03 hố nhỏ xung quanh cây chủ, dùng bơm xylanh có đầu kim dài cỡ 10 cm hút lượng dung dịch chứa khoảng 800 ấu trùng cảm nhiễm tuổi 2, sau đó cho vào 03 hố đó (lưu ý vừa bơm vừa rút kim lên để cho dịch tuyến trùng được phân bố đều trong đất). Thí nghiệm được lặp lại 3 lần có đối chứng và bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên. Theo dõi và phân tích sau 30 và 60 ngày lây nhiễm. Thử nghiệm ở ngoài đồng ruộng Từ những kết quả thu được trên cây hồ tiêu ở điều kiện vườn ươm. Bước đầu chúng tôi kết hợp với hộ dân trồng tiêu ở Ấp Bầu Trư, xã An Bình, Phú Giáo, Bình Dương sơ bộ đánh giá hiệu quả của chế phẩm. Chế phẩm NemaITB dạng bột được khuyến cáo sử dụng 100g/gốc tiêu trưởng thành. Cách bón như sau: Theo độ dốc của vườn tiêu, ở phía trên độ dốc cách 30 cm tới tâm gốc tiêu tạo đường vòng tròn bán nguyệt, còn đất bằng phẳng thì tạo đường vòng tròn cách 30 – 40 cm tới tâm gốc tiêu để đảm bảo không ảnh hưởng đến bộ rễ của cây tiêu, rắc chế phẩm vào và phủ một lớp đất mỏng lên để tránh bị rửa trôi khi mưa. Theo dõi và phân tích sau mỗi tháng. Chỉ tiêu theo dõi: - Thành phần lý hóa của đất sau mỗi tháng bón chế phẩm - Mật độ tuyến trùng biến động trong đất sau mỗi tháng bón chế phẩm ._.